Средство, обладающее антиоксидантным и противовоспалительным действием и способ его получения Российский патент 2023 года по МПК A61K36/28 B01D11/02 A61P29/00 A61P39/06 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и фармакогнозии, и касается средства растительного происхождения, обладающего антиоксидантной и противовоспалительной активностью.

Цель: расширение ряда средств, обладающих антиоксидантными и противовоспалительными свойствами. В качестве средства, обладающего антиоксидантным и противовоспалительным действием, применяют экстракт из воздушно-сухого сырья трехреберника продырявленного.

Известно средство растительного происхождения, обладающее антиоксидантной активностью (RU 2342942C1 от 10.01.2009), и может быть использовано для лечения и профилактики заболеваний, где основным патогенетическим фактором является нарушение процессов перекисного и свободнорадикального окисления, особенно липидов. В качестве антиоксидантного средства предложен густой экстракт травы первоцвета весеннего (Primula veris L.). Средство расширяет арсенал лекарственных средств для профилактики и лечения свободнорадикальных патологий.

Также известно средство, обладающее антиоксидантной активностью по патенту РФ на изобретение №2292214С1 от 26.07.2005 г., содержащее экстракт надземной части альфредии поникшей (Alfredia cernua Cass.), который используют в качестве средства, обладающего антиоксидантной активностью. Изобретение расширяет арсенал средств растительного происхождения, обладающих антиоксидантной активностью.

Также известно применение 5%-ного водного экстракта из побегов астрагала (Astragalus dasyanthus) в качестве антиоксидантного средства. Средство обладает выраженным антиоксидантным действием и может расширить арсенал антиоксидантных средств природного происхождения (RU 2302252C1 от 10.07.2007).

Известно средство растительного происхождения, обладающее противовоспалительным действием (RU 2308961C1 от 27.10.2007), содержащее комплекс действующих веществ, выделенных из водного экстракта листьев персика, включающий флавоноиды, дубильные вещества, кумарины, фенилкарбоновые кислоты, фенолгликозиды, сапонины, комплекс действующих веществ, выделенный из водного экстракта растения очанки, включающий флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, стероидные сапонины, гликозиды, каротиноиды, при этом соотношение комплексов составляет 1:1 или 1:2, или 2:1, а также биологически активные компоненты, выбранные из группы глюкоза, лактоза, аскорбиновая кислота, витамины А и Б, растительная клетчатка и вспомогательные вещества, взятые в определенном соотношении. Средство предназначено для перорального применения в виде капель, порошков, таблеток, драже, капсул. Средство не обладает токсичностью, мутагенностью, эмбриотоксичностью, тератогенностью.

Также известно средство, обладающее противовоспалительным действием по патенту РФ на изобретение № 2637414 от 04.12.2017 г., содержащее спиртовую жидкую вытяжку из растительного сырья, отличающееся тем, что в качестве растительного сырья используют траву кровохлебки лекарственной, измельченную до размера частиц 2,0 мм, экстракцию проводят 70%-ным спиртом при 90°C при соотношении сырье - экстрагент 1:50 в течение 2 ч, при этом первую экстракцию проводят в течение 60 мин, вторую и третью - по 30 мин, затем фильтрацию, упаривание, концентрирование и высушивание спиртового экстракта, что способствует повышению противовоспалительной активности средства.

В литературе упоминаются противовоспалительные и антиоксидантные свойства цветков трехреберника продырявленного (Махлаюк В.П. Лекарственные растения в народной медицине. /В.П. Махлаюк. – Саратов, Приволжское книжное изд., 1991. – с.328–329; Дрибноход Ю.Ю. Косметика и косметология: все растительные средства по уходу за кожей. / Ю.Ю. Дрибноход. – СПб: Весь, 2006. – 314с), но для травы, собранной до цветения, таких свойств не установлено.

Техническим результатом заявленного изобретения является расширение арсенала средств, обладающих антиоксидантным и противовоспалительным действием.

