8-(4-Метил-4Н-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан, обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способ его получения Российский патент 2024 года по МПК C07D487/10 A61K31/4196 A61P31/06 

Изобретение относится к области органической химии и медицины, а именно к индивидуальному 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октану формулы 1 (в виде рацемической смеси), обладающему противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, и способу его получения.

Туберкулез является одной из 10 ведущих причин смерти в мире. Согласно данным ВОЗ, ежегодно в мире туберкулезом заболевают до 10 миллионов человек, и около 1,5 миллионов человек умирают от этой болезни, в том числе 20% от ко-инфекции ВИЧ и туберкулез. Наибольшей сложностью для проведения противотуберкулезных мероприятий в настоящее время является особенность возбудителя - его лекарственная резистентность к противотуберкулезным препаратам. На лекарственно-устойчивый туберкулез приходится около 29% смертей, связанных с резистентностью к антибактериальным препаратам [Singh V., Chibale К. Strategies to Combat Multi-Drug Resistance in Tuberculosis. Acc. Chem. Res. 2021; 54(10):2361-2376].

Туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя (МЛУ) отличается длительным, дорогостоящим и низкоэффективным лечением, часто переходящим в хронические формы с сохранением нереплицирующихся микобактерий, что неизбежно ведет к рецидивам инфекции. Кроме того, проведению полноценной противотуберкулезной терапии препятствует высокая частота возникновения побочных эффектов (73-92%), что требует ее отмены у 11-28% пациентов. В результате такого лечения, по данным мировой статистики, излечиваются лишь 48% пациентов с МЛУ-ТБ при рекомендованной ВОЗ эффективности лечения не менее 75,0% [Global tuberculosis report 2020. Женева: Всемирная организация здравоохранения; 2020].

Развитие резистентности и дальнейшая невосприимчивость микобактерий (МБТ) к известным на сегодняшний день препаратам остается главной проблемой при лечении туберкулеза. По данным ВОЗ для того, чтобы ускорить средние темпы снижения заболеваемости туберкулезом до 17% в год до 2025 года, потребуются технологические прорывы, в том числе разработка новых лекарственных препаратов для снижения риска развития активной формы туберкулеза примерно двух миллиардов человек с латентной инфекцией туберкулеза, а также более простых и коротких режимов лечения туберкулеза.

Поэтому поиск новых концептуальных путей повышения эффективности лечения туберкулеза, в том числе и при МЛУ формах, является одним из важнейших и приоритетных направлений в современной фтизиатрии.

Анализ патентной и научно-технической литературы показал, что данные о способе получения заявляемого соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]-октана формулы 1 и его структуре, ранее не публиковались.

Задачей предлагаемого изобретения является создание нового соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октана формулы 1, обладающего противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя с МЛУ, что позволит расширить спектр потенциальных противотуберкулезных препаратов.

Техническими результатами явилась разработка способа синтеза соединения формулы 1 с подтвержденной in vitro противотуберкулезной активностью в отношении стандартного и клинических штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, не проявляющего цитотоксического действия в отношении клеток макроорганизма и отличающегося хорошей переносимостью и безвредностью.

Задача решается тем, что способ получения соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октана формулы 1 осуществляется путем взаимодействия в сухом диметилформамиде имидазолида 5-нитрофуран-2-карбоновой кислоты и спироциклического амина, получаемого непосредственно перед реакцией обработкой 2-(трет-бутил)-6-(метилсульфонил)-8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан-2-карбоксилата (формулы 6) раствором трифторуксусной кислоты в сухом хлористом метилене при температуре 0°С.

Задача решается также тем, что соединение формулы 1 обладает противотуберкулезной активностью в отношении чувствительного стандартного штамма М. tuberculosis H37RV и клинических изолятов М. tuberculosis с МЛУ.

