Ферменты лактазы с улучшенной активностью при низких температурах Российский патент 2023 года по МПК A23C9/12 C12N9/38 A23C9/20 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам получения молочного продукта и к способам снижения содержания лактозы в молочном продукте с использованием новых пептидов или димерных пептидов, проявляющих активность бета-галактозидазы, с улучшенной активностью при низких температурах.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Для роста молочнокислых бактерий на молоке оптимальным путем получения ими глюкозы и галактозы в качестве источника углерода является гидролиз лактозы. Лактаза (бета-галактозидаза; ЕС 3.2.1.23) представляет собой фермент, который осуществляет стадию гидролиза молочного сахара лактозы до моносахаридов. В коммерческих целях лактазу используют для расщепления лактозы в молочных продуктах. Лица с непереносимостью лактозы испытывают затруднения при переваривании молочных продуктов с высоким содержанием лактозы. По расчетам примерно 70% населения мира обладает ограниченной способностью к перевариванию лактозы. Соответственно, растет потребность в молочных пищевых продуктах, не содержащих или содержащих лишь низкие концентрации лактозы.

Лактазы выделены из широкого ряда организмов, включая такие микроорганизмы, как Kluyveromyces и Bacillus. Распространенным источником грибных лактаз являются дрожжи Kluyveromyces, в частности K. fragilis и K. lactis, и другие грибы, например родов Candida, Torula и Torulopsis, при этом хорошо известными источниками бактериальных лактаз являются В. coagulans и В. circulans. В продаже имеется несколько полученных из этих организмов коммерческих препаратов, таких как Lactozym® (производства компании Novozymes, Дания), HA-Lactase (производства компании Chr. Hansen, Дания) и Maxilact® (производства компании DSM, Нидерланды), все из K. lactis. Все эти лактазы представляют собой так называемые нейтральные лактазы, имеющие оптимум рН от рН 6 до рН 8, а также температурный оптимум примерно 37°С. При применении таких лактаз в производстве, например, йогурта с низким содержанием лактозы обработку ферментом либо необходимо проводить на отдельной стадии, предшествующей ферментации, либо чаще всего приходится использовать высокие дозы ферментов, поскольку их активность будет падать по мере снижения рН в процессе ферментации.

Характерный способ получения пастеризованного молока с пониженным содержанием лактозы включает добавление к молоку фермента лактазы с последующей длительной инкубацией (10-48 ч, часто 24 ч) при температурах примерно 6°С. Поскольку активность Ha-Lactase и NOLA® Fit находится в диапазоне 45-70 мкмоль в минуту на мг фермента, для достижения желаемого содержания остаточной лактозы требуются дозы фермента 55-70 мг/л и 45-60 мг/л соответственно. Ферменты Ha-Lactase и NOLA® Fit имеют оптимум температуры примерно 37°С. Более длительная инкубация молока при 37°С может приводить в результате к росту микроорганизмов

Эти лактазы также не подходят для гидролиза лактозы в молоке, проводимого при высокой температуре, что в некоторых случаях было бы полезно для поддержания микроорганизмов в малом количестве и, следовательно, гарантии высокого качества молока. Кроме того, известные лактазы не подойдут для применения, если желателен процесс производства ультрапастеризованного молока (UHT), в котором ферменты добавляют до обработки UHT.

WO 92/13068 относится к композициям, обладающим активностью лактазы, полученным в результате обработки ультразвуком клеток микроорганизмов - бактерий или дрожжей. WO 2010092057 и WO 0104276 относятся к бета-галактозидазам, активным при низкой температуре. WO 07110619 относится к бета-галактозидазе с высокой активностью транс-галактозилирования, где WO 2009071539 относится к бета-галактозидазе со сниженной активностью транс-галактозилирования.

ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача воплощений изобретения состоит в разработке способов применения бета-галактозидаз, обеспечивающих получение усовершенствованных безлактозных или низколактозных продуктов при низких температурах.

Дополнительная задача воплощений изобретения состоит в разработке способов применения бета-галактозидаз со свойствами, улучшающими снижение содержания лактозы в продукте, таком как безлактозные или низколактозные продукты.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Автор(-ы) настоящего изобретения идентифицировал(-и) бета-галактозидазы, обладающие прежде не описанными свойствами, обеспечивающими получение усовершенствованных безлактозных или низколактозных продуктов, а также обеспечивающими усовершенствованные способы получения таких безлактозных или низколактозных продуктов. В частности, показано, что эти бета-галактозидазы обладают высокой стабильностью при относительно высокой активности в очень широких диапазонах значений температуры, а также рН. Их также можно применять при определенных температурах, например, при высоких температурах, и значениях рН, обычно не рассматриваемых для этих ферментов. Прежде всего, это обеспечивает возможность использования бета-галактозидаз при определенных значениях рН и температуры, которая прежде не была известна. Это также обеспечивает применение одного и того же конкретного фермента в нескольких различных областях применения с высокой потребностью в промышленности.

В первом аспекте настоящего изобретения предложены способы получения молочного продукта, включающие:

(а) смешивание субстрата на молочной основе, содержащего лактозу в концентрации по меньшей мере 10 г/л, и пептида или димерного пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, в концентрации от 10 до 55 мг/л, например, от 20 до 55 мг/л;

(б) инкубацию смеси при температуре от 1°С до 10°С в течение периода времени, достаточного для снижения концентрации лактозы в смеси до менее 0,2 г/л.

В родственном воплощении настоящего изобретения предложены способы снижения содержания лактозы в субстрате на молочной основе, включающие:

(а) смешивание субстрата на молочной основе, содержащего лактозу в концентрации по меньшей мере 10 г/л, и пептида или димерного пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, в концентрации от 10 до 55 мг/л, например, от 20 до 55 мг/л;

(б) инкубацию смеси при температуре от 1°С до 10°С в течение периода времени, достаточного для снижения концентрации лактозы в смеси до менее 0,2 г/л.

Описанные выше способы можно осуществлять с помощью пептида или димерного пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, который может быть дополнительно охарактеризован как:

(1) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, 33, 14, 7, 9, 11, 30 и 1, или пептид, имеющий идентичность аминокислотной последовательности более 85% с любой из этих последовательностей;

(2) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, 33, 14, 13, 19, 7, 9, 11, 26 и 27, 30 и 1, или пептид, имеющий идентичность аминокислотной последовательности более 85% с любой из этих последовательностей;

(3) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, или его обладающие ферментативной активностью фрагменты, или аминокислотная последовательность любого из них, имеющая не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 замен, добавлений или делеций аминокислот.

Преимущество способов по настоящему изобретению состоит в том, что для них требуется лишь низкая концентрация пептида или димерного пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, и при этом они значительно снижают концентрацию лактозы. В предпочтительной альтернативе пептид или димерный пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, добавляют в концентрации от 35 до 52 мг/л, в концентрации от 40 до 52 мг/л или в концентрации от 45 до 52 мг/л.

Субстрат на молочной основе может представлять собой любой субстрат, содержащий молоко. В одном аспекте описанных выше способов используют субстрат на молочной основе, представляющий собой:

(1) коровье молоко, овечье молоко, козье молоко, буйволиное молоко, верблюжье молоко или указанное молоко в пастеризованной и/или фильтрованной форме; или

(2) кисломолочный продукт, полученный из (1) путем ферментации.

В особенно предпочтительном воплощении изобретения в описанных выше способах в качестве субстрата на молочной основе используют коровье молоко, содержащее лактозу в концентрации от примерно 37 до 50 г/л, или это молоко в термически обработанной, пастеризованной, сырой и/или фильтрованной форме.

Описанные выше способы обеспечивают значительное снижение концентрации лактозы за короткий период времени. В некоторых воплощениях изобретения концентрация лактозы снижается до значения менее 0,2 г/л после инкубации в течение по меньшей мере 4 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 12 часов или по меньшей мере 24 часов.

Одно из преимуществ способов по настоящему изобретению заключается в снижении концентрации лактозы при низких температурах. Например, температура инкубации на стадии (б) описанных выше способов может находиться в диапазоне от 2°С до 7°С или в диапазоне от 3°С до 6°С.

Эти способы обеспечивают значительное снижение концентрации лактозы и предпочтительно при инкубации на стадии (б) концентрация лактозы в смеси снижается до менее 0,05 г/л, до менее 0,02 г/л или до менее 0,01 г/л.

Конкретный пептид или димерный пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, для применения в способах по изобретению обладает высокой активностью не только при низких температурах, но и при высоких температурах. Таким образом, в одном аспекте в изобретении предложен способ, как описано выше, в котором до или после инкубации при температуре от 1°С до 10°С смесь, содержащую субстрат на молочной основе и пептид или димерный пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, нагревают до температуры по меньшей мере 60°С в течение по меньшей мере четырех секунд. В частности, способ может включать в себя стадию нагревания, включающую нагревание до температуры 72°С в течение примерно 15 секунд до или после инкубации смеси при низких температурах на стадии (б) или нагревание до температуры 140°С в течение примерно четырех секунд до или после инкубации смеси при температуре от 1°С до 10°С.

В одной альтернативе способы по настоящему изобретению используют для получения молочного продукта. Эти способы могут дополнительно включать стадию ферментации субстрата на молочной основе молочнокислыми бактериями. Стадию ферментации выполняют до или после инкубации с пептидом или димерным пептидом, проявляющим активность бета-галактозидазы,

Эти способы особенно подходят для получения молочных продуктов, таких как кисломолочный продукт, сыр, йогурт, сливочное масло, молочный спред, пахта, напиток из сквашенного молока, сметана, напиток на основе молочной сыворотки, мороженое, сгущенное молоко, карамелизированное сгущенное молоко или ароматизированный молочный напиток.

В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложены способы получения молока или молочного продукта, включающие:

(а) смешивание субстрата на молочной основе, содержащего лактозу в концентрации по меньшей мере 10 г/л, и пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, в концентрации от 35 до 52 мг/л, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, 33, 14, 7, 9, 11, 30 и 1, или идентичность аминокислотной последовательности более 85% с любой из этих последовательностей;

(б) инкубацию смеси при температуре от 1°С до 10°С в течение 12 часов в условиях, достаточных для снижения концентрации лактозы в смеси до менее 0,2 г/л.

В дополнительном предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложены способы получения молока или молочного продукта, включающие:

(а) смешивание субстрата на молочной основе, содержащего лактозу в концентрации по меньшей мере 10 г/л, и пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, в концентрации от 35 до 52 мг/л, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, 33, 14, 7, 9, 11, 30 и 1, или идентичность аминокислотной последовательности более 85% с любой из этих последовательностей;

(б) инкубацию смеси при температуре от 1°С до 10°С в течение 12 часов в условиях, достаточных для снижения концентрации лактозы в смеси до менее 0,2 г/л,

где до или после инкубации при температуре от 1°С до 10°С смесь, содержащую субстрат на молочной основе и пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, нагревают до температуры по меньшей мере 60°С в течение по меньшей мере четырех секунд.

В дополнительном воплощении настоящее изобретение относится к применению пептида или димерного пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, для получения молочного продукта с пониженным содержанием лактозы при температуре от 1°С до 10°С в течение периода времени, достаточного для снижения концентрации лактозы в смеси до менее 0,2 г/л, где пептид или димерный пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, представляет собой:

(1) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, 33, 14, 7, 9, 11, 30 и 1, или пептид, имеющий идентичность аминокислотной последовательности более 85% с любой из этих последовательностей;

(2) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, 33, 14, 13, 19, 7, 9, 11, 26 и 27, 30 и 1, или пептид, имеющий идентичность аминокислотной последовательности более 85% с любой из этих последовательностей;

(3) пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или его обладающие ферментативной активностью фрагменты, или аминокислотная последовательность любого из них, имеющую не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 замен, добавлений или делеций аминокислот.

ПОДПИСИ К ФИГУРАМ

Фиг. 1. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 6,7 при 37°С с лактозой в качестве субстрата, описываемая как SUAL-1, обсуждаемая в примере 6. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 6%.

Фиг. 2. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 6,7 при 37°С в присутствии галактозы, описываемая как SUAG, обсуждаемая в примере 7. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 15%.

Фиг. 3. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 6,7 при 4°С с лактозой в качестве субстрата, описываемая как SUAL-2, обсуждаемая в примере 8. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 5%.

Фиг. 4. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 6,7 при 43°С с лактозой в качестве субстрата, описываемая как SUAL-3, обсуждаемая в примере 9. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 5%.

Фиг. 5. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 5,5 при 4°С с лактозой в качестве субстрата, описываемая как SUAL-4, обсуждаемая в примере 10. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 5%.

Фиг. 6. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 5,5 при 37°С с лактозой в качестве субстрата, описываемая как SUAL-5, обсуждаемая в примере 11. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 5%.

Фиг. 7. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 5,5 при 43°С с лактозой в качестве субстрата, описываемая как SUAL-6, обсуждаемая в примере 12. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 5%.

Фиг. 8. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 4,5 при 4°С с лактозой в качестве субстрата, описываемая как SUAL-7, обсуждаемая в примере 13. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 5%.

Фиг. 9. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 4,5 при 37°С с лактозой в качестве субстрата, описываемая как SUAL-8, обсуждаемая в примере 14. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 5%.

Фиг. 10. Удельная активность очищенных ферментов, определяемая при рН 4,5 при 43°С с лактозой в качестве субстрата, описываемая как SUAL-9, обсуждаемая в примере 15. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло менее 5%.

Фиг. 11. Процентное содержание остаточной лактозы в пастеризованном молоке после обработки фиксированным количеством фермента, определенное через 24 ч при 5°С с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Фиг. 12. Процентное содержание остаточной лактозы в ультрапастеризованном (UHT) молоке после обработки фиксированным количеством фермента, определенное через 24 ч при 25°С с помощью ВЭЖХ.

Фиг. 13. Процент остаточной активности очищенных ферментов при повышенных температурах, определенной с использованием лактозы в качестве субстрата. Активность при рН 6,7 при 37°С считали 100%-ной.

Фиг. 14. Процентное содержание остаточной лактозы, присутствующей в пастеризованном молоке после инкубации с ферментами лактазами при различной температуре, 37°С, 55°С или 60°С. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 15. Процентное содержание остаточной лактозы, присутствующей в пастеризованном молоке после инкубации с ферментами лактазами в концентрации 0,047 мг/мл. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг.16. Процентное содержание остаточной лактозы, присутствующей в пастеризованном молоке после инкубации с ферментами лактазами в течение различного времени реакции, в частности 15 или 30 минут. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 17. Процентное содержание остаточной лактозы, присутствующей в пастеризованном молоке после инкубации с ферментами лактазами при различных дозах фермента, в частности 0,047 мг/мл или 0,024 мг/мл. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 18. Процентное содержание остаточной лактозы, присутствующей в пастеризованном молоке после инкубации с ферментами лактазами при использовании различных доз и различного времени реакции. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 19. Процентное содержание остаточной лактозы, присутствующей в фильтрованном молоке после инкубации с ферментами лактазами при 55°С. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 20. Процентное содержание остаточной лактозы, присутствующей в фильтрованном молоке после инкубации с ферментами лактазами при 55°С и при различных дозах фермента. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 21. Процентное содержание остаточной лактозы, присутствующей в фильтрованном молоке после инкубации с ферментами лактазами при 55°С и в течение различного времени реакции. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 22. Кинетика гидролиза лактозы в пастеризованном молоке при 4°С с Ha-Lactase и NOLA® Fit в дозе 50 мг/л. Фермент смешивали с молоком и хранили при 4°С в течение различных интервалов времени. Количество остаточной лактозы определяли с помощью набора реактивов LactoSens® (Chr. Hansen, Дания). Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 23. Процентное содержание остаточной лактозы, измеренное через 12 и 24 ч после добавления ферментов. Фермент смешивали с молоком и хранили при 4°С в течение различных интервалов времени. Количество остаточной лактозы определяли с помощью набора реактивов LactoSens® (Chr. Hansen, Дания). Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 24. Кинетика гидролиза лактозы в пастеризованном молоке при 4°С с новыми лактазами в дозе 0,050 мг/мл. Фермент смешивали с молоком и хранили при 4°С в течение различных интервалов времени. Количество остаточной лактозы определяли с помощью набора реактивов LactoSens® (Chr. Hansen, Дания). NOLA® Fit и Ha-Lactase использовали в качестве контрольных образцов. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 25. Кинетика гидролиза лактозы в пастеризованном молоке при 4°С с отдельными новыми лактазами в дозе 0,050 мг/л. Измеренные значения содержания остаточной лактозы показаны на графике. Фермент смешивали с молоком и хранили при 4°С в течение различных интервалов времени. Количество остаточной лактозы определяли с помощью набора реактивов LactoSens® (Chr. Hansen, Дания). NOLA® Fit и Ha-Lactase использовали в качестве контрольных образцов. Измеренные значения содержания остаточной лактозы показаны на графике. Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 26. Влияние дозы фермента на гидролиз лактозы. Молоко инкубировали с различными дозами ферментов, смешивали и хранили при 4°С в течение 24 ч. Количество остаточной лактозы определяли с помощью набора реактивов LactoSens® (Chr. Hansen, Дания). Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет либо от 0,01% до 0,2%, либо от 0,02% до 1,0% лактозы.

Фиг. 27. Сравнение характеристик ферментов в различных типах молока. Молоко инкубировали с 0,052 мг/л фермента в пастеризованном и фильтрованном молоке, смешивали и хранили при 4°С в течение 24 ч. Количество остаточной лактозы определяли с помощью набора реактивов LactoSens® (Chr. Hansen, Дания). Предел обнаружения используемого в анализе набора реактивов LactoSens® составляет от 0,01% до 0,2% лактозы.

Фиг. 28. Измеренная удельная активность очищенных ферментов, определенная при рН 6,7 при различных температурах. Значения удельной активности определяли как количество микромоль (мкмоль) образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм фермента в данных условиях. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло 5-20%.

Фиг. 29. Измеренная удельная активность очищенных ферментов, определенная при рН 5,5 при различных температурах. Значения удельной активности определяли как количество микромоль (мкмоль) образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм фермента в данных условиях. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло примерно 5%.

Фиг. 30. Измеренная удельная активность очищенных ферментов, определенная при рН 4,5 при различных температурах. Значения удельной активности определяли как количество микромоль (мкмоль) образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм фермента в данных условиях. В данных условиях измеренное стандартное отклонение составляло примерно 5%.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что некоторые пептиды и димерные пептиды, проявляющие ферментативную активность бета-галактозидазы, неожиданно оказались стабильными при различных физических условиях и обладают относительно высокой активностью за пределами диапазонов, которые обычно рассматривают как оптимальные для этого класса ферментов.

Соответственно, авторами настоящего изобретения были идентифицированы ферменты, обладающие относительно высокой активностью при температуре примерно 4°С или 5°С, и поэтому их можно применять для гидролиза лактозы в производстве, например, свежего молока. Таким образом, эти новые ферменты особенно подходят для снижения содержания лактозы в продуктах на основе молока, таких как молочные продукты, при низких температурах.

Дополнительное преимущество этих новых улучшенных пептидов, проявляющих ферментативную активность бета-галактозидазы, состоит в том, что они характеризуются относительно низкой степенью ингибирования галактозой. Пониженное ингибирование галактозой этих новых ферментов в высокой степени актуально для областей применения, где желательны очень низкие концентрации лактозы.

Что касается применимости для кисломолочных продуктов, значительное преимущество состоит в том, что описанные в настоящем документе ферменты обладают высокой ферментативной активностью бета-галактозидазы в относительно широком температурном диапазоне от 4°С до 43°С, например, примерно 37°С, где ферментация в норме должна быть оптимальной, но эта ферментативная активность бета-галактозидазы также присутствует при низком рН, например, пониженном до 4,5, или пониженном до 4,0, или пониженном до 3,5, или даже пониженном до рН 3.

В итоге, авторами настоящего изобретения обнаружено, что некоторые пептиды, проявляющие ферментативную активность бета-галактозидазы, активны в широком диапазоне температуры, активны в широком диапазоне рН, обладают общей высокой гидролитической активностью без побочных активностей, что ингибирование этих пептидов галактозой отсутствует или происходит незначительно, например, менее чем на 60%, и что они стабильны в течение длительного срока хранения.

Активность бета-галактозидазы можно определить путем измерения количества высвобождаемой глюкозы после инкубации с лактозой в заданных условиях. Высвобождаемую глюкозу можно обнаружить с помощью цветной реакции.

Определения

Используемый в настоящем документе и в контексте настоящего изобретения термин «молоко» следует понимать как выделяемое молоко, полученное в результате доения любого млекопитающего, такого как корова, овца, коза, буйвол или верблюд.

Используемый в настоящем документе термин «содержащая лактозу композиция» относится к любой композиции, такой как любая жидкость, содержащая лактозу в значительной измеримой степени, например, с содержанием лактозы выше 0,002% (0,002 г/100 мл). Этот термин охватывает молоко и субстраты на молочной основе.

В контексте настоящего изобретения термин «субстрат на молочной основе» может означать любой материал из сырого и/или обработанного молока. Полезные субстраты на молочной основе включают, но не ограничены ими, растворы/суспензии любого молока или подобных молоку продуктов, содержащих лактозу, такие как цельное молоко или молоко низкой жирности, обезжиренное молоко, пахта, низколактозное молоко, восстановленное сухое молоко, сгущенное молоко, растворы сухого молока, молоко UHT, молочная сыворотка, пермеат молочной сыворотки, кислая молочная сыворотка, сливки, кисломолочные продукты, такие как йогурт, сыр, диетическая добавка и пробиотические диетические продукты. Как правило, термин «субстрат на молочной основе» относится к материалу из сырого и/или обработанного молока, который обрабатывают дополнительно в целях получения молочного продукта.

Используемый в настоящем документе термин «пастеризация» относится к процессу снижения или устранения в субстрате на молочной основе присутствия живых организмов, таких как микроорганизмы. Предпочтительно пастеризация достигается путем поддержания определенной температуры в течение определенного периода времени. Определенная температура обычно достигается путем нагревания. Температура и продолжительность времени может быть выбрана так, чтобы уничтожить или инактивировать некоторые бактерии, такие как вредные бактерии, и/или инактивировать ферменты в молоке. За этим может следовать стадия быстрого охлаждения.

Используемый в настоящем документе термин «молочный продукт» может означать любой пищевой продукт, один из основных компонентов которого основан на молоке. Обычно основной компонент основан на молоке, и в некоторых воплощениях изобретения основной компонент представляет собой субстрат на молочной основе, обработанный в соответствии со способом по настоящему изобретению ферментом, обладающим активностью бета-галактозидазы.

Молочный продукт в соответствии с изобретением может представлять собой, например, обезжиренное молоко, молоко низкой жирности, цельное молоко, сливки, молоко UHT, молоко с длительным сроком хранения, кисломолочный продукт, сыр, йогурт, сливочное масло, молочный спред, пахту, кисломолочный напиток, сметану, напиток на основе молочной сыворотки, мороженое, сгущенное молоко, карамелизованное сгущенное молоко или ароматизированный молочный напиток.

Молочный продукт может дополнительно содержать отличные от молока компоненты, например растительные компоненты, такие как, например, растительное масло, растительный белок и/или растительные углеводы. Молочные продукты могут также содержать дополнительные добавки, такие как, например, ферменты, вкусоароматические добавки, культуры микроорганизмов, такие как пробиотические культуры, соли, подсластители, сахара, кислоты, фрукты, приготовленные фрукты, фруктовые соки или любой другой известный в данной области техники компонент в качестве компонента или добавки молочного продукта.

Используемые в настоящем документе термины «кисломолочный продукт» или «продукт из сквашенного молока» следует понимать как любой молочный продукт, в состав технологического процесса которого входит ферментация любого типа. Примерами кисломолочных продуктов являются такие продукты, как йогурт, пахта, крем-фреш, мягкий творог и свежеприготовленный сыр. Кисломолочный продукт может быть получен любым известным в данной области техники способом или способом, включающим его стадии.

Используемый в настоящем документе термин «ферментация» относится к конверсии углеводов в спирты или кислоты под действием микроорганизмов. В некоторых воплощениях изобретения ферментация в соответствии с настоящим изобретением включает конверсию лактозы в молочную кислоту. В контексте настоящего изобретения «микроорганизм» может включать любую бактерию или гриб, способные ферментировать молочный субстрат.

Используемый в настоящем документе термин «повышенная ферментативная активность бета-галактозидазы» относится к относительно повышенной активности фермента бета-галактозидазы по сравнению с эталонной последовательностью.

Используемый в настоящем документе термин «пептид, проявляющий повышенную ферментативную активность бета-галактозидазы» относится к любому пептиду, который обладает ферментативной активностью катализа гидролиза дисахарида лактозы до его моносахаридных компонентов глюкозы и галактозы. Этот пептид может также называться лактазой или просто бета-галактозидазой (ЕС: 3.2.1.23).

В предпочтительном воплощении изобретения активность бета-галактозидазы определяют путем инкубации 13 мкл раствора, содержащего известное количество очищенного фермента лактазы, с раствором, содержащим 140 мМ лактозы, при рН 6,7 и 37°С в течение 10 мин, завершения реакции с лактазой путем повышения температуры до 95°С в течение 10 мин. Количество образовавшейся глюкозы определяли путем инкубации продукта реакции при 30°С в течение 40 мин с 80 мкл раствора глюкозооксидазы (0,6 г/л), диаммониевой соли 2,2'-азино-бис(3-этилбензолтиазолин-6-сульфокислоты) (1,0 г/л ABTS) и пероксидазы хрена (0,02 г/л) и определения оптической плотности при 610 нм с помощью фотометра FLUO.

Оптическая плотность коррелирует с концентрацией образующейся за минуту глюкозы, и ее определенное максимальное значение (в мкмоль образовавшейся глюкозы/мин) определяют как единицу активности лактазы 1 (также обозначена в настоящем документе как UAL-1; Unit of Lactase Activity). Удельную активность лактазы (также обозначена в настоящем документе как SUAL-1; Specific Activity of Lactase) при рН 6,7 при 37°С определяют в мкмоль образовавшейся глюкозы/мин/мг фермента и рассчитывают путем деления UAL-1 на концентрацию белка лактазы в мг. Полное подробное описание предпочтительной альтернативы выполнения этого анализа проиллюстрировано в примере 6.

Хотя стандартным подходом к определению активности является характеристика активности бета-галактозидазы по соотнесению со значениями в единицах, представляющих собой мкмоль образовавшейся глюкозы/мин/мг фермента, для характеристики активности ферментов лактаз с использованием описанного выше теста можно в равной степени использовать другие единицы. Соответственно, в некоторых из примеров активность фермента лактазы характеризуют по соотнесению с мкмоль образующейся за секунду глюкозы на мкмоль фермента.

В альтернативных воплощениях изобретения этот анализ можно выполнять с использованием различных значений температуры или различных значений рН для инкубации с лактазой.

Используемые в контексте настоящей заявки термины «пептид» и «олигопептид», как общепризнанно, считают синонимами, и каждый термин можно использовать взаимозаменяемо в зависимости от требований контекста как указывающий на цепь из по меньшей мере двух аминокислот, связанных пептидильными связями. Слово «полипептид» используют в настоящем документе для цепей, содержащих более десяти аминокислотных остатков. Все приведенные в настоящем документе формулы или последовательности пептида и полипептида написаны слева направо и в направлении от амино-конца к карбокси-концу. Используемый в настоящем документе термин «белки» относится к пептидным последовательностям, продуцируемым некоторым организмом-хозяином, и могут включать посттрансляционные модификации, такие как присоединенные гликаны.

Используемые в настоящем документе термины «аминокислота» или «аминокислотная последовательность» относятся к последовательности олигопептида, пептида, полипептида или белка или к любому ее фрагменту и к природным или синтетическим молекулам. В данном контексте «фрагмент» относится к фрагментам пептида, проявляющим ферментативную активность бета-галактозидазы, которые сохраняют некоторую ферментативную активность. Если указанная в настоящем документе «аминокислотная последовательность» относится к аминокислотной последовательности встречающейся в природе молекулы белка, «аминокислотная последовательность» и другие подобные термины не подразумевают как ограничивающие аминокислотную последовательность полноразмерной нативной аминокислотной последовательностью, связанной с молекулой указанного пептида.

Примеры пептидов по изобретению также включают фрагменты длиной по меньшей мере примерно 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 или более остатков, либо превышающей длину полноразмерного фермента. Соответственно «пептидный фрагмент» или «ферментативно-активный фрагмент» по изобретению представляют собой фрагменты, сохраняющие по меньшей мере некоторую функциональную ферментативную активность. Как правило, пептидный фрагмент по изобретению будет по-прежнему содержать функциональный каталитический домен или другие существенные активные центры пептида, проявляющего ферментативную активность бета-галактозидазы. Другие домены могут быть делетированы.

Как правило, удельная ферментативная активность бета-галактозидазы будет измерена и указана в мкмоль образовавшейся глюкозы/мин/мг используемого фермента. Однако это конкретное значение будет изменяться в зависимости от применяемых условий, таких как температура и рН. Соответственно, значения ферментативной активности бета-галактозидазы могут быть также указаны как относительные по отношению к известному эталонному ферменту, такому как фермент бета-галактозидаза, определенный SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35.

