ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ЧИП Российский патент 2010 года по МПК G01N33/543 

Область техники

Настоящее изобретение относится к иммунологическому анализу для измерения количества специфического компонента в растворе образца с использованием реакции антиген-антитело, в частности к иммунологическому анализу, подходящему для проведения на чипе. Кроме того, настоящее изобретение также относится к чипу, подходящему для проведения иммунологического анализа.

Уровень техники

Иммунологические анализы привлекают внимание как способ высокоточной идентификации и количественного определения белков, таких как белок вирусов, бактерий и аллергенного вещества, содержащихся в биологических образцах (например, в крови).

В общих чертах иммунологический анализ делят на иммунонефелометрию и анализ иммунного мечения. Иммунонефелометрия представляет собой способ определения изменения мутности раствора образца, вызванной комплексами антиген-антитело, образуемыми в результате реакции антиген-антитело. Анализ иммунного мечения представляет собой способ определения изменения количества метящего вещества (метки) после реакции антиген-антитело с использованием антитела, меченного метящим веществом.

Анализ иммунного мечения делят на подклассы в соответствии с типом метящего вещества. Их примеры включают радиоиммунный анализ, в котором радиоактивный изотоп используют в качестве метки, иммуноферментный анализ (EIA), в котором используют фермент, и иммунофлуоресцентный анализ, в котором используют флуоресцентное вещество. При EIA, по сравнению с другими методами иммунного мечения, безопасность метящего вещества выше, его можно проводить более простым способом, а точность измерения выше. Таким образом, EIA используют часто.

Типичным примером EIA является твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Пример ELISA описан со ссылкой на фиг.1.

Стадия 1-A: Образование твердофазного антигена

Раствор, содержащий иммобилизуемый антиген, имеющий эпитоп, идентичный эпитопу подлежащего измерению антигена, помещают в реакционную камеру 7 и поддерживают при заданной температуре заданный период времени и, таким образом, иммобилизуемому антигену позволяют адсорбироваться на поверхности реакционной камеры 7. После этого иммобилизуемый антиген, которому позволяют адсорбироваться, покрывают белком, который не вовлечен в последующую реакцию антиген-антитело и ферментативную реакцию (блокирование). Таким образом, внутри реакционной камеры 7 образуется твердофазный антиген 6. Твердофазный антиген 6 фиксируется на поверхности реакционной камеры 7 и, таким образом, не удаляется из реакционной камеры 7 промыванием, описанным ниже.

Стадия 1-B: Реакции связывания между антителом и подлежащим измерению антигеном, а также твердофазным антигеном

Антитело 3, которое специфически связывается с подлежащим измерению антигеном 2, добавляют к раствору 9 образца. Антитело 3 метят метящим веществом (например, ферментом) 4. После этого раствор 9 образца, содержащий антитело 3, помещают в реакционную камеру 7. Таким образом, в реакционной камере 7 между антителом 3 и подлежащим измерению антигеном 2, а также твердофазным антигеном 6 происходит реакция антиген-антитело.

Стадия 1-C: Удаление непрореагировавшего антитела и комплекса антиген-антитело

Используя промывающий раствор 10, типичным примером которого является буфер Tris-HCl, промывают внутреннюю часть реакционной камеры 7. Таким образом, комплекс антиген-антитело, образованный посредством связывания антитела 3 с подлежащим измерению антигеном 2, и антитело 3, которое не связалось с твердофазным антигеном 6, удаляют из реакционной камеры 7. Соответственно, конъюгат твердофазного антигена 6 и антитела 3 остается в реакционной камере 7.

Затем измеряют количество метящего вещества 4 конъюгата твердофазного антигена 6 и антитела 3, оставшегося в реакционной камере 7. Это измерение проводят, например, следующим образом. Сначала получают раствор, содержащий реагент для измерения (например, субстрат фермента), который реагирует с метящим веществом 4. Затем этот раствор помещают в реакционную камеру 7 и, таким образом, получают раствор для измерения, который содержит реагент для измерения и конъюгат твердофазного антигена 6 и антитела 3. После того как в растворе для измерения дадут пройти реакции между реагентом для измерения и метящим веществом 4, детектируют сигнал, отражающий количество продукта реакции.

В результате этого измерения вычисляют количество измеряемого антигена 2 в растворе 9 образца на основании количества твердофазного антигена 6 и количества раствора 9 образца, помещенного в реакционную камеру на стадии 1-B.

С точки зрения измерения количества вещества, измеряемого в растворе образца с использованием небольшого количества раствора образца в течение короткого промежутка времени, заслуживает внимания биосенсор в виде чипа. Например, в JP 2(1990)-062952 A описан биосенсор в виде чипа, содержащий изолирующую подложку чипа, систему электродов, расположенную на подложке чипа, ферментативный реакционный слой, расположенный на системе электродов, и изоляционный слой, который содержит прорези и расположен над подложкой чипа таким образом, что система электродов и ферментативный реакционный слой являются доступными. Ферментативный реакционный слой содержит реагент для измерения, типичным примером которого является оксидоредуктаза, и переносчик электронов для индукции циклической ферментативной реакции. В качестве оксидоредуктазы используют фермент, содержащий в качестве субстрата вещество, подлежащее измерению. Например, для измерения количества глюкозы используют глюкозооксидазу, а при измерении количества холестерина используют холестериноксидазу. В этом биосенсоре раствор образца по каплям наносят внутрь прорезей, так что реагент для измерения растворяется в растворе образца. Таким образом, протекает реакция между ферментом и измеряемым веществом с помощью переносчика электронов (ферментативная циклическая реакция). Количество измеряемого вещества в растворе образца вычисляют на основании значения тока окисления, полученного электрохимическим окислением переносчика электронов, восстановленного ферментативной реакцией.