Изобретение поясняется чертежами, где:

Фиг 1. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан формулы 1 в отношении штамма стандартного H37R.V, где по оси абсцисс - концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистового резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0,0247 мкг/мл

Фиг. 2. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4] октан формулы 1 в отношении клинического штамма 4542 с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс -концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистового резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0,0297 мкг/мл Фиг. 3. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан формулы 1 в отношении клинического штамма 7074 с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс - концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистового резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0,0441 мкг/мл Фиг. 4. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан формулы 1 в отношении клинического штамма 396у с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс -концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистового резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0,0173 мкг/мл Фиг. 5. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан формулы 1 в отношении клинического штамма 6691 с множественной лекарственной устойчивостью, где по оси абсцисс -концентрация соединения (мкг/мл) формулы 1, по оси ординат - индикатор роста культуры, нормированный на контрольные значения медианных величин цвета чистового резазурина без культуры МБТ и культуры МБТ без добавления соединения формулы 1. Значение МИК=0,0124 мкг/мл Фиг. 6. Цитотоксические свойства соединения формулы 1 на клеточной линии Vero (АТСС CCL-81)

Примеры практического осуществления

Пример 1. Методика получения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октана формулы 1

6-Бензил-2-(трет-бутил)-8-этил-2,6-диазаспиро[3.4]октан-2,8-дикарбоксилат(3)

Синтезировали по методике, описанной в литературе [Le Manach, С.; Dam, J.; Woodland, J. Get al. Identification and Profiling of a Novel Diazaspiro[3.4]octane Chemical Series Active against Multiple Stages of the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum and Optimization Efforts. J. Med. Chem. 2021, 64, 2291-2309.]. К суспензии NaH (60%-ная дисперсия в вазелиновом масле, 1,88 г, 0,047 моль, 1,15 экв.) в ТГФ (150 мл) прикапывали триэтилфосфоноацетат (11 г, 0,054 моль, 1,2 экв.) при 0°С. Полученную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 30 минут. Затем снова охлаждали до 0°С и добавляли трет-бутил-3-оксазетидин-1-карбоксилат (7 г, 0,041 моль, 1,0 экв.) в ТГФ (50 мл). Реакционную смесь вновь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в этих условиях в течение ночи. Затем реакцию разбавляли этилацетатом, промывали насыщенным водным раствором NaHCO₃, водой и насыщенным водным раствором NaCl. Органическую фазу отделяли, сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя смесью этилацетата в гексане 0→10%. Выход 2-9 г (92%), прозрачное масло. Спектральные данные соединения 2 соответствовали литературным данным: ¹Н NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 5.74 (дд, J=4.5, 2.2 Hz, 1Н), 4.80 (дд, J=6.3, 2.9 Hz, 2H), 4.57 (дт, J=5.3, 2.7 Hz, 2H), 4.31 - 4.02 (м, 2H), 1.45 (с, 9H), 1.26 (т, J=7.1 Hz, 3H); LCMS (ESI): m/z рассчитанный для C₂₁H₃₀N₂O₄ (M+H), 242.3; обнаруженный 242.2.

К раствору соединения 2 (5 г, 20,75 ммоль, 1 экв.) и LiF (2,15 г, 83 ммоль, 4 экв.) в ацетонитриле добавляли (метоксиметил)-1-фенил-N-(триметилсилилметил)метанамин (6,25 г, 25 ммоль, 1,2 экв.). Полученную смесь перемешивали при 60°С в течение ночи. Растворитель удаляли в вакууме и остаток растворяли в этилацетате (50 мл). Раствор промывали насыщенным раствором лимонной кислоты (3 × 25 мл). Объединенные водные фазы экстрагировали этилацетатом (2×100 мл). рН водной фазы доводили до 8 с помощью насыщенного водного раствора К₂СО₃ и экстрагировали этилацетатом (2×100 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме, получая 4,3 г (56%) указанного в заголовке продукта в виде прозрачного масла. Этот продукт использовали на последующих стадиях без дополнительной очистки. Спектральные данные соединения 3 соответствовали литературным данным: ¹HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 7.46 -7.14 (м, 5Н), 4.22 - 4.00 (m, 2Н), 3.94 (дд, J=16.6, 8.4 Hz, 2Н), 3.78-3.51 (м, 5Н), 3.12 (т, J=7.6 Hz, 1Н), 2.83 - 2.66 (м, 4Н), 1.36 (с, 9Н), 1.19 (т, J=7.1 Hz, 3Н); LCMS (ESI): m/z рассчитанный для (М+Н⁺), 375.5; обнаруженный, 375.4.

