Способ определения жизнеспособности яиц гельминтов Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 

00

ю

4 Изобретение относится к медицине, в частности к паразитологии. Известен способ определения жизнеспособности личинок гельминтов, заключающийся в том, что при определении жизнеспособности адолескариев парамфистоматид последние помещают в 0,4-0,6%-ный раствор сернистого натрия, приготовленного на 0,5-0,85/о-ном растворе NaCl, и жизнеспособными считают адолескариев, из которых эксцистировались личинки парамфистоматид 1 . Известный способ не позволяет определять жизнеспособность яиц трематод. Наиболее близким к предлагаемому является способ определения жизнеспособности яиц гельминтов, основанный на замещении красителей и заключающийся в том, что яйца гельминта вначале подвергают окращиванию бриллианткрезилблау, а затем сафранином. При этом происходит замещение красителей и живые яйца приобретают красную окраску, а неживые становятся двухцветными: скорлупки красные, содержимое яйца-синее 2. Недостатком данного способа является низкя точность идентификации жизнеспособных яиц, так как определение проводится косвенным методом на основании плохо выраженных различий в окраске живых и погибщих яиц, к тому же эта разница в окрашивании исчезает через 30-40 мин. Цели изобретения - повыщение точности определения. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения жизнеспособности яиц гельминтов, заключающемся в прокращивании их в водной среде красителем с последующим микроскопированием и подсчитыванием, яйца гельминтов предварительно охлаждают до 4-6°С, подсущивают, после чего заливают средой, содержащей 96°/о-ный этанол, краситель и 0,05 трмс-НС1 буфер в соотнощении (9-12) :(l-10):(78-90) при рН 8,5-9,5, далее нанесенные на предметное стекло яйца гельминтов в той же среде перед микроскопированием покачивают и жизнеспособность определяют по числу вышедщих мирацидиев. При этом в качестве красителя берут саф ранин или фуксин. Способ осуществляют следующим образом. Предварительно охлажденные до 4- 6°С и слегка подсущенные с помощью полоски фильтровальной бумаги яйца трематод (описторхисов, клонорхисов) заливают в центрифужной пробирке средой комнатной температуры, содержащей, ч.: 96%-ный этанол9-12 Краситель (маточный раствор)1 -10 0, грыс-НС1 буфер (рН 8,5-9,5)78-90 Пробирку слегка встряхивают, затем 0,1 мл (1-2 капли) среды со взвещенными яйцами переносят на предметное стекло и оставляют на 5-10 мин. Предметное стекло с каплей при этом необходимо слегка покачивать для создания слабых токов жидкости. Затем добавляют еще 0,1 мл среды и осторожно накрывают покровным стеклом. Препарат просматривают под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу выщедщих из яиц мирацидиев. Пример 1. Среду готовят из 9 ч. 96%-ного этанола, 1 ч насыщенного спиртового раствора фуксина, остальное (до 100 ч) 0,05/4 грыс-НС1 буфер, рН 9,5. Определение жизнеспособности яиц. Взвесь яиц в воде предварительно охлаждают в холодильнике до -f 4°С. В центрифужную пробирку пипеткой вносят 1 каплю взвеси, содержащей 100-500 яиц (меньщее их число может дать нерепрезентативные результаты, а большее затрудняет подсчет). Пробирку со взвесью яиц ставят в штатив на 3-5 мин для того, чтобы яйца опустились на дно. Полоской фильтровальной бумаги, опущенной в пробирку, осторожно отсасывают излишки воды и пастеровской пипеткой в пробирку с подсушенными таким образом яйцами добавляют 0,1 мл среды, встряхивают, пипеткой переносят на предметное стекло и оставляют на 10 мин, слегка покачивая. Затем добавляют еще 0,1 мл среды и осторожно накрывают покровным стеклом. Препарат просматривают под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении. Перечисленные операции занимают 20-25 мин, вместе с подсчетом вышедших мирацидиев 30-40 мин. Пример 2. Среду готовят из 12 ч 96%ного этанола, 10 ч маточного раствора сафранина (5 мг в 10 мл дистиллированной воды), остальное (до 100 ч) 0,05 ш трыс-НС1 буфер, рН 9,5. Определение жизнеспособности яиц проводят как в примере 1, но взвесь яиц в воде предварительно охлаждают до + 6°С. Пример 3. Среду готовят из 11 ч 96%ного этанола, 5 ч маточного раствора сафранина (5 мг в 10 мл дистиллированной воды), остальное (до 100 ч.) 0,05/ трис-НС1 буфер, рН 9,0. Определение жизнеспособности проводят как в примерах 1 и 2, но взвесь яиц в воде предварительно охлаждают до + 5°С. Испытание метода проводили на яйцах описторхисов (Opisthorchis felineus) и клонорхисов (Clonorchis sinensis), полученных из гельминтов при вскрытии спонтанно инвазированных кощек из очагов описторхоза (в Томской и Сумской областях) и клонорхоза (Хабаровский край) и экспериментально зараженных лабораторных животных (золотистых хомяков). Полученные таким образом яйца гельминтов в различное время (от нескольких часов до двух лет) и при различной температуре (от О до 25°С) содержались в воде.

Предлагаемый способ определения жизнеспособности яиц гельминтов (трематод, у которых выход личинок из яиц в естественных условиях происходит в организме промежуточного хозяина - пресноводного моллюска) основан на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимулирования его двигательной активности, что приводит к активному выходу мирацидиев из яиц в экспериментальных условиях.

Выход мирацидиев осуществляется при действии на яйца гельминтов среды в сочетании с рядом обязательных последовательных приемов: созданием перепада температур, подсушиванием взвеси яиц, созданием слабого тока жидкости в исследуемой капле. Основная функция среды - химическая активация железы вылупления мирацидиев. Все составные части среды подобраны экспериментально, изменение их соотношений сверх данных пределов ведет к резкому снижению выхода личинок. Добавляемый в среду краситель не несет основной функции в определении жизнеспособности яиц, а лишь облегчает нахождение и подсчет вышедших мирацидиев, поэтому можно использовать любой краситель, работающий в пределах рН 8,5-9,5, в частности взят сафранин и фуксин.

Предварительное охлаждение взвеси яиц до 4-6°С (как и другие указанные физические воздействия) дополнительно стимулирует активность железы вылупления мирацидия. Охлаждение яиц до

температуры ниже +4°С вызывает длительное торможение активности железы вылупления, что ведет к прекращению выхода личинок.

В таблице приведены результаты определения жизнеспособности яиц описторхисов, определенные известным и предлагаемым способами.

Более высокая точность определения по предлагаемому способу подтверждается

резким снижением статистической ошибки получаемых результатов. Кроме того, процент жизнеспособных яиц после 19 мес. хранения, определенный предлагаемым способом, соответствует норме, в то время как

определенный известным способом оказывается резко завышенным вследствие прокрашивания пустых скорлупок как живых объектов.

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЯИЦ ГЕЛЬМИНТОВ, заключающийся в прокрашивании их в водной среде красителем с последуюш,им микроскопированием и подсчитыванием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, яйца гельминтов предварительно охлаждают до 4-6°С, подсушивают, после чего заливают средой, содержащей 96%-ный этанол, краситель и 0,05 гр«с-НС1 буфер в соотношении

10-20 дней 19 мес.

52,0±21,3

75,0±1,2 75,0±12,0 12,8±0,7