Если не указано иное, используемый в настоящем документе термин «идентичность последовательности» для аминокислот относится к идентичности последовательности, рассчитываемой как (n_ref - n_dif)⋅100/n_ref, где n_dif представляет собой общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при выравнивании, и где n_ref представляет собой число остатков в одной из последовательностей.

В некоторых воплощениях изобретения идентичность последовательности определяют традиционными способами, например, Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, путем поиска с применением метода подобия Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, применения алгоритма CLUSTAL W Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res 22:467380, с помощью компьютерных приложений этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group). Можно также применять алгоритм BLAST (Altschul et al., 1990, Mol. Biol. Biol. 215: 403-10), для которого можно получить программное обеспечение через Национальный центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov/). При использовании любого из упомянутых выше алгоритмов для «окна» длины, штрафа на гэп и т.д. используют параметры по умолчанию.

Пептид с определенной аминокислотной последовательностью, как описано в настоящем документе, может отличаться от последовательности эталонного пептида заменой, добавлением/вставкой или делецией любой из аминокислот.

Некоторые воплощения в соответствии с настоящим изобретением относятся к применению пептида с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1-33, или последовательностью по меньшей мере с 80%-ной идентичностью любой из указанных последовательностей. В некоторых воплощениях изобретения эта идентичность последовательности может составлять по меньшей мере приблизительно 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, например, пептид, имеющий не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 замен, добавлений или делеций по сравнению с любой одной эталонной аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1-33. Признаками изобретения также являются биологически активные фрагменты пептидов в соответствии с изобретением. Биологически активные фрагменты пептида по изобретению включают пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, по существу идентичные аминокислотной последовательности пептида по изобретению или полученные из нее, которые включают в себя меньше аминокислот, чем полноразмерный белок, но проявляют существенную часть биологической активности соответствующего полноразмерного пептида. Как правило, биологически активные фрагменты содержат домен или мотив по меньшей мере с одной активностью варианта белка по изобретению. Биологически активный фрагмент пептида по изобретению может представлять собой пептид, длина которого составляет, например, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или более аминокислот.

Используемый в настоящем документе термин «клетка-хозяин» включает клетку любого типа, подверженную трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. нуклеиново-кислотной конструкцией или экспрессионным вектором, которые содержат полинуклеотид, кодирующий пептиды по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой клетку любого типа, из которой получают конкретный фермент, или альтернативно клетку такого типа, который склонен к продуцированию конкретного фермента. Этот термин включает и штаммы дикого типа, и аттенуированные штаммы.

Подходящей клеткой-хозяином может быть любая бактерия, включающая молочнокислые бактерии в пределах порядка Lactobacillales, который включает Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. и Propionibacterium spp. Он также включает продуцирующие молочную кислоту бактерии, относящиеся к группе анаэробных бактерий, бифидобактерий, т.е. Bifidobacterium spp., часто используемых в качестве пищевых культур отдельно или в комбинации с молочнокислыми бактериями. В это определение также включают Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactobacillus casei subsp. casei и Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei и виды термофильных молочнокислых бактерий, включающие в качестве примеров Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Lactobacillus acidophilus. Другие конкретные бактерии в пределах этого определения включают бактерии семейства Bifidobacteriaceae, например из рода Bifidobacterium, например штаммы Bifidobacterium animalis или Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifodum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium infantus, или из рода Lactobacillus, например L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. Lactis, и L. helveticus.

В это определение клеток-хозяев также включают штамм Agaricus, например А. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, например A. niger, A. awamori, A. foetidus, А. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, например D. discoideum; Kluveromyces, например K. fragilis, K. lactis; Mucor, например M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, например N. crassa; Rhizomucor, например R. pusillus; Rhizopus, например R arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, например S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, например Т. rubrum; Whetzelinia, например W. sclerotiorum; Bacillus, например В. coagulans, В. circulans, В. megaterium, В. novalis, В. subtilis, В. pumilus, В. stearothermophilus, В. thuringiensis; Bifidobacterium, например В. Iongum, В. bifidum, В. animalis; Chryseobacterium; Citrobacter, например С. freundii; Clostridium, например С perfringens; Diplodia, например D. gossypina; Enterobacter, например E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, например E. herbicola; Escherichia, например E. coli; Klebsiella, например K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, например N. crassa; Proteus, например P. vulgaris; Providencia, например P. stuartii; Pycnoporus, например Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, например R torques; Salmonella, например S. typhimurium; Serratia, например S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, например S. flexneri; Streptomyces, например S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, например Т. reesei, Т. viride; Yersinia, например Y. enterocolitica.

Для получения безлактозного пастеризованного молока (содержание остаточной лактозы менее 0,01%) при низких температурах (4-5°С) за 24 ч рекомендуемая доза Ha-Lactase и NOLA® составляет 55-70 мг/л (10000 NLU/л) и 45-60 мг/л (10000 BLU/л) соответственно. Ферменты по настоящему изобретению обеспечивают очень низкие остаточные концентрации лактозы при низких температурах (от менее 0,01% до 0,2%). Измерения удельной активности показывают, что новые ферменты обладают в 2-5 раз более высокой активностью по сравнение с Ha-Lactase и NOLA® Fit, поэтому для получения безлактозного молока требуется меньше времени.

В приведенных ниже примерах показано, что новые лактазы действуют быстрее, чем Ha-Lactase и NOLA® Fit, и в результате безлактозное пастеризованное молоко получают за значительно более короткое время. Эти новые ферменты могут уменьшить общее время технологического процесса. Дополнительно с помощью новых ферментов можно дополнительно уменьшить дозу фермента для получения безлактозного/низколактозного пастеризованного молока до 25-50%.

ПРИМЕРЫ

Общие материалы и методы

Молекулярное клонирование и генетические методики

Методики расщепления ферментами рестрикции, лигирования, трансформации и другие стандартные молекулярно-биологические манипуляции были основаны на методах, описанных в литературе (Maniatis et al. "Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd edition" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Sambrook and Russell "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edition" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; Miller "Experiment in molecular genetics" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972); или предложенных производителем. ПЦР проводили в термоциклере ДНК производства компании Bio-Rad, США. Секвенирование ДНК было выполнено компанией LGC, г. Берлин, Германия. Белки анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ-электрофореза) в денатурирующих условиях, используя додецилсульфат натрия, в гелях, содержащих 10% ДСН (гель Mini-PROTEAN® TGX stain-free™, Biorad, США). Концентрации белка определяли, используя метод с бицинхониновой кислотой (ВСА), следуя протоколу, поставляемому с набором реактивов.

Штаммы бактерий, плазмиды и условия выращивания

Для клонирования и выделения плазмид использовали штамм Escherichia coli ТОР10 (Invitrogen). Для получения рекомбинантного белка использовали штамм Е. coli BW25113 с дефицитом бета-галактозидазы (Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), λ-, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514) (Datsenko KA, Wanner BL; 2000, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97: 6640-6645) в комбинации с вектором pBAD/His, полученным от компании Invitrogen™ Life Technologies Corporation Europe BV.

Питательная среда для выращивания для экспрессии белка

Для продукции рекомбинантного белка использовали питательную среду 2xPY, содержащую 16 г/л пептона BD BBL™ Phyton ТМ, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl. Среда для роста содержала добавку ампициллина (100 мкг/мл) для поддержания плазмиды. Продукцию белка инициировали добавлением в культуральную среду 0,05% арабинозы.

Пример 1. Конструирование экспрессионного вектора для продукции лактаз

Геномную ДНК молочнокислых бактерий или бифидобактерий выделяли с использованием коммерческого набора реактивов для выделения геномной ДНК, следуя протоколу поставщика (DNeasy, Qiagen, Германия). Ген лактазы амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двух синтетических праймеров, очищенной геномной ДНК в качестве источника биомассы и реактивы, поставляемые в наборе с ДНК-полимеразой «горячего старта» Phusion U Hot start (Thermo Scientific, США). Ген лактазы клонировали в стартовом кодоне экспрессионного вектора pBAD/His с использованием метода клонирования USER (Nour-Eldin НН, Geu-Flores F, Halkier BA, Plant Secondary Metabolism Engineering, Methods in Molecular Biology, 643; 2010) с получением в результате экспрессионной конструкции. При использовании метода USER и в продукте ПЦР, и в векторе доставки образуются длинные комплементарные выступающие концы. Эти выступающие концы можно подвергать отжигу друг с другом с образованием стабильного продукта гибридизации, который используют для трансформации Е. coli без лигирования. Для создания выступающих концов в продукте ПЦР в расположенный выше участок каждого праймера для амплификации целевой ДНК включали единственный остаток дезоксиуридина. Ген лактазы амплифицировали с использованием прямого праймера (5'-ATTAACCAUGCGACGCAACTTCGAATGGCC-3') и обратного праймера (ATCTTCTCUTTACCGCCTTACCACGAGCACG), содержащих уридин в 9-ом положении (показано полужирным шрифтом), за которым следовала последовательность гена лактазы. Параллельно векторную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР, используя пару прямого (5'-AGAGAAGAUTTTCAGCCTGATACAGATTAAATC-3') и обратного праймера (5'-ATGGTTAAUTCCTCCTGTTAGCCCAAAAAACGG-3'), содержащих единственный остаток дезоксиурацила в 9-ом положении (выделено жирным шрифтом), за которым следовала последовательность векторной ДНК. Продукты ПЦР очищали с помощью коммерческого набора для очистки продуктов ПЦР (Qiagen, Дания). Очищенные продукты ПЦР (ген лактазы и векторную ДНК) смешивали в эквимолярном количестве и инкубировали с коммерческой смесью ферментов USER (New England Biolabs, США), следуя протоколу поставщика. Эти ферменты удаляют остаток урацила, а также расположенный выше уридина короткий фрагмент, в результате чего в продуктах ПЦР образуются комплементарные выступающие концы. Эти комплементарные выступающие концы претерпевают отжиг друг с другом с получением в результате экспрессионного вектора лактазы pBAD. Аликвоты этой лигированной смеси трансформировали в полученные химическим способом компетентные клетки Е. coli ТОР 10. Трансформанты отбирали при 37°С на чашках Петри со средой LB-Amp (LB; среда Лурия - Бертани, Amp; 100 мкг/мл ампициллина). На следующий день проводили ПЦР отдельных колоний, используя небольшую биомассу выросших за ночь трансформантов, используя праймеры к вектору (праймер 1; 5'-CGGCGTCACACTTTGCTATGCC-3' и праймер 2; 5'-CCGCGCTACTGCCGCCAGGC-3'). Положительные клоны в ПЦР отдельных колоний культивировали в 5 мл среды LB-Amp и выделяли из клеток плазмидную ДНК. Клонированный ген лактазы секвенировали, чтобы подтвердить, что в процессе амплификации гена не было внесено дополнительных мутаций. Плазмидной ДНК трансформировали экспрессионный штамм-хозяин BW25113.

Пример 2. Экспрессия лактаз в экспрессионном штамме-хозяине Е. coli

Фермент лактазу продуцировали в Е. coli BW25113 с использованием экспрессионной системы pBAD. Свежетрансформированные клетки Е. coli BW25113, несущие плазмидную ДНК, собирали с чашки LB-Amp с помощью стерильной петли и использовали для инокуляции 5 мл среды LB-Amp. Выращенную ночную культуру (200 мкл) использовали для инокуляции 50 мл среды 2х PY, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, в колбу емкостью 250 мл и помещали в устройство для встряхивания (Innova® 42). Культуру выращивали при 37°С при 220 об/мин до достижения оптической плотности при 600 нм (OD600) 0,6-0,8. Экспрессию лактазы инициировали добавлением в культуральную среду 0,05% арабинозы, и клетки культивировали дополнительно в течение 16-20 часов при 18°С при 180 об/мин. Клетки собирали центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин при 4°С) и хранили при -20°С до дальнейшего использования.

Пример 3. Очистка белка с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованных металлах

Клетки из культуры объемом 50 мл оттаивали на льду и лизировали, используя 10 мл смеси буфера для лизиса BugBuster® (Novagen), содержащей 2 мг/мл лизоцима (Sigma Aldrich), 1 единицу бензоназы (Sigma Aldrich) и 1-кратную полную смесь ингибиторов протеаз (без ЭДТА, Roche), путем инкубации клеток при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Полученную надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Колонку с гравитационным течением с Ni-сефарозой (GE Healthcare) готовили с 1 мл суспензии путем промывания этанолом и водой. Затем колонку уравновешивали отмывочным буфером 50 ммоль/л NaH₂PO₄, рН 8,0, содержащим 300 ммоль/л NaCl и 20 ммоль/л имидазола. Бесклеточный экстракт наносили на колонку, и несвязанные белки элюировали из колонки. Колонку промывали 20 мл отмывочного буфера, и удержавшиеся на колонке белки элюировали 3,5 мл буфера для элюции 50 ммоль/л NaH₂PO₄, рН 8,0, содержащего 300 ммоль/л NaCl и 250 ммоль/л имидазола. Собранные фракции анализировали методом электрофореза в ДСН-ПААГ в гелях, содержащих 10% акриламид, и фракции, содержащие очищенные ферменты лактазы, объединяли вместе. Проводили обмен буфера на буфер для хранения (буферный раствор 50 ммоль/л KH₂PO₄, рН 7,0, содержащий 10 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л MgCl₂), используя предварительно упакованную колонку PD-10 для обессоливающей гель-фильтрации G-25 (GE Healthcare). Очищенные ферменты хранили при 4°С до дальнейшего использования.

Пример 4. Очистка белка с использованием гель-фильтрационной хроматографии

Клетки из культуры объемом 50 мл оттаивали на льду и лизировали, используя 10 мл смеси буфера для лизиса BugBuster® (Novagen), содержащей 2 мг/мл лизоцима (Sigma Aldrich), 1 единицу бензоназы (Sigma Aldrich) и 1-кратную полную смесь ингибиторов протеаз (без ЭДТА, Roche), путем инкубации клеток при комнатной температуре в течение 30 мин. Через 30 мин клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Полученную надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Осветленный бесклеточный экстракт концентрировали фильтрованием через фильтр с порогом отсечения 30000 Дальтон (Vivaspin 20, GE Healthcare), следуя протоколу поставщика. Колонку Sephadex G50 superfine с гравитационным потоком (Pharmacia Chemicals, Швеция) готовили с 1 г материала колонки, подготовленного путем кипячения в 100 мл воды в течение 1 часа, охлажденного до комнатной температуры. Колонку готовили путем нанесения 20 мл охлажденной суспензии на фильтрационную колонку объемом 30 мл. Колонку промывали водой MilliQ и уравновешивали отмывочным буфером В (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄, рН 7,0). 500 мкл концентрированной надосадочной жидкости наносили на колонку и оставляли для вхождения в неподвижную фазу. Отмывочный буфер (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄, рН 7,0) наносили на колонку сверху и собирали фракции элюента по отдельности. Собранные фракции анализировали в геле с ДСН-ПААГ, содержащем 10% акриламид. Фракции белка объединяли вместе и проводили обмен буфера на буфер для хранения (буферный раствор 50 ммоль/л KH₂PO₄, рН 7,0, содержащий 10 ммоль/л NaCl, 1 ммоль/л MgCl₂) с помощью обессоливающей колонки, как описано в предыдущем разделе. Очищенные ферменты хранили при 4°С до дальнейшего использования.

Пример 5. Измерение концентрации белка методом с бицинхониновой кислотой (ВСА)

Концентрацию очищенных лактаз определяли с помощью набора реактивов для анализа белков Pierce™ ВСА (Thermo Fisher Scientific, Германия), следуя протоколу, поставляемому с набором.

Пример 6. Определение активности с использованием очищенных ферментов на лактозе в качестве субстрата при рН 6,7 и температуре 37°С

Для измерения активности бета-галактозидазы очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере В (раствор лактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 6,7, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 10 мин при 37°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, охлаждение при 4°С. Очищенные ферменты хранили при -20°С до дальнейшего использования. Для определения количества глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, 10 мкл реакционной смеси переносили в одну лунку стандартного микротитрационного планшета (Thermo Fischer Scientific, Дания), содержащую 80 мкл буфера С (буферный раствор 100 ммоль/л NaH₂PO₄, рН 7,0, содержащий глюкозооксидазу, 0,6 г/л (Sigma Aldrich); диаммониевую соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты), ABTS, 1,0 г/л (Sigma Aldrich); пероксидазу хрена, 0,02 г/л (Sigma Adrich)) и инкубировали при 30°С в течение 40 мин. Через 40 мин определяли оптическую плотность при 610 нм, используя сканирующий УФ-спектрофотометр для прочтения планшетов FLUOStar Omega (BMG Labtech, Германия). Для расчетов использовали значения оптической плотности от 0,1 до 1,5; если значение А610 нм превышало 1,5, реакционную смесь разводили до 10-кратной концентрации буфером А. Для каждого очищенного фермента реакции проводили в трех повторностях и использовали для расчетов среднее значение трех повторных измерений. Для нормализации использовали очистку белка, проведенную на клетках Е. coli, трансформированных вектором pBAD/His без вставки. Строили стандартную кривую, используя известную концентрацию глюкозы (0-2,5 ммоль/л), и наклон кривой использовали для расчета количества глюкозы, образовавшейся в ходе реакции. Для определения количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы (например, путем приведения значения оптической плотности в соответствие с концентрацией образовавшейся глюкозы с помощью стандартной или калибровочной кривой) и также обозначенного как единица активности лактазы 1 (или UAL-1) при рН 6,7 при 37°С, использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность (обозначенную как SUAL-1) при рН 6,7 при 37°С определяют как количество мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один мг фермента (мкмоль глюкозы/мин/мг фермента) и определяют путем деления UAL-1 на концентрацию белка в мг. Удельная активность SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35 была определена по существу в таких же условиях. Высокая удельная активность при рН 6,7 в высокой степени желательна для устойчивости фермента в областях применения для свежего и ферментированного молока. Подробные результаты определения удельной активности ферментов при рН 6,7 при 37°С описаны на Фиг. 28. Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы на один мкмоль добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 1.

Удельную активность ферментов определяли при рН 6,7 и при 37°С и использовали для расчета приблизительного времени, требующегося для гидролиза лактозы с использованием фиксированной дозы фермента в единицах активности при рН 6,7 при 37°С и 140 ммоль/л лактозы в качестве субстрата (SUAL-1). Результаты определения расчетного времени для гидролиза лактозы представлены в таблице 2.

Пример 7. Определение активности с использованием очищенных ферментов в присутствии галактозы при рН 6,7 и температуре 37°С

Очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельных реакциях разведенные ферменты инкубировали с буфером D (раствор лактозы 140 ммоль/л и галактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 6,7, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционная смесь состояла из 13 мкл разведенного фермента и 37 мкл буфера D в пробирке для ПЦР. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере при следующих параметрах инкубации: время реакции 10 мин при 37°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, охлаждение 4°С. Очищенные ферменты хранили при -20°С до дальнейшего использования. Для определения количества глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, 10 мкл реакционной смеси переносили в одну лунку стандартного микротитрационного планшета (Thermo Fischer Scientific, Дания), содержащую 80 мкл буфера С (буферный раствор 100 ммоль/л NaH₂PO₄, рН 7,0, содержащий глюкозооксидазу, 0,6 г/л (Sigma Aldrich); диаммониевую соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты), ABTS, 1,0 г/л (Sigma Aldrich); пероксидазу хрена, 0,02 г/л (Sigma Adrich)) и инкубировали при 30°С в течение 40 мин. Через 40 мин определяли оптическую плотность при 610 нм, используя сканирующий УФ-спектрофотометр для прочтения планшетов FLUOStar Omega (BMG Labtech, Германия). Для расчетов использовали значения оптической плотности от 0,1 до 1,5; если значение А610 нм превышало 1,5, реакционную смесь разводили до 10-кратной концентрации буфером А. Для каждого очищенного фермента реакции проводили в трех повторностях и использовали для расчетов среднее значение трех повторных измерений. Для нормализации использовали очистку белка, проведенную на клетках Е. coli, трансформированных вектором pBAD/His без вставки. Строили стандартную кривую, используя известную концентрацию глюкозы (0-2,5 ммоль/л), и наклон кривой использовали для расчета оптической плотности, соответствующей 1 мкмоль глюкозы, образовавшейся в ходе реакции. Для определения количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы описываемого как 1 единица активности с галактозой при рН 6,7 при 37°С (UAG), использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность при рН 6,7 при 37°С в присутствии галактозы, описываемую как SUAG, определяют как количество мкмоль образующейся за секунду глюкозы на один мкмоль фермента (мкмоль глюкозы/с/мкмоль фермента) и рассчитывают путем деления UAG на концентрацию белка в мкмоль.

Процент ингибирования ферментов галактозой рассчитывают по формуле

% ингибирования = 100*(А-В)/А,

где А представляет собой удельную активность ферментов с лактозой при рН 6,7 при 37°С (SUAL), как описано в примере 6, а В означает удельную активность ферментов в присутствии галактозы при рН 6,7 при 37°С (SUAG), как описано в примере 7. Подробные результаты % ингибирования галактозой описаны на Фиг. 2 и Фиг. 28. Пониженное ингибирование галактозой в высокой степени актуально для областей применения, где желательны очень низкие концентрации лактозы.

Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 28.

Примечание: относительно высокие стандартные отклонения измерения ингибирования галактозой связаны со следовыми количествами примесей глюкозы в приобретенной галактозе.

Пример 8. Определение активности с использованием очищенных ферментов на лактозе в качестве субстрата при рН 6,7 и температуре 4°С

Очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере В (раствор лактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 6,7, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄. Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 60 мин при 4°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. Очищенные ферменты хранили в морозильной камере при -20°С до дальнейшего использования. Количество глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, определяли, следуя протоколу, описанному в примере 6. Для определения количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы, описываемого как 1 единица активности с лактозой при рН 6,7 при 4°С (UAL-2), использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность при рН 6,7 при 4°С, описываемую как SUAL-2, определяют как количество мкмоль образующейся за секунду глюкозы на один мкмоль фермента (мкмоль глюкозы/с/мкмоль фермента) и рассчитывают путем деления UAG на концентрацию белка в мкмоль. Высокая удельная активность при рН 6,7 при 4°С весьма желательна для гидролиза лактозы в областях применения для свежего/пастеризованного молока. Подробные результаты определения удельной активности ферментов при рН 6,7 при 4°С описаны на Фиг. 3.

Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 28.

Пример 9. Определение активности с использованием очищенных ферментов на лактозе в качестве субстрата при рН 6,7 и температуре 43°С

Очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере В (раствор лактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 6,7, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 10 мин при 43°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. Очищенные ферменты хранили в морозильной камере при -20°С до дальнейшего использования. Количество глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, определяли, следуя протоколу, описанному в примере 6. Для определения количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы, описываемого как 1 единица активности с лактозой при рН 6,7 при 43°С (UAL-3), использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность при рН 6,7 при 43°С, описываемую как SUAL-3, определяют как количество мкмоль образующейся за секунду глюкозы на один мкмоль фермента (мкмоль глюкозы/с/мкмоль фермента) и рассчитывают путем деления UAL-3 на концентрацию белка в мкмоль. Высокая удельная активность при рН 6,7 при 43°С весьма желательна для гидролиза лактозы в областях применения для свежего/пастеризованного молока. Подробные результаты определения удельной активности ферментов при рН 6,7 при 43°С описаны на Фиг. 4.

Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 28.

Пример 10. Определение активности с использованием очищенных ферментов на лактозе в качестве субстрата при рН 5,5 и температуре 4°С

Очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере Е (раствор лактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 5,5, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Раствор субстрата готовили в буфере рН 5,5, в раствор фермента имел рН 6,7. Для инициации реакции добавляли 13 мкл фермента к 37 мкл раствора субстрата. Таким образом, при смешивании этих двух буферов конечный рН реакции повышался от 5,5 до 5,7.

Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 60 мин при 4°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. Очищенные ферменты хранили в морозильной камере при -20°С до дальнейшего использования. Для определения количества глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, 10 мкл реакционной смеси переносили в одну лунку стандартного микротитрационного планшета, содержащую 80 мкл буфера С, и инкубировали при 30°С в течение 40 мин. Через 40 мин определяли оптическую плотность при 610 нм, используя сканирующий УФ-спектрофотометр для прочтения планшетов FLUOStar Omega (BMG Labtech, Германия). Для расчетов использовали значения оптической плотности от 0,1 до 1,5; если значение А610 нм превышало 1,5, реакционную смесь разводили до 10-кратной концентрации буфером А. Для каждого очищенного фермента реакции проводили в трех повторностях и использовали для расчетов среднее значение трех повторных измерений. Для определения количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы, описываемого как 1 единица активности с лактозой при рН 5,5 при 4°С (UAL-4), использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность при рН 5,5 при 4°С, описываемую как SUAL-4, определяют как количество мкмоль образующейся за секунду глюкозы на один мкмоль фермента (мкмоль глюкозы/с/мкмоль фермента) и рассчитывают путем деления UAL-4 на концентрацию белка в мкмоль. Высокая удельная активность при рН 5,5 при 4°С весьма желательна для гидролиза лактозы в областях применения для ферментированного молока. Подробные результаты определения удельной активности ферментов при рН 5,5 при 4°С описаны на Фиг. 5.

Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 29.

Пример 11. Определение активности с использованием очищенных ферментов на лактозе в качестве субстрата при рН 5,5 и температуре 37°С

Очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере Е (раствор лактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 5,5, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Раствор субстрата готовили в буфере рН 5,5, в раствор фермента имел рН 6,7. Для инициации реакции добавляли 13 мкл фермента к 37 мкл раствора субстрата. Таким образом, при смешивании этих двух буферов конечный рН реакции повышался от 5,5 до 5,7.

Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 10 мин при 37°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. Очищенные ферменты хранили при -20°С до дальнейшего использования. Количество глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, определяли, следуя протоколу, описанному в примере 10. Для определения количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы, описываемого как 1 единица активности с лактозой при рН 5,5 при 37°С (UAL-5), использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность при рН 5,5 при 37°С, описываемую как SUAL-5, определяют как количество мкмоль образующейся за секунду глюкозы на один мкмоль фермента (мкмоль глюкозы/с/мкмоль фермента) и рассчитывают путем деления UAL-5 на концентрацию белка в мкмоль. Высокая удельная активность при рН 5,5 при 37°С актуальна для гидролиза лактозы в областях применения для ферментированного молока и гидролиза лактозы в сладкой молочной сыворотке. Подробные результаты определения удельной активности ферментов при рН 5,5 при 37°С описаны на Фиг. 6.

Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 29.

Пример 12. Определение активности с использованием очищенных ферментов на лактозе в качестве субстрата при рН 5,5 и температуре 43°С

Очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере Е (раствор лактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 5,5, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Раствор субстрата готовили в буфере рН 5,5, в раствор фермента имел рН 6,7. Для инициации реакции добавляли 13 мкл фермента к 37 мкл раствора субстрата. Таким образом, при смешивании этих двух буферов конечный рН реакции повышался от 5,5 до 5,7.

Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 10 мин при 43°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. Очищенные ферменты хранили при -20°С до дальнейшего использования. Количество глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, определяли, следуя протоколу, описанному в примере 10. Для определения количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы, описываемого как 1 единица активности с лактозой при рН 5,5 при 43°С (UAL-6), использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность при рН 5,5 при 43°С, описываемую как SUAL-6, определяют как количество мкмоль образующейся за секунду глюкозы на один мкмоль фермента (мкмоль глюкозы/с/мкмоль фермента) и рассчитывают путем деления UAL-6 на концентрацию белка в мкмоль. Высокая удельная активность при рН 5,5 при 43°С актуальна для гидролиза лактозы в областях применения для ферментированного молока и гидролиза лактозы в сладкой молочной сыворотке. Подробные результаты определения удельной активности ферментов при рН 5,5 при 43°С описаны на Фиг. 7.

Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 29.

Пример 13. Определение активности с использованием очищенных ферментов на лактозе в качестве субстрата при рН 4,5 и температуре 4°С

Очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере F (раствор лактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 4,5, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Раствор субстрата готовили в буфере рН 4,5, в раствор фермента имел рН 6,7. Для инициации реакции добавляли 13 мкл фермента к 37 мкл раствора субстрата. Таким образом, при смешивании этих двух буферов конечный рН реакции повышался от 4,5 до 4,7.

Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 60 мин при 4°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. Для определения количества глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, 10 мкл реакционной смеси переносили в одну лунку стандартного микротитрационного планшета, содержащую 80 мкл буфера С (как описано в примере 6), и инкубировали при 30°С в течение 40 мин. Через 40 мин определяли оптическую плотность при 610 нм, используя сканирующий УФ-спектрофотометр для прочтения планшетов FLUOStar Omega (BMG Labtech, Германия). Для расчетов использовали значения оптической плотности от 0,1 до 1,5; если значение А610 нм превышало 1,5, реакционную смесь разводили до 5-кратной концентрации буфером А. Для каждого очищенного фермента реакции проводили в трех повторностях и использовали для расчетов среднее значение трех повторных измерений. Для определения количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы, описываемого как 1 единица активности с лактозой при рН 4,5 при 4°С (UAL-7), использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность при рН 4,5 при 4°С, описываемую как SUAL-7, определяют как количество мкмоль глюкозы, образующейся за секунду, на один мкмоль фермента (мкмоль глюкозы/с/мкмоль фермента) и рассчитывают путем деления UAL-7 на концентрацию белка в мкмоль. Высокая удельная активность при рН 4,5 при 4°С актуальна для гидролиза лактозы в областях применения для ферментированного молока. Подробные результаты определения удельной активности ферментов при рН 4,5 при 4°С описаны на Фиг. 8.

Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 30.

Пример 14. Определение активности с использованием очищенных ферментов на лактозе в качестве субстрата при рН 4,5 и температуре 37°С

Очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере F (раствор лактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 4,5, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Раствор субстрата готовили в буфере рН 4,5, в раствор фермента имел рН 6,7. Для инициации реакции добавляли 13 мкл фермента к 37 мкл раствора субстрата. Таким образом, при смешивании этих двух буферов конечный рН реакции повышался от 4,5 до 4,7.

Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 10 мин при 37°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. Очищенные ферменты хранили при -20°С до дальнейшего использования. Количество глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, определяли, следуя протоколу, описанному в примере 13. Для определения количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы, описываемого как 1 единица активности с лактозой при рН 4,5 при 37°С (UAL-8), использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность при рН 4,5 при 37°С, описываемую как SUAL-8, определяют как количество мкмоль образующейся за секунду глюкозы на один мкмоль фермента (мкмоль глюкозы/с/мкмоль фермента) и рассчитывают путем деления UAL-8 на концентрацию белка в мкмоль. Высокая удельная активность при рН 4,5 при 37°С актуальна для гидролиза лактозы в областях применения для ферментированного молока и гидролиза лактозы в кислой молочной сыворотке. Подробные результаты определения удельной активности ферментов при рН 4,5 при 37°С описаны на Фиг. 9. Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 30.

Пример 15. Определение активности с использованием очищенных ферментов на лактозе в качестве субстрата при рН 4,5 и температуре 43°С

Очищенные лактазы разводили до 40-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере F (раствор лактозы 140 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 4,5, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Раствор субстрата готовили в буфере рН 4,5, в раствор фермента имел рН 6,7. Для инициации реакции добавляли 13 мкл фермента к 37 мкл раствора субстрата. Таким образом, при смешивании этих двух буферов конечный рН реакции повышался от 4,5 до 4,7. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 10 мин при 43°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. Очищенные ферменты хранили при -20°С до дальнейшего использования. Количество глюкозы, образовавшейся в ходе реакции, определяли, следуя протоколу, описанному в примере 13. Для определения количества мкмоль образующейся за секунду глюкозы, описываемого как 1 единица активности с лактозой при рН 4,5 при 43°С (UAL-9), использовали максимальное значение оптической плотности для каждой лактазы. Удельную активность при рН 4,5 при 43°С, описываемую как SUAL-9, определяют как количество мкмоль образующейся за секунду глюкозы на один мкмоль фермента (мкмоль глюкозы/с/мкмоль фермента) и рассчитывают путем деления UAL-9 на концентрацию белка в мкмоль. Высокая удельная активность при рН 4,5 при 43°С актуальна для гидролиза лактозы в областях применения для ферментированного молока и гидролиза лактозы в кислой молочной сыворотке. Подробные результаты определения удельной активности ферментов при рН 4,5 при 43°С описаны на Фиг. 10.

Дополнительно активность была описана в виде количества мкмоль образующейся за минуту глюкозы на один миллиграмм добавленного фермента. Результаты представлены на Фиг. 30.

Пример 16. Определение активности в единицах BLU

Готовили разведения имеющегося в продаже фермента NOLA® Fit (Chr-Hansen, Дания) в диапазоне концентрации от 0,5 BLU/мл до 2,5 BLU/мл в буфере G (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄, рН 7,0, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄, 0,045% красителя Бридж, Sigma Aldrich). Разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере Н (раствор лактозы 105 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 6,7, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 10 мин при 37°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. Конверсию глюкозы определяли количественно путем переноса 10 мкл реакционной смеси в одну лунку стандартного микротитрационного планшета, содержащую 80 мкл буфера С, и инкубации при 30°С в течение 40 мин. Через 40 мин определяли оптическую плотность при 610 нм, используя сканирующий УФ-спектрофотометр для прочтения планшетов FLUOStar Omega (BMG Labtech, Германия). Стандартную кривую строили с использованием измеренных значений оптической плотности против BLU/мл. Максимальный наклон кривой использовали для определения активности новых ферментов в BLU/мл.

Пример 17. Определение активности новых лактаз в BLU/мл с использованием лактозы в качестве субстрата

Очищенные лактазы разводили до 50-кратной концентрации в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции разведенный фермент инкубировали с раствором лактозы, приготовленном в буфере Н (раствор лактозы 105 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 6,7, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл разведенного очищенного фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 10 мин при 37°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. После проведения реакции 10 мкл реакционной смеси переносили в одну лунку стандартного микротитрационного планшета, содержащую 80 мкл буфера С (как описано в примере 6), и инкубировали при 30°С в течение 40 мин. Через 40 мин определяли оптическую плотность при 610 нм, используя сканирующий УФ-спектрофотометр для прочтения планшетов FLUOStar Omega. Для расчетов использовали значения оптической плотности от 0,1 до 1,5; если значение А610 нм превышало 1,5, реакционную смесь разводили до 5-кратной концентрации буфером А. Для расчета активности фермента в BLU/мл с помощью стандартной кривой, описанной в примере 16, использовали максимальные значения оптической плотности.

Пример 18. Измерение процентного содержания остаточной лактозы в свежем молоке при температуре охлаждения

2 мл имеющегося в продаже пастеризованного молока (пастеризованное молоко 1,5%-ной жирности, Arla Food) смешивали в стеклянной пробирке емкостью 10 мл с 10-125 мкл фермента (эквивалент 10 BLU/мл), как определено в примере 17. Образцы инкубировали в постоянных условиях в течение 24 часов при 4°С. После инкубации реакцию останавливали путем инактивации нагреванием при 95°С в течение 7 мин с последующим хранением при -20°С до дальнейшего использования. Количество остаточной лактозы в молоке анализировали, используя метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Образцы для анализа обрабатывали 1,8 мл раствора для осаждения белка (0,083 моль/л РСА и 2 ммоль/л Na-ЭДТА) и 2 мл воды Milli-Q (MQW), после чего центрифугировали при 2800 об/мин в течение 30 мин при 4°С. Аликвоту надосадочной жидкости разводили в общей сложности в 200 раз, используя автоматическую систему разведения JANUS (PerkinElmer, Уолтем, штат Массачусетс, США). Разведенные образцы анализировали в системе Dionex ICS-5000 (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, штат Массачусетс, США), используя аналитическую колонку 4 × 250 мм CarboPac SA20 (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, штат Массачусетс, США) и импульсный амперометрический детектор. Детектор был настроен на определение простой трехступенчатой потенциальной формы колебательного сигнала для избирательного обнаружения углеводов. Элюент был настроен на 1 ммоль/л KOH, и его постоянно регенерировали пропусканием через предколонку (CR-TC, Thermo Fischer Scientific, Уолтем, штат Массачусетс, США). Расход элюента составлял 1,2 мл/мин, а время анализа на одно введение пробы составляло 10 мин. Для количественного определения лактозы в каждом образце использовали внешнюю калибровочную кривую, построенную по трем точкам путем добавления известных количеств моногидрата лактозы (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США) к MQW. Концентрации рассчитывали по высоте хроматографических пиков. Измеренное процентное содержание остаточной лактозы в свежем молоке представлено на Фиг. 11.

Пример 19. Определение активности в UHT молоке при комнатной температуре 2 мл имеющегося в продаже UHT молока (UHT молоко 1,5%-ной жирности, Arla Food) смешивали в стеклянной пробирке емкостью 2 мл с 2-25 мкл фермента (эквивалент 10 BLU/мл), как определено в примере 17. Образцы инкубировали в постоянных условиях в течение 24 часов при 25°С. После инкубации реакцию останавливали путем инактивации нагреванием при 95°С в течение 7 мин с последующим хранением при -20°С до дальнейшего использования. Количество остаточной лактозы в UHT молоке анализировали методом ВЭЖХ, следуя протоколу, описанному в примере 18. Измеренное процентное содержание остаточной лактозы в свежем молоке после гидролиза представлено на Фиг. 12.

Пример 20. Характеристики фермента при высокой температуре в буфере

Очищенный фермент разводили до 5 BLU/мл в буфере А (буферный раствор 50 ммоль/л NaH₂PO₄ рН 6,7, содержащий 100 мкмоль/л MgSO₄). В отдельной реакции 13 мкл разведенного фермента инкубировали в термоциклере для ДНК с раствором лактозы (раствор лактозы 105 ммоль/л, приготовленный в 100 мМ натрийцитратном буфере рН 6,7, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄). Реакционную смесь готовили путем смешивания 13 мкл фермента и 37 мкл раствора лактозы в пробирке для ПЦР. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК с использованием следующих параметров инкубации: время реакции 10 мин при 37°С, инактивация фермента 10 мин при 95°С, хранение при 4°С. После проведения реакции 10 мкл реакционной смеси переносили в одну лунку стандартного микротитрационного планшета, содержащую 80 мкл буфера С (как описано в примере 6), и инкубировали при 30°С в течение 40 мин. Через 40 мин определяли оптическую плотность при 610 нм, используя сканирующий УФ-спектрофотометр для прочтения планшетов FLUOStar Omega. Для расчетов использовали значения оптической плотности от 0,1 до 1,5; если значение А610 нм превышало 1,5, реакционную смесь разводили до 5-кратной концентрации буфером А. Измеренную оптическую плотность обозначили как Abs37°C и считали эталонным значением при расчетах.

Для измерения влияния термической обработки на активность фермента в отдельной реакции инкубировали 13 мкл разведенного фермента (5 BLU/мл) в термоциклере для ДНК, используя следующие параметры инкубации: при 72°С в течение 15 с, либо при 74°С в течение 15 с, либо при 76°С в течение 6 с, либо 78°С в течение 6 с, либо при 80°С в течение 4 с, либо при 85°С в течение 5 с, либо при 90°С в течение 5 с, либо при 95°С в течение 5 с, с последующим хранением при 4°С. Активность обработанного нагреванием фермента определяли путем инкубации с раствором лактозы (раствор 105 ммоль/л лактозы, приготовленный в натрийцитратном буфере 100 ммоль/л при рН 6,7, содержащем 100 мкмоль/л MgSO₄), как описано выше. Оптическую плотность, измеренную при различной температуре (например, при 72°С, 74°С, 76°С, 78°С, 80°С, 85°С, 90°С или 95°С), обозначали как Abs72°C, Abs74°C, Abs76°C, Abs78°C, Abs80°C, Abs85°C, Abs90°C, Abs95°C.

Процент остаточной активности при высокой температуре определяли по формуле

% остаточной активности = (Abs72°C/Abs37°C)*100

Проценты остаточной активности различных ферментов при различной температуре описаны на Фиг. 13.

Пример 21. Процентное содержание остаточной лактозы после высокотемпературной обработки

Влияние термической обработки на характеристики фермента в пастеризованном молоке определяли путем инкубации фиксированного количества фермента в молоке с последующей термической обработкой. В отдельных реакциях 50 мкл пастеризованного молока смешивали с 10 BLU/мл очищенного фермента (как определено в примере 17) в пробирке для ПЦР. Образец молока инкубировали при 72°С в течение 15 или при 76°С в течение 10 с, либо при 85°С в течение 5 с и при 90°С в течение 5 с, с последующей инкубацией при 5°С в течение 24 ч. После 24 ч при 5°С реакцию останавливали нагреванием при 95°С в течение 7 мин с последующим хранением при -20°С. Количество остаточной лактозы измеряли с помощью набора реактивов LactoSens® (Chr. Hansen, Дания), следуя протоколу поставщика. Измеренное количество остаточной лактозы, определенное при различной температуре, выражали в г/л. Предел обнаружения для набора реактивов LactoSens® составляет от 0,2 г/л до 10 г/л. Результаты описаны в таблице 3.

Пример 22. Процентное содержание остаточной лактозы в пастеризованном молоке после инкубации при различных температурах

1 мл имеющегося в продаже пастеризованного молока (молоко 1,5% жирности, содержащее 4,7% лактозы, Arla Foods, Дания) смешивали с 0,047 мг/мл фермента в пробирке Eppendorf емкостью 1,5 мл. Фермент смешивали с молоком мягким вращением или перемешиванием пипеткой. 50 мкл содержащего фермент молока переносили в пробирку для ПЦР. Для каждого фермента реакцию проводили в объеме реакционной смеси 2 по 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК при следующих параметрах инкубации: температура и время реакции 37°С в течение 30 мин, или 55°С в течение 30 мин, или 60°С в течение 30 мин; температура и время инактивации фермента 95°С в течение 10 мин; температура хранения 4°С. Чтобы свести к минимуму влияние температуры на производительность фермента, в процессе добавления, переноса пипеткой и смешивания с молоком образцы выдерживали в смеси льда с водой. После проведения реакции образцы молока либо сразу использовали для измерения остаточной лактозы, либо хранили при -20°С до дальнейшего использования. Для анализа остаточной лактозы в молоке использовали набор реактивов LactoSens^® (Chr. Hansen, Дания), следуя протоколу, поставляемому с набором. Измеренное процентное содержание остаточной лактозы в пастеризованном молоке представлено на Фиг. 14.

Для испытания этих новых лактаз на потенциальную способность к гидролизу лактозы авторы изобретения инкубировали 0,047 мг фермента на один миллилитр пастеризованного молока и проводили инкубацию при 37°С, 55°С и 60°С в течение 30 мин. После 30-минутной инкубации ферменты инактивировали нагреванием при 95°С. Количество остаточной лактозы определяли с помощью набора реактивов LactoSens^® (Chr. Hansen, Дания). Для обоих ферментов, Ha-Lactase и NOLA® fit, при их оптимальной температуре (37°С) показано высокое содержание остаточной лактозы (более 1% остаточной лактозы), поэтому можно предположить, что эти ферменты обладают пониженной активностью, и в данной временной рамке получить безлактозное пастеризованное молоко не удается. Кроме того, аналогичное содержание остаточной лактозы было измерено при 55°С и 60°С. Напротив, для ферментов G33, G44, G95 и G158 было показано содержание остаточной лактозы менее 0,1% при 37°С, Фиг. 15. Новые ферменты благодаря их высокой активности при повышенной температуре (55°С или 60°С) показали содержание остаточной лактозы менее 0,01% после 30 мин инкубации. Таким образом, показано, что при использовании действующей дозы фермента можно получить по существу безлактозное пастеризованное и фильтрованное молоко менее чем за 30 мин. Фильтрованное молоко больше напоминает сырое молоко, чем пастеризованное молоко. Гидролиз лактозы при повышенной температуре (55°С - 60°С) за короткое время уменьшает вероятность роста микроорганизмов, не влияя на качество молока.

Пример 23. Процентное содержание остаточной лактозы в пастеризованном молоке после инкубации в течение различных периодов времени

1 мл имеющегося в продаже пастеризованного молока (молоко 1,5% жирности, содержащее 4,7% лактозы, Arla Foods, Дания) смешивали с 0,047 мг/мл фермента в пробирке Eppendorf емкостью 1,5 мл. Фермент смешивали с молоком мягким вращением или с помощью пипетки. 50 мкл содержащего фермент молока переносили в пробирку для ПЦР. Для каждого фермента реакцию проводили в объеме реакционной смеси 2 по 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК при следующих параметрах инкубации: температура и время реакции 55°С в течение 15 мин или 55°С в течение 30 мин; температура и время инактивации фермента 95°С в течение 10 мин; температура хранения 4°С. Чтобы свести к минимуму влияние температуры и времени на производительность фермента, в процессе добавления, переноса пипеткой и смешивания с молоком образцы выдерживали в смеси льда с водой. После проведения реакции образцы молока либо сразу использовали для измерения остаточной лактозы, либо хранили при -20°С до дальнейшего использования. Для анализа остаточной лактозы в молоке использовали набор реактивов LactoSens^® (Chr. Hansen, Дания), как описано в примере 22. Измеренное процентное содержание остаточной лактозы в пастеризованном молоке представлено на Фиг. 16.

Пример 24. Процентное содержание остаточной лактозы в пастеризованном молоке после инкубации с различными дозами фермента

1 мл имеющегося в продаже пастеризованного молока (молоко 1,5% жирности, содержащее 4,7% лактозы, Arla Foods, Дания) смешивали с различными дозами фермента (0,024 мг/мл или 0,047 мг/мл) в пробирке Eppendorf емкостью 1,5 мл. Фермент смешивали с молоком аккуратным вращением или с помощью пипетки. 50 мкл содержащего фермент молока переносили в пробирку для ПЦР. Для каждого фермента реакцию проводили в объеме реакционной смеси 2 по 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК при следующих параметрах инкубации: температура и время реакции 55°С в течение 30 мин; температура и время инактивации фермента 95°С в течение 10 мин; температура хранения 4°С. После проведения реакции образцы либо сразу использовали для измерения остаточной лактозы, либо хранили при -20°С до дальнейшего использования. Количество остаточной лактозы в молоке анализировали, следуя тому же протоколу, который описан в примере 22. Измеренное процентное содержание остаточной лактозы в пастеризованном молоке представлено на Фиг. 17.

Пример 25. Процентное содержание остаточной лактозы в пастеризованном молоке после инкубации с различными дозами фермента и в течение различных периодов времени

1 мл имеющегося в продаже пастеризованного молока (молоко 1,5% жирности, содержащее 4,7% лактозы, Arla Foods, Дания) смешивали с различными дозами фермента (0,024 мг/мл или 0,047 мг/мл) в пробирке Eppendorf емкостью 1,5 мл. Фермент смешивали с молоком аккуратным вращением или перемешиванием пипеткой. 50 мкл содержащего фермент молока переносили в пробирку для ПЦР. Для каждого фермента реакцию проводили в объеме реакционной смеси 2 по 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК при следующих параметрах инкубации: температура и время реакции 55°С в течение 15 мин или 55°С в течение 30 мин; температура и время инактивации фермента 95°С в течение 10 мин; температура хранения 4°С. Чтобы свести к минимуму влияние температуры и времени на производительность фермента, в процессе добавления, переноса пипеткой и смешивания с молоком образцы выдерживали в смеси льда с водой. После проведения реакции образцы либо сразу использовали для измерения остаточной лактозы, либо хранили при -20°С до дальнейшего использования. Количество остаточной лактозы определяли с использованием протокола, описанного в примере 22. Измеренное процентное содержание остаточной лактозы в пастеризованном молоке представлено на Фиг. 18.

Пример 26. Процентное содержание остаточной лактозы в фильтрованном молоке

1 мл имеющегося в продаже микрофильтрованного, частично обезжиренного молока (молоко 1,5% жирности, содержащее 4,8% лактозы, молоко «Маргарита», Франция) смешивали с 0,047 мг/мл фермента в пробирке Eppendorf емкостью 1,5 мл. Фермент смешивали с молоком аккуратным вращением или перемешиванием пипеткой. 50 мкл содержащего фермент молока переносили в пробирку для ПЦР. Для каждого фермента реакцию проводили в объеме реакционной смеси 2 по 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК при следующих параметрах инкубации: температура и время реакции 55°С в течение 30 мин; температура и время инактивации фермента 95°С в течение 10 мин; температура хранения 4°С. Чтобы свести к минимуму влияние температуры и времени на производительность фермента, в процессе добавления, переноса пипеткой и смешивания с молоком образцы выдерживали в смеси льда с водой. После проведения реакции образцы либо сразу использовали для измерения остаточной лактозы, либо хранили при -20°С до дальнейшего использования. Для количественного анализа остаточной лактозы в молоке использовали набор реактивов LactoSens^® (Chr. Hansen, Дания), следуя протоколу, поставляемому с набором. Измеренное процентное содержание остаточной лактозы в фильтрованном молоке представлено на Фиг. 19.

Таким образом, показано, что при использовании действующей дозы фермента можно получить безлактозное фильтрованное молоко (фильтрованное молоко больше напоминает сырое молоко, чем пастеризованное) менее чем за 30 мин. Гидролиз лактозы при повышенной температуре (55°С - 60°С) за короткое время уменьшает вероятность роста микроорганизмов, не влияя на качество молока.

Пример 27. Процентное содержание остаточной лактозы в фильтрованном молоке после инкубации с различными дозами фермента

1 мл имеющегося в продаже микрофильтрованного, частично обезжиренного молока (молоко 1,5% жирности, содержащее 4,8% лактозы, молоко «Маргарита», Франция) смешивали с различными дозами фермента (0,055 мг/мл, 0,55 мкмоль/л, или 0,11 мг/мл, 0,11 мкмоль/л) в пробирке Eppendorf емкостью 1,5 мл. Фермент смешивали с молоком аккуратным вращением или перемешиванием пипеткой. 50 мкл содержащего фермент молока переносили в пробирку для ПЦР. Для каждого фермента реакцию проводили в объеме реакционной смеси 2 по 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК при следующих параметрах инкубации: температура и время реакции 55°С в течение 5 мин; температура и время инактивации фермента 95°С в течение 10 мин; температура хранения 4°С. Чтобы свести к минимуму влияние температуры и времени на производительность фермента, в процессе добавления, переноса пипеткой и смешивания с молоком образцы выдерживали в смеси льда с водой. После проведения реакции образцы либо сразу использовали для измерения остаточной лактозы, либо хранили при -20°С до дальнейшего использования. Количество остаточной лактозы в молоке анализировали, следуя тому же протоколу, который описан в примере 22. Измеренное процентное содержание остаточной лактозы в фильтрованном молоке представлено на Фиг. 20.

Пример 28. Процентное содержание остаточной лактозы в фильтрованном молоке после инкубации в течение различных периодов времени

1 мл имеющегося в продаже микрофильтрованного, частично обезжиренного молока (молоко 1,5% жирности, содержащее 4,8% лактозы, молоко «Маргарита», Франция) смешивали с 0,11 мг/мл (1 мкмоль/л) фермента в пробирке Eppendorf емкостью 1,5 мл. Фермент смешивали с молоком мягким вращением или перемешиванием пипеткой. 50 мкл содержащего фермент молока переносили в пробирку для ПЦР. Для каждого фермента реакцию проводили в объеме реакционной смеси 2 по 50 мкл. Реакционную смесь инкубировали в термоциклере ДНК при следующих параметрах инкубации: температура и время реакции 55°С в течение 5 мин, или 55°С в течение 6 мин, или 55°С в течение 7 мин; температура и время инактивации фермента 95°С в течение 10 мин; температура хранения 4°С. Чтобы свести к минимуму влияние температуры и времени на производительность фермента, в процессе добавления, переноса пипеткой и смешивания с молоком образцы выдерживали в смеси льда с водой. После проведения реакции образцы либо сразу использовали для измерения остаточной лактозы, либо хранили при -20°С до дальнейшего использования. Для количественного анализа остаточной лактозы в молоке использовали набор реактивов LactoSens^® (Chr. Hansen, Дания), следуя протоколу, поставляемому с набором. Измеренное процентное содержание остаточной лактозы в фильтрованном молоке представлено на Фиг. 21. Таким образом, показано, что при использовании действующей дозы фермента можно получить безлактозное пастеризованное и фильтрованное молоко (фильтрованное молоко больше напоминает сырое молоко, чем пастеризованное) менее чем за 5-30 мин. Гидролиз лактозы при повышенной температуре (55°С - 60°С) за короткое время уменьшает вероятность роста микроорганизмов, не влияя на качество молока.

Пример 29. Активность фермента при 4-5°С

Для анализа кинетики гидролиза лактозы новыми ферментами в пастеризованном молоке добавляли 0,05 мг фермента на один миллилитр имеющегося в продаже пастеризованного молока (молоко 1,5% жирности, содержащее 4,7% лактозы, Arla Foods, Дания). Фермент хорошо перемешивали аккуратным вращением и переносили в пробирку для ПЦР, 10 по 100 мкл каждая. Реакционные смеси инкубировали при 4°С и отбирали образцы после фиксированного интервала времени. Реакцию останавливали нагреванием при 95°С в течение 10 мин в устройстве для ПЦР. Образцы охлаждали до комнатной температуры и измеряли содержание остаточной лактозы с помощью набора реактивов LactoSens^® (Chr. Hansen, Дания). Измеренное значение содержания остаточной лактозы наносили на график против времени реакции.

Как показано на Фиг. 22 и 23 при 4-5°С для снижения концентрации остаточной лактозы в коровьем молоке до менее 0,1% и до менее 0,01% с помощью известных коммерческих продуктов NOLA® Fit (G600) и Ha-Lactase™ (G500) требуется от 8-12 ч до 18-24 ч соответственно.

Лактазы по настоящему изобретению в этих условиях значительно более активны. Например, при использовании самого активного фермента G95 концентрация остаточной лактозы достигает уровня менее 0,1% (4 ч). G158 и G33 способны снизить концентрацию остаточной лактозы до уровня менее 0,1% за 5-6 ч и до уровня менее 0,01% лактозы за 8-12 ч. Как показано на Фиг. 24 и 25, для нескольких лактаз после 12 ч инкубации показана сниженная концентрация остаточной лактозы по сравнению с контрольными ферментами. Эти результаты показывают, что новые лактазы действуют быстрее, чем Ha-Lactase™ и NOLA® Fit, и в результате безлактозное пастеризованное молоко получают за значительно более короткое время. Эти новые ферменты могут уменьшить общее время технологического процесса на 50%. Кроме того, как показано на Фиг. 26, с помощью новых ферментов можно дополнительно уменьшить дозу фермента для получения безлактозного/низколактозного пастеризованного молока на 25-50%.

Таким образом, эти результаты показывают, что при использовании новых лактаз можно получить безлактозное пастеризованное молоко за значительно более короткое время (8-12 ч) при дозе фермента 50 мг/л. Кроме того, в зависимости от требуемой концентрации лактозы дозу фермента можно уменьшить на 25-50%.

Пример 30. Ферментативная активность в различных типах молока при 4-5°С

Для сравнения ферментативной активности в различных типах молока пастеризованное и фильтрованное молоко инкубировали, используя фермент лактазу в концентрации 0,052 мг/л. Образцы смешивали и хранили при 4°С в течение 24 ч.