6-Бензил-2-(трет-6утил)-8-(4-метил-4Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан-2-карбоксилат(5)

К раствору 3 (3 г, 8 ммоль) в этаноле (25 мл) добавляли N₂H₄ (64% водный раствор, 1 мл). Реакционную смесь перемешивали при кипении с обратным холодильником в течение 8 часов. Затем реакцию охлаждали до комнатной температуры и концентрировали в вакууме с получением соединения 4 2,8 г, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

К раствору соединения 4 (2 г, 5,5 ммоль, 1 экв.) в этаноле (25 мл) по каплям добавляли CH₃NCS (0,5 г, 6,8 ммоль, 1,25 экв.) и полученную смесь перемешивали при кипении с обратным холодильником в течение 2 часов. Затем добавляли насыщенный водный раствор К₂СО₃ (5 мл) и продолжали перемешивать при кипении с обратным холодильником в течение 8 часов. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, остаток растворяли в воде (25 мл), полученный раствор подкисляли до рН 7 добавлением 5% водного раствора HCl. Образовавшийся осадок отфильтровывали и растворяли в этаноле (25 мл) и добавляли суспензию свежеприготовленного никеля Ренея в минимальном количестве этанола. Смесь интенсивно перемешивали при кипении с обратным холодильником в течение 12 ч. При охлаждении до комнатной температуры, реакционную смесь фильтровали через слой целита, фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя 10% метанол в CH₂Cl₂, с получением указанного в заголовке соединения (1,22 г, 58%) в виде прозрачного масла. ¹HNMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.08 (с, 1Н), 7.39 - 7.13 (м, 5Н), 4.01 - 3.84 (м, 2Н), 3.74 - 3.59 (м, 6Н), 3.53 (т, J=8.0 Hz, 1Н), 3.35 (д, J=9.5 Hz, 1H), 3.28 (т, J=8.8Hz, 1H), 3.12 (д, J=9.4 Hz, 1H), 2.97 - 2.86 (м, 1H), 2.80 (д, J=9.4 Hz, 1H), 1.37 (с, 9H); ¹³CNMR (75 MHz, CDCl₃) δ 156.25, 154.24, 144.60, 138.35, 128.65, 128.34, 127.19, 79.74, 64.86, 59.57, 58.88, 43.59, 42.08, 30.78, 28.23; HRMS (ESI) m/z рассчитанный для C₂₁H₃₀N₅O₂ [M+H⁺] 384.2399, обнаруженный 384.2405.

2-(трет-Бутил)-6-(метилсульфонил)-8-(4-метил-4Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан-2-карбоксилат (6)

К раствору соединения 5 (0,46 г, 1.1 ммоль) в 25 мл этанола добавляли 0.1 г 10% Pd/C и гидрировали в автоклаве при начальном давлении Н₂ 100 атм при комнатной температуре 12 часов. Затем реакционную массу фильтровали через слой целита, фильтрат упаривали, остаток растворяли в CH₂Cl₂ (10 мл) по каплям добавляли Et₃N (0,14 г, 1,37 ммоль, 1,25 экв.). Смесь охлаждали до 0°С и прикапывали мезилхлорид (0,16 г, 1,37 ммоль, 1,25 экв.). После перемешивания смеси в течение ночи ее промывали 10% водным раствором К₂СО₃, насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя 10% смесь метанола в CH₂Cl₂, с получением указанного в заголовке соединения (0,22 г, 53%) в виде прозрачного масла. ¹HNMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.11 (с, 1Н), 3.04-3.95 (м, 2Н), 3.91-3.75 (м, 4Н), 3.64-3.52 (м, 2Н), 1.40 (s, 9H). ¹³CNMR (75 MHz, CDCl₃) δ 156.03, 152.70, 144.60, 80.13, 61.23, 55.73, 53.35, 51.38, 43.74, 41.23, 35.65, 30.95, 28.20; HRMS (ESI) m/z рассчитанный для C₁₅H₂₆N₅O₄S [M+H⁺] 372.1705, обнаруженный 372.1701.

6-(Метилсульфонил)-8-(4-метил-4Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан(7)

К раствору 5-нитрофурановой кислоты (75 мг, 0,47 ммоль) в ДМФА (3 мл) добавляли карбонилдиимидазол (97 мг, 0,6 ммоль) при 0°С и раствор перемешивали в течение 1 часа.

