ШТАММ BZR GV L-3 ВИРУСА ГРАНУЛЁЗА ЯБЛОННОЙ ПЛОДОЖОРКИ Cydia pomonella L., ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2024 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, энтомологии и защиты растений, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса гранулеза яблонной плодожорки Cydia pomonella L., 1758 (CpGV), являющейся опасным вредителем, повреждающим плоды яблони, груши, айвы и других плодовых культур.

Одной из основных причин снижения качества и количества получаемой сельскохозяйственной продукции является наличие насекомых-фитофагов. Обычно такие вредители имеют высокую численность популяции на протяжении всего вегетационного периода, что увеличивает частоту повреждений как несозревших плодов, так и плодов на стадии сбора урожая. Например, яблонная плодожорка при благоприятных для нее условиях способна повредить до 70% плодов яблони (Черкезова С.Р., 2019). Именно поэтому снижение численности фитофагов до сих пор актуальная проблема.

На современном этапе борьбу с насекомыми осуществляют с использованием инсектицидов. Наиболее распространены химические инсектициды, которые являются высокоэффективными и быстродействующими. Однако, инсектициды химической природы не могут защитить культуры в полной мере из-за высокой скорости выработки резистентности у вредителя к основным действующим компонентами препаратов. Кроме того, химические инсектициды, накапливаясь в продуктах питания и окружающей среде, оказывают негативное воздействие на здоровье человека и животных.

По сравнению с химическими инсектицидами, применение биологических средств защиты растений является способом рационального природопользования. К высокоэффективным и узконаправленным биоинсектицидам относят препараты на основе бакуловирусов насекомых. В отличии от химинсектицидов, направленных на полное истребление вредителя, вирусные биоинсектициды снижают численность вредителя до экономически безопасного уровня и не затрагивают большое количество нецелевых, в том числе полезных сопутствующих видов (Бондарчук Е.Ю., Асатурова A.M., Томашевич Н.С. и др., 2020). При своевременном и правильном применении биологическая эффективность вирусного инсектицида сопоставима с эффективностью химических препаратов, используемых в защите растений.

Известны химические инсектициды, используемые для борьбы с яблонной плодожоркой. Например, препараты «Альфацин, КЭ» (100 г/л, альфа-циперметрин), «Герольд, ВСК» (240 г/л, дифлубензурон), «Орбита Люкс, КЭ» (400+50 г/л, фенитротион + дельтаметрин) и другие (Государственный каталог пестицидов…, 2024). Преимуществом таких инсектицидов контактно-кишечного действия является высокая эффективность, при этом гибель вредителя может наступить спустя пару часов после обработки. Недостатком является то, что постоянное их применение может приводить не только к загрязнению агробиоценозов и гибели пчел, но и может быть причиной формирования резистентности у вредителей, против которых эти инсектициды применяются. К тому же инсектицидные компоненты способны накапливаться в почве, растениях, в других объектах окружающей среды, а главное в конечных продуктах, создавая угрозу для здоровья человека.

Известны биологические инсектициды для борьбы с яблонной плодожоркой на основе различных штаммов бактерий и/или грибов. Например, препараты «Инсетим, Ж» (2×10⁹ КОЕ/см³, Bacillus thuringiensis, subsp.Thuringiensis, ИПМ-1140), «Биостоп, Ж» (10⁹КОЕ/мл + 10⁸ КОЕ/мл + 10⁸ КОЕ/мл, Bacillus thuringiensis + Streptomyces sp.+Beauveria bassiana), «Биослип БВ, Ж» (1×10⁸ КОЕ/мл, Beauveria bassiana) и другие (Государственный каталог пестицидов…, 2024). Их преимуществом является безопасность и эффективность в отношении насекомых около 70%. Однако, в связи с морфологическими и биохимическими особенностями бактерий и грибов, составляющих основу инсектицидных препаратов, недостатком является применение только при температуре не выше +30°С и при наличии влаги (Ruiu I., 2018; Semenova Т. A., Dunaevsky, Y. Е., Beljakova, G. A. et al, 2020). Кроме того, их эффективность ниже, чем при использовании химических инсектицидов.

