СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЧИПА ДЛЯ АНАЛИЗА И ЧИП ДЛЯ АНАЛИЗА Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 B01L3/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области биологических анализов, в частности биохимических анализов.

Более конкретно, изобретение относится к способу изготовления фильтрующих чипов, которые могут необязательно функционировать для проведения биологических анализов.

Уровень техники

В области биологических анализов известно использование белковых чипов («белковых микрочипов») для изучения биохимической активности белков. В таких чипах библиотека антител или белковых фрагментов («зондов») или даже целых белков - помещается на матрицу, такую как предметное стекло. В этом случае один образец исследуется на всех зондах, нанесенных на матрицу.

Также были разработаны устройства для биологического анализа, позволяющие проводить параллельный анализ нескольких образцов.

Документ WO 2014/053237 представляет собой пример, в котором миниатюрное устройство позволяет проводить анализ нескольких биологических образцов одновременно («мультиплексный» анализ). Каждый образец также может подвергаться последовательному воздействию нескольких различных зондов. Другими словами, прибор позволяет проводить анализ типа «3D-анализ».

Устройство, описанное в этом документе, содержит множество каналов, в каждый из которых может инжектироваться образец в жидкой фазе независимо от других каналов.

Каждый канал может формироваться из нескольких трубчатых участков. Между двумя последовательными частями вставляется приблизительно цилиндрическая зона анализа, сформированная в соответствующей матрице.

Зоны анализа могут, в частности, сформироваться в плоской нитроцеллюлозной матрице, вся поверхность которой, за исключением зон анализа, гидрофобна благодаря пропитке воском.

Зоны анализа могут состоять просто из необработанной нитроцеллюлозы, так что они представляют собой зоны фильтрации, или альтернативно из нитроцеллюлозы, функционализированной, например, с помощью молекулы-зонда.

Операция пропитки воском позволяет разграничить зоны анализа, а также ограничить боковую диффузию внутри матрицы (то есть за пределы данной зоны анализа по направлению к другим соседним зонам анализа), представляющих интерес молекул (молекул-зондов или молекул образца).

Для этой операции пропитки осуществляется способ печати твердой краской, чтобы нанести слой воска на матрицу в областях, которые должны быть гидрофобными. По окончании печати матрицу нагревают до температуры выше температуры плавления используемого воска, затем охлаждают, чтобы воск диффундировал в стороны и вглубь, по толщине матрицы, и чтобы ограничить его последующее нежелательное распространение на области анализа, соответственно.

Однако такой способ не позволяет точно контролировать объем данной зоны анализа или форму поверхности, которая ограничивает этот объем, как показано на фигурах, представленных в настоящем документе. В частности, окружность верхней поверхности площадки тестирования варьируется от площадки к площадке и, как правило, не является круглой, так что в направлении потока сечение анализируемой зоны не совпадает с внутренним сечением канала, в которую должна быть вставлена область анализа.

Следовательно, точность такого устройства ограничена из-за производственного процесса, используемого для формирования зон анализа, и, соответственно, предел количественного определения остается слишком высоким для определенных биологических анализов, в которых задействованные концентрации (или их разбросы) особенно малы.

Документ US 2004/0115707 описывает блок биохимического анализа, содержащий базовую пластину, имеющую множество отверстий, заполненных пористым и адсорбирующим материалом, для получения множества зон анализа.

Заполнение отверстий может быть получено посредством ламинирования листа адсорбирующего материала на предварительно перфорированной опорной плите.

Во время ламинирования лист материала для анализа подвергается воздействию анизотропных напряжений из-за силы растяжения, приложенной в направлении ламинирования. Таким образом, свойства адсорбирующего материала после вставки в отверстия являются анизотропными. Возможна даже разная толщина адсорбирующего материала в пределах одного и того же отверстия.

Более того, ламинирование не нарушает сплошности листа адсорбирующего материала. Таким образом, адсорбирующий материал образует сплошную поверхность между двумя каналами под пластиной или на ней, как можно увидеть на Фиг.2b документа US2004/0115707. Таким образом, интересующие молекулы (из образца или зондов) рискуют диффундировать из одного канала 3 в другой благодаря этой сплошности.

Таким образом, точность и чувствительность количественного анализа, проводимого с помощью такой пластины, ограничены.

В другом варианте осуществления, описанном в US 2004/0115707, адсорбирующий материал может растворяться в растворителе. Затем полученный раствор вводят в отверстия и растворитель выпаривают. Этот способ инжектирования жидкой фазы также не позволяет точно контролировать изотропность свойств зоны исследований, в частности, потому, что воздушный поток, обеспечивающий испарение растворителя, обязательно является направленным.

В дополнение к этому, в адсорбирующем материале могут оставаться следы растворителя, которые могут взаимодействовать с молекулами-зондами или анализируемыми молекулами. В дополнение к этому, использование растворителей, в частности органических растворителей в случае нитроцеллюлозы, вызывает загрязнение окружающей среды способом.

Наконец, не обеспечивается надежная связь между адсорбирующим материалом после затвердевания и базовой пластиной. Качество этого соединения зависит, в частности, от химической композиции адсорбирующего материала и базовой пластины. Таким образом, связь между данной зоной анализа и пластиной может оказаться непрочной. При принудительной циркуляции жидкости посредством относительного вакуума эти зоны анализа могут отрываться и уноситься циркулирующей жидкостью. Поэтому невозможно провести анализ с принудительной циркуляцией жидкости через зоны анализа, полученные в этом варианте осуществления.

Другие способы, использующие, например, другие химические вещества или стадию нагревания, или стадию облучения, также описаны в документе W001/19502A2 после первой стадии ламинирования.

В дополнение к выявленным ранее недостаткам ламинирования все эти варианты осуществления имеют недостаток, заключающийся в том, что они вызывают физико-химические модификации фильтрующей мембраны, которые изменяют ее свойства, важные для анализа, и, следовательно, чувствительность и точность анализа.

Поскольку химический композиция и физическая структура мембраны, на которой осуществляется анализ, влияют на эффективность способа анализа и, в частности, на предел количественного определения этого способа, целью изобретения является создание способа изготовления чипа для анализа биологического образца, позволяющего точно контролировать эту химическую композицию и эту физическую структуру.

В частности, изобретение нацелено на создание способа изготовления недорогого чипа для анализа, не требующего стадии тепловой, химической или радиационной обработки для формирования площадок тестирования в матрице (за исключением возможной биохимической функционализации этих площадок после или до формирования площадок) и позволяющие проводить количественный анализ с высокой точностью и чувствительностью и/или анализ биологического образца или простую фильтрацию жидкого биологического образца.

Сущность изобретения

Таким образом, изобретение относится к способу изготовления чипа для анализа биологических образцов, включающему:

- создание матрицы, сформированной из материала твердого носителя, имеющей нижнюю поверхность и верхнюю поверхность, и в ней формируется, по меньшей мере, одно сквозное отверстие, проходящее между указанными нижней и верхней поверхностями;

- создание, по меньшей мере, одного вкладыша, вырезанного из листа твердого и пористого материала для анализа, причем вкладыш имеет нижнюю поверхность и верхнюю поверхность,

- осуществление вставки, по меньшей мере, одного вкладыша, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие матрицы посредством поступательного перемещения, по меньшей мере, одного вкладыша в направлении нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы;

- осуществление механической сборки при температуре ниже температуры плавления материала носителя и материала для анализа, в ходе которой прикладывают прижимающее усилие в направлении нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы по меньшей мере, к той части матрицы, которая находится рядом, по меньшей мере, с одним вкладышем, вставляемым в матрицу, и/или, по меньшей мере, к одной из нижней и верхней поверхностей, по меньшей мере, одного вкладыша, вставляемого в матрицу.

Благодаря этим положениям получается чип для анализа, содержащий, по меньшей мере, один вкладыш из материала для анализа, вставляемый в отверстие, проходящее через материал носителя. Сборка вкладыша и материала носителя не достигается химическим процессом или плавлением одного из материалов, так что физические и химические свойства материала носителя и материала для анализа перед сборкой не изменяются или, по меньшей мере, очень мало изменяются после сборки, в том числе вблизи границы раздела между этими двумя материалами. Сборка осуществляется только механически и посредством приложения прижимающего усилия по нормали к верхней и нижней поверхностям матрицы, так что деформация материалов является равномерной в плоскости, нормальной к направлению прижимающего усилия.

Таким образом, способ позволяет, в отличие от способов, осуществляющих стадию ламинирования, не вводить анизотропию в материал носителя и/или анализируемый материал в направлении, нормальном к направлению прижимающего усилия.

Такая анизотропия привела бы, например, в случае иммунологических тестов с использованием флуоресцентных реагентов, к неоднородности флуоресценции на поверхности аналитического планшета, что сделало бы количественный анализ сигнала флуоресценции неточным.

Таким образом, благодаря всем этим устройствам улучшаются чувствительность и воспроизводимость анализа для чипа, полученного способом по настоящему изобретению, по сравнению с чипами, полученными в соответствии со способами предшествующего уровня техники.

Кроме того, применяемые средства являются только механическими, поэтому они не очень загрязняют окружающую среду, поскольку они не содержат растворителя и просты в применении.

В соответствии с различными аспектами можно обеспечить одну и/или другую из нижеприведенных характеристик, взятых по отдельности или в сочетании.

Согласно одному из вариантов осуществления способа изготовления чипа для анализа биологических образцов прижимающее усилие воздействует на часть матрицы, которая находится рядом, по меньшей мере, с одним вкладышем, вставляемым в матрицу.

Благодаря такому расположению эта часть матрицы может иметь коническую поверхность с сужающимся просветом вверху вкладыша и/или под ним, так что вкладыш может, по меньшей мере, частично обжиматься матрицей. Таким образом, сборка вкладыша с матрицей в чипе для анализа будет иметь хорошую механическую устойчивость и не будет подвержена влиянию потока анализируемой жидкой пробы в направлении, нормальном к верхней и нижней поверхностям матрицы, или даже с помощью относительного вакуума, прикладываемого к одной из этих поверхностей для ускорения потока жидкого образца.

Согласно одному из вариантов осуществления способа изготовления чипа для анализа биологических образцов прижимающее усилие прикладывается, по меньшей мере к одной из нижней и верхней поверхностей, по меньшей мере, одного вкладыша, вставляемого в матрицу.

