Консорциум липофильных бактериальных штаммов для биодеградации пальмового масла Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, в частности к консорциуму липофильных бактериальных штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D для биодеградации пальмового масла. Данный консорциум липофильных бактериальных штаммов может быть использован для деструкции жидких отходов производства пальмового масла.

Жидкие отходы производства пальмового масла характеризуются высоким содержанием непереработанного масла и других загрязняющих веществ. Прямой сброс таких стоков в окружающую среду без надлежащей очистки может вызвать серьезные экологические проблемы [Dominic D., Baidurah S. Recent developments in biological processing technology for palm oil mill effluent treatment - A review // Biology - 2022. - Vol. 11. - P. 525]. Бактерии играют значительную роль в биогеохимических циклах природных и антропогенных экосистем. В речных экосистемах бактерии интенсивно колонизируют иловые отложения, донные отложения могут быть источником разнообразных по метаболизму микроорганизмов, в том числе перспективных для промышленных биотехнологий [Araya R., Tani K., Takagi T., Yamaguchi N., Nasu M. Bacterial activity and community composition in stream water and biofilm from an urban river determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 2003;43(1):111-119. DOI 10.1111/j.15746941.2003.tb01050.x]. Поиск эффективных микроорганизмов-деструкторов и разработка на их основе биотехнологий имеет большой потенциал для разработки промышленных технологий биодеградации пальмового масла.

Ранее опубликованы результаты выделения липофильных микроорганизмов из проб жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии, по филогенетическому анализу, определению липолитической активности и способности к росту на среде с пальмовым маслом штамм Pseudomonas protegens был признан перспективным для дальнейших исследований [Герасимчук А.Л., Ивасенко Д.А., Трифонов А.А., Топилина Ю.С., Сысоева А.Н., Франк Ю.А. Поиск и выделение липофильных бактерий для утилизации отходов производства пальмового масла // В книге: БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ. Материалы международного конгресса. Москва, 2023. С. 114-116].

Известно, что Gordonia paraffinivorans актиномицет, обладает способностью разлагать углеводороды, выделен из нефтедобывающей скважины месторождения Дацин, Китай [Xue Y, Sun X, Zhou P, Liu R, Liang F, Ma Y. Gordonia paraffinivorans sp. nov., a hydrocarbon-degrading actinomycete isolated from an oil-producing well. Int J Syst Evol Microbiol. 2003 Sep; 53(Pt 5): 1643-1646. doi: 10.1099/ijs.0.02605-0. PMID: 13130063]. Об изучении липолитической активности у Gordonia paraffinivorans в отношении пальмового масла ранее опубликованных сведений не обнаружено.

Задачей данного изобретения является получение нового консорциума липофильных бактериальных штаммов для биодеградации пальмового масла, отличительной особенностью которого является объединение в одной ассоциации двух штаммов бактерий, способных к активному росту в среде с пальмовым маслом в качестве единственного источника органического вещества.

Для решения поставленной задачи предназначен консорциум липофильных бактериальных штаммов для биодеградации пальмового масла, состоящий из Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia parafinivorans VKM Ac-3071D в соотношении 1:1.

Сведения о депонировании штаммов

Штаммы депонированы во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР «ПУЩИНСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК», ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ИМ. Г.К. СКРЯБИНА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ИБФМ РАН) (142290, Россия, Московская обл., Пущино, пр. Науки, 5) под регистрационным номером VKM B-3844D и VKM Ac-3071D.

Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D

Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D выделен из образцов жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии. Жидкие отходы использовали в качестве инокулята при проведении посева методом разведений на агаризованную синтетическую среду с добавлением пальмового масла и карбоксиметилцеллюлозы в конечной концентрации 1% и на богатую питательную среду Plate Count Agar (PCA).

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки

Колонии светло-бежевые, непрозрачные. Клетки представлены палочками 2-4 мкм длиной. Спор не обнаружено. Температура культивирования 28°C, продолжительность культивирования 1-2 суток.

Культивирование и хранение

Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D растет на таких средах, как ГРМ (гидролизат рыбной муки), Plate Count Agar (PCA), трибутириновый агар (ТБА), минеральная среда с пальмовым маслом в конечной концентрации 1 %. При росте на ТБА штамм образует зоны гидролиза вокруг колоний 1-2 мм, что свидетельствует о продукции внеклеточных липолитических ферментов. Рост на богатых питательных средах составляет 1-2 суток при температуре 4-35°C, оптимум 28-32°C. Штамм способен к росту на минеральной среде с пальмовым маслом (1%), рост составляет 2-3 суток при температуре 15-35°C, оптимум 28°C.

Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D в лабораторных условиях поддерживают способом периодических пересевов 1 раз в 2-3 месяца на агаризованную среду Plate Count Agar (PCA) состава: дрожжевой экстракт 2.5 г/л; NaCl 5.0 г/л; D-глюкоза 1.0 г/л; пептон сухой ферментативный 5.0 г/л; агар микробиологический 15.0 г/л, вода дистиллированная до 1.0 л.

Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D также может храниться при положительной температуре 4°C в лиофилизированном состоянии с использованием натурального снятого молока в качестве защитной среды.

Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D

Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D выделен из образцов жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки

Колонии оранжевые, непрозрачные. Клетки представлены палочками 2-4.5 мкм длиной. Спор не обнаружено. Температура культивирования 28°C, продолжительность культивирования 1-2 суток.

Культивирование и хранение

Штамм растет на таких средах, как гидролизат рыбной муки (ГРМ), Plate Count Agar (PCA), трибутириновый агар (ТБА), минеральная среда с пальмовым маслом в конечной концентрации 1%. При росте на ТБА штамм образует зоны гидролиза вокруг колоний 1-2 мм, что свидетельствует о продукции внеклеточных липолитических ферментов. Рост на богатых питательных средах составлял 1-2 суток при температуре 4-50°C, оптимум 32-40°C. Штамм способен к росту на минеральной среде с пальмовым маслом (1%), рост составлял 2-3 суток при температуре 15-40°C, оптимум 32°C.

Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D в лабораторных условиях поддерживают способом периодических пересевов 1 раз в 2-3 месяца на агаризованную среду Plate Count Agar (PCA) состава: дрожжевой экстракт 2.5 г/л; NaCl 5.0 г/л; D-глюкоза 1.0 г/л; пептон сухой ферментативный 5.0 г/л; агар микробиологический 15.0 г/л, вода дистиллированная до 1.0 л.

Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D может храниться при положительной температуре 4°C в лиофилизированном состоянии с использованием натурального снятого молока в качестве защитной среды.

Липолитическая активность штаммов

Липолитическую активность штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D определяли по наличию зон гидролиза на трибутриновом агаре (ТБА). Способность утилизировать пальмовое масло определяли культивированием на бедной минеральной среде с добавлением пальмового масла (1%). Оба штамма росли на ТБА и образовывали зоны гидролиза вокруг колоний 1-2 мм, что свидетельствует о продукции клетками внеклеточных липолитических ферментов. На жидкой среде с пальмовым маслом при 28°C максимальная численность Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D составила 9.47×10⁸ кл/мл, максимальная численность Pseudomonas protegens VKM B-3844D и 1.14×10⁹ кл/мл. Диапазон температур для роста с пальмовым маслом составил 15-40°C для Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D и 15-35°C для Pseudomonas protegens VKM B-3844D с оптимумом при 32°C и 28°C, соответственно.

Каждую культуру консорциума штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D получают и хранят отдельно. Далее из штаммов составляют консорциум в соотношении 1:1.

Липолитическая активность консорциума штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D

В составе консорциума штаммы Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D и Pseudomonas protegens VKM B-3844D активно росли в присутствии 5 % пальмового масла (не менее 10⁸ кл/мл), о гидролизе масла в ходе культивирования свидетельствовало увеличение значения кислотного числа масла более чем в три раза, по сравнению с контролем, контрольные значения перекисного числа составили 12.43 мг КОН/г, в экспериментальных образцах при культивировании консорциума - 39.97 и 51.2 мг КОН/г.

Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение и культивирование штамма Pseudomonas protegens VKM B-3844D

Штамм выделен из образцов жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии. Образец воды из аэротенка объемом 450 мл транспортировали в лабораторию при положительной температуре 5±2°C. Исследованы некоторые физико-химические параметры отходов, послуживших источниками для культивирования микроорганизмов: значение рН 6.9, ХПК 92.7 мгО/л, содержание ионов аммония 31.6 мг/л, нитрат-иона 134 мг/л, нитрит-иона 30 мг/л, сульфатов 263 мг/л, хлоридов 214 мг/л, фосфора фосфатов 4.16 мг/л.

