ЦИФРОВОЙ ОПТИЧЕСКИЙ БЛОК, УСТРОЙСТВО И СИСТЕМА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ИССЛЕДУЕМОМ БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ Российский патент 2024 года по МПК G01N21/64 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к лабораторному оборудованию для проведения микробиологических исследований, а именно к устройствам и системам для исследования биологических образцов, размещенных в контейнерах, например, в чашках Петри, включая регистрацию роста колоний микроорганизмов в режиме реального времени, классификацию микроорганизмов и их таксономическую идентификацию по данным оптического отклика, идентификацию микробного агента в образце, определение его резистентности к антибактериальным препаратам и т.д.

Устройство для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце, содержащее цифровой оптический блок, может выступать в качестве самостоятельного изделия (продукта), а также может быть использовано совместно с камерой инкубации биологических образцов (см., например, патент на изобретение RU 2813445), которые, в свою очередь, могут входить в состав автоматизированной микробиологической лаборатории или любой другой системы со встроенной функцией фотографирования биологических образцов (см., например, патент на изобретение RU2811721). Цифровой оптический блок в устройстве для идентификации микроорганизмов может быть выполнен в соответствии с патентом RU2813210, при этом дополнен функцией спектроскопического исследования образцов. Для реализации функции спектроскопического исследования образцов заявленный цифровой оптический блок устройства и системы для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце в своем составе содержит подвижную спектроскопическую головку, используемую для подведения возбуждающего излучения и детектирования сигнала флуоресцентного отклика от колонии микроорганизмов.

Уровень техники

В настоящее время наблюдается активное развитие микробиологической отрасли, одной из задач которой является внедрение автоматизированных систем и оборудования для инкубации микроорганизмов и клеточных структур и проведения микробиологических исследований, включая решение задач классификации микроорганизмов и их таксономической идентификации. С ростом количества проводимых микробиологических исследований актуальным является разработка высокопроизводительных устройств, повышение скорости проведения исследования, при обеспечении высокого качества получаемого результата, в том числе, и за счет исключения ошибок, вызванных человеческим фактором. Одна из задач автоматизации микробиологических исследований связана с разработкой модулей или блоков исследования биологических образцов, основанных на использовании оптических средств и методов, включая средства и методы формирования цифровых изображений биологических образцов и спектроскопии, обеспечивающих высокую точность результатов исследования микроорганизмов, включая их классификацию и таксономическую идентификацию. Данные модули и блоки могут быть встроены или совмещены с камерой инкубации биологических образцов, обеспечивая в замкнутом объеме процессы инкубации и исследования биологических образцов.

Из уровня техники известна система для микроскопического наблюдения за биологическими образцами (US 2021278652 A1), содержащая модули визуализации образцов, включающие инкубационный компонент и сконфигурированные с возможностью формирования изображения образца клеточной культуры; и пользовательский интерфейс, внешний по отношению к инкубатору клеток, сконфигурированный для приема изображений от модулей визуализации. Формирование изображения образца может быть реализовано с помощью цифровой камеры микроскопа, функционально связанной с компонентом управления движением камеры посредством использования роботизированного элемента, который выполнен с возможностью перемещения указанной камеры в измерениях X, Y и Z. Кроме того, модули визуализации образцов сконфигурированы для выполнения одной или более микроскопии видимого света и флуоресцентной микроскопии. Модули снабжены нижними и верхними светильниками с обеспечением равномерного освещения контейнера с биологическим образцом.

Однако указанная система предназначена для проведения исследований единичных образцов, является автономной без возможности встраивания в систему инкубации биологических образцов для проведения исследований в потоковом режиме. Кроме того, решение, представленное в US 2021278652, характеризуется ограниченным функционалом, позволяющим проводить наблюдения за биологическими образцами с использованием оптической визуализации без возможности таксономической идентификации - определения вида, рода, группы микроорганизма, по данным оптической диагностики.

Из уровня техники известны цифровой оптический блок, устройство и система для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце (US 2011299071 А1). Цифровой оптический блок включает: корпус с площадкой для размещения контейнера с биологическим образцом; цифровую камеру, расположенную в верхней части корпуса; две оптические системы, одна из которых предназначена для подведения возбуждающего излучения, вторая - для детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца; верхний светильник, расположенный для освещения контейнера с биологическим образцом. Устройство для оптической идентификации микроорганизмов содержит цифровой оптический блок, соединенный с источником света, выполненным с возможностью выделения необходимого набора длин волн, и спектрометром. Система для оптической идентификации микроорганизмов содержит устройство для оптической идентификации микроорганизмов, соединенное с модулем управления перемещением спектроскопической головки, включая управление навигацией оптической головки по изображениям, получаемым с цифровой камеры, с модулями перемещения цифровой камеры и контейнера, а также с модулем управления оптическими измерениями и модулем анализа получаемых изображений.

Однако в описанном устройстве источник и приемник излучения размещены раздельно, что увеличивает габариты устройства. Кроме того, для идентификации микроорганизмов используют метод спектроскопии комбинационного рассеяния (рамановской спектроскопии), требующий использования специализированной сложной и дорогостоящей техники для детектирования спектров оптического отклика комбинационного рассеяния - спектрометра с высоким спектральным разрешением и высокой чувствительностью матрицы.

Наиболее близкими к заявленным изобретениям являются цифровой оптический блок в составе модуля фотографирования, устройство и система для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце, представленные в составе системы для инкубации биологических культур (US 11041871 B2). Цифровой оптический блок модуля фотографирования расположен в отдельном корпусе, который выполнен сообщающимся с рабочим объемом камеры инкубации. Цифровой оптический блок содержит средство фотографирования и средство перемещения контейнера. Средство перемещения контейнера выполнено в виде поворотного диска с возможностью перемещения контейнера в горизонтальной плоскости из рабочей зоны камеры инкубации в зону формирования цифрового изображения и обратно. Поворотный диск, поворачиваясь на 90 градусов, помещает образец в зону фотографирования под объектив камеры, после чего, вновь осуществив поворот на 90 градусов, передает контейнер на транспортер для возврата в камеру инкубации.

Однако указанная система позволяет формировать оптическое изображение клеточной культуры в видимом спектре, и не предусматривает измерения спектров флуоресценции клеточной культуры под воздействием ультрафиолетового излучения, что ограничивает аналитические возможности системы.

Кроме того, конструктивные решения аналогов и прототипа реализованы без возможности комплексирования данных флуоресценции и данных фотографических снимков с целью таксономической идентификации микроорганизмов при проведении исследований биологических образцов, что снижает точность получаемых результатов.

Технической проблемой, решение которой обеспечивается настоящим изобретением, является разработка устройства для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце, устраняющего недостатки аналогов и прототипа, способного обеспечить высокую точность при решении задач классификации и таксономической идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце.

Раскрытие сущности изобретения

Технический результат, обеспечиваемый изобретением при решении вышеуказанной технической проблемы, заключается в повышении точности результатов исследования микроорганизмов в исследуемых биологических образцах, помещенных в контейнеры, например, в чашки Петри, включая их классификацию и таксономическую идентификацию, при обеспечении надежности и компактности используемого для этих целей цифрового оптического блока, содержащего цифровую камеру и спектроскопическую головку.

Технический результат достигается при реализации цифрового оптического блока устройства для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце, включающего:

- корпус, содержащий площадку для размещения контейнера с биологическим образцом;

- цифровую камеру, расположенную в верхней части корпуса над площадкой для размещения контейнера,

- спектроскопическую головку, содержащую размещенные в держателе две оптические системы, одна из которых предназначена для подведения возбуждающего излучения, вторая - для детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца, при этом спектроскопическая головка выполнена с возможностью перемещения, по меньшей мере, в горизонтальной плоскости над площадкой с контейнером;

- по меньшей мере два светильника - верхний и нижний, расположенные с обеспечением равномерного освещения контейнера с биологическим образцом;

при этом держатель выполнен сборным, по меньшей мере, из трех частей, имеющих смежные профилированные поверхности, сконфигурированные с возможностью формирования при совмещении частей двух световодных каналов с размещением в них упомянутых оптических систем.