В общепринятом иммунологическом анализе, показанном на фиг.1, как описано выше, стадию 1-C проводят с использованием промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl. Таким образом, для осуществления иммунологического анализа на чипе необходимо подавать промывающий раствор извне чипа или предусмотреть, чтобы промывающий раствор заранее находился на чипе. Однако когда промывающий раствор подают извне чипа, требуются дополнительное время и усилие. Если промывающему раствору позволяют находиться на чипе, желательно, чтобы этот раствора на чипе был в герметичном состоянии и в состоянии, которое облегчает его введение в реакционную камеру для промывания. Однако обеспечить такое состояние хранения на чипе не так просто.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предназначено для проведения иммунологического анализа, который не требует промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl, подаваемого извне чипа или помещенного заранее на чип, пригодного для использования на чипе. Кроме того, настоящее изобретение предназначено для предоставления чипа, который является подходящим для осуществления этого иммунологического анализа. Настоящее изобретение также предназначено для предоставления способа измерения с использованием этого чипа.

Как правило, в иммунологическом анализе для промывания реакционной камеры считают важным использование промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl, который не содержит подлежащих измерению соединений, таких как белок. Однако неожиданно было обнаружено, что сигнал, отражающий количество вещества, подлежащего измерению, также определяют с очень высокой точностью до степени, сравнимой со случаем использования промывающего раствора, даже при промывании реакционной камеры с использованием биологического образца, содержащего подлежащее измерению вещество, например белок, вместо промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl.

Настоящее изобретение относится к способу измерения количества подлежащего измерению антигена, который находится в растворе образца, с использованием чипа. Чип содержит реакционную камеру, камеру, содержащую промывающий раствор, сточную камеру и отверстие для введения раствора образца. Отверстие для введения образца и реакционная камера соединены друг с другом через первый канал. Отверстие для введения образца и камера, содержащая промывающий раствор, соединены друг с другом через второй канал. Камера, содержащая промывающий раствор, и реакционная камера соединены друг с другом через третий канал. Кроме того, реакционная камера и сточная камера соединены друг с другом через четвертый канал. Способ включает стадии: введения раствора образца через отверстие для введения образца и распределения раствора образца в реакционную камеру и в камеру, содержащую промывающий раствор, через первый канал и второй канал, соответственно; получения комплекса антиген-антитело, позволяющего подлежащему измерению антигену, который содержится в растворе образца, связываться с антителом, которое специфически связывается с подлежащим измерению антигеном в реакционной камере; отделения комплекса антиген-антитело и антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, друг от друга путем введения раствора образца, находящегося в камере, содержащей промывающий раствор, в реакционную камеру через третий канал и промывания реакционной камеры, содержащей комплекс антиген-антитело, чтобы оставить одно из i) комплекса антиген-антитело и ii) антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, в реакционной камере, а остальное переместить в сточную камеру; измерения количества комплекса антиген-антитело или антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном; и вычисления количества подлежащего измерению антигена, которое содержится в растворе образца, исходя из конечного количества комплекса антиген-антитело или антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу измерения количества подлежащего измерению антигена, которое содержится в растворе образца. Способ включает: стадию связывания для получения комплекса антиген-антитело, позволяющего подлежащему измерению антигену, который содержится в растворе образца, связаться с антителом, которое специфически связывается с подлежащим измерению антигеном в реакционной камере; стадию промывания и разделения, состоящую из промывания реакционной камеры раствором образца для разделения комплекса антиген-антитело от антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном; стадию измерения количества комплекса антиген-антитело или антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном; и стадию вычисления количества подлежащего измерению антигена, которое содержится в растворе образца, исходя из общего количества комплекса антиген-антитело или антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет чип для измерения количества подлежащего измерению антигена, содержащегося в растворе образца. Чип содержит реакционную камеру, камеру, содержащую промывающий раствор, сточную камеру и отверстие для введения раствора образца. Отверстие для введения образца и реакционная камера соединены друг с другом через первый канал. Отверстие для введения образца и камера, содержащая промывающий раствор, соединены друг с другом через второй канал. Камера, содержащая промывающий раствор, и реакционная камера соединены друг с другом через третий канал. Кроме того, реакционная камера и сточная камера соединены друг с другом через четвертый канал. В чипе раствор образца, введенный через отверстие для введения образца, поступает в реакционную камеру и в камеру, содержащую промывающий раствор, через первый канал и второй канал, соответственно. В реакционной камере подлежащему измерению антигену позволяют связаться с антителом, которое специфически связывается с подлежащим измерению антигеном, и, таким образом, получают комплекс антиген-антитело. Затем раствор образца, находящийся в камере, содержащей промывающий раствор, поступает в реакционную камеру через третий канал для промывания реакционной камеры, содержащей комплекс антиген-антитело. Таким образом, одно, выбранное из i) комплекса антиген-антитело и ii) антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, остается в реакционной камере, а остальное переносится в сточную камеру. Таким образом, комплекс антиген-антитело и антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, разделяют.