Выделение штамма Pseudomonas protegens VKM B-3844D проводили путем посева десятикратных разведений воды на агаризованную синтетическую среду состава NH₄Cl - 0.625 г/л, CaCl₂ - 0.0025 г/л, MnCl₂ - 0.005 г/л, MgSO₄×7Н₂О - 0.05 г/л, FeSO₄×5Н₂О - 0.0025 г/л, NaCl - 1.25 г/л, Na₂HPO₄ - 2.5 г/л, KH₂PO₄ - 0.25 г/л; рН 7.5 с добавлением карбоксиметилцеллюлозы в конечной концентрации 1%. Культивирование проводили при температуре 28С в течение 2 суток. Колонии пересевали не менее 3-5 раз на плотной среде Plate Count Agar (PCA) с контролем чистоты культуры с помощью микроскопии, далее полученную чистую культуру идентифицировали. В качестве основного метода видовой идентификации применялось секвенирование близкой к полной последовательности гена 16S рРНК (1415 п.о.) и последовательности gyrB (1145 п.о.). Геномную ДНК из культур выделяли с помощью набора Biolabmix (DU-50) в соответствии с инструкцией производителя (http://biolabmix.ru/). Для амплификации бактериальных генов 16S рРНК, которые являются универсальными филогенетическими маркерами, использовали праймеры 27F [DeLong E.F. Archaea in coastal marine environments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1992. - Vol. 89, Iss. 12. - P. 5685-5689. - DOI: 10.1073/pnas.89.12.5685] и 1492R [Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // Journal of Bacteriology - 1991. - Vol. 173, Iss. 2. - P. 697-703. - DOI: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991]. ПЦР-смесь объемом 50 мкл содержала 1×ПЦР-буфер (Biolabmix), 2.5 мМ MgCl₂ (Biolabmix), 0.2 мМ смеси dNTP (Biolabmix), по 10 пм каждого праймера (ООО «Синтол»), 0.7 ед.а. термостабильной HS-Taq-полимеразы (Biolabmix), 3 мкл матрицы ДНК (в концентрации превышающей 50 нг), до конечного объема доводили стерильной деионизованной водой. Амплификацию генов 16S рРНК проводили по программе: первоначальная денатурация при 95°С в течение 20 с; последующие 6 циклов денатурация при 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров при 45°С в течение 20 с, элонгация праймеров при 72°С в течение 1.5 мин; последующие 27 циклов денатурация при 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров при 55°С в течение 20 с; элонгация праймеров при 72°С в течение 1.5 мин; окончательная элонгация при 72°С в течение 3 мин [Герасимчук А.Л., Ивасенко Д.А., Касымова А.А., Франк Ю.А. Селективное культивирование бактериальных штаммов с липолитической и нефтеокисляющей активностью из донных осадков реки Оби в Западной Сибири // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2022. Т. 26. № 5. С. 449-457. DOI: 10.18699/VJGB-22-55]. Амплификацию генов gyrB проводили с использованием праймеров UP-1 и UP-2r [Yamamoto S., Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains // Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61(3). P. 1104-1109. doi: 10.1128/aem.61.3.1104-1109.1995]. ПЦР-смесь готовили как описано выше. Проводили 30 циклов амплификации с денатурацией матричной ДНК при 94°С в течение 1 мин, отжигом праймеров при 60°С в течение 1 мин и элонгацией при 72°С в течение 2 мин. Секвенирование полученных последовательностей ДНК осуществляли с помощью генетического анализатора «НАНОФОР - 05» на базе НПФ Синтол, г. Москва. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и gyrB проводили с помощью редактора последовательностей BIOEDIT (http://www.jwbrown. mbio.ncsu.edu), программы BLAST в базе данных NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Штамм способен к росту на таких средах, как гидролизат рыбной муки (ГРМ), Plate Count Agar (PCA), трибутириновый агар (ТБА), минеральная среда с пальмовым маслом в конечной концентрации 1%. Штамм образовывал зоны гидролиза на диагностической среде с трибутирином, что свидетельствует о продукции клетками внеклеточных липолитических ферментов (липаз, эстераз). Также косвенным подтверждением липолитической активности является положительная ПЦР-амплификация фрагмента длиной 250 п.о. с праймерами OXF1 и ACR3 [Bell P.J.L., Sunna A., Gibbs M.D., Curach N.C., Nevalainen H. and Bergquist P.L. Prospecting for novel lipase genes using PCR // Microbiology - 2002. - Vol. 148. - P. 2283-2291], специфичными к самой разнообразной группе липаз семейства альфа-бета гидролаз.