Перемещение спектроскопической головки в цифровом оптическом блоке реализовано с помощью электромеханического привода перемещения, снабженного ременной передачей, при этом электромеханический привод размещен с нижней стороны корпуса цифрового оптического блока.

Каждая из оптических систем спектроскопической головки в одном из вариантов ее реализации содержит оптическое волокно (оптоволокно), две выпуклых (коллимирующих) линзы - входную и выходную, и плоское зеркало, расположенное на оптическом пути между линзами, при этом указанные элементы оптических систем размещены в световодных каналах держателя, сконфигурированных с возможностью ввода и вывода оптического излучения в ортогональных плоскостях. Оптические волокна предпочтительно расположены в плоскости, параллельной поверхности площадки для размещения контейнера. Оптические системы расположены с возможностью формирования угла между оптическими осями в вертикальной плоскости, обеспечивающего возможность совпадения фокальных пятен на исследуемой поверхности биологического образца. В конкретном варианте реализации изобретения данный угол между оптическими осями оптических систем составляет 36 градусов.

Спектроскопическая головка в цифровом оптическом блоке расположена с возможностью детектирования сигнала флуоресцентного отклика на расстоянии до 2 мм от исследуемого биологического образца. В спектроскопической головке могут быть использованы: линзы с фокусным расстоянием от 15 до 20 мм и апертурой (диаметром) 10 мм, при этом линзы выполнены из плавленного кварца марки КУ-1; зеркала с покрытием, характеризующимся максимальной отражательной способностью в диапазоне длин волн от 280 до 800 нм; многомодовое оптическое волокно с диаметром жилы d = 200-600 мкм, и числовой апертурой NA = 0,22; при этом торцы оптических волокон расположены на расстоянии Δx от 0 до 5 мм от фокуса линзы.

Цифровая камера снабжена приводом ее вертикального перемещения для фокусировки.

В одном из вариантов осуществления изобретения держатель в спектроскопической головке выполнен в виде параллелепипеда из трех частей - центрального элемента и двух боковых элементов, расположенных симметрично относительно центрального элемента; элементы образованы рассечением параллелепипеда двумя плоскостями сечения, расположенными под углом к вертикальной продольной плоскости параллелепипеда, при этом элементы держателя содержат части световодных каналов (предпочтительно 1/2 часть в поперечном сечении), сконфигурированные с возможностью образования световодных каналов при совмещении соответствующих боковых элементов с центральным элементом, где один из световодных каналов сконфигурирован с возможностью размещения оптической системы, предназначенной для подведения возбуждающего излучения, второй световодный канал - с возможностью размещения второй оптической системы, предназначенной для детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца. В световодных каналах выполнены пазы для размещения линз и зеркал оптических систем. Световодный канал может содержать участок с диаметром d1, соответствующим диаметру оптического волокна для его неподвижного размещения в канале, данный участок канала соединен с участком большего диаметра d2, предназначенным для распространения излучения от оптического волокна - для первой оптической системы, или к оптическому волокну - для второй оптической системы, с изменением направления распространения излучения на 90 градусов с помощью установленного в канале зеркала. Держатель в спектроскопической головке в предпочтительном варианте его реализации имеет высоту 25 мм и менее, ширину и длину 75 мм и менее.

Цифровой оптический блок может быть снабжен средством перемещения контейнера, содержащим транспортировочную корзину для контейнера. Средство перемещения контейнера может быть снабжено шторкой, выполненной с возможностью возвратно-поступательного перемещения в горизонтальном направлении по направляющим рельсам и размещения в зоне фотографирования под транспортировочной корзиной с возможностью перекрытия светового потока от нижних светильников, при этом

Спектроскопическая головка в цифровом оптическом блоке закреплена на подвижной платформе, при этом электромеханический привод содержит два шаговых вращательных двигателя со шкивами и ременный привод с крестообразным расположением ремней. Крестообразное расположение ремней может быть реализовано с использованием четырех роликов, размещенных на подвижной платформе, при этом ход ремней по каждой из осей X и Y ограничен механическими упорами и концевыми выключателями на основе оптических датчиков.

Технический результат достигается также при реализации устройства для идентификации микроорганизмов, содержащего цифровой оптический блок, соединенный с источником света, выполненным с возможностью выделения необходимого набора длин волн (т.е. с возможностью облучения образца в нескольких спектральных диапазонах длин волн) и спектрометром. В устройстве может быть использованы: плазменный источник света с возможностью излучения на длинах волн из диапазона 280-500 нм и спектральной яркостью от 1 мВт/(мм*ср*нм) до 35 мВт/(мм*ср*нм), при этом плазменный источник света снабжен монохроматором, например, XWS-65, ООО «Троицкий инженерный центр»; спектрометр (детектор) с диапазоном детектирования излучения 300-800 нм со спектральным разрешением не хуже 5 нм и обладающий уровнем детектирования рассеянного света не более 0,5 %, например, OceanOptics USB2000; монохроматор, обладающий спектральным диапазоном перестройки излучения 280-500 нм, с выделяемой спектральной шириной полосы не более 10 нм в указанном диапазоне.

Технический результат достигается также при реализации системы для идентификации микроорганизмов, содержащей указанное выше устройство для оптической идентификации микроорганизмов, соединенное с модулем управления перемещением спектроскопической головки, включая управление позиционированием оптической головки по изображениям, получаемым с цифровой камеры, модулями управления перемещением цифровой камеры и контейнера, а также модулем управления оптическими измерениями и модулем анализа получаемых изображений и данных флуоресцентной спектроскопии.

Модуль управления оптическими измерениями выполнен с возможностью возбуждения эмиссии на нескольких длинах волн возбуждения от 280 до 500 нм, и детектирования от 300 до 800 нм.

Модуль анализа изображений в предпочтительном варианте реализации изобретения содержит средства компьютерного зрения, выполнен с возможностью предобработки изображений, обеспечивающей визуализацию области, связанной с питательной средой и культивируемыми на них микроорганизмами; в конкретном варианте реализации содержит сверточную нейронную сеть, используемую для классификации микроорганизмов, например, модель с архитектурой по типу ConvNeXt, предобученную на базе данных ImageNet.

В одном из вариантов реализации изобретения модуль анализа изображений содержит средства классификации микроорганизмов по результатам флуоресцентной спектроскопии с использованием средств машинного обучения, включая полносвязные нейронные сети, обученные при использовании амплитуд главных компонент спектров флуоресценции на этапе предобработки данных оптической спектроскопии и данных оптических изображений.

В заявленном изобретении получаемая точность, объединяющая результаты оптических исследований данных флуоресценции и данных цифровых фотографических снимков на стратифицированных выборках, учитывающих распределение баланса видов микроорганизмов в микробиологической лаборатории, составляет F = 0,828±0,013, что превышает значения точности, получаемой по отдельности на основе данных флуоресценции или данных фотографических снимков.

В конструкции заявленного устройства использован усовершенствованный цифровой оптический блок, включающий корпус, который имеет модульное исполнение и является совместимым с системой автоматической инкубации бактерий, при этом в одном блоке совмещены две системы оптического и спектрального метода исследований, позволяющие формировать как видимое фотографическое изображение микробиологического образца, так и спектры флуоресценции в ультрафиолетовом спектре, расширяющие аналитические возможности устройства; спектроскопическую головку, совмещающую в себе приемный и излучающий каналы, которая имеет компактное исполнение с надежным размещением в ней элементов оптической системы; механизм быстрого и точного перемещения и позиционирования спектроскопической головки при проведении оптических измерений, и как следствие, высокоточное наведение излучаемого света на объект, в т.ч. за счет использования XY-привода с крестообразной ременной передачей и опорными роликами, позволяющего перемещать головку по произвольной траектории с точностью до 50 мкм.