Согласно Государственному каталогу пестицидов, разрешенных к применению на территории РФ, биологических инсектицидов российского производства для борьбы с яблонной плодожоркой на основе штаммов вирусов насекомых нет. В 2017-2023 годах с различной периодичностью было разрешено к применению три биопрепарата: «ФермоВирин ЯП, СП» (3×10¹² гранул/г, GpGV, Германия), «Мадекс Твин, СК» (3×10¹³ гранул/л, CpGV isolat V22, Швейцария) и «Карповирусин, СК» (1×10¹³ гранул/л, CpGV isolat М, Бельгия) (Государственный каталог пестицидов…, 2017; 2018; 2019; 2020; 2021; 2022; 2023). На 03.05.2024 года возобновлено разрешение на применение препарата «Карповирусин, СК» (Государственный каталог пестицидов…, 2024). Необходимо подчеркнуть, что вирусные инсектициды обладают эффективностью в отношении целевых видов на уровне 95-97%, имеют накопительный эффект и способны встраиваться в агроценозы (Moore S., Kirkman W., Richards G. et al, 2015; Долженко Т.В., Долженко В.И., 2017; Государственный каталог…, 2024).

Наиболее близким аналогом (прототипом) из уровня техники является штамм BZR 14, выделенный на территории Российской Федерации и обладающий инсектицидной активностью в отношении яблонной плодожорки (Патент РФ №2744522, публ. 11.03.2021). Штамм депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия, г. Новосибирская обл., р. п. Кольцово, 630559) под регистрационным номером V - 986. Штамм BZR 14 выделен из инфицированных гусениц С.pomonella, собранных в яблонном саду учебно-опытного хозяйства "Кубань", г. Краснодар, ст.Елизаветинская. Стоит отметить, что природные популяции яблонной плодожорки также способны к выработке резистентности к препаратам на основе энтомопатогенных бакуловирусов, что снижает их эффективность (Sauer A.J., Fritsch, Е., Undorf-Spahn, K. et al., 2021). Именно поэтому необходим постоянный поиск новых высокоэффективных штаммов с энтомопатогенными свойствами в отношении насекомых-вредителей.

Технической задачей предлагаемого изобретения является выделение нового штамма вируса гранулеза С.pomonella с высокой инсектицидной активностью против гусениц яблонной плодожорки, который в перспективе может быть использован в качестве штамма-продуцента нового биопрепарата в целях расширения ассортимента биологических средств защиты растений против особо опасного вредителя плодовых культур - яблонной плодожорки.

Указанный технический результат достигается тем, что выделен и идентифицирован штамм BZR GV L-3, депонированный в биоресурсной коллекции Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр биологической защиты растений» «Государственная коллекция энтомоакарифагов и микроорганизмов» (БРК ФГБНУ ФНЦБЗР), Россия, г. Краснодар, 350039 под регистрационным номером BZR GV L-3. Впервые в России информация о частичных генетических последовательностях штамма BZR GV L-3 депонирована в National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank под номерами доступа OR651295 и OR651296.

Происхождение заявляемого штамма BZR GV Г-3. Штамм выделен на территории Краснодарского края, Россия из насекомых природной популяции С.pomonella, 1758 в 2010 году. Со времени выделения исходного изолята до времени патентования штамм BZR GV Г-3 последовательно прошел три пассажа на гусеницах природной популяции яблонной плодожорки путем заражения per os насекомых через питательный субстрат.

Идентификацию штамма осуществляли с использованием современных молекулярно-генетических методов, а также на основе сравнительной оценки формы, размеров и плавучей плотности вирусных гранул в водной вирусной суспензии и в полученном урожае после инкубации на целевом насекомом.