Содержание остаточной лактозы было определено с помощью набора реактивов LactoSens® (Chr. Hansen, Denmark) и представлено на Фиг. 27, где показано, что многие из новых ферментов лактаз обладают высокой активностью расщепления лактозы в пастеризованном и фильтрованном молоке при 4°С.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Chr. Hansen A/S

<120> ФЕРМЕНТЫ ЛАКТАЗЫ С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ ПРИ

ПОНИЖЕННЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

<130> P 102838

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1049

<212> PRT

<213> Bifidobacterium adolescentis

<400> 1

Met Ala Asp Thr Ala Glu Leu Ala Ile Val His Ala Thr Thr Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ser Trp Leu Thr Asp Pro Thr Val Phe Ala Ala Asn Arg Lys Pro

20 25 30

Ala His Ser Ser His Arg Tyr Val Ile Gly Glu Thr Ser Glu Pro Lys

35 40 45

Gln Ser Leu Asp Gly Glu Trp Lys Val Arg Ile Glu Gln Ala Arg Asn

50 55 60

Val Asp Val Glu Ser Ala Pro Phe Ala Ala Val Asp Phe Glu Asp Gly

65 70 75 80

Asp Phe Gly Ala Ile Glu Val Pro Gly His Leu Gln Met Ala Gly Tyr

85 90 95

Leu Lys Asn Lys Tyr Val Asn Ile Gln Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu

100 105 110

Asp Pro Gln Ala Pro Asn Ile Pro Glu Asn Asn His Val Ala Ile Tyr

115 120 125

Arg Arg Arg Phe Ala Leu Asp Ala Gln Leu Ala Arg Thr Leu Glu Asn

130 135 140

Asp Gly Thr Val Ser Leu Thr Phe His Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr

145 150 155 160

Val Trp Leu Asp Gly Thr Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Gly Phe Thr

165 170 175

Pro Ser Glu Phe Asp Val Thr Glu Ala Leu Arg Asn Gly Asn Gly Asn

180 185 190

Ala Ala Asp Ser Pro Glu Ala Glu His Thr Leu Thr Val Ala Cys Tyr

195 200 205

Glu Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu

210 215 220

His Gly Leu Phe Arg Thr Val Glu Leu Ala Ala Gln Pro His Thr His

225 230 235 240

Val Glu Thr Val Gln Leu Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Ala Asp Thr Ala

245 250 255

Gly Thr Ala Asp Thr Ala Glu Leu Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn

260 265 270

Ser Ala Asp Ala Met Thr Ile Glu Ser Thr Leu Arg Asp Gly Asp Gly

275 280 285

Asn Val Val Trp Glu Ser Thr Gln Ala Cys Asn Gly Glu Ile Ala Leu

290 295 300

Asn Ser Gly Lys Met Thr Asn Ile Ala Pro Trp Ser Ala Glu Ser Pro

305 310 315 320

Thr Leu Tyr Thr Leu Thr Val Arg Val Val Gly His Asp Gly Ala Ile

325 330 335

Ile Glu Thr Val Thr Gln Lys Ile Gly Phe Arg Thr Phe Arg Ile Glu

340 345 350

Asn Gly Ile Met Thr Leu Asn Gly Lys Arg Ile Val Phe Lys Gly Ala

355 360 365

Asp Arg His Glu Phe Asp Ala Lys Arg Gly Arg Ala Ile Thr Arg Glu

370 375 380

Asp Met Leu Ser Asp Val Val Phe Cys Lys Arg His Asn Ile Asn Ala

385 390 395 400

Ile Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln Glu Tyr Trp Tyr Asp Leu Cys

405 410 415

Asp Glu Tyr Gly Leu Tyr Leu Ile Asp Glu Thr Asn Met Glu Thr His

420 425 430

Gly Thr Trp Val Ala Asn Asn Val Glu Arg Pro Glu Asp Gly Ile Pro

435 440 445

Gly Ser Arg Pro Glu Trp Glu Gly Ala Cys Val Asp Arg Ile Asn Ser

450 455 460

Met Met Arg Arg Asp Tyr Asn His Pro Ser Val Leu Ile Trp Ser Leu

465 470 475 480

Gly Asn Glu Ser Ser Ala Gly Glu Val Phe Arg Ala Met Tyr Arg His

485 490 495

Ala His Thr Ile Asp Pro Asn Arg Pro Val His Tyr Glu Gly Ser Val

500 505 510

His Met Arg Glu Phe Glu Asp Val Thr Asp Ile Glu Ser Arg Met Tyr

515 520 525

Ala His Ala Asp Glu Ile Glu Arg Tyr Leu Asn Asp Gly Ser Pro Ala

530 535 540

His Thr Asp Gly Pro Lys Lys Pro Tyr Ile Ser Cys Glu Tyr Met His

545 550 555 560

Ala Met Gly Asn Ser Cys Gly Asn Met Asp Glu Tyr Thr Ala Leu Glu

565 570 575

Arg Tyr Pro Met Tyr Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln

580 585 590

Ala Ile Glu Thr Lys Leu Pro Asp Gly Thr Thr Arg Met Cys Tyr Gly

595 600 605

Gly Asp Phe Gly Asp Arg Pro Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly

610 615 620

Leu Leu Phe Ala Asp Arg Thr Pro Ser Pro Lys Ala Gln Glu Val Lys

625 630 635 640

Gln Leu Tyr Ala Asn Val Lys Ile Val Val Ser Val Asp Glu Ala Arg

645 650 655

Ile Thr Asn Asp Asn Leu Phe Val Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Phe Val

660 665 670

Leu Arg Ile Leu Ala Asp Gly Lys Pro Val Trp Ser Thr Thr Arg Arg

675 680 685

Phe Asp Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ser Phe Glu Val Asp Trp Pro

690 695 700

Val Asp Asp Tyr Arg Ser Asn Ala Glu Glu Leu Val Leu Glu Val Ser

705 710 715 720

Gln Gln Leu Gly Asn Ala Cys Asp Trp Ala Pro Ala Gly Tyr Glu Leu

725 730 735

Ala Phe Gly Gln Cys Val Val Ala Gly Ala Lys Thr Thr Ala Asp Ala

740 745 750

Val Asp Ala Ala Gly Ala Pro Ala Asp Gly Thr Val Thr Leu Gly Arg

755 760 765

Trp Asn Ala Gly Val Arg Gly Gln Gly Arg Glu Ala Leu Phe Ser Arg

770 775 780

Thr Gln Gly Gly Met Val Ser Tyr Thr Phe Gly Glu Arg Glu Phe Val

785 790 795 800

Leu Arg Arg Pro Ser Ile Thr Thr Phe Arg Pro Leu Thr Asp Asn Asp

805 810 815

Arg Gly Ala Gly His Ala Phe Glu Arg Ala Ala Trp Ala Val Ala Gly

820 825 830

Lys Tyr Ala Arg Cys Val Asp Cys Ala Ile Ala Asn Arg Gly Glu Asn

835 840 845

Ala Val Glu Ala Thr Tyr Thr Tyr Glu Leu Ala Ile Pro Gln Arg Thr

850 855 860

Lys Val Thr Val Arg Tyr Val Ala Asp Thr Ala Gly Leu Val Ser Leu

865 870 875 880

Asp Val Glu Tyr Pro Gly Glu Lys Asn Gly Asp Leu Pro Thr Ile Pro

885 890 895

Ala Phe Gly Ile Glu Trp Ala Leu Pro Val Glu Tyr Ala Asn Leu Arg

900 905 910

Phe Tyr Gly Ala Gly Pro Glu Glu Thr Tyr Ala Asp Arg Arg His Ala

915 920 925

Lys Leu Gly Val Trp Ser Thr Thr Ala Gly Asp Asp Cys Ala Pro Tyr

930 935 940

Leu Leu Pro Gln Glu Thr Gly Asn His Glu Asp Val Arg Trp Ala Glu

945 950 955 960

Ile Thr Asp Asp Ser Gly His Gly Val Arg Val Lys Arg Gly Ala Gly

965 970 975

Ala Lys Pro Phe Ala Met Ser Leu Leu Pro Tyr Ser Ser Thr Met Leu

980 985 990

Glu Glu Ala Leu His Gln Asp Glu Leu Pro Lys Pro Arg His Met Phe

995 1000 1005

Leu Arg Leu Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly Asp Asp Ser

1010 1015 1020

Trp Met Ser Pro Val His Glu Gln Tyr Gln Leu Pro Ala Asp Gln

1025 1030 1035

Pro Leu Ser Leu Asn Val Gln Leu Lys Leu Phe

1040 1045

<210> 2

<211> 625

<212> PRT

<213> Lactobacillus sakei

<400> 2

Met Gln Pro Asn Ile Gln Trp Leu Asp Thr Pro Ala Val Phe Arg Val

1 5 10 15

Gly Gln Leu Pro Ala His Ser Asp His Arg Tyr Tyr Ala Thr Leu Ala

20 25 30

Glu Met Ala Gln Gln Gln Ser Ser Phe Glu Gln Ser Leu Asn Gly Thr

35 40 45

Trp Gln Phe His Tyr Ser Val Asn Ala Ala Ser Arg Pro Lys Ser Phe

50 55 60

Tyr Glu Leu Ala Phe Asp Ala Gln Asp Phe Glu Pro Ile Thr Val Pro

65 70 75 80

Gln His Ile Glu Leu Ala Gly Tyr Glu Gln Leu His Tyr Ile Asn Thr

85 90 95

Met Tyr Pro Trp Glu Gly His Tyr Tyr Arg Arg Pro Ala Phe Ser Thr

100 105 110

Ser Asp Asp Lys Gln His Leu Gly Met Phe Ser Glu Ala Asp Tyr Asn

115 120 125

Pro Val Gly Ser Tyr Leu His His Phe Asp Leu Thr Pro Ala Leu Arg

130 135 140

Asn Gln Arg Val Ile Ile Arg Phe Glu Gly Val Glu Gln Ala Met Tyr

145 150 155 160

Val Trp Leu Asn Gly Gln Phe Ile Gly Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr

165 170 175

Pro Ser Glu Phe Asp Leu Thr Pro Tyr Leu Lys Glu Thr Asp Asn Cys

180 185 190

Leu Ala Val Glu Val His Lys Arg Ser Ser Ala Ala Phe Ile Glu Asp

195 200 205

Gln Asp Phe Phe Arg Phe Phe Gly Ile Phe Arg Asp Val Lys Leu Leu

210 215 220

Ala Lys Pro Arg Thr His Leu Glu Asp Leu Trp Val Ile Pro Glu Tyr

225 230 235 240

Asp Val Val Gln Gln Thr Gly Gln Val Lys Leu Arg Leu Gln Phe Ser

245 250 255

Gly Asp Glu Asn Arg Val His Leu Arg Ile Arg Asp Gln His Gln Ile

260 265 270

Ile Leu Thr Ala Asp Leu Thr Ser Ala Ala Gln Val Asn Gly Leu Tyr

275 280 285

Lys Met Pro Glu Leu Val Gln Ala Trp Ser Asn Gln Thr Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Thr Leu Glu Leu Glu Val Val Asp Gln Ala Gly Glu Thr Ile Glu

305 310 315 320

Ile Ser Gln Gln Pro Phe Gly Phe Arg Lys Ile Glu Ile Lys Asp Lys

325 330 335

Val Met Leu Leu Asn Gly Lys Arg Leu Val Ile Asn Gly Val Asn Arg

340 345 350

His Glu Trp His Pro Glu Thr Gly Arg Thr Ile Thr Ala Glu Asp Glu

355 360 365

Ala Trp Asp Ile Ala Cys Met Gln Arg Asn His Ile Asn Ala Val Arg

370 375 380

Thr Ser His Tyr Pro Asp Arg Leu Ser Phe Tyr Asn Gly Cys Asp Gln

385 390 395 400

Ala Gly Ile Tyr Met Met Ala Glu Thr Asn Leu Glu Ser His Gly Ser

405 410 415

Trp Gln Lys Met Gly Ala Val Glu Pro Ser Trp Asn Val Pro Gly Ser

420 425 430

Tyr Asp Glu Trp Glu Ala Ala Thr Leu Asp Arg Ala Arg Thr Asn Phe

435 440 445

Glu Thr Phe Lys Asn His Val Ser Ile Leu Phe Trp Ser Leu Gly Asn

450 455 460

Glu Ser Tyr Ala Gly Ser Val Leu Glu Lys Met Asn Ala Tyr Tyr Lys

465 470 475 480

Gln Gln Asp Pro Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Val Phe Arg Ala

485 490 495

Pro Glu Tyr Lys Ala Thr Ile Ser Asp Val Glu Ser Arg Met Tyr Ala

500 505 510

Thr Pro Ala Glu Ile Lys Ala Tyr Leu Asp Asn Ala Pro Gln Lys Pro

515 520 525

Phe Ile Leu Cys Glu Tyr Met His Asp Met Gly Asn Ser Leu Gly Gly

530 535 540

Met Gln Ser Tyr Ile Asp Leu Leu Ser Gln Tyr Asp Met Tyr Gln Gly

545 550 555 560

Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln Ala Leu Leu Val Thr Asp Pro

565 570 575

Val Thr Gly Gln Arg Glu Leu Arg Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg

580 585 590

Pro Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly Leu Val Phe Ala Thr Arg

595 600 605

Asp Glu Lys Pro Ala Met Gln Glu Val Arg Tyr Tyr Tyr Gly Glu His

610 615 620

Lys

625

<210> 3

<211> 330

<212> PRT

<213> Lactobacillus sakei

<400> 3

Met Lys Asn Gln Gln Cys Arg Arg Leu Asp Thr Ile Met Ala Asn Thr

1 5 10 15

Asn Lys Arg Leu Ala Val Ile Phe Gly Asp Val Thr Leu Gly Leu Lys

20 25 30

Gly Pro Asp Phe His Tyr Leu Phe Ser Tyr Gln Thr Gly Gly Pro Glu

35 40 45

Ser Leu Arg Ile Gln Gly Lys Glu Trp Leu Tyr Arg Ser Pro Lys Pro

50 55 60

Thr Phe Trp Arg Ala Thr Thr Asp Asn Asp Arg Gly Asn Gln Phe Pro

65 70 75 80

Leu Lys Ser Gly Met Trp Leu Ala Ala Asp Gln Phe Ile Ala Cys Gln

85 90 95

Ser Ile Thr Val Ala Ile Asp Gly Gln Thr Ile Pro Leu Pro Ile Ala

100 105 110

Pro Glu Asn Asn Arg Tyr Ser Gly Gln Glu Thr Ala Gln Glu Val Thr

115 120 125

Val Thr Tyr Thr Tyr Gln Thr Ile Thr Thr Pro Gln Thr Thr Val Glu

130 135 140

Val Ser Tyr Thr Ile Gln Ala Ser Gly Lys Ile Arg Val Ala Val Thr

145 150 155 160

Tyr His Gly Gln Ala Gly Leu Pro Ser Leu Pro Val Phe Gly Leu Arg

165 170 175

Phe Val Met Pro Thr Pro Ala Thr Arg Phe Ile Tyr Gln Gly Leu Ser

180 185 190

Gly Glu Thr Tyr Pro Asp Arg Met Ala Gly Gly Met Ala Gly Glu Tyr

195 200 205

Glu Val Thr Gly Leu Pro Val Thr Pro Tyr Leu Val Pro Gln Asp Cys

210 215 220

Gly Val His Met Ala Thr Asp Trp Val Thr Ile Tyr Arg Gln Ala Val

225 230 235 240

Leu Asp Asn Arg Leu Arg Glu Pro Val Glu Thr Gly Leu Lys Phe Lys

245 250 255

Met Val Asp Gln Pro Phe Ala Phe Ser Cys Leu Pro Tyr Thr Ala Glu

260 265 270

Glu Leu Glu Asn Ala Thr His His Ser Glu Leu Pro Ala Pro His Arg

275 280 285

Thr Val Leu Ser Leu Leu Gly Ala Val Arg Gly Val Gly Gly Ile Asp

290 295 300

Ser Trp Gly Ser Asp Val Glu Ala Ala Tyr Gln Ile Asp Ala Thr Gln

305 310 315 320

Asp His His Leu Glu Phe Glu Ile Ser Phe

325 330

<210> 4

<211> 1049

<212> PRT

<213> Bifidobacterium adolescentis

<400> 4

Met Ala Asp Thr Ala Glu Leu Ala Ile Val His Ala Thr Thr Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ser Trp Leu Thr Asp Pro Thr Val Phe Ala Ala Asn Arg Lys Pro

20 25 30

Ala His Ser Ser His Arg Tyr Val Ile Gly Glu Thr Ser Glu Pro Lys

35 40 45

Gln Ser Leu Asp Gly Glu Trp Lys Val Arg Ile Glu Gln Ala Arg Asn

50 55 60

Val Asp Val Glu Ser Ala Pro Phe Ala Ala Val Asp Phe Glu Asp Gly

65 70 75 80

Asp Phe Gly Ala Ile Glu Val Pro Gly His Leu Gln Met Ala Gly Tyr

85 90 95

Leu Lys Asn Lys Tyr Val Asn Ile Gln Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu

100 105 110

Asp Pro Gln Ala Pro Asn Ile Pro Glu Asn Asn His Val Ala Ile Tyr

115 120 125

Arg Arg Arg Phe Ala Leu Asp Ala Gln Leu Ala Arg Thr Leu Glu Asn

130 135 140

Asp Gly Thr Val Ser Leu Thr Phe His Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr

145 150 155 160

Val Trp Leu Asp Gly Thr Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Gly Phe Thr

165 170 175

Pro Ser Glu Phe Asp Val Thr Glu Ala Leu Arg Asn Gly Asn Gly Asn

180 185 190

Ala Ala Asp Ser Pro Glu Ala Glu His Thr Leu Thr Val Ala Cys Tyr

195 200 205

Glu Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu

210 215 220

His Gly Leu Phe Arg Thr Val Glu Leu Ala Ala Gln Pro His Thr His

225 230 235 240

Val Glu Thr Val Gln Leu Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Ala Asp Thr Ala

245 250 255

Gly Thr Ala Asp Thr Ala Glu Leu Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn

260 265 270

Pro Ala Asp Ala Met Thr Ile Glu Ser Thr Leu Arg Asp Gly Asp Gly

275 280 285

Asn Val Val Trp Glu Ser Thr Gln Ala Cys Asn Gly Glu Ile Ala Leu

290 295 300

Asn Ser Gly Lys Met Thr Asn Ile Ala Pro Trp Ser Ala Glu Ser Pro

305 310 315 320

Thr Leu Tyr Thr Leu Thr Val Arg Val Val Gly His Asp Gly Ala Ile

325 330 335

Ile Glu Thr Val Thr Gln Lys Ile Gly Phe Arg Thr Phe Arg Ile Glu

340 345 350

Asn Gly Ile Met Thr Leu Asn Gly Lys Arg Ile Val Phe Lys Gly Ala

355 360 365

Asp Arg His Glu Phe Asp Ala Lys Arg Gly Arg Ala Ile Thr Arg Glu

370 375 380

Asp Met Leu Ser Asp Val Val Phe Cys Lys Arg His Asn Ile Asn Ala

385 390 395 400

Ile Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln Glu Tyr Trp Tyr Asp Leu Cys

405 410 415

Asp Glu Tyr Gly Leu Tyr Leu Ile Asp Glu Thr Asn Met Glu Thr His

420 425 430

Gly Thr Trp Val Ala Asn Asn Val Glu Arg Pro Glu Asp Gly Ile Pro

435 440 445

Gly Ser Arg Pro Glu Trp Glu Gly Ala Cys Val Asp Arg Ile Asn Ser

450 455 460

Met Met Arg Arg Asp Tyr Asn His Pro Ser Val Leu Ile Trp Ser Leu

465 470 475 480

Gly Asn Glu Ser Ser Ala Gly Glu Val Phe Arg Ala Met Tyr Arg His

485 490 495

Ala His Thr Ile Asp Pro Asn Arg Pro Val His Tyr Glu Gly Ser Val

500 505 510

His Met Arg Glu Phe Glu Asp Val Thr Asp Ile Glu Ser Arg Met Tyr

515 520 525

Ala His Ala Asp Glu Ile Glu Arg Tyr Leu Asn Asp Gly Ser Pro Ala

530 535 540

His Thr Asp Gly Pro Lys Lys Pro Tyr Ile Ser Cys Glu Tyr Met His

545 550 555 560

Ala Met Gly Asn Ser Cys Gly Asn Met Asp Glu Tyr Thr Ala Leu Glu

565 570 575

Arg Tyr Pro Met Tyr Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln

580 585 590

Ala Ile Glu Thr Lys Leu Pro Asp Gly Thr Thr Arg Met Cys Tyr Gly

595 600 605

Gly Asp Phe Gly Asp Arg Pro Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly

610 615 620

Leu Leu Phe Ala Asp Arg Thr Pro Ser Pro Lys Ala Gln Glu Val Lys

625 630 635 640

Gln Leu Tyr Ala Asn Val Lys Ile Ala Val Ser Val Asp Glu Ala Arg

645 650 655

Ile Thr Asn Asp Asn Leu Phe Val Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Phe Val

660 665 670

Leu Arg Ile Leu Ala Asp Gly Lys Pro Val Trp Ser Thr Thr Arg Arg

675 680 685

Phe Asp Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ser Phe Glu Val Asp Trp Pro

690 695 700

Val Asp Asp Tyr Arg Ser Asn Ala Glu Glu Leu Val Leu Glu Val Ser

705 710 715 720

Gln Gln Leu Gly Asn Ala Cys Asp Trp Ala Pro Ala Gly Tyr Glu Leu

725 730 735

Ala Phe Gly Gln Cys Val Val Ala Gly Ala Lys Thr Thr Ala Asp Ala

740 745 750

Val Asp Ala Ala Gly Ala Pro Ala Asp Gly Thr Val Thr Leu Gly Arg

755 760 765

Trp Asn Ala Gly Val Arg Gly Gln Gly Arg Glu Ala Leu Phe Ser Arg

770 775 780

Thr Gln Gly Gly Met Val Ser Tyr Thr Phe Gly Glu Arg Glu Phe Val

785 790 795 800

Leu Arg Arg Pro Ser Ile Thr Thr Phe Arg Pro Leu Thr Asp Asn Asp

805 810 815

Arg Gly Ala Gly His Ala Phe Glu Arg Ala Ala Trp Ala Val Ala Gly

820 825 830

Lys Tyr Ala Arg Cys Val Asp Cys Ala Ile Ala Asn Arg Gly Glu Asn

835 840 845

Ala Val Glu Ala Thr Tyr Thr Tyr Glu Leu Ala Ile Pro Gln Arg Thr

850 855 860

Lys Val Thr Val Arg Tyr Val Ala Asp Thr Ala Gly Leu Val Ser Leu

865 870 875 880

Asp Val Glu Tyr Pro Gly Glu Lys Asn Gly Asp Leu Pro Thr Ile Pro

885 890 895

Ala Phe Gly Ile Glu Trp Ala Leu Pro Val Glu Tyr Ala Asn Leu Arg

900 905 910

Phe Tyr Gly Ala Gly Pro Glu Glu Thr Tyr Ala Asp Arg Arg His Ala

915 920 925

Lys Leu Gly Val Trp Ser Thr Thr Ala Gly Asp Asp Cys Ala Pro Tyr

930 935 940

Leu Leu Pro Gln Glu Thr Gly Asn His Glu Asp Val Arg Trp Ala Glu

945 950 955 960

Ile Thr Asp Asp Ser Gly His Gly Val Arg Val Lys Arg Gly Ala Gly

965 970 975

Ala Lys Pro Phe Ala Met Ser Leu Leu Pro Tyr Ser Ser Thr Met Leu

980 985 990

Glu Glu Ala Leu His Gln Asp Glu Leu Pro Lys Pro Arg His Met Phe

995 1000 1005

Leu Arg Leu Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly Asp Asp Ser

1010 1015 1020

Trp Met Ser Pro Val His Glu Gln Tyr Gln Leu Pro Ala Asp Gln

1025 1030 1035

Pro Leu Ser Leu Asn Val Gln Leu Lys Leu Phe

1040 1045

<210> 5

<211> 626

<212> PRT

<213> Lactobacillus amylovorus

<400> 5

Met Lys Ala Asn Ile Lys Trp Leu Asp Asp Pro Glu Val Phe Arg Ile

1 5 10 15

Asn Gln Leu Pro Ala His Ser Asp His Pro Phe Tyr Lys Asp Tyr Arg

20 25 30

Glu Trp Gln Asn His Ser Ser Ser Phe Lys Gln Ser Leu Asn Gly Ala

35 40 45

Trp Gln Phe His Phe Ser Lys Asp Pro Gln Ser Arg Pro Ile Asp Phe

50 55 60

Tyr Lys Arg Ser Phe Asp Ser Ser Ser Phe Asp Thr Ile Pro Val Pro

65 70 75 80

Ser Glu Ile Glu Leu Asn Gly Tyr Ala Gln Asn Gln Tyr Thr Asn Ile

85 90 95

Leu Tyr Pro Trp Glu Ser Lys Ile Tyr Arg Lys Pro Ala Tyr Thr Leu

100 105 110

Gly Arg Gly Ile Lys Asp Gly Asp Phe Ser Gln Gly Lys Asp Asn Thr

115 120 125

Val Gly Ser Tyr Leu Lys His Phe Asp Leu Asn Pro Ala Leu Ala Gly

130 135 140

His Asp Ile His Ile Gln Phe Glu Gly Val Glu Arg Ala Met Tyr Val

145 150 155 160

Tyr Leu Asn Gly His Phe Ile Gly Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr Pro

165 170 175

Ser Glu Phe Asp Leu Thr Pro Tyr Ile Gln Ala Lys Asp Asn Ile Leu

180 185 190

Ala Val Glu Val Phe Lys His Ser Thr Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln

195 200 205

Asp Met Phe Arg Phe Ser Gly Ile Phe Arg Ser Val Glu Leu Leu Ala

210 215 220

Leu Pro Arg Thr His Leu Met Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Val

225 230 235 240

Asn Asp Tyr His Asp Gly Val Phe Asn Ala Lys Leu His Phe Met Gly

245 250 255

Lys Thr Ser Gly Asn Val His Val Leu Ile Glu Asp Ile Asp Gly Lys

260 265 270

Thr Leu Leu Asn Lys Lys Leu Pro Leu Lys Ser Thr Val Glu Ile Glu

275 280 285

Asn Glu Thr Phe Ala Asn Val His Leu Trp Asp Asn His Asp Pro Tyr

290 295 300

Leu Tyr Gln Leu Ile Ile Glu Val His Asp Gln Asp Gly Lys Leu Val

305 310 315 320

Glu Leu Ile Pro Tyr Gln Phe Gly Phe Arg Lys Ile Glu Ile Thr Lys

325 330 335

Asp His Val Val Leu Leu Asn Gly Lys Arg Leu Ile Ile Asn Gly Val

340 345 350

Asn Arg His Glu Trp Asp Ala Lys Arg Gly Arg Ser Ile Thr Leu Ala

355 360 365

Asp Met Lys Gln Asp Ile Ala Thr Phe Lys His Asn Asn Ile Asn Ala

370 375 380

Val Arg Thr Cys His Tyr Pro Asn Gln Ile Pro Trp Tyr Tyr Leu Cys

385 390 395 400

Asp Gln Asn Gly Ile Tyr Met Met Ala Glu Asn Asn Leu Glu Ser His

405 410 415

Gly Thr Trp Gln Lys Leu Gly Gln Val Glu Ala Thr Ser Asn Val Pro

420 425 430

Gly Ser Ile Pro Glu Trp Arg Glu Val Val Val Asp Arg Ala Arg Ser

435 440 445

Asn Tyr Glu Thr Phe Lys Asn His Thr Ala Ile Leu Phe Trp Ser Leu

450 455 460

Gly Asn Glu Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Ile Ala Ala Met Asn Lys Leu

465 470 475 480

Tyr Lys Asp His Asp Ser Ser Arg Leu Thr His Tyr Glu Gly Val Phe

485 490 495

His Ala Pro Glu Phe Lys Lys Glu Ile Ser Asp Leu Glu Ser Cys Met

500 505 510

Tyr Leu Pro Pro Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Lys

515 520 525

Pro Leu Val Glu Cys Glu Tyr Met His Asp Met Gly Thr Pro Asp Gly

530 535 540

Gly Met Gly Ser Tyr Ile Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Pro Gln Tyr Met

545 550 555 560

Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln Ala Leu Leu Val His Asp

565 570 575

Pro Val Ser Gly Gln Asp Val Leu Arg Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp

580 585 590

Arg His Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly Leu Met Phe Ala Asp

595 600 605

Arg Thr Pro Lys Pro Ala Met Gln Glu Val Arg Tyr Tyr Tyr Gly Leu

610 615 620

His Lys

625

<210> 6

<211> 316

<212> PRT

<213> Lactobacillus amylovorus

<400> 6

Met Ala Tyr Thr Asn Asn Leu His Val Val Tyr Gly Glu Ala Ser Leu

1 5 10 15

Gly Val Asn Gly Gln Asp Phe Ala Tyr Leu Phe Ser Tyr Glu Arg Gly

20 25 30

Gly Leu Glu Ser Leu Lys Ile Lys Asp Lys Glu Trp Leu Tyr Arg Thr

35 40 45

Pro Thr Pro Thr Phe Trp Arg Ala Thr Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Phe Asn Gln Lys Ala Ala Gln Trp Leu Gly Ala Asp Met Phe Thr

65 70 75 80

Lys Cys Val Gly Ile His Val Gln Val Asp Asp His Arg Phe Asp Glu

85 90 95

Leu Pro Val Ala Pro Ile Asn Asn Gln Phe Ser Asn Gln Glu Phe Ala

100 105 110

His Glu Val Lys Val Ala Phe Asp Tyr Glu Thr Leu Thr Thr Pro Ala

115 120 125

Thr Lys Val Lys Ile Ile Tyr Asn Ile Asn Asp Phe Gly His Met Thr

130 135 140

Ile Thr Met His Tyr Phe Gly Lys Lys Gly Leu Pro Pro Leu Pro Val

145 150 155 160

Ile Gly Met Arg Phe Ile Met Pro Thr Lys Ala Lys Ser Phe Asp Tyr

165 170 175

Thr Gly Leu Ser Gly Glu Thr Tyr Pro Asp Arg Met Ala Gly Ala Glu

180 185 190

Arg Gly Thr Phe His Ile Asp Gly Leu Pro Val Thr Lys Tyr Leu Val

195 200 205

Pro Gln Glu Asn Gly Met His Met Gln Thr Asn Glu Leu Val Ile Thr

210 215 220

Arg Asn Ser Thr Gln Asn Asn Ala Asp Lys Asp Gly Asp Phe Ser Leu

225 230 235 240

Lys Ile Thr Gln Thr Lys Gln Pro Phe Asn Phe Ser Leu Leu Pro Tyr

245 250 255

Thr Ala Glu Glu Leu Glu Asn Ala Thr His Ile Glu Glu Leu Pro Leu

260 265 270

Ala Arg Arg Ser Val Leu Val Ile Ala Gly Ala Val Arg Gly Val Gly

275 280 285

Gly Ile Asp Ser Trp Gly Ser Asp Val Glu Glu Gln Tyr His Ile Asp

290 295 300

Pro Glu Gln Asp His Glu Phe Ser Phe Thr Leu Asn

305 310 315

<210> 7

<211> 1052

<212> PRT

<213> Bifidobacterium bifidum

<400> 7

Met Asn Thr Thr Asp Asp Gln Arg Lys Asn Gly Asp Pro Ile Val Ser

1 5 10 15

Pro Ser Ile Pro Thr Thr Ala Trp Leu Ala Asp Pro Arg Val Tyr Ala

20 25 30

Val His Arg Leu Asp Ala His Ser Asp His Ala Cys Trp Ser Arg Ser

35 40 45

Pro Val Asp Gly Glu Ser Thr Asp Leu Arg Gln Ser Leu Asp Gly Glu

50 55 60

Trp Arg Val Arg Val Glu Thr Ala Pro Thr Gly Arg Phe Pro Asp Gly

65 70 75 80

Thr Ser Asp Gly Pro Asp Trp Ile Ser Asp Val Ser Pro Leu Phe Ala

85 90 95

Ala Pro Gly Phe Asp Asp Ser Ser Phe Ser Arg Val Gln Val Pro Ser

100 105 110

His Leu Glu Thr Ala Gly Leu Leu Ala Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln

115 120 125

Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu Asp Pro Lys Ala Pro Ala Ile Pro Glu

130 135 140

His Gly His Val Ala Val Tyr Arg Arg Glu Phe Asp Ala Asp Gly Glu

145 150 155 160

Val Ala Gln Ala Val Arg Glu Gly Arg Pro Val Thr Leu Thr Phe Gln

165 170 175

Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu Asn Gly Ser Phe Ile Gly

180 185 190

Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu Phe Asp Val Thr Asp Ala

195 200 205

Ile Lys Val Asp Gly Asn Val Leu Ala Val Ala Cys Tyr Glu Tyr Ser

210 215 220

Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu His Gly Leu

225 230 235 240

Phe Arg Ser Val Glu Leu Asn Ala Arg Pro Ala Ala His Val Ala Asp

245 250 255

Leu His Ala Asp Ala Asp Trp Asp Leu Ala Thr Ser Arg Gly Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Asp Val Leu Ile Asp Gly Ala Ala Asn Ala Ala Thr Ala Asp

275 280 285

Phe Ala Leu Arg Asp Lys Asn Gly Thr Ile Val Trp Arg Thr Ala Thr

290 295 300

Lys Ala Asp Gly Thr Leu His Ala Glu Ala Glu Ile Asp Asp Ala Ala

305 310 315 320

Pro Trp Ser Ala Glu Arg Pro Asp Leu Tyr Glu Leu Ser Val Thr Leu

325 330 335

Leu Asp Ala Asp Gly Lys Val Leu Glu Thr Ala Arg Thr Arg Ile Gly

340 345 350

Phe Arg His Val Ala Ile Glu Asp Gly Ile Leu Lys Leu Asn Gly Lys

355 360 365

Arg Leu Val Phe Arg Gly Val Asn Arg His Glu Phe Asp Cys Arg Arg

370 375 380

Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Leu Trp Asp Ile Arg Phe Met

385 390 395 400

Lys Arg His Asn Ile Asn Ala Val Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln

405 410 415

Ser Arg Trp Tyr Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Tyr Leu Ile Asp

420 425 430

Glu Thr Asn Leu Glu Thr His Gly Ser Trp Asn Ser Pro Gly Asp Ile

435 440 445

Pro Val Gly Thr Ser Val Pro Gly Asp Asp Glu Ala Trp Leu Gly Ala

450 455 460

Cys Ile Asp Arg Leu Asp Ser Met Ile Leu Arg Asp Arg Asn His Pro

465 470 475 480

Ser Val Leu Val Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ser Tyr Ala Gly Glu Val

485 490 495

Leu Lys Ala Met Ser Ala His Ala His Gln Leu Asp Pro Gly Arg Pro

500 505 510

Val His Tyr Glu Gly Val Asn Trp Asn His Ala Tyr Asp Gly Ile Ser

515 520 525

Asp Phe Glu Ser Arg Met Tyr Ala Lys Pro Ala Glu Ile Gln Asp Trp

530 535 540

Leu Glu His Gly Asp Glu Arg Gly Glu Ala Ser Lys Pro Phe Val Ser

545 550 555 560

Cys Glu Tyr Met His Ala Met Gly Asn Ser Cys Gly Gly Leu Ser Glu

565 570 575

Phe Ile Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Ser Gly Gly Phe Ile Trp

580 585 590

Asp Tyr Ile Asp Gln Gly Leu Val Gln Arg Leu Pro Asp Gly Ser Glu

595 600 605

Arg Leu Ser Val Gly Gly Glu Trp Gly Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu

610 615 620

Phe Val Gly Asn Gly Ile Val Phe Ala Asp Arg Thr Pro Ser Pro Lys

625 630 635 640

Ala Gln Glu Val Lys Gln Leu Tyr Ser Pro Val Lys Leu Ala Pro Asp

645 650 655

Gly His Gly Val Thr Ile Glu Asn Arg Asn Leu Phe Ala Gly Thr Asp

660 665 670

Gly Tyr Val Phe Ala Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gly His Glu Ile Trp

675 680 685

His Ala Asp Tyr Arg Phe Asp Val Ala Ala Gly Asp Thr Gln His His

690 695 700

Asp Ile Ala Phe Pro Asp Ile Asp Ala Asp Gly Asp Thr Arg Glu Val

705 710 715 720

Thr Tyr Glu Val Asp Leu Leu Leu Ala Glu Ala Thr Ala Trp Ala Pro

725 730 735

Ala Gly Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Gln Leu Thr Gly Thr Leu Asn Pro

740 745 750

Glu Gln Asp Ile Thr Glu Thr Ser His Asp Asp Asp Gly Arg Ala Thr

755 760 765

Arg Thr Leu Ser Arg Trp Asn Ala Gly Ile Arg Arg Asp Asp Glu Glu

770 775 780

Ile Leu Leu Ser Arg Thr Gln Gly Gly Ile Val Ser Trp Lys Arg Asp

785 790 795 800

Asp Arg Glu Met Val Ile Arg Arg Pro Glu Leu Val Thr Phe Arg Pro

805 810 815

Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Asn His Ser Gly Phe Asp Arg Ala Ala

820 825 830

Trp Phe Ala Ala Gly Arg Tyr Ala Ile Val Thr Glu Thr Lys Ile His

835 840 845

Glu Ser Asp Asp Gly Leu Val Ala Glu Tyr Gln Tyr Glu Leu Ala Asp

850 855 860

Pro Asn His Thr Pro Val Ser Val Thr Tyr His Val Asn Ser Asp Met

865 870 875 880

Arg Met Gln Leu Thr Val Glu Tyr Pro Gly Asn Ala Thr Asp Met Ala

885 890 895

Ser Leu Pro Ala Phe Gly Ile Glu Trp Glu Leu Pro Gly Glu Tyr Asp

900 905 910

Arg Leu Arg Tyr Tyr Gly Pro Gly Pro Glu Glu Thr Tyr Arg Asp Arg

915 920 925

Lys Gln Gly Gly Lys Leu Gly Ile Trp Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser

930 935 940

Met Ala Pro Tyr Leu Met Val Gln Glu Thr Gly Ser His Glu Asp Val

945 950 955 960

Arg Trp Leu Glu Ala Thr Asp Ile Gln Gly His Gly Leu Arg Val Thr

965 970 975

Gln Arg Gly Asp Arg His Phe Thr Ala Ser Leu Leu Pro Trp Asn Thr

980 985 990

Tyr Thr Ile Glu Ala Ala Arg Arg His Glu Asp Leu Pro Lys Pro Arg

995 1000 1005

His Asn Tyr Leu Arg Leu Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly

1010 1015 1020

Asp Asp Ser Trp Gly Ala Pro Val His Thr Ala Tyr Gln Leu Pro

1025 1030 1035

Ala Gly Arg Pro Leu Thr Leu Asp Val Asn Leu Glu Leu Ile

1040 1045 1050

<210> 8

<211> 1052

<212> PRT

<213> Bifidobacterium bifidum

<400> 8

Met Asn Thr Thr Asp Asp Gln Arg Lys Asn Gly Asp Pro Ile Val Ser

1 5 10 15

Pro Ser Ile Pro Thr Thr Ala Trp Leu Ala Asp Pro Arg Val Tyr Ala

20 25 30

Val His Arg Leu Asp Ala His Ser Asp His Ala Cys Trp Ser Arg Ser

35 40 45

Pro Val Asp Gly Glu Ser Thr Asp Leu Arg Gln Ser Leu Asp Gly Glu

50 55 60

Trp Arg Val Arg Val Glu Thr Ala Pro Thr Gly Arg Phe Pro Asp Gly

65 70 75 80

Thr Ser Asp Gly Pro Asp Trp Ile Ser Asp Val Ser Pro Leu Phe Ala

85 90 95

Ala Pro Gly Phe Asp Asp Ser Ser Phe Ser Arg Val Gln Val Pro Ser

100 105 110

His Leu Glu Thr Ala Gly Leu Leu Ala Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln

115 120 125

Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu Asp Pro Lys Ala Pro Ala Ile Pro Glu

130 135 140

His Gly His Val Ala Val Tyr Arg Arg Glu Phe Asp Ala Asp Gly Glu

145 150 155 160

Val Ala Gln Ala Val Arg Glu Gly Arg Pro Val Thr Leu Thr Phe Gln

165 170 175

Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu Asn Gly Ser Phe Ile Gly

180 185 190

Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu Phe Asp Val Thr Asp Ala

195 200 205

Ile Lys Val Asp Gly Asn Val Leu Ala Val Ala Cys Tyr Glu Tyr Ser

210 215 220

Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu His Gly Leu

225 230 235 240

Phe Arg Ser Val Glu Leu Asn Ala Arg Pro Ala Ala His Val Ala Asp

245 250 255

Leu His Ala Asp Ala Asp Trp Asp Leu Ala Thr Ser Arg Gly Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Asp Val Leu Ile Asp Gly Ala Ala Asn Ala Ala Thr Ala Asp

275 280 285

Phe Ala Leu Trp Asp Lys Asn Gly Thr Ile Val Trp His Ile Val Thr

290 295 300

Lys Ala Asp Gly Thr Leu His Ala Glu Ala Glu Ile Asp Asp Ala Ala

305 310 315 320

Pro Trp Ser Ala Glu Arg Pro Asp Leu Tyr Glu Leu Ser Val Thr Leu

325 330 335

Leu Asp Ala Asp Gly Lys Val Leu Glu Thr Ala Arg Thr Arg Ile Gly

340 345 350

Phe Arg His Val Ala Ile Glu Asp Gly Ile Leu Lys Leu Asn Gly Lys

355 360 365

Arg Leu Val Phe Arg Gly Val Asn Arg His Glu Phe Asp Cys Arg Arg

370 375 380

Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Leu Trp Asp Ile Arg Phe Met

385 390 395 400

Lys Arg His Asn Ile Asn Ala Val Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln

405 410 415

Ser Arg Trp Tyr Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Tyr Leu Ile Asp

420 425 430

Glu Thr Asn Leu Glu Thr His Gly Ser Trp Asn Ser Pro Gly Asp Ile

435 440 445

Pro Val Gly Thr Ser Val Pro Gly Asp Asp Glu Ala Trp Leu Gly Ala

450 455 460

Cys Ile Asp Arg Leu Asp Ser Met Ile Leu Arg Asp Arg Asn His Pro

465 470 475 480

Ser Val Leu Val Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ser Tyr Ala Gly Glu Val

485 490 495

Leu Lys Ala Met Ser Ala His Ala His Arg Leu Asp Pro Gly Arg Pro

500 505 510

Val His Tyr Glu Gly Val Asn Trp Asn His Ala Tyr Asp Gly Ile Ser

515 520 525

Asp Phe Glu Ser Arg Met Tyr Ala Lys Pro Ala Glu Ile Gln Asp Trp

530 535 540

Leu Glu His Gly Asp Glu Arg Gly Glu Ala Ser Lys Pro Phe Val Ser

545 550 555 560

Cys Glu Tyr Met His Ala Met Gly Asn Ser Cys Gly Gly Leu Ser Glu

565 570 575

Phe Ile Asp Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Ser Gly Gly Phe Ile Trp

580 585 590

Asp Tyr Ile Asp Gln Gly Leu Val Gln Arg Leu Pro Asp Gly Ser Glu

595 600 605

Arg Leu Ser Val Gly Gly Glu Trp Gly Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu

610 615 620

Phe Val Gly Asn Gly Ile Val Phe Ala Asp Arg Thr Pro Ser Pro Lys

625 630 635 640

Ala Gln Glu Val Lys Gln Leu Tyr Ser Pro Val Lys Leu Ala Pro Asp

645 650 655

Gly His Gly Val Thr Ile Glu Asn Arg Asn Leu Phe Ala Gly Thr Asp

660 665 670

Gly Tyr Val Phe Ala Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gly His Glu Ile Trp

675 680 685

His Ala Asp Tyr Arg Phe Asp Val Ala Ala Gly Asp Thr Gln His His

690 695 700

Asp Ile Ala Phe Pro Asp Ile Asp Ala Asp Gly Asp Thr Arg Glu Val

705 710 715 720

Thr Tyr Glu Val Asp Leu Leu Leu Ala Glu Ala Thr Ala Trp Ala Pro

725 730 735

Ala Gly Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Gln Leu Thr Gly Thr Leu Asn Pro

740 745 750

Glu Gln Asp Ile Thr Glu Thr Ser His Asp Asp Asp Gly Arg Ala Thr

755 760 765

Arg Thr Leu Ser Arg Trp Asn Ala Gly Ile Arg Arg Asp Asp Lys Glu

770 775 780

Ile Leu Leu Ser Arg Thr Gln Gly Gly Ile Val Ser Trp Lys Arg Asp

785 790 795 800

Asp Arg Glu Met Val Ile Arg Arg Pro Glu Leu Val Thr Phe Arg Pro

805 810 815

Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Asn His Ser Gly Phe Asp Arg Ala Ala

820 825 830

Trp Phe Ala Ala Gly Arg Tyr Ala Ile Val Thr Glu Thr Lys Ile His

835 840 845

Glu Ser Asp Asp Gly Leu Val Ala Glu Tyr Gln Tyr Glu Leu Ala Asp

850 855 860

Pro Asn His Thr Pro Val Ser Val Thr Tyr His Val Asn Ser Asp Met

865 870 875 880

Arg Met Gln Leu Thr Val Glu Tyr Pro Gly Asn Ala Thr Asp Met Ala

885 890 895

Ser Leu Pro Ala Phe Gly Ile Glu Trp Glu Leu Pro Gly Glu Tyr Asp

900 905 910

Arg Leu Arg Tyr Tyr Gly Pro Gly Pro Glu Glu Thr Tyr Arg Asp Arg

915 920 925

Lys Gln Gly Gly Lys Leu Gly Ile Trp Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser

930 935 940

Met Ala Pro Tyr Leu Met Val Gln Glu Thr Gly Ser His Glu Asp Val

945 950 955 960

Arg Trp Leu Glu Ala Thr Asp Ile Gln Gly His Gly Leu Arg Val Thr

965 970 975

Gln Arg Gly Asp Arg His Phe Thr Ala Ser Leu Leu Pro Trp Asn Thr

980 985 990

Tyr Met Ile Glu Ala Ala Arg Arg His Glu Asp Leu Pro Glu Pro Arg

995 1000 1005

His Asn Tyr Leu Arg Leu Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly

1010 1015 1020

Asp Asp Ser Trp Gly Ala Pro Val His Thr Ala Tyr Gln Leu Pro

1025 1030 1035

Ala Gly Arg Pro Leu Thr Leu Asp Val Asn Leu Glu Leu Ile

1040 1045 1050

<210> 9

<211> 1055

<212> PRT

<213> Bifidobacterium breve

<400> 9

Met Thr Asn Ser Met Gln Gly Lys Ala Lys Thr Ile Met Thr Asn Leu

1 5 10 15

Gln Ser Ala Gln Gln Phe Ser Gln Ala Trp Leu Thr Asp Pro Arg Val

20 25 30

Phe Ala Val Asn Arg Leu Ala Ala His Ser Ser His Lys Phe Tyr Asp

35 40 45

His Ser Pro Gln Cys Gly Glu Ala Met Asp Leu Lys Gln Ser Leu Asp

50 55 60

Gly Gln Trp Arg Val Gln Met Leu Asp Leu Ala Asp Leu Ala Asp Asn

65 70 75 80

Glu Leu Ala Glu Ala Ala Phe Ala Gln Pro Gly Tyr Asp Ala Ala Gly

85 90 95

Phe Ser Pro Ile Glu Val Pro Ser Ala Leu Glu Thr Lys Gly Phe Leu

100 105 110

Asn His Gln Tyr Val Asn Gln Gln Tyr Pro Trp Ser Gly His Glu Ser

115 120 125

Pro Val Ala Pro Asp Val Pro Lys His Asn His Val Ala Leu Tyr Arg

130 135 140

His Glu Phe Ser Leu Glu Pro Lys Ala Ala Ala Val Leu Glu Ala Asn

145 150 155 160

Lys Thr Ala Ala Asp Asp Ala Ala Lys Arg Arg Val Thr Leu Thr Phe

165 170 175

Gln Gly Ala Ala Thr Ala Ile Val Val Trp Leu Asn Gly Ala Phe Ile

180 185 190

Gly Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu Phe Asp Val Thr Asp

195 200 205

Val Leu Arg Asp Gly Val Asn Thr Leu Ala Val Ala Cys Phe Glu Phe

210 215 220

Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu His Gly

225 230 235 240

Ile Phe Arg Ser Val Glu Leu Glu Ala Gln Pro Leu Val His Val Asn

245 250 255

Asp Leu Arg Val Leu Ala Asp Tyr Asp His Thr Thr Gly Glu Gly Ser

260 265 270

Leu Asp Val Val Ala Leu Leu Arg Asn Ala Gly Thr Ala Ala Ala Val

275 280 285

Ala Ala Thr Val Leu Asp Ala Ala Gly Asn Thr Val Trp His Ser Lys

290 295 300

Leu Thr Ala Gly Ala Asp Ala Glu Thr Leu Thr Val Lys Ala Asn Val

305 310 315 320

Gly Lys Val Asn Pro Trp Ser Ala Glu Glu Pro Thr Leu Tyr Thr Leu

325 330 335

Gln Val Val Ala Thr Asp Ala Ala Gly Gln Val Ile Glu Ala Ala Leu

340 345 350

Gln Arg Ile Gly Phe Arg His Phe Ala Ile Glu Asp Gly Leu Met Lys

355 360 365

Leu Asn Gly Lys Arg Ile Val Phe Lys Gly Val Asp Arg His Glu Phe

370 375 380

Asp Ala Arg Thr Gly Arg Thr Ile Ala Glu Ala Asp Met Ile Glu Asp

385 390 395 400

Ile His Ser Phe Lys Arg Leu Asn Ile Asn Ala Val Arg Thr Ser His

405 410 415

Tyr Pro Asn Glu Thr Arg Trp Tyr Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Ile

420 425 430

Tyr Val Leu Asp Glu Thr Asn Leu Glu Thr His Gly Ser Trp Thr Asp

435 440 445

Pro Gly Asp Val Phe Gln Pro Ala Arg Ala Ile Pro Gly Ser Lys Asp

450 455 460

Glu Trp Arg Ala Ala Cys Val Asp Arg Thr Ala Ser Met Val Arg Arg

465 470 475 480

Asp Tyr Asn His Pro Ser Val Val Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu Ala

485 490 495

Phe Gly Gly Asp Val Phe Tyr Ser Met Arg Asp Phe Val His Glu Asn

500 505 510

Asp Pro Phe Arg Pro Val His Tyr Glu Gly Thr Phe Asn Asp Pro Glu

515 520 525

Phe Ser Ala Ala Thr Asp Ile Met Ser Arg Met Tyr Ala Lys Pro Asp

530 535 540

Glu Ile Val Lys Leu Tyr Leu Gly Glu Asp Gly Lys Lys Pro Tyr Ile

545 550 555 560

Ser Cys Glu Tyr Ser His Ser Met Gly Asn Ser Thr Gly Gly Leu His

565 570 575

Leu Tyr Thr Glu Leu Glu Arg Tyr Pro Leu Tyr Gln Gly Gly Phe Ile

580 585 590

Trp Asp Tyr Val Asp Gln Ala Leu Trp Gln Asp Cys Gly Asn Gly Thr

595 600 605

Glu Arg Leu Ala Tyr Gly Gly Asp Phe Glu Asp Arg Pro Asn Asp Tyr

610 615 620

Glu Phe Ser Gly Asp Gly Val Met Phe Ala Asp Arg Thr Pro Ser Pro

625 630 635 640

Lys Ala Gln Glu Val Lys Gln Leu Tyr Ala Asn Val Lys Leu Val Pro

645 650 655

Asp Glu Ser Gly Val Thr Ile Thr Asn Asp Asn Leu Phe Ile Ser Thr

660 665 670

Ala Ser Ser Leu Phe Thr Ala Arg Val Leu Val Asp Gly Ala Glu Arg

675 680 685

Trp His Ala Asn Tyr Arg Phe Asp Val Pro Ala Gly Glu Thr Val Arg

690 695 700

Glu Pro Ile Ala Phe Pro Lys Val Thr Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly

705 710 715 720

Ser Ala Glu Val Thr Tyr Glu Val Asp Gln Arg Leu Ala Glu Ala Thr

725 730 735

Asp Trp Ala Pro Ala Gly Tyr Glu Leu Thr Phe Gly Gln Tyr Val Ala

740 745 750

Ala Val Ser Phe Asp Asp Gly Ala Ala Asp Ala Val Val Ala Gly Asp

755 760 765

Ala Glu Val Ala Ala Asp Gly Phe Asn Ala Gly Ile His Thr Asp Phe

770 775 780

Gly Glu Val Leu Leu Ser Lys Thr Gln Gly Gly Met Val Ser Phe Lys

785 790 795 800

Arg Asp Gly Arg Glu Met Val Ile Arg Arg Pro Asn Leu Thr Thr Phe

805 810 815

Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Asn Gly Ser Gly Phe Glu Arg

820 825 830

Ala Gln Trp Met Ala Ala Gly Arg Tyr Ala Arg Val Thr Gly Thr Ser

835 840 845

Val Glu Glu Thr Ala Asp Gly Lys Gly Leu Lys Ala Thr Tyr Ser Tyr

850 855 860

Glu Leu Ala Asp Ala Lys His Thr Pro Val Thr Val His Tyr Glu Val

865 870 875 880

Asp Ala Ala Leu Arg Val His Leu Thr Val Glu Tyr Pro Gly Glu Ala

885 890 895

Asp Ala Ala Thr Leu Pro Ala Phe Gly Leu Glu Trp Ile Leu Pro Lys

900 905 910

Gln Tyr Asp Arg Leu Arg Phe Tyr Gly Leu Gly Pro Glu Glu Thr Tyr

915 920 925

Ala Asp Arg Leu His Gly Ala Lys Leu Gly Val Phe Ser Arg Thr Ala

930 935 940

Ala Glu Asp Cys Ala Pro Tyr Leu Leu Pro Gln Glu Thr Gly Asn His

945 950 955 960

Glu Gln Val Arg Trp Ala Glu Ile Thr Asp Glu Tyr Gly His Gly Met

965 970 975

Arg Val Thr Ala Ala Gly Gly Thr Arg Phe Ala Thr Ser Leu Leu Pro

980 985 990

Tyr Ser Ser Leu Met Phe Glu Asp Ala Leu His Gln Asn Glu Leu Pro

995 1000 1005

Lys Pro Arg His Thr Phe Leu Arg Leu Leu Ala Ala Gln Met Gly

1010 1015 1020

Val Gly Gly Asp Asp Thr Trp Gly Ala Pro Val His Asp Glu Phe

1025 1030 1035

Gln Val Pro Ala Asp Gln Pro Leu Lys Leu Asp Val Thr Leu Glu

1040 1045 1050

Leu Ile

1055

<210> 10

<211> 689

<212> PRT

<213> Bifidobacterium catenulatum

<400> 10

Met Thr Gln Arg Arg Ser Tyr Arg Trp Pro Gln Pro Leu Ala Gly Gln

1 5 10 15

Gln Ala Arg Ile Trp Tyr Gly Gly Asp Tyr Asn Pro Asp Gln Trp Pro

20 25 30

Glu Glu Val Trp Asp Asp Asp Val Arg Leu Met Lys Lys Ala Gly Val

35 40 45

Asn Leu Val Ser Val Gly Ile Phe Ser Trp Ala Lys Ile Glu Thr Ser

50 55 60

Glu Gly Val Tyr Asp Phe Asp Trp Leu Asp Arg Ile Ile Asp Lys Leu

65 70 75 80

Gly Glu Ala Gly Ile Ala Val Asp Leu Ala Ser Ala Thr Ala Ser Pro

85 90 95

Pro Met Trp Leu Thr Gln Ala His Pro Glu Val Leu Trp Lys Asp Tyr

100 105 110

Arg Gly Asp Val Cys Gln Pro Gly Ala Arg Gln His Trp Arg Pro Thr

115 120 125

Ser Pro Val Phe Arg Glu Tyr Ala Leu Lys Leu Cys Arg Ala Met Ala

130 135 140

Glu His Tyr Lys Gly Asn Pro Tyr Val Val Ala Trp His Val Ser Asn

145 150 155 160

Glu Tyr Gly Cys His Asn Arg Phe Asp Tyr Ser Glu Asp Ala Glu Arg

165 170 175

Ala Phe Arg Lys Trp Cys Glu Glu Arg Tyr Gly Thr Ile Asp Ala Val

180 185 190

Asn Asp Ala Trp Gly Thr Ala Phe Trp Ala Gln Arg Met Asn Asp Phe

195 200 205

Thr Glu Ile Val Pro Pro Arg Phe Ile Gly Asp Gly Asn Phe Met Asn

210 215 220

Pro Gly Lys Leu Leu Asp Phe Lys Arg Phe Ser Ser Asp Ala Leu Lys

225 230 235 240

Ala Phe Tyr Val Ala Glu Arg Asp Ala Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp

245 250 255

Leu Pro Leu Thr Thr Asn Phe Met Val Ser Ala Ala Gly Ser Val Leu

260 265 270

Asp Tyr Asp Asp Trp Gly Arg Glu Val Asp Phe Val Ser Asn Asp His

275 280 285

Tyr Phe Ile Pro Gly Glu Ala His Leu Asp Glu Leu Ala Phe Ser Ala

290 295 300

Ser Leu Val Asp Gly Ile Ala Arg Lys Asp Pro Trp Phe Leu Met Glu

305 310 315 320

His Ser Thr Ser Ala Val Asn Trp Arg Pro Val Asn Tyr Arg Lys Glu

325 330 335

Pro Gly Gln Leu Val Arg Asp Ser Leu Ala His Val Ala Met Gly Ala

340 345 350

Asp Ala Val Cys Tyr Phe Gln Trp Arg Gln Ser Lys Ala Gly Ala Glu

355 360 365

Lys Phe His Ser Ala Met Val Pro His Thr Gly Glu Asp Ser Ala Val

370 375 380

Phe Arg Asp Val Cys Glu Leu Gly Ala Asp Leu Asn Thr Leu Ala Asp

385 390 395 400

Asn Gly Leu Leu Gly Thr Lys Leu Ala Lys Ser Lys Val Ala Val Val

405 410 415

Phe Asp Tyr Glu Ser Glu Trp Ala Thr Glu His Thr Ala Thr Pro Thr

420 425 430

Gln Lys Val His His Val Asp Glu Pro Leu Gln Trp Phe Arg Ala Leu

435 440 445

Ala Asp His Gly Val Thr Ala Asp Val Val Pro Val Ser Ser Asn Trp

450 455 460

Asp Glu Tyr Glu Val Val Val Leu Pro Ser Val Tyr Ile Leu Ser Glu

465 470 475 480

Glu Thr Thr Arg Arg Val Arg Asp Tyr Val Val Asn Gly Gly Arg Leu

485 490 495

Ile Val Thr Tyr Tyr Thr Gly Leu Ser Asp Glu Lys Asp His Val Trp

500 505 510

Leu Gly Gly Tyr Pro Gly Ser Ile Arg Asp Val Val Gly Val Arg Val

515 520 525

Glu Glu Phe Met Pro Met Gly Asp Asp Phe Pro Gly Val Pro Asp Cys

530 535 540

Leu Gly Leu Ser Asn Gly Ala Val Ala His Asp Ile Ala Asp Val Ile

545 550 555 560

Gly Ser Val Asp Gly Thr Ala Thr Val Leu Glu Thr Phe Arg Asp Asp

565 570 575

Pro Trp Thr Gly Met Asp Gly Ala Pro Ala Ile Val Ala Asn Thr Phe

580 585 590

Gly Glu Gly Arg Ser Val Tyr Val Gly Ala Arg Leu Gly Arg Asp Gly

595 600 605

Ile Ala Lys Ser Leu Pro Glu Ile Phe Glu Ser Leu Gly Met Ala Glu

610 615 620

Thr Gly Glu Asn Asp Ser Arg Val Leu Arg Val Glu Arg Glu Gly Ser

625 630 635 640

Asp Gly Ser Arg Phe Val Phe Ser Phe Asn Arg Thr His Glu Ala Val

645 650 655

Gln Ile Pro Phe Glu Gly Lys Ile Val Val Ser Ser Phe Ala Glu Val

660 665 670

Ser Gly Glu Asn Val Ser Ile Lys Pro Asn Gly Val Ile Val Thr Lys

675 680 685

Gln

<210> 11

<211> 1023

<212> PRT

<213> Bifidobacterium catenulatum

<400> 11

Met Ala Asn Ser Asn Arg Val Glu His Ala Ser Glu Thr Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Thr Val Phe Glu Val Asn Arg Thr Pro Ala His Ser Asn His