Таким образом, заявленный блок может быть встроен в высокопроизводительную автоматизированную систему для инкубирования и проведения исследований биологических образцов в потоке инкубируемых образцов (не менее 100 измерений за 1 час) с возможностью мониторинга инкубируемых культур в процессе культивирования с заданной периодичностью. Габариты спектроскопической головки позволяют ее использовать совместно с цифровой камерой без увеличения габаритов модуля при обеспечении высокоточного позиционирования подводимого возбуждающего излучения по отношении к исследуемому образцу с детектированием флуоресцентного отклика от биологического образца.

Заявленное устройство является надежным, эргономичным, удобным в изготовлении, использовании и обслуживании, снижает вероятность ошибок оператора, которые могут привести к неправильной постановке диагноза, поздней диагностике, потере или порче образцов. Такие ошибки потенциально могут негативно сказываться на качестве диагностики и эффективности лечения пациентов.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где

на фиг. 1-6 представлено изображение заявленного цифрового оптического блока устройства для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце, общий вид, вид сзади, вид сверху, вид в разрезе, вид сбоку, вид снизу, соответственно;

на фиг. 7 представлен общий вид цифрового оптического блока, совмещенного с блоком перемещения контейнеров;

на фиг. 8 представлена камера инкубации с двумя 3-х координатными манипуляторами - верхним и нижним, в которую установлены два цифровых оптических блока, общий вид со стороны окна загрузки/выгрузки контейнеров;

на фиг. 9 схематично показан пример использования заявленного цифрового оптического блока устройства для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце в автоматизированной микробиологической лаборатории, где помимо упомянутого блока, встроенного в камеру инкубации, лаборатория также содержит модуль посева биоматериала в контейнеры, конвейерную систему, модуль загрузки и выгрузки контейнеров из камеры инкубации, рабочее место лаборанта с ПК для проведения исследований биологических образцов;

на фиг. 10 представлена принципиальная блок-схема проведения оптических измерений и идентификации микроорганизмов по данным оптического отклика, реализованная в заявленной системе, содержащей устройство с цифровым оптическим блоком, модулями управления перемещением спектроскопической головки, перемещением контейнера и камеры, оптическими измерениями и анализом изображений;

на фиг. 11 представлена схема сборки спектроскопической головки, держатель которой состоит из трех частей (деталей) - центрального и двух боковых;

на фиг. 12 представлена фотография деталей держателя двух оптических систем спектроскопической головки, изготовленных методом 3D-печати;

на фиг. 13 и 14 показаны схема размещения спектроскопической головки и схема расположения детектирующей и возбуждающей частей спектроскопической головки относительно друг друга и чашки Петри при проведении измерений;

на фиг. 15 показана оптическая схема возбуждающего/детектирующего излучения оптической системы, где ΔX - расстояние расположения торца оптического волокна от фокальной плоскости линзы, ΔZ - высота расположения исследуемого объекта над плоскостью, характеризующейся максимальной интенсивностью излучения;

на фиг. 16 представлены графики сравнения А) интенсивностей флуоресцентного отклика в зависимости от расположения излучающего торца приемо-передающего волокна ΔX, и Б) спектральной полосы эмиссии флуоресценции, детектируемой от модельного объекта с помощью двухволоконной приёмо-передающей схемы и спектроскопической головки устройства;

на фиг. 17 представлены графики А) спектров флуоресценции бактерии Escherichia coli при возбуждении на 380 нм при различных конфигурации оптической головки; Б) нормированные на максимумы спектров флуоресценции бактерии Escherichia coli при возбуждении на 380 нм при различных конфигурации спектроскопической головки;

на фиг. 18 представлено распределение числа объектов различных таксономических категорий, использованных для апробации и оценки точности устройства;

на фиг. 19 представлен пример оптического изображения и спектров флуоресценции, полученных с помощью заявленного устройства;

на фиг. 20 представлены значения метрик качества таксономической идентификации классов микроорганизмов по данным оптической визуализации, флуоресцентной спектроскопии и их объединения, полученные при апробации устройства;

на фиг. 21 представлена принципиальная блок-схема объединения моделей классификации по данным флуоресцентного отклика и изображениям.

Позициями на чертежах обозначены: 1 - цифровой оптический блок, 2 - спектроскопическая головка, 3 - цифровая камера, 4 - верхний светильник, 5 - нижний светильник, 6 - боковой светильник, 7 - корпус цифрового оптического блока, 8 - площадка корпуса для размещения контейнера, 9 - первая оптическая система - для подведения возбуждающего излучения, 10 - вторая оптическая система - для детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца, 11 - держатель оптических систем (или корпус спектроскопической головки), 12 - консоль спектроскопической головки, 13 -оптоволокно (оптические волокна), 14 - выпуклая линза, 15 - плоское зеркало, 16 - световодный канал держателя, 17 - электромеханический привод спектроскопической головки, 18 - подвижная платформа, на которой закреплена спектроскопическая головка, 19 - двигатель со шкивом привода спектроскопической головки, 20 - ременная передача привода спектроскопической головки, 21 - направляющие для перемещения спектроскопической головки, 22 - концевой выключатель привода спектроскопической головки, 23 - центральный элемент держателя, 24 - боковые элементы держателя, 25 - привод перемещения цифровой камеры, 26 - винтовая передача, 27 - концевой выключатель привода цифровой камеры, 28 - средство перемещения контейнера, 29 - транспортировочная корзина для контейнера, 30 - шторка, 31 - направляющие рельсы для перемещения корзины, 32 - направляющие рельсы для перемещения шторки, 33 - источник света, 34 - спектрометр, 35 - монохроматор, 36 - камера инкубации, 37 - трехкоординатный манипулятор, 38 - блок управления, 39 - блок перемещения контейнера.

Осуществление изобретения

Далее представлено более подробное описание заявляемого изобретения.

В настоящем описании использованы следующие термины, определения и сокращения.

«Система для инкубации и формирования цифровых изображений биологических образцов» при описании заявленного изобретения может иметь сокращенное название - система, система для инкубации, система инкубации, автоматизированная система.

«Контейнер» - емкость, в которой возможно размещение исследуемого образца, в том числе, посредством ручной и/или автоматической инокуляции. Емкость, в которую может быть помещен образец, обычно содержит субстрат или среду с питательными веществами для роста целевых микроорганизмов. Согласно настоящему изобретению, в автоматизированной системе для проведения исследований могут быть использованы такие контейнеры, как чашки Петри (далее также - чашки), содержащие высеянную среду, пробирки с бульоном и предметные стекла с биологическими образцами и др.

«Биологический образец» (далее также - образец) - образец жидкости и/или ткани организма человека, а также любой другой материальный образец, потенциально содержащий микробиологические объекты, взятый для проведения лабораторного исследования.

«Таксономическая идентификация микроорганизмов» - определение принадлежности микроорганизма к конкретному роду, виду и другим таксономическим категориям с использованием оптического отклика колонии микроорганизма.

Заявленный цифровой оптический блок устройства и системы для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце может быть выполнен на основе цифрового оптического блока, входящего в модуль фотографирования, конструктивное решение которого представлено в описании изобретения по патенту RU 2813210. Заявленный блок 1 дополнительно снабжен подвижной спектроскопической головкой 2, используемой для подведения возбуждающего излучения и детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца (например, колонии микроорганизмов).

Заявленный цифровой оптический блок 1 (фиг. 1-6) устройства для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце имеет модульную конструкцию, включает корпус 7 с площадкой 8 для размещения контейнера с биологическим образцом; расположенные в корпусе 7: спектроскопическую головку 2, выполненную с возможностью перемещения, по меньшей мере, в горизонтальной плоскости над площадкой 8 с контейнером; цифровую камеру 3, закрепленную в верхней части корпуса 7 над площадкой 8 для размещения контейнера, и выполненную с возможностью перемещения, по меньшей мере, в вертикальном направлении; по меньшей мере, два светильника - верхний 4 и нижний 5, закрепленные в корпусе с обеспечением равномерного освещения контейнера с биологическим образцом.

