ЭКЗОСОМЫ РАСТЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВОЗНИКАЮЩИХ ИЗ-ЗА АГРЕГАТОВ БЕЛКА, СФОРМИРОВАННЫХ В КЛЕТКАХ Российский патент 2024 года по МПК A61K36/18 A61P25/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению экзосом растений для уменьшения агрегатов белка, сформированных в клетках, и повреждения, которое они вызывают в клетках.

Уровень техники для изобретения

Боковой амиотрофический склероз (ALS) представляет собой заболевание, которое вызывает потерю моторных нейронов, обеспечивающих движение произвольно сокращающихся мышц, и которое приводит к мышечной атрофии и инсульту. В соответствии с проведенными исследованиями, частота встречаемости ALS во всем мире составляет 2,7 на 1000000 человек [1]. Начало первых симптомов заболевания наблюдают в возрасте 45-70 лет. Симптомы прогрессируют с потерей способностей к движению, письму и речи и приводят к смерти в результате дыхательной недостаточности из-за инсульта. Пациента теряют в пределах в среднем двух-пяти лет после диагностики заболевания [2].

Заболевание у 90% пациентов с ALS, по-видимому, является спорадическим, независимым от причин наследственности. Остальные случаи называют семейным ALS, и он возникает в результате наследования генетических мутаций, 13 из которых определены с использованием исследований, проведенных до настоящего времени, от родителей к их детям. Среди этих генов мутации супероксиддисмутазы 1 (SOD1) наблюдают в 20% случаев наследственного ALS и в 5% случаев, которые считают спорадическими [3].

Известно, что антиоксиданты играют важную роль в процессе заболевания ALS. Ген SOD1 кодирует фермент, который служит антиоксидантом. Мутантный SOD1, образованный в результате мутации, сворачивается отличным образом (неправильно сворачивается) от его здоровой формы, вызывая образование агрегатов белка, что приводит к гибели нейронов [4, 5, 6]. Другие исследования показали, что мутантная форма гена вызывает окислительное повреждение, приводящее к апоптозу моторных нейронов и, таким образом, к ALS [7]. Показано, что лекарственные средства, которые ингибируют продукцию мутантного фермента SOD1 и уменьшают окислительное повреждение, для лечения ALS, являются эффективными для замедления процесса заболевания.

Клетки млекопитающих включают малые везикулярные структуры, называемые экзосомами. Когда эти экзосомы выделены из здоровых клеток, их можно использовать для восстановления клеток, которые являются поврежденными или подверженными определенному стрессу, и которые не могут завершить свою саморегенерацию, обратно до своего более раннего здорового состояния [8]. В последнее время использование стволовых клеток в видах терапии на основе клеток также является одним из самых многообещающих исследований. Утверждают, что использование экзосом, высвобожденных из этих клеток, может оказывать положительные эффекты на заживление ран и рост/укрепление волос в клиническом применении [9].

Везикулы представляют собой малые мешочки, которые вовлечены в транспорт и хранение веществ внутри клеток и отделены по меньшей мере одним липидным бислоем от цитоплазматической жидкости. Экзосомы представляют собой везикулы, которые высвобождаются множеством организмов от прокариот до высших эукариот и растений, и которые содержат липидные бислойные везикулы различных размеров [10]. Важность этих везикул лежит за пределами способности к переносу информации к другим клеткам для влияния на функцию клеток. Передачу сигналов посредством экзосом осуществляют посредством биомолекул во многих различных категориях, состоящих из белков, липидов, нуклеиновых кислот и сахаров [11].

Функциональные взаимодействия внеклеточных везикул с клетками впервые обнаружены в 1982 г. после экспериментального определения того, что везикулы, выделенные из семенной плазмы, увеличивают подвижность спермы [12]. С этого момента проводили исследования на многих различных тканях до настоящего времени для разработок, относящихся к молекулярному механизму везикул и прояснению оставшихся неясных проблем.

Хотя не существует исследования, проведенного на клетках, относящегося к эффектам жизнеспособности и стимуляции роста волос для экзосом растений, применительно к агрегатам, сформированным в клеткам, характеризацию экзосом растений и их эффекты на клетки злокачественных опухолей начали исследовать [13].

Лекарственные средства, используемые в лечении ALS, предназначены для уменьшения симптомов у пациентов и продления их продолжительности жизни. Эти лекарственные средства имеют серьезные побочные эффекты, и их эффективность является низкой. Два из наиболее часто используемых лекарственных средств приведены ниже:

• Эдавор (Радикава): Этот антиоксидант, который вводят внутривенно, предназначен для предотвращения разрушения нейронов. Эффект лекарственного средства на ALS не полностью известен. Его побочными эффектами являются гематомы на теле, нарушения походки и головные боли.

