Способ подготовки марит трематод для морфологического исследования Российский патент 2024 года по МПК G01N1/30 G01N33/48 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и биологии и может быть использовано при проведении морфологических исследований марит трематод.

В настоящее время из области науки известны способы окраски трематод квасцовым кармином и кармином по Блажину, приведенные в руководствах по микроскопической технике (A.M. Петрова и В.Г. Гагарина, 1953, Г.И. Роскина и Л.В. Левинсона, 1957). Оба способа являются трудоемкими и не позволяют получить качественную окраску исследуемых объектов.

В качестве прототипа взят метод окраски и изготовления гельминтологических препаратов (Ромашов Б.В., Хицова Л.Н., Труфанова Е.И., Ромашова Н.Б. Методика гельминтологических исследований позвоночных животных: Учебно-методическое пособие - Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 2003. - 35 с, стр. 12-14), заключающийся в следующем. Промытых (отмоченных) предварительно червей помещают в раствор уксуснокислого кармина на 7-20 минут, затем споласкивают в дистиллированной воде. Контроль окраски осуществляют, наблюдая в стереоскопический микроскоп. При перекрашивании гельминтов их помещают в солянокислый спирт (на 100 мл 70% спирта добавляют 2-3 капли концентрированной соляной кислоты) для удаления избытка красителя. Далее червей повторно промывают в дистиллированной воде и проводят по спиртам возрастающей крепости: 70% спирт 7 минут дважды, 80% спирт 7 минут дважды, 90% спирт 7 минут дважды, 96% спирт 7 минут дважды. Обезвоженных червей просветляют. Для этого из 96% спирта червей переводят в сосуд, наполненный двумя компонентами - 96%» спирт + диметилфталат. При этом спирт, как более легкий, образует верхний слой, а диметилфталат - нижний. Помещенные в эту «смесь» черви сначала находятся (зависают) в 96% спирте на границе двух сред, что визуально хорошо заметно, а через некоторое время (в течение 1-2 часов) постепенно перемещаются в диметилфталат. После этого червей можно перенести в чистый диметилфталат, в котором, они могут храниться продолжительное время. Для сохранения целостности и дальнейшего исследования окрашенных гельминтов заключают в бальзам, для изготовления постоянных препаратов.

Данный метод является общепринятым, но имеет несколько весомых недостатков. Окраску по данному методу рекомендуют производить в часовом стекле, что неудобно на практике. Сложность возникает при проводке трематод по всей схеме окрашивания. Плоских червей из раствора в раствор переносят либо препаровальными иглами, либо кисточкой, иногда даже используют очин контурных перьев птиц. Данная манипуляция отличается большой трудоемкостью и растягивается по времени выполнения. При окрашивании сразу нескольких особей невозможно выдержать одинаковое время экспозиции для всех объектов окрашивания, так как их невозможно всех одновременно перенести в следующий по ходу методики раствор. При этом за счет разницы во времени нахождения в растворах окраска разных особей получается неравномерной (часть недокрашена, часть хорошо окрашена, часть перекрашена, т.е. окрашена избыточно). Это приводит к недостаточно четкой визуализации структуры и в последующем к недостоверной морфологической оценке исследуемых гельминтов. Недокрашенных особей приходится вновь окрашивать. При этом расход красителя, реактивов и время на проведение исследования нецелесообразно увеличиваются, принимая во внимание, что, например, количество одновременно окрашиваемых трематод ограничено четырьмя-шестью особями. Перекрашенных особей необходимо отмывать от избытка красителя путем помещения их в солянокислый спирт (на 100 мл 70% спирта добавляют 2-3 капли концентрированной соляной кислоты). Недостатком данного метода является также то, что неудобно осуществлять контроль окрашивания в часовом стекле. При неаккуратном движении во время переноса стекла до микроскопа можно пролить реактив и потерять объекты исследования.

Изобретение решает задачу упрощения и повышения эффективности способа подготовки марит трематод для морфологического исследования за счет достижения следующего технического результата: сокращение количества и времени проведения операций способа.

Для этого в способе подготовки марит трематод для морфологического исследования, включающем окрашивание в растворе уксуснокислого кармина, промывку водой, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, осветление в диметилфталате, согласно изобретению, все операции осуществляют в тиглях Гуча, а обезвоживание исследуемого материала, окрашенного в растворе уксуснокислого кармина, начинают проводить непосредственно после промывки водой.

Сущность изобретения поясняется графическими материалами. На фиг.1 приведены последовательные этапы способа подготовки марит трематод для морфологического исследования, на фиг.2 - пример окрашивания марит трематод Opisthorchis felineus по способу-прототипу, на фиг.3 - пример окрашивания марит трематод Opisthorchis felineus по предлагаемому способу, на фиг.4 - фото извлечения трематод из уксуснокислого кармина с помощью тигля Гуча, на фиг.5 - фото помещения трематод в диметилфталат после прохождения всех этапов с помощью тигля Гуча.

