Способ оценки патогенной микробиоты ЖКТ сельскохозяйственных животных, включая такие виды, как Clostridium perfringens, C. difficile, C. ramosum, C. septicum Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, ветеринарии, в частности к способу диагностики патогенной микробиоты ЖКТ сельскохозяйственных животных, включая такие виды микроорганизмов, как Clostridium perfringens, C. difficile, C. ramosum, C. septicum. Диагностика осуществляется с использованием молекулярно-биологического подхода высокопроизводительного секвенирования на основании выделения бактериальной ДНК из ЖКТ сельскохозяйственных животных. Способ позволяет полностью оценить профиль патогенных клостридий в ЖКТ.

Известен способ патолого-анатомической диагностики анаэробной энтеротоксемии поросят, вызванной Clostridium perfringens тип С [RU 2131703, A61B 10/00]. Способ заключается в том, что после тщательного вскрытия и исследования первых трупов новорожденных поросят при обнаружении характерных патолого-анатомических изменений, развивающихся при данном заболевании, диагностируют энтеротоксемию поросят, вызванную Clostridium perfringens тип С. Изобретение относится к способам патолого-анатомической диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных и может быть использовано при вскрытии трупов в ветеринарной медицине.

Недостатками данного способа является его узкая специфичность.

Известен способ диагностики токсигенных штаммов Clostridium difficile [RU 2548719, G01N 33/569, G01N 33/50]. Изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способу диагностики токсигенных штаммов Clostridium difficile. Использование заявленного способа позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью, простотой и доступностью диагностировать токсигенные штаммы Clostridium difficile.

Недостатками данного способа является его узкая специфичность.

Известен способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile [RU 2612789, C12Q 1/68, C12N 15/11, C12M 1/00]. Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ детектирования и характеризации токсиногенного штамма Clostridium difficile в пробе.

Недостатками данного способа является его узкая специфичность.

Известен способ диагностики инфекционно-воспалительных урогенитальных заболеваний у женщин [RU 2008118641, G01N 33/48, C12Q 1/68]. Способ диагностики инфекционно-воспалительных урогенитальных заболеваний у женщин, по которому осуществляют количественную оценку состава микробиоты для определения этиологической природы заболевания, отличающийся тем, что для количественной оценки состава микробиоты осуществляют постановку реакции ПЦР в режиме «реального времени и определяют следующие показатели: общая бакмасса, Lactobacillus spp и представителей условно-патогенной флоры урогенитальной области - Enterobacterium spp, Streptococcus spp, Mobiluncus spp/Corynebacterium spp, Lachnobacterium/ Clostridium, Peptostococcus spp, Eubacterium spp, Prevotella bivia/ Porphyromonas spp, Megasphera spp/Veilonella spp /Dialister spp, Sneathia spp/Leptotrihia spp/Fusobacterium spp, Atopobium, vadinae, Gardnerella vaginalis, Candida albicans.

Недостатками данного способа является невозможность определения патогенных видов клостридий.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является способ идентификации патогенных бактерий в пищевых субстратах с использованием высокопроизводительного секвенирования [RU 2018127490, C12Q 1/68], включающий отбор биологического материала и выделение ДНК с проведением мультиплексной ПЦР, отличающийся тем, что для амплификации в одной реакции одновременно используются 34 праймера: прямые SEQ ID NO 1-17 и обратные SEQ ID NO 18-34, все амплифицированные последовательности подвергаются высокопроизводительному секвенированию, проводится сравнение секвенированных нуклеотидных последовательностей с последовательностями бактерий Bacillus cereus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Clostridium tyrobutyricum, Cronobacter sakazii, Escherichia coli (EHEC), Escherichia coli (STEC/VTEC), Listeria monocytogenes, Mycobacterium tubercolosis, Proteus mirabilis, Salmonella enteric, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Vibrio parahaemoliticus, причем при идентичности последовательностей свыше 95% делается вывод о присутствии данной патогенной бактерии в пищевом субстрате.