• Рилузол (Рилутек): Это перорально вводимое лекарственное средство систематически уменьшает уровни глутамата в организме. Оно вызывает расстройство желудка, головокружение и гематомы на теле.

В Международной патентной заявке no. документа WO 2018102397, заявке, известной на предшествующем уровне техники, описано использование экзосом для доставки лекарственных средств. Микровезикулы продуцируются из множества типов клеток, и среди них есть также клетки растений. Нагруженные лекарственным средством экзосомы по указанному изобретению используют для лечения или уменьшения тяжести различных заболеваний, где одно из этих заболеваний представляет собой боковой амиотрофический склероз (ALS). В патентную заявку no. WO 2018102397 включено использование различных экзосом для доставки другого лекарственного средства. Терапевтический эффект обеспечивают не посредством экзосом, но посредством лекарственного средства, которое они несут.

В Международной патентной заявке no. документа WO 2016033696, заявке, известной на предшествующем уровне техники, описан способ получения и использования экзосом и полученных посредством биоинженерии экзосом. Экзосомы можно получать из не относящихся к млекопитающим клеток, и термин «не относящиеся к млекопитающим клетки» включает экзосомы из растений и овощей. Одной из областей, в которых используют экзосомы, является лечение метаболического синдрома у млекопитающих, и одним из этих метаболических синдромов является боковой амиотрофический склероз (ALS). В Патентной заявке no. документа WO 2016033696 описан сбор экзосом, продуцированных индивидуумами после физической активности, в течение 4 часов после физической активности. Экзосомы продуцируются с нагрузкой, специфической для источника, из которого они получены, типа клетки, из которой они продуцированы, и состояния стимуляции и стресса, которое указанная клетка испытывает в это время, и они действуют в соответствии с указанной нагрузкой. В указанном исследовании заявлены экзосомы в условиях, которые там указаны.

В Патентной заявке США no. документа US 20170307638, заявке, известной на предшествующем уровне техники, описан способ основанной на биологических жидкостях диагностики нейродегенеративного заболевания путем высокочувствительного иммуноанализа агрегированных белков посредством индуцированной фотоокислением амплификации. В рамках объема способа по указанному изобретению, в ходе получения образца биологической жидкости, проводят стадии способа экстракции экзосом из биологической жидкости, выделения нейрональных экзосом из указанных экстрагированных экзосом или лизиса экзосом для получения образца, подлежащего анализу. Нейрональная дисфункция может быть индуцирована посредством токсичных и легко поддающихся агрегации белков, и множество неврологических заболеваний характеризуются таким состоянием. Одним из этих заболеваний является заболевание боковой амиотрофический склероз (ALS). Указанное изобретение предназначено для диагностики индивидуумов с нейродегенеративными заболеваниями посредством агрегатов белков внутри экзосом, продуцированных их нейронами.

В Европейской патентной заявке no. документа EP 1165789 одной из заявок, известных на предшествующем уровне техники, описаны ассоциированные с везикулами белки (VEAS) и способы диагностики, лечения или предотвращения нарушений, ассоциированных с экспрессией VEAS. Одним из заболеваний, лечение или предотвращение которого является целью в рамках объема указанного изобретения, является заболевание боковой амиотрофический склероз (ALS). Подобно упомянутой ранее патентной заявке, описанное изобретение предназначено полностью для диагностических целей. В указанном документе, экзосомы, полученные из его/ее собственного профиля, используют для диагностических целей.

В Европейской патентной заявке номер документа EP2756847, одной из заявок, известных на предшествующем уровне техники, описано лекарственное средство для предотвращения или лечения болезни Альцгеймера. Это лекарственное средство содержит мембранные везикулы (экзосомы) происходящих из жировой ткани мезенхимальных стволовых клеток, и мембранные везикулы (экзосомы) содержат неприлизин. Эти содержащие неприлизин мембранные везикулы (экзосомы) осуществляют деградацию амилоида-β в качестве патогенного белка для болезни Альцгеймера. Когда эти экзосомы вводят в головной мозг модельных мышей для болезни Альцгеймера, образование амилоида-β ингибируют. В документе указанной патентной заявки используют экзосомы, происходящие из стволовых клеток жировой ткани. Причиной для выбора стволовых клеток жировой ткани в качестве источника является то, что эти экзосомы содержат белок неприлизин, который осуществляет деградацию амилоидных бляшек. Одним из факторов, влияющих на нагрузку экзосомы, является тип клетки. Ни одна экзосома не может являться одинаковой с другой экзосомой. Различия в их нагрузках позволяет каждой из них показывать различные результаты. В то время как для экзосом жировых клеток не показывают эффектов экзосом растений авторов настоящего изобретения на агрегаты белков, таким же образом, в равной степени, для экзосом растений могут не показывать этого эффекта, проявляемого экзосомами жировой ткани.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является уничтожение агрегатов посредством применения экзосом, таким образом, их использование для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как ALS, которые вызваны агрегатами белка, сформированными в клетках. (Уменьшение агрегатов показано на фигуре 1).