В соответствии с настоящим изобретением при проведении иммунологического анализа реакционную камеру можно промывать до степени, которая позволяет обнаруживать сигнал, отражающий количество подлежащего измерению вещества, без использования промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой блок-схему для пояснения одного из примеров общепринятого иммунологического анализа.

Фиг.2 представляет собой блок-схему для пояснения одного из примеров иммунологического анализа по настоящему изобретению.

Фиг.3 представляет собой блок-схему для пояснения одного из примеров иммунологического анализа по настоящему изобретению, который проводят с использованием немеченого первичного антитела и меченого вторичного антитела.

Фиг.4 представляет собой диаграмму для описания одного из примеров чипов по настоящему изобретению.

Фиг.5 представляет собой блок-схему для пояснения одного из примеров, в котором реакцию антиген-антитело между антителом и подлежащим измерению антигеном проводят сэндвич-способом.

На фиг.6 представлена кривая, изображающая результат измерения оптической плотности.

Описание предпочтительных способов осуществления

Пример иммунологического анализа по настоящему изобретению описан со ссылкой на блок-схему, приведенную на фиг.2.

Стадия 2-A: Образование твердофазного антигена

Твердофазный антиген 6 образуют путем фиксирования на поверхности реакционной камеры 7 заданного количества иммобилизуемого антигена, имеющего эпитоп, идентичный эпитопу специфического белка (подлежащего измерению антигена 2), содержащегося в растворе образца. Фиксацию иммобилизуемого антигена можно проводить, например, таким же образом, как на стадии 1-A, используемым в общепринятом ELISA.

Примеры материала для реакционной камеры 7 включают смолы, такие как полистирол, полиэтилентерефталат (PET), поликарбонат и полидиметилсилоксан, стекло и магнитные материалы. Реакционная камера 7 желательно имеет форму, способную удерживать жидкость, например по типу пробирки или по типу лунки, типичным примером которой является микропланшет.

Стадия 2-B: Стадия связывания

Вводят заданное количество части 1 раствора образца. Примеры раствора образца включают образцы биологических жидкостей, таких как кровь, моча, слюна, пот и слеза. Антитело 3, меченное метящим веществом 4, добавляют к части 1 раствора образца. Антитело 3 представляет собой первичное антитело, которое специфически связывается с подлежащим измерению антигеном 2. Другую часть 8 раствора образца резервируют без добавления в нее антитела 3. Антитело 3 может представлять собой коммерчески доступное антитело или антитело, самостоятельно полученное с использованием лабораторных животных. Антитело 3 может представлять собой поликлональное антитело, но предпочтительно представляет собой моноклональное антитело, с точки зрения повешения специфичности и чувствительности реакции антиген-антитело. Примеры подлежащего измерению антигена 2 включают белки, заслуживающие особого клинического внимания, такие как C-реактивный белок (CRP), сывороточный амилоид A, тропонин T, креатинкиназа MB и ретинол-связывающий белок. Метящее вещество 4 предпочтительно представляет собой фермент, но может представлять собой флуоресцентный краситель или, кроме того, радиоактивный изотоп.

Часть 1 раствора образца в состоянии сразу после добавления к ней меченого антитела 3 помещают в реакционную камеру 7, в которой зафиксирован твердофазный антиген 6. С помощью этого действия часть 1 раствора образца вводят в реакционную камеру 7. После введения часть 1 раствора образца поддерживают в реакционной камере 7 при заданной температуре в течение заданного периода времени. Таким образом, проходит конкурентная реакция антиген-антитело между антителом 3 и твердофазным антигеном 6, а также между подлежащим измерению антигеном 2, и в реакционной камере 7 образуются комплекс антиген-антитело, представляющий собой конъюгат подлежащего измерению антигена 2 и антитела 3, а также конъюгат твердофазного антигена 6 и антитела 3. Поскольку конъюгат твердофазного антигена 6 и антитела 3 не связывается с подлежащим измерению антигеном 2, конъюгат обозначают как "антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном", как в случае с антителом 3 в настоящем описании. Как описано выше, иммунологический анализ по настоящему изобретению можно осуществить указанным ниже образом. А именно, твердофазный антиген фиксируют в реакционной камере и на стадии связывания получают комплекс антиген-антитело и антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, связавшееся с твердофазным антигеном.

Реакция антиген-антитело, которая проходит в реакционной камере 7, может быть неконкурентной реакцией. Неконкурентную реакцию можно проводить следующим образом. Часть 1 раствора образца, к которой добавляли меченое антитело 3, поддерживают при заданной температуре в течение заданного периода времени, а затем вводят в реакционную камеру 7. После того как реакции между подлежащим измерению антигеном 2 и меченым антителом 3 дают достичь равновесного состояния, часть 1 раствора образца вводят в реакционную камеру 7. Затем антителу 3, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном 2, и твердофазному антигену 6 дают взаимодействовать друг с другом. Таким образом, протекает неконкурентная реакция. Температуру и период времени, позволяющие протекать реакции антиген-антитело, соответствующим образом устанавливают согласно типу антигена и антитела. То же применимо к следующей ниже реакции антиген-антитело.

