Контроль заражения при выращивании дрожжей Российский патент 2024 года по МПК C12N1/16 C12N1/38 C12P1/02 C12P7/06 C12M1/02 C12R1/645 

ДАННЫЕ О ПРИОРИТЕТЕ

Данная заявка на патент представляет собой международную заявку на патент, заявляющую приоритет предварительной заявки на патент США №63/534123, поданной 23 августа 2023 г., и заявки на патент США №18/532043, поданной 7 декабря 2023 г., каждая из которых полностью включена в настоящий документ для всех целей посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области выращивания микроорганизмов. Более конкретно, изобретение относится к контролю заражения при выращивании дрожжей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Выращивание дрожжей в промышленных масштабах обычно используется для получения белка одноклеточных (SCP) или попутных продуктов, таких как этанол. Такое выращивание в настоящем документе называется «ферментацией», и для него используют «ферментер» для выращивания данных дрожжей, даже когда отсутствуют попутные продукты, такие как этанол, и даже когда процесс является либо аэробным, либо анаэробным.

Одной проблемой при выращивании дрожжей в промышленных масштабах, например в ферментерах объемом более 100 м³, является заражение другими микроорганизмами.

Например, ферментеры промышленного масштаба, в которых используются Saccharomyces cerevisiae для производства этанола из cахаров, часто заражены молочнокислыми бактериями, такими как Lactobacillus fermentum, или дрожжами дикого типа, такими как Dekkera bruxellensis и его анаморфой Brettanomyces bruxellensis. Заражение особенно распространено в случае повторного использования дрожжей. Заражения описаны в Bassi, Ana Paula Guarnieri, et al., "Interaction of Saccharomyces cerevisiae Lactobacillus fermentum-Dekkera bruxellensis and feedstock on fuel ethanol fermentation", Antonie Van Leeuwenhoek 111 (2018): 1661-1672, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

Заражение происходит, если скорость роста нежелательного микроорганизма выше скорости роста желательного микроорганизма. Например, время удвоения большинства молочнокислых бактерий составляет приблизительно 0,5 часа, а время удвоения многих дрожжей составляет приблизительно 1,5 часа. Это означает, что за период времени 24 часа одна бактериальная клетка молочнокислой бактерии вырастет до 2^24/0,5 или 3 × 10¹⁴ клеток, тогда как одна дрожжевая клетка вырастет до 2^24/1,5 или 7 × 10⁴ клеток. Снижение скорости роста молочнокислой бактерии до немного меньшей, чем у дрожжей (повышение времени удваивания только на немного более 1,5 часа) полностью устраняет проблему заражения, даже в течение многих месяцев непрерывной ферментации. Часто забывают, что увеличение скорости роста дрожжей (например, путем использования мочевины в качестве источника азота) также снижает заражение.

Контроль заражения непосредственно связан с продолжительностью ферментации и начальной концентрацией нежелательных микроорганизмов и желательных микроорганизмов, а также со скоростью роста данных организмов. Простые расчеты показывают, что при более длительной ферментации возникает больше проблем с заражением, чем при более короткой ферментации, принимая во внимание разные скорости роста этих микроорганизмов.

По этой причине заражение можно контролировать путем комбинирования уменьшения времени ферментации (например, повторное использование дрожжей при производстве этанола в Бразилии), уничтожения посторонних микроорганизмов (например, промывание повторно используемых дрожжей серной кислотой) или снижения скорости роста посторонних микроорганизмов (например, с помощью антибиотиков).

Выращивание дрожжей в промышленных масштабах неизбежно происходит в нестерильных условиях, поскольку выращивание в стерильных условиях в промышленных масштабах является слишком дорогим. Наиболее распространенными способами контроля заражения при ферментации в промышленных масштабах было использование сульфитов (SO₂), антибиотиков и пероксидов.

Виноделы в древнем Риме сжигали серные свечи в емкостях для вина, чтобы контролировать заражение, которое превращало вино в уксус, что, как стало известно, вызвано уксусно-кислой бактерией, такой как Acetobacter aceti. В наше время сульфиты часто используют для предотвращения роста бактерий в виноделии. Однако, у некоторых людей сульфиты вызывают аллергию, по этой причине винные этикетки должны содержать предостережение о содержащихся в вине сульфитах.