Другой целью настоящего изобретения является предоставление лекарственного средства с высокой эффективностью и без побочных эффектов, которое можно получать в высоких количествах и по приемлемой цене благодаря тому факту, что оно происходит из растений.

Подробное описание изобретения

«Экзосомы растений, используемые для лечения заболеваний, возникающих из-за агрегатов белка, сформированных в клетках», разработанное для удовлетворения цели настоящего изобретения, проиллюстрировано в сопутствующих фигурах, где,

Фигура 1 является графическим представлением эффекта экзосом граната, вводимых в различных дозах в клетки, в которых сформированы агрегаты посредством введения бафиломицина A1, верапамила и MG132, на формирование агрегатов.

Фигура 2 является графическим представлением изменений уровней экспрессии гена NF-kB для экзосом граната, ананаса и сельдерея, вовлеченных в разрушение агрегатов после введения верапамила.

На фигуре 3 показано (a) графическое представление, демонстрирующее посредством проточной цитометрии, что полученные экзосомы растений и характеризация распределения их размеров являются положительными по маркерам CD9, HSP70 и CD63, и (b) графическое представление распределения размеров экзосом.

Настоящее изобретение относится к применению экзосом растений для лечения заболеваний, вызванных агрегатами белка, сформированными в клетках. Нейродегенеративные заболевания, такие как заболевание боковой амиотрофический склероз (ALS), можно перечислить среди этих заболеваний. В рамках объема изобретения экзосомы растений используют отдельно, и экзосомы растений сами уменьшают агрегаты белков.

Наивысшие значения агрегации белков, т.е. формирования агрегатов, представляют собой значения, возникающие при введении MG132, верапамила и бафиломицина, и являются токсичными для клеток. Низшее значение указано как контроль на фигуре 1, то есть оно показывает здоровую клетку. Подобным образом на фигуре 1 видно, что при введении различных концентраций экзосом, агрегаты, т.е. агрегация белка, значимо уменьшается.

Эффективные дозы экзосом растений, включенные в объем изобретения, показаны на фигурах 1 и 2. Для живых организмов эти значения эффективной дозы могут отличаться в зависимости от возраста, массы и пола пациента. Как можно понять из этих фигур, количество агрегосом постепенно уменьшается с увеличением количества экзосом (граната) (25, 50 и 100 мкг/мл), вводимых в клетки, в которых сформированы агрегаты посредством введения бафиломицина A1, верапамила и MG132. Кроме того, несмотря на то, что эти экзосомы можно использовать в различных комбинациях, определен ряд применений. Как можно также видеть на фигурах, эффекты экзосом растений, необходимые для удаления агрегатов из клеток, определяли в соответствии с результатами тестов измерения агрегатов, показанных на фигуре 1. На фигуре 2 показано, что не только гранат, но также другие растения могут служить для разрушения агрегатов. Экзосомы растений, полученные посредством выделения из по меньшей мере одного из растений граната, ананаса и сельдерея, используют в рамках объема изобретения (как можно видеть на фигуре 2). В одном варианте осуществления изобретения экзосомы растений используют в эффективных дозах в диапазонах уровней экзосом 10 мкг-1 мг для лечения заболеваний, вызванных посредством агрегатов белка, сформированных в клетках. Некоторые заболевания, вызванные указанной агрегацией белков, являются следующими: болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз (ALS) и прионные заболевания.