Способ осуществляют следующим образом (фиг.1).

Предварительно фиксированных в 70% спирте червей перед окраской промывают в воде. Если окрашивают нефиксированных червей, то после извлечения из органов хозяина, их отмывают (отмачивают) в воде в течение нескольких часов. При этом наилучшая окраска достигается при окрашивании недавно извлеченных из органа (не фиксированных) червей.

Тотальное окрашивание марит трематод проводят в уксуснокислом кармине: на 100 мл 45% уксусной кислоты добавлено 2 г кармина, полученный раствор насыщен путем кипячения на медленном огне в течение 1 часа и профильтрован (Ивашкин В. М., Контримавичус В. Н., Назарова Н. С.Методы сбора и изучения гельминтов наземных млекопитающих. М.: Наука, 1971. 124 с). Данный краситель позволяет в полной мере прокрасить все структуры гельминта, не повреждая его, и в последующем четко рассмотреть строение объекта. Время окраски плоских червей колеблется от 7 до 20 минут, в зависимости от вида, а, соответственно, и величины особи. Для окрашивания и осуществления всех последующих операций исследуемый материал помещают в тигель Гуча. Это позволяет перемещать мариты трематод, не перекладывая их на всех этапах осуществления способа из одной емкости в другую, что упрощает и ускоряет процесс подготовки к исследованию.

Для реализации способа необходимо следующее.

1. Использовать для окрашивания вместо часового стекла стаканчик для взвешивания высокий СВ 34/12 мм (d-40, h-65 мм) со стеклянной крышкой ГОСТ 25336-82, изготовленный из химико-лабораторного стекла по ГОСТ 21400-75, объемом не менее 50 мл. Химико-лабораторное стекло не вступает в реакцию с используемыми веществами, а стеклянная притертая крышка предотвращает испарение и загрязнение окрашивающего раствора и спиртов.

2. Промытых (отмоченных) предварительно марит трематод поместить в тигель Гуча №1 (наибольший наружный диаметр, D 25 мм; диаметр дна, d 14 мм; высота 32 мм; диаметр отверстий 0,85 мм; число отверстий, не менее 26) или тигель Гуча №2 (наибольший наружный диаметр, D 35 мм; диаметр дна, d 18 мм; высота 43 мм; диаметр отверстий 1 мм; число отверстий, не менее 37), изготавливаемых из технического, химически инертного, высокотемпературного фарфора, соответствующего требованиям ГОСТ 9147-80. Затем необходимо провести погружение тигля в стаканчик для взвешивания высокий СВ 34/12 мм (d-40, h-65 мм), заполненный 25 мл раствора уксуснокислого кармина, закрыть притертой крышкой и оставить на заранее выбранное время экспозиции. Время экспозиции в уксуснокислом кармине колеблется от 7 до 20 минут и зависит от вида трематод, которые отличаются размером марит.

3. Далее следует извлечь тигель Гуча из раствора уксуснокислого кармина с находящимися в нем маритами трематод и продолжить осуществлять дальнейшие этапы окрашивания. Не вынимая трематод из тигля, сполоснуть в дистиллированной воде, затем выполнить проводку по спиртам восходящей крепости так же, не извлекая трематод из тигля.

Благодаря отверстиям тигля раствор уксуснокислого кармина, а также дистиллированная вода и растворы спиртов в возрастающей концентрации свободно проникают внутрь, равномерно и своевременно обеспечивая все этапы окрашивания трематод. Трематоды имеют большие размеры, чем отверстия тигля, не покидают его и эффективно окрашиваются.

Таким образом, предложенный способ позволяет сэкономить время при переносе трематод из емкости в емкость и при этом добиться равномерного прокрашивания внутренней структуры всех особей.

Примеры осуществления способа

Эффективность способа подтверждена проведенными научными исследованиями. Опыт проводился в лаборатории ГНУ «Всероссийский НИВИ патологии, фармакологии и терапии». Для эксперимента были использованы мариты трематод вида Opisthorchis felineus, полученные из желчных протоков печени взрослой собаки.

Пример 1. Подготовка к морфологическому исследованию 20 марит трематод по способу-прототипу (фиг.2). Окрашивание проводили в часовом стекле. Степень и интенсивность прокрашивания варьировали из-за неодновременного перемещения марит трематод по растворам. При окрашивании в часовом стекле окрашивающий раствор уксуснокислого кармина в определенной мере загрязняется, в результате чего необходимо каждый раз применять новый раствор для исключения погрешностей в окрашивании. Раствор уксуснокислого кармина был заменен 4 раза, чтобы не потерять качество окрашивания. Расход раствора уксуснокислого кармина составил 64 мл. При окрашивании в часовом стекле происходит испарение уксусной кислоты из раствора уксуснокислого кармина (чем больше площадь часового стекла, тем большее количество вещества испаряется), снижается протравливающая способность и степень проникновения красителя в мариты трематод. Время окрашивания составило 205 минут 45 секунд. Далее промыли окрашенных гельминтов в дистиллированной воде. Для этого потребовалось 55 мл воды, дважды сменяя воду.