К раствору соединения 6 (0,22 г, 0,57 ммоль) в CH₂Cl₂ (5 мл) при 0°С добавляли трифторуксусную кислоту (1 мл) и продолжали перемешивание в течение 1 часа. Раствор концентрировали в вакууме, поддерживая температуру бани ниже 30°С. Остаток растворяли в ДМФА (3 мл), добавляли по каплям триэтиламин (0,19 г, 1,9 ммоль) и после 30-минутного перемешивания раствор добавляли к раствору имидазолида 5-нитрофурановой кислоты, полученному, как описано выше. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, выливали в воду (25 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×20 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным водным раствором NaCl, сушили над безводным Na₂SO₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, используя 10% смесь метанола в CH₂Cl₂, с получением указанного в заголовке соединения.

Выход 138 мг (56%), белое твердое вещество, t_пл.=180-182°С. ¹HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) смесь ротамеров δ 8.44 (с, 1H), 7.78 (д, J=3.9 Hz, 1Н), 7.73 (д, J=3.9 Hz, 1H), 7.30 (т, J=4.1 Hz, 1H), 4.57 (кв, J=9.5 Hz, 2H), 4.21 -3.84 (м, 5H), 3.84 - 3.58 (м, 6H), 3.56 - 3.37 (м, 1H), 2.85 (д, J=9.7 Hz, 3H); ¹³CNMR (75 MHz, DMSO-d₆) смесь ротамеров, δ 156.67, 152.31, 151.83, 147.80, 147.70, 145.65, 117.39, 113.50, 113.45, 62.50, 59.36, 57.62, 56.55, 55.27, 53.97, 51.20, 51.05, 44.12, 43.99, 34.59, 34.52, 30.92.; HRMS (ESI) m/z рассчитанный для C₁₅H₁₉N₆O₆S [M+H⁺] 411.1086, обнаруженный 411.1091.

Пример 2. Противотуберкулезная активность соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октана формулы 1 (исследование in vitro)

Исследование антимикобактериальной активности проводили методом двукратных серийных микроразведений в жидкой синтетической среде Миддлбрука (Middlebrook 7Н9 BrothBase, Sigma-Aldrich, кат. №М0178) с 10% ростовой добавки OADC (BBL Middlebrook OADC Enrichment, BectonDickinson, кат. №245116) в 96-луночном планшете с индикацией роста микобактерий с помощью 0,01% резазурина (Resazurin sodium salt, Sigma, кат. №R7017) (метод REMA - Resazurin Microdilution Assay; [Martin A., Camacho M., Portaels F., Palomino J.C. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: rapid, simple, and inexpensive method. Antimicrob. Agents Chemother. 2003. 47 (11). P. 3616-3619].

В качестве тест-штаммов использовали:

1) международный стандартный тест-штамм Mycobacterium tuberculosis H₃₇Rv - чувствительный к противотуберкулезным препаратам (ТВС # 1/47, источник - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, 1976 г., получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России).

2) 4 клинических штамма Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и различными сочетаниями мутаций в генах rpoB (резистентность к рифампицину), katG, inhA, ahpC (устойчивость к изониазиду) из коллекции ФГБУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Минздрава России:

- штаммы 4542 (SIT266) и 7074 (SIT252) Евро-Американской линии (Lineage 4), генотип Latin-American Mediterranean (LAM):

- штаммы 396y (SIT1) и 6691 (SIT269) Восточно-Азиатской линии (Lineage 2) генотип Beijing, сублиния earlyancient Beijing RD181-intact.

Исходные растворы тестируемого соединения с концентрацией 10 мг/мл в диметилсульфоксиде доводили до концентрации 10 мкг/мл бульоном Миддлбрука 7Н с ростовой добавкой OADC. Растворы исследуемых веществ вносили в 96-луночные стерильные планшеты и производили последовательное двукратное разведение от 100 до 0.4 мкг/мл и от 1,0 до 0,004 мкг/мл. Во все лунки вносили рабочие суспензии М. tuberculosis H37Rv или клинических штаммов МБТ в объеме 100 мкл, кроме: ряд 10 - контроль суспензии МБТ, ряд 11 - контроль роста суспензии МБТ, разведенной в 100 раз (1% контроль); ряд 12 - контроль питательной среды/«бланк» (200 мкл). После чего планшеты инкубировали в течение 7 дней в термостате при температуре +35°С. На 7 сутки инкубации во все лунки добавляли по 30 мкл водного раствора резазурина с концентрацией 0.01%. Планшеты повторно инкубировали 18 ч при +35°С. Рост микобактерий регистрировали визуально по изменению цвета индикатора резазурина (с голубого на розовый). Величину минимальной ингибирующей концентрация (МИК) вычисляли как средние значения интенсивности свечения индикатора роста (резаруфина, в который превращается резазурин при воздействии комплекса редуктаз микроорганизмов).