20 25 30

Lys Cys Phe Thr His Asp Pro Gln Ser Gly Glu His Ser Asp Leu Thr

35 40 45

Gln Ser Leu Asp Gly Glu Trp Arg Val Glu Ile Val Gln Ala Ser Asp

50 55 60

Ile Asp Phe Asn Glu Glu Pro Phe Val Ala Glu Asn Phe Asp Asp Ser

65 70 75 80

Ser Phe Cys Arg Ala Gln Val Pro Gly His Leu Gln Met Ala Gly Leu

85 90 95

Leu Lys Asn Lys Tyr Val Asn Ile Gln Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu

100 105 110

Asn Pro Leu Glu Pro Asn Val Pro Glu Asn Asn His Val Ala Leu Tyr

115 120 125

Arg Arg Lys Phe Val Val Ser Lys Arg Leu Ala Asp Thr Lys Glu Ser

130 135 140

Glu Gly Ser Val Ser Ile Val Phe His Gly Met Ala Thr Ala Ile Tyr

145 150 155 160

Val Trp Val Asn Gly Leu Phe Ala Gly Tyr Gly Glu Asp Gly Phe Thr

165 170 175

Pro Asn Glu Phe Asp Ile Thr Asp Leu Leu His Asp Gly Glu Asn Val

180 185 190

Val Ala Val Ala Cys Tyr Glu Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp

195 200 205

Gln Asp Phe Trp Arg Leu His Gly Leu Phe Arg Ser Val Glu Leu Thr

210 215 220

Ala Gln Pro His Val His Val Glu Asn Met Gln Leu Glu Ala Asp Trp

225 230 235 240

Asp Ala Glu Ser Gly Thr Ala Ser Leu Asp Ala Ala Leu Ser Val Arg

245 250 255

Asn Ala Ser Asp Ala Ala Thr Ile Ser Ala Thr Leu Lys Asp Ser Glu

260 265 270

Gly Asn Val Val Trp Glu Ala Ser Thr Asn Ala Asp Ala Asn Thr Thr

275 280 285

Phe Ala Ser Gly Ser Leu Gln Gly Leu Glu Pro Trp Ser Ala Glu Ser

290 295 300

Pro Ser Leu Tyr Glu Leu Glu Val Asn Val Ile Asp Gln Ala Gly Asn

305 310 315 320

Ile Val Glu Ala Ala Val Gln Lys Val Gly Phe Arg Arg Phe Arg Ile

325 330 335

Glu Asn Gly Ile Met Thr Leu Asn Gly Lys Arg Ile Val Phe Lys Gly

340 345 350

Ala Asp Arg His Glu Phe Asp Ala Lys Arg Gly Arg Ser Ile Thr Glu

355 360 365

Gln Asp Met Ile Asp Asp Val Ile Phe Cys Lys Arg His Asn Ile Asn

370 375 380

Ala Ile Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln Glu Arg Trp Tyr Asp Leu

385 390 395 400

Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Tyr Leu Ile Asp Glu Thr Asn Leu Glu Thr

405 410 415

His Gly Ser Trp Cys Leu Pro Gly Asp Val Val Thr Ala Glu Thr Ala

420 425 430

Val Pro Gly Ser Lys Ala His Trp Glu Gly Ala Cys Val Asp Arg Val

435 440 445

Asn Ser Met Val Arg Arg Asp Tyr Asn His Pro Ser Val Val Ile Trp

450 455 460

Ser Leu Gly Asn Glu Ser Tyr Thr Gly Asp Val Phe Arg Ala Met Tyr

465 470 475 480

Lys His Val His Asp Ile Asp Pro Asn Arg Pro Val His Tyr Glu Gly

485 490 495

Val Thr Lys Asn Arg Asp Tyr Asp Asp Val Thr Asp Ile Glu Thr Arg

500 505 510

Met Tyr Glu His Ala Asp Val Val Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Asp Pro

515 520 525

Gln Lys Pro Tyr Ile Ser Cys Glu Tyr Met His Ala Met Gly Asn Ser

530 535 540

Val Gly Asn Leu Asp Glu Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Tyr Pro His Tyr

545 550 555 560

Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln Ala Ile Tyr Ala Thr

565 570 575

Gln Pro Asp Gly Ser Thr Arg Leu Cys Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Asp

580 585 590

Arg Pro Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp

595 600 605

Arg Thr Pro Thr Pro Lys Ala Gln Glu Val Lys Gln Leu Tyr Ser Asn

610 615 620

Val His Ile Asp Val Thr Asp Arg Ser Val Ser Ile Lys Asn Asp Asn

625 630 635 640

Leu Phe Ile Ser Thr Gly Gly Tyr Gln Phe Val Leu Arg Ile Leu Ala

645 650 655

Asp Gly Glu Pro Val Trp Gln Ser Glu Arg Arg Phe Asp Val Pro Ala

660 665 670

Asp Ser Ala Cys Thr Phe Asp Val Glu Trp Pro Val Asp Leu Tyr Arg

675 680 685

Ala Asn Ala Asp Glu Leu Val Leu Glu Val Ser Gln Arg Leu Ala Glu

690 695 700

Ala Thr Asp Trp Ala Pro Ala Gly Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Gln Thr

705 710 715 720

Ile Val Ala Gly Thr Lys Ala Ala Glu Asp Ala Ala Leu Pro Ala Asp

725 730 735

Gly Ile Val Thr Val Gly Arg Trp Asn Ala Gly Val Gln Gly Ser Gly

740 745 750

Arg Glu Ile Leu Leu Ser Arg Thr Gln Gly Gly Leu Val Ser Tyr Thr

755 760 765

Phe Asp Gly His Glu Phe Val Leu Arg Arg Pro Ala Ile Thr Thr Phe

770 775 780

Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly His Gly Phe Glu Arg

785 790 795 800

Ala Gln Trp Met Val Ala Gly Arg Tyr Ala Arg Cys Val Asp Asn Val

805 810 815

Ile Glu Gln Val Asp Glu Asp Thr Leu Lys Ala Val Tyr Thr Tyr Glu

820 825 830

Leu Ala Thr Pro Gln Cys Thr Lys Val Thr Val Gly Tyr Thr Ala Asp

835 840 845

Thr Thr Gly Arg Leu Asn Leu His Val Glu Tyr Pro Gly Glu Ser Gly

850 855 860

Glu Leu Pro Thr Ile Pro Ala Phe Gly Ile Glu Trp Thr Leu Pro Val

865 870 875 880

Gln Tyr Ser Asn Leu Arg Phe Phe Gly Ala Gly Pro Glu Glu Thr Tyr

885 890 895

Gln Asp Arg Lys His Ala Lys Leu Gly Val Trp Ser Thr Asp Ala Phe

900 905 910

Lys Asp His Ala Pro Tyr Leu Met Pro Gln Glu Thr Gly Asn His Glu

915 920 925

Glu Val Arg Trp Ala Glu Ile Thr Asp Glu Asn Gly His Gly Leu Arg

930 935 940

Val Ser Arg Ala Asn Gly Ala Ala Pro Phe Ala Val Ser Leu Gln Pro

945 950 955 960

Tyr Ser Ser Phe Met Ile Glu Glu Ala Gln His Gln Asp Glu Leu Pro

965 970 975

Ala Pro Lys His Met Phe Leu Arg Val Leu Ala Ala Gln Met Gly Val

980 985 990

Gly Gly Asp Asp Ser Trp Met Ser Pro Val His Ser Gln Tyr His Ile

995 1000 1005

Thr Ala Asp Gln Pro Ile Ser Leu Asp Val Asn Leu Glu Leu Ile

1010 1015 1020

<210> 12

<211> 1008

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

<400> 12

Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asp Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Val Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Ile Pro Ser Lys Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Phe Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Asp Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Asn Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Met Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Gln Ala Lys Pro

210 215 220

Arg Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Leu Gly Pro Ile Arg Ser Glu Gln Leu Glu Phe Thr

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Ala Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Met Lys Arg Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp

420 425 430

Asp Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met

435 440 445

Ala Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn

450 455 460

Glu Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg

465 470 475 480

Lys Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn

485 490 495

Arg Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro

500 505 510

Ala Lys Val Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Pro Ala Lys Pro Phe

515 520 525

Ile Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu

530 535 540

Ala Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe

545 550 555 560

Ile Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu

565 570 575

Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly

580 585 590

Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Glu Ser Pro Lys Leu Ala Asn

595 600 605

Val Lys Ala Leu Tyr Ala Asn Leu Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln

610 615 620

Leu Phe Leu Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr

625 630 635 640

Phe Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Arg

645 650 655

Pro Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu

660 665 670

Pro Trp Pro Glu Val Ala Asp Glu Lys Gly Glu Val Val Tyr Arg Val

675 680 685

Thr Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr

690 695 700

Val Ala Glu Ala Glu Glu Val Ala Gln Lys Leu Pro Glu Phe Lys Pro

705 710 715 720

Glu Gly Arg Pro Asp Leu Val Asp Ser Asp Tyr Asn Leu Gly Leu Lys

725 730 735

Gly Asn Asn Phe Gln Ile Leu Phe Ser Lys Val Lys Gly Trp Pro Val

740 745 750

Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe

755 760 765

Thr Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly

770 775 780

Tyr Asp Leu Ala Arg Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Lys

785 790 795 800

Asp Ile Ser Cys Glu Val Lys Glu Asp Ser Val Leu Val Lys Thr Ala

805 810 815

Phe Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Val Thr Tyr Glu

820 825 830

Val Asp Gly Arg Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asp Phe Pro Gly Ala

835 840 845

Glu Glu Ala Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Leu Ala Leu Pro

850 855 860

Lys Glu Leu Thr Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser

865 870 875 880

Tyr Pro Asp Arg Leu Glu Gly Asn Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Ala

885 890 895

Val Lys Lys Asn Phe Ser Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Thr Gly Asn

900 905 910

Arg Ser Lys Val Arg Trp Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Lys Gly Gly Leu

915 920 925

Glu Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr

930 935 940

Ser Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Asp Leu Thr Asn

945 950 955 960

Asn Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ser Ala Gln Met Gly Val Gly Gly

965 970 975

Asp Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala

980 985 990

Gln Lys Ala Arg Gln Leu Arg Leu Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys

995 1000 1005

<210> 13

<211> 1007

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis

<400> 13

Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asn Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Ile Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Ile Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Val Pro Ser Lys Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Leu Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Gly Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Leu Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Glu Ala Lys Pro

210 215 220

Leu Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Val Gly Pro Ile Arg Ser Glu Lys Leu Gly Phe Ser

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Val Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Ala Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Met Lys Gln Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp Asp

420 425 430

Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met Ala

435 440 445

Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu

450 455 460

Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg Lys

465 470 475 480

Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn Arg

485 490 495

Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro Ala

500 505 510

Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Ala Lys Pro Phe Ile

515 520 525

Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu Ala

530 535 540

Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe Ile

545 550 555 560

Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu Tyr

565 570 575

Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly Asp

580 585 590

Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Thr Ser Pro Lys Leu Ala Asn Val

595 600 605

Lys Ala Leu Tyr Ser Asn Leu Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln Leu

610 615 620

Phe Ile Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ala Tyr Tyr Phe

625 630 635 640

Leu Ala Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Val Leu Pro

660 665 670

Trp Pro Glu Val Glu Asp Glu Lys Gly Glu Ile Val Tyr Gln Val Thr

675 680 685

Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr Val

690 695 700

Ala Glu Ala Glu Glu Ala Val Thr Lys Leu Pro Glu Phe Tyr Pro Ala

705 710 715 720

Gly Arg Pro Glu Leu Val Asp Ser Asp Phe Asn Leu Gly Leu Lys Gly

725 730 735

Asn Gly Phe Arg Ile Leu Phe Ser Lys Ala Lys Gly Trp Pro Val Ser

740 745 750

Ile Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe Thr

755 760 765

Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly Tyr

770 775 780

Asp Leu Ala Lys Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Gln Asp

785 790 795 800

Ile Ser Tyr Glu Ile Lys Glu Asn Ser Ala Leu Val Lys Thr Thr Phe

805 810 815

Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Ile Thr Tyr Glu Val

820 825 830

Asp Ser Leu Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asn Phe Pro Gly Ala Val

835 840 845

Glu Asn Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Phe Ala Leu Pro Lys

850 855 860

Glu Leu Ser Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser Tyr

865 870 875 880

Ala Asp Arg Leu Glu Gly Ser Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Ala Val

885 890 895

Glu Lys Asn Phe Thr Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Ala Gly Asn Arg

900 905 910

Ser Lys Val Arg Tyr Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Glu Gly Gly Leu Glu

915 920 925

Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr Ser

930 935 940

Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Glu Leu Thr Asn Asn

945 950 955 960

Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly Asp

965 970 975

Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala Gln

980 985 990

Glu Ala Arg Gln Leu Lys Leu Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys

995 1000 1005

<210> 14

<211> 1008

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

<400> 14

Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Phe Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asp Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Val Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Ile Pro Ser Lys Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Phe Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Asp Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Asn Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Met Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Gln Ala Lys Pro

210 215 220

Arg Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Leu Gly Pro Ile Arg Ser Glu Gln Leu Glu Phe Thr

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Ala Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Met Lys Arg Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp

420 425 430

Asp Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met

435 440 445

Ala Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn

450 455 460

Glu Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg

465 470 475 480

Lys Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn

485 490 495

Arg Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro

500 505 510

Ala Lys Val Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Pro Ala Lys Pro Phe

515 520 525

Ile Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu

530 535 540

Ala Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe

545 550 555 560

Ile Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu

565 570 575

Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly

580 585 590

Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Glu Ser Pro Lys Leu Ala Asn

595 600 605

Val Lys Ala Leu Tyr Ala Asn Leu Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln

610 615 620

Leu Phe Leu Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr

625 630 635 640

Phe Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Arg

645 650 655

Pro Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu

660 665 670

Pro Trp Pro Glu Val Ala Asp Glu Lys Gly Glu Val Val Tyr Arg Val

675 680 685

Thr Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr

690 695 700

Val Ala Glu Ala Glu Glu Val Ala Gln Lys Leu Pro Glu Phe Lys Pro

705 710 715 720

Glu Gly Arg Pro Asp Leu Val Asp Ser Asp Tyr Asn Leu Gly Leu Lys

725 730 735

Gly Asn Asn Phe Gln Ile Leu Phe Ser Lys Val Lys Gly Trp Pro Val

740 745 750

Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe

755 760 765

Thr Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly

770 775 780

Tyr Asp Leu Ala Arg Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Lys

785 790 795 800

Asp Ile Ser Cys Glu Val Lys Glu Asp Ser Val Leu Val Lys Thr Ala

805 810 815

Phe Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Val Thr Tyr Glu

820 825 830

Val Asp Gly Arg Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asp Phe Pro Gly Ala

835 840 845

Glu Glu Ala Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Leu Ala Leu Pro

850 855 860

Lys Glu Leu Thr Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser

865 870 875 880

Tyr Pro Asp Arg Leu Glu Gly Asn Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Ala

885 890 895

Val Lys Lys Asn Phe Ser Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Thr Gly Asn

900 905 910

Arg Ser Lys Val Arg Trp Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Lys Gly Gly Leu

915 920 925

Glu Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr

930 935 940

Ser Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Glu Leu Thr Asn

945 950 955 960

Asn Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ser Ala Gln Met Gly Val Gly Gly

965 970 975

Asp Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala

980 985 990

Gln Lys Ala Arg Gln Leu Arg Leu Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys

995 1000 1005

<210> 15

<211> 1008

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

<400> 15

Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asp Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Val Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Ile Pro Ser Lys Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Phe Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Asp Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Asn Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Met Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Gln Ala Lys Pro

210 215 220

Arg Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Leu Gly Pro Ile Arg Ser Glu Gln Leu Glu Phe Thr

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Ala Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Met Lys Arg Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp

420 425 430

Asp Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met

435 440 445

Ala Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn

450 455 460

Glu Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg

465 470 475 480

Lys Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn

485 490 495

Arg Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro

500 505 510

Ala Lys Val Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Pro Ala Lys Pro Phe

515 520 525

Ile Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu

530 535 540

Ala Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe

545 550 555 560

Ile Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu

565 570 575

Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly

580 585 590

Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Glu Ser Pro Lys Leu Ala Asn

595 600 605

Val Lys Ala Leu Tyr Ala Asn Leu Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln

610 615 620

Leu Phe Leu Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr

625 630 635 640

Phe Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Arg

645 650 655

Pro Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu

660 665 670

Pro Trp Pro Glu Val Ala Asp Glu Lys Gly Glu Val Val Tyr Arg Val

675 680 685

Thr Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr

690 695 700

Val Ala Glu Ala Glu Glu Val Ala Gln Lys Leu Pro Glu Phe Lys Pro

705 710 715 720

Glu Gly Arg Pro Asp Leu Val Asp Ser Asp Tyr Asn Leu Gly Leu Lys

725 730 735

Gly Asn Asn Phe Gln Ile Leu Phe Ser Lys Val Lys Gly Trp Pro Val

740 745 750

Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe

755 760 765

Thr Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly

770 775 780

Tyr Asp Leu Ala Arg Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Lys

785 790 795 800

Asp Ile Ser Cys Glu Val Lys Glu Asp Ser Val Leu Val Lys Thr Ala

805 810 815

Phe Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Val Thr Tyr Glu

820 825 830

Val Asp Gly Arg Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asp Phe Pro Gly Ala

835 840 845

Glu Glu Ala Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Leu Ala Leu Pro

850 855 860

Lys Glu Leu Thr Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser

865 870 875 880

Tyr Pro Asp Arg Leu Glu Gly Asn Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Ala

885 890 895

Val Lys Lys Asn Phe Ser Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Thr Gly Asn

900 905 910

Arg Ser Lys Val Arg Trp Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Lys Gly Gly Leu

915 920 925

Glu Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr

930 935 940

Ser Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Glu Leu Thr Asn

945 950 955 960

Asn Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ser Ala Gln Met Gly Val Gly Gly

965 970 975

Asp Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala

980 985 990

Gln Lys Ala Arg Gln Leu Arg Leu Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys

995 1000 1005

<210> 16

<211> 1008

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis

<400> 16

Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asp Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Val Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Ile Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Val Pro Ser Lys Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Phe Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Asn Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Leu Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Gln Ala Lys Pro

210 215 220

Leu Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Leu Gly Pro Ile Arg Ser Glu Gln Leu Glu Phe Thr

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Val Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Met Lys Arg Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp Asp

420 425 430

Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met Ala

435 440 445

Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu

450 455 460

Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg Lys

465 470 475 480

Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn Arg

485 490 495

Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro Ala

500 505 510

Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Ala Lys Pro Phe Ile

515 520 525

Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu Ala

530 535 540

Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe Ile

545 550 555 560

Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu Tyr

565 570 575

Gly Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly

580 585 590

Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Thr Ser Pro Lys Leu Ala Asn

595 600 605

Val Lys Ala Leu Tyr Ser Asn Leu Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln

610 615 620

Leu Phe Leu Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ala Tyr Tyr

625 630 635 640

Phe Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Gln

645 650 655

Pro Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Val Leu

660 665 670

Pro Trp Pro Glu Val Glu Asp Glu Lys Gly Glu Ile Val Tyr Gln Val

675 680 685

Thr Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr

690 695 700

Val Ala Glu Ala Glu Glu Ala Val Thr Lys Leu Pro Glu Phe Tyr Pro

705 710 715 720

Ala Gly Arg Pro Glu Leu Val Asp Ser Asp Phe Asn Leu Gly Leu Lys

725 730 735

Gly Asn Gly Phe Arg Ile Leu Phe Ser Lys Ala Lys Gly Trp Pro Val

740 745 750

Ser Ile Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe

755 760 765

Thr Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly

770 775 780

Tyr Asp Leu Ala Lys Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Gln

785 790 795 800

Asp Ile Ser Tyr Glu Ile Lys Glu Asn Ser Val Leu Val Lys Thr Ala

805 810 815

Phe Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Ile Thr Tyr Glu

820 825 830

Val Asp Ser Leu Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asn Phe Pro Gly Ala

835 840 845

Val Glu Asn Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Phe Ala Leu Pro

850 855 860

Lys Glu Leu Ser Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser

865 870 875 880

Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Ser Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Ala

885 890 895

Val Glu Lys Asn Phe Thr Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Ala Gly Asn

900 905 910

Arg Ser Lys Val Arg Tyr Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Glu Ser Gly Leu

915 920 925

Glu Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr

930 935 940

Ser Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Glu Leu Ser Asn

945 950 955 960

Asn Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly

965 970 975

Asp Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala

980 985 990

Gln Glu Ala Arg Gln Leu Lys Leu Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys

995 1000 1005

<210> 17

<211> 1008

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

<400> 17

Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asp Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Val Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Ile Pro Ser Lys Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Phe Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Asp Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Asn Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Met Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Gln Ala Lys Pro

210 215 220

Arg Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Leu Gly Pro Ile Arg Ser Glu Gln Leu Glu Phe Thr

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Val Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Ile Lys Arg Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp

420 425 430

Asp Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met

435 440 445

Ala Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn

450 455 460

Glu Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg

465 470 475 480

Lys Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn

485 490 495

Arg Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro

500 505 510

Ala Lys Val Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Pro Ala Lys Pro Phe

515 520 525

Ile Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu

530 535 540

Ala Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe

545 550 555 560

Ile Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu

565 570 575

Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly

580 585 590

Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Glu Ser Pro Lys Leu Ala Asn

595 600 605

Val Lys Ala Leu Tyr Ala Asn Leu Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln

610 615 620

Leu Phe Leu Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr

625 630 635 640

Phe Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Arg

645 650 655

Pro Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu

660 665 670

Pro Trp Pro Glu Val Ala Asp Glu Lys Gly Glu Val Val Tyr Arg Val

675 680 685

Thr Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr

690 695 700

Val Ala Glu Ala Glu Glu Val Ala Gln Lys Leu Pro Glu Phe Lys Pro

705 710 715 720

Glu Gly Arg Pro Asp Leu Val Asp Ser Asp Tyr Asn Leu Gly Leu Lys

725 730 735

Gly Asn Asn Phe Gln Ile Leu Phe Ser Lys Val Lys Gly Trp Pro Val

740 745 750

Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe

755 760 765

Thr Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly

770 775 780

Tyr Asp Leu Ala Arg Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Lys

785 790 795 800

Asp Ile Ser Cys Glu Val Lys Glu Asp Ser Val Leu Val Lys Thr Ala

805 810 815

Phe Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Val Thr Tyr Glu

820 825 830

Val Asp Gly Arg Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asp Phe Pro Gly Ala

835 840 845

Glu Glu Ala Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Leu Ala Leu Pro

850 855 860

Lys Glu Leu Thr Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser

865 870 875 880

Tyr Pro Asp Arg Leu Glu Gly Asn Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Ala

885 890 895

Val Lys Lys Asn Phe Ser Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Thr Gly Asn

900 905 910

Arg Ser Lys Val Arg Trp Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Lys Gly Gly Leu

915 920 925

Glu Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr

930 935 940

Ser Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Asp Leu Thr Asn

945 950 955 960

Asn Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ser Ala Gln Met Gly Val Gly Gly

965 970 975

Asp Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala

980 985 990

Gln Lys Ala Arg Gln Leu Arg Leu Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys

995 1000 1005

<210> 18

<211> 1008

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

<400> 18

Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asp Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Val Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Ile Pro Ser Lys Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Phe Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Asp Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Asn Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Met Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Gln Ala Lys Pro

210 215 220

Arg Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Leu Gly Pro Ile Gly Ser Glu Gln Leu Glu Phe Thr

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Val Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Glu Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Ile Lys Arg Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp

420 425 430

Asp Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met

435 440 445

Ala Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn

450 455 460

Glu Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg

465 470 475 480

Lys Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn

485 490 495

Arg Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro

500 505 510

Ala Lys Val Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Pro Ala Lys Pro Phe

515 520 525

Ile Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu

530 535 540

Ala Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe

545 550 555 560

Ile Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu

565 570 575

Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly

580 585 590

Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Glu Ser Pro Lys Leu Ala Asn

595 600 605

Val Lys Ala Leu Tyr Ala Asn Leu Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln

610 615 620

Leu Phe Leu Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ser Tyr Tyr

625 630 635 640

Phe Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Arg

645 650 655

Pro Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu

660 665 670

Pro Trp Pro Glu Val Ala Asp Glu Lys Gly Glu Val Val Tyr Arg Val

675 680 685

Thr Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr

690 695 700

Val Ala Glu Ala Glu Glu Val Ala Gln Lys Leu Pro Glu Phe Lys Pro

705 710 715 720

Glu Gly Arg Pro Asp Leu Val Asp Ser Asp Tyr Asn Leu Gly Leu Lys

725 730 735

Gly Asn Asn Phe Gln Ile Leu Phe Ser Lys Val Lys Gly Trp Pro Val

740 745 750

Ser Leu Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe

755 760 765

Thr Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly

770 775 780

Tyr Asp Leu Ala Arg Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Lys

785 790 795 800

Asp Ile Ser Cys Glu Val Lys Glu Asp Ser Val Leu Val Lys Thr Ala

805 810 815

Phe Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Val Thr Tyr Glu

820 825 830

Val Asp Gly Arg Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asp Phe Pro Gly Ala

835 840 845

Glu Glu Ala Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Leu Ala Leu Pro

850 855 860

Lys Glu Leu Thr Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser

865 870 875 880

Tyr Pro Asp Arg Leu Glu Gly Asn Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Ala

885 890 895

Val Lys Lys Asn Phe Ser Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Thr Gly Asn

900 905 910

Arg Ser Lys Val Arg Trp Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Lys Gly Gly Leu

915 920 925

Glu Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr

930 935 940

Ser Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Glu Leu Thr Asn

945 950 955 960

Asn Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ser Ala Gln Met Gly Val Gly Gly

965 970 975

Asp Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala

980 985 990

Gln Lys Ala Arg Gln Leu Arg Leu Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys

995 1000 1005

<210> 19

<211> 1007

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis

<400> 19

Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asn Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Ile Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Ile Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Val Pro Ser Lys Asn Pro Leu Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Leu Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Gly Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Leu Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Glu Ala Lys Pro

210 215 220

Leu Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Val Gly Pro Ile Arg Ser Glu Lys Leu Asp Phe Ser

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Val Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Ala Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Met Lys Gln Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp Asp

420 425 430

Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met Ala

435 440 445

Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu

450 455 460

Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg Lys

465 470 475 480

Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn Arg

485 490 495

Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro Ala

500 505 510

Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Ala Lys Pro Phe Ile

515 520 525

Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu Ala

530 535 540

Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe Ile

545 550 555 560

Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu Tyr

565 570 575

Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly Asp

580 585 590

Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Thr Ser Pro Lys Leu Ala Asn Val

595 600 605

Lys Ala Leu Tyr Ser Asn Leu Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln Leu

610 615 620

Phe Ile Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ala Tyr Tyr Phe

625 630 635 640

Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu Pro

660 665 670

Trp Pro Glu Val Glu Asp Glu Lys Gly Glu Ile Val Tyr Gln Val Thr

675 680 685

Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr Val

690 695 700

Ala Glu Ala Glu Glu Ala Val Thr Lys Leu Pro Glu Phe Tyr Pro Ala

705 710 715 720

Gly Arg Pro Glu Leu Val Asp Ser Asp Phe Asn Leu Gly Leu Lys Gly

725 730 735

Asn Gly Phe Arg Ile Leu Phe Ser Lys Ala Lys Gly Trp Pro Val Ser

740 745 750

Ile Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe Thr

755 760 765

Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly Tyr

770 775 780

Asp Leu Ala Lys Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Gln Asp

785 790 795 800

Ile Ser Tyr Glu Ile Lys Glu Asn Ser Ala Leu Val Lys Thr Ala Phe

805 810 815

Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Ile Thr Tyr Glu Val

820 825 830

Asp Ser Leu Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asn Phe Pro Gly Ala Val

835 840 845

Glu Asn Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Phe Ala Leu Pro Lys

850 855 860

Glu Leu Ser Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser Tyr

865 870 875 880

Ala Asp Arg Leu Glu Gly Ser Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Met Val

885 890 895

Glu Lys Asn Phe Thr Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Ala Gly Asn Arg

900 905 910

Ser Lys Val Arg Tyr Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Glu Gly Gly Leu Glu

915 920 925

Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr Ser

930 935 940

Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Glu Leu Thr Asn Asn

945 950 955 960

Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly Asp

965 970 975

Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala Gln

980 985 990

Glu Ala Arg Gln Leu Lys Leu Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys

995 1000 1005

<210> 20

<211> 628

<212> PRT

<213> Lactobacillus helvaticus

<400> 20

Met Gln Ala Asn Ile Asn Trp Leu Asp Asn Pro Glu Val Phe Arg Val

1 5 10 15

Asn Gln Leu Pro Ala His Ser Asp His Pro Phe Phe Arg Asp Tyr Arg

20 25 30

Glu Trp Gln Lys Gln His Ser Ser Tyr Gln Gln Ser Leu Asn Gly Lys

35 40 45

Trp Lys Phe His Phe Ser Ala Asn Pro Met Asp Arg Pro Gln Asp Phe

50 55 60

Tyr Gln Arg Asp Phe Asp Ser Ser Asn Phe Asp Ser Ile Pro Val Pro

65 70 75 80

Ser Glu Ile Glu Leu Ser Asn Tyr Thr Gln Asn Gln Tyr Ile Asn Val

85 90 95

Leu Phe Pro Trp Glu Gly Lys Ile Phe Arg Arg Pro Ala Tyr Ala Leu

100 105 110

Asp Pro Asn Asp His Glu Glu Gly Ser Phe Ser Lys Gly Ala Asp Asn

115 120 125

Thr Val Gly Ser Tyr Leu Lys Arg Phe Asp Leu Ser Ser Ala Leu Ile

130 135 140

Gly Lys Asp Val His Ile Lys Phe Glu Gly Val Glu Gln Ala Met Tyr

145 150 155 160

Val Trp Leu Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr

165 170 175

Pro Ser Glu Phe Asp Leu Thr Pro Tyr Ile Gln Asp Lys Asp Asn Leu

180 185 190

Leu Ala Val Glu Val Phe Lys His Ser Thr Ala Ser Trp Leu Glu Asp

195 200 205

Gln Asp Met Phe Arg Phe Ser Gly Ile Phe Arg Ser Val Glu Leu Leu

210 215 220

Gly Ile Pro Ala Thr His Leu Met Asp Met Asp Leu Lys Pro Arg Val

225 230 235 240

Ala Asp Asn Tyr Gln Asp Gly Ile Phe Asn Leu Lys Leu His Phe Ile

245 250 255

Gly Lys Lys Ala Gly Ser Phe His Leu Leu Val Lys Asp Ile Lys Gly

260 265 270

His Thr Leu Leu Glu Lys Asn Glu Asp Ile Lys Glu Asn Val Gln Ile

275 280 285

Asn Asn Glu Lys Phe Glu Asn Val His Leu Trp Asn Asn His Asp Pro

290 295 300

Tyr Leu Tyr Gln Leu Leu Ile Glu Val Tyr Asp Glu Gln Gln Asn Leu

305 310 315 320

Leu Glu Leu Ile Pro Phe Gln Phe Gly Phe Arg Arg Ile Glu Ile Ser

325 330 335

Pro Glu Lys Val Val Leu Leu Asn Gly Lys Arg Leu Ile Ile Asn Gly

340 345 350

Val Asn Arg His Glu Trp Asp Ala Lys Arg Gly Arg Ser Ile Thr Met

355 360 365

Ser Asp Met Thr Thr Asp Ile Asn Thr Phe Lys Glu Asn Asn Ile Asn

370 375 380

Ala Val Arg Thr Cys His Tyr Pro Asn Gln Ile Pro Trp Tyr Tyr Leu

385 390 395 400

Cys Asp Gln Asn Gly Ile Tyr Val Met Ala Glu Asn Asn Leu Glu Ser

405 410 415

His Gly Thr Trp Gln Lys Met Gly Glu Ile Glu Pro Ser Asp Asn Val

420 425 430

Pro Gly Ser Ile Pro Gln Trp Lys Glu Ala Val Ile Asp Arg Ala Arg

435 440 445

Asn Asn Tyr Glu Thr Phe Lys Asn His Thr Ser Ile Leu Phe Trp Ser

450 455 460

Leu Gly Asn Glu Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Ile Ala Met Asn Glu

465 470 475 480

Phe Tyr Lys Ser His Asp Asp Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Val

485 490 495

Val His Arg Pro Glu Leu Lys Asp Lys Ile Ser Asp Val Glu Ser Cys

500 505 510

Met Tyr Leu Pro Pro Lys Lys Val Glu Glu Tyr Leu Gln Asn Asp Pro

515 520 525

Pro Lys Pro Phe Met Glu Cys Glu Tyr Met His Asp Met Gly Asn Ser

530 535 540

Asp Gly Gly Met Gly Ser Tyr Ile Lys Leu Leu Asp Lys Tyr Pro Gln

545 550 555 560

Tyr Phe Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln Ala Leu Leu Val

565 570 575

His Asp Glu Ile Ser Gly His Asp Val Leu Arg Tyr Gly Gly Asp Phe

580 585 590

Asp Asp Arg His Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly Leu Met Phe

595 600 605

Ala Asp Arg Thr Pro Lys Pro Ala Met Gln Glu Val Arg Tyr Tyr Tyr

610 615 620

Gly Leu His Lys

625

<210> 21

<211> 318

<212> PRT

<213> Lactobacillus helvaticus

<400> 21

Met Asp Tyr Thr Asn Asn Gln Leu His Ile Ile Tyr Gly Asp Ala Thr

1 5 10 15

Phe Gly Val Asn Gly Lys Asp Phe Gln Tyr Ile Phe Ser Tyr Glu Arg

20 25 30

Gly Gly Leu Glu Ser Leu Lys Val His Gly Lys Glu Trp Leu Tyr Arg

35 40 45

Val Pro Thr Pro Thr Phe Trp Arg Ala Thr Thr Asp Asn Asp Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Asn Leu Lys Ala Ala Gln Trp Leu Gly Ala Asp Met Phe

65 70 75 80

Thr Lys Cys Thr Asp Ile His Leu Lys Val Asp Arg His Asp Phe Ala

85 90 95

Glu Leu Pro Ile Ala Pro Phe Asn Asn Lys Phe Ser Asn His Glu Tyr

100 105 110

Ala Lys Ser Ala Glu Ile Ser Phe Thr Tyr Gln Thr Leu Thr Thr Pro

115 120 125

Ala Thr Asn Ala Lys Ile Ile Tyr Asn Ile Asp Asp Val Gly His Ile

130 135 140

Lys Val Thr Met Arg Tyr Tyr Gly Lys Lys Gly Leu Pro Pro Leu Pro

145 150 155 160

Val Ile Gly Ile Arg Leu Ile Met Pro Thr Ala Ala Thr Gly Phe Asp

165 170 175

Tyr Glu Gly Leu Ser Gly Glu Thr Tyr Pro Asp Arg Met Ala Gly Ala

180 185 190

Lys Glu Gly Lys Phe His Ile Asp Gly Leu Pro Val Thr Glu Tyr Leu

195 200 205

Val Pro Gln Glu Asn Gly Met His Met Gln Thr Lys Lys Leu Thr Ile

210 215 220

Asn Arg Glu Thr Thr Gln Asn Asn Val Asp Arg Thr Asn Glu Lys Phe

225 230 235 240

Ser Leu Ser Ile Gln Gln Ala Glu Lys Pro Phe Asn Phe Ser Cys Leu

245 250 255

Pro Tyr Thr Ala Glu Glu Leu Glu Asn Ala Thr His Ile Glu Glu Leu

260 265 270

Pro Leu Val Arg Arg Thr Val Leu Val Ile Ala Gly Ala Val Arg Gly

275 280 285

Val Gly Gly Ile Asp Ser Trp Gly Thr Asp Val Glu Ser Ala Tyr His

290 295 300

Ile Asn Pro Glu Leu Asp His Glu Phe Ser Phe Ile Leu Asn

305 310 315

<210> 22

<211> 1023

<212> PRT

<213> Bifidobacterium longum

<400> 22

Met Thr Asp Val Thr His Val Asp Arg Ala Ser Gln Ala Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Pro Thr Val Phe Glu Val Asn Arg Thr Pro Ala His Ser Ser His

20 25 30

Lys Trp Tyr Ala Arg Asp Pro Gln Ser Gly Gln Trp Ser Asp Leu Lys

35 40 45

Gln Ser Leu Asp Gly Glu Trp Arg Val Glu Val Val Gln Ala Ala Asp

50 55 60

Ile Asn Leu Glu Glu Glu Pro Ala Thr Ala Glu Ser Phe Asp Asp Ser

65 70 75 80

Ser Phe Glu Arg Ile Gln Val Pro Gly His Leu Gln Thr Ala Gly Leu

85 90 95

Met Asn His Lys Tyr Val Asn Val Gln Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu

100 105 110

Asn Pro Leu Glu Pro Asn Ile Pro Glu Asn Asn His Val Ala Leu Tyr

115 120 125

Arg Arg Lys Phe Thr Val Ser Ala Pro Val Ala Asn Ala Lys Gln Ala

130 135 140

Gly Gly Ser Val Ser Ile Val Phe His Gly Met Ala Thr Ala Ile Tyr

145 150 155 160

Val Trp Val Asn Gly Ala Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Gly Phe Thr

165 170 175

Pro Asn Glu Phe Asp Ile Thr Glu Leu Leu His Asp Gly Glu Asn Val

180 185 190

Val Ala Val Ala Cys Tyr Glu Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp

195 200 205

Gln Asp Phe Trp Arg Leu His Gly Leu Phe Arg Ser Val Glu Leu Ala

210 215 220

Ala Arg Pro His Val His Ile Glu Asn Thr Gln Ile Glu Ala Asp Trp

225 230 235 240

Asp Pro Glu Ala Gly Thr Ala Ser Leu Asp Ala Ala Leu Thr Val Leu

245 250 255

Asn Ala Ala Asp Ala Ala Thr Val Arg Ala Thr Leu Lys Asp Ala Asp

260 265 270

Gly Asn Thr Val Trp Gln Thr Thr Gly Asp Ala Glu Ala Gln Thr Ala

275 280 285

Ile Ser Ser Gly Pro Leu Gln Gly Ile Ala Pro Trp Ser Ala Glu Ser

290 295 300

Pro Thr Leu Tyr Glu Leu Asp Val Asp Val Ile Asp Gln Ala Gly Asp

305 310 315 320

Val Ile Glu Cys Thr Ser Gln Lys Val Gly Phe Arg Arg Phe Arg Ile

325 330 335

Glu Asp Gly Ile Leu Thr Ile Asn Gly Lys Arg Ile Val Phe Lys Gly

340 345 350

Ala Asp Arg His Glu Phe Asp Ala Glu Gln Gly Arg Ala Ile Thr Glu

355 360 365

Gln Asp Met Ile Asp Asp Val Val Phe Cys Lys Arg His Asn Ile Asn

370 375 380

Ser Ile Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln Glu Arg Trp Tyr Glu Leu

385 390 395 400

Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Tyr Leu Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ala

405 410 415

His Gly Ser Trp Ser Leu Pro Gly Asp Val Leu Thr Glu Asp Thr Ile

420 425 430

Val Pro Gly Ser Lys Arg Glu Trp Glu Gly Ala Cys Val Asp Arg Val

435 440 445

Asn Ser Met Met Arg Arg Asp Tyr Asn His Pro Ser Val Leu Ile Trp

450 455 460

Ser Leu Gly Asn Glu Ser Tyr Val Gly Asp Val Phe Arg Ala Met Tyr

465 470 475 480

Lys His Val His Asp Ile Asp Pro Asn Arg Pro Val His Tyr Glu Gly

485 490 495

Val Thr His Asn Arg Asp Tyr Asp Asp Val Thr Asp Ile Glu Thr Arg

500 505 510

Met Tyr Ser His Ala Asp Glu Ile Glu Lys Tyr Leu Lys Asp Asp Pro

515 520 525

Lys Lys Pro Tyr Leu Ser Cys Glu Tyr Met His Ala Met Gly Asn Ser

530 535 540

Val Gly Asn Met Asp Glu Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Tyr Pro Lys Tyr

545 550 555 560

Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln Ala Ile Tyr Ala Thr

565 570 575

Gln Pro Asp Gly Thr Arg Ser Leu Arg Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Asp

580 585 590

Arg Pro Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly Leu Leu Phe Ala Asn

595 600 605

Arg Lys Pro Ser Pro Lys Ala Gln Glu Val Lys Gln Leu Tyr Ser Asn

610 615 620

Val His Ile Asp Val Thr Lys Asp Ser Val Ser Val Lys Asn Asp Asn

625 630 635 640

Leu Phe Thr Ala Thr Gly Asp Tyr Val Phe Val Leu Ser Val Leu Ala

645 650 655

Asp Gly Lys Pro Val Trp Gln Ser Thr Arg Arg Phe Asp Val Pro Ala

660 665 670

Gly Glu Thr Arg Thr Phe Asp Val Ala Trp Pro Val Ala Ala Tyr Arg

675 680 685

Ala Asp Ala Arg Glu Leu Val Leu Gln Val Ser Gln Arg Leu Ala Lys

690 695 700

Ala Thr Asp Trp Ala Glu Ser Gly Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Gln Thr

705 710 715 720

Val Val Pro Ala Asp Ala Thr Ala Thr Pro Asp Thr Lys Pro Ala Asp

725 730 735

Gly Thr Ile Thr Val Gly Arg Trp Asn Ala Gly Val Arg Gly Ala Gly

740 745 750

Arg Glu Val Leu Leu Ser Arg Thr Gln Gly Gly Met Val Ser Tyr Thr

755 760 765

Phe Ala Gly Asn Glu Phe Val Leu Arg Arg Pro Ala Ile Thr Thr Phe

770 775 780

Arg Pro Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly His Gly Phe Glu Arg

785 790 795 800

Val Gln Trp Leu Gly Ala Gly Arg Tyr Ala Arg Cys Val Asp Asn Val

805 810 815

Leu Glu Gln Ile Asp Asp Ser Thr Leu Lys Gly Thr Tyr Thr Tyr Glu

820 825 830

Leu Ala Thr Ala Gln Arg Thr Lys Val Thr Val Ser Tyr Thr Ala His

835 840 845

Thr Asp Gly Arg Val Asn Leu His Val Glu Tyr Pro Gly Glu Gln Gly

850 855 860

Asp Leu Pro Thr Ile Pro Ala Phe Gly Ile Glu Trp Thr Leu Pro Val

865 870 875 880

Gln Tyr Thr Asn Leu Arg Phe Phe Gly Thr Gly Pro Ala Glu Thr Tyr

885 890 895

Leu Asp Arg Lys His Ala Lys Leu Gly Val Trp Ser Thr Asn Ala Phe

900 905 910

Ala Asp His Ala Pro Tyr Leu Met Pro Gln Glu Thr Gly Asn His Glu

915 920 925

Asp Val Arg Trp Ala Glu Ile Thr Asp Asp His Gly His Gly Met Arg

930 935 940

Val Ser Arg Ala Asp Gly Ala Ala Pro Phe Ala Val Ser Leu Leu Pro

945 950 955 960

Tyr Ser Ser Phe Met Leu Glu Glu Ala Gln His Gln Asp Glu Leu Pro

965 970 975

Lys Pro Lys His Met Phe Leu Arg Val Leu Ala Ala Gln Met Gly Val

980 985 990

Gly Gly Asp Asp Ser Trp Met Ser Pro Val His Pro Gln Tyr His Ile

995 1000 1005

Pro Ala Asp Lys Pro Ile Ser Leu Asp Val Asp Leu Glu Leu Ile

1010 1015 1020

<210> 23

<211> 628

<212> PRT

<213> Lactobacillus reuteri

<400> 23

Met Asp Ala Asp Ile Lys Trp Leu Asp Glu Pro Glu Thr Phe Arg Val

1 5 10 15

Asn Gln Leu Pro Ala His Ser Asp His Tyr Tyr Tyr Gly Asn Tyr Asp

20 25 30

Glu Trp Arg His Asn Asn Ser Arg Phe Ala Gln Asn Leu Asp Gly Gln

35 40 45

Trp Gln Phe Asn Phe Ala Glu Asn Leu Arg Glu Arg Glu Asn Asp Phe

50 55 60

Tyr Lys Met Asp Tyr Asp Ser Ser Ser Phe Gly Thr Ile Glu Val Pro

65 70 75 80

Ser Glu Ile Glu Leu Asn Asn Tyr Ala Gln Asn Asn Tyr Ile Asn Thr

85 90 95

Leu Ile Pro Trp Glu Gly Lys Ile Tyr Arg Arg Pro Ala Tyr Thr Leu

100 105 110

Ser Pro Asp Asp Ala Gln Glu Gly Ser Phe Ser Asp Gly Asp Asp Asn

115 120 125

Thr Ile Gly Glu Tyr Leu Lys His Phe Asp Leu Asp Pro Ser Leu Arg

130 135 140

Gly Lys Gln Val Arg Ile Arg Phe Asp Gly Val Glu Arg Ala Met Tyr

145 150 155 160

Val Trp Leu Asn Gly His Phe Ile Gly Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr

165 170 175

Pro Ser Glu Phe Asp Leu Thr Pro Tyr Ile Gln Asp Glu Gly Asn Val

180 185 190

Leu Ala Val Glu Val Phe Lys His Ser Thr Ala Ser Trp Ile Glu Asp

195 200 205

Gln Asp Met Phe Arg Phe Ser Gly Ile Phe Arg Ser Val Asn Leu Leu

210 215 220

Ala Gln Pro Leu Val His Val Glu Asp Leu Asn Ile Arg Pro Ile Val

225 230 235 240

Thr Asp Asn Tyr Gln Asp Gly Ile Phe Asn Val Glu Leu Gln Leu His

245 250 255

Gly Glu Lys Thr Gly Asn Val Asn Val Arg Val Ile Asp Asn Asp Gly

260 265 270

Asn Thr Leu Val Asn Glu Thr His Pro Val Asp Ser Thr Val Lys Val

275 280 285

Gln Asp Gln Phe Leu Glu Asn Val His Leu Trp Asp Asn His Asp Pro

290 295 300

Tyr Leu Tyr Gln Leu Leu Ile Glu Ile Arg Asp Asp Glu Gly Asn Leu

305 310 315 320

Val Glu Leu Val Pro Tyr Arg Phe Gly Phe Arg Arg Ile Glu Ile Asn

325 330 335

Lys Asp His Val Val Leu Leu Asn Gly Gln Arg Leu Ile Ile Asn Gly

340 345 350

Val Asn Arg His Glu Trp Asp Ala Arg Arg Gly Arg Ala Ile Thr Met

355 360 365

Asp Asp Met Thr Ser Asp Ile His Thr Phe Lys Glu Asn Asn Ile Asn

370 375 380

Ala Val Arg Thr Cys His Tyr Pro Asp Gln Ile Pro Trp Tyr Tyr Leu

385 390 395 400

Cys Asp Asp Asn Gly Ile Tyr Met Met Ala Glu Asn Asn Leu Glu Ser

405 410 415

His Ala Thr Trp Gln Lys Met Gly Ala Ile Glu Pro Ser Tyr Asn Val

420 425 430

Pro Gly Ser Val Pro Gln Trp Arg Asp Val Val Val Asp Arg Ala Arg

435 440 445

Thr Asn Tyr Glu Thr Phe Lys Asn His Pro Ser Ile Leu Phe Trp Ser

450 455 460

Leu Gly Asn Glu Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Val Lys Met Asn Glu

465 470 475 480

Phe Tyr Lys Lys His Asp Asp Ser Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Val

485 490 495

Cys His Thr Pro Glu Tyr Arg Asp Arg Ile Ser Asp Val Glu Ser Trp

500 505 510

Met Tyr Leu Pro Pro Lys Glu Val Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Asn Pro

515 520 525

Asp Lys Pro Phe Met Glu Cys Glu Tyr Met His Asp Met Gly Asn Ser

530 535 540

Asp Gly Gly Met Gly Ser Tyr Ile Ser Leu Leu Asp Lys Tyr Pro Gln

545 550 555 560

Tyr Phe Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln Ala Leu Leu Val

565 570 575

Lys Asp Pro Val Ser Gly Gln Glu Val Met Arg Tyr Gly Gly Asp Phe

580 585 590

Asp Asp Arg His Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly Leu Met Phe

595 600 605

Ala Asp Arg Thr Pro Lys Pro Ala Met Gln Glu Val Arg Tyr Tyr Tyr

610 615 620

Gly Leu His Lys

625

<210> 24

<211> 319

<212> PRT

<213> Lactobacillus reuteri

<400> 24

Met Ala Tyr Thr Asn Lys Leu Arg Val Ile Tyr Gly Asp Ala Thr Leu

1 5 10 15

Gly Leu Ser Gly Asp Gly Phe His Tyr Ile Phe Ser Tyr Glu Arg Gly

20 25 30

Gly Leu Glu Ser Leu Lys Leu Asn Gly Lys Glu Trp Leu Tyr Arg Glu

35 40 45

Pro Met Pro Thr Phe Trp Arg Ala Thr Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Phe Asn Ile Arg Ser Ala Gln Trp Leu Ala Ala Asp Thr Phe His

65 70 75 80

Lys Cys Val Gly Ile Asp Leu Thr Val Asp Asn Gln His Phe Ala Glu

85 90 95

Leu Pro Ile Ala Pro Ile Thr Asn Glu Phe Ser Asp Pro Val Ser Ala

100 105 110

Glu Ser Val Lys Ile Lys Tyr Thr Phe Ala Thr Leu Thr Val Pro Ala

115 120 125

Thr Gln Val Thr Val Ile Tyr Glu Val Asn Gly Gln Gly Glu Ile Lys

130 135 140

Val Thr Met His Tyr Tyr Gly His Glu Asp Leu Pro Gly Leu Pro Val

145 150 155 160

Val Gly Met Arg Phe Ile Met Pro Thr Val Ala Thr Gly Phe Asp Tyr

165 170 175

Gln Gly Leu Ser Gly Glu Thr Tyr Pro Asp Arg Met Ala Gly Ala Thr

180 185 190

Glu Gly Thr Phe His Val Asp Gly Leu Pro Val Thr Lys Tyr Leu Val

195 200 205

Pro Gln Glu Asn Gly Met His Met Ala Thr His Ala Leu Thr Ile Thr

210 215 220

Arg Asp Ser Thr Gln Asn Asn Ala Asp His Ser Arg Glu Pro Phe Ser

225 230 235 240

Leu Thr Val Lys Gln Asp Ala Gln Pro Phe Ala Phe Ser Cys Leu Pro

245 250 255

Tyr Thr Ala Glu Glu Leu Glu Asn Ala Thr His Ile Glu Glu Leu Pro

260 265 270

Leu Ala Arg Arg Thr Val Leu Val Val Ala Gly Ala Val Arg Gly Val

275 280 285

Gly Gly Ile Asp Ser Trp Gly Ala Asp Val Glu Glu Gln Tyr His Ile

290 295 300

Pro Ala Asp Arg Asp Val Glu Phe Ser Phe Val Leu Asn Ala Lys

305 310 315

<210> 25

<211> 1007

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis

<400> 25

Met Ser Asn Lys Leu Val Lys Glu Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Val Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Gln Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asn Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Gln Gly Pro Ile Asn Phe Tyr Ala Glu Asp Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Asn Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Ile Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Glu Glu Ile Phe Pro Pro Gln Val Pro Ser Lys Ile Pro Leu Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Asp Glu Ala Leu Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Gly Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Leu Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Glu Ala Lys Pro

210 215 220

Leu Leu His Leu Glu Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asp Asn

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Lys Leu Glu Val Glu Ala Asn Ile Ala Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ala Ser Phe Lys Leu Glu Val Arg Asp Ser Glu Gly Asp Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Val Gly Pro Ile Arg Ser Glu Lys Leu Asp Phe Ser

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Lys Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Tyr Leu Tyr Gln Ala Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Gln Arg Ile Val Phe Lys Gly Val Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Ala Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Met Lys Gln Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp Asp

420 425 430

Gln His Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met Ala

435 440 445

Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn Glu

450 455 460

Ser Tyr Ala Gly Thr Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg Lys

465 470 475 480

Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn Arg

485 490 495

Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro Ala

500 505 510

Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Ala Lys Pro Phe Ile

515 520 525

Ser Val Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu Ala

530 535 540

Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe Ile

545 550 555 560

Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Asp Gly His Leu Leu Tyr

565 570 575

Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Thr Asp Tyr Glu Phe Cys Gly Asp

580 585 590

Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Thr Ser Pro Lys Leu Ala Asn Val

595 600 605

Lys Ala Leu Tyr Ser Asn Leu Lys Leu Glu Val Lys Asp Gly Gln Leu

610 615 620

Phe Ile Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ala Tyr Tyr Phe

625 630 635 640

Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Thr Phe Gly Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu Pro

660 665 670

Trp Pro Glu Val Glu Asp Glu Lys Gly Glu Ile Val Tyr Gln Val Thr

675 680 685

Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr Val

690 695 700

Ala Glu Ala Glu Glu Ala Val Thr Lys Leu Pro Glu Phe Tyr Pro Ala

705 710 715 720

Gly Arg Pro Glu Leu Val Asp Ser Asp Phe Asn Leu Gly Leu Lys Gly

725 730 735

Asn Gly Phe Arg Ile Leu Phe Ser Lys Ala Lys Gly Trp Pro Val Ser

740 745 750

Ile Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe Thr

755 760 765

Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly Tyr

770 775 780

Asp Leu Ala Lys Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Gln Asp

785 790 795 800

Ile Ser Tyr Glu Ile Lys Glu Asn Ser Ala Leu Val Lys Thr Thr Phe

805 810 815

Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Ile Thr Tyr Glu Val

820 825 830

Asp Ser Leu Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asn Phe Pro Gly Ala Val

835 840 845

Glu Asn Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Phe Ala Leu Pro Lys

850 855 860

Glu Leu Ser Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser Tyr

865 870 875 880

Ala Asp Arg Leu Glu Gly Ser Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Met Val

885 890 895

Glu Lys Asn Phe Thr Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Ala Gly Asn Arg

900 905 910

Ser Lys Val Arg Tyr Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Glu Gly Gly Leu Glu

915 920 925

Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asp Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr Ser

930 935 940

Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Glu Leu Thr Asn Asn

945 950 955 960

Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly Asp

965 970 975

Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala Gln

980 985 990

Glu Ala Arg Gln Leu Lys Leu Val Ile Gln Pro Leu Leu Leu Lys

995 1000 1005

<210> 26

<211> 628

<212> PRT

<213> Lactobacillus helvaticus

<400> 26

Met Gln Ala Asn Ile Asn Trp Leu Asp Asn Pro Glu Val Phe Arg Val

1 5 10 15

Asn Gln Leu Pro Ala His Ser Asp His Pro Phe Phe Arg Asp Tyr Arg

20 25 30

Glu Trp Gln Lys Gln His Ser Ser Tyr Gln Gln Ser Leu Asn Gly Lys

35 40 45

Trp Lys Phe His Phe Ser Ala Asn Pro Met Asp Arg Pro Gln Asp Phe

50 55 60

Tyr Gln Arg Asp Phe Asp Ser Ser Asn Phe Asp Ser Ile Pro Val Pro

65 70 75 80

Ser Glu Ile Glu Leu Ser Asn Tyr Thr Gln Asn Gln Tyr Ile Asn Val

85 90 95

Leu Phe Pro Trp Glu Gly Lys Ile Phe Arg Arg Pro Ala Tyr Ala Leu

100 105 110

Asp Pro Asn Asp His Glu Glu Gly Ser Phe Ser Lys Gly Ala Asp Asn

115 120 125

Thr Val Gly Ser Tyr Leu Lys Arg Phe Asp Leu Ser Ser Ala Leu Ile

130 135 140

Gly Lys Asp Val His Ile Lys Phe Glu Gly Val Glu Gln Ala Met Tyr

145 150 155 160

Val Trp Leu Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr

165 170 175

Pro Ser Glu Phe Asp Leu Thr Pro Tyr Ile Gln Glu Lys Asp Asn Leu

180 185 190

Leu Ala Val Glu Val Phe Lys His Ser Thr Ala Ser Trp Leu Glu Asp

195 200 205

Gln Asp Met Phe Arg Phe Ser Gly Ile Phe Arg Ser Val Glu Leu Leu

210 215 220

Gly Ile Pro Ala Thr His Leu Met Asp Met Asp Leu Lys Pro Arg Val

225 230 235 240

Ala Asp Asn Tyr Gln Asp Gly Ile Phe Asn Leu Lys Leu His Phe Ile

245 250 255

Gly Lys Lys Ala Gly Ser Phe His Leu Leu Val Lys Asp Ile Lys Gly

260 265 270

His Thr Leu Leu Glu Lys Asn Glu Asp Ile Lys Glu Asn Val Gln Ile

275 280 285

Asn Asn Glu Lys Phe Glu Asn Val His Leu Trp Asn Asn His Asp Pro

290 295 300

Tyr Leu Tyr Gln Leu Leu Ile Glu Val Tyr Asp Glu Gln Gln Asn Leu

305 310 315 320

Leu Glu Leu Ile Pro Phe Gln Phe Gly Phe Arg Arg Ile Glu Ile Ser

325 330 335

Pro Glu Lys Val Val Leu Leu Asn Gly Lys Arg Leu Ile Ile Asn Gly

340 345 350

Val Asn Arg His Glu Trp Asp Ala Lys Arg Gly Arg Ser Ile Thr Met

355 360 365

Ser Asp Met Thr Thr Asp Ile Asn Thr Phe Lys Glu Asn Asn Ile Asn

370 375 380

Ala Val Arg Thr Cys His Tyr Pro Asn Gln Ile Pro Trp Tyr Tyr Leu

385 390 395 400

Cys Asp Gln Asn Gly Ile Tyr Val Met Ala Glu Asn Asn Leu Glu Ser

405 410 415

His Gly Thr Trp Gln Lys Met Gly Glu Ile Glu Pro Ser Asp Asn Val

420 425 430

Pro Gly Ser Ile Pro Gln Trp Lys Glu Ala Val Ile Asp Arg Ala Arg

435 440 445

Asn Asn Tyr Glu Thr Phe Lys Asn His Thr Ser Ile Leu Phe Trp Ser

450 455 460

Leu Gly Asn Glu Ser Tyr Ala Gly Asp Asn Ile Ile Ala Met Asn Glu

465 470 475 480

Phe Tyr Lys Ser His Asp Asp Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Val

485 490 495

Val His Arg Pro Glu Leu Lys Asp Lys Ile Ser Asp Val Glu Ser Cys

500 505 510

Met Tyr Leu Pro Pro Lys Lys Val Glu Glu Tyr Leu Gln Asn Asp Pro

515 520 525

Pro Lys Pro Phe Met Glu Cys Glu Tyr Met His Asp Met Gly Asn Ser

530 535 540

Asn Gly Gly Met Asp Ser Tyr Ile Lys Leu Leu Asp Lys Tyr Pro Gln

545 550 555 560

Tyr Phe Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln Ala Leu Leu Val

565 570 575

His Asp Glu Ile Ser Gly His Asp Val Leu Arg Tyr Gly Gly Asp Phe

580 585 590

Asp Asp Arg His Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly Leu Met Phe