Морфологическое описание. Для молекулярно-генетической идентификации суммарную ДНК выделяли из водной вирусной суспензии методом осаждения на центрифуге с использованием набора PureLink™ Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen). Концентрацию ДНК определяли флуориметрически на приборе Qubit набором High Sensitivity. Для создания геномных библиотек использовали набор КАРА DNA Prep. Секвенирование проводили на приборе NextSeq550 пар но концевыми чтениями 2×150 п. н. согласно протоколу производителя. Выявлена двуспиральная ДНК. Геном имеет длину 123 362 пар оснований. Установлено наличие «инсектицидных» белков IAP, Cathepsin, ММР и Chitinase, что позволяет ему быть перспективным агентом для разработки биоинсектицидов на его основе. Изучение морфологии вирусных гранул проводили с помощью световой оптической микроскопии и с использованием компьютерных программ ZEN 2012, AxioVision Rel. 4.8. Для этого микроскопировали водную вирусную суспензию на предметном стекле. Размеры гранул субсферические, правильной формы, ∅ 0,6-2,1 мкм. Оптимальной культурой насекомых для культивирования штамма являются гусеницы средних возрастов природной популяции яблонной плодожорки.

Штамм обладает следующей репродукционной активностью: выход вируса составляет 5×10⁷ гранул/мл при его культивировании на гусеницах яблонной плодожорки 3-5 возраста.

Не патогенен для теплокровных животных. Высокопатогенен для гусениц яблонной плодожорки.

Культивирование вируса. Репродукцию вирусных гранул осуществляют путем заражения per os гусениц яблонной плодожорки через питательный субстрат. Инфицированных насекомых инкубируют при температуре +26°С, влажности воздуха 70% и фотопериоде 18:6 ч (день:ночь). Сбор наработанных личиночных эквивалентов штамма BZR GV L-3 проводят по мере гибели объектов. Состав искусственной питательной среды на 1 кг следующий: агар-агар - 12 г, кукурузная мука - 45 г, отруби пшеничные - 45 г, солодовые ростки - 54 г, соевая мука - 40 г, аскорбиновая кислота - 5,4 г, лимонная кислота - 4,5 г, сорбиновая кислота - 0,81 г, метилпарабен - 2,25 г, вода (разбавить до 1 кг разбавить) (Митрофанов В.Б., 1976).

Вирус инактивируется под действием УФ излучения и нагревания до +60-70°С.

Серологические свойства. Белки вирусных гранул являются антигенами, активирующими в клетках насекомого-хозяина активную репродукцию. При передаче другим насекомым штамма вируса в их организме образуются серологически идентичные вирусные вирионы.

Условия длительного хранения штамма. Лиофильное высушивание водной вирусной суспензии и дальнейшее хранение при температуре -70°С. Хранение на инфицированных высушенных насекомых при температуре 5-7°С. Хранение в виде водной вирусной суспензии в закрытой герметичной емкости при температуре 5-7°С.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Технология получения суспензии штамма BZR GV L-3 Технология получения вирусов гранулеза in vivo осуществляется по следующей схеме: сбор насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших/инфицированных насекомых, наработка водной вирусной суспензии.

В качестве целевого насекомого для наработки вирусосодержащей биомассы штамма CpGV используют гусениц яблонной плодожорки 2-5 возраста. Для этого активно питающихся особей собирают в садовых насаждениях. Инокуляцию насекомых проводят методом поверхностного заражения рациона. Для этого в пластиковые секционные планшеты «Falcon, SPL Lifesciences» помещают питательный субстрат по 1 г/лунку с добавлением 0,03 мл водной вирусной суспензии. Затем в лунку помещают гусениц по 1 шт./лунку. Инкубацию проводят в климатической камере при температуре +26°С, влажности воздуха 70% и фотопериоде 18:6 ч (день:ночь) в течение 10-12 дней (Голуб В.Б., Цуриков М.Н., Прокин А.А., 2012; Graillot В., Blachere-Fopez С, Besse S. et al., 2019).