Благодаря такому расположению, вкладыш, по меньшей мере, частично обжимает матрицу, так что сборка вкладыша с матрицей оказывает определенное механическое сопротивление и на нее не будет влиять поток анализируемой жидкой пробы в направлении, нормальном к верхней и нижней поверхностям матрицы, или даже относительный вакуум, приложенный к одной из этих поверхностей для ускорения потока жидкого образца.

Согласно конкретному варианту осуществления способа изготовления чипа для анализа биологических образцов материал носителя является гидрофобным, а материал для анализа является гидрофильным или наоборот. Таким образом, например, можно нанести на вкладыш исследуемый образец в водной фазе без его диффузии к материалу носителя, если последний является гидрофобным. И наоборот, если материал носителя является гидрофильным, материал для анализа является гидрофобным, и тогда можно нанести тестируемый образец в органической фазе на вкладыш без его диффузии к материалу носителя.

Согласно конкретному варианту осуществления способа изготовления чипа для анализа биологических образцов для вставки, по меньшей мере, одного вкладыша, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие, по меньшей мере, один вкладыш перемещается, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие с помощью пробойника, при этом, по меньшей мере, один вкладыш вырезается из листа материала для анализа перед его вставкой с помощью этого же пробойника и, по меньшей мере, одно сквозное отверстие предварительно формируется в матрице с помощью этого же пробойника.

Благодаря такой компоновке для подготовки чипа для анализа необходим только один инструмент, а именно инструмент, имеющий один или несколько пробойников, размер и форма которых адаптированы к форме желаемых углублений. Такой инструмент прост в разработке и реализации и, возможно, позволяет автоматизировать процесс, что позволяет получать высокоточные и контролируемые чипы для анализа воспроизводимым, быстрым и недорогим способом.

Согласно конкретному варианту осуществления способа изготовления чипа для анализа биологических образцов после механической сборки, по меньшей мере, один вкладыш функционализируется.

Например, можно рассмотреть биохимическую функционализацию с помощью антитела или антигена, адсорбированного на вкладыше.

Таким образом, чип для анализа биологического образца, полученный с помощью настоящего способа, позволяет осуществить аналитический тест с помощью реагента, используемого для функционализации, например, иммунологический тест. Таким образом, благодаря этой стадии функционализации чип для анализа может адаптироваться к потребностям анализа. Чипы для анализа могут, например, производиться серийно перед стадией функционализации, и каждый из них может функционализироваться по желанию во время анализа.

Согласно конкретному варианту осуществления способа изготовления чипа для анализа биологических образцов материал для анализа функционализируют перед вставкой, по меньшей мере, одного вкладыша в матрицу.

Благодаря такому расположению функционализация может осуществляться на всем листе материала для анализа перед резанием носителя. Когда чипы для анализа изготавливаются серийно, это экономит время. Контроль функционализации и, в частности, количества реагента для анализа, нанесенного на каждый вкладыш, также улучшается, что в конечном итоге обеспечивает более высокую точность и лучшую воспроизводимость тестов, проводимых с данной серией чипов для анализа.

Согласно конкретному варианту осуществления способа изготовления чипа для анализа биологических образцов вставку, по меньшей мере, одного вкладыша в матрицу повторяют, по меньшей мере, один раз, используя для каждой новой вставки функционализированный материал для анализа, отличный от того, который использовался для предыдущего вкладыша, и пробойника, соответствующего по меньшей мере, одному сквозному отверстию матрицы, отличному от использованного для предыдущей вставки.

Благодаря такому расположению на одном и том же чипе для анализа можно сформировать несколько вкладышей для анализа с различной функционализацией. Тогда можно одновременно осуществить несколько различных исследований на одном и том же чипе, на одном и том же образце или на нескольких различных образцах. Способ остается простым при осуществлении, поскольку для него требуются только различные пробойники или, что то же самое, один инструмент, снабженный несколькими пробойниками, расположенными в разных местах и которые можно приводить в действие по отдельности или группами. Согласно конкретному варианту осуществления способа изготовления чипа для анализа биологических образцов механическая сборка, по меньшей мере, одного вкладыша с матрицей приводит к обжатию, по меньшей мере, одного вкладыша матрицей, по меньшей мере, на части его нижней и верхней поверхностей.

Благодаря такому расположению вкладыш нельзя вытолкнуть при нормальных условиях использования за пределы матрицы, по меньшей мере, с одной стороны этой матрицы. Таким образом, сборка матрицы и вкладыша устойчива к относительному вакууму или давлению, оказываемому на одну сторону вкладыша исследуемым образцом при его осаждении.

Согласно конкретному варианту осуществления способа изготовления чипа для анализа биологических образцов перед вставкой, по меньшей мере, одного вкладыша в матрицу, по меньшей мере, один вкладыш доводят до температуры ниже температуры матрицы. Благодаря такому расположению материал для анализа сжимается перед вставкой, что облегчает его вставку в сквозное отверстие за счет уменьшения контактных усилий, а после вставки он расширяется, так что после вставки контакт между вкладышем и матрицей усиливается и позволяет удерживать вкладыш на месте в матрице.

Изобретение также относится к чипу для анализа биологических образцов, содержащему:

- матрицу, сформированную из материала твердого носителя, имеющую нижнюю поверхность и верхнюю поверхность и в которой формируется, по меньшей мере, одно сквозное отверстие, проходящее между указанными нижней и верхней поверхностями;

- по меньшей мере, один вкладыш, вырезываемый из листа твердого и пористого материала для анализа и вставляемый, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие, при этом, по меньшей мере, один вкладыш имеет нижнюю поверхность и верхнюю поверхность, причем чип для анализа биологического образца отличается тем, что по меньшей мере один вкладыш обжат матрицей, по меньшей мере, на одной из его верхней и нижней поверхностей.

Преимущество такого чипа для анализа состоит в том, что он не содержит остатков растворителя или зоны плавления, или пайки, которые могут повлиять на точность теста, проводимого с помощью этого чипа. Обжатие позволяет сохранить исходные физико-химические свойства как материала носителя, так и материала для анализа. Это также позволяет проводить тест с перетеканием образца вдоль оси сквозного отверстия с одной стороны вкладыша на другую, так как соединение между вкладышем и матрицей имеет хорошую механическую стойкость.

В соответствии с одним из вариантов осуществления образца чипа для анализа биологического образца материал носителя содержит, по меньшей мере, один компонент, выбранный из металла, пластика и целлюлозы, и при этом материал для анализа, из которого состоит, по меньшей мере, один вкладыш, содержит, по меньшей мере, один компонент, выбранный из нитроцеллюлозы, целлюлозы и органического полимера.

Такие материалы являются недорогими и обладают качествами биохимической инертности и адсорбции, необходимыми для проведения таких анализов, как биохимические тесты.

Согласно одному из вариантов осуществления чипа для анализа биологических образцов сборка, по меньшей мере, из одного вкладыша и матрицы выдерживает, по меньшей мере, относительный вакуум, равный 0,100 бар.

Благодаря такому устройству можно проводить анализ образца, принудительно протекающего через вкладыш, без отделения вкладыша от матрицы из-за избыточных локальных давлений.

Настоящее изобретение также относится к устройству для анализа биологического образца, содержащему, по меньшей мере, два наложенных друг на друга чипа для анализа биологических образцов в соответствии с одним из предыдущих вариантов осуществления и при этом, по меньшей мере, один вкладыш одного, по меньшей мере, из двух чипов сконфигурирован для осуществления функции фильтрации и накладывается, по меньшей мере, на один функциональный вкладыш другого чипа, по меньшей мере, из двух чипов.

Таким образом, можно пакетировать несколько чипов для анализа для получения устройства для трехмерного анализа, при этом анализ, осуществляемый в разных местах анализа, варьируется в направлении пакетирования и/или в пределах заданного чипа для анализа, и осуществить первую стадию фильтрации перед анализом, в частности, для отделения сыворотки от эритроцитов с целью анализа образца крови.

В последнем случае устройство позволяет избежать осуществления стадии центрифугирования.

Кроме того, изобретение относится к диагностическому набору, содержащему, по меньшей мере, один материал для анализа биологического образца в соответствии с одним из предыдущих вариантов осуществления и, по меньшей мере, один реагент для анализа.

Таким образом, могут предусматриваться один или несколько реагентов для анализа, в частности буфер, растворитель, антиген, антитело, для осуществления стандартизированного теста, такого как иммунологический тест.

Изобретение также относится к использованию чипа для анализа биологических образцов в соответствии с одним из предыдущих вариантов осуществления в диагностических целях или для иммунологического теста.

Наконец, изобретение относится к устройству для изготовления чипа для анализа биологических образцов в соответствии с одним из предыдущих вариантов осуществления, при этом устройство для изготовления содержит:

- систему вставки, пригодную для вставки, по меньшей мере, одного вкладыша, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие матрицы посредством поступательного перемещения вкладыша в направлении, нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы;

- систему механической сборки при температуре ниже температуры плавления материала носителя и материала для анализа, адаптированную для приложения прижимающего усилия в направлении, нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы, по меньшей мере, на той части матрицы, которая находится рядом, по меньшей мере, с одним вкладышем, вставляемым в матрицу, и/или, по меньшей мере, с одной из нижней и верхней поверхностей, по меньшей мере, одного вкладыша, вставляемого в матрицу.

Такое устройство для изготовления просто в осуществлении и вносит только минимальную и изотропную деформацию материала носителя и/или материала для анализа в любой плоскости, параллельной нижней и верхней поверхностям матрицы. Таким образом, это позволяет формировать чипы для анализов с низкими затратами и при сохранении исходных физико-химических свойств материала носителя и материала для анализа.

Краткое описание фигур

Варианты осуществления изобретения описываются ниже со ссылкой на фигуры, кратко описанные ниже:

На Фиг.1 показан один из вариантов матрицы носителя для чипа для анализа.

На Фиг.2 показана полоска носителя, в которой только что вырезаны три основные части, каждая из которых позволяет формировать матрицу носителя.

Фиг.3а1 представляет собой часть матрицы носителя в начале перфорации сквозного отверстия в разрезе по плоскости, содержащей ось этого отверстия, в соответствии с конкретным вариантом осуществления.

Фиг.3а2 представляет часть матрицы носителя, в которой проделывается сквозное отверстие, в разрезе по плоскости, содержащей ось этого отверстия, в соответствии с конкретным вариантом осуществления.

Фиг.3b представляет собой часть матрицы носителя после перфорации сквозного отверстия и в начале стадии вставки вкладыша из материала для анализа в разрезе вдоль плоскости, содержащей ось этого отверстия, в соответствии с конкретным вариантом осуществления.