Недостатками данного способа идентификации патогенных бактерий является:

1. Выявление узкого спектра патогенных бактерий рода Clostridium.

2. Использование узкоспецифичных праймеров, не позволяющих учитывать патогенные виды клостридий с возникшими мутациями.

Задача изобретения - диагностика патогенной микробиоты, присутствующей в ЖКТ сельскохозяйственных животных, включая такие особо опасные виды микроорганизмов, как Clostridium perfringens, C. difficile, C. ramosum, C. septicum.

Поставленная задача решается за счет того, что используются широкоспецифичные праймеры на фрагмент гена 16S рРНК, позволяющие охватить полный спектр патогенной микробиоты в ЖКТ животных.

Новые существенные признаки:

1. Максимальный охват идентификации патогенных бактерий, включая Clostridium perfringens, C. difficile, C. ramosum, C. septicum и пр.

Перечисленные новые существенные признаки в совокупности с известными позволяют получить технический результат во всех случаях, на которые распространяется объем правовой охраны.

Технический результат

Технический результат заключается в быстрой индентификации патогенной микробиоты ЖКТ сельскохозяйственных животных, включая Clostridium perfringens, C. difficile, C. ramosum, C. septicum при помощи методов высокопроизводительного секвенирования и последующей биоинформатической обработке.

На фиг. 1 изображена относительная численность патогенных клостридий в исследованных пробах, %

На фиг. 2 изображена относительная численность патогенов в исследованных пробах, %.

В начале проводится отбор проб содержимого ЖКТ в объеме - 30-50 г, Отобранные образцы немедленно помещают в стерильные пластиковые пробирки. Все образцы замораживают при -20°C и транспортируют в сухом льду в лабораторию для последующего выделения ДНК.

Тотальную ДНК из образцов выделяли с использованием детергентно-опосредованном осаждения ДНК из субстрата с применением растворов для лизиса клеточных стенок и осаждения ДНК, 1,2 М хлорида натрия и хлороформа.

Бактериальное сообщество, включая патогенные виды, оценивали методом NGS-секвенирования, на автоматическом секвенаторе с применением праймеров для V3-V4 региона 16S рРНК. Автоматический биоинформатический анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения QIIME2.

Для оценки работоспособности данного способа был проведен производственный опыт. Период проведения опыта - c 10 января по 10 марта 2023 г. Кормовая добавка с антиклостридиальной активностью раздавалась вручную каждой голове опытной группы по 50г/гол/сут за 2-3-недели до отела, затем в новотельный период и раздой. Живая масса коров составляла 600 кг. Продуктивность коров составляла 8500 кг/гол/год.

В результате использования способа оценки патогенной микробиоты было показано, что основную долю патогенных бактерий составили микроорганизмы рода Acinetobacter. К данному роду относятся возбудители преимущественно общих инфекций, бактериемий, сепсиса. При этом среди обнаруженных видов ацинетобактерий был выявлен особо опасный патоген Acinetobacter baumannii, входящий в группу ESCKAPE, как один из главных патогенов с множественной устойчивостью к разным антибиотикам. К концу эксперимента общая доля ацинетобактерий была значительно ниже в опытной группе, а именно 0,059%, в сравнении с контрольной группой 0,15%. Аналогично, к концу эксперимента было выявлено снижение доли вида Acinetobacter baumannii в опытной группе 0,04% в сравнении с контролем 0,13%.

Также высокую долю патогенных видов занимали возбудители клостридиозов рода Clostridium, в том числе C. spiroforme, C. colinum, C. difficile, C. innocuum, C. intestinale. Было отмечено снижение доли патогенных клостридий в рубцовой жидкости коров в течение эксперимента, при этом в течение всего эксперимента доля данных бактерий в образцах от опытной группы была ниже, чем в образцах от контрольной группы. Наиболее широко представленный во всех образцах C. colinum вызывает клостридиозные энтериты КРС. В образцах рубцового содержимого от опытной группы его содержание было также ниже, чем в образцах от контрольной группы. Также обнаруженный в большинстве образцов C. innocuum связывают с диареями животных. Помимо этого, данный вид является потенциально устойчивым к действию антибиотиков. Виды C. spiroforme, C. difficile, C. intestinale были обнаружены в минорном количестве в образцах. Их также связывают с энтеритами, диареей и бактериемией скота (фиг. 1).