Для получения водной вирусной суспензии после гибели насекомых собирают в стеклянную посуду и гомогенизируют. Полученный гомогенат фильтруют от остатков крупных частиц кутикулы и/или хитина, добавляя воду из расчета 1 мл воды на 1 личиночный эквивалент насекомого. Полученный фильтрат помещают в центрифужную 50 мл пробирку и доводят дистиллятом до метки. Процедуру центрифугирования осуществляют при 8000 об/мин в течение 15 мин. Затем надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют в 30-40 мл дистиллированной воды. При необходимости циклы центрифугирования и ресуспендирования проводят несколько раз до получения однородной непрозрачной жидкости с окраской от светло бежевого до коричневого (водная вирусная суспензия) (Колосов А.В., 2011). Подсчет титра осуществляют с использованием камеры Горяева при увеличении ×400. Титр полученной суспензии составляет не менее 1×10⁷ гранул/мл.

Пример 2. Сравнительные данные инсектицидной активности заявляемого штамма BZR GV F-3 со штаммом-прототипом и эталоном.

В процессе исследования измеряли и сравнивали инсектицидную активность штамма BZR GV F-3, штамма-прототипа BZR 14 и эталона (коммерческий препарат «Мадекс Твил, СК») в отношении гусениц природной популяции яблонной плодожорки 3-5 возраста в лабораторных условиях. Инфицирование насекомых осуществляли поверхностным методом с использованием искусственной питательной среды Митрофанова (Митрофанов В.Б., 1976; Цыгичко А.А., Асатурова A.M., 2022). Расчет инсектицидной активности осуществляли с использованием формулы биологической эффективности (БЭ) Хендерсона-Тилтона, которая учитывает изменения численности, как в опытном, так и контрольном варианте (Henderson C.F., Tilton E.W., 1955). Полученные данные приведены в таблице 1.

Анализ данных таблицы 1 показывает, что штамм BZR L-3 высокопатогенен для гусениц яблонной плодожорки. Его БЭ на 10 сутки эксперимента составляет 80,6%, а на 15 сутки эксперимента - 100%. Установлено, что уровень БЭ заявляемого штамма превышает эффективность эталонного препарата «Мадекс Твил, СК» на 10,5% и эффективность штамма-аналога прототипа BZR 14 на 79,9%.

Таким образом, штамм BZR GV L-3 является новым, с более высокой инсектицидной активностью в отношении гусениц яблонной плодожорки, перспективным для разработки энтомопатогенных препаратов с целью расширения ассортимента биологических средств защиты растений и импортозамещения.

Источники информации

1. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Часть I. Пестициды. М.: МСХ РФ, 2024. 890 с.

2. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Часть I. Пестициды. М.: МСХ РФ, 2017. 938 с.

3. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Часть I. Пестициды. М.: МСХ РФ, 2018. 960 с.

4. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Часть I. Пестициды. М.: МСХ РФ, 2019. 871 с.

5. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Часть I. Пестициды. М.: МСХ РФ, 2020. 829 с.

6. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Часть I. Пестициды. М.: МСХ РФ, 2021. 819 с.

7. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Часть I. Пестициды. М.: МСХ РФ, 2022. 852 с.

8. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ. Часть I. Пестициды. М.: МСХ РФ, 2023. 924 с.

9. Цыгичко А.А., Асатурова А. М., Исмаилов В.Я., Пушня М.В. Штамм вируса гранулеза яблонной плодожорки Cydia pomonella L., обладающий инсектицидной активностью. Патент РФ. Патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр биологической зашиты растений". Дата заявки: 30.05.2020. Дата публикации: 11.03.2021.

10. Sauer A.J., Fritsch, Е., Undorf-Spahn, К., Iwata К., Kleespies R.G., Nakai М., Jehle J. A. Cross-Resistance of the Codling Mom against Different Isolates of Cydia pomonella Granuloviras Is Caused by Two Different but Genetically Linked Resistance Mechanisms // Viruses. 2021. 13. P. 1952. https://doi.org/10.3390/v13101952.