В качестве кривой «доза-эффект» использовалась стандартная для биохимических и биомедицинских исследований [Motulsky H., Christopoulos A. Fittingmodels to biological data usinglinear and nonlinear regression: apractical guide to curvefitting. Oxford University Press, 2004] функция Хилла

с четырьмя параметрами: b₁ и b₂ задают, соответственно, верхнюю и нижнюю асимптоты кривой отклика построенной регрессией непосредственно экспериментальных данных (в силу экспериментальной неопределенности данных они могут отличаться от 0 и 1), b₃=IC₅₀ - концентрация, при которой кривая ингибирования принимает половинное значение между асимптотами; b₄ - феноменологический степенной показатель функции Хилла. Применимость данного подхода для нахождения МИК в резазуриновом тесте с использованием данных о флуоресценции резоруфина была установлена ранее [Postnikov Е.В., Lavrova A.I. Statistical features of REMA data of antimycobacterial drug screening and determining the minimal inhibitory concentration. 2021 6th International Conference on Intelligent Informatics and Biomedical Sciences (ICIIBMS). IEEE, 2021. P. 107-108].

В подходе данной работы за значение МИК принимается концентрация, соответствующая увеличению отклика на ¼ расстояния между асимптотами кривой Хилла, полученной нелинейной регрессией (на основе алгоритма Левенберга-Марквардта), что соответствует бинарному характеру классифицирующего метода и характерному масштабу медианного отклонения данных. Для функции Хилла с известными параметрами это значение находится аналитически как

Результаты определения МИК соединения формулы 1 для стандартного штамма M.tuberculosis H₃₇Rv и лекарственно устойчивых штаммов М. tuberculosis представлены в таблице 1 и фиг. 1-5.

Как видно из представленных в таблице 1 данных, тестируемое соединения формулы 1 проявляет высокое ингибирующее действие в отношении как чувствительного штамма М. tuberculosis H37RV, так и всех клинических штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, наиболее ярко выраженное в отношении штаммов с генотипом (Beijing 396у и 6691).

Пример 3. Исследование цитотоксичности соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октана (in vitro)

Оценка цитотоксичности соединения формулы I проведена на клеточной линии Vero (АТСС CCL-81) при помощи метилтетразолиевого метода (МТТ) [Mosmann Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 1983. Dec 16; 65(1-2):55-63.]. Клетки (10 тыс. клеток в лунке) культивировали в 90 мкл среды α-МЕМ в стандартных условиях в 96-луночном культуральном планшете в течение 16-24 часов до формирования монослоя. Готовили серию трехкратных разведений тестируемого соединения от 300 до 3,7 мкг/мл, клетки промывали средой MEM, далее вносили по 100 мкл раствора в лунки планшетов и инкубировали 48 часов при 36°С в атмосфере 5% СО₂. По истечении этого срокасреду с раствором тестируемого соединения заменяли на чистую среду α-МЕМ (100 мкл на лунку), содержащую 0,5 мг/мл 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида. Клетки инкубировали при 36°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 2 ч, затем промывали в течение 5 минут физиологическим раствором. Осадок растворяли в 100 мкл ДМСО на лунку. Оптическую плотность измеряли с помощью планшетного анализатора Multiscan FC (ThermoScientific) при длине волны 540 нм.

Процент жизнеспособных клеток в лунке вычисляли по формуле:

где V - процент жизнеспособных клеток, ODd и ODc - оптическая плотность в лунках с препаратом и в контроле клеток без препарата, соответственно. На основании полученных данных рассчитывали 50% цитотоксическую концентрацию (СС₅₀), т.е. концентрацию соединения, снижающую оптическую плотность в лунках вдвое по сравнению с контрольными клетками без препаратов. Расчет СС₅₀ проводили при помощи пакета программ GraphPadPrism 6.01 с использованием расчетной опции «нелинейная регрессия, 4-параметрическое уравнение».

Согласно полученным данным, значение СС₅₀ для тестируемого соединения составило больше 300 мкг/мл, что свидетельствует об отсутствии цитотоксического эффекта.