Фиг.3c представляет собой часть матрицы носителя во время вставки вкладыша из материала для анализа, если смотреть в разрезе вдоль плоскости, содержащей ось этого отверстия, в соответствии с конкретным вариантом осуществления.

Фиг.3d представляет собой часть матрицы носителя в конце стадии вставки вкладыша из материала для анализа в разрезе вдоль плоскости, содержащей ось этого отверстия, в соответствии с конкретным вариантом осуществления.

На Фиг.4а показан вид в разрезе той же части матрицы носителя, что и на Фиг.3d, в начале стадии сборки в конкретном варианте осуществления.

На Фиг.4b показан вид в разрезе той же части матрицы носителя, что и на Фиг.3d, во время стадии сборки в конкретном варианте осуществления.

На Фиг.4с показано сечение той же части матрицы носителя, что и на Фиг.3d, в конце стадии сборки в конкретном варианте осуществления.

На Фиг.5 показан вид сверху одного из вариантов осуществления чипа для анализа.

На Фиг. 6 показано устройство для мультиплексного анализа, содержащее два чипа для анализа.

На чертежах одинаковые ссылочные номера обозначают идентичные или подобные объекты.

Фиг.7 представляет собой вид сверху варианта осуществления матрицы носителя чипа для анализа, в которой сквозные отверстия имеют различные формы.

Фиг.8а представляет собой фотографию, полученную с помощью бинокулярной лупы (модель Zeiss, Stemi SV8) чипа 1 для анализа биологических образцов, разрезанного по плоскости, ортогональной верхней и нижней граням чипа и содержащей диаметр круглого сечения цилиндрического сквозного отверстия.

Фиг.8b воспроизводит фотографию чипа для анализа, полученного способом известным из литературы, использующим твердокрасочный принтер Xerox®, где диаметр вкладышей для анализа составляет порядка 500 микрометров.

На Фиг.8с представлена фотография чипа для анализа на Фиг.8b, полученная с помощью бинокулярной лупы (Zeiss, модель Stemi SV8, увеличение x64).

Фиг.8d представлена фотография чипа для анализа на Фиг.8а, полученная с помощью бинокулярной лупы (модель Zeiss, Stemi SV8, увеличение x64), полученного способом по настоящему изобретению, в котором материал для анализа - нитроцеллюлоза, материал носителя - черная бумага, покрытая воском, диаметр вкладыша для анализа равен 500 микрометрам.

Фиг.9 представлена фотография чипа для анализа, полученная с помощью бинокулярной лупы (Zeiss, модель Stemi SV8, увеличение x64), полученного способом по настоящему изобретению, в котором материал для анализа представляет собой нитроцеллюлозу, а материал носителя - латунь, диаметр вкладышей для анализа равен 500 микрометрам.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к способу изготовления чипа 1 для анализа биологических образцов, предназначенного для применения отдельно или в устройстве 7 для анализа. Устройство 7 для анализа или сам по себе чип 1 для анализа биологических образцов дает возможность, например, осуществлять анализы биологических жидкостей, таких как кровь или жидкие фракции крови (плазма, сыворотка), моча, слюна и тому подобное.

Анализируемая жидкость также может представлять собой реакционную среду, содержащую биомолекулы, такие как антитела или белки.

Таким образом, понятие анализа биологического образца следует понимать в широком смысле, то есть это анализ, включающий, по меньшей мере, одну биомолекулу из реагентов и/или анализируемых веществ.

Таким образом, чипы 1 для анализа биологических образцов можно использовать для обнаружения и количественного определения сложных биомолекул в биологических средах: крови, плазме, сыворотке, органах или экстрактах органов, реакционной среде, в которой образуются сложные биомолекулы (антитела, белки).

В частности, биологический анализ может представлять собой иммунологический тест, такой как ELISA («иммуносорбентный анализ с ферментной меткой»).

Микрочипы 1 для анализа биологических образцов могут внедряться в области пищевой промышленности для поиска патогенных агентов, например, при медицинском осмотре.

Способ изготовления чипа 1 для анализа биологических образцов по настоящему изобретению включает:

- изготовление матрицы 10 носителя, выполненной из твердого материала, называемого "материал носителя", имеющей нижнюю поверхность и верхнюю поверхность, и в ней проделывается, по меньшей мере, одно сквозное отверстие 11, проходящее между ее нижней и верхней поверхностями;

- изготовление, по меньшей мере, одного вкладыша 3, вырезанного из листа второго твердого пористого материала, называемого «материалом для анализа», при этом, по меньшей мере, один вкладыш 3 имеет нижнюю поверхность и верхнюю поверхность;

- вставку по меньшей мере, одного вкладыша 3, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие 11 матрицы 10 носителя посредством поступательного перемещения, по меньшей мере, одного вкладыша 3 в направлении нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы 10;

- холодную механическую сборку, при температуре ниже температуры плавления материала носителя и материала для анализа, при которой прикладывается прижимающее усилие в направлении, нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы 10, по меньшей мере, к той части матрицы 10, которая находится рядом, по меньшей мере, с одним вкладышем 3, вставляемым в матрицу 10, и/или, по меньшей мере, к одной из указанных нижней и верхней поверхностей, по меньшей мере, одного вкладыша 3, вставляемого в матрицу 10.

Чип 1 для анализа биологических образцов, полученный после осуществления способа, содержит:

- матрицу 10, сформированную в твердом материале носителя, в которой образуется, по меньшей мере, одно сквозное отверстие 11;

- по меньшей мере один вкладыш 3, вырезанный из листа твердого и пористого материала для анализа и вставляемый, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие 11, причем по меньшей мере один вкладыш 3 обжимается матрицей 10, по меньшей мере, на одной из его верхней и нижней поверхностей.

Чип 1 для анализа биологических образцов, который можно увидеть в конкретном варианте осуществления на Фиг.5, таким образом, содержит матрицу 10 носителя, сформированную из твердого материала толщиной e1, в котором проделано одно или несколько сквозных отверстий 11. Конкретный вариант матрицы 10 носителя показан на Фиг.1. Другой конкретный вариант осуществления матрицы 10 носителя представлен на Фиг.1. 7. Как показано на Фиг.2, матрица 10 носителя формируется посредством вырезания базовой части 21 формы, подходящей для аналитического устройства, в котором она предназначена для использования, или для ее отдельного использования. Базовая часть 21 представляет собой, например, прямоугольный или квадратный параллелепипед, вырезанный из полоски 2 носителя из твердого материала, далее называемого «материалом носителя», имеющий нижнюю поверхность и плоскую верхнюю поверхность, параллельные друг другу.

Базовая часть 21, вырезанная из полоски 2 носителя для формирования матрицы 10, носителя может представлять собой параллелепипед и иметь ширину L1 от 5 мм (5 миллиметров) до 50 мм и длину L2 от 5 мм до 50 мм.

В конкретном варианте осуществления матрица 10 носителя формируется из материала для анализа с постоянной толщиной е1 между нижней поверхностью и верхней поверхностью, при этом эти поверхности являются плоскими и параллельными друг другу.

Толщина е1 полоски 2 носителя остается постоянной и идентична толщине вырезанной части 21. Предпочтительно она меньше, например, по меньшей мере, в десять раз, чем другие размеры (длина L1 и ширина L2) вырезанной части 21.

Полоска 2 носителя может, например, иметь ширину L3, равную или немного превышающую ширину L1 матрицы 10 носителя, или, например, более чем в два раза превышающую ширину L1.

В последнем случае можно вырезать несколько базовых частей 21 по ширине полоски 2 носителя.

Таким образом, ширина L3 полоски 2 носителя составляет, например, от 5 до 50 мм.

Длина L4 полоски 2 носителя может быть больше или даже намного больше длины L2 части 21. Длина L4, например, больше 1 м или даже 10 м.

Таким образом, можно последовательно вырезать несколько основных частей 21 в полоске 2 носителя. Вырезание базовой части 21 можно, например, осуществлять с помощью резака, в который вставляется полоска 2 носителя.

Если полоска 2 носителя достаточно длинная, резку базовых частей 21 можно автоматизировать, при этом полоска 2 носителя перемещается на достаточное расстояние между двумя последовательными разрезами базовой детали 21.

Толщина е1 полоски 2 носителя (и базовой части 21, вырезанной из этой полоски 2 носителя) может быть менее 1 мм, менее 0,15 мм или даже менее 0,1 мм. Например, толщина е1 полоски носителя может быть равна 0,06 мм.

В конкретном варианте полоска 2 носителя имеет, например, ширину 20 мм и длину 25 м. Ширина и длина могут изменяться в зависимости от типа изготавливаемых чипов 1 для анализа. Толщина полоски 2 носителя может быть равна 0,12 мм, то есть текущей толщине фильтрующих мембран (как правило, изготовленных из нитроцеллюлозы), образованных в анализируемом материале, но может составлять порядка 0,10 мм.

В конкретном варианте осуществления основная часть 21 представляет собой квадратную фильтрующую мембрану со стороной 20 мм.

Полоска 2 носителя может быть изготовлена, в частности, из металла, например, из стали, меди или латуни. Полоска 2 носителя в альтернативном варианте может изготавливаться из пластика. В качестве неограничивающего примера пластиковый материал может представлять собой полиэтилен, поливинилхлорид, полистирол, полиметилметакрилат, полипропилен или любой другой пластиковый материал, обычно используемый в области биохимических анализов. Он может иметь поверхностную обработку или быть устойчивым к ультрафиолетовому излучению.

Материал носителя может также содержать растительные волокна, например, целлюлозу. В частности, он может представлять собой бумагу.

Материал носителя является прочным, но не обязательно жестким. Таким образом, полоска 2 носителя может иметь определенную гибкость при условии, что полоска 2 носителя или матрица 10 носителя, образованная из этой полоски 2 носителя, могут подвергаться манипуляциям и перемещаться для изготовления чипов 1 для анализа, в частности, без разрывов, включая случай, когда изготовление матрицы 10 носителя автоматизировано. Например, бумага для копировальных аппаратов Rex Copy A4, продаваемая Mondi®, с плотностью 80 г/м², доступная на дату приоритета настоящей заявки на патент, является пригодной для настоящего изобретения.

В случае, когда полоска 2 носителя является гибкой, материал является достаточно жестким для того, чтобы верхняя и нижняя поверхности были фактически плоскими, когда нижняя поверхность, по меньшей мере, локально, просто помещается на плоскую опору.