Корпус 7 цифрового оптического блока может иметь различную конфигурацию, предпочтительно в виде прямоугольного короба, облегчающего процесс сборки и обслуживания данного блока. Корпус содержит верхнюю, нижнюю, переднюю, боковые и заднюю стенки, оснащен электроразъемами, кронштейнами, технологическими отверстиями и углублениями, посадочными местами, переходными площадками с быстросъемными эксцентриковыми креплениями для установки и подключения к системе автоматической инкубации бактерий, а также удобства демонтажа и обслуживания. Корпус может быть выполнен из листового металла с антибликовым (поглощающим) матовым покрытием с внутренней стороны.

Спектроскопическая головка 2 (фиг.11-15) содержит две оптические системы 9 и 10, размещенные в держателе 11. Одна из оптических систем - 9, предназначена для подведения возбуждающего излучения, вторая 10 - для детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца. Каждая из оптических систем содержит оптоволокно 13, две выпуклых линзы 14 - входную и выходную, и плоское зеркало 15, расположенное на оптическом пути между линзами 14, при этом указанные элементы оптических систем размещены в световодных каналах 16 держателя 11, сконфигурированных с возможностью ввода и вывода оптического излучения в ортогональных плоскостях, при этом оптические волокна 13 расположены параллельно поверхности площадки 8 для размещения контейнера. Такое расположение оптических волокон обеспечивает беспрепятственное перемещение оптической головки относительно других электромеханических частей устройства.

В отдельных вариантах реализации изобретения спектроскопическая головка 2 содержит многомодовое оптическое волокно 13 с диаметром жилы d = 200-600 мкм, и числовой апертурой NA = 0,22, при этом торцы оптических волокон 13 расположены на расстоянии Δx от 0 до 5 мм от фокуса коллимирующей линзы 14; линзы 14 использованы с фокусным расстоянием от 15 до 20 мм и апертурой (диаметром) 10 мм, при этом линзы предпочтительно выполнены из плавленного кварца марки КУ-1; зеркала 15 имеют покрытие, характеризующееся максимальной отражательной способностью в диапазоне длин волн от 280 до 800 нм.

Оптические системы 9 и 10 расположены в держателе 11 с возможностью совпадения формируемых ими фокальных пятен на исследуемой поверхности биологического образца. Это достигается за счет формирования угла между оптическими осями данных оптических систем в вертикальной плоскости, который в конкретном варианте реализации может составлять 36 градусов.

Спектроскопическая головка 2 закреплена на консоли 12 на определенном (заданном) расстоянии от площадки для размещения контейнера с возможностью детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца. В конкретной реализации изобретения расстояние (высота H) от головки до исследуемого биологического образца предпочтительно составляет от 2 до 5 мм.

Держатель 11 оптических систем в одном из вариантов осуществления изобретения выполнен в виде параллелепипеда, содержащего три элемента - центральный 23 и два боковых 24 элемента, расположенные симметрично относительно центрального элемента; элементы образованы рассечением параллелепипеда двумя плоскостями сечения, расположенными под углом к вертикальной продольной плоскости параллелепипеда, при этом элементы держателя содержат части световодных каналов (предпочтительно 1/2 часть в поперечном сечении), сконфигурированные с возможностью образования световых каналов 16 при совмещении соответствующих боковых элементов 24 с центральным элементом 23, где один из световодных каналов сконфигурирован с возможностью размещения оптической системы, предназначенной для подведения возбуждающего излучения, второй световодный канал - с возможностью размещения второй оптической системы, предназначенной для детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца. В каналах держателя выполнены пазы для размещения линз и зеркал оптических систем.

Световодный канал 16 содержит участок, имеющий диаметр d1, соответствующий диаметру оптического волокна 13 для его неподвижного размещения в канале. Данный участок канала соединен с участком большего диаметра d2, предназначенным для распространения излучения от оптического волокна (для первой оптической системы) или к оптическому волокну (для второй оптической системы), с изменением направления распространения излучения на 90 градусов, реализованным посредством установленного в канале зеркала 15.

Держатель 11 в спектроскопической головке 2 предпочтительно имеет высоту (А) не более 25 мм, ширину (В) и длину (С) не более 75 мм (фиг. 13, 14).

Перемещение спектроскопической головки 2 реализовано с помощью электромеханического привода перемещения 17, снабженного ременной передачей 20 с крестообразным расположением ремней, при этом спектроскопическая головка 2 закреплена на подвижной платформе 18, привод размещен с нижней стороны корпуса цифрового оптического блока.

Электромеханический привод перемещения спектроскопической головки содержит два шаговых вращательных двигателя 19 со шкивами, размещенные на неподвижных опорах. В качестве направляющих 21 для перемещения спектроскопической головки использованы цилиндрические элементы с подшипниками скольжения. Также на подвижной платформе 18 находятся четыре ролика, обеспечивающие крестообразную конфигурацию ремня, а у задней стенки цифрового оптического блока (положение, соответствующее убранной головке) находится заделка для закрепления свободных концов ремня. Ход спектроскопической головки по каждой из осей X и Y ограничен механическими упорами и концевыми выключателями 22 на основе оптических датчиков. Указанная конфигурация позволяет обеспечить произвольную траекторию движения головки, делает узел перемещения спектроскопической головки более компактным (по сравнению с приводами с винтовыми передачами) и позволяет закрепить оба двигателя 19 неподвижно, что исключает необходимость подвижной прокладки проводов и повышает надежность узла перемещения.

Система освещения в цифровом оптическом блоке содержит, по меньшей мере, два светильника - верхний 4 и нижний 5, закрепленные в корпусе 7 с обеспечением равномерного освещения контейнера с биологическим образцом. Для наиболее равномерного освещения исследуемого образца может быть добавлен боковой светильник 6. Светильники могут быть выполнены с рассеивателями цилиндрической, конической, параболической или сферической формы, позволяющими направлять свет на контейнер с образцом и цифровую фотокамеру, установленную в верхней части корпуса цифрового блока. Светильники в одном из вариантов реализации изобретения представляют собой кольцевые или круглые плоские печатные платы с размещенным на них массивом светодиодов. Закрепление плат реализовано на металлических пластинах, размещенных внутри корпуса 7 блока.

Цифровая камера 3 снабжена приводом 25 ее вертикального перемещения для фокусировки, содержащим винтовую передачу 26 и концевой выключатель 27. При этом объектив камеры расположен в отверстии, выполненном в корпусе, над площадкой 8 для размещения контейнера с образцом для фотографирования, соосно верхнему 4 и нижнему 5 светильникам. Фокусировка камеры может осуществляться как вручную, так и при помощи отдельного электропривода, включающего шаговый электродвигатель, винтовую передачу, направляющие и оптические либо индукционные концевые выключатели.

Цифровой оптический блок 1 снабжен средством перемещения контейнера 28 в горизонтальном направлении (или в горизонтальной плоскости), содержащим транспортировочную корзину 29 для контейнера (фиг. 7). Транспортировочная корзина 29 может быть консольно закреплена на подвижной каретке, которая, в свою очередь, закреплена на направляющих рельсах 31. Транспортировочная корзина 29 снабжена своим электродвигателем с ременной передачей (приводом), обеспечивающей возвратно-поступательное перемещение корзины в горизонтальном направлении по направляющим рельсам 31 от зоны приема контейнера в зону фотографирования - под объектив фотокамеры 3. Транспортировочная корзина 29 в одном из вариантов осуществления изобретения может быть выполнена в виде опорного кольца, имеющего конфигурацию, обеспечивающую размещение в нем контейнера.