595 600 605

Ala Asp Arg Lys Pro Lys Pro Ala Met Gln Glu Val Arg Tyr Tyr Tyr

610 615 620

Gly Leu His Lys

625

<210> 27

<211> 318

<212> PRT

<213> Lactobacillus helvaticus

<400> 27

Met Asp Tyr Thr Asn Asn Gln Leu His Ile Ile Tyr Gly Asp Ala Thr

1 5 10 15

Phe Gly Val Asn Gly Lys Asp Phe Gln Tyr Ile Phe Ser Tyr Glu Arg

20 25 30

Gly Gly Leu Glu Ser Leu Lys Val His Gly Lys Glu Trp Leu Tyr Arg

35 40 45

Val Pro Thr Pro Thr Phe Trp Arg Ala Thr Thr Asp Asn Asp Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Phe Asn Leu Lys Ala Ala Gln Trp Leu Gly Ala Asp Met Phe

65 70 75 80

Thr Lys Cys Thr Asp Ile His Leu Lys Val Asp Arg His Asp Phe Ala

85 90 95

Glu Leu Pro Ile Ala Pro Phe Asn Asn Lys Phe Ser Asn His Glu Tyr

100 105 110

Ala Lys Ser Ala Glu Ile Ser Phe Thr Tyr Gln Thr Leu Thr Thr Pro

115 120 125

Ala Thr Asn Ala Lys Ile Ile Tyr Asn Ile Asp Asp Gly Gly His Ile

130 135 140

Lys Val Thr Met Arg Tyr Tyr Gly Lys Lys Gly Leu Pro Pro Leu Pro

145 150 155 160

Val Ile Gly Ile Arg Leu Ile Met Pro Thr Ala Ala Thr Gly Phe Asp

165 170 175

Tyr Glu Gly Leu Ser Gly Glu Thr Tyr Pro Asp Arg Met Ala Gly Ala

180 185 190

Lys Glu Gly Lys Phe His Ile Asp Gly Leu Pro Val Thr Glu Tyr Leu

195 200 205

Val Pro Gln Glu Asn Gly Met His Met Gln Thr Lys Lys Leu Thr Ile

210 215 220

Asn Arg Glu Thr Thr Gln Asn Asn Val Asp Arg Thr Asn Glu Lys Phe

225 230 235 240

Ser Leu Ser Ile Gln Gln Ala Glu Lys Pro Phe Asn Phe Ser Cys Leu

245 250 255

Pro Tyr Thr Ala Glu Glu Leu Glu Asn Ala Thr His Ile Glu Glu Leu

260 265 270

Pro Leu Val Arg Arg Thr Val Leu Val Ile Ala Gly Ala Val Arg Gly

275 280 285

Val Gly Gly Ile Asp Ser Trp Gly Thr Asp Val Glu Ser Ala Tyr His

290 295 300

Ile Asn Pro Asp Leu Asp His Glu Phe Ser Phe Ile Leu Asn

305 310 315

<210> 28

<211> 626

<212> PRT

<213> Lactobacillus crispatus

<400> 28

Met Lys Ala Asn Ile Lys Trp Leu Asp Asp Pro Glu Val Phe Arg Ile

1 5 10 15

Asn Gln Leu Pro Ala His Ser Asp His Pro Phe Tyr Lys Asp Tyr Arg

20 25 30

Glu Trp Gln Lys His Ser Ser Ser Phe Lys Gln Ser Leu Asn Gly Ala

35 40 45

Trp Gln Phe His Phe Ser Lys Asp Pro Gln Ser Arg Pro Ile Asp Phe

50 55 60

Tyr Lys Leu Ser Phe Asp Ser Ser Ser Phe Asp Thr Ile Pro Val Pro

65 70 75 80

Ser Glu Ile Glu Leu Asn Gly Tyr Ala Gln Asn Gln Tyr Thr Asn Ile

85 90 95

Leu Tyr Pro Trp Glu Ser Lys Ile Tyr Arg Lys Pro Ala Tyr Thr Leu

100 105 110

Gly Arg Gly Ile Lys Asp Gly Asp Phe Ser Gln Gly Lys Asp Asn Thr

115 120 125

Val Gly Ser Tyr Leu Lys His Phe Asp Leu Asn Pro Ala Leu Ala Gly

130 135 140

His Asp Ile His Ile Gln Phe Glu Gly Val Glu Arg Ala Met Tyr Val

145 150 155 160

Tyr Leu Asn Gly His Phe Ile Gly Tyr Ala Glu Asp Ser Phe Thr Pro

165 170 175

Ser Glu Phe Asp Leu Thr Pro Tyr Ile Gln Ala Lys Asp Asn Ile Leu

180 185 190

Ala Val Glu Val Phe Lys His Ser Thr Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln

195 200 205

Asp Met Phe Arg Phe Ser Gly Ile Phe Arg Ser Val Glu Leu Leu Ala

210 215 220

Leu Pro Arg Thr His Leu Met Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Val

225 230 235 240

Asn Asp Tyr His Asp Gly Val Phe Asn Ala Lys Leu His Phe Met Gly

245 250 255

Lys Thr Ser Gly Asn Val His Val Leu Ile Glu Asp Ile Asp Gly Lys

260 265 270

Thr Leu Leu Asn Lys Lys Leu Pro Leu Lys Ser Thr Val Glu Ile Glu

275 280 285

Asn Glu Thr Phe Ala Asn Val His Leu Trp Asp Asn His Asp Pro Tyr

290 295 300

Leu Tyr Gln Leu Ile Ile Glu Val His Asp Gln Asp Gly Lys Leu Val

305 310 315 320

Glu Leu Ile Pro Tyr Gln Phe Gly Phe Arg Lys Ile Glu Ile Thr Lys

325 330 335

Asp His Val Val Leu Leu Asn Gly Lys Arg Leu Ile Ile Asn Gly Val

340 345 350

Asn Arg His Glu Trp Asp Ala Lys Arg Gly Arg Ser Ile Thr Leu Ala

355 360 365

Asp Met Lys Gln Asp Ile Ala Thr Phe Lys His Asn Asn Ile Asn Ala

370 375 380

Val Arg Thr Cys His Tyr Pro Asn Gln Ile Pro Trp Tyr Tyr Leu Cys

385 390 395 400

Asp Gln Asn Gly Ile Tyr Met Met Ala Glu Asn Asn Leu Glu Ser His

405 410 415

Gly Thr Trp Gln Lys Leu Gly Gln Val Glu Ala Thr Ser Asn Val Pro

420 425 430

Gly Ser Ile Pro Glu Trp Arg Glu Val Val Val Asp Arg Ala Arg Ser

435 440 445

Asn Tyr Glu Thr Phe Lys Asn His Thr Ala Ile Leu Phe Trp Ser Leu

450 455 460

Gly Asn Glu Ser Tyr Ala Gly Ser Asn Ile Ala Ala Met Asn Lys Leu

465 470 475 480

Tyr Lys Asp His Asp Ser Ser Arg Leu Thr His Tyr Glu Gly Val Phe

485 490 495

His Ala Pro Glu Phe Lys Lys Glu Ile Ser Asp Leu Glu Ser Cys Met

500 505 510

Tyr Leu Pro Pro Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Lys

515 520 525

Pro Leu Val Glu Cys Glu Tyr Met His Asp Met Gly Asn Ser Asp Gly

530 535 540

Gly Ile Gly Ser Tyr Ile Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Pro Gln Tyr Met

545 550 555 560

Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln Ala Leu Leu Val His Asp

565 570 575

Pro Val Ser Gly Gln Asp Val Leu Arg Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp

580 585 590

Arg His Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly Leu Met Phe Ala Asp

595 600 605

Arg Thr Pro Lys Pro Ala Met Gln Glu Val Arg Tyr Tyr Tyr Gly Leu

610 615 620

His Lys

625

<210> 29

<211> 316

<212> PRT

<213> Lactobacillus crispatus

<400> 29

Met Ala Tyr Thr Asn Asn Leu His Val Val Tyr Gly Glu Ala Ser Leu

1 5 10 15

Gly Val Asn Gly Gln Asp Phe Ala Tyr Leu Phe Ser Tyr Glu Arg Gly

20 25 30

Val Leu Glu Ser Leu Lys Ile Lys Asp Lys Glu Trp Leu Tyr Arg Thr

35 40 45

Pro Thr Pro Thr Phe Trp Arg Ala Thr Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Phe Asn Gln Lys Ala Ala Gln Trp Leu Gly Ala Asp Met Phe Thr

65 70 75 80

Lys Cys Val Gly Ile His Val Gln Val Asp Asp His Gln Phe Asp Glu

85 90 95

Leu Pro Ile Ala Pro Ile Asn Asn Gln Phe Ser Asn Gln Glu Phe Ala

100 105 110

His Glu Val Lys Val Ala Phe Asp Tyr Glu Thr Leu Thr Thr Pro Ala

115 120 125

Thr Lys Val Lys Ile Ile Tyr Asn Ile Asn Asp Ala Gly His Met Thr

130 135 140

Ile Thr Met His Tyr Phe Gly Lys Lys Gly Leu Pro Pro Leu Pro Val

145 150 155 160

Ile Gly Met Arg Phe Ile Met Pro Thr Lys Ala Lys Ser Phe Asp Tyr

165 170 175

Thr Gly Leu Ser Gly Glu Thr Tyr Pro Asp Arg Met Ala Gly Ala Glu

180 185 190

Arg Gly Thr Phe His Ile Asp Gly Leu Pro Val Thr Lys Tyr Leu Val

195 200 205

Pro Gln Glu Asn Gly Met His Met Gln Thr Asn Glu Leu Val Ile Thr

210 215 220

Arg Asn Ser Thr Gln Asn Asn Ala Asp Lys Asp Gly Asp Phe Ser Leu

225 230 235 240

Lys Ile Thr Gln Thr Lys Gln Pro Phe Asn Phe Ser Leu Leu Pro Tyr

245 250 255

Thr Ala Glu Glu Leu Glu Asn Ala Thr His Ile Glu Glu Leu Pro Leu

260 265 270

Ala Arg Arg Ser Val Leu Val Ile Ala Gly Ala Val Arg Gly Val Gly

275 280 285

Gly Ile Asp Ser Trp Gly Ser Asp Val Glu Glu Gln Tyr His Ile Asp

290 295 300

Pro Glu Gln Asp His Glu Phe Ser Phe Thr Leu Asn

305 310 315

<210> 30

<211> 1025

<212> PRT

<213> Streptococcus thermophilus

<400> 30

Met Asn Met Thr Lys Ile Gln Thr Tyr Leu Asn Asp Pro Lys Ile Val

1 5 10 15

Ser Val Asn Thr Val Asp Ala His Ser Asp His Lys Tyr Phe Glu Ser

20 25 30

Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Glu Met Lys Leu Arg Gln Ser Leu Asn

35 40 45

Gly Lys Trp Lys Ile His Tyr Ala Gln Asn Thr Asn Gln Val Leu Lys

50 55 60

Asp Phe Tyr Lys Thr Glu Phe Asp Glu Thr Asp Leu Asn Phe Ile Asn

65 70 75 80

Val Pro Gly His Leu Glu Leu Gln Gly Phe Gly Ser Pro Gln Tyr Val

85 90 95

Asn Thr Gln Tyr Pro Trp Asp Gly Lys Glu Phe Leu Arg Pro Pro Gln

100 105 110

Val Pro Gln Glu Ser Asn Ala Val Ala Ser Tyr Val Lys His Phe Thr

115 120 125

Leu Asn Asp Ala Leu Lys Asp Lys Lys Val Phe Ile Ser Phe Gln Gly

130 135 140

Val Ala Thr Ser Ile Phe Val Trp Val Asn Gly Asn Phe Val Gly Tyr

145 150 155 160

Ser Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu Phe Glu Ile Ser Asp Tyr Leu

165 170 175

Val Glu Gly Asp Asn Lys Leu Ala Val Ala Val Tyr Arg Tyr Ser Thr

180 185 190

Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu Tyr Gly Ile Phe

195 200 205

Arg Asp Val Tyr Leu Tyr Ala Ile Pro Lys Val His Val Gln Asp Leu

210 215 220

Phe Val Lys Gly Asp Tyr Asp Tyr Gln Thr Lys Ala Gly Gln Leu Asp

225 230 235 240

Ile Asp Leu Lys Thr Val Gly Asp Tyr Glu Asp Lys Lys Ile Lys Tyr

245 250 255

Val Leu Ser Asp Tyr Glu Gly Ile Val Thr Glu Gly Asp Ala Ser Val

260 265 270

Asn Gly Asp Gly Glu Leu Ser Val Ser Leu Glu Asn Leu Lys Ile Lys

275 280 285

Pro Trp Ser Ala Glu Ser Pro Lys Leu Tyr Asp Leu Ile Leu His Val

290 295 300

Leu Asp Asp Asp Gln Val Val Glu Val Val Pro Val Lys Val Gly Phe

305 310 315 320

Arg Arg Phe Glu Ile Lys Asp Lys Leu Met Leu Leu Asn Gly Lys Arg

325 330 335

Ile Val Phe Lys Gly Val Asn Arg His Glu Phe Asn Ala Arg Thr Gly

340 345 350

Arg Cys Ile Thr Glu Glu Asp Met Leu Trp Asp Ile Lys Val Met Lys

355 360 365

Gln His Asn Ile Asn Ala Val Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln Thr

370 375 380

Arg Trp Tyr Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu

385 390 395 400

Ala Asn Leu Glu Thr His Gly Thr Trp Gln Lys Leu Gly Leu Cys Glu

405 410 415

Pro Ser Trp Asn Ile Pro Ala Ser Glu Pro Glu Trp Leu Pro Ala Cys

420 425 430

Leu Asp Arg Ala Asn Asn Met Phe Gln Arg Asp Lys Asn His Ala Ser

435 440 445

Val Ile Ile Trp Ser Cys Gly Asn Glu Ser Tyr Ala Gly Lys Asp Ile

450 455 460

Ala Asp Met Ala Asp Tyr Phe Arg Ser Val Asp Asn Thr Arg Pro Val

465 470 475 480

His Tyr Glu Gly Val Ala Trp Cys Arg Glu Phe Asp Tyr Ile Thr Asp

485 490 495

Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Lys Pro Ala Asp Ile Glu Glu Tyr Leu

500 505 510

Thr Thr Gly Lys Leu Val Asp Leu Ser Ser Val Ser Asp Lys His Phe

515 520 525

Ala Ser Gly Asn Leu Thr Asn Lys Pro Gln Lys Pro Tyr Ile Ser Cys

530 535 540

Glu Tyr Met His Thr Met Gly Asn Ser Gly Gly Gly Leu Gln Leu Tyr

545 550 555 560

Thr Asp Leu Glu Lys Tyr Pro Glu Tyr Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp

565 570 575

Phe Ile Asp Gln Ala Ile Tyr Lys Thr Leu Pro Asn Gly Ser Glu Phe

580 585 590

Leu Ser Tyr Gly Gly Asp Trp His Asp Arg Pro Ser Asp Tyr Glu Phe

595 600 605

Cys Gly Asn Gly Ile Val Phe Ala Asp Arg Thr Leu Thr Pro Lys Leu

610 615 620

Gln Thr Val Lys His Leu Tyr Ser Asn Ile Lys Ile Ala Val Asp Glu

625 630 635 640

Lys Ser Val Thr Ile Lys Asn Asp Asn Leu Phe Glu Asp Leu Ser Ala

645 650 655

Tyr Thr Phe Leu Ala Arg Val Tyr Glu Asp Gly Arg Lys Val Ser Glu

660 665 670

Ser Glu Tyr His Phe Asp Val Lys Pro Gly Glu Glu Ala Thr Phe Pro

675 680 685

Val Asn Phe Val Val Glu Ala Ser Asn Ser Glu Gln Ile Tyr Glu Val

690 695 700

Ala Cys Val Leu Arg Glu Ala Thr Lys Trp Ala Pro Lys Gly His Glu

705 710 715 720

Ile Val Arg Gly Gln Tyr Val Val Glu Lys Ile Ser Thr Glu Thr Pro

725 730 735

Val Lys Ala Pro Leu Asn Val Val Glu Gly Asp Phe Asn Ile Gly Ile

740 745 750

Gln Gly Gln Asn Phe Ser Ile Leu Leu Ser Arg Ala Gln Asn Thr Leu

755 760 765

Val Ser Ala Lys Tyr Asn Gly Val Glu Phe Ile Glu Lys Gly Pro Lys

770 775 780

Leu Ser Phe Thr Arg Ala Tyr Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr

785 790 795 800

Pro Phe Glu Met Ala Gly Trp Lys Val Ala Gly Asn Tyr Ser Lys Val

805 810 815

Thr Asp Thr Gln Ile Gln Ile Glu Asp Asp Ser Val Lys Val Thr Tyr

820 825 830

Val His Glu Leu Pro Gly Leu Ser Asp Val Glu Val Lys Val Thr Tyr

835 840 845

Gln Val Asp Tyr Lys Gly Arg Ile Phe Val Thr Ala Asn Tyr Asp Gly

850 855 860

Lys Ala Gly Leu Pro Asn Phe Pro Glu Phe Gly Leu Glu Phe Ala Ile

865 870 875 880

Gly Ser Gln Phe Thr Asn Leu Ser Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Glu Glu

885 890 895

Ser Tyr Arg Asp Lys Leu Pro Gly Ala Tyr Leu Gly Arg Tyr Glu Thr

900 905 910

Ser Val Glu Lys Thr Phe Ala Pro Tyr Leu Met Pro Gln Glu Ser Gly

915 920 925

Asn His Tyr Gly Thr Arg Glu Phe Thr Val Ser Asp Asp Asn His Asn

930 935 940

Gly Leu Lys Phe Thr Ala Leu Asn Lys Ala Phe Glu Phe Ser Ala Leu

945 950 955 960

Arg Asn Ser Thr Glu Gln Ile Glu Asn Ala Arg His Gln Tyr Glu Leu

965 970 975

Gln Glu Ser Asp Ala Thr Trp Ile Lys Val Leu Ala Ala Gln Met Gly

980 985 990

Val Gly Gly Asp Asp Ser Trp Gly Ala Pro Val His Asp Glu Phe Leu

995 1000 1005

Leu Ser Ser Ala Asp Ser Tyr Gln Leu Ser Phe Met Ile Glu Pro

1010 1015 1020

Leu Asn

1025

<210> 31

<211> 1008

<212> PRT

<213> Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus

<400> 31

Met Asn Asn Lys Leu Ala Gln Val Lys Arg Val Asp Gln Ala Asp Leu

1 5 10 15

Ala Trp Leu Thr Asp Pro Glu Ile Tyr Glu Val Asn Thr Ile Pro Pro

20 25 30

His Ser Asp His Glu Ser Phe Gln Ser Leu Glu Glu Leu Glu Glu Gly

35 40 45

Lys Ser Ser Leu Val Gln Ser Leu Asp Gly Asp Trp Leu Ile Asp Tyr

50 55 60

Ala Glu Asn Gly Glu Gly Pro Ala Asn Phe Tyr Glu Glu Asn Phe Asp

65 70 75 80

Asp Ser Ser Phe Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Asn Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Gly Phe Gly Gln Pro Gln Tyr Val Asn Val Gln Tyr Pro Trp Asp Gly

100 105 110

Ser Asp Glu Ile Phe Pro Pro Met Ile Pro Ser Lys Asn Pro Val Ala

115 120 125

Ser Tyr Val Arg Tyr Phe Asp Leu Glu Glu Ala Phe Trp Asp Lys Glu

130 135 140

Val Ser Leu Lys Phe Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Val Trp Leu

145 150 155 160

Asn Gly His Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu

165 170 175

Phe Met Val Thr Lys Phe Leu Lys Lys Glu Gly Asn Arg Leu Ala Val

180 185 190

Ala Leu Tyr Lys Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe

195 200 205

Trp Arg Met Ser Gly Leu Phe Arg Ser Val Thr Leu Glu Ala Lys Pro

210 215 220

Leu Leu His Leu Gln Asp Leu Lys Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asn Asp

225 230 235 240

Tyr Gln Lys Gly Ser Leu Gln Val Glu Ala Asp Ile Asp Tyr Arg Leu

245 250 255

Pro Asn Ser Ser Phe Lys Leu Glu Leu Arg Asp Ser Ala Gly Glu Leu

260 265 270

Val Ala Glu Lys Val Gly Pro Ile Arg Ser Glu Lys Leu Asp Phe Ser

275 280 285

Leu Ala Asp Leu Pro Val Ala Ala Trp Ser Ala Glu Glu Pro Asn Leu

290 295 300

Tyr Gln Val Arg Leu Ser Leu Tyr Gln Gln Gly Ser Leu Leu Glu Val

305 310 315 320

Ser Arg Gln Glu Val Gly Phe Arg Asn Phe Glu Leu Lys Asp Gly Ile

325 330 335

Met Tyr Leu Asn Gly Lys Arg Ile Val Phe Lys Gly Val Asn Arg His

340 345 350

Glu Phe Asp Ser Lys Leu Gly Arg Ala Ile Thr Glu Ala Asp Met Ile

355 360 365

Trp Asp Ile Lys Thr Met Lys Gln Ser Asn Ile Asn Ala Val Arg Cys

370 375 380

Ser His Tyr Pro Asn Gln Ser Ile Phe Tyr His Leu Cys Asp Lys Tyr

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Ala Asn Leu Glu Ser His Gly Thr Trp

405 410 415

Glu Lys Val Gly Gly His Glu Asp Pro Ser Phe Asn Val Pro Gly Asp

420 425 430

Asp Gln Arg Trp Leu Gly Ala Ser Leu Ser Arg Val Lys Asn Met Met

435 440 445

Ala Arg Asp Lys Asn His Ala Ser Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn

450 455 460

Glu Ser Tyr Ala Gly Lys Val Phe Ala Gln Met Ala Asp Tyr Val Arg

465 470 475 480

Gln Ala Asp Pro Thr Arg Val Gln His Tyr Glu Gly Val Thr His Asn

485 490 495

Arg Lys Phe Asp Asp Ala Thr Gln Ile Glu Ser Arg Met Tyr Ala Pro

500 505 510

Ala Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Ala Lys Pro Phe

515 520 525

Val Ser Cys Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn Ser Val Gly Asp Leu

530 535 540

Ala Ala Tyr Thr Ala Leu Glu Lys Tyr Pro His Tyr Gln Gly Gly Phe

545 550 555 560

Ile Trp Asp Trp Ile Asp Gln Gly Leu Glu Lys Glu Gly His Leu Leu

565 570 575

Tyr Gly Gly Asp Phe Asp Asp Arg Pro Ser Asp Tyr Glu Phe Cys Gly

580 585 590

Asp Gly Leu Val Phe Ala Asp Arg Thr Thr Ser Pro Lys Leu Ala Asn

595 600 605

Val Lys Ala Leu Tyr Ser Asn Leu Lys Leu Glu Leu Lys Asp Gly Gln

610 615 620

Leu Phe Leu Lys Asn Asp Asn Leu Phe Thr Asn Ser Ser Ala Tyr Tyr

625 630 635 640

Phe Leu Thr Ser Leu Leu Val Asp Gly Lys Leu Thr Tyr Gln Ser Gln

645 650 655

Pro Leu Thr Phe Ala Leu Glu Pro Gly Glu Ser Gly Thr Phe Ala Leu

660 665 670

Pro Trp Pro Glu Val Glu Asp Glu Lys Gly Glu Ile Val Tyr Gln Val

675 680 685

Thr Ala His Leu Lys Glu Asp Leu Pro Trp Ala Asp Glu Gly Phe Thr

690 695 700

Val Ala Glu Ala Glu Glu Ala Val Thr Lys Leu Pro Glu Phe Tyr Pro

705 710 715 720

Ala Gly Arg Pro Glu Leu Val Asp Ser Asp Tyr Asn Leu Gly Ile Lys

725 730 735

Gly Asn Gly Phe Arg Ile Leu Phe Ser Lys Ala Lys Gly Trp Pro Val

740 745 750

Ser Ile Lys Tyr Ala Gly Arg Glu Tyr Leu Lys Arg Leu Pro Glu Phe

755 760 765

Thr Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly Tyr Gly

770 775 780

Tyr Asp Leu Ala Lys Trp Glu Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Leu Gln

785 790 795 800

Asp Ile Ser Tyr Glu Ile Lys Glu Asn Ser Val Leu Val Lys Thr Ala

805 810 815

Phe Thr Leu Pro Val Ala Leu Lys Gly Asp Leu Thr Ile Thr Tyr Glu

820 825 830

Val Asp Ser Leu Gly Lys Ile Ala Val Thr Ala Asn Phe Pro Gly Ala

835 840 845

Val Glu Asn Gly Leu Leu Pro Ala Phe Gly Leu Asn Phe Ala Leu Pro

850 855 860

Lys Glu Leu Ser Asp Tyr Arg Tyr Tyr Gly Leu Gly Pro Asn Glu Ser

865 870 875 880

Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Ser Tyr Leu Gly Ile Tyr Gln Gly Ala

885 890 895

Val Glu Lys Asn Phe Thr Pro Tyr Leu Arg Pro Gln Glu Val Gly Asn

900 905 910

Arg Ser Lys Val Arg Tyr Tyr Gln Leu Phe Asp Glu Glu Gly Gly Leu

915 920 925

Glu Phe Thr Ala Asn Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ala Leu Pro Tyr

930 935 940

Ser Ala Ala Gln Ile Glu Ala Ala Asp His Ala Phe Glu Leu Thr Asn

945 950 955 960

Asn Tyr Thr Trp Val Arg Ala Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly

965 970 975

Asp Asp Ser Trp Gly Gln Lys Val His Pro Glu Phe Cys Leu Asp Ala

980 985 990

Gln Glu Ala Arg Gln Leu Lys Leu Val Ile Gln Pro Leu Phe Thr Glu

995 1000 1005

<210> 32

<211> 1049

<212> PRT

<213> Bifidobacterium adolescentis

<400> 32

Met Ala Asp Thr Ala Glu Leu Ala Ile Val His Ala Thr Thr Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ser Trp Leu Thr Asp Pro Thr Val Phe Ala Ala Asn Arg Lys Pro

20 25 30

Ala His Ser Ser His Arg Tyr Val Ile Gly Glu Thr Ser Glu Pro Lys

35 40 45

Gln Ser Leu Asp Gly Glu Trp Lys Val Arg Ile Glu Gln Ala Arg Asn

50 55 60

Val Asp Val Glu Ser Ala Pro Phe Ala Ala Val Asp Phe Glu Asp Gly

65 70 75 80

Asp Phe Gly Ala Ile Glu Val Pro Gly His Leu Gln Met Ala Gly Tyr

85 90 95

Leu Lys Asn Lys Tyr Val Asn Ile Gln Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu

100 105 110

Asp Pro Gln Ala Pro Asn Ile Pro Glu Asn Asn His Val Ala Ile Tyr

115 120 125

Arg Arg Arg Phe Ala Leu Asp Ala Gln Leu Ala Arg Thr Leu Glu Asn

130 135 140

Asp Gly Thr Val Ser Leu Thr Phe His Gly Ala Ala Thr Ala Ile Tyr

145 150 155 160

Val Trp Leu Asp Gly Thr Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Gly Phe Thr

165 170 175

Pro Ser Glu Phe Asp Val Thr Glu Ala Leu Arg Asn Gly Asn Gly Asn

180 185 190

Ala Ala Asp Ser Pro Glu Ala Glu His Thr Leu Thr Val Ala Cys Tyr

195 200 205

Glu Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu

210 215 220

His Gly Leu Phe Arg Thr Val Glu Leu Ala Ala Gln Pro His Thr His

225 230 235 240

Val Glu Thr Val Gln Leu Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Ala Asp Thr Ala

245 250 255

Gly Thr Ala Asp Thr Ala Glu Leu Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn

260 265 270

Pro Ala Asp Ala Met Thr Ile Glu Ser Thr Leu Arg Asp Gly Asp Gly

275 280 285

Asn Val Val Trp Glu Ser Thr Gln Ala Cys Asn Gly Glu Ile Ala Leu

290 295 300

Asn Ser Gly Lys Met Thr Asn Ile Ala Pro Trp Ser Ala Glu Ser Pro

305 310 315 320

Thr Leu Tyr Thr Leu Thr Val Arg Val Val Gly His Asp Gly Ala Ile

325 330 335

Ile Glu Thr Val Thr Gln Lys Ile Gly Phe Arg Thr Phe Arg Ile Glu

340 345 350

Asn Gly Ile Met Thr Leu Asn Gly Lys Arg Ile Val Phe Lys Gly Ala

355 360 365

Asp Arg His Glu Phe Asp Ala Lys Arg Gly Arg Ala Ile Thr Arg Glu

370 375 380

Asp Met Leu Ser Asp Val Val Phe Cys Lys Arg His Asn Ile Asn Ala

385 390 395 400

Ile Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln Glu Tyr Trp Tyr Asp Leu Cys

405 410 415