В одном из вариантов осуществления материал носителя является достаточно жестким, чтобы можно было разрезать одну или несколько базовых частей 21 с помощью резака. В базовой части 21 из материала носителя проделывается, по меньшей мере, одно сквозное отверстие 11 в материале по всей его толщине, то есть вдоль направления, нормального к нижней и верхней поверхностям детали 21.

В конкретном варианте сквозное отверстие 11 формируется с помощью пробойника 42, как показано на Фигуре 3а1 (в начале перфорации), 3а2 (во время перфорации) и 3b (непосредственно перед стадией вставки, которая следует за стадией перфорации, описанной далее). В этом варианте пробойник 42 перемещается вдоль направления оси будущего сквозного отверстия 11, чтобы проткнуть матрицу 10 носителя. Под полоску 2 носителя может помещаться специальная направляющая 4 для резки. Ход пробойника 42 через направляющую 4 для резки регулируется таким образом, чтобы обеспечить удаление вкладыша 10b из полоски 2 носителя, как можно увидеть на Фигурах 3а1 и 3а2.

Затем пробойник можно переместить в противоположном направлении, чтобы освободить матрицу 10 носителя, содержащую одно или несколько сквозных отверстий 11.

В конкретном варианте выполнения сквозные отверстия 11 формируются в местах, соответствующих будущим базовым частям 21 в полоске 2 носителя, перед вырезанием одной или нескольких базовых частей 21.

В другом варианте сквозные отверстия 11 формируются в уже вырезанной базовой части 21.

Альтернативно, сквозные отверстия 11 формируются одновременно с вырезанием базовой части 21, например, с помощью резака соответствующей формы.

Форму сквозных отверстий 11 можно выбирать в соответствии с потребностями анализа. Например, поверхность, ограничивающая внутреннюю часть сквозного отверстия 11, представляет собой цилиндр, образующая которого параллельна направлению нормальному к нижней и верхней поверхностям детали 21, направлению, которое далее будет называться «направлением оси отверстия». 11. Например, сквозные отверстия 11 представляют собой цилиндры вращения.

В варианте осуществления, представленном на Фиг.7, одно из сквозных отверстий 11 можно характеризовать как образованное двумя сквозными частями круглого сечения 11а и 11b, соединенными каналом 11с. Как только вкладыши с материалом для анализа будут вставлены, как описано ниже, можно поместить анализируемый образец в лунку, соответствующую первому «суботверстию», и позволить образцу диффундировать из субчасти 11а в субчасть 11b. В этом случае можно использовать чип для анализов для осуществления теста типа с латеральным потоком.

Характерные размеры сквозного отверстия 11 в направлении верхней или нижней поверхности детали 21, в которой образовано сквозное отверстие 11, могут составлять менее 1 мм.

Например, матрица 10 носителя может содержать 9, 12, 24, 48 или 96 отверстий (или лунок) 11, имеющих форму цилиндров вращения с диаметром d1 порядка 300-800 мкм (микрометров), два последовательных сквозных отверстия 11, разнесенных на расстояние d2 порядка от 100 до 250 мкм.

На матрице 10 носителя необязательно формируют вырез или контрольную отметку 12, чтобы можно было определить ее ориентацию, в частности, во время анализа, который осуществляется позже. Такое расположение позволяет отличать сквозные отверстия 11 друг от друга, когда матрица 10 носителя имеет элементы симметрии.

В конце стадии перфорации сквозного отверстия 11 нижняя и верхняя грани материала носителя уже не являются строго плоскими вблизи нижнего и верхнего оснований сквозного отверстия 11, а образуется выступ материала 10а носителя по всей окружности сквозного отверстия 11 на стороне нижней стороны материала носителя из-за сопротивления, которое материал носителя оказывает при его резании. Этот выступ 10а, который можно увидеть на Фиг.3а2, используется на следующей стадии сборки.

По этой причине на первой стадии способа по настоящему изобретению создается матрица 10 носителя, сформированная из материала носителя постоянной толщины е1, между нижней поверхностью и верхней поверхностью, в которой формируются одно или несколько отверстий 11, проходящих через нее по всей ее толщине.

На второй стадии получают лист 6 постоянной толщины, обозначенный e2, из второго пористого твердого материала, называемого «материалом для анализа», имеющий верхнюю поверхность и нижнюю поверхность.

Материал для анализа, предназначенный для приема на одну из своих нижней и верхней поверхностей жидкого образца, который анализируется или фильтруется, а затем должен иметь возможность стекать к другой из этих поверхностей либо самопроизвольно посредством простой диффузии, либо за счет принудительной циркуляции жидкости. Следовательно, материал для анализа может представлять собой пористый материал, такой как бумага, в частности фильтровальная бумага, то есть бумага с высоким содержанием альфа-целлюлозы (в частности, более 90%, 95% или даже 98% альфа-целлюлозы).

Материал для анализа также может представлять собой нитроцеллюлозу.

Нитроцеллюлоза имеет хорошее сродство к небольшим белкам, пептидам или нуклеиновым кислотам. Поэтому она особенно хорошо подходит для биологических анализов. Однако эти примеры не следует рассматривать как ограничивающие.

Материал для анализа может выбираться, в частности, в соответствии с его влагоустойчивостью, скоростью фильтрации, прочностью на разрыв, скоростью капиллярного подъема или сопротивлением прохождению воздуха.

В случае, когда анализируемая жидкость в основном содержит воду, материал для анализа предпочтительно является гидрофильным, так что анализируемая жидкость смачивает поверхность материала для анализа. В этом случае материал носителя может быть гидрофобным.

В дальнейшем авторы считают материал гидрофобным, если вода не смачивает материал, то есть, если угол между каплей воды и поверхностью материала, на которую капля наносится, строго больше 90°. В противном случае материал для анализа является гидрофильным.

В качестве альтернативы материал для анализа может быть гидрофобным, а материал носителя гидрофильным.

Материал для анализа может представлять собой изотропную или анизотропную фильтрующую мембрану. В частности, она может представлять собой органическую фильтрующую мембрану, то есть мембрану, содержащую органический полимер, такой как ацетат целлюлозы, полисульфон или полиамид.

Толщина е2 материала для анализа может быть близкой к толщине е1 материала носителя. Толщина e2 может быть больше, равна или меньше толщины e1.

Таким образом, в случае, когда материал носителя представляет собой нитроцеллюлозу, толщина е2 материала для анализа может составлять порядка нескольких сотен или даже нескольких десятков микрометров, например, от 50 мкм до 150 мкм.

На третьей стадии, называемой вставкой, часть материала для анализа, называемая вкладышем 3, вставляется, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие 11 матрицы 10 носителя, так что вкладыш 3 перекрывает это отверстие 11.

Таким образом, вкладыш 3 дополняет отверстие 11, в которое он должен вставляться, по меньшей мере, на часть толщины материала носителя. Другими словами, если поверхность, ограничивающая внутреннюю часть сквозного отверстия 11, представляет собой цилиндр, образующая которого параллельна направлению нормальному к нижней и верхней поверхностям детали 21, то вкладыш 3, который может в него вставляться, представляет собой цилиндр, образующая которого после вставки параллельна оси сквозного отверстия 11, основание которого имеет ту же форму, что и основание сквозного отверстия 11.

Таким образом, термин «вкладыш» не следует интерпретировать как ограничительный с точки зрения формы. Он выбирается в связи с наиболее простым вариантом осуществления, то есть таким, в котором сквозное отверстие 11 и вкладыш 3 являются цилиндрами вращения.

Таким образом, в варианте осуществления, показанном на Фиг.7, вкладыш 3, вставляемый в сквозное отверстие 11, образованное двумя составными частями 11а, 11b и каналом 11с, имеет дополняющую форму, приспособленную для заполнения составных частей 11а, 11b и 11с, при этом вкладыш 3, входящий в цилиндрическое сквозное отверстие 11, будет цилиндрической.

Высота вкладыша 3 во всех случаях может быть равной высоте отверстия 11 (как видно на виде в разрезе по плоскости, содержащей ось сквозного отверстия 11, показанной на Фигуре 4с), или отличаться от нее (смотри Фиг.9 показана аналитическая пластина 1 согласно изобретению, материал носителя которой представляет собой латунь, покрытую пищевым парафином Le Parfait® (номер в каталоге 365 EMB 44 026, упаковка 250 г), и материал для анализа представляет собой нитроцеллюлозу (номер в каталоге: Amersham Protran® Premium NitroCellulose с порами 0.45 пм, GE Healthcare Life Science Nitrocellulose Bloting Membrane Nucleic acid and Protein application Catalog No 10600008).

Блокировка, осуществляемая на стадии вставки, достигается только за счет перемещения вкладыша 3 вдоль оси сквозного отверстия 11. Например, если сквозное отверстие 11 формируется в основном материале с помощью пробойника, матрица 10 носителя может оставаться на месте под пробойником 42 после того, как будет проделано отверстие 11.

Затем лист 6 материала для анализа помещают над проколотой матрицей 10 носителя, как показано на Фиг.3b, и снова перемещают пробойник 42 вдоль оси отверстия на расстояние по меньшей мере, немного меньшее, чем то, которое позволило проделать отверстие 11.

Таким образом, пробойник 42 вырезает вкладыш 3, который вставляется и перемещается по своему пути внутри сквозного отверстия 11, но не выходя полностью из сквозного отверстия 11 со стороны нижней поверхности матрицы 10 носителя и так, чтобы он располагался, по меньшей мере, над частью выступа 10а.

Таким образом, в конце этой стадии вставки вкладыш 3 хорошо входит, по меньшей мере, на части своей высоты в сквозное отверстие 11.

Выбор хода пробойника позволяет расположить вкладыш 3 на заданной высоте в соответствующем сквозном отверстии 11, например, так, чтобы нижнее основание вкладыша 3 находилось в одной плоскости с нижней поверхностью матрицы 10 носителя или, по меньшей мере, с самыми нижними точками выступа 10а, как показано на Фигуре 3с.

Также можно использовать пробойник, предназначенный для стадии вставки, например, в варианте осуществления, в котором изготовление матриц автоматизировано и осуществляется задолго до стадии вставки.

Также можно предусмотреть один или несколько вкладышей 3, вырезанных заранее, например, с помощью резака или любого другого прецизионного режущего инструмента, и вставлять их в соответствующее им сквозное отверстие 11 вертикальным поступательным движением.