Средство перемещения контейнера 28 в одном из вариантов реализации может содержать шторку 30, выполненную с возможностью возвратно-поступательного перемещения в горизонтальном направлении и размещения в зоне фотографирования под транспортировочной корзиной 29 с возможностью перекрытия светового потока от нижних светильников 5. При этом средство перемещения контейнера 28 предпочтительно снабжено отдельными горизонтально ориентированными направляющими рельсами 32 для перемещения по ним шторки и своим приводом (электродвигателем с ременной передачей), обеспечивающим возвратно-поступательное перемещение шторки 30 по направляющим рельсам 32 под объектив фотокамеры 3. Шторка 30 размещена ниже уровня расположения транспортировочной корзины таким образом, что при размещении корзины в цифровом оптическом блоке под объективом фотокамеры шторка расположена под транспортировочной корзиной (под контейнером), перекрывая световой поток от нижних светильников при их использовании в конструкции данного блока. Средство перемещения контейнера 28 также снабжено датчиками положения шторки - «закрыто» или «открыто», при ее положении под камерой и за пределами данной зоны, соответственно. Шторка предназначена для получения цифровых изображений на темном фоне, при ее отсутствии получают фотографии на светлом фоне.

Устройство для идентификации микроорганизмов (фиг. 10) содержит цифровой оптический блок 1, соединенный с источником света, выполненным с возможностью выделения необходимого набора длин волн и спектрометром.

В конкретном варианте осуществления изобретения может быть использован плазменный источник света, имеющий диапазон излучения 280-500 нм и спектральную яркость в диапазоне значений от 1 мВт/(мм*ср*нм) до 35 мВт/(мм*ср*нм). Для спектральной селекции возбуждения могут быть использованы монохроматоры, выполненные по любой известной схеме - Черни-Тернера, Эберта-Фасти и др. Основными характеристиками монохроматора служат его спектральный диапазон и ширина полосы, выделяемой им из широкого спектра излучения. Спектральный диапазон прибора должен лежать в области от 300 до 800 нм, что покрывает всю видимую область оптического спектра. В частности, указанным условиям удовлетворяет лампа XWS-65 производителя ООО «Троицкий инженерный центр», совмещенная с монохроматором OceanOptics Monoscan 2000. Данный монохроматор является оптимальным, так как выделяет из попадающего в него спектра плазменного источника полосы шириной порядка 5-7 нм. Альтернативно, в качестве источников возбуждающего излучения, могут быть использованы светодиоды ближнего ультрафиолетового и видимого диапазона, для дополнительной спектральной селекции могут быть использованы диэлектрические фильтры, выделяющие необходимый спектральный диапазон. В заявленном устройстве предпочтительным является использование спектрометра (детектора) с диапазоном детектирования 300-800 нм со спектральным разрешением не хуже 5 нм и обладающего уровнем детектирования рассеянного света не более 0,5 % Такими характеристиками обладает устройство OceanOptics USB2000, сочетающее в себе быстродействие, хорошее разрешение и оптимальные значения «сигнал-шум». В заявленном устройстве предпочтительным также является использование монохроматора, обладающего спектральным диапазоном перестройки в диапазоне не менее 300-500 нм, с выделяемой спектральной шириной полосы не более 10 нм в указанном диапазоне.

Использование кварцевых оптоволокон 13 для детектирования флуоресцентного отклика от бактериальных колоний повышает интенсивность детектируемого сигнала эмиссии на величину порядка 30-40% в области от 280 до 380 нм.

При проведении исследований с помощью заявленного устройства было установлено, что для достижения точностей классификации, сопоставимых с точностями классификаций по флуоресцентному отклику, получаемому на 10 длинах волн возбуждения в диапазоне 280-460 нм, достаточно использовать набор из 5-6 длин волн возбуждения, сосредоточенных в диапазоне 300-420 нм. Установлено, что для решения задачи классификации требуется детектирование флуоресцентного отклика с разрешением не хуже ~5 нм, при этом влияние спектрального разрешения существенно сказывается на точности низкоуровневой классификации и менее выражено при решении задачи среднеуровневой классификации. Экспериментально проведена оценка влияния различных составных компонентов экспериментального устройства на возможность детектирования флуоресцентного отклика при возбуждении в ближнем ультрафиолетовом и видимом диапазоне. Продемонстрировано, что интенсивность флуоресцентного отклика может быть увеличена за счет использования волокон из плавленого кварца с увеличенным пропусканием в ближнем УФ диапазоне.

Система для идентификации микроорганизмов (фиг. 10) содержит устройство для оптической идентификации микроорганизмов, соединенное с блоком управления, содержащим, по меньшей мере, два модуля - модуль управления перемещением спектроскопической головки (модуль управления электромеханической частью устройства) и навигацией спектроскопической головки по изображениям, получаемым с цифровой камеры (модуля управления подведением спектроскопической головки), и модуль управления оптическими измерениями. Блок управления может быть дополнительно снабжен модулями перемещения цифровой камеры и контейнера, а также модулем анализа получаемых изображений и данных флуоресцентной спектроскопии.

Модуль анализа изображений и данных флуоресцентной спектроскопии содержит средства компьютерного зрения для анализа оптических изображений, при этом может быть выполнен с возможностью предобработки изображений, обеспечивающей визуализацию области, связанной с питательной средой и культивируемыми на них микроорганизмами. Модуль анализа изображений содержит сверточную нейронную сеть, используемую для классификации микроорганизмов, в качестве которой может быть использована модель с архитектурой по типу ConvNeXt (Woo, Sanghyun et al. "Convnext v2: Co-designing and scaling convnets with masked autoencoders." Proceedings of the IEEE/CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2023). При этом могут быть использованы другие архитектуры предиктивных моделей с аналогичной или более сложной архитектурой, в случае, если это повышает точность таксономической идентификации микроорганизмов.

Для анализа получаемых данных флуоресцентного отклика модуль анализа изображений и данных флуоресцентно спектроскопии содержит средства классификации микроорганизмов по результатам флуоресцентной спектроскопии с использованием средств машинного обучения, включая полносвязные нейронные сети, обученные с использованием амплитуд главных компонент спектров флуоресценции на этапе предобработки данных оптической спектроскопии и данных оптических изображений, а также на основе исходных спектров флуоресцентного отклика, полученных на различных длинах волн возбуждения флуоресценции.

Модуль управления оптическими измерениями выполнен с возможностью возбуждения эмиссии на нескольких длинах волн возбуждения от 280 до 500 нм, и детектирования от 300 до 800 нм.

Перечисленные модули позволяют в полуавтоматическом режиме производить подведение оптической головки к указанному месту на изображении чашки с питательной средой, производить управление измерением оптического сигнала, и передавать данные в алгоритмы таксономической идентификации микроорганизмов по данным оптического отклика.

Перечисленные модули могут быть реализованы в виде программ для ЭВМ, с использованием графического интерфейса, отображающего изображение чашки Петри с исследуемым биологическим образом, а также элементы управления спектроскопической головкой, предоставляющие пользователю возможность выбора геометрической области на изображении, куда необходимо подвести спектроскопическую головку. Программное обеспечение может быть выполнено с возможностью выбора координат для подведения спектроскопической головки путем нажатия на соответствующую область изображения, или же путем ручного управления перемещением спектроскопической головки в вертикальном и горизонтальном направлении на изображении. Полученные изображения могут быть сохранены для дальнейшего анализа и использования в алгоритмах классификации. После подведения спектроскопической головки к указанному месту в области чашки, может быть запущен модуль, управляющий оптическими измерениями. Указанный модуль, в том числе, управляет изменением длины волны возбуждения путем управления монохроматором, обеспечивающим спектральную селекцию излучения широкополосного плазменного источника, а также сбор данных со спектрометра, осуществляющего детектирование оптического отклика.