Стадия 2-C: Стадия промывания и разделения

Реакционную камеру 7 промывают, используя оставшуюся часть 8 раствора образца, зарезервированную на стадии связывания (стадия 2-B). Это промывание можно проводить, например, следующим образом. Сначала, с помощью пипетки, из реакционной камеры 7 удаляют часть 1 раствора образца. Затем оставшуюся часть 8 раствора образца, с помощью пипетки, по каплям вносят в реакционную камеру 7 и несколько раз проводят пипетирование. После этого оставшуюся часть 8 раствора образца удаляют из реакционной камеры 7. Таким образом, комплекс антиген-антитело удаляют из реакционной камеры 7, а антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, остается. Соответственно, комплекс антиген-антитело и антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, полученные на стадии связывания (стадия 2-B), разделяют. Таким образом, реакционную камеру можно промывать с использованием раствора образца без использования промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl. Как описано выше, для промывания реакционной камеры, как правило, полагают важным использование промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl. Это предназначено для отделения друг от друга комплекса антиген-антитело и антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, без загрязнения примесями. Однако даже когда реакционную камеру промывают раствором образца, как описано выше, комплекс антиген-антитело и антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, по-видимому, можно с высокой точностью отделить друг от друга, поскольку, как описано ниже в примере, сигнал, отражающий количество измеряемого вещества, может быть определен с очень высокой точностью до степени, сравнимой со случаем, где реакционную камеру промывают промывающим раствором, типичным примером которого является буфер Tris-HCl.

Стадия измерения

Измеряют количество метящего вещества 4 антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном и осталось в реакционной камере 7. Например, это измерение можно проводить следующим образом. Сначала готовят раствор, содержащий реагент для измерения. Реагент для измерения выбирают согласно типу метящего вещества 4. Например, он может представлять собой субстрат фермента, когда метящее вещество 4 представляет собой фермент. Затем раствор вводят в реакционную камеру 7 и, таким образом, в реакционной камере 7 получают раствор для измерения, содержащий реагент для измерения и антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном. В растворе для измерения дают протекать реакции между реагентом для измерения и метящим веществом 4 антитела, не связавшегося с подлежащим измерению антигеном. После этого, с использованием, например, общеизвестных оптических средств для измерения или электрохимических средств для измерения, проводят определение величины сигнала, отражающего количество продукта реакции.

Стадия вычисления

На основе результата измерения, полученного на стадии измерения, вычисляют количество подлежащего измерению антигена. В частности, количество подлежащего измерению антигена 2 вычисляют исходя из количества твердофазного антигена 6, который зафиксирован в реакционной камере 7, и количества части 1 раствора образца, которую вводили в реакционную камеру на стадии связывания (стадия 2-B), полученных в результате измерений, описанных выше. Количество подлежащего измерению антигена может быть выражено в виде физической величины, которая может быть ассоциирована с указанным выше количеством, например, в виде концентрации. Таким образом, количество подлежащего измерению антигена, содержащегося в растворе образца, вычисляют исходя из количества антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, или количества комплекса антиген-антитело, как описано ниже, которые были измерены на стадии измерения.

Другой пример иммунологического анализа по настоящему изобретению описан со ссылкой на блок-схему, приведенную на фиг.5. В этом примере реакцию антиген-антитело между антителом и подлежащим измерению антигеном проводят сэндвич-способом.

Стадия 5-A: Получение связанного с твердой фазой антитела

Заданное количество иммобилизуемого антитела для связывания с подлежащим измерению антигеном 2, который содержится в растворе образца, фиксируют на поверхности реакционной камеры 7 и, таким образом, получают связанное с твердой фазой антитело 19. Фиксацию иммобилизуемого антитела можно проводить, например, таким же образом, как на стадии 2-A в иммунологическом анализе, показанном на фиг.2.

Стадии от 5-B до 5-D: Стадии связывания

Вводят заданное количество раствора образца. Таким образом, готовят часть 1 раствора образца и оставшуюся часть 8 раствора образца.

Часть 1 раствора образца вводят в реакционную камеру 7, в которой зафиксировано связанное с твердой фазой антитело 19 (стадия 5-B). С помощью этого действия часть 1 раствора образца вводят в реакционную камеру 7. Часть 1 раствора образца, введенную таким образом в реакционную камеру 7, поддерживают при заданной температуре в течение заданного периода времени. Таким образом, реакция антиген-антитело протекает между связанным с твердой фазой антителом 19 и подлежащим измерению антигеном 2, и в реакционной камере 7 образуется конъюгат подлежащего измерению антигена 2 и связанного с твердой фазой антитела 19.

Затем реакционную камеру 7 промывают оставшейся частью 8 раствора образца (стадия 5-C). На этой стадии используют не всю оставшуюся часть 8 раствора образца и остаток сохраняют для того, чтобы использовать на стадии промывания и разделения (стадия 5-E), описанной ниже. Это промывание (стадия 5-C) можно проводить таким же образом, как на стадии 2-C, используемой в иммунологическом анализе, показанном на фиг.2. Однако поскольку оставшаяся часть 8 раствора образца содержит подлежащий измерению антиген 2, желательным является достаточно быстрое удаление его из реакционной камеры 7 для предотвращения протекания реакции антиген-антитело между подлежащим измерению антигеном 2 и связанным с твердой фазой антителом 19. При этом промывании (стадия 5-C) подлежащий измерению антиген 2, который не связался со связанным с твердой фазой антителом 19 на стадии 5-B, удаляют из реакционной камеры 7. Таким образом, конъюгат подлежащего измерению антигена 2 и связанного с твердой фазой антитела 19 остается в реакционной камере 7.