Преимущество варианта осуществления, в котором резка и вставка осуществляется последовательно одним и тем же пробойником, заключается в простоте позиционирования вкладышей и скорости осуществления этой стадии.

В последнем случае предусматриваются пробойник резака и два соответствующих ответных элемента, чтобы иметь возможность соответствующим образом перфорировать полоску 2 носителя и, таким образом, сначала сделать углубления (или даже «пятна», или даже сквозные отверстия 11) в полоске 2 носителя. Этот инструмент, в частности, может изготавливаться из стали, чтобы гарантировать его жесткость и устойчивость во времени. Размеры этого инструмента адаптируются к типам чипов для анализа 1, которые должны изготавливаться.

В конкретном варианте осуществления формируются 25 сквозных отверстий 11 диаметром 500 микрометров на расстоянии 200 микрометров друг от друга, содержащихся в квадрате 6 мм × 6 мм, расположенном в центре базовой части 21 в форме квадрата из материала носителя (20 × 20 мм).

Таким образом, устройство пробойника будет иметь 25 пробойников диаметром 500 микрометров. Для других конфигураций чипа 1 для анализа биологических образцов пробойники, используемые для всех сквозных отверстий 11 или для части этих сквозных отверстий 11, могут иметь разные диаметры. Таким образом, диаметр (или характерный размер в случае, когда сечение сквозного отверстия 11 не круглое) пробойника может быть менее 1000 микрометров, менее 900 микрометров, менее 800 микрометров, менее 700 микрометров, менее 600 микрометров, менее 500 микрометров, менее 400 микрометров, менее 300 микрометров, менее 200 микрометров, менее 150 микрометров, менее 100 микрометров.

Узел «пробойники, а также два ответных элемента» может быть закреплен под прессом, между зажимами 5а и 5b этого пресса. Полоска 2 носителя автоматически разворачивается в нижней части первой ответной части и устанавливается посередине этого узла «пробойник; первый ответный элемент; второй ответный элемент», чтобы сделать лунки (сквозные отверстия 11) автоматически простым движением сверху вниз в намеченном месте. Как только эта первая штамповка закончена, полоска материала для анализа вводится поверх второго ответного элемента после того, как пробойник вернулся в «поднятое» положение. Затем осуществляют вторую штамповку (на этот раз материала для анализа, формирующего мембрану фильтра), что позволяет вырезать вкладыши 3 этого материала для анализа, например, фильтрующие мембраны.

Затем ход резака с пробойниками вниз можно отрегулировать, например, для этой второй штамповки таким образом, что в нижнем положении пробойник останавливается в начале уже пробитой полоски 2 носителя. Таким образом, пробойники проталкивают свежевырезанные вкладыши 3 из материала для анализа, например, нитроцеллюлозы, и вставляют их в сквозные отверстия 11 так, чтобы по меньшей мере, частично заполнить эти сквозные отверстия 11 матрицы носителя (или мембраны).

После этого полоска может продвигаться под вторым прессом, который имеет функцию обжатия вкладышей материала для анализа, например, из нитроцеллюлозы, в полоске 2 носителя или, по меньшей мере, в матрице 10 носителя посредством удара (давления), который может воздействовать на всю поверхность мембраны, чтобы должным образом заблокировать вкладыши в полоске носителя, как описано ниже. Силу этого давления или (удара) можно определить посредством исследования.

Какой бы вариант осуществления не был выбран для стадии вставки, вставка осуществляется, если это возможно, только посредством поступательного перемещения вкладыша 3 вдоль оси соответствующего сквозного отверстия 11, чтобы сохранить неизменными свойства материала для анализа на этой стадии. В частности, способ по настоящему изобретению имеет то преимущество, что в нем не используется какая-либо стадия, которая может привести к появлению анизотропии свойств этого материала и, таким образом, ухудшить точность и чувствительность анализа, как обсуждалось ранее для стадии ламинирования.

Кроме того, в случае, когда матрица 10 носителя содержит, по меньшей мере, два вкладыша 3, вставляемые, по меньшей мере, в два различных сквозных отверстия 11, эти вкладыши 3 не соединяются частью материала для анализа. Следовательно, если выбирается материал для анализа, существенно отличающийся от материала носителя, маловероятно, что молекулы, которые адсорбируются на данном вкладыше 3, рискуют мигрировать на соседний вкладыш 3.

Таким же образом, если анализируемая жидкость смачивает вкладыш 3, посредством выбора материала носителя с гидрофобностью, отличной от гидрофобности материала для анализа, можно ограничить или даже избежать боковой диффузии анализируемой жидкости от вкладыша 3 к материалу носителя и, возможно, к другому вкладышу 3.

Таким образом, если анализируемый образец представляет собой водный раствор, можно выбрать гидрофильный материал для анализа и гидрофобный материал носителя.

Также можно предусмотреть гидрофильный материал носителя и вкладыш 3 из гидрофобного материала для анализа в случае, когда анализируемый образец представляет собой органическую фазу, не смешивающуюся с водой.

Эта стадия вставки только поступательным движением вдоль оси отверстия 11 позволяет, при сохранении физико-химических свойств материала носителя и материала для анализа, получить в конце всего способа чип 1 для анализа биологического образца, позволяющий качественные анализы высокой чувствительности.

В конкретном варианте осуществления матрица 10 носителя имеет, по меньшей мере, два сквозных отверстия 11, и первый вкладыш 3 вставляется в одно из сквозных отверстий 11 до того, как другой вкладыш 3 вставляется в другое сквозное отверстие 11.

В этом случае последовательно используются по меньшей мере два разных резака.

Этот вариант осуществления позволяет вставлять в два разных сквозных отверстия 11 два вкладыша 3, сформированных из разных анализируемых материалов.

Например, можно приготовить, по меньшей мере, два листа исходно идентичного материала для анализа, но подвергнуть каждый из них различным стадиям биофункционализации, в частности, посредством адсорбции двух разных антигенов.

Вкладыш 31а, на котором адсорбируется первый антиген, можно вставить в первое сквозное отверстие 11 матрицы 10 носителя, а другой вкладыш 31b, на котором адсорбируется второй антиген, можно вставить во второе сквозное отверстие 11 матрицы 10 носителя.

В этом случае вырез или контрольная отметка 12, необязательно сформированная на матрице 10 носителя, может позволить идентифицировать положения различных площадок тестирования.

В случае, когда управление биофункционализацией осуществляется в масштабе листа материала для анализа, а не на отдельных вкладышах 3 на данном чипе и/или на последовательных чипах, можно производить идентичные чипы для анализа в серии с высоким выходом, которые обладают идентичными аналитическими свойствами, что позволяет работать в условиях удовлетворительной повторяемости, даже воспроизводимости. Предел количественного определения, то есть, наименьшая концентрация или содержание анализируемого вещества, которое может определяться количественно с приемлемой неопределенностью, в условиях эксперимента, описанных в способе, может считаться постоянным для серии чипов для анализа, изготовленных автоматически из одних и тех же листов материала для анализа.

Этот предел количественного определения легче контролировать в случае листа, чем в случае одиночного вкладыша 3, для которого краевые эффекты будут играть важную роль.

Также можно ориентировать молекулы-зонды, используемые для функционализации, так, чтобы сайты, с которыми могут связываться тестируемые молекулы, были ориентированы вдоль оси отверстия. Такое расположение позволяет дополнительно повысить чувствительность (или предел количественного определения) анализа. Молекулы-зонды могут, в частности, представлять собой молекулы, описанные в патенте EP3591024B1 (авторы Wong Ka-Leung, Goetz Joan et al.), поданном 05/07/2018, а именно ультраярко-люминесцентные наночастицы лантанидов, содержащие тербий. Таким образом достигаются пределы количественного определения порядка нескольких атомов на микролитр тестируемой жидкости.

В конкретном варианте анализируемый материал не функционализируется и сохраняется в своей нативной структуре на уровне вкладышей 3. Таким образом образуется так называемая «фильтрующий» вкладыш 32, единственной функцией которого является функция фильтрации.

Если наложить чип 1 для анализа биологических образцов, содержащий фильтрующие вкладыши 32, на чип 1 для анализа биологических образцов, содержащий функционализированные вкладыши 31 (31a, 31b и тому подобное) так что каждый фильтрующий вкладыш 32 помещается над функционализированным вкладышем 31 так что вся жидкость, которая проходит через фильтрующий вкладыш 32, достигает соответствующего функционализированного вкладыша 31, таким образом, можно анализировать образец крови без предварительного центрифугирования, при этом эритроциты удерживаются фильтрующим чипом 1 для анализа биологических образцов, в то время как сыворотка или плазма проходят через этот чип для последующего анализа с помощью функционализированного чипа 1 для анализа биологических образцов.

Таким образом, такое расположение значительно экономит время и материал для таких анализов. В конкретном варианте осуществления один или несколько вкладышей 3 могут представлять собой калибровочные вкладыши 33 чипа 1 для анализа биологических образцов.

В конкретном варианте осуществления стадии вставки вкладыша 3 его охлаждают непосредственно перед вставкой до температуры, несколько меньшей температуры матрицы 10 носителя, в которую его нужно вставить. Таким образом, вставка облегчается, но одновременно с вставкой вкладыша 3 он нагревается и, следовательно, расширяется, предпочтительно настолько, чтобы обеспечить его удержание на месте в конце стадии вставки.

Этот вариант осуществления является предпочтительным, когда материал носителя имеет особую жесткость, как в случае с некоторыми пластиковыми материалами. После стадии вставки в сквозное отверстие 11 вкладыш 3 так, чтобы он находился выше, по меньшей мере, части выступа 10а, как показано на Фигуре 3d.

Если чип 1 для анализа биологических образцов находится в состоянии покоя, вкладыш (и) 3 остается на месте в сквозном (ых) отверстии (ях) 11. Таким образом, чип 1 для анализа биологических образцов можно использовать как есть.

Однако, поскольку на стадии вставки не применяется химическая или термическая обработка, нет уверенности в том, что вкладыши 3 останутся на месте, например, из-за принудительного протекания образца жидкости или под действием силы тяжести.

Поэтому четвертая стадия, называемая сборкой, осуществляется таким образом, чтобы закрепить соединение вкладыша (вкладышей) 3 с матрицей 10 носителя.

Для этого к чипу для анализа прикладывают прижимающее усилие по оси сквозного отверстия 11 с помощью двух зажимов 5а, 5b зажимной системы, расположенных ниже и выше оснований вкладыша 3 и, по меньшей мере, части матрицы 10 носителя, которая находится рядом с ним.