При проведении измерения пользователь видит текущий спектр флуоресцентного отклика на заданной длине волны возбуждения, а также все спектры флуоресценции на нескольких длинах волн возбуждения, получаемые в рамках текущего измерения. Пользователем могут быть осуществлены настройки измерения - выбор длин волн возбуждения, времен накопления сигнала, эмиссии, а также параметры, связанные с графическим отображением внутри окна модуля. После нажатия кнопки «начать измерение» производится измерение набора спектров флуоресценции на различных длинах волн возбуждения, данные автоматически записываются, а также подаются на вход алгоритма таксономической идентификации

Таким образом, с помощью данных модулей может осуществляться верхнеуровневое управление получением изображения с цифровой камеры блока, используемой для наведения на колонию микроорганизма, управление подведением спектроскопической головки к необходимому месту измерения, управлением измерения оптического сигнала от колоний микроорганизмов, и в результате - управление алгоритмами таксономической идентификации микроорганизмов по данным оптического отклика.

Предлагаемый цифровой оптический блок и устройство для идентификации микроорганизмов с использованием данного блока могут быть интегрированы в камеру инкубации (фиг. 8) для инкубирования контейнеров с образцами в оптимальных условиях и проведением исследований образцов в режиме реального времени с заданной (или необходимой) периодичностью (например, каждые 60 минут). Исследование образцов может быть реализовано с применением программного обеспечения, содержащего алгоритмы, основанные на использовании искусственного интеллекта. Камера инкубации, в свою очередь, может быть интегрирована в структуру микробиологической лаборатории (фиг. 9), в которой могут присутствовать модули и/или блоки автоматического посева биоматериала в контейнеры, например, такие как чашки Петри, с функцией загрузки контейнеров в кассеты, маркировки контейнеров; подготовки образцов для микрофлюидных тестов; отбора колоний; определения резистентности к антибиотикам и т.д. В частности, устройство для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце, содержащее цифровой оптический блок 1, может входить в состав автоматизированной микробиологической лаборатории, или любой другой системы со встроенной функцией фотографирования биологических образцов, реализованной, например, по патенту на изобретение RU 2811721. Кроме того, устройство для оптической идентификации микроорганизмов может быть использовано в составе «умного» инкубатора в качестве дополнительного модуля - «модуля спектроскопии», например, в составе модуля и системы формирования цифровых изображений биологических образцов, представленные в патенте на изобретение RU 2813210.

Камера инкубации 36 (фиг. 8) может быть выполнена в соответствии с патентом на изобретение RU 2813445. В рабочем объеме камеры расположены полки с ячейками (гнездами) для размещения чашек Петри с биологическими образцами. В камере размещены инженерные системы для создания в ее рабочем объеме оптимальных условий для роста микроорганизмов, включая средства формирования требуемого режима инкубации (средства нагрева, увлажнения, поддержания концентрации СО₂ и циркуляции воздуха) рабочего объема. Камера инкубации может быть снабжена датчиками контроля температуры, влажности, состава среды, и средствами, обеспечивающими возможность поддержания требуемых параметров в автоматическом режиме. Камера инкубации снабжена окном для загрузки и выгрузки контейнеров, а также одним или двумя окнами для связи с соответствующими цифровыми оптическими блоками устройства для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце. Предпочтительным является выполнение камеры инкубации с двумя цифровыми оптическими блоками 1 - верхним и нижним, функционирующими независимо друг от друга, один из которых расположен над окном загрузки и выгрузки контейнеров, второй блок - под упомянутым окном. Такое расположение блоков в камере инкубации предполагает использование двух трехкоординатных манипуляторов 37, которые расположены в камере один над другим с возможностью обслуживания каждым манипулятором своей зоны, содержащей цифровой блок - верхней и нижней, соответственно, и общую зону загрузки-выгрузки. При этом верхний манипулятор 37 обеспечивает перемещение контейнеров между окном загрузки и выгрузки контейнеров, верхним оптическим блоком и соответствующими (верхними) ячейками камеры инкубации; нижний манипулятор 37 обеспечивает перемещение контейнеров между окном загрузки и выгрузки контейнеров, нижним оптическим блоком и соответствующими (нижними) ячейками камеры инкубации. Перемещение манипуляторов в камере инкубации может быть реализовано независимо друг от друга в соответствии с управляющими программами. Корпус камеры инкубации может иметь отдельные отсеки для размещения верхнего и нижнего оптических блоков. Размещение полок с ячейками может быть реализовано различными способами. Каждая ячейка приспособлена для приема и удержания в ней контейнера с образцом в процессе инкубации. Камера инкубации может включать различное количество ячеек в зависимости от задач микробиологической лаборатории. Каждая ячейка характеризуется координатами ее пространственного местоположения. Цифровой оптический блок 1 размещен в своем корпусе 7 и может быть встроен в рабочий объем камеры инкубации или с внешней стороны камеры инкубации.

При совместном использовании заявленной системы для идентификации микроорганизмов с камерой инкубации, блок управления работой представляет собой программно-аппаратный комплекс, включает локальное хранилище для программного обеспечения, необходимого для управления элементами системы, и независимое локальное хранилище для результатов оптических измерений и анализа биологических образцов. Блок управления может содержать микропроцессор и комплект плат управления или микроконтроллеров, которые управляют функциями системы и обеспечивают работу по заданному алгоритму камеры инкубации, манипуляторов в рабочем объеме камеры, и цифрового оптического блока. Блок управления состоит из источников питания, преобразователей напряжения, защитных автоматов, плат управления шаговыми двигателями, плат управления двигателями постоянного тока, плат управления светильниками, нагревателями и прочим оборудованием камеры инкубации.

Пример реализации изобретения

Экспериментальный образец заявленного устройства для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце содержит цифровой оптический блок 1 со спектроскопической головкой 2, плазменный источник света XWS-65, производства ООО «Троицкий инженерный центр», монохроматор OceanOptics Monoscan2000, спектрометр (детектор) OceanOptics USB2000, оптоволокна d=600 мкм, материал - стекло, числовая апертура – 0,22.

Было разработано и изготовлено несколько вариантов спектроскопической головки 2 с габаритными характеристиками, удовлетворяющие заданным ограничениям. Трехмерный макет спектроскопической головки представлен на фиг. 11. Положения зеркал и линз относительно оптических волокон фиксировались и выбирались так, чтобы на заданном расстоянии от объекта пятно излучения возбуждающей части оптической системы перекрывалось с областью регистрации детектирующей части системы. На фиг. 12 представлены составные части оптической головки, изготовленные методом 3D-печати.

Было изготовлено 3 варианта спектроскопической головки, отличающиеся по расстоянию от торца волокна до фокальной плоскости линзы (размер “Х”) (фиг. 15), при этом угол между детектирующей и возбуждающей частью (фиг. 14) выбирался так, чтобы максимизировать пересечение пятна возбуждения и области регистрации в заданной конфигурации оптической схемы. Каждый из вариантов оптических головок был протестирован на модельном объекте на предмет возможности детектирования флуоресцентного сигнала в сравнении с приёмо-передающей двухволоконной схемой, в которой излучение напрямую подводилось к исследуемому объекту, расположенному на расстоянии 1 мм от приёмо-передающего волокна. Флуоресценция модельного объекта возбуждалась в широком спектральном диапазоне (от 280 до 500 нм), время накопления сигнала на спектрометре варьировалось в зависимости от типа детектирующей системы (двухволоконная схема, схема со спектроскопической головкой).

Проведенные испытания показали хороший результат. При сопоставимых временах накопления (0,1 с для двухволоконной схемы и 1 с для спектроскопической/оптической головки) отличия по интенсивности детектируемого сигнала составляли менее чем в 2 раза для одного из вариантов оптической головки (фиг. 16 А), при этом соотношение сигнал-шум в обеих конфигурациях было одинаково и составило порядка 50. Форма спектров флуоресценции модельного объекта совпала для обеих конфигураций детектирующей системы (фиг. 16 Б).