При окрашивании в часовом стекле потребовалось поместить марит трематод в солянокислый спирт под контролем микроскопа, т.к. окрашивание марит произошло неравномерно из-за разницы времени экспозиции отдельных экземпляров. Далее марит трематод повторно промыли в дистиллированной воде. Расход раствора солянокислого спирта составил 23 мл, дистиллированной воды 50 мл.

По способу-прототипу расход спирта составил: 70% раствор спирта -30 мл и 30 мл; 80% раствор спирта - 30 мл и 30 мл; 90% раствор спирта - 30 мл и 30 мл; 96% раствор спирта - 30 мл и 30 мл. Расход растворов - 96% спирт 25 мл и диметилфталат 25 мл. Общий расход спиртов разной крепости равен 265 мл.

По способу-прототипу повторно использовать растворы спиртов нецелесообразно из-за их загрязнения, а также активного испарения.

Пример 2. Подготовка к морфологическому исследованию 20 марит трематод по предлагаемому способу (фиг.3). Время окрашивания в тигле Гуча составило 126 минут 30 секунд, что на 79 минут 15 секунд меньше, чем в примере 1. Степень и интенсивность прокрашивания у всех особей была одинаковой, так как бюкс после помещения в него тигля Гуча герметично закрыт притертой крышкой на время экспозиции. Следовательно, низка вероятность загрязнения раствора и погрешности при окрашивании последующих образцов марит трематод Opisthorchis felineus отсутствуют.

После извлечения тигля Гуча с окрашенными маритами трематод можно сразу погружать следующий тигель Гуча с новой партией марит трематод в тот же окрашивающий раствор. При окрашивании предлагаемым способом уксусная кислота не имеет возможности испаряться, соответственно не снижается концентрация активного вещества. Качество окрашивающего раствора не снижается, он может продолжительное время храниться в стаканчике для взвешивания высоком СВ 34/12 мм (d-40, h-65 мм), закрытом притертой крышкой. Расход раствора уксуснокислого кармина равен 25 мл. После проведения последовательного окрашивания в тигле Гуча партии в количестве 20 экземпляров за раз, объем окрашивающей жидкости изменился незначительно и составил после замера 24,5 мл. Далее промыли окрашенных гельминтов в дистиллированной воде. Расход воды составил 25 мл и после использования вода требует замены, т.к. приобретает розоватый цвет. Это условие необходимо чтобы не потерять качество окрашивания и не окрасить следующий по методике 70% раствор спирта, не снизить тем самым его качество. При окрашивании все экземпляры трематод равномерно окрасились, и были далее помещены в раствор 70% спирта на 7 минут. В солянокислом спиртовом растворе необходимости не было, что упростило способ и сократило время его осуществления.

По предлагаемому способу расход спирта составил: 70% раствор спирта - 20 мл и 20 мл; 80% раствор спирта - 20 мл и 20 мл; 90% раствор спирта - 20 мл и 20 мл; 96% раствор спирта - 20 мл и 20 мл. Расход растворов -96% спирт 20 мл и диметилфталат 20 мл. Общий расход спиртов разной крепости равен 180 мл. Общий расход всех реактивов в мл: 250 мл.

После проведения окрашивания по предлагаемому способу реактивы можно использовать не единожды, благодаря притертой крышке спирты не испаряются, благодаря быстрому переносу марит трематод с помощью тигля Гуча растворы не загрязняются.

Для приготовления постоянных препаратов окрашенных марит трематод промокают фильтровальной бумагой, помещают на предметное стекло, заливают канадским бальзамом и накрывают покровным стеклом.

Предлагаемый способ прост в применении, позволяет снизить время и трудоемкость при проведении диагностики, сократить расход красителя и других реагентов и может быть осуществлен практикующим врачами для дифференциальной диагностики трематод в лаборатории.

Способ позволяет исследователю в последующем четко рассмотреть структуру и строение объекта, приготовить наглядные постоянные и временные препараты, а самое главное, достоверно классифицировать окрашенную особь.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ подготовки марит трематод для морфологического исследования, включающий окрашивание в растворе уксуснокислого кармина, промывку водой, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, осветление в диметилфталате; при этом все операции осуществляют в тиглях Гуча, а обезвоживание исследуемого материала, окрашенного в растворе уксуснокислого кармина, начинают проводить непосредственно после промывки водой. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов подготовки марит трематод для морфологического исследования и классификации окрашенной особи. 5 ил., 1 пр.

Способ подготовки марит трематод для морфологического исследования, включающий окрашивание в растворе уксуснокислого кармина, промывку водой, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, осветление в диметилфталате, отличающийся тем, что все операции осуществляют в тиглях Гуча, а обезвоживание исследуемого материала, окрашенного в растворе уксуснокислого кармина, начинают проводить непосредственно после промывки водой.