Рост на богатых питательных средах составлял 1-2 суток. Диапазон рН для роста 4-10, оптимум 8-9. Диапазон температур для роста 4-35°C, оптимум 28-32°C. Штамм способен к росту на минеральной среде с пальмовым маслом (1%) в качестве единственного источника углерода, рост составляет 2-3 суток, численность 10⁸-10⁹ кл/мл, при температуре 15-35°C, оптимум 28°C при котором максимальная численность составляет 1.14×10⁹ кл/мл.

Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D в лабораторных условиях поддерживали способом периодических пересевов 1 раз в 2-3 месяца на агаризованную среду Plate Count Agar (PCA) состава: дрожжевой экстракт - 2.5 г/л; NaCl - 5.0 г/л; D-глюкоза - 1.0 г/л; пептон сухой ферментативный - 5.0 г/л; агар микробиологический - 15.0 г/л, вода дистиллированная - до 1.0 л.

Пример 2. Способ коллекционного (долговременного) хранения штамма Pseudomonas protegens VKM B-3844D

Штамм Pseudomonas protegens VKM B-3844D выращивали на жидкой оптимальной питательной среде (например, PCA) путем внесения 5% инокулята и культивирования в течение 24 часов при температуре 28°C. В экспоненциальной фазе роста жидкую культуру осаждали центрифугированием и удаляли супернатант. К полученному осадку добавляли снятое молоко в качестве протектора. Суспензию клеток в протекторе разливали по стеклянным ампулам и обезвоживали методом лиофилизации. Хранение флаконов или ампул проводили при положительной температуре 4°C.

Пример 3. Выделение и культивирование штамма Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D

Штамм выделен из проб жидких отходов из очистных сооружений г. Сурабая в Индонезии. Образец воды из аэротенка объемом 450 мл транспортировали в лабораторию при положительной температуре 5±2°C. Выделение штамма Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D проводили путем посева десятикратных разведений воды на агаризованную синтетическую среду, состав которой описан в Примере 1, с добавлением карбоксиметилцеллюлозы в конечной концентрации 1%. Культивирование при температуре 28°C в течение 2 суток. Колонии пересевали не менее 3-5 раз на плотной среде PCA с контролем чистоты культуры с помощью микроскопии, далее полученную чистую культуру идентифицировали на основании анализа последовательности гена 16S рРНК, а также на основе культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик. В качестве основного метода видовой идентификации применялось секвенирование близкой к полной последовательности гена 16S рРНК (1415 п.о.). Геномную ДНК из культур выделяли с помощью набора Biolabmix (DU-50) в соответствии с инструкцией производителя (http://biolabmix.ru/). Для амплификации бактериальных генов 16S рРНК, которые являются универсальными филогенетическими маркерами, использовали праймеры 27F и 1492R также, как описано для штамма Pseudomonas protegens VKM B-3844D в Примере 1. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК проводили с помощью редактора последовательностей BIOEDIT (http://www.jwbrown. mbio.ncsu.edu) и инструмента UGENE Unipro (https://ugene.net/ru/download.html), а также программы BLAST в базе данных NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Штамм способен к росту на таких средах, как гидролизат рыбной муки (ГРМ), Plate Count Agar (PCA), трибутириновый агар (ТБА), минеральная среда с пальмовым маслом в конечной концентрации 1%. Штамм образовывал зоны гидролиза на диагностической среде с трибутирином, что свидетельствует о продукции клетками внеклеточных липолитических ферментов. Кроме того, штамм рос на жидкой синтетической среде с пальмовым маслом (1% v/v) в качестве единственного источника углерода и при 28°C максимальная численность Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D составляла 9.47×10⁸ кл/мл. На минеральной среде с пальмовым маслом (1%) рост составлял 2-3 суток с образованием численности 10⁸-10⁹ кл/мл при температуре 15-40°C, оптимум 32°C.

Рост на богатых питательных средах составлял 1-2 суток при температуре 28°C. Диапазон рН для роста 4-10, оптимум 7.5. Диапазон температур для роста 4-50°C, оптимум 32-40°C.

Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D в лабораторных условиях поддерживали способом периодических пересевов 1 раз в 2-3 месяца на агаризованную среду Plate Count Agar (PCA) состава: дрожжевой экстракт 2.5 г/л; NaCl 5.0 г/л; D-глюкоза 1.0 г/л; пептон сухой ферментативный 5.0 г/л; агар микробиологический 15.0 г/л, вода дистиллированная до 1.0 л.

Пример 4. Способ коллекционного (долговременного) хранения штамма Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D

Штамм Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D выращивают на жидкой оптимальной питательной среде (например, PCA) путем внесения 5% инокулята и культивирования в течение 24 часов при температуре 28°C. В экспоненциальной фазе роста жидкую культуру осаждают центрифугированием и удаляют супернатант. К полученному осадку добавляют снятое молоко в качестве протектора. Суспензию клеток в протекторе разливают по стеклянным ампулам и обезвоживают методом лиофилизации. Хранение флаконов или ампул проводят при положительной температуре 4°C.

Пример 5. Применение консорциума Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D для биодеградации пальмового масла

Эксперименты проводили в стерильных условиях в стеклянных колбах объемом 19 л, содержащих 10 л минеральной питательной среды с добавлением 5% пальмового масла. Аэрацию осуществляли с помощью подачи стерильного воздуха в колбы с помощью компрессора. В экспериментальные колбы добавляли 2% инокулята - жидкую культуру штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D, выращенных по отдельности, в соотношении 1:1. Культивирование проводили при комнатной температуре 22-23°C. В эксперименте А для наблюдения за динамикой процессов деструкции через 5, 10 и 15 суток фиксировали визуальные изменения в культуральной жидкости, а также собирали остатки масла и проводили анализ кислотного и перекисного числа. Эксперимент В включал экспериментальную колбу с консорциумом (опыт) и контрольную колбу без добавления инокулята (контроль), включая анализ кислотного и перекисного числа через 15 суток инкубирования при описанных выше условиях.

По результатам эксперимента А через 5 суток культивирования общая численность консорциума составляла не менее 10⁸ кл/мл и не снижалась до конца эксперимента А. Значительная часть пальмового масла эмульгировала в питательную среду. Значения кислотного числа увеличилось по сравнению с сырым пальмовым маслом в 32, 132 и более чем в 240 раз через 5, 10 и 15 суток эксперимента по биодеструкции, что свидетельствует об активных процессах гидролиза пальмового масла под воздействием консорциума штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D.

В эксперименте В показано, что в контрольной колбе под действием аэрации происходил химический гидролиз пальмового масла, однако в экспериментальной колбе под действием консорциума штаммов гидролиз проходил эффективнее, более чем в 3.2 раза (при сравнении кислотного числа). Показатели перекисного числа не менялись, что может свидетельствовать о том, что в ходе экспериментов не происходило процессов химического или биологического образования перекисных соединений. Кроме того, в культуральной жидкости происходило увеличение количества свободных жирных кислот (С16:1, С18:2) и изменение их состава. Под воздействием консорциума появлялись жирные кислоты 18:0, 18:1, которых не обнаружено в химическом контроле без внесения консорциума.

Пример 6. Применение консорциума Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D для биодеградации отходов производства пальмового масла

В качестве модели прудов-накопителей выступали стеклянные аквариумы объемом 5 л со смесью из 2 л нестерильной водопроводной воды и 100 г сырых жидких отходов из пруда-накопителя, находящегося на предприятии PT Agro Indomas, координаты места обора проб -0.9141973777308665, 116.83024569376929. Сырые жидкие отходы из пруда накопителя представляли собой вязкую массу с высоким (89.5%) содержанием пальмового масла. С помощью компрессора в двух аквариумах были созданы условия аэрации толщи воды, в один из которых (опыт) был внесен консорциум штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D в количестве, соответствующем 10⁹ кл/мл на 1 м³ жидких отходов. В качестве контрольных (без внесения консорциума штаммов) выступали аквариум без аэрации (контроль 1) и аквариум с аэрацией (контроль 2). Эксперимент проводился при комнатной температуре около 22°C. Продолжительность эксперимента составила 33 суток. Меньше, чем через 24 ч в опытном аквариуме наблюдали помутнение воды, что свидетельствует об активном росте внесенного консорциума и развитии бактериальной биомассы. Плотные вязкие отходы с большим содержанием масла (массовая доля жира - 89.5%), использованные для проведения эксперимента и анализа их деструкции, оставались нерастворимыми на протяжении всего эксперимента и покрывали поверхность жидкости в аквариумах. Однако по завершении эксперимента внешний вид и консистенция отходов из опытного аквариума с консорциумом отличались от образцов из контрольных аквариумов. Результаты анализа показали, что экспериментальный образец (опыт) содержал наименьшее количество жира в сухом веществе (64.28%) по сравнению с контролем 2 (68.5%) и контролем 1 (82.01%). Кроме того, в экспериментальном аквариуме выявлено значимое повышение таких свободных жирных кислот, как C18:2 и C18:3 (показатели измеренной площади пика увеличились со 192.27 до 1378.97 мВ⋅сек и с 50.00 до 118.25 мВ⋅сек, соответственно), что свидетельствует о деструкции жиросодержащих отходов сточных вод предприятий пищевой промышленности под влиянием консорциума липофильных бактериальных штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D.