11. Черкезова С.Р. Разработка технологии защиты яблоневого сада против комплекса чешуекрылых вредителей в условиях погодных стрессов // Плодоводство и виноградарство Юга России. 2019. №. 55. С. 107-119. https://doi.org/10.30679/2219-5335-2019-1-55-107-119.

12. БондарчукЕ.Ю., Асатурова A.M., Томашевич Н.С., Цыгичко А.А., Гырнец Е.А. Биологический контроль численности яблонной плодожорки на основе энтомопатогенных микроорганизмов (обзор) // Достижения науки и техники АПК. 2020. Т. 34. №11. С. 53-66. https://doi.org/10.24411/0235-2451-2020-11108.

13. Ruiu L. Microbial biopesticides in agroecosystems // Agronomy. 2018. T. 8. №. 11. P. 235. https://doi.org/10.3390/agronomy8110235.

14. Semenova T. A., Dunaevsky, Y. E., Beljakova, G. A., Belozersky M.A. Extracellular peptidases of insect-associated fungi and their possible use in biological control programs and as pathogenicity markers // Fungal Biology. 2020. T. 124. №. 1. C. 65-72. https://doi.Org/10.1016/j.funbio.2019.ll.005.

15. Долженко T.B., Долженко В.И. Инсектициды на основе энтомопатогенных вирусов // Агрохимия. 2017. №4. С. 26-33.

16. Moore S., Kirkman W., Richards G., Stephen P. The Cryptophlebia Leucotreta Granuloviras - 10 Years of Commercial Field Use // Viruses. 2015. 7(3). P. 1284-1312. https://doi.org/10.3390/v7031284.

17. Митрофанов В. Б. Гранулез яблонной плодожорки Laspeyresia pomonella L.: дис.канд. биол. наук / Митрофанов Василий Борисович. -Ленинград, 1976. 182 с.

18. Graillot В., Blachere-Lopez С, Besse S., Siegwart М., Lopez-Ferber М. Importance of the Host Phenotype on the Preservation of the Genetic Diversity in Codling Moth Granuloviras // Viruses. Special Issue: Insect Viruses and Pest Management. 2019. 11 (7). P. 621. https://doi.org/10.3390/v11070621.

19. Голуб В.Б., Цуриков М.Н., Прокин А.А. Коллекции насекомых: сбор, обработка и хранение материала. - М.: Товарищество научных изданий КМК. 2012. 339 с. 4.

20. Колосов А.В. Разработка и испытание вирусных энтомопатогенных препаратов для защиты растений: дис. канд. биол. наук / Колосов, Алексей Владимирович. - Кольцево, 2011. 131 с.

21. Henderson С.F., Tilton Е. W. Tests with acaricides against brown wheat mite // Journal of Economic Entomology. 1955. 48. P. 157-161.

22. Цыгичко A.A., Асатурова A.M. Скрининг новых штаммов вируса гранулеза в отношении большой восковой моли Galleria mellonella // Достижения науки и техники АПК. 2022. Т. 36, №3. С. 45-52. https://doi.org/10.53859/02352451_2022_36_3_45.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм BZR GV L-3 вируса гранулёза яблонной плодожорки Cydia pomonella L., депонированный в биоресурсной коллекции Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр биологической защиты растений» «Государственная коллекция энтомоакарифагов и микроорганизмов», обладающий инсектицидной активностью против гусениц яблонной плодожорки. 1 табл., 2 пр.

Штамм BZR GV L-3 вируса гранулёза яблонной плодожорки Cydia pomonella L., депонированный в биоресурсной коллекции Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр биологической защиты растений» «Государственная коллекция энтомоакарифагов и микроорганизмов», обладающий инсектицидной активностью против гусениц яблонной плодожорки.