СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАФИЛОКОККОВОЙ АЛЛЕРГИИ ПРИ АЛЛЕРГИЧЕСКОМ РИНИТЕ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии, иммунологии, оториноларингологии, и может быть использовано для диагностики аллергии на золотистый стафилококк (S. aureus) у больных аллергическим ринитом.

Из литературных источников известно, что среди пациентов с круглогодичным аллергическим ринитом довольно часто отмечается носительство Staphylococcus aureus [1].

Инфекционно-аллергические процессы составляют основу патогенеза ряда заболеваний, в том числе и аллергического ринита. Изучение этиологии и патогенеза инфекционно-аллергического ринита связано с решением целого ряда проблем, в том числе касающихся качественного состава микрофлоры верхнего отдела дыхательного тракта, выявления микробов, ответственных за сенсибилизацию организма, выяснения природы их аллергенов. Исследованиями многочисленных авторов, в частности сотрудниками ГНЦ-Института иммунологии ФМБА А.Д. Адо, В.Н. Федосеевой и соавт. 1997-2003 гг., было показано, что стафилококки играют важную роль в патогенезе инфекционнозависимых форм аллергии. Была доказана возможность формирования гиперчувствительности немедленного типа на аллергены стафилококка у больных респираторно-аллергическими заболеваниями и атопическими дерматитами. Последнее является важным критерием назначения больным аллергенспецифической иммунотерапии аллерговакцинами из стафилококка и последующей тактики ведения больных с немедленным типом аллергии к стафилококку.

Выявление этиологического фактора аллергии до настоящего времени базируется главным образом на результатах кожных проб [2]. Постановка кожных проб является диагностическим методом выявления специфической сенсибилизации организма путем введения под кожу аллергена и оценки величины и характера развившегося при этом отека или воспалительной реакции. Существуют разные методы кожного тестирования с использованием аллергенов: прик-тесты, скарификационные, аппликационные и внутрикожные пробы. Для выявления сенсибилизации к аллергенам бактериального происхождения широко используются скарификационные аллерготесты. Однако при их постановке часто возникают ложноположительные результаты [3]. В настоящее время эксперты Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии не рекомендуют использовать скарификационные кожные тесты для диагностики аллергии ввиду их низкой информативности [4].

Общим недостатком кожного тестирования как способа аллергодиагностики является определенная опасность для здоровья обследуемого, так как не исключается возможность провоцирования аллергических реакций и дополнительной сенсибилизации организма.

За прототип принят способ диагностики стафилококковой аллергии, включающий определение специфических IgE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного с использованием активной аллергенной субстанции (ААС), выделенной из стафилококка и состоящей из трех активных фракций с молекулярными массами 50, 130 и 170 кДа, при этом позитивная реакция оценивается 2-4 классом [5]. Известный способ позволяет выявить стафилококковую аллергию у больных аллергическими заболеваниями с помощью авторской тест-системы, однако является трудоемким, сложным и не нашел широкого применения в клинической практике.

Задачей изобретения является создание информативного способа диагностики стафилококковой аллергии у больных аллергическим ринитом.

Задача достигается тем, что с помощью хемилюминесцентного анализа исследуют функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови больных аллергическим ринитом и рассчитывают индекс образования активных форм кислорода (ИО_АФК) по формуле

ИО_АФК=S_{индуцированная}/T_max

где

S_{индуцированная} - величина площади под кривой люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной живой суспензией S. aureus, относительные единицы (о.е.);

T_max - время выхода на максимум люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной живой бактериальной суспензией S. aureus, секунды (с).

При значении ИО_АФК более 100 о.е./с диагностируют сенсибилизацию к S. aureus у больных аллергическим ринитом.

Пороговое значение 100 о.е./с получено опытным путем на основании сопоставления данных по ИО_АФК, полученных хемилюминесцентным методом при исследовании функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови больных аллергическим ринитом, с результатами кожного тестирования этих больных на наличие или отсутствие сенсибилизации к S. aureus.

Активированные нейтрофильные гранулоциты являются мощными эффекторами и запускают механизмы каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления. Противоинфекционное действие нейтрофильных гранулоцитов связано, главным образом, с генерацией активных форм кислорода, а одним из методов, позволяющих оценить кислородзависимую биоцидность нейтрофильных гранулоцитов, является хемилюминесцентный анализ.

Нейтрофильные гранулоциты способны осуществлять киллинг микроорганизмов с помощью кислородозависимого механизма, к которому относят «респираторный взрыв», развивающийся при взаимодействии нейтрофилов с объектами фагоцитоза. «Респираторный взрыв» относится к серии метаболических процессов, имеющих место при стимуляции нейтрофилов: увеличение потребления кислорода и усиление окисления глюкозы в пентозофосфатном цикле (ПФП), и как результат этого - продукция активных форм кислорода, обладающих бактерицидным действием. Функциональное состояние фагоцитирующих клеток можно охарактеризовать через уровень «респираторного взрыва», при котором наблюдается резкое увеличение потребления кислорода за счет преобразования его в активные формы. Способность нейтрофильных гранулоцитов образовывать нужное количество АФК может служить прогностическим признаком для оценки дальнейшего хода воспалительного процесса, а уровень ответа на индуктор «респираторного взрыва» может характеризовать активность защитных сил организма. Именно на регистрации интенсивности «респираторного взрыва» основаны многие клинико-диагностические методы оценки состояния организма, в частности и хемилюминесцентный анализ (ХЛ). Скорость образования АФК не зависит от чувствительности хемилюминесцентного анализатора, на котором проводится исследование.