После этого в реакционную камеру 7 вводят раствор 30. Раствор 30 получают добавлением заданного количества антитела 3, меченного метящим веществом 4, к растворителю, не содержащему белок, имеющий эпитоп, идентичный эпитопу подлежащего измерению антигена 2. Используемое здесь антитело 3 представляет собой первичное антитело, которое также может связываться с подлежащим измерению антигеном 2, связавшимся со связанным с твердой фазой антителом 19. Примером растворителя для раствора 30 является буфер Tris-HCl. Раствор 30, введенный, как описано выше, поддерживают в реакционной камере 7 при заданной температуре в течение заданного периода времени (стадия 5-D). Таким образом, проходит реакция антиген-антитело между меченым антителом 3 и подлежащим измерению антигеном 2, который не связался со связанным с твердой фазой антителом 19. Эта реакция антиген-антитело приводит к образованию комплекса антиген-антитело, который представляет собой конъюгат связанного с твердой фазой антитела 19, подлежащего измерению антигена 2 и антитела 3, а также антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, и представляет собой несвязанный остаток 21 меченого антитела 3. Несвязанный остаток 21 антитела 3 присутствует в растворе 30 в высвобожденном с поверхности реакционной камеры 7 состоянии.

Иммунологический анализ по настоящему изобретению может быть осуществлен указанным ниже способом. А именно, в реакционную камеру помещают связанное с твердой фазой антитело, дают связанному с твердой фазой антителу и подлежащему измерению антигену связаться друг с другом на стадии связывания, затем части антитела дают связаться с подлежащим измерению антигеном, связавшимся со связанным с твердой фазой антителом, и, таким образом, получают комплекс антиген-антитело, представляющий собой конъюгат связанного с твердой фазой антитела, подлежащего измерению антигена и указанной выше части антитела, а также антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном и которое представляет собой несвязанный остаток антитела.

Стадия 5-E: Стадия промывания и разделения

Реакционную камеру 7 промывают оставшейся частью 8 раствора образца, которую сохранили на стадии 5-C. Это промывание можно проводить таким же образом, как на стадии 2-C, используемой в иммунологическом анализе, показанном на фиг.2. Таким образом, антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, удаляют из реакционной камеры 7, и в реакционной камере 7 остается комплекс антиген-антитело. Таким образом, при промывании реакционной камеры с использованием раствора образца комплекс антиген-антитело и антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, полученные на стадии 5-D, разделяют без использования промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl. Точность разделения также считается очень высокой до степени, сравнимой со случаем, где реакционную камеру промывают с использованием промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl.

Стадия измерения

Измеряют количество метящего вещества 4 в комплексе антиген-антитело, который остался в реакционной камере 7. Это измерение можно проводить таким же образом, как на стадии измерения, используемой в иммунологическом анализе, показанном на фиг.2.

Стадия вычисления

На основании результатов измерения, полученных на стадии измерения, вычисляют концентрацию подлежащего измерению антигена. А именно, на основании результатов измерения, то есть количества связанного с твердой фазой антитела 19, зафиксированного в реакционной камере 7, и количества части 1 раствора образца, введенного в реакционную камеру 7 на стадии связывания (стадия 5-B), вычисляют количество подлежащего измерению антигена 2. Количество подлежащего измерению антигена может быть выражено в виде физической величины, которая может быть ассоциирована с указанным выше количеством, например, в виде концентрации.

В иммунологическом анализе по настоящему изобретению порядок работы и оборудование, используемые по настоящему описанию, можно соответствующим образом изменять, при условии, что сигнал, отражающий концентрацию измеряемого вещества, можно детектировать до степени, сравнимой со случаем использования промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl. Например, в иммунологических анализах, показанных на фиг.2 и 5, приведены описания случая, где первичное антитело, используемое для получения комплекса антиген-антитело, или антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, метили метящим веществом. Однако вместо этого, как показано на принципиальной схеме на фиг.3, первичное антитело 22, используемое для получения комплекса антиген-антитело, или антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, не является меченым, но вторичное антитело 18, которому дают связаться с немеченым первичным антителом 22, может быть меченным метящим веществом. Кроме того, в иммунологических анализах, показанных на фиг.2 и 5, приведено описание случая, где стадию измерения проводили относительно одного компонента, выбранного из комплекса антиген-антитело и антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, оставшегося в реакционной камере 7 после стадии промывания и разделения. Однако вместо этого стадию измерения можно проводить в отношении другого компонента, выбранного из комплекса антиген-антитело и антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, которое было удалено из реакционной камеры 7 на стадии промывания и разделения. Кроме того, в иммунологическом анализе по настоящему изобретению, как описано выше, с точки зрения облегчения осуществления на чипе, желательно использовать в качестве реакционной камеры подложку чипа, имеющую форму, способную вместить жидкость, типичным примером которой является микропланшет. Однако это не исключает использование подложки чипа, имеющей форму, которая не позволяет легко удерживать жидкость, типичным примером которой являются шарики, например полимерные шарики и магнитные шарики. В иммунологических анализах, показанных на фиг.2 и 5, приведены описания случая, где вводили раствор образца и, таким образом, получали раствор для индукции реакции антиген-антитело в реакционной камере и раствор для промывания реакционной камеры. Однако вместо этого промывающий раствор можно получать при помощи нового сбора раствора образца.

На фиг.4 представлена схема, объясняющая пример чипа, подходящего для проведения иммунологического анализа по настоящему изобретению.

