СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К АЛЛЕРГЕНАМ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/532 G01N33/577 A61K39/35 

Изобретение относится к медицине, а именно аллергологии, и может быть использовано при выявлении сенсибилизации к аллергенам (гиперчувствительности) у взрослых и детей.

В аллергологии для выявления гиперчувствительности к пищевым аллергенам используют различные серологические тесты, из которых наиболее доступным, простым и экономичным является иммунофлуоресцентный анализ.

Известен способ диагностики пищевой аллергии к молоку, куриному мясу, цельному куриному яйцу, желтку яйца и белку яйца в непрямом методе флуоресцирующих антител (Способ диагностики пищевой аллергии. Патент на изобретение 2140085, зарегистрирован в Госреестре изобретений 20 октября 1999 г. ).

Недостатки способа:
1. Заявленный набор аллергенов обеспечивает диагностику аллергии лишь к ограниченному количеству пищевых аллергенов.

2. Неудовлетворительная специфичность непрямого метода флуоресцирующих антител (нМФА) вследствие использования поликлональных флуоресцирующих иммуноглобулинов против иммуноглобулинов Е человека.

Изобретение направлено на решение задач: выявление сенсибилизации у людей к широкому спектру аллергенов (пищевые, бытовые, эпидермальные, пыльцевые), повышение специфичности нМФА.

Указанные задачи достигаются за счет использования нМФА, который отличается тем, что применяют диагностикумы - формалинизированные танизированные эритроциты барана, сенсибилизированные очищенными белками пищевых (гречневая крупа, говядина, свинина, курица, хек, мандарин), бытовых (библиотечная пыль, домашняя пыль, клещ домашней пыли), эпидермальных (перо подушки, шерсть кошки, шерсть собак, шерсть овцы, перхоть лошади), пыльцевых (пыльца сорных трав, тимофеевка, лебеда, полынь, подсолнечник береза, ольха) аллергенов, а флуоресцирующие анти-IgE антитела получают путем конъюгации моноклональных антител (МКА) к иммуноглобулинам Е человека с красителем - изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ).

Приготовление флуоресцирующих aнти-IgE антител осуществляют по следующей методике: в МКА к иммуноглобулинам Е человека с концентрацией белка 10 мг/мл добавляют раствор ФИТЦ. Для этого навеску ФИТЦ, взятую из расчета 1,5 мг на 100 мг белка, растворяют в 0,15 мл карбонатно-бикарбонатного буферного раствора, рН 9,0, и добавляют по каплям в раствор МКА. Конъюгацию проводят при непрерывном перемешивании в течение 18 часов при 2-8^oС. По истечении времени конъюгации меченые МКА освобождают от непрореагировавшего красителя методом гель-фильтрации на сефадексе Г-50. В полученных флуоресцирующих aнти-IgE антителах определяют молярное соотношение ФИТЦ/белок, количество белка, красящий титр и рабочее разведение, оценивают специфичность в нМФА.

При постановке нМФА с сывороткой крови больного аллергией на диагностикуме образуется комплекс (аллерген + специфический IgE сыворотки человека + флуоресцирующее анти-IgE антитело), который выявляют при исследовании в люминесцентном микроскопе в виде флуоресцирующего ободка у эритроцита. При флуоресценции ободка эритроцита интенсивностью от 1+ до 4+ выявляют уровень сенсибилизации к данному аллергену.

Способ осуществляется следующим образом. На мазки из аллергенов (8 аллергенов на одном предметном стекле) наносят по 5 мкл исследуемой сыворотки в цельном разведении. Стекла с мазками помещают во влажную камеру и выдерживают 20 мин при температуре 37^oС. По истечении сроков инкубации предметные стекла с мазками достают и промывают в 0,9%-ном растворе хлорида натрия с добавлением 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,4 (промывающий раствор), дважды по 7 мин, затем высушивают. На все мазки наносят флуоресцирующие анти-IgE антитела, взятые в рабочем разведении, в объеме 5 мкл.

Рабочее разведение флуоресцирующих анти-IgE антител представляет собой сконцентрированный в 2 раза красящий титр, т.е. их максимальное разведение, обеспечивающее специфическую флуоресценцию, не ниже чем на 3+, комплекса: диагностикум + сыворотка человека, содержащая IgE к данному диагностикуму. Например, красящий титр (максимальное разведение) флуоресцирующих анти-IgЕ антител - 1:8, тогда рабочее разведение препарата составит 1:4. Рабочее разведение определяется производителем и всегда указывается на этикетке ампулы.

Предметное стекло с мазками вновь помещают во влажную камеру и инкубируют в течение 20 мин при температуре 37^oС. Затем предметные стекла с мазками вновь дважды промывают по 7 мин промывающим раствором. Стекла с мазками высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионным объективом люминесцентного микроскопа.

При наличии в сыворотке аллергенспецифических IgE иммуноглобулинов к соответствующим аллергенам наблюдают специфическую флуоресценцию ободка у эритроцитов.