Технический результат достигается благодаря тому, что средство, обладающее антиоксидантным и противовоспалительным действием, получают экстракцией аналитической пробы травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, массой около 1,0 г (точная навеска), измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм в ультразвуковой ячейке 50 мл спирта этилового 40% с озвучиванием в течении 3 минут в термостатируемом режиме при частоте колебаний 22 кГц и мощности ультразвука 90 Вт; последующим фильтрованием в мерную колбу емкостью 250 мл через бумажный фильтр и переносом сырья из ячейки вместе с фильтром в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, соединенную с обратным холодильником с последующей экстракцией 100 мл спирта 40% путем нагревания на плитке с закрытой спиралью в течении 20 мин; охлаждением полученного экстракта, фильтрованием в мерную колбу вместимостью 250 мл, доведением до метки 40% спиртом этиловым с последующим высушиванием с помощью лиофильной сушки.

Именно такое соотношение сырья и экстрагента, концентрация спирта этилового, последовательность стадий, применяемая частота колебаний и мощность ультразвука, время экстракции, позволяют получить экстракт, который дает наиболее полный выход флавоноидов; большее время экстракции не рационально, так как содержание действующих веществ в экстракте практически не меняется, следовательно, уровень активности будет оставаться прежним. Применение ультразвука позволяет увеличить выход флавоноидов и сократить общее время получения экстракта.

Возможность использования сухого экстракта из воздушно-сухой травы трёхреберника продырявленного, собранной до цветения, в качестве средства, обладающего антиоксидантным и противовоспалительным действием, из известного уровня техники не выявлена. Экстракт из воздушно-сухой травы трёхреберника продырявленного, собранной до цветения, характеризуются высоким содержанием флавоноидов (более 7%), обладающих антиоксидантной и противовоспалительной активностью.

Предлагаемая нами совокупность признаков позволяет получить средство, устойчивое при хранении, обладающее антиоксидантным и противовоспалительным действием.

Заявленное изобретение может быть подтверждено следующими примерами.

Пример 1.

Аналитическую пробу воздушно-сухой травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, измельчали до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в ультразвуковую ячейку, заливали 50 мл спирта этилового 40%, озвучивали в течении 3 минут в термостатируемом режиме при частоте колебаний 22 кГц и мощности ультразвука 90 Вт. Извлечение фильтровали в мерную колбу емкостью 250 мл через бумажный фильтр. Сырье из ячейки вместе с фильтром переносили в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, заливали 100 мл спирта 40%, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на плитке с закрытой спиралью в течении 20 мин. Затем содержимое колбы охлаждали, после чего извлечение фильтровали через бумажный фильтр в ту же мерную колбу и доводили до 250 мл до метки 40% спиртом этиловым (раствор А испытуемого раствора). Полученный экстракт лиофильно высушивали.

Затем определяли содержание флавоноидов.

Пример 2.

Сумму флавоноидов определяли по методике:

2,0 мл раствора А испытуемого раствора помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 2 мл алюминия хлорида раствора 5% в спирте 70% и 0,2 мл уксусной кислоты 30%, доводили объем раствора спиртом 70% до метки и перемешивали (раствор Б испытуемый раствор).

Оптическую плотность раствора Б испытуемого раствора измеряли через 20 мин на спектрофотометре при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 2,0 мл раствора А испытуемого раствора, 0,2 мл уксусной кислоты 30%, доведенный спиртом 70 % до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

где    А — оптическая плотность раствора Б испытуемого раствора;

А_о — оптическая плотность раствора Б СО рутина;

а – навеска сырья, г;

а_о — навеска СО рутина, г;

Р – содержание основного вещества в СО рутина, %;

W — влажность сырья, %.

Содержание флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в экстракте составило 7,65±0,03%.

Пример 3.

Для исследования антиоксидантной и противовоспалительной активности готовый сухой экстракт растворяли в воде дистиллированной в соотношении 1:10 и определяли показатели биологической активности экстракта травы трёхреберника продырявленного.