Под частью матрицы 10 носителя, примыкающей к вкладышу 3, понимают часть матрицы носителя, которая находится в непосредственной близости от этого вкладыша 3 и ограничивает сквозное отверстие 11, в которое он вставляется. В частности, та часть матрицы 10 носителя, которая находится рядом с вкладышем 3, может включать в себя весь выступ 10а или его часть.

В конкретном варианте осуществления часть матрицы 10 носителя, примыкающая к цилиндрическому вкладышу 3 вдоль оси сквозного отверстия 11 и сечением S, может представлять собой, по меньшей мере, ту часть, которая находится в цилиндрическом объеме с осью сквозного отверстия 11 и сечением S', причем S' получают расширением с коэффициентом больше 1 и с центром на пересечении осей сквозного отверстия и сечения S. Например, если вкладыш 3 имеет цилиндрическую форму с диаметром до 100 микрометров прижимающее усилие можно прикладывать к расположенному в цилиндре участку матрицы носителя с той же осью, что и ранее вставляемый вкладыш 3, и диаметром не менее 101 микрометра, не менее 102 микрометров, не менее 103 микрометров, не менее 104 микрометров, не менее 104 микрометров, не менее 110 микрометров, не менее 120 микрометров, не менее 130 микрометров, не менее 140 микрометров, 150 микрометров.

Если в матрицу 10 носителя вставляется несколько вкладышей 3, те же рассуждения применяются к каждому из вкладышей 3.

В конкретном варианте прижимающее усилие прикладывается с помощью зажимной системы ко всей верхней поверхности и/или нижней поверхности матрицы 10 носителя.

Затем прижимающее усилие может прикладываться с помощью зажимной системы, зажимы 5а, 5b которой при сближении зажимают, по меньшей мере, часть матрицы 10 носителя, которая находится рядом с вкладышем 3, так что часть матрицы 10 носителя сжимает верхнюю поверхность и/или нижнюю поверхность вкладыша 3.

В настоящем варианте осуществления подразумевается, что прижимающее усилие не может включать составляющую в направлении, нормальном к оси сквозного отверстия 11. Таким образом, направление прижимающего усилия является параллельным оси сквозного отверстия 11, так что никакие отличные от исходных анизотропности не вводятся в материал носителя и материал для анализа в направлении, непараллельном оси сквозного отверстия 11. Такое расположение позволяет, в частности, точно контролировать предел количественного определения чипа для анализа.

Как вариант, прижимающее усилие может прикладываться с помощью зажимов 5а, 5b зажимной системы, которые при сближении зажимают, по меньшей мере, часть нижней поверхности и/или верхней поверхности вкладыша 3, которая выступает из матрицы 10 носителя, так что верхняя поверхность и/или нижняя поверхность вкладыша 3 подворачивается внутрь матрицу 10 и сжимает ее.

Таким образом, стадия механической сборки может приводить к обжатию матрицей 10, по меньшей мере, одного вкладыша 3, по меньшей мере, на одной из его нижней и верхней поверхностей. Для простоты авторы считают, что в настоящем документе формулировка предыдущего предложения охватывает два возможных сценария: обжатие матрицы 10 вкладышем 3 или обжатие вкладыша 3 матрицей 10, причем технический результат в обоих случаях является одинаковым, а именно сборка по меньшей мере, одного вкладыша 3 с матрицей 10, становится устойчивой к нагрузкам, прилагаемым вдоль оси сквозного отверстия 11.

Если вкладыш 3 изначально имеет высоту e2, которая меньше, чем высота e1 сквозного отверстия 11, при условии, что нижнее основание вкладыша 3 было размещено выше, по меньшей мере, чем часть выступа 10a, прижимающее усилие, которое прикладывается вдоль оси отверстия, позволяет осуществить обжатие, как показано на Фигурах 4а (в начале стадии сборки), 4b (во время сборки) и 4с (в конце стадии сборки): толщина е'1 материала носителя и e'2 вкладыша 3 в конце стадии сборки меньше, чем их толщины e1 и e2 до этой стадии, а выступ 10а подвернут внутрь по всей окружности вкладыша 3 так, что материал носителя образует закраину над вкладышем 3 и под ним. В конкретном варианте вкладыш 3 обжат матрицей носителя по всей окружности его нижнего основания. В конкретном варианте осуществления вкладыш 3 обжат матрицей носителя по всей окружности его верхнего основания. Вкладыш 3 может быть обжат одновременно по всей окружности его нижнего основания и по всей окружности его верхнего основания.

Следовательно, вкладыш 3 соединяется с матрицей 10 носителя после этой стадии сборки прочнее, чем до этого, и соединение становится устойчивее к разрыву под действием силы, прилагаемой от верхней поверхности к нижней поверхности этого вкладыша. На стадии сборки факт оказания только механического воздействия, причем последнее оказывается в направлении оси сквозного отверстия 11 и, возможно, равномерно распределяется по основаниям вкладыша 3, позволяет сохранить однородность и изотропность физико-химических свойств материала для анализа в плоскостях, перпендикулярных оси рассматриваемого сквозного отверстия 11.

Давление, оказываемое на этой стадии сборки, может выбираться в соответствии с механической прочностью сборки, необходимой для анализа.

Например, можно получить чип 1 для анализа биологических образцов, вкладыши 3 которого остаются на месте при принудительном прохождении через них жидкости за счет разницы давлений между входной и выходной сторонами вкладыша менее 100 мбар (миллибар); менее 200 мбар; менее 300 мбар; менее 400 мбар; ниже 500 мбар; менее 600 мбар; менее 650 мбар; менее 700 мбар; ниже 750 мбар; менее 800 мбар; менее 850 мбар; менее 900 мбар; ниже 950 мбар; менее 1,00 бар.

Направления вверх и вниз по течению понимаются здесь относительно направления и направления потока жидкости.

Считается, что вкладыш 3 для анализа «остается на месте», если по окончании анализа этот вкладыш для анализа еще полностью закрывает сквозное отверстие 11, в которое он был вставлен. В частности, смещение вкладыша 3 в направлении оси сквозного отверстия из-за разницы давлений между его входной и выходной сторонами может происходить без ущерба для качества анализа, проводимого с помощью чипа 1 для анализа биологических образцов.

Если вкладыш 3 для анализа «остается на месте», когда между его входной и выходной сторонами существует разность давлений, тогда указывается, что чип 1 для анализа биологического образца «сопротивляется» соответствующему относительному вакууму.

Верхняя поверхность вкладыша 3 может, в конкретном варианте осуществления, просто подвергаться атмосферному давлению, а нижняя поверхность может располагаться при пониженном давлении. Таким образом, устройство для анализа, содержащее чип 1 для анализа биологического образца, может изготавливаться с принудительной циркуляцией жидкости, что позволяет контролировать время контакта тестируемого образца с вкладышем 3 и, следовательно, воспроизводимость анализа.

Такое расположение также позволяет сократить продолжительность анализов.

В частности, принудительная циркуляция исследуемого образца позволяет избежать или, по меньшей мере, ускорить стадии промывки, обычно необходимые для удаления непрореагировавшей фракции исследуемого образца, а также молекул, адсорбировавшихся неспецифическим образом на мембране. Например, можно осуществить анализ крови в течение 30 минут между внесением образца (не центрифугированного) и получением результата анализа. Обычный тест ELISA требует гораздо большего времени, обычно от 12 до 24 часов.

Механическая сборка осуществляется в твердой фазе и при температуре ниже температуры плавления материала носителя и материала для анализа. Таким образом, эта сборка не использует способ, например, типа сварки, который может изменять естественные свойства материалов или изменять их физическую структуру.

Благодаря способу сборки в соответствии с настоящим изобретением отсутствует возможность миграции материала носителя или растворителя к анализируемому материалу и наоборот, так что анализируемый материал сохраняет свои исходные свойства, то есть свойства перед сборкой с материалом носителя. Кроме того, поверхность раздела между материалом носителя и материалом для анализа является чистой, как это видно на Фигуре 8а, на которой фотография среза чипа 1 для анализа биологического образца в плоскости, содержащей ось цилиндрического сквозного отверстия 11 и представлен диаметр его сечения. В этом случае, как и в случае на Фиг. 8d, материал носителя представляет собой сажевую бумагу, продаваемую компанией Mondi®, плотностью 80 г/м², доступную на дату приоритета настоящей заявки на патент. Она пропитана пищевым парафином Le Parfait® (номер в каталоге 365 EMB 44 026, упаковка 250 г), так что матрица носителя с 9 отверстиями весит 55 мг до пропитки и 77 мг после пропитки. Материалом для анализа представляет собой нитроцеллюлозу (ссылка: Amersham Protran® Premium NitroCellulose с порами s 0.45 пм, GE Healthcare Life Science Nitrocellulose Blotting Membrane Nucleic acid and Protein application № в каталоге 10600008).

Диаметр сквозных отверстий составляет 500 мкм. Фотографии на Фигурах 8a, 8c и 8d получают с помощью бинокулярной лупы (Zeiss, модель STEMI SV8, увеличение x64). Далее следует отметить, что на Фиг.8d и 9 видно, что при увеличении бинокулярной лупы материал для анализа и материал носителя не диффундируют навстречу друг другу. Наконец, на Фиг.8а, 8d и 9 видно, что способ изготовления чипа для анализа позволяет получать лунки с чистыми краями и при этом с размерами порядка десяти-ста микрометров.

Ситуация отличается от случая с Фигурами 8b и 8c, на которых показана фотография чипа для анализа, полученного в процессе печати с использованием принтера с твердой краской, лунки которого имеют диаметр 500 микрометров. На этой фотографии видно, что краска, используемая для формирования лунок, диффундирует к анализируемому материалу, так что сечение лунки не совсем круглое, что влияет на точность анализа, а также на его воспроизводимость, контуры двух разные лунок никогда не бывают строго одинаковыми.

Белые пятна, присутствующие (кроме вкладышей 3) в материале носителя на Фиг.8с, соответствуют областям, в которые диффундирует краска, образующая шарики. Таким образом, материал носителя утратил свои исходные свойства в результате печати, и поэтому количество краски, соответствующее данному вкладышу, неизвестно. Таким образом, воспроизводимость и точность анализа на вкладыше трудно контролировать с помощью этого способа предшествующего уровня техники.