Оценку интенсивности флуоресценции ободка эритроцитов и оценку степени сенсибилизации людей к аллергену проводят по четырехкрестовой шкале:
4+ - изумрудная, зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита (очень высокая степень сенсибилизации);
3+ - яркая зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита (высокая степень сенсибилизации);
2+ - зеленого цвета флуоресценция ободка вокруг эритроцита (средняя степень сенсибилизации);
1+ - слабая, едва заметная флуоресценция ободка вокруг эритроцита (низкая степень сенсибилизации);
- отсутствие флуоресценции, (отсутствие сенсибилизации).

Постановка реакции должна сопровождаться следующими контролями:
1. Заведомо положительный контроль: диагностикум + стандартная сыворотка к данному аллергену + флуоресцирующие анти-IgE антитела. Наличие 4+ - 3+ флуоресценции.

2. Заведомо отрицательный контроль: диагностикум + исследуемая сыворотка + флуоресцирующие анти-IgE антитела. Отсутствие флуоресценции.

3. Контроль конъюгата: диагностикум + флуоресцирующие анти-IgE антитела. Отсутствие флуоресценции.

Продолжительность реакции 1 час 30 мин. Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Больная Г., 24.12.90 года рождения. В период обращения жалоб не предъявляет.

Из анамнеза: зуд кожи, гиперемия, расчесы в подколенных ямках, локтевых сгибах после употребления цитрусовых, куриного яйца, морской рыбы. Отмечает многократное чихание с водянистым отделяемым из носа, зуд глаз, слезотечение, бронхоспазмы после контакта с кошкой.

Осмотр: состояние удовлетворительное. Зев спокойный, лимфоузлы не увеличены. Дыхание везикулярное, хрипов нет.

Обследование.

1. Спирография: умеренная обструкция на уровне крупных бронхов. Время выдоха (ВВ) нормальное. Проба с бронходилятатором (БД) положительная.

2. Индекс местной эозинофилии (ИМЭ) 10,4.

3 Скарификационные кожные пробы (СКП): тест с контрольной жидкостью (ТКЖ) отриц. , гистамин 3+, цельное куриное яйцо (ЦКЯ) 3+, желток куриного яйца (ЖКЯ) 3+, белок куриного яйца (БКЯ) 1+, треска 3+, шерсть кошки (ШК) 3+.

4. Общий IgE 340 ME/мл.

5. Специфический IgE: треска 3+, ЦКЯ 3+, мясо куриное (МК) 2+.

6. нМФА: ШК 3+, ЦКЯ 3+, ЖКЯ 3+, БКЯ 2+, хек 3+.

Диагноз: пищевая, эпидермальная сенсибилизация.

Бронхиальная астма атопическая, интермиттирующая, ремиссия.

Аллергический ринит, интермиттирующий, ремиссия.

Аллергический конъюнктивит, интермиттирующий, ремиссия.

Атонический дерматит, ограниченный, ремиссия.

Пример 2.

Больной Б. 3.11.87 года рождения. Жалобы на чихание, зуд носа, глаз, затрудненное дыхание после посещения цирка, зоопарка, контакта с кошкой. В период осмотра состояние удовлетворительное. Зев спокойный, лимфоузлы не увеличены. Дыхание жесткое, хрипов нет. Тоны соr ясные, ритмичные. Живот мягкий, безболезненный.

Обследование.

1. Спирография: на фоне умеренного снижения ФЖЕЛ умеренная генерализованная обструкция. ВВ увеличено. Проба с БД положительная.

2. ИМЭ 4,3.

3. Общий IgE 285 ME/ мл.

4. Специфический IgE: библиотечная пыль (БП) 2+, ШК 1+.

5. СКП: ТКЖ отриц, гистамин 2+, домашняя пыль (ДП) 2+, БП 2+, ШК 2+, перхоть лошади 2+.

6. Внутрикожные пробы (В/к пробы): ТКЖ отриц., гистамин 3+, клещ домашней пыли (КДП) 2+, перо подушки (ПП) 2+, ШК 2+, ДП 2+, БП 2+.

7. нМФА: ШК 2+, ДП 2+, КДП 2+.

Диагноз: бытовая, эпидермальная сенсибилизация.

Бронхиальная астма атопическая, субремиссия.

Аллергический ринит, интермиттирующий, ремиссия.

Аллергический конъюнктивит, интермиттирующий, ремиссия.

Пример 3.

Больной П. 25.04.96 года рождения. Жалобы на приступы затрудненного дыхания, заложенность носа в утреннее время.

Из анамнеза стало известно, что в весенне-летнее время двукратно имел место бронхообструктивный синдром.

Осмотр. Состояние удовлетворительное. По внутренним органам без отклонений.

Обследование.

1. ИМЭ (обострение) 20,6.

2. Общий IgE 640 ME/мл (обострение).

4. Специфический IgE: пшеничная мука (ПМ) 3+, гречневая крупа (ГК) 4+, пыльца деревьев (ПД )2+, ШК -0.

5. СКП: ТКЖ отриц., гистамин 3+, перхоть лошади 1+, ПД 4+.

5. нМФА. ШК-0, ПД 3+, ПМ 4+, ГК 4+.

Диагноз: пищевая, пыльцевая сенсибилизация.