Первая успешная ферментация SCP в промышленных масштабах была выполнена в Германии в 1930-х и 1940-х годах с использованием отработанного щелока из сульфитной варки целлюлозы. Это описано в hiskeep, Gordon С., et al., "Food yeast from sulfite liquor", Industrial & Engineering Chemistry 43.8 (1951): 1702-1711, которая включена в настоящий документ путем ссылки. Inskeep отмечает, что «Ферментация дрожжей удивительным образом не была подвержена заражению. За более чем 2 года работы завода Lake States производство никогда не прерывалось из-за заражения. Условия рН, температуры и аэрации с перемешиванием обеспечивали размножение Т. utilis со скоростью, достаточно быстрой для того, чтобы они успели перерасти и предотвратить развитие посторонних организмов». Inskeep также отмечает, что «рН ферментационной смеси (сусла) колебался в пределах приблизительно 5,0». Похоже, что Inskeep не учел, что остаточные сульфиты из варки целлюлозы, возможно, привели к отсутствию бактериального заражения. Также в 1950-х годах не было известно об аллергических реакциях на сульфиты.

Сегодня производители топливного этанола часто используют антибиотики для контроля бактериального заражения при ферментации в промышленных масштабах. Однако это дорого. Кроме того, ценный попутный продукт из сушеной дробины с растворимыми веществами (DDGS) загрязнен данными антибиотиками, которые попадают в пищевую цепочку, порождая стойкие к антибиотикам бактерии, которые вызывают болезни у людей. Это описано в Olendorff, Samantha A., Karolina Chmielewska, and Kevin R. Tucker, "Survey of antibiotics residues in DDGS from 14 different states by LCM", Cereal Chemistry 98.1 (2021): 81-88, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

Были предприняты попытки контролировать бактериальное заражение с использованием пероксигидрата мочевины и безазотистых соединений, выделяющих пероксид. Применение пероксигидрата мочевины для контроля заражения Lactobacillus описано в Narendranath, N.V., К.С. Thomas, and W.М. Ingledew, "Urea hydrogen peroxide reduces the numbers of lactobacilli, nourishes yeast, and leaves no residues in the ethanol fermentation", Applied and Environmental microbiology 66.10 (2000): 4187-4192, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Применение безазотистых соединений, выделяющих пероксид, для контроля бактериального заражения описано у Solomon в патенте США №8759051, опубликованном 24 июня 2014 года, который включен в настоящий документ посредством ссылки. Однако, было доказано, что применение пероксидов для контроля бактериального заражения экономически нецелесообразно и в настоящее время широко не используется в процессах ферментации в промышленных масштабах.

За более чем 30 лет для получения SCP применяли четыре микроорганизма, которые безопасны для употребления людьми и для скармливания животным. Дрожжи, которые использовали для получения SCP из гексозных сахаров и из гидролизованного крахмала на протяжении более 100 лет, представляют собой Saccharomyces cerevisiae, более известные как хлебопекарные дрожжи, пивные дрожжи или просто дрожжи. Дрожжи, которые использовали для получения SCP из гидролизованного крахмала, гексозных сахаров и пентозных сахаров на протяжении более 80 лет, представляют собой Cyberlindnera jadinii, более известные как Candida utilis или торула. Дрожжи, которые использовали для получения SCP из гидролизованного крахмала, гексозных сахаров, лактозы и галактуроновой кислоты на протяжении более 50 лет, представляют собой Kluyveromyces marxianus, более известные как Candida kefyr и Kluyveromyces lactis. Дрожжи, которые использовали для получения SCP из липидов (масел) на протяжении более 50 лет, представляют собой Yarrowia lipolytica.

Все эти четыре вида дрожжей были одобрены в Соединенных Штатах как общепризнанно безопасные (GRAS) и получили аналогичные разрешения в большинстве других стран, включая Канаду, Европу, Австралию, Китай и Россию. Все они были тщательно протестированы и признаны безопасными для применения в кормах для животных (особенно рыбы и кур), а также для употребления людьми. Candida utilis (тортулу) в настоящее время даже используют в качестве вкусовой добавки, которая имеет аромат умами (мясной) и приятный вкус.

Бактериальное заражение часто является наибольшей технической проблемой при использовании дрожжей для ферментации в промышленных масштабах для производства этанола, белка одноклеточных и липидов Омега-3.

Существует необходимость в контроле заражения в промышленных масштабах без применения сульфитов, антибиотиков, кислотных промывок или пероксидов при производстве топливного этанола и при выращивании дрожжей для SCP.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В некоторых вариантах изобретения предложен способ выращивания дрожжей, причем способ предусматривает выращивание дрожжей в течение периода ферментации при начальном рН в ферментационном бульоне, содержащем источник углерода, источник азота и источник минералов, где ферментационный бульон находится в функциональной связи с теплообменником, при этом дрожжи принадлежат к классу Saccharomycetes, при этом источник азота в ферментационном бульоне содержит мочевину, при этом содержание никеля в ферментационном бульоне составляет менее 1 мг/кг, и при этом мочевину вводят в ферментационный бульон таким образом, что рН ферментационного бульона в течение периода ферментации не превышает начального рН более чем на 2,0.