Чип 100 включает: подложку чипа 11 и реакционную камеру 12, камеру 14, содержащую промывающий раствор, сточную камеру 15, и отверстие 17 для введения образца, через которое вводят раствор образца, которые сформированы на подложке 11. Примеры материала для подложки 11 чипа включают материалы для реакционной камеры 7, которые используют в иммунологических анализах по настоящему изобретению, например PET.

Отверстие 17 для введения образца и реакционная камера 12 соединены друг с другом через канал 16a, образованный на подложке 11 чипа. Кроме того, отверстие 17 для введения образца и камера 14, содержащая промывающий раствор, соединены друг с другом через канал 16b, образованный на подложке 11 чипа. Канал 16a и канал 16b не сообщаются друг с другом. В связи с этим, когда раствор образца вводят внутрь отверстия 17 для введения образца, раствор образца разделяют для вхождения в реакционную камеру 12 и камеру 14, содержащую промывающий раствор, через канал 16a и канал 16b, соответственно. Таким образом, часть раствора образца поступает в реакционную камеру 12, а оставшаяся часть раствора образца поступает в камеру 14, содержащую промывающий раствор, и остается в камере 14.

Желательно, чтобы хотя бы один из (1) твердофазного антигена и (2) связанного с твердой фазой антитела был зафиксирован в реакционной камере 12. Желательно, чтобы первичное антитело, которое специфически связывается с подлежащим измерению антигеном в растворе образца, помещали в реакционную камеру 12 или на пути, через который часть раствора образца проходит до внесения в реакционную камеру 12, в состоянии, способном к растворению в растворе образца. Первичное антитело предпочтительно находится в меченном метящим веществом состоянии. Когда часть раствора образца вводят в реакционную камеру 12, (1) в случае, когда в реакционной камере 12 зафиксирован твердофазный антиген, получают комплекс антиген-антитело, представляющий собой конъюгат подлежащего измерению антигена и антитела, а также антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном и которое представляет собой конъюгат твердофазного антигена и антитела, и (2) в случае, когда в реакционной камере 12 зафиксировано связанное с твердой фазой антитело, получают комплекс антиген-антитело, представляющий собой конъюгат связанного с твердой фазой антитела, подлежащего измерению антигена и антитела, а также антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном и которое представляет собой оставшееся несвязанным антитело.

Реакционная камера 12 и сточная камера 15 соединены друг с другом через канал 16d, образованный на подложке 11 чипа. Кроме того, камера 14, содержащая промывающий раствор, и реакционная камера 12 соединены друг с другом через канал 16c, образованный на подложке 11 чипа. Раствор образца (указанная выше оставшаяся часть), оставшийся в камере 14, содержащей промывающий раствор, вводят в реакционную камеру 12 через канал 16c после достижения реакцией антиген-антитело равновесного состояния в реакционной камере 12. Затем он направляется из реакционной камеры 12 в сточную камеру 15 через канал 16d. Таким образом, в случае, когда в реакционную камеру 12 помещали твердофазный антиген, в реакционной камере 12 остается антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном и которое представляет собой конъюгат твердофазного антигена и антитела, тогда как в случае, когда в реакционную камеру 12 помещали связанное с твердой фазой антитело, в реакционной камере 12 остается комплекс антиген-антитело, представляющий собой конъюгат связанного с твердой фазой антитела, подлежащего измерению антигена и антитела. Таким образом, когда реакционную камеру 12 промывают раствором образца, комплекс антиген-антитело и антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, разделяют.

Как описано выше, чип по настоящему изобретению может быть представлен, как указано ниже. А именно, твердофазный антиген фиксируют в реакционной камере, антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, связалось с твердофазным антигеном, антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, остается в реакционной камере при промывании, и комплекс антиген-антитело переносится в сточную камеру. Кроме того, как описано выше, в чипе по настоящему изобретению связанное с твердой фазой антитело фиксируют в реакционной камере, комплекс антиген-антитело представляет собой конъюгат связанного с твердой фазой антитела, подлежащего измерению антигена и антитела, комплекс антиген-антитело остается в реакционной камере при промывании, а антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, переносится в сточную камеру.

Раствор можно пропустить через соответствующие каналы известным способом пропускания раствора, таким как способ с использованием электроосмотического тока (например, Barker et al., Anal. Chem.; (Article); 2000; 72(24); 5925-5929), способ с использованием силы нагнетания или силы всасывания, обеспечиваемых насосом (например, Hisamoto et al., Anal. Chem.; (Article); 2001; 73(22); 5551-5556), и способ с использованием центробежной силы (например, Duffy et al., Anal. Chem.; (Article); 1999; 71(24); 4669-4678).

Как описано выше, с помощью чипа по настоящему изобретению можно разделять комплекс антиген-антитело и антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, даже при использовании промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl. Как описано в пояснении к иммунологическим анализам по настоящему изобретению, точность разделения является высокой. В соответствии с этим чип по настоящему изобретению позволяет детектировать сигнал, отражающий концентрацию измеряемого вещества до степени, сравнимой со случаем использования промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl. Детекцию сигнала можно осуществлять в отношении одного компонента, выбранного из комплекса антиген-антитело, оставшегося в реакционной камере 12, и антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, или в отношении другого компонента, который был перенесен в сточную камеру 15. Таким образом, сточную камеру, в дополнение к накоплению стока, также можно использовать для осуществления ферментативной реакции, и ее предполагаемое использование не ограничивается термином "сток".