Далее было проведено сравнение рассматриваемых конфигураций спектроскопической головки на модельном микроорганизме - бактерии вида Escherichia coli. (см. фиг. 17 А). Для изготовленных вариантов спектроскопической головки на бактериях удалось получить сравнимый с оптоволоконной схемой детектируемый сигнал («сигнал-шум» для всех конфигураций составил порядка 25) за разумное время накопления этого сигнала (1 секунда на спектроскопических головках против 0.1с на волоконной схеме). При этом не наблюдалось существенного различия между формой полосы эмиссии, детектируемой с помощью приемо-передающего волокна и оптических головок (см. фиг. 17 Б).

Оптические системы спектроскопической головки - первая и вторая, полностью помещались в параллелепипед, который имел высоту (A) не более ≤ 25 мм, ширину и глубину (B и С) не превышающую ≤ 74,5 мм. Полученная спектроскопическая головка была расположена в цифровом оптическом блоке на высоте H от 2 до 5 мм от поверхности чашки Петри с питательной средой. Заведение возбуждающего излучения и регистрация оптического отклика было реализовано с помощью приемо-передающих оптических волокон. Оптическая схема позволяла детектировать флуоресцентный отклик в спектральных диапазонах возбуждения (280-500 нм) и детектирования (300-800 нм). Заведение возбуждающего излучения в данной схеме осуществлялось через многомодовое волокно с диаметром жилы d = 550 мкм и числовой апертурой NA = 0,22.

Для того, чтобы получить сигнал, эквивалентный измерению флуоресцентного отклика от колонии микроорганизмов с помощью двухволоконной схемы, расположенной на расстоянии ~1-2 мм от измеряемого объекта, были использованы линзы с большим диаметром и коротким фокусным расстоянием так, чтобы угловой размер детектирующей линзы, расположенной на фокусном расстоянии был по порядку сопоставим с угловым размером торца волокна двухволоконной схемы при ее расстоянии от объекта порядка 1-2 мм. С учетом ограничений по высоте расположения оптической схемы, были использованы линзы с фокусным расстоянием от 15 до 20 мм и апертурой (диаметром) 10 мм. Для большей чувствительности спектрометра в ближнем УФ диапазоне были использованы линзы из плавленного кварца марки КУ-1, обладающего высоким пропусканием в диапазоне >280 нм. Зеркала были использованы с алюминиевым покрытием, обеспечивающим высокие отражательные характеристики в диапазоне 280-1000 нм.

Далее разработанное устройство для идентификации микроорганизмов было использовано для измерения оптического отклика и последующей таксономической идентификации микроорганизмов, принадлежащих к клинически значимым видам, важным для принятия врачебного решения. Для этого с помощью устройства были проведены измерения на чашках Петри с питательной средой “колумбийский агар” для колоний микроорганизмов, инкубированных в течение суток в стандартных условиях. При этом вид микроорганизма, независимо от оптических измерений, проводимых с помощью устройства, определялся с помощью метода время-пролётной масс-спектрометрии для определения таксономической категории микроорганизма. Всего для определения конечной точности таксономической идентификации микроорганизмов с помощью устройства было проведено ~10000 измерений на образцах, с 25 клинически значимыми категориями микроорганизмов - микроорганизмов рода Lactobacillus, Neisseria, Corynebacterium, анаэробных микроорганизмах, а также микроорганизмов вида Enterococcus faecalis , Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Candida albicans, Candida auris, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Gardnerella vaginalis. Распределение числа объектов различных видов, использованных для апробации устройства представлен на фиг. 18-20. Для каждого измерения был известен “истинный” класс микроорганизма, идентифицированный с помощью времяпролётной масс-спектрометрии, и предсказание, осуществленное с помощью устройства по данным оптической визуализации, флуоресцентной спектроскопии и при объединении данных методов. Пример изображения и спектров флуоресценции, получаемых с помощью устройства для колоний микроорганизма вида Candida.auris, представлен на фиг. 19.

Для определения точности таксономической идентификации устройства для каждого измеренного образца определялось совпадение предсказания, полученного с помощью устройства с “истинной” меткой класса, после чего рассчитывалось количество истинно положительных (TP), ложноположительных (FP) и ложноотрицательных (FN) срабатываний устройства, на основе чего производился расчёт метрики классификации F-меры - как F = 2*TP/(2*TP + FP + FN) для каждого из рассматриваемых классов, после чего значения F-метрик, полученных для каждого класса, усреднялись - что и характеризовало финальное качество классификации. Значения поклассовых метрик классификации, полученных с помощью двух методов, приведены на фиг. 20. В результате апробации устройства было установлено, что на основе метода оптической визуализации, реализуемой в рамках устройства, таксономическая идентификация микроорганизмов возможна с F = 0,78. С использованием флуоресцентной спектроскопии точность таксономической идентификации составляет F = 0,83, а при объединении двух оптических методик точность составила F = 0,85, при этом данные двух оптических модальностей определялись по схеме, представленной на фиг. 21. То есть каждый из используемых методов - оптической визуализации с помощью цифровой камеры цифрового оптического блока, и флуоресцентной диагностики, осуществляемой с помощью оптической головки - обладали высокими точностями таксономической идентификации (F = 0,78 и F = 0,83 соответственно). При этом при совмещении двух оптических методик в реализованной системе идентификации достигалось увеличение точности таксономической идентификации микроорганизмов до F = 0,85.

Таким образом, была разработана и протестирована оптическая схема спектроскопической головки, используемой для подведения возбуждающего излучения и детектирования сигнала флуоресцентного отклика от колонии микроорганизма. Показано, что данная схема позволяет получать сигналы флуоресцентного отклика эквивалентные сигналам, получаемым с помощью двухволоконного приемо-передающего зонда, который был использован для набора статистики оптического отклика. Разработанная схема была полностью совместима с электромеханическим модулем перемещения спектроскопической головки, обеспечивает высокую точность идентификации микроорганизмов по данным оптического отклика, получаемого с помощью заявленного устройства.

Изобретение относится к лабораторному оборудованию для проведения микробиологических исследований. Цифровой оптический блок устройства для идентификации микроорганизмов включает корпус, содержащий площадку для размещения контейнера с биологическим образцом; цифровую камеру; спектроскопическую головку, содержащую размещенные в держателе две оптические системы, одна из которых предназначена для подведения возбуждающего излучения, вторая - для детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца, где спектроскопическая головка выполнена с возможностью перемещения, по меньшей мере, в горизонтальной плоскости над площадкой с контейнером; и по меньшей мере, два светильника - верхний и нижний, расположенные с обеспечением равномерного освещения контейнера с биологическим образцом. Держатель выполнен сборным, по меньшей мере, из трех частей, имеющих смежные профилированные поверхности, сконфигурированные с возможностью формирования при совмещении частей двух световодных каналов с размещением в них упомянутых оптических систем. Изобретение направлено на повышение точности таксономической идентификации микроорганизмов при обеспечении надежности и компактности используемого для этих целей цифрового оптического блока. 3 н. и 29 з.п. ф-лы, 21 ил.

1. Цифровой оптический блок устройства для идентификации микроорганизмов в исследуемом биологическом образце, включающий:

- корпус, содержащий площадку для размещения контейнера с биологическим образцом;

- цифровую камеру, расположенную в верхней части корпуса над площадкой для размещения контейнера;

- спектроскопическую головку, содержащую размещенные в держателе две оптические системы, одна из которых предназначена для подведения возбуждающего излучения, вторая - для детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца, при этом спектроскопическая головка выполнена с возможностью перемещения, по меньшей мере, в горизонтальной плоскости над площадкой с контейнером;

- по меньшей мере, два светильника - верхний и нижний, расположенные с обеспечением равномерного освещения контейнера с биологическим образцом;

при этом держатель выполнен сборным, по меньшей мере, из трех частей, имеющих смежные профилированные поверхности, сконфигурированные с возможностью формирования при совмещении частей двух световодных каналов с размещением в них упомянутых оптических систем.