На фигуре 8d, увеличение которой практически такое же, как на фигуре 8с, видно, что наблюдается зернистость материала носителя, но диффузия материала для анализа к материалу носителя отсутствует. То же самое верно и в случае с Фигурой 9.

Таким образом, способ по настоящему изобретению позволяет получить более тонкий контроль вкладышей 3 для анализа, чем способы предшествующего уровня техники.

В конце стадии сборки можно выполнить стадию функционализации одного или нескольких вкладышей 3.

Например, выбранный объем раствора молекул-зондов может наноситься пипеткой или микропипеткой, необязательно автоматически, на один или несколько вкладышей 3.

Биофункционализация чипа 1 для анализа биологических образцов заключается, в частности, в присоединении захватывающей молекулы (например, антитела для обнаружения антигена), нацеленной на сложную биомолекулу, подлежащую обнаружению и количественному определению в биологической жидкости, подлежащей анализу.

В конкретном варианте осуществления рулон с чипами 1 для анализа, в которых уже установлены вкладыши 3, может помещаться в «позиционирующую» машину. Рулон разворачивают для прохождения полосок с чипами 1 для анализа по фильтрующей пластине, соединенной с вакуумным насосом. Инжекционная головка позиционирующей машины вносит, например, за 2 или 3 захода инжектирования объем порядка 10 мкл раствора, содержащего захваченную молекулу, например, при концентрации от 10 до 30 мкг/мл.

Вакуум всасывания можно выбрать таким образом, чтобы обеспечить медленную фильтрацию в течение примерно 20 секунд 10 мкл раствора. Таким образом, все вкладыши 3 каждого чипа 1 для анализа биологических образцов могут обрабатываться одинаковым образом.

Затем можно осуществить второе нанесение в тех же условиях, но с раствором BSA (Bovine Serum Albumin (бычий сывороточный альбумин)), например, при концентрации около 100 мкг/мл. Этот раствор позволяет насытить полярные площадки фильтрующего чипа 1 для анализа биологических образцов, чтобы избежать образования неспецифических связей между биомолекулой, которая будет обнаружена, и поверхностью анализа, например, из нитроцеллюлозы, чипа 1 для анализа биологических образцов.

После инкубации рулона с чипами 1 для анализа, например, при 37°С в течение 30 минут, чипы 1 для анализа можно отделить друг от друга с помощью режущего инструмента, чтобы получить изолированные чипы для анализа с одинаковыми размерами у всех. Таким образом, в конце стадии сборки и, возможно, после функционализации, можно, если это еще не было сделано ранее, разрезать базовые части 12, чтобы отсоединить чип (ы) 1 для анализа от полоски 2 носителя. Чип 1 для биологического анализа для анализа образцов, полученный способом по настоящему изобретению, можно хранить в течение нескольких месяцев при комнатной температуре, предпочтительно в сухой атмосфере (например, под воздухонепроницаемой и водонепроницаемой защитой). В частности, чипы 1 для анализа можно хранить при температуре 20°C +/- 5°C в течение не менее 1 месяца, не менее 2 месяцев, не менее 3 месяцев, не менее 4 месяцев, не менее 5 месяцев, не менее 6 месяцев, не менее 7 месяцев, не менее 8 месяцев, не менее 9 месяцев, не менее 10 месяцев, не менее 11 месяцев, не менее 12 месяцев без изменения их аналитических свойств. В частности, эталонный тест на эталонном биологическом образце статистически даст ту же концентрацию искомого анализируемого вещества (то же самое среднее значение и то же стандартное отклонение) у партии чипов 1 для анализа биологических образцов сразу после изготовления и после хранения при 20°C +/- 5°C в герметичной и водонепроницаемой упаковке (например, в блистерной упаковке) не менее 1 месяца, не менее 2 месяцев, не менее 3 месяцев, не менее 4 месяцев, не менее 5 месяцев, не менее 6 месяцев, не менее 7 месяцев, не менее 8 месяцев, не менее 9 месяцев, не менее 10 месяцев, не менее 11 месяцев, не менее 12 месяцев.

Последние две стадии (вставки и сборки) позволяют контролировать свойства материала носителя независимо от свойств материала для анализа и наоборот, в отличие от способов предшествующего уровня техники.

Как правило, если материал носителя сформирован из металлической пластины, эту металлическую пластину можно предварительно сделать гидрофобной. Например, может осуществляться обработка поверхности, такая как покрытие натуральным или синтетическим воском.

В известных способах такая обработка ограничивает аналитические качества чипов, поскольку воск может неконтролируемым образом мигрировать из материала носителя в материал для анализа, например, на стадии нагревания, химической обработки или сворачивания в рулон. Воск (или любое другое химическое соединение, используемое для обработки поверхности) может препятствовать анализу. Среди прочего наблюдаются явления гашения флуоресценции, которые снижают чувствительность анализа при использовании флуоресцентных молекул-зондов. В настоящем изобретении стадия сборки не приводит к такой неконтролируемой диффузии или миграции парафина. Определенные варианты осуществления даже дают возможность избежать неконтролируемой диффузии или миграции химических веществ из аналитических вкладышей 3 или к этим вкладышам 3. Таким образом, способ по настоящему изобретению позволяет получить чип 1 для анализа биологических образцов, у которого площадки тестирования (другими словами, вкладыши 3 для анализа) формируются с большей точностью, чем в способах предшествующего уровня техники.

Этот анализ также действителен для случая, когда вкладыши 3 функционализируют перед стадией вставки.

Таким образом, авторы могут увидеть преимущество стадии вставки по настоящему изобретению, которая позволяет ограничить взаимодействие между носителем и материалами для анализа, которые находятся в нем, и, таким образом, получить чип 1 для анализа биологического образца с низким пределом количественного определения. Кроме того, на стадиях вставки и сборки площадок тестирования с матрицей носителя не используется растворитель или термическая обработка. Эти стадии можно осуществить с помощью простых инструментов. Таким образом, способ является недорогим, быстрым и не очень загрязняющим окружающую среду.

Поскольку один материал из материала носителя и материала для анализа может быть гидрофильным, в конкретном варианте осуществления будет возможным работать в условиях контролируемой влажности для одной или нескольких стадий процесса, чтобы сохранить точный контроль над геометрией и объемом матрицы 10 носителя и/или вкладышем 3 чипа 1 для анализа биологических образцов.

Чип 1 для анализа биологических образцов, полученный способом по настоящему изобретению, может изготавливаться отдельно. В этом случае анализируемый образец может быть нанесен на один или несколько контактных вкладышей 3 чипа. Или даже несколько анализируемых образцов могут помещаться по одному на один или несколько вкладышей 3, отличных от тех, которые используются для других образцов, одновременно или последовательно.

Чип 1 для анализа биологического образца может для этого размещаться горизонтально, так что данный жидкий образец, подлежащий анализу, стекает с верхней поверхности вкладыша 3, на которую он осаждается, на нижнюю сторону этого же самого вкладыша 3, либо под действием силы тяжести, либо под действием градиента давления, при этом со стороны нижней стороны вкладыша 3 создается относительный вакуум.

Несколько чипов 1 для анализа, в частности, функционально отличающихся друг от друга, могут накладываться друг на друга, как описано в заявке WO 2014/053,237A1, так что образуются разные каналы, причем каждый канал содержит один контактный вкладыш 3 или несколько контактных вкладышей 3, каждый из которых принадлежит другому чипу 1 для анализа биологических образцов.

Такое трехмерное мультиплексное устройство для анализа схематически представлено на Фиг.6. Устройство 7 для анализа состоит из набора твердых пластин 72 носителя, например, из полиметилметакрилата (PMMA) или другого пластикового материала, в которых формируются микроканалы 71 и между которыми вставлены чипы 1 для анализа.

Микроканалы выравниваются друг с другом, и места анализа (то есть вкладыши 3) чипов 1 для анализа вставляются между двумя микроканалами двух последовательных пластин 72 носителя. Также возможно наложение нескольких чипов 1 для анализа между двумя последовательными пластинами 72 носителя. В этом случае, если разные анализируемые образцы исследуются в разных каналах, и можно выполнить трехмерный мультиплексный анализ.

Проще говоря, можно создать устройство для анализа 7, содержащее четыре опоры, на которых своими четырьмя углами закреплен чип 1 для анализа биологических образцов. Эти два примера не являются ограничивающими. Обнаружение интересующего анализируемого вещества может осуществляться с помощью иммунологического анализа типа ELISA: после того, как комплекс захватывающей молекулы/интересующей биомолекулы образовался на площадках тестирования (или в эквивалентных лунках) чипа 1 для анализа биологического образца, добавляют выявляющее антитело, которое специфически связывается с комплексом захватывающая молекула/биомолекула. Флуоресценция или новый цвет, появляющийся в каждой лунке, измеряется с помощью такого устройства, как фотоумножитель или камера типа CMOS, в сочетании с компьютерной программой, которая выполняет расчеты.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к устройству 7 для анализа, содержащему, по меньшей мере, один чип 1 для анализа биологических образцов.

Устройство 7 для анализа может содержать несколько чипов 1 для анализа, в частности, наложенных друг на друга, как описано выше.

Изобретение также относится к диагностическому набору, содержащему по меньшей мере один чип 1 для анализа биологических образцов.

Диагностический набор может также содержать носитель для чипа 1 для анализа биологических образцов и/или, по меньшей мере, один реагент для анализа. Реагент для анализа может, в частности, содержать одно или несколько антител, или один или несколько антигенов для проведения иммунологического теста. Реагент для анализа также может быть индикатором.

В случае настоящей заявки термин «иммунологический тест» («иммуноанализ») понимается как тест, в котором используется, по меньшей мере, один антиген для обнаружения антител, направленных против патогенного агента, в образце или, по меньшей мере, одно антитело для обнаружения антигена возбудителя в образце.

Реагент для анализа также может представлять собой буфер, например, солевой фосфатный буфер (PBS) или другой раствор, например, раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA).

Настоящее изобретение относится к использованию чипа 1 для анализа биологических образцов в диагностических целях или для проведения иммунологического теста. В частности, серологические исследовательские тесты при количественном определении антител иммуноглобулина типа G или M (IgG или IgM) могут осуществляться после функционализации чипа 1 для анализа биологических образцов соответствующим антигеном. Чип 1 для анализа биологических образцов также может функционализироваться для поиска и количественного определения белков теплового шока, таких как белки семейства HSP60, с помощью специфичного антитела, например, флуоресцентного. Полипопротеин А ApoA1 или даже медиаторы воспаления, такие как С-реактивный белок (CRP) или панкреатический стабилизирующий белок PSP («белок панкреатического камня»), можно обнаруживать посредством осуществления иммуноферментного метода на чипе 1 для анализа биологических образцов.