Эффективные уровни экзосом растений, включенные в объем изобретения, могут меняться в зависимости от частей растений, из которых можно выделять экзосомы. В то время как они могут представлять собой целое растение, плод, лист, семя и корень, они могут также представлять собой дифференцированные ткани, подобные культуральной среде, стволовой клетке, отходам, шелухе или флоэме растений. Экзосомы растений можно выделять множеством способов, таких как выделение посредством двухфазного разделения, ступенчатого центрифугирования, ультрафильтрации, хроматографических способов, выделение на основе полимеров и выделение посредством микробусин. Стадии подготовки для способа выделения с использованием двухфазной жидкостной системы, которая позволяет выделение самых чистых экзосом, являются следующими: частицы большого размера, полученные в результате измельчения растений, при центрифугировании, проводимом между 2000 g и 10000 g в течение 5-20 минут для выделения экзосом из лизата растений, не должны вызывать никаких примесей в фазе декстрана при преципитации, благодаря центрифугированию, используемому в процессе двухфазного разделения, и их массам. Кроме того, это гарантирует, что фильтр, который используют в ходе процесса фильтрации, проводимого для удаления частиц размером 220 нанометров и выше, не закупоривается. Двухфазную жидкостную систему рекомендуют использовать для разделения гомогенной смеси экзосом-белков, полученной в результате стадий подготовки. Экзосомы очищают от неэкзосомных белков, клеточных жиров и других примесей посредством использования химической склонности фазы PEG к белкам и фазы DEX к фосфолипидным структурированным мембранам в двухфазной жидкостной системе. Фаза DEX, образованная посредством концентраций полимеров, которые используют в растворе, отделяет экзосомы. Выделенные экзосомы помечают посредством антител против поверхностных маркеров CD9, CD63 и HSP70, которые несут экзосомы, и экзосомы, несущие эти маркеры, измеряют посредством устройства для проточной цитометрии. В то же самое время размеры выделенных экзосом измеряют посредством устройства Zeta Sizer (Malvern Zetasizer ZS) (Фигуры 1-3).

Поскольку объектом изобретения является «применение экзосом растений для уменьшения агрегатов белка, сформированных в клетках, и повреждений, которые они могут вызывать в клетке», в процессе разработки изобретения агрегаты экзосом растений, которые могут формировать агрегаты в биологической системе на клетках, проверяли на протяжении 3 различных путей. Бафиломицин A1 использовали для представления агрегатов, сформированных из-за нарушений энергетического метаболизма. Верапамил использовали для представления агрегации, вызванной разрушением кальциевых каналов. MG132 представляет агрегацию, связанную с повреждением и неправильным функционированием протеаз, вовлеченных в разрушение агрегатов. Несмотря на то, что агрегация возникает в клетках из-за таких причин, как стресс, старение, радиация, накопление химических веществ, возникновение механизмов агрегации можно было имитировать с использованием этих 3 химических веществ.

В рамках объема изобретения, для определения эффектов экзосом растений на агрегацию, измеряли количества агрегатов и проводили анализы уровней генов. Способ, который используют для детекции этих агрегатов после формирования агрегатов в клетках посредством введения верапамила, MG132 и бафиломицина, является следующим;

1. Среду из клеток удаляют и промывают дважды с использованием 200 мкл 1X PBS. (приблизительно 200 мкл является достаточным для покрытия площади поверхности 1 см².)

2. PBS осторожно удаляют, и клетки фиксируют с использованием 200 мкл 4% раствора параформальдегида в течение 30 минут при комнатной температуре.

3. После удаления 4% раствора параформальдегида, клетки промывают дважды с использованием 200 мкл PBS.

4. После удаления PBS клетки инкубируют на льду в течение 30 минут с раствором, содержащим 0,5% Triton X-100, 3 мМ ЭДТА (pH 8), для увеличения проницаемости мембраны.

5. После промывки дважды с использованием PBS клетки инкубируют с 200 мкл раствора для детекции (1 мкл красителя для определения агрегации Proteostate, 2 мкл Hoechst 33342) в течение 30 минут в темноте.

6. После инкубации клетки промывают с использованием 200 мкл PBS и затем покрывают на покровных стеклах адгезивным раствором.

7. Окрашенные клетки анализировали под конфокальным микроскопом (40X увеличение). Фильтр для техасского красного используют для визуализации агрегатов клеток, и фильтр для DAPI используют для детекции ядер клеток.

В процессе разработки изобретения уровни экспрессии гена NFB также измеряли для определения механизма экзосом, вызывающего разрушение агрегатов в клетке. Культивированные клетки могут терять свои собственные свойства и приобретать новые свойства. Эти свойства могут присутствовать как на морфологическом уровне, так и на уровне экспрессии генов. Способ ПЦР с детекцией в реальном времени использовали для наблюдения изменений в уровне экспрессии генов. Тотальные РНК выделяли, и кДНК синтезировали из клеток, которые были рассеяны в 6-луночные культуральные планшеты (Corning Glasswork, Corning, NY) при 50000 клеток/лунку в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM). Синтезированные кДНК смешивали с праймерами в продукте готовой смеси Fermentas Maxima SYBR Green, так чтобы конечный объем составлял 20 мкл, и уровни экспрессии генов анализировали с использованием устройства BIO-RAD.

