Способ моделирования периневральной инвазии опухоли: экспериментальная модель на крысах линии Wistar Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 A61K31/01 A61K47/06 A61P43/00 A61M3/00 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, экспериментальной онкологии и экспериментальной патологии.

Периневральная инвазия (ПНИ) представляет собой процесс проникновения опухолевых клеток в нерв, его оболочки либо окружение нерва по его периферии не менее чем на 33%.

Встречается как относительно частое осложнение при различных видах раков, например: протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (70-100%), рак желудка (6,8-75,6%), злокачественная опухоль желчевыводящих путей (56-88%), рак простаты (12,4-83,6%), колоректальный рак (15,7-38,9%), рак шейки матки (8,6-31,3%). Для многих злокачественных опухолей ПНИ является показателем неблагоприятного прогноза, высокой вероятности рецидива опухоли и летальности.

Первые упоминания феномена в литературе встречаются ещё в середине XIX века, но тогда он не получил должного внимания. А в 1985 году Д. Г. Батсакис впервые дал определение ПНИ: инвазия опухолевых клеток «в нерв, вокруг и через нервы». Ранее считалось, что к возникновению ПНИ приводят особенности структур вокруг нервов, а именно сниженная плотность периневрального матрикса, из-за чего клетки опухоли проникают в область по пути наименьшего сопротивления. Однако с развитием медицины и молекулярной биологии стало ясно, что это результат сочетания многих факторов (молекулярно-биологических, клеточных, биохимических, иммунологических), а сам механизм периневральной инвазии представляет собой многостадийный и непрерывный процесс.

Известно изобретение: способ моделирования злокачественных соединительнотканных опухолей (сарком), RU 2407063, опубликовано: 20.12.2010 г. Принцип действия данного метода основывается на длительном культивировании мультипотентных мезенхимальных клеток до получения опухолевой культуры саркомы, которая в дальнейшем иммобилизируется на поверхности губчатого деминерализованного костного матрикса.

Данный метод имеет недостатки в виде большого срока получения первого имплантата, затратности и сложности хранения.

В качестве прототипа взят метод, описанный А. Н. Студитским, заключающийся в нарушении межтканевого взаимодействия путём обёртывания мышцы целлофановой плёнкой и последующим многократным пересаживанием опухолевой ткани с целью выведения штамма ЦРМ-I (целлофановая рабдомиобластома). (Экспериментальная гистология опухолевого роста: [Сборник статей] / Под ред. А.Н. Студитского; [АН СССР. Ин-т морфологии животных им. А.Н. Северцова]. - Москва: Наука, 1966. - 279 с.)

Метод имеет недостатки, заключающиеся в сложности проведения операции экспериментальному животному по обертыванию органа плёнкой, сопряженной с риском вызвать послеоперационные осложнения, и в длительном периоде ожидания до возникновения первичного очага, а также в сложности сохранения полученного штамма опухоли.

Технический результат заключается в разработке способа моделирования периневральной инвазии опухолей по ходу крупных нервов у крыс.

Технический результат достигается тем, что нижнюю конечность взрослой половозрелой крысы линии Wistar выпрямляют и фиксируют вручную, затем в подкожно-жировую клетчатку голени между медиальной и латеральной головками икроножной мышцы в область проекции большеберцового нерва с помощью шприца вводят 0,5 мл 0,2% масляного раствора 9,10- диметил-1,2,-бензантрацена 1 раз в неделю в течение 6 недель, через 3 недели после появления первых опухолевых узлов получают модель периневральной инвазии опухоли.

ИЗОБРЕТЕНИЕ ПОЯСНЯЕТСЯ ФИГУРАМИ (ФИГ. 1-5).

Фиг. 1 – Поперечный срез периферического нерва нижней конечности контрольного животного. Окраска гематоксилином и эозином, Х200;

Фиг. 2 – Поперечный срез периферического нерва конечности крысы, находящийся в толще опухолевой ткани. Поля опухоли формируют муфтообразный каркас вокруг нерва, определяются очаговые прорастания опухолью периневрия. Окраска гематоксилином и эозином, Х200;

Фиг. 3 – Срез периферического нерва конечности крысы, пронзающий опухолевую ткань. Отмечается плотное прилегание структур опухоли к нервному стержню, видимых признаков прорастания опухоли не определяется. Окраска гематоксилином и эозином, Х200;

Фиг. 4 – Продольный срез нерва конечности крысы с наличием достоверных признаков пери- и интраневральной инвазии опухоли. Окраска гематоксилином и эозином, Х200;

Фиг. 5 – В поперечном срезе периферического нерва крысы отмечается выраженный интерстициальный отек периневрия, участки роста опухоли в толщу периневрия. Окраска гематоксилином и эозином, Х100.