Антиоксидантные свойства оценивали в простых
модельных системах, имитирующих наиболее распространенные реакции
свободно-радикального окисления в организме и в средах, в которых
инициировалось образование активных форм кислорода и реакции перекисного окисления липидов. Регистрацию свечения проводили на хемилюминомере «ХЛМ-003» (Россия). Антиоксидантная активность
определялась по степени угнетения хемилюминесценции и пересчитывалась в процентах от контроля. В качестве препарата сравнения была выбрана аскорбиновая кислота. Для выявления активных форм кислорода использовали люминол (5-амино-2,3-дегидро-4-фталазиндион), который окисляется и образует электронно-возбужденные карбонильные хромофоры с высоким квантовым выходом, в результате чего резко повышается интенсивность свечения, связанного с образованием активных форм кислорода. Хемилюминесценцию регистрировали в течение 5 минут. Исследование проводилось при добавлении 1 мл раствора экстракта травы терехреберника продырявленного, собранной до цветения, на 20 мл реакционной смеси.

Для инициации активных форм кислорода (модель I) использовали 20 мл фосфатного буфера с добавлением цитрата и люминола. Состав буфера: 2,72 г. KH₂PO₄, 7,82 г. KCL, 1,5 г. цитрата натрия C₆H₈O₇Na₃*5,5H₂O на 1 литр дистиллированной воды. Величину рН полученного раствора доводили до 7,45 ед. титрованием насыщенным раствором КОН и добавляли 0,2 мл маточного раствора люминола (10^-5 М). Образование АФК инициировали введением 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа.

Для оценки действия соединений на перекисное окисление липидов (модель II) из куриного желтка готовили липопротеиновые комплексы. Желток смешивали с фосфатным буфером в соотношении 1:5, затем гомогенизировали. Хемилюминесценцию инициировали добавлением 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа, запускавшего процесс окисления ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов. По интенсивности развивающегося свечения судили о процессах перекисного окисления липидов. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Анализируя полученные результаты следует отметить, что исследуемое сырье трехреберника продырявленного проявляет антиоксидантную активность как на модельной системе генерации активных форм кислорода (I), так и перекисного окисления липидов (II), но по уровню антиоксидантных свойств уступает аскорбиновой кислоте. Более сопоставимые результаты АОА исследуемого препарата и препарата сравнения наблюдались в системе ПОЛ (аскорбиновая кислота снижала скорость ПОЛ на 78,1%, а трехреберник на 32,6%), во второй модельной системе - аскорбиновая кислота уменьшала генерацию АФК на 84,5%, а трехреберник на 16,1%.

Таким образом, в результате экспериментальной работы установлено, что в условиях in vitro экстракт травы терехреберника продырявленного, собранной до цветения, проявляет антиоксидантную активность.

Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводили субплантарным (под подошвенный или плантарный апоневроз) введением 0,1 мл 2% раствора формалина. Экспериментальная работа в условиях in vivo проведена на 30 аутбредных крысах-самцах Wistar массой 250-300 г, которые содержались в условиях вивария согласно положениям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях ETS N 123» (Страсбург, 18.03.1986 г).

Исследуемые препараты вводили принудительно ежедневно на протяжении недели. Отек лапки животных определяли по разнице диаметра лапки (миллиметры), измеренного штангенциркулем, через 4 и 24 часа после индукции воспаления относительно диаметра лапки до индукции воспаления. Препарат сравнения (диклофенак натрия) вводили за 1 час до моделирования отека в дозировке 10 мг/кг внутрибрюшинно. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению отека лапки у крыс на фоне исследуемого растительного средства относительно показателя контрольной группы. Препарат сравнения Диклофенак натрия (ООО «Гротекс», Россия). Результаты исследования представлены в таблице 2.

В результате исследования установлено, что экстракт из травы трехреберника продырявленного вызывал угнетение отека на пике его развития (4ч) на 66,67%, а препарат сравнения на 72,22% по сравнению с группой контроля, что свидетельствует о торможении экссудативной фазы воспаления. К концу опыта (24 ч) выраженность воспалительной реакции снижалась и экстракт травы терехреберника продырявленного, собранной до цветения, показал результаты сопоставимые с препаратом сравнения, что показывает его противовоспалительный эффект.