Наконец, изобретение относится к устройству для изготовления чипа 1 для анализа биологических образцов в соответствии с любым из вариантов осуществления, содержащему:

- систему вставки, пригодную для вставки, по меньшей мере, одного вкладыша 3, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие 11 матрицы 10 посредством поступательного перемещения вкладыша 3 в направлении, нормальном к верхней и нижней поверхностям матрицы 10.

- систему механической сборки при температуре ниже температуры плавления материала носителя и материала для анализа, адаптированную для приложения прижимающего усилия в направлении, нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы 10, по меньшей мере, на той части матрицы 10, которая находится рядом по меньшей мере, с одним вкладышем 3, вставляемым в матрицу 10, и/или, по меньшей мере, на одной из указанных нижней и верхней поверхностей, по меньшей мере, одного вкладыша 3, вставляемого в матрицу 10.

Устройство для изготовления чипа 1 для анализа биологических образцов может, в частности, содержать один или несколько пробойников, каждый из содержащихся одного или нескольких пробойников, может быть идентичным остальным или отличаться от них, и их ход является регулируемым, и один или несколько ответных элементов.

Устройство для изготовления чипа 1 для анализа биологических образцов может быть полностью автоматизировано.

Список ссылочных обозначений

1: чип для анализа

10: матрица носителя

10a: выступ материала носителя

11: отверстие в матрице носителя 10

11a, 11b: часть сквозного отверстия 11

11c: канал, соединяющий две части 11а и 11b.

12: вырез/контрольная отметка

2: полоска носителя

21: базовая часть

3: вкладыш с материалом для анализа

31 a, b, c: функционализированный вкладыш 3

32: фильтрующий вкладыш

33: калибровочный вкладыш

4: направляющая для резки

42: пробойник резака

5а, 5b: зажимы пресса

6: лист материала для анализа

7: устройство для мультиплексного анализа

71: микроканал

72: пластина носителя

Группа изобретений относится к области биологических анализов. Раскрыт способ изготовления чипа для анализа биологических образцов, включающий обеспечение матрицы (10), обеспечение, по меньшей мере, одного вкладыша (3), вставку, по меньшей мере, одного вкладыша (3), по меньшей мере, в одно сквозное отверстие (11) матрицы (10) посредством поступательного перемещения, по меньшей мере, одного вкладыша (3) в направлении, нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы (10), осуществление механической сборки при температуре ниже температур плавления материала носителя и материала для анализа, в ходе которой прикладывают прижимающее усилие, причем указанная механическая сборка, по меньшей мере, одного вкладыша (3) с матрицей (10) приводит к обжатию, по меньшей мере, одного вкладыша (3) матрицей (10) на, по меньшей мере, части его нижней и верхней поверхностей. Также раскрыты чип (1) для анализа биологических образцов и его применение для обнаружения сложных биомолекул в биологических средах, устройство и диагностический набор, содержащие указанный чип, а также устройство для изготовления указанного чипа. Группа изобретений позволяет не вводить анизотропию в материал носителя и анализируемый материал, что улучшает чувствительность и воспроизводимость анализа для чипа. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 18 ил.

1. Способ изготовления чипа для анализа биологических образцов, содержащий:

- обеспечение матрицы (10), сформированной из материала твердого носителя, имеющей нижнюю поверхность и верхнюю поверхность, и в которой сформировано, по меньшей мере, одно отверстие (11), проходящее между указанной нижней и указанной верхней поверхностями; где указанное сквозное отверстие (11) представляет собой цилиндр вращения;

- обеспечение, по меньшей мере, одного вкладыша (3), вырезанного из листа (6) твердого и пористого материала для анализа, причем указанный вкладыш имеет нижнюю поверхность и верхнюю поверхность;

- вставку, по меньшей мере, одного вкладыша (3), по меньшей мере, в одно сквозное отверстие (11) матрицы (10) посредством поступательного перемещения, по меньшей мере, одного вкладыша (3) в направлении, нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы (10);

- осуществление механической сборки при температуре ниже температур плавления материала носителя и материала для анализа, в ходе которой прикладывают прижимающее усилие в направлении, нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы (10), по меньшей мере, к одной части матрицы (10), которая примыкает, по меньшей мере, к указанному, по меньшей мере, одному вкладышу (3), вставляемому в матрицу (10), и/или, по меньшей мере, к одной из нижней и верхней поверхностей, по меньшей мере, одного вкладыша (3), вставляемого в матрицу (10), причем указанная механическая сборка, по меньшей мере, одного вкладыша (3) с матрицей (10) приводит к обжатию, по меньшей мере, одного вкладыша (3) матрицей (10) на, по меньшей мере, части его нижней и верхней поверхностей.

2. Способ изготовления чипа (1) для анализа биологических образцов по п.1, отличающийся тем, что указанное прижимающее усилие прикладывают к части матрицы (10), которая примыкает к, по меньшей мере, одному вкладышу (3), вставляемому в матрицу (10).

3. Способ изготовления чипа (1) для анализа биологических образцов по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанное прижимающее усилие прикладывают, по меньшей мере, к одной из нижней и верхней поверхностей, по меньшей мере, одного вкладыша (3), вставляемого в матрицу (10).

4. Способ изготовления чипа (1) для анализа биологических образцов по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что материал носителя является гидрофобным, а материал для анализа является гидрофильным, или наоборот.

5. Способ изготовления чипа (1) для анализа биологических образцов по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что для вставки, по меньшей мере, одного вкладыша (3), по меньшей мере, в одно сквозное отверстие (11), по меньшей мере, один вкладыш (3) поступательно перемещается, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие (11) с помощью пробойника, при этом, по меньшей мере, один вкладыш (3) вырезается из листа (6) материала для анализа перед его вставкой с помощью этого же пробойника, и тем, что, по меньшей мере, одно сквозное отверстие (11) предварительно формируется в матрице (10) с помощью этого же пробойника.

6. Способ изготовления чипа (1) для анализа биологических образцов по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что после механической сборки осуществляют функционализацию, по меньшей мере, одного вкладыша (3).

7. Способ изготовления чипа (1) для анализа биологических образцов по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что функционализацию материала для анализа проводят перед вставкой, по меньшей мере, одного вкладыша (3) в матрицу (10).

8. Способ изготовления чипа (1) для анализа биологических образцов по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что перед вставкой, по меньшей мере, одного вкладыша (3) в матрицу (10), по меньшей мере, один вкладыш (3) доводится до температуры ниже температура матрицы (10).

9. Способ изготовления чипа (1) для анализа биологических образцов по пп.5 и 7, отличающийся тем, что вставку, по меньшей мере, одного вкладыша (3) в матрицу (10) повторяют еще раз, используя для каждой новой вставки функционализированный материал для анализа, отличающийся от того, который использовался для предыдущей вставки, и пробойник, соответствующий, по меньшей мере, одному сквозному отверстию (11) матрицы (10), отличному от того, который использовался для предыдущей вставки.

10. Чип (1) для анализа биологических образцов, содержащий:

- матрицу (10), сформированную в твердом материале носителя, имеющем нижнюю поверхность и верхнюю поверхность и в котором образовано, по меньшей мере, одно сквозное отверстие (11), проходящее между указанными нижней и верхней поверхностями; причем указанное сквозное отверстие (11) представляет собой цилиндр вращения;

- по меньшей мере, один вкладыш (3), вставляемый, по меньшей мере, в одно сквозное отверстие (11), при этом, по меньшей мере, один вкладыш (3) имеет нижнюю поверхность и верхнюю поверхность, причем, по меньшей мере, один вкладыш (3) содержит твердый и пористый материал для анализа,

и отличающийся тем, что, по меньшей мере, один вкладыш (3) обжат, по меньшей мере, на одной из его верхней и нижней поверхностей матрицей (10).

11. Чип (1) для анализа биологических образцов по п.10, в котором материал носителя содержит, по меньшей мере, один компонент, выбранный из металла, пластика и целлюлозы или их сочетания, и при этом материал для анализа, из которого формируется, по меньшей мере, один вкладыш (3), содержит, по меньшей мере, один компонент, выбранный из нитроцеллюлозы, целлюлозы и органического полимера.

12. Чип (1) для анализа биологических образцов по любому из пп.10, 11, в котором сборка, по меньшей мере, из одного вкладыша (3) и матрицы (10) является устойчивой, по меньшей мере, при относительном вакууме, равном 0,100 бар.

13. Устройство для анализа, содержащее, по меньшей мере, два чипа (1) для анализа биологических образцов по одному из пп.10-12, наложенных друг на друга, и в котором, по меньшей мере, один вкладыш (3) одного из, по меньшей мере, двух чипов выполнен с возможностью выполнения функции фильтрации и накладывается на, по меньшей мере, один функциональный вкладыш (3) другого чипа из, по меньшей мере, двух чипов.

14. Диагностический набор, содержащий, по меньшей мере, один чип (1) для анализа биологических образцов по одному из пп.10-12 и, по меньшей мере, один реагент для анализа.

15. Применение чипа (1) для анализа биологических образцов по любому из пп.10-12 для обнаружения сложных биомолекул в биологических средах.

16. Устройство для изготовления чипа (1) для анализа биологических образцов по любому из пп.10-12, указанное устройство для изготовления содержит:

- систему вставки, пригодную для вставки, по меньшей мере, одного вкладыша (3) в, по меньшей мере, одно сквозное отверстие (11) матрицы (10) посредством поступательного перемещения вкладыша (3) в направлении, нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы (10);

- систему механической сборки при температуре ниже температуры плавления материала носителя и материала для анализа, адаптированную для приложения прижимающего усилия в направлении, нормальном к нижней и верхней поверхностям матрицы (10), по меньшей мере, на части матрицы (10), которая примыкает к, по меньшей мере, одному вкладышу (3), вставляемому в матрицу (10), и/или, по меньшей мере, с одной из указанных нижней и верхней поверхностей, по меньшей мере, одного вкладыша (3), вставляемого в матрицу (10); причем указанная механическая сборка, по меньшей мере, одного вкладыша (3) с матрицей (10) приводит к обжатию, по меньшей мере, одного вкладыша (3) матрицей (10) на, по меньшей мере, части его нижней и верхней поверхностей.