Бронхиальная астма атопическая, ремиссия.

Аллергический ринит, персистирующий, субремиссия.

Пример 4.

Больная П. 17.10.95 года рождения. В момент обращения жалоб не предъявляет.

Из анамнеза известно, что после употребления коровьего молока, цитрусовых, куриного яйца, рыбы имеют место кожные высыпания в локтевых сгибах и подколенных ямках, сопровождающиеся сильным зудом. В весенний период (май) отмечаются зуд глаз, носа, чихание, бронхообструкция. Аналогичные симптомы появляются после посещения цирка.

При осмотре. Состояние удовлетворительное. Кожные покровы сухие, легкая пигментация кожи век. Дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны соr ясные, ритмичные.

Обследование.

1. СКП: ТКЖ отриц., гистамин 3+, мандарин 1+, коровье молоко (КМ) 1+, МК 1+, мясо говядины (МГ)1+, ЖКЯ 1+, БКЯ 1+, рыба (хек) 1+, овсяница 1+, полынь 1+, лещина 1+.

2. Общий IgE 956 ME/мл.

3. нМФА: KM 1+, ЦКЯ 1+, ЖКЯ 1+, БКЯ 1+, МГ 1+, МК 1+, хек 1+, мандарин 1+.

Диагноз: пищевая, пыльцевая сенсибилизация.

Бронхиальная астма атопическая, интермиттирующая, ремиссия.

Аллергический ринит, интермиттирующий, ремиссия.

Аллергический конъюнктивит, интермиттирующий, ремиссия.

Атопический дерматит, ограниченный, ремиссия.

Пример 5.

Больной О. 01.06.89 года рождения. Обратился с жалобами на кожные высыпания, заложенность носа, чихание.

Осмотр. Состояние удовлетворительное. Зев спокойный. Лимфоузлы не увеличены. На коже по всему телу сыпь. Носовое дыхание затруднено. В легких дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны cor ясные, ритмичные. Живот мягкий, безболезненный.

Обследование.

1. ИМЭ 32,2 (ИМЭ в ремиссии 5,5.

2. Общий IgE 1075 МЕ/мл.

3. В/кожные пробы: ТКЖ -, гистамин 3+, КДП 2+, ШК 1+, ПП 2+, ДП 2+, БП 2+.

4. нМФА: ШК 3+, ДП 2+, ПД 1+, КПД 2+, БП 2+, ПП 3+.

Диагноз: бытовая, эпидермальная сенсибилизация.

Аллергический ринит, интермиттирующий, обострение. Строфулюс, обострение.

Пример 6.

Больной П., 30.08.98 года рождения. В момент обращения жалоб не предъявляет.

Из анамнеза известно, что весной появляются зуд глаз и носа, слезотечение, чихание многократное с обильным водянистым отделяемым.

При осмотре. Состояние удовлетворительное. Зев спокойный. Лимфоузлы не увеличены. Дыхание везикулярное, хрипов нет. Тоны соr ясные, ритмичные. Живот мягкий, безболезненный.

Обследование.

1. ИМЭ 5,37.

2. СКП: ТКЖ-, гистамин 3+, ДК 0, береза 0, клещевина 0, овсянница 0.

3. Общий IgE 975 МЕ/мл.

4. нМФА: ШК 0, ДП 0, ГК 0, KM 0, ПД 0, ЦКЯ 0, ЖЯ 0, БЯ 0.

Диагноз: острая респираторная инфекция. Реакция на аллергены отсутствует.

Положительный эффект: способ позволяет выявлять сенсибилизацию к широкому спектру аллергенов: бытовых, эпидермальных, пыльцевых, а также к расширенному спектру пищевых аллергенов, позволяет повысить специфичность реакции за счет использования флуоресцирующих моноклональных антител против IgE человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к аллергологии, и может быть использовано при выявлении сенсибилизации к аллергенам у взрослых и детей. Сущностью способа является проведение непрямого метода флуоресцирующих антител с использованием диагностикумов, содержащих очищенные белки пищевых, бытовых, пыльцевых, эпидермалъных аллергенов, и меченых анти-IgE антител, в качестве которых используют моноклоналъные антитела к IgE человека, меченные красителем - изотиоцианатом флуоресцеина. Полученный комплекс исследуют в люминесцентном микроскопе и при наличии у эритроцитов специфического флуоресцирующего ободка выявляют сенсибилизацию к соответствующему аллергену. Техническим результатом является выявление сенсибилизации к широкому спектру аллергенов и повышение специфичности реакции.

Способ выявления сенсибилизации к аллергенам непрямым методом флуоресцирующих антител в сыворотке крови с использованием диагностикумов, содержащих формалинизированные и танизированные эритроциты барана, сенсибилизированные пищевыми белковыми аллергенами, и меченных анти-IgE антител, отличающийся тем, что для исследования используют цельную сыворотку в объеме 5 мкл, используемые диагностикумы сенсибилизированы очищенными белками пищевых, бытовых, пыльцевых, эпидермальных аллергенов, а ФИТЦ-меченые анти-IgE антитела представляют собой моноклональные антитела к IgE человека, взятые в объеме 5 мкл.