Таблица 1. - Показатели хемилюминесценции на модельных системах генерации активных форм кислорода (I) и перекисного окисления липидов (II), % к контролю.

№ Исследуемое вещество Модель Светосумма Вспышка 1 Трёхреберник продырявленный I - 16,1 (13,9-18,5)*^{, a} - 11,4 (8,3-17,3)* ^{, a} II - 32,6 (28,5-33,8)**^{, a} - 7,2 (6,5-13,2)* ^{, a} 2 Аскорбиновая кислота I - 84,5 (79,3-87,1)** - 91,7 (82,3-95,2)** II - 78,1 (70,4-82,4)** - 86,8 (80,3-92,1)** Приведены медиана и межквартильный интервал по результатам 6 измерений. *р≤0,05, **р≤0,001 - в сравнении с контролем; ^aр≤0.05 - в сравнении с аскорбиновой кислотой.

Таблица 2. - Противовоспалительная активность экстракта трехреберника травы

Препарат Чис-ло животных Диаметр лапки (мм) Выраженность воспалительной реакции, % Угнетение отека на пике воспаления (4ч), % 0ч 4ч 24ч 4ч 24ч 4ч Контроль 10 2,9 (2,9-3,4) 4,7(4,3-4,7)^a 4,1 (3,6-4,1)^a 62,07 41,38 - Трехребер-ник, водн.экстракт 1:10 10 2,7 (2,5-3,1) 3,3 (2,7-3,8)* 3,1 (2,9-3,5)* 22,22±3,56 14,81±2,15 66,67 Диклофенак натрия,10 мг/кг 10 3,0 (2,7-3,2) 3,5 (3,3-3,9)*,^a 3,2 (2,9-3,6)* 16,67±2,78 6,67±1,05 72,22 Приведены медиана и межквартильный интервал по результатам 10 измерений. *р≤0,05, **р≤0,001 - в сравнении с контролем по соответствующему времени; ^aр≤0.05 – 0ч vs 4ч и 24ч.

Заявленное изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, обладающему антиоксидантной и противовоспалительной активностью. Средство, обладающее антиоксидантным и противовоспалительным действием, представляющее сухой экстракт, полученный экстракцией аналитической пробы травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, массой около 1,0 г -точная навеска, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, в ультразвуковой ячейке 50 мл спирта этилового 40% с озвучиванием в течении 3 минут в термостатируемом режиме при частоте колебаний 22 кГц и мощности ультразвука 90 Вт; последующим фильтрованием в мерную колбу емкостью 250 мл через бумажный фильтр и переносом сырья из ячейки вместе с фильтром в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, соединенную с обратным холодильником с последующей экстракцией 100 мл спирта этилового 40% путем нагревания на плитке с закрытой спиралью в течение 20 мин; охлаждением полученного экстракта, фильтрованием в ту же мерную колбу вместимостью 250 мл, доведением до метки 40% спиртом этиловым с последующим высушиванием с помощью лиофильной сушки. Вышеописанное средство обладает выраженным антиоксидантным и противовоспалительным действием, характеризуется увеличенным выходом флавоноидов, а именно средство содержит 7,65±0,03% флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье. 2 табл., 3 пр.

Средство, обладающее антиоксидантным и противовоспалительным действием, представляющее сухой экстракт, полученный экстракцией аналитической пробы травы трехреберника продырявленного, собранной до цветения, массой около 1,0 г -точная навеска, измельченного до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм, в ультразвуковой ячейке 50 мл спирта этилового 40% с озвучиванием в течении 3 минут в термостатируемом режиме при частоте колебаний 22 кГц и мощности ультразвука 90 Вт; последующим фильтрованием в мерную колбу емкостью 250 мл через бумажный фильтр и переносом сырья из ячейки вместе с фильтром в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, соединенную с обратным холодильником с последующей экстракцией 100 мл спирта этилового 40% путем нагревания на плитке с закрытой спиралью в течение 20 мин; охлаждением полученного экстракта, фильтрованием в ту же мерную колбу вместимостью 250 мл, доведением до метки 40% спиртом этиловым с последующим высушиванием с помощью лиофильной сушки.