Пример 4. Исследование острой токсичности соединения 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октана формулы 1на мышах линии C57black/6

Исследование острой токсичности соединения проводилось на 50 мышах-самцах линии C57black/6 (6-8 недель, 22-25 г), полученных из питомника "Андреевка" - филиала ФГБУН "Научный центр биомедицинских технологий" ФМБА. Животные содержались в условиях сертифицированного вивария ФГБУ "СПб НИИФ» Минздрава России в клетки системы NexGenMouse IVC Cage&Rack со встроенной системой вентиляции и кондиционирования воздуха (HVAC) по 5 особей при свободном доступе к воде и пище и естественной смене светового режима.

Диапазон исследуемых доз составил 100-3000 мг/кг, интервал между дозами составил 500 мг/кг, каждую дозу исследовали на 5 особях. Использовалось однократное внутрибрюшинное введение свежеприготовленных растворов с применением ТВИН-80. Контрольные животные получали аналогичные объемы стерильной дистиллированной воды. Период наблюдения составил 14 дней. Регистрируемые показатели: летальность, время гибели, симптоматика отравления, ежедневное наблюдение общего состояния и поведения, взвешивание до введения, на 7 и 14 дни наблюдения, объемы потребления корма и воды, вскрытие и макроскопическое исследование всех погибавших и выживших животных в конце исследования (эвтаназия осуществлялась передозировкой эфира).

Расчет ЛД₅₀ производили по методу Кербера [Методы экспериментальной медицины (Практическое руководство) / под редакцией Г.Н. Першина. Москва: Медицина, 1971.] по формуле:

где z - половина суммы числа животных, погибших от двух последующих доз; d- интервал между дозами; m - число животных на каждую дозу; ∑ - сумма

Обобщая данные по исследованию острой токсичности, необходимо отметить, что величина ЛД₅₀ тестируемого соединения составила 2350 мг/кг. Гибель животных при внутрибрюшинном введении смертельных доз (более 2500 мг/кг) наблюдалась в течение 1-2 дней от момента введения при явлениях гиперсаливации, одышки, заторможенности, вялости, оглушения, кратковременных судорог в атональной стадии и паралича. Вскрытие погибших мышей выявило венозное полнокровие внутренних органов, субплевральные и субдуральные кровоизлияния. У остальных экспериментальных животных на дозах менее 1500 мг/кг лишь в первые 2-3 часа отмечались заторможенность, вялость. В остальные дни общее состояние и поведение экспериментальных животных не отличались от контрольной группы. На вскрытии - без особенностей. Состояние переживших острую интоксикацию животных свидетельствует о хорошей переносимости тестируемого соединения.

Результаты токсикометрии, данные некропсии и наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационном периоде острого отравления позволяют отнести тестируемое соединение к V классу - практически не токсично [Hodge Н. et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimor. 1975, 427p.].

Таким образом, соединение 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4] октан формулы 1 обладает выраженной противотуберкулезной активностью in vitro в отношении чувствительного и клинических лекарственно-устойчивых штаммов М. tuberculosis, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью, не оказывает цитотоксического действия in vitro. Величина ЛД₅₀ (2350 мг/кг) и хорошая переносимость при внутрибрюшинном введении мышам линии C57black/6 позволяет отнести тестируемое соединение к практически безвредным, что представляется перспективным для применения в медицинской практике.

Изобретение относится к области органической химии и медицины, а именно к индивидуальному 8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октану формулы 1. Соединение формулы 1 обладает противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза. Изобретение также относится к способу получения указанного соединения. Технический результат заключается в получении соединения формулы 1 с подтвержденной in vitro противотуберкулезной активностью в отношении стандартного и клинических штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью, не проявляющего цитотоксического действия в отношении клеток макроорганизма и отличающегося хорошей переносимостью и безвредностью. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 4 пр.

1. 8-(4-Метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан формулы 1, обладающий противотуберкулезной активностью в отношении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью

.

2. Способ получения соединения по п. 1, заключающийся во взаимодействии в сухом диметилформамиде имидазолида 5-нитрофуран-2-карбоновой кислоты и спироциклического амина, получаемого непосредственно перед реакцией обработкой 2-(трет-бутил)-6-(метилсульфонил)-8-(4-метил-4H-1,2,4-триазол-3-ил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан-2-карбоксилата раствором три-фторуксусной кислоты в сухом хлористом метилене при температуре 0°С.