Способ осуществляется следующим образом: нижнюю конечность взрослой половозрелой крысы линии Wistar выпрямляют и фиксируют вручную, затем в подкожно-жировую клетчатку голени, между медиальной и латеральной головками икроножной мышцы в область проекции большеберцового нерва, с помощью шприца вводят 0,5 мл 0,2 об. % масляного раствора DMBA (9,10-диметил-1,2,-бензантрацен) 1 раз в неделю в течение 6 недель, таким образом достигают формирования первых опухолевых узлов соединительнотканного генеза (фибросаркомы) через 3 недели от последней инъекции, после чего ожидают развития периневральной инвазии в течение 3 недель от момента появления первых опухолевых узлов.

Животных выводят из эксперимента через 3 недели от момента появления первых опухолевых узлов для появления периневральной инвазии в процессе развития опухоли. Выведение животных из эксперимента осуществляется согласно принятым этическим и деонтологическим нормам.

Затем из материала инъецированной конечности с периневрально распространившимися клетками основной опухоли в рамках рутинной гистологической практики подготавливают гистологические препараты и проводят гистологическую верификацию опухоли.

ПРИМЕР ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ СПОСОБА

Исследование проводилось на базе Института Морфологии Человека им. А.П. Авцына.

Для эксперимента были взяты 14 взрослых самцов крыс линии Wistar, которым в область проекции большеберцового нерва проводились инъекции 0,5 мл 0,2% масляного раствора DMBA (9,10-диметил-1,2-бензантрацен). Кратность введения составила 1 раз в неделю в течение 6 недель. Через 3 недель с последней инъекции были сформированы крупные опухолевые узлы, затем через 3 недели с момента появления опухолевых узлов животных выводили из эксперимента. После чего был взят материал из макроскопически определяемого опухолевидного образования, топографически относимого к зоне инъекции. Макропрепарат извлекался таким образом, что полностью сохранялись гистотопография и анатомическое строение прилежащих к опухоли структур. Материал фиксировали в растворе (10 % об.) нейтрального забуференного формалина, заливали парафином. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Далее материал был микроскопически исследован.

Были получены серии гистологических препаратов, рутинно окрашенные гематоксилином и эозином. В качестве образца для гистологического контроля интактного нервного волокна был взят материал у контрольной группы крыс (фиг. 1). На материале экспериментальных животных гистологически был верифицирован процесс индуцированного канцерогенеза, выражающийся в возникновении опухолевой массы, в том числе муфтообразно охватывающей нерв (фиг. 2-3). Морфологически определены участки периневральной инвазии с пери- и интраканаликулярным вовлечением опухолевых клеток в процесс периневральной инвазии, что определяется как на продольном срезе (фиг. 4), так и на поперечном (фиг. 5).

Данный способ моделирования периневральной инвазии опухоли при помощи индукции масляным раствором (0,2%) DMBA (9,10-диметил-1,2,-бензантрацен) в области прохождения крупного нерва позволяет определить распространение клеток злокачественных опухолей по периферическим нервным волокнам. Полученный результат может быть использован в создании микропрепаратов, которые в дальнейшем будут использованы в качестве материала для исследования морфологических особенностей феномена периневральной инвазии.

Это необходимо для изучения процесса периневральной инвазии опухоли, в рамках изучения и оценки особенностей периневрального распространения опухоли, значимых с позиций как фундаментальной, так и клинической медицины. Способ позволяет индуцировать развитие периневральной инвазии опухоли и в рамках моделируемых условий оценить значимые характеристики процесса периневрального распространения опухоли.

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, экспериментальной онкологии и патологии. Нижнюю конечность взрослой половозрелой крысы линии Wistar выпрямляют и фиксируют вручную. В подкожно-жировую клетчатку голени между медиальной и латеральной головками икроножной мышцы в область проекции большеберцового нерва с помощью шприца вводят 0,5 мл 0,2% масляного раствора 9,10-диметил-1,2,-бензантрацена. Препарат вводят 1 раз в неделю в течение 6 недель, через 3 недели. При появлении первых опухолевых узлов получают модель периневральной инвазии опухоли. Способ позволяет получить модель периневральной инвазии опухолей по ходу крупных нервов у крыс, определить распространение клеток злокачественных опухолей по периферическим нервным волокнам, что в свою очередь дает возможность создать микропрепараты, которые в дальнейшем будут использованы в качестве материала для исследования морфологических особенностей феномена периневральной инвазии. 5 ил., 1 пр.

Способ моделирования периневральной инвазии опухоли в эксперименте, отличающийся тем, что нижнюю конечность взрослой половозрелой крысы линии Wistar выпрямляют и фиксируют вручную, затем в подкожно-жировую клетчатку голени между медиальной и латеральной головками икроножной мышцы в область проекции большеберцового нерва с помощью шприца вводят 0,5 мл 0,2% масляного раствора 9,10-диметил-1,2,-бензантрацена 1 раз в неделю в течение 6 недель, через 3 недели после появления первых опухолевых узлов получают модель периневральной инвазии опухоли.