Также в образцах рубцового содержимого были обнаружены патогенные кампилобактерии. Кампилобактериоз - инфекционная болезнь крупного рогатого скота, проявляющаяся поражением половых органов, частыми перегулами, бесплодием, массовыми абортами и рождением нежизнеспособного приплода. Содержание кампилобактерий колебалось от 0,03% до 0,05% в зависимости от образца.

Также в образцах были обнаружены патогенные представители порфиромонад рода Porphyromonas, в том числе P. cangingivalis, P. circumdentaria, P. endodontalis преимущественно вызывающие воспаления ротовой полости, а также P. levii связанный с некротическим вульвовагинитом и P. somerae связанный с инфекциями кожи, мягких тканей, язвами. При этом следует отметить, что P. levii и P. endodontalis были обнаружены только в образцах от контрольной группы в начале эксперимента. При этом общее содержание порфиромонад в опытной группе было ниже, чем в контрольной как в начале эксперимента 0,022% против 0,046% соответственно, так и в конце эксперимента 0,063% и 0,086% соответственно.

Во всех образцах были обнаружены патогенные микоплазмы, возбудители маститов, артритов, пневмонии, отиты и нарушений репродуктивной системы крупного рогатого скота. В течение всего эксперимента доля данных бактерий в образцах от опытной группы была ниже, чем в образцах от контрольной группы: в начале эксперимента доля микоплазм составила 0,043% в контрольной группе и 0,006% в опытной группе, а к концу эксперимента 0,065% в контрольной группе и 0,035% в опытной группе.

Во всех образцах были обнаружены стрептококки, возбудители септико-некротических заболеваний. В образцах контрольной группы их доля колебалась от 0,037% в начале эксперимента до 0,031% в конце эксперимента. В образцах опытной группы доля стрептококков снизилась с 0,033% в начале эксперимента до 0,008% в конце эксперимента.

Также в исследованных образцах в меньшей степени обнаруживались следующие виды патогенных микроорганизмов:

1. возбудитель Stenotrophomonas maltophilia, связанный с острыми маститами коров (фиг. 2);

2. стафилококки - возбудители септико-некротических заболеваний, прежде всего, респираторных органов;

3. трепонемы - у КРС в основном считаются возбудителями дерматитов, в том числе язвенного дерматита вымени;

4. аэромонады - преимущественно возбудители гастроэнтеритов.

Изобретение относится к ветеринарии. Описан способ диагностики патогенной микробиоты ЖКТ сельскохозяйственных животных, включая такие виды, как Clostridium perfringens, C. difficile, C. ramosum, C. septicum. Способ осуществляется с использованием молекулярно-биологического подхода высокопроизводительного секвенирования на основании выделения бактериальной ДНК из ЖКТ сельскохозяйственных животных и использования широкоспецифичных праймеров на фрагмент гена 16S рРНК, позволяющий полностью оценить профиль патогенных клостридий в ЖКТ. Изобретение позволяет полностью оценить профиль патогенных клостридий в ЖКТ. 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ диагностики патогенной микробиоты, присутствующей в ЖКТ сельскохозяйственных животных, который осуществляется с использованием высокопроизводительного секвенирования на основании выделения бактериальной ДНК из ЖКТ сельскохозяйственных животных при использовании праймеров для V3-V4 региона гена 16S рРНК и последующей биоинформатической обработки, позволяющей полностью оценить профиль патогенности микробиоты в ЖКТ.

2. Способ по п.1, где патогенная микробиота включает патогенные клостридии, в том числе такие виды, как Clostridium perfringens, C. difficile, C. ramosum, C. septicum.