2. Цифровой оптический блок по п.1, характеризующийся тем, что перемещение спектроскопической головки реализовано с помощью электромеханического привода перемещения, снабженного ременной передачей, при этом электромеханический привод размещен с нижней стороны корпуса цифрового оптического блока.

3. Цифровой оптический блок по п.1, характеризующийся тем, что каждая из оптических систем содержит оптоволокно, две выпуклых линзы – входную и выходную, и плоское зеркало, расположенное на оптическом пути между линзами, при этом указанные элементы оптических систем размещены в световодных каналах держателя, сконфигурированных с возможностью ввода и вывода оптического излучения в ортогональных плоскостях.

4. Цифровой оптический блок по п.3, характеризующийся тем, что спектроскопическая головка сконфигурирована с расположением оптических волокон в плоскости, параллельной поверхности площадки для размещения контейнера.

5. Цифровой оптический блок по п.1, характеризующийся тем, что спектроскопическая головка сконфигурирована с образованием угла между оптическими осями оптических систем в вертикальной плоскости, обеспечивающего возможность совпадения формируемых оптическими системами фокальных пятен на исследуемой поверхности биологического образца.

6. Цифровой оптический блок по п.5, характеризующийся тем, что угол между оптическими осями оптических систем составляет 36 градусов.

7. Цифровой оптический блок по п.1, характеризующийся тем, что спектроскопическая головка расположена с возможностью детектирования сигнала флуоресцентного отклика на расстоянии до 2 мм от исследуемого биологического образца.

8. Цифровой оптический блок по п.7, характеризующийся тем, что в спектроскопической головке использованы линзы с фокусным расстоянием от 15 до 20 мм и апертурой 10 мм, при этом линзы выполнены из плавленого кварца марки КУ-1.

9. Цифровой оптический блок по п.3, характеризующийся тем, что в спектроскопической головке зеркала имеют покрытие, характеризующееся максимальной отражательной способностью в диапазоне длин волн от 280 до 800 нм.

10. Цифровой оптический блок по п.3, характеризующийся тем, что в спектроскопической головке использовано многомодовое оптическое волокно с диаметром жилы d = 200-600 мкм и числовой апертурой NA = 0,22.

11. Цифровой оптический блок по п.3, характеризующийся тем, что в спектроскопической головке торцы оптических волокон расположены на расстоянии Δx от 0 до 5 мм от фокуса линзы.

12. Цифровой оптический блок по п.1, характеризующийся тем, что цифровая камера снабжена приводом ее вертикального перемещения для фокусировки.

13. Цифровой оптический блок по п.1, характеризующийся тем, что держатель выполнен в виде параллелепипеда из трех частей - центрального элемента и двух боковых элементов, расположенных симметрично относительно центрального элемента; элементы образованы рассечением параллелепипеда двумя плоскостями сечения, расположенными под углом к вертикальной продольной плоскости параллелепипеда, при этом элементы держателя содержат части световодных каналов, сконфигурированные с возможностью образования световодных каналов при совмещении соответствующих боковых элементов с центральным элементом, где один из световодных каналов сконфигурирован с возможностью размещения оптической системы, предназначенной для подведения возбуждающего излучения, второй световодный канал - с возможностью размещения второй оптической системы, предназначенной для детектирования сигнала флуоресцентного отклика от биологического образца.

14. Цифровой оптический блок по п.13, характеризующийся тем, что в световодных каналах выполнены пазы для размещения линз и зеркал оптических систем.

15. Цифровой оптический блок по п.13, характеризующийся тем, что световодный канал содержит участок, имеющий диаметр d1, соответствующий диаметру оптического волокна для его неподвижного размещения в канале, данный участок канала соединен с участком большего диаметра d2, предназначенным для распространения излучения от оптического волокна - для первой оптической системы, или к оптическому волокну - для второй оптической системы, с изменением направления распространения излучения на 90 градусов с помощью установленного в канале зеркала.

16. Цифровой оптический блок по п.13, характеризующийся тем, что держатель в спектроскопической головке имеет высоту 25 мм и менее, ширину и длину 75 мм и менее.

17. Цифровой оптический блок по п.1, характеризующийся тем, что он снабжен средством перемещения контейнера, содержащим транспортировочную корзину для контейнера.

18. Цифровой оптический блок по п.17, характеризующийся тем, что средство перемещения контейнера снабжено шторкой, выполненной с возможностью возвратно-поступательного перемещения в горизонтальном направлении и размещения в зоне фотографирования под транспортировочной корзиной с возможностью перекрытия светового потока от нижних светильников.

19. Цифровой оптический блок по п.17, характеризующийся тем, что средство перемещения контейнера в горизонтальном направлении снабжено отдельными горизонтально ориентированными направляющими рельсами для перемещения по ним шторки.

20. Цифровой оптический блок по п.2, характеризующийся тем, что спектроскопическая головка закреплена на подвижной платформе, при этом электромеханический привод содержит два шаговых вращательных двигателя со шкивами и ременный привод с крестообразным расположением ремней.

21. Цифровой оптический блок по п.20, характеризующийся тем, что крестообразное расположение ремней реализовано с использованием четырех роликов, размещенных на подвижной платформе, при этом ход ремней по каждой из осей X и Y ограничен механическими упорами и концевыми выключателями на основе оптических датчиков.

22. Устройство для идентификации микроорганизмов, содержащее цифровой оптический блок, выполненный по п.1, соединенный с источником света, выполненным с возможностью выделения необходимого набора длин волн, и спектрометром.

23. Устройство по п.22, характеризующееся тем, что использован плазменный источник света с возможностью излучения на длинах волн из диапазона 280-500 нм и спектральной яркостью от 1 мВт/(мм*ср*нм) до 35 мВт/(мм*ср*нм), при этом плазменный источник света снабжен монохроматором.

24. Устройство по п.22, характеризующееся тем, что использован спектрометр (детектор) с диапазоном детектирования излучения 300-800 нм со спектральным разрешением не хуже 5 нм и обладающий уровнем детектирования рассеянного света не более 0,5 %.

25. Устройство по п.23, характеризующееся тем, что использован монохроматор, обладающий спектральным диапазоном перестройки излучения 280-500 нм, с выделяемой спектральной шириной полосы не более 10 нм в указанном диапазоне.

26. Система для идентификации микроорганизмов, содержащая устройство для оптической идентификации микроорганизмов, выполненное по п.22, соединенное с модулем управления перемещением спектроскопической головки, включая управление позиционированием оптической головки по изображениям, получаемым с цифровой камеры, модулями управления перемещением цифровой камеры и контейнера, а также модулем управления оптическими измерениями и модулем анализа получаемых изображений и данных флуоресцентной спектроскопии.

27. Система по п.26, характеризующаяся тем, что модуль анализа изображений содержит средства компьютерного зрения.

28. Система по п.26, характеризующаяся тем, что модуль анализа изображений выполнен с возможностью предобработки изображений, обеспечивающей визуализацию области, связанной с питательной средой и культивируемыми на них микроорганизмами.

29. Система по п.26, характеризующаяся тем, что модуль анализа изображений содержит сверточную нейронную сеть, используемую для классификации микроорганизмов.

30. Система по п.29, характеризующаяся тем, что использована модель с архитектурой по типу ConvNeXt, предобученная на базе данных ImageNet.

31. Система по п.26, характеризующаяся тем, что модуль анализа изображений содержит средства классификации микроорганизмов по результатам флуоресцентной спектроскопии с использованием средств машинного обучения, включая полносвязные нейронные сети, обученные при использовании амплитуд главных компонент спектров флуоресценции на этапе предобработки данных оптической спектроскопии и данных оптических изображений.

32. Система по п.26, характеризующаяся тем, что модуль управления оптическими измерениями выполнен с возможностью возбуждения эмиссии на нескольких длинах волн возбуждения от 280 до 500 нм и детектирования от 300 до 800 нм.