Чип по настоящему изобретению можно подходящим образом модифицировать по конструкции, при условии, что измерение можно проводить достаточно хорошо до степени, сравнимой со случаем использования промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl. Например, дополнительно может быть образован другой канал для введения меченого антитела в реакционную камеру, с тем чтобы проводить реакцию антиген-антитело сэндвич-способом.

Ниже настоящее изобретение дополнительно подробно описано с использованием примеров.

Ссылочный пример

Сначала описан ссылочный пример, в котором реакционную камеру промывают с использованием буферного раствора (буфер Tris-HCl) после того, как произошла реакция антиген-антитело.

Получение раствора образца

Нормальную человеческую сыворотку смешивают с 42,3 мкМ раствором CRP и, таким образом, получают растворы образцов с концентрацией CRP приблизительно 0 нМ, 10 нМ, 20 нМ, 50 нМ и 100 нМ.

Получение реакционной камеры

На планшете из PET толщиной 1 мм формировали множество отверстий с диаметром 5 мм. Другой планшет из PET прикрепляли к одной из поверхностей указанного выше PET планшета с использованием известного адгезивного фотополимера (LUXTRAK) так, чтобы прикрыть отверстия с одного конца. Таким образом получают большинство реакционных камер.

Фиксирование CRP

С использованием 50 мМ буфера Tris-HCl (pH 7,5) получали 42,3 нМ раствор CRP. 10 мкл раствора CRP вводили внутрь каждой из соответствующих реакционных камер. Затем каждую реакционную камеру плотно закрывали резиновой пластиной (пластина с 96 отверстиями). Это устройство поддерживали при температуре 35°C в течение одного часа и, таким образом, позволяли CRP адсорбироваться в реакционных камерах. После этого реакционные камеры промывали 50 мМ буфером Tris-HCl (pH 7,5). Затем в каждую реакционную камеру добавляли 10 мкл блокирующего агента (производства SEIKAGAKU CORPORATION, ApplieDuo, Cat. No. 200140). Реакционную смесь поддерживали при 35°C в течение одного часа. Таким образом блокировали CRP, позволяя адсорбироваться в реакционной камере, и в реакционной камере образовывался твердофазный антиген. После этого реакционные камеры снова промывали 50 мМ буфером Tris-HCl (pH 7,5).

Реакция антиген-антитело

1 мкл 880 нМ анти-CRP моноклонального антитела, которое метили щелочной фосфатазой (ALP), 1 мкл раствора образца и 8 мкл нормальной человеческой сыворотки вводили в реакционную камеру. Содержимое поддерживали при 35°C в течение 15 минут. Таким образом, давали протекать реакциям антиген-антитело между антителом и твердофазным антигеном, а также CRP. Конечная концентрация антитела в каждой реакционной камере составляла 88 нМ. Конечные концентрации CRP составляли приблизительно 0 нМ, 10 нМ, 20 нМ, 50 нМ и 100 нМ.

Промывание и разделение

После введения 20 мкл промывающего раствора в реакционные камеры его удаляли. Используемым здесь промывающим раствором был 50 мМ буфер Tris-HCl (pH 7,5). Таким образом, реакционные камеры промывали и тем самым отделяли комплекс антиген-антитело, представляющий собой конъюгат CRP и антитела, от антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном и представляло собой конъюгат твердофазного антигена и антитела. Более конкретно, комплекс антиген-антитело удаляли из реакционных камер, тогда как антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, оставляли в реакционных камерах.

Измерение

10 мкл раствора п-нитрофенилфосфата (производства Cygnus, жидкий субстрат PNPP, Cat. No. F008-1000; pNPP) вводили в каждую реакционную камеру. Тем самым давали протекать ферментативной реакции между pNPP и ALP антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном. В каждой реакционной камере измеряли оптическую плотность продукта ферментативной реакции, п-нитрофенола (pNP).

Пример

Иммунологический анализ проводили таким же образом, как в ссылочном примере, за исключением того, что после реакции антиген-антитело реакционные камеры промывали с использованием 20 мкл раствора образца вместо промывающего раствора. Раствор образца, используемый для промывания, получали путем введения раствора образца для индукции реакции антиген-антитело.

Сравнительный пример

Иммунологический анализ проводили таким же образом, как в ссылочном примере, за исключением того, что реакционные камеры не промывали после реакции антиген-антитело. В частности, пока не был удален введенный в них промывающий раствор, в реакционные камеры дополнительно вводили pNP и измеряли оптическую плотность.

На фиг.6 представлен график, показывающий результаты измерения оптической плотности, полученные в каждом примере. Оптическая плотность выражена как относительная величина, при этом оптическая плотность, полученная в реакционной камере, в которой конечная концентрация CRP составляла примерно 0 нМ в ссылочном примере, составляет 1.

В таблице приведены результаты оценки фонового уровня и разброса для каждого значения оптической плотности на основании графика, изображенного на фиг.6. Оценку фонового уровня оптической плотности выражали следующим образом:

абсолютная величина среднего значения снижалась после промывания больше всего,

◯: ее падение после промывания было вторым по величине, и

×: она была целиком под влиянием фона.

Оценку отклонения оптической плотности выражали следующим образом:

наименьшее стандартное отклонение,

◯: немного большее стандартное отклонение, чем указанное выше, и

×: явно большее, чем указанные стандартные отклонения.