Благодаря использованию экзосом растений для уменьшения агрегатов белка, сформированных в клетках, и повреждения, которое они вызывают в клетке, в рамках объема изобретения, можно получать лекарственное средство, которое имеет высокую эффективность, и без побочных эффектов, и которое можно получать в больших объемах и по приемлемой цене. Кроме того, благодаря тому факту, что это лекарственное средство имеет растительное происхождение и не является трансгенным, предложен надежный продукт с приемлемой ценой.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

[1]. Chiò A, Logroscino G, Traynor B, Collins J, Simeone J, Goldstein L, White L: Global epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis: a systematic review of the published literature. Neuroepidemiology 2013;41:118-130.

[2]. Kiernan MC, Vucic S, Cheah BC, Turner MR, Eisen A, Hardiman O, Burrell JR, Zoing MC: Amyotrophic lateral sclerosis. The Lancet 2011;377:942-955.

[3]. Rowland LP, Shneider NA: Amyotrophic lateral sclerosis. New England Journal of Medicine 2001;344:1688-1700.

[4]. Durham HD, Roy J, Dong L, Figlewicz DA: Aggregation of Mutant Cu/Zn Superoxide Dismutase Proteins in a Culture Model of ALS. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology 1997;56:523-530.

[5]. Karch CM, Prudencio M, Winkler DD, Hart PJ, Borchelt DR: Role of mutant SOD1 disulfide oxidation and aggregation in the pathogenesis of familial ALS. Proceedings of the National Academy of Sciences 2009;106:7774-7779.

[6]. Cleveland DW, Liu J: Oxidation versus aggregation - how do SOD1 mutants cause ALS? Nature medicine 2000;6:1320.

[7]. Estévez AG, Crow JP, Sampson JB, Reiter C, Zhuang Y, Richardson GJ, Tarpey MM, Barbeito L, Beckman JS: Induction of Nitric Oxide--Dependent Apoptosis in Motor Neurons by Zinc-Deficient Superoxide Dismutase. Science 1999;286:2498-2500.

[8]. Beach, A., Zhang, H. G., Ratajczak, M. Z., &Kakar, S. S. (2014). Exosomes: an overview of biogenesis, composition and role in ovarian cancer. Journal of ovarian research, 7(1), 1-11.

[9]. Levi, S. K., Yeo, M. S. W., Chen, T. S., & Lai, R. C. (2011). U.S. Patent Application 13/879905.

[10]. Ludwig, A. K. and B. Giebel (2012). «Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication.» Int J Biochem Cell Biol 44(1): 11-15.

[11]. Iraci, N., T. Leonardi, F. Gessler, B. Vega and S. Pluchino (2016). «Focus on Extracellular Vesicles: Physiological Role and Signalling Properties of Extracellular Membrane Vesicles.» Int J Mol Sci 17(2): 171.

[12]. Stegmayr, B. and G. Ronquist (1982). «Promotive effect on human sperm progressive motility by prostasomes.» Urol Res 10(5): 253-257.

[13]. Raimondo S, Naselli F, Fontana S, et al. Citrus limon-derived nanovesicles inhibit cancer cell proliferation and suppress CML xenograft growth by inducing TRAIL-mediated cell death. Oncotarget. 2015;6(23):19514-19527.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Раскрыто применение экзосом растений для уменьшения агрегатов белка, сформированных в клетках, и повреждения, которое они вызывают в клетке. Изобретение позволяет использовать продукт с высокой эффективностью и без побочных эффектов, который можно получать в высоких количествах и по приемлемой цене, благодаря тому факту, что он имеет растительное происхождение. 3 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Применение экзосомы растений, полученной посредством выделения из по меньшей мере одного из растений граната, ананаса и сельдерея, для уменьшения агрегатов белка, сформированных в клетках, и повреждения, которое они вызывают в клетках.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что экзосома растения применяется в эффективной дозе в диапазонах уровней экзосом 10 мкг-1 мг.

3. Применение по п.1, где экзосома растения получена при выделении из по меньшей мере одного из целого растения, плода, листа, семени, корня, так же как культуральной среды, стволовой клетки, отходов, шелухи и флоэмы растений.

4. Применение по п.3, где экзосома растения получена при выделении из растений посредством по меньшей мере одного из способов выделения из двухфазного разделения, ступенчатого центрифугирования, ультрафильтрации, хроматографических способов, выделения на основе полимеров и выделения посредством микробусин.