В предпочтительных вариантах осуществления теплообменник представляет собой пластинчатый теплообменник, содержащий титановые теплообменные пластины, при этом содержание никеля в титановых теплообменных пластинах составляет менее 1 г/кг.

В предпочтительных вариантах осуществления теплообменник представляет собой теплообменник со спиральными пластинами, содержащий титановые теплообменные пластины, при этом содержание никеля в титановых теплообменных пластинах составляет менее 1 г/кг.

В предпочтительных вариантах осуществления способ применяют для производства этанола в ферментационном бульоне.

В предпочтительных вариантах осуществления отношение содержания источника углерода к содержанию мочевины является таким, что в ферментационном бульоне по существу не остается мочевины перед отделением этанола от ферментационного бульона путем дистилляции.

В предпочтительных вариантах осуществления в способе используют отделение дрожжей от ферментационного бульона для получения повторно используемых дрожжей, и при этом повторно используемые дрожжи не промывают кислотой после отделения.

В предпочтительных вариантах осуществления для отделения используют центрифугирование, при котором на входе подаютпринимают вводимую жидкость, а на выходе получают выводимые твердые вещества и супернатант, при этом вводимая жидкость представляет собой ферментационный бульон, при этом центрифугирование имеет отсекаемый размер от 1,5 микрон до 2,5 микрон, и при этом выводимые твердые вещества содержат повторно используемые дрожжи.

В некоторых вариантах осуществления дрожжи содержат нехлопьевидные дрожжи, при этом для отделения используют первое центрифугирование и второе центрифугирование, при этом при первом центрифугировании на входе подают первую вводимую жидкость, а на выходе получают первые выводимые твердые вещества и первый супернатант, при этом при указанном втором центрифугировании на входе подают вторую вводимую жидкость, а на выходе получают вторые выводимые твердые вещества и второй супернатант, при этом первая вводимая жидкость представляет собой ферментационный бульон, причем первое центрифугирование имеет отсекаемый размер от 10 микрон до 15 микрон, при этом первые выводимые твердые вещества представляют собой попутные продукты ферментации, при этом первый супернатант представляет собой вторую вводимую жидкость, при этом второе центрифугирование имеет размер отсечения от 1,5 микрон до 2,5 микрон, и при этом вторые выводимые твердые вещества представляют собой повторно используемые дрожжи.

В некоторых вариантах осуществления дрожжи включают хлопьевидные дрожжи, причем при отделении используют дефлокулирование с высоким усилием сдвига, первое центрифугирование и второе центрифугирование, при этом при дефлокулировании с высоким усилием сдвига на входе подают вводимую жидкость с высоким усилием сдвига, а на выходе получают выводимую жидкость с высоким усилием сдвига, причем при первом центрифугировании на входе подают первую вводимую жидкость, а на выходе получают первые выводимые твердые вещества и первый супернатант, причем при втором центрифугировании на входе подают вторую вводимую жидкость, а на выходе получают вторые выводимые твердые вещества и второй супернатант, причем вводимая жидкость с высоким усилием сдвига представляет собой ферментационный бульон, где масштаб шкалы Колмогорова дефлокулирования с высоким усилием сдвига находится в диапазоне от 7 микрон до 15 микрон, причем первая вводимая жидкость представляет собой выводимую жидкость с высоким усилием сдвига, причем первое центрифугирование имеет отсекаемый размер от 10 микрон до 15 микрон, где первые выводимые твердые вещества представляют собой попутные продукты ферментации, при этом первый супернатант представляет собой вторую вводимую жидкость, при этом второе центрифугирование имеет отсекаемый размер от 1,5 микрон до 2,5 микрон, и где вторые выводимые твердые вещества представляют собой повторно используемые дрожжи.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы, процессы и системы настоящего изобретения будут подробно описаны со ссылкой на различные неограничивающие варианты осуществления и фигуру(-ы).

Описание позволит специалисту в данной области техники осуществить и использовать изобретение, а также в нем описано несколько вариантов осуществления, адаптаций, видоизменений, альтернатив и применений изобретения. Эти и другие варианты осуществления, признаки и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными для специалистов в данной области техники при рассмотрении со ссылкой на последующее подробное описание изобретения в сочетании с прилагаемыми графическими материалами.