Таблица 1   Ссылочный пример Пример Сравнительный пример Фон ◯ × Отклонения ◯ ×

Как показано в таблице, доказано, что очень хороший эффект промывания получали до степени, сравнимой со случаем использования промывающего раствора, типичным примером которого является буфер Tris-HCl, даже когда для промывания реакционных камер используют раствор образца.

Промышленное применение

Настоящее изобретение относится к иммунологическому анализу, где нет необходимости вводить извне чип или заранее размещать на чипе промывающий раствор, типичным примером которого является буфер Tris-HCl. Таким образом, настоящее изобретение имеет намного больший потенциал в любой области, где требуется проводить иммунологический анализ на чипе.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. После получения в реакционной камере комплекса антиген-антитело, где подлежащий измерению антиген и антитело связались друг с другом, реакционную камеру промывают с использованием раствора образца. Изобретение позволяет детектировать сигнал, отражающий количество подлежащего измерению антигена, со степенью точности, сравнимой в случае использования промывающего раствора с точностью без использования промывающего раствора. Таким образом, нет необходимости подавать промывающий раствор извне чипа или обеспечить то, чтобы промывающий раствор заранее находился на чипе. Таким образом, иммунологический анализ может быть легко проведен на чипе. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

1. Способ измерения количества подлежащего измерению антигена, который содержится в растворе образца, с использованием чипа,
где чип содержит реакционную камеру, камеру, содержащую промывающий раствор, сточную камеру и отверстие для введения раствора образца,
отверстие для введения образца и реакционная камера соединены друг с другом через первый канал,
отверстие для введения образца и камера, содержащая промывающий раствор, соединены друг с другом через второй канал,
камера, содержащая промывающий раствор, и реакционная камера соединены друг с другом через третий канал,
реакционная камера и сточная камера соединены друг с другом через четвертый канал,
где способ включает стадии:
введения раствора образца через отверстие для введения образца и распределения раствора образца в реакционной камере и камере, содержащей промывающий раствор, через первый канал и второй канал соответственно;
получения комплекса антиген-антитело, позволяющего подлежащему измерению антигену, который содержится в растворе образца, связаться с антителом, которое специфически связывается с подлежащим измерению антигеном в реакционной камере;
разделения комплекса антиген-антитело и антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, путем введения раствора образца, содержащегося в камере, содержащей промывающий раствор, в реакционную камеру через третий канал и промывания реакционной камеры, содержащей комплекс антиген-антитело, чтобы в реакционной камере осталось одно, выбранное из:
i) комплекса антиген-антитело; и
ii) антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном,
а остальное было перемещено в сточную камеру;
измерения количества комплекса антиген-антитело или антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном; и
вычисления количества подлежащего измерению антигена, который содержится в растворе образца, из конечного количества комплекса антиген-антитело или антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном.

2. Способ по п.1, где в реакционной камере зафиксирован твердофазный антиген, антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, связывается с твердофазным антигеном, и, на стадии разделения, антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, остается в реакционной камере, в то время как комплекс антиген-антитело перемещается в сточную камеру.

3. Способ по п.1, где в реакционной камере зафиксировано связанное с твердой фазой антитело, комплекс антиген-антитело представляет собой конъюгат связанного с твердой фазой антитела, подлежащего измерению антигена и антитела, и, на стадии разделения, комплекс антиген-антитело остается в реакционной камере, в то время как антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, перемещается в сточную камеру.

4. Чип для измерения количества подлежащего измерению антигена, который содержится в растворе образца,
где чип содержит реакционную камеру, камеру, содержащую промывающий раствор, сточную камеру и отверстие для введения раствора образца,
отверстие для введения образца и реакционная камера соединены друг с другом через первый канал,
отверстие для введения образца и камера, содержащая промывающий раствор, соединены друг с другом через второй канал,
камера, содержащая промывающий раствор, и реакционная камера соединены друг с другом через третий канал,
реакционная камера и сточная камера соединены друг с другом через четвертый канал,
раствор образца, введенный через отверстие для введения образца, поступает в реакционную камеру и камеру, содержащую промывающий раствор, через первый канал и второй канал соответственно,
в реакционной камере подлежащему измерению антигену позволяют связаться с антителом, которое специфически связывается с подлежащим измерению антигеном, и, таким образом, получают комплекс антиген-антитело,
раствор образца, содержащийся в камере, содержащей промывающий раствор, через третий канал вводят в реакционную камеру для промывания реакционной камеры, содержащей комплекс антиген-антитело, таким образом, что одно, выбранное из:
i) комплекса антиген-антитело; и
ii) антитела, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, остается в реакционной камере, а остальное перемещается в сточную камеру, и, таким образом, комплекс антиген-антитело и антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, отделяют друг от друга.

5. Чип по п.4, где в реакционной камере зафиксирован твердофазный антиген, антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, связывается с твердофазным антигеном, и при промывании антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, остается в реакционной камере, тогда как комплекс антиген-антитело перемещается в сточную камеру.

6. Чип по п.5, где в реакционной камере зафиксировано связанное с твердой фазой антитело, комплекс антиген-антитело представляет собой конъюгат связанного с твердой фазой антитела, подлежащего измерению антигена и антитела, и при промывании комплекс антиген-антитело остается в реакционной камере, тогда как антитело, которое не связалось с подлежащим измерению антигеном, перемещается в сточную камеру.