Способ осуществляется следующим образом.

Из венозной крови больного аллергическим ринитом с подозрением на бактериальную аллергию (при длительной неэффективной противоаллергической терапии, при круглогодичном аллергическом рините) выделяют нейтрофильные гранулоциты. Для этого к 5 мл крови с гепарином добавляют 1 мл полиглюкина и инкубируют в течение 30 мин при 37°C для ускорения осаждения эритроцитов. Надосадочную жидкость наслаивают на двойной градиент плотности фиколл-верографин (ρ=1,077 для выделения популяции лимфоцитов; ρ=1,199 для выделения популяции нейтрофильных гранулоцитов) и центрифугируют при 400 g в течение 45 минут. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода нейтрофильных гранулоцитов, которая составляет не менее 97%. Полученную суспензию нейтрофильных гранулоцитов дважды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 400 g. Супернатант сливают, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводят в 1 мл раствора Хенкса и получают взвесь. Подсчитывают количество нейтрофильных гранулоцитов в камере Горяева. Для проведения хемилюминесцентного анализа используют следующие реактивы: донорскую сыворотку (группа крови АВ, резус-фактор отрицательный), раствор Хенкса (без фенолового красного), люминол в концентрации 100 мкг/мл. Готовят пробу: 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 240 мкл раствора Хенкса, 50 мкл люминола и 40 мкл живой суспензии Staphylococcus aureus в концентрации 10⁶ КОЕ/мл. Измерение хемилюминесцентного ответа осуществляют при помощи хемилюминесцентного анализатора, например «CL3604», в течение 90 мин (5400 с). Регистрацию результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляют через компьютер. Получают кривую люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной живой суспензией S. aureus. Вычисляют по формуле индекс образования АФК. В зависимости от значения рассчитанного индекса определяют наличие или отсутствие у больных аллергическим ринитом сенсибилизации к золотистому стафилококку. Значение ИО_АФК более 100 о.е./с свидетельствует о сенсибилизации организма больного к S. aureus, и больному рекомендуют проведение посева микрофлоры и антибиотикограммы. ИО_АФК равное или менее 100 о.е./с свидетельствует об отсутствии сенсибилизации к S. aureus.

Заявленный способ апробирован на 45 больных аллергическим ринитом, поступивших на лечение в ЛОР-отделение НУЗ ″Дорожная клиническая больница″ на ст. Красноярск ОАО РЖД. Результаты обследования представлены в таблице 1. У 15 больных аллергическим риносинуситом был определен ИО_АФК выше 100. Кожные аллергологические пробы показали наличие у них бактериальной аллергии. У 3 больных аллергически ринитом ИО_АФК был ниже 100, но кожные аллергологические пробы показали наличие бактериальной аллергии. У 21 больного аллергическим ринитом был отмечен ИО_АФК ниже 100, и кожные аллергологические пробы показали наличие аллергии на шерсть животных. У 6 больных отмечен ИО_АФК ниже 100, и при этом кожные аллергопробы и ИФА на специфический IgE выявили наличие сезонной аллергии на пыльцу. Таким образом, совпадение результатов аллергодиагностики на стафилококк при аллергическом рините заявленным способом составляет 94%.

Таблица 1. Результаты исследования сенсибилизация к S. aureus у больных аллергическим ринитом по заявленному способу и по результатам кожных проб № п/п ИО_АФК Сенсибилизация к S. aureus пo заявленному способу Сенсибилизация к S. aureus по результатам кожных проб Совпадение прогноза 1 162,2 Должна быть Есть + 2 188,8 Должна быть Есть + 3 220,3 Должна быть Есть - 4 290,7 Должна быть Есть + 5 335,2 Должна быть Есть + 6 144,4 Должна быть Есть + 7 985,2 Должна быть Есть + 8 157,4 Должна быть Есть + 9 136,1 Должна быть Есть + 10 461,1 Должна быть Есть + 11 718,5 Должна быть Есть + 12 128,3 Должна быть Есть + 13 277,9 Должна быть Есть + 14 244,7 Должна быть Есть + 15 138,9 Должна быть Есть + 16 63,7 нет Есть - 17 68,3 нет Есть - 18 71,1 нет Есть - 19 11,6 Не будет Нет - 20 32,0 Не будет Нет - 21 32,0 Не будет Нет - 22 51,3 Не будет Нет - 23 53,4 Не будет Нет - 24 50,8 Не будет Нет - 25 61,8 Не будет Нет - 26 73,1 Не будет Нет - 27 16,8 Не будет Нет - 28 27,7 Не будет Нет - 29 48,3 Не будет Нет - 30 39,0 Не будет Нет - 31 22,5 Не будет Нет - 32 45,3 Не будет Нет - 33 30,5 Не будет Нет - 34 31,1 Не будет Нет - 35 31,8 Не будет Нет - 36 34,4 Не будет Нет - 37 36,1 Не будет Нет - 38 42,0 Не будет Нет - 39 43,1 Не будет Нет - 40 43,3 Не будет Нет - 41 44,0 Не будет Нет - 42 49,2 Не будет Нет - 43 53,5 Не будет Нет - 44 54,4 Не будет Нет - 45 61,1 Не будет Нет -