Как описано в данном описании и прилагаемой формуле изобретения, формы существительных в единственном числе включают объекты во множественном числе, если контекст явным образом не указывает иное. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое понимает специалист в данной области техники, для которого предназначено данное изобретение.

Если не указано иное, все числа, выражающие параметры, условия, результаты и так далее, используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «приблизительно». Соответственно, если не указано обратное, числа, приведенные в последующем описании и приложенной формуле изобретения, являются приближенными величинами, которые могут варьироваться в зависимости от конкретных алгоритмов и вычислений.

Термин «содержащий», который является синонимом «включающий», «вмещающий» или «характеризующийся», является охватывающим или открытым и не исключает дополнительных, не перечисленных элементов или стадий способа. «Содержащий» является термином в данной области техники, используемым в языке формулы изобретения, который означает, что упомянутые заявленные элементы являются существенными, но могут быть добавлены другие заявленные элементы, которые по-прежнему формируют концепцию в пределах объема пункта формулы изобретения.

Используемая в настоящем документе фраза «состоящий из» исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанный в пункте формулы изобретения. Когда фраза «состоит из» (или ее вариации) встречается в отличительной части пункта формулы изобретения, а не сразу после преамбулы, она ограничивает только элемент, предложенный в данном пункте; другие элементы не исключаются из пункта формулы изобретения в целом. Используемая в настоящем документе фраза «состоящий по существу из» ограничивает объем пункта формулы изобретения до конкретных элементов или стадий способа плюс те, которые существенно влияют на исходную(-е) и новую(-е) характеристику(-и) заявленного объекта изобретения.

В отношении терминов «содержащий», «состоящий из» и «состоящий по существу из», где используется один из этих терминов, описанный в данном случае и заявленный объект изобретения может включать использование любого другого из двух терминов, за исключением групп Маркуша. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, иначе не указанных явно, при любом появлении «содержащий» может быть заменен на «состоящий из» или, альтернативно, на «состоящий по существу из».

Ни один из вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, не должен ограничиваться какой-либо теорией или рассуждением в отношении механизмов реакции, механизмов массообмена или описаниями сырья или продуктов.

Настоящее изобретение основано на техническом решении серьезной проблемы бактериального заражения во время выращивания дрожжей. Автором изобретения было замечено, что для бактерий в качестве кофактора для ферментов уреазы требуется никель, чтобы использовать мочевину для выращивания, в то время как для дрожжей в качестве кофактора для каких-либо ферментов никель не требуется. Данный принцип применяется при проектировании системы ферментации, в которой минимизируют содержание никеля в бульоне, причем в это же время мочевина представляет собой главный источник азота, который, в свою очередь, снижает скорость роста бактерий до значения ниже скорости роста дрожжей, препятствуя заражению.

Многие бактерии, особенно многие из которых часто заражают ферментацию дрожжей, не содержат ферментов уреазы и, таким образом, не могут вообще расти, если источником азота является мочевина. Данные бактерии включают Liquorilactobacillus vini {Lactobacillus vini), Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis и Lactobacillus casei. Однако, две распространенные заражающие бактерии, которые не содержат ферментов уреазы, представляют собой Lactobacillus fermentum и Lactobacillus reuteri. В данном описании заражение этими организмами контролируют путем снижения содержания никеля в ферментационном бульоне.

Было замечено, что уменьшение содержания никеля в ферментационном бульоне приводит к значительному снижению скорости роста бактерий в ферментационном бульоне. Поскольку никель является катализатором для уреазы у бактерий, снижение наполовину концентрации никеля наполовину снижает рост бактерий, если мочевина является главным источником азота.

Дополнительным благоприятным фактором для контроля заражения является использование мочевины в качестве главного источника азота. Lactobacillus fermentum медленнее растет на мочевине, чем на аммонии. Это описано в Gao, X., S.Y. Qiao, and W.Q. Lu., "Determination of an economical medium for growth of Lactobacillus fermentum using response surface methodology", Letters in applied microbiology 49.5 (2009): 556-561, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Многие дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, на мочевине растут быстрее, чем на других источниках азота. Это описано в Jones, Alison М., and W.М. Ingledew., "Fuel alcohol production: optimization of temperature for efficient very-high-gravity fermentation", Applied and environmental microbiology 60.3 (1994): 1048-1051, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

В случае повторном использовании дрожжей благоприятным фактором для контроля заражения является использование дифференциального центрифугирования для отделения дрожжей от бактерий и повторное использование дрожжей. Впервые это было описано в Whiting, М., et al., "Detection of Pediococcus spp. in brewing yeast by a rapid immunoassay", Applied and environmental microbiology 58.2 (1992): 713-716, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Относительное центробежное ускорение, используемое Whiting, демонстрирует отделение хлопьевидных дрожжевых клеток от бактериальных клеток. Клетки дрожжей имеют размер приблизительно 7 микрон, при этом бактерии имеют размер приблизительно 1 микрон, а также сопоставимую плотность, поэтому скорости осаждения Стокса отличаются приблизительно в 50 раз, при этом клетки дрожжей осаждаются приблизительно в 50 раз быстрее бактерий. Это затрудняется наличием твердых веществ (попутных продуктов) при производстве кукурузного этанола, но дрожжи можно отделить от данных твердых веществ путем одного центрифугирования для удаления твердых веществ и второго - для отделения дрожжей. Это затрудняется флокуляцией, которую можно устранить путем применения нехлопьевидных дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae РЕ-2, или путем использования смесителя с высоким усилием сдвига для дефлокулирования перед центрифугированием.

Использование мочевины осложняется тем, что, когда внутри клеток дрожжей слишком много мочевины, они выделяют из себя аммоний, чтобы снизить для себя его токсичность, но аммоний является хорошей средой для роста бактерий. При концентрации мочевины менее 0,25 мМ, мочевина проникает в дрожжевую клетку с помощью индуцибельной пермеазы мочевины, а при концентрации свыше 0,5 мМ мочевина проникает в клетку дрожжей путем облегченной диффузии. Это описано в Yang, Xinchao, et al., "Comparisons of urea or ammonium on growth and fermentative metabolism of Saccharomyces cerevisiae in ethanol fermentation", World Journal of Microbiology and Biotechnology 37.6 (2021): 98, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Если данная скорость диффузии выше кинетической потребности в азоте для роста, дрожжевые клетки будут снижать для себя токсичный эффект от аммония из мочевины путем выделения аммония. Это описано в Prins, Rianne С., and Sonja Billerbeck., "A buffered media system for yeast batch culture growth", BMC microbiology 21.1 (2021): 1-9, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Prins показал, что рост дрожжей с мочевиной в качестве главного источника азота приводит к ощелачиванию при 5 мМ мочевины (Prins, Фиг. 1А и 1В, левые столбцы, небуферированный). Ощелачивание происходит из-за выделения аммиака из дрожжей. Автор настоящего изобретения экспериментально продемонстрировал, что ощелачивание снижается путем добавления мочевины периодической подпиткой, сохраняя концентрацию мочевины ниже 1 мМ, что значительно снижает скорость роста заражающих бактерий.

В некоторых вариантах изобретения предложен способ выращивания дрожжей, причем способ предусматривает выращивание дрожжей в течение периода ферментации при начальном рН в ферментационном бульоне, содержащем источник углерода, источник азота и источник минералов, где ферментационный бульон находится в функциональной связи (т.е. способен к теплообмену) с теплообменником, причем дрожжи принадлежат к классу Saccharomycetes, причем источник азота в ферментационном бульоне содержит мочевину, причем содержание никеля в ферментационном бульоне составляет менее 1 мг/кг, и где мочевину вводят в ферментационный бульон таким образом, что рН ферментационного бульона в течение периода ферментации не превышает начального рН более чем на 2,0 (т.е. более чем на две единицы рН).

Если источником азота является мочевина, то бактерии могут расти только тогда, когда в ферментационном бульоне достаточно никеля, чтобы катализировать превращение мочевины ферментом уреазой в аммиак и СО₂. Дрожжи используют фермент амидолазу мочевины (которого нет у бактерий), чтобы катализировать превращение мочевины в аммиак и СО₂. В качестве катализатора амидолаза мочевины использует биотин вместо никеля. Данная разница между бактериями и дрожжами описана в Strope, Pooja K., et al., "Molecular evolution of urea amidolyase and urea carboxylase in fungi", BMC Evolutionary Biology 11.1 (2011): 1-15, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

В кислотных растворах, содержащих ионы хлора, нержавеющая сталь выщелачивает никель в раствор. Одним способом снизить содержание никеля в водном ферментационном бульоне является применение теплообменников, выполненных из титанового сплава со следовым количеством никеля или других металлических сплавов со следовым количеством никеля. Никель является следовым элементом во всех титановых сплавах, за исключением нитинолового сплава, который содержит приблизительно 50% никеля и 50% титана.

Контроль рН по сравнению с начальным рН выявил, что при повышении рН, скорость подачи мочевины является слишком высокой, а замедление скорости подачи мочевины с периодической подпиткой приводит к уменьшению количества выделяемого аммония. Бактерии могут использовать аммоний в качестве источника азота, поэтому при уменьшении или в отсутствие выделения аммония, аммоний недоступен для потребления бактериями.

В предпочтительных вариантах осуществления теплообменник представляет собой пластинчатый теплообменник, содержащий титановые теплообменные пластины, причем содержание никеля в титановых теплообменных пластинах составляет менее 1 г/кг. В данном описании «титан» включает титановые сплавы, при условии что содержание никеля в таких сплавах составляет менее 1 г/кг.

В предпочтительных вариантах осуществления теплообменник представляет собой теплообменник со спиральными пластинами, содержащий титановые теплообменные пластины, причем содержание никеля в титановых теплообменных пластинах составляет менее 1 г/кг.

Основным источником никеля в ферментере является ощелачивание никеля из нержавеющей стали в теплообменнике. Два наиболее целесообразных теплообменника для ферментеров представляют собой теплообменники с широким зазором между пластинами и спиральные теплообменники. Данные теплообменники поступают в продажу, в них используется титан вместо нержавеющей стали, и не происходит ощелачивание никеля. Дополнительным преимуществом применения теплообменников, выполненных из титановых сплавов, является то, что они не подвержены коррозии при охлаждении морской водой, которая является неистощимым и недорогим источником охлаждения в промышленных масштабах.

В предпочтительных вариантах осуществления способ применяют для производства этанола в ферментационном бульоне.

Наиболее широко используемыми дрожжами для производства этанола являются Saccharomyces cerevisiae, которые хорошо растут с использованием мочевины в качестве источника азота, как правило, с использованием глубинной ферментации, обычно в анаэробных условиях или слегка аэробных условиях.

В предпочтительных вариантах осуществления отношение содержание источника углерода к содержанию мочевины является таким, что в ферментационном бульоне по существу не остается мочевины перед отделением этанола от ферментационного бульона путем дистилляции.

Этилкарбамат, который является известным канцерогеном, получают в результате реакции мочевины и этанола при повышенных температурах, а мочевина безопасна при аэробном выращивании без получения этанола. Этилкарбамат не образуется из пероксигидрата мочевины при условии, что этанол не присутствует при более высоких температурах, и поэтому его безопасно использовать в отбеливателях для зубов. Предпочтительные варианты настоящего изобретения обеспечивают отсутствие мочевины во время дистилляции, что устраняет проблему образования этилкарбамата в ходе дистилляции.

В предпочтительных вариантах осуществления в способе используют отделение дрожжей от ферментационного бульона для получения повторно используемых дрожжей, при этом повторно используемые дрожжи не промывают кислотой после отделения.

Процесс повторного использования дрожжей, широко используемый в Бразилии для ферментации сока из сахарного тростника и патоки из сахарного тростника, называется процессом Мелле-Буано, который был запатентован Фирмином Буано в 1936 г. для ферментации сока из сахарной свеклы в этанол. Это описано Буано в патенте США № 2230318, опубликованном 4 февраля 1941 г., который включен в настоящий документ посредством ссылки. В процессе Мелле-Буано используют отделение дрожжей и бактерий после ферментации с помощью центрифугирования с последующей обработкой разбавленной серной кислотой, которая убивает бактерии, не вредя большей части дрожжей. Однако, данный процесс является дорогостоящим, использует опасные кислоты и вызывает проблемы с утилизацией жидких отходов после обработки. В отличие от этого, настоящее изобретение устраняет необходимость обработки кислотой после отделения дрожжей, поскольку скорость роста бактерий замедляется с помощью вышеописанных методов.

В предпочтительных вариантах осуществления для отделения используют центрифугирование, при котором на входе подают вводимую жидкость, а на выходе получают выводимые твердые вещества и супернатант, при этом вводимая жидкость представляет собой ферментационный бульон, при этом центрифугирование имеет отсекаемый размер от 1,5 микрон до 2,5 микрон, и при этом выводимые твердые вещества содержат повторно используемые дрожжи.

При использовании данного отсекаемого размера дрожжи отделяются от ферментационного бульона, поскольку дрожжи обычно имеют диаметр более 2,5 микрон. Данный вариант осуществления применяют, если отсутствуют попутные продукты с диаметром более 2,5 микрон, которые необходимо отделить от дрожжей. Это справедливо для сока из сахарного тростника, патоки из сахарного тростника, сока из сахарной свеклы и патоки из сахарной свеклы, поскольку их уже центрифугировали для удаления твердых веществ.

В некоторых вариантах осуществления дрожжи содержат нехлопьевидные дрожжи, причем при отделении используют первое центрифугирование и второе центрифугирование, где при первом центрифугировании на входе подают первую вводимую жидкость, а на выходе получают первые выводимые твердые вещества и первый супернатант, где при указанном втором центрифугировании на входе подают вторую вводимую жидкость, а на выходе получают вторые выводимые твердые вещества и второй супернатант, причем первая вводимая жидкость представляет собой ферментационный бульон, причем первое центрифугирование имеет отсекаемый размер от 10 микрон до 15 микрон, причем первые выводимые твердые вещества представляют собой попутные продукты ферментации, причем первый супернатант представляет собой вторую вводимую жидкость, причем второе центрифугирование имеет отсекаемый размер от 1,5 микрон до 2,5 микрон, и причем вторые выводимые твердые вещества представляют собой повторно используемые дрожжи.

Производство кукурузного этанола и пшеничного этанола после ферментации часто приводит к значительному количеству твердых веществ, которые представляют собой ценные попутные продукты. В данном варианте осуществления применяют дифференциальное центрифугирование для отделения попутных продуктов при первом центрифугировании и для отделения дрожжей при втором центрифугировании. Данный вариант осуществления применяют, если дрожжи не являются хлопьевидными и при этом имеют размер в пределах от 2,5 микрон до 15 микрон.

В некоторых вариантах осуществления дрожжи включают хлопьевидные дрожжи, при этом при отделении используют дефлокулирование с высоким усилием сдвига, первое центрифугирование и второе центрифугирование, где при дефлокулировании с высоким усилием сдвига на входе подают вводимую жидкость с высоким усилием сдвига, а на выходе получают выводимую жидкость с высоким усилием сдвига, где при первом центрифугировании на входе подают первую вводимую жидкость, а на выходе получают первые выводимые твердые вещества и первый супернатант, где при втором центрифугировании на входе подают вторую вводимую жидкость, а на выходе получают вторые выводимые твердые вещества и второй супернатант, причем вводимая жидкость с высоким усилием сдвига представляет собой ферментационный бульон, причем масштаб длины Колмогорова дефлокулирования с высоким усилием сдвига находится в диапазоне от 7 микрон до 15 микрон, где первая вводимая жидкость представляет собой выводимую жидкость с высоким усилием сдвига, где первое центрифугирование имеет отсекаемый размер от 10 микрон до 15 микрон, где первые выводимые твердые вещества представляют собой побочные продукты ферментации, где первый супернатант представляет собой вторую вводимую жидкость, где второе центрифугирование имеет отсекаемый размер от 1,5 микрон до 2,5 микрон, и где вторые выводимые твердые вещества представляют собой повторно используемые дрожжи.

Если дрожжи являются хлопьевидными, в некоторых вариантах осуществления используют обработку с высоким усилием сдвига для дефлокулирования дрожжей, а затем используют дифференциальное центрифугирование для отделения побочных продуктов при первом центрифугировании и для отделения дрожжей при втором центрифугировании.

ПРИМЕР

Следующий пример демонстрирует принципы описанного изобретения. Как описано выше, было показано экспериментальное обоснование пользы данного изобретения для контроля заражения при выращивании дрожжей.

В данном примере два отдельных стеклянных сосуда с 400 мл определенной среды одновременно инокулировали одинаковым количеством Candida utilis Y-264 и Lactobacillus fermentum В-8183. Нержавеющая сталь не контактировала ни с одним из ферментационных бульонов, и керамический барботер использовали для насыщения кислородом ферментационного бульона в течение 24 часов, при этом сосуды выдерживали на водяной бане при 34°С. Источником углерода в каждом сосуде были 2,8 г глюкозы, причем в каждый сосуд добавляли 0,05, 0,05 и 0,10 г мочевины в начале ферментации, через 4 часа и через 8 часов, соответственно. Определенная среда в обоих сосудах содержала дистиллированную воду с 200 мг/л KH₂PO₄, 7 мг/л ZnSO₄, 4 мг/л CuSO₄, 20 мг/л FeSO₄, 5 мг/л MnSO₄ и 100 мг/л MgSO₄. Между первым и вторым сосудом было только одно различие: во второй сосуд было добавлено 10 мг/л NiCl₂.

Через 24 часа аэробной ферментации оптическая плотность первого сосуда увеличилась с 0,132 до 2,025, а оптическая плотность второго сосуда увеличилась с 0,084 до 1,96. Предыдущие опыты показали, что данная ферментация переходила в стационарное состояние (вся глюкоза израсходована) через 15 часов. Исследование под микроскопом показало, что первый сосуд (без добавления NiCl₂) содержал преимущественно Candida utilis, а второй сосуд (с добавлением NiCl₂) содержал преимущественно Lactobacillus fermentum.

Другие опыты показали, что добавление всей мочевины в момент времени 0 вызывало рост рН раствора от приблизительно 6 до приблизительно 7, при этом добавление мочевины через некоторое время вызывало падение рН от приблизительно 5 до 4. Это демонстрирует, что мочевину предпочтительно добавлять со скоростью, которая не вызывает повышение рН, поскольку это указывает на выделение аммиака дрожжами (и бактерии могут расти на аммиаке).

Данный пример явно демонстрирует, что когда мочевина является источником азота и когда во время ферментации отсутствуют источники никеля, Candida utilis (дрожжи) растут быстрее, чем Lactobacillus fermentum (бактерии), тем самым препятствуя бактериальному заражению.

В данном подробном описании была сделана ссылка на многочисленные варианты осуществления и на прилагаемые графические материалы, на которых в качестве иллюстрации показаны конкретные варианты осуществления изобретения. Данные варианты осуществления описаны с целью обеспечения практического использования изобретения специалистами в данной области техники, также следует понимать, что специалистами в данной области техники могут быть выполнены модификации к различным описанным вариантам осуществления.

Когда вышеописанные способы и стадии указывают на определенный порядок, которому следуют определенные события, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что порядок некоторых стадий может быть модифицирован и что такие модификации соответствуют видоизменениям данного изобретения. Кроме того, где определенные стадии можно выполнять одновременно в параллельном процессе, а также выполнять последовательно.

Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в данном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте, как если бы каждая публикация, патент или заявка на патент были определенно и каждый в отдельности изложены в настоящем документе.

Варианты осуществления, видоизменения и фигуры, описанные выше, должны содержать указание на полезность и универсальность настоящего изобретения. Другие варианты осуществления, которые не обеспечивают всех этих признаков и преимуществ, изложенных в настоящем документе, также могут использоваться без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Такие модификации и видоизменения считаются находящимися в пределах объема изобретения, определенного формулой изобретения. В случае конфликта в определениях между настоящим описанием и словарем или другой ссылкой, настоящее описание будет иметь преимущественную силу.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ контроля заражения при выращивании дрожжей. Дрожжи класса Saccharomycetes выращивают в течение периода ферментации при начальном рН в ферментационном бульоне, содержащем источник углерода, источник азота, содержащий мочевину, и источник минералов, где содержание никеля в ферментационном бульоне составляет менее 1 мг/кг. Ферментационный бульон находится в функциональной связи с теплообменником. Мочевину вводят в ферментационный бульон таким образом, что рН указанного ферментационного бульона в течение периода ферментации не превышает начального рН более чем на 2,0. Изобретение обеспечивает контроль бактериального заражения без применения сульфитов, антибиотиков, кислотных промывок или пероксидов при производстве топливного этанола и при выращивании дрожжей для SCP. 5 з.п. ф-лы, 1 пр.

1. Способ контроля заражения при выращивании дрожжей, причем способ предусматривает выращивание дрожжей в течение периода ферментации при начальном рН в ферментационном бульоне, содержащем источник углерода, источник азота и источник минералов, где указанный ферментационный бульон находится в функциональной связи с теплообменником, где указанные дрожжи принадлежат к классу Saccharomycetes, где указанный источник азота в указанном ферментационном бульоне содержит мочевину, где содержание никеля в указанном ферментационном бульоне составляет менее 1 мг/кг, и где указанную мочевину вводят в указанный ферментационный бульон таким образом, что рН указанного ферментационного бульона в течение указанного периода ферментации не превышает указанного начального рН более чем на 2,0.

2. Способ по п. 1, где указанный теплообменник представляет собой пластинчатый теплообменник, содержащий титановые теплообменные пластины, где содержание никеля в указанных титановых теплообменных пластинах составляет менее 1 г/кг.

3. Способ по п. 1, где указанный теплообменник представляет собой теплообменник со спиральными пластинами, содержащий титановые теплообменные пластины, где содержание никеля в указанных титановых теплообменных пластинах составляет менее 1 г/кг.

4. Способ по п. 1, где указанный способ применяют для производства этанола в указанном ферментационном бульоне.

5. Способ по п. 4, где отношение содержания указанного источника углерода к содержанию указанной мочевины является таким, что в указанном ферментационном бульоне по существу не остается мочевины перед отделением указанного этанола от указанного ферментационного бульона путем дистилляции.

6. Способ по п. 1, где в указанном способе используют отделение указанных дрожжей от указанного ферментационного бульона для получения повторно используемых дрожжей, и причем указанные повторно используемые дрожжи не промывают кислотой после указанного отделения.