Таким образом, получен консорциум липофильных бактериальных штаммов Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia paraffinivorans VKM Ac-3071D для биодеградации пальмового масла, отличительной особенностью которого является объединение в одной ассоциации двух штаммов бактерий, способных к активному росту в среде с пальмовым маслом в качестве единственного органического вещества. Полученный консорциум может применяться в технологиях биоремедиации жидких отходов производства пальмового масла (POME).

Список использованных источников

1. Dominic D., Baidurah S. Recent developments in biological processing technology for palm oil mill effluent treatment - A review // Biology - 2022. - Vol. 11. - P. 525.

2. Araya R., Tani K., Takagi T., Yamaguchi N., Nasu M. Bacterial activity and community composition in stream water and biofilm from an urban river determined by fluorescent in situ hybridization and DGGE analysis. FEMS Microbiol. Ecol. 2003; 43(1): 111-119. DOI 10.1111/j.15746941.2003.tb01050.x.

3. Герасимчук А.Л., Ивасенко Д.А., Трифонов А.А., Топилина Ю.С., Сысоева А.Н., Франк Ю.А. Поиск и выделение липофильных бактерий для утилизации отходов производства пальмового масла // В книге: БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ. Материалы международного конгресса. Москва, 2023. С. 114-116.

4. Xue Y, Sun X, Zhou P, Liu R, Liang F, Ma Y. Gordonia paraffinivorans sp. nov., a hydrocarbon-degrading actinomycete isolated from an oil-producing well. Int J Syst Evol Microbiol. 2003 Sep;53(Pt 5):1643-1646. doi: 10.1099/ijs.0.02605-0. PMID: 13130063.

5. [DeLong E.F. Archaea in coastal marine environments // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1992. - Vol. 89, Iss. 12. - P. 5685-5689. - DOI: 10.1073/pnas.89.12.5685.

6. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // Journal of Bacteriology - 1991. - Vol. 173, Iss. 2. - P. 697-703. - DOI: 10.1128/jb.173.2.697-703.1991.

7. Герасимчук А.Л., Ивасенко Д.А., Касымова А.А., Франк Ю.А. Селективное культивирование бактериальных штаммов с липолитической и нефтеокисляющей активностью из донных осадков реки Оби в Западной Сибири // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2022. Т. 26. № 5. С. 449-457. DOI: 10.18699/VJGB-22-55.

8. Yamamoto S., Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their application to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains // Appl Environ Microbiol. 1995. V. 61(3). P. 1104-1109. doi: 10.1128/aem.61.3.1104-1109.1995.

9. Bell P.J.L., Sunna A., Gibbs M.D., Curach N.C., Nevalainen H. and Bergquist P.L. Prospecting for novel lipase genes using PCR // Microbiology - 2002. - Vol. 148. - P. 2283-2291.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к консорциуму липофильных бактериальных штаммов для биодеградации пальмового масла, состоящему из Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia parafinivorans VKM Ac-3071D в соотношении 1:1. Данный консорциум липофильных бактериальных штаммов может быть использован для деструкции жидких отходов производства пальмового масла. Задачей данного изобретения является получение нового консорциума липофильных бактериальных штаммов для биодеградации пальмового масла, отличительной особенностью которого является объединение в одной ассоциации двух штаммов бактерий, способных к активному росту в среде с пальмовым маслом в качестве единственного источника органического вещества. 6 пр.

Консорциум липофильных бактериальных штаммов для биодеградации пальмового масла, состоящий из Pseudomonas protegens VKM B-3844D и Gordonia parafinivorans VKM Ac-3071D в соотношении 1:1.