Клинический пример 1. Больная Г., 42 года. В 2008 году поставлен диагноз: аллергический ринит. Принимает противоаллергическую терапию без эффекта. Обострение аллергического ринита наблюдается в осенне-зимний период. В анамнезе отмечаются частые респираторные инфекции, которые предшествовали или сопутствовали аллергии. Общий IgE в сыворотке крови равен 170 МЕ/мл. Специфические IgE на пыльцу растений, шерсть животных и продукты питания показали отрицательные значения. Проведена аллергодиагностика к золотистому стафилококку заявленным способом. ИО_АФК составил 125 о.е./с (более 100 о.е./с). У больной диагностирована сенсибилизация к S. aureus. Рекомендовано назначение специфической иммунотерапии (СИТ) золотистым стафилококком.

Клинический пример 2. Пациент А., 50 лет. В 1970 году поставлен диагноз: аллергический ринит. Принимает противоаллергическую терапию без эффекта. Обострение аллергического ринита наблюдается после ОРЗ. Общий IgE в сыворотке крови равен 220 МЕ/мл. Специфические IgE на пыльцу растений, шерсть животных и продукты питания показали отрицательные значения. Проведена аллергодиагностика к золотистому стафилококку заявленным способом. ИО_АФК составил 512 о.е./с (более 100 о.е./с). У больного диагностирована сенсибилизация к S. aureus. Рекомендовано назначение СИТ золотистым стафилококком.

Технический результат от реализации предлагаемого способа:

- возможность диагностики сенсибилизации к S. aureus;

- отсутствие субъективных факторов при оценке результатов диагностики стафилококковой сенсибилизации;

- расширение арсенала способов диагностики стафилококковой аллергии при аллергическом рините.

Таким образом, способ информативен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет выявить стафилококковую сенсибилизацию до начала терапии и способствует оптимальному лечению больных аллергическим ринитом.

Источники информации

1. Федосеева В.Н., Молотилов Б.А., Ларина О.Н., Федоскова Т.Г. Бактериальная аллергия. Пенза, частная типография Тугущева, 2004.

2. Пыцкий В.И., Адрианова Н.В., Артомасова А.В. Аллергические заболевания. М.: Триада-Х, 1999. С.102-112.

3. Гущин И.С. Аллергическое воспаление и его фармакологическое действие. М.: Фармакус Приит, 1998.

4. Федоскова Т.Г. и др. Принципы диагностики аллергических заболеваний. // Consilium medicum. - 2002. - №4. - С.13-19.

5. Пат. 2436100 РФ. Способ определения специфических IGE-антител к стафилококку в сыворотке крови больного аллергическими заболеваниями, имеющего гиперчувствительность к аллергенам стафилококка, с применением тест-системы для определения специфических IGE-антител к стафилококку, выделенная из стафилококка активная аллергенная субстанция (ААС) и способ диагностики стафилококковой аллергии / Федосеева В.Н., Камышева В.А. и др.; заявитель и патентообладатель: ФГБУ ″Институт иммунологии″ ФМБА России (РФ). - №2010111254/15; заявл. 25.03.2010; опубл. 20.09.2010.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики стафилококковой аллергии при аллергическом рините. Сущность способа состоит в том, что с помощью хемилюминесцентного анализа исследуют функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, рассчитывают индекс образования активных форм кислорода (ИО_АФК), представляющий собой отношение площади под кривой люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной живой бактериальной суспензией золотистого стафилококка, ко времени выхода на максимум люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной живой бактериальной суспензией золотистого стафилококка. При значении ИО_АФК более 100 о.е./с диагностируют сенсибилизацию к золотистому стафилококку у больных аллергическим ринитом. Использование заявленного способа позволяет диагностировать стафилококковую аллергию при аллергическом рините до начала терапии и способствует оптимальному выбору лечения больных. 1 табл., 2 пр.

Способ диагностики стафилококковой аллергии при аллергическом рините, включающий исследование крови, отличающийся тем, что с помощью хемилюминесцентного анализа исследуют функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови больных и рассчитывают индекс образования активных форм кислорода (ИО_АФК) по формуле
ИО_АФК=S_{индуцированная}/T_max
где
S_{индуцированная} - величина площади под кривой люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной живой суспензией золотистого стафилококка (S. aureus), относительные единицы (о.е.);
T_max - время выхода на максимум люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной живой бактериальной суспензией S. aureus, секунды (с),
и при значении ИО_АФК более 100 о.е./с диагностируют сенсибилизацию к S. aureus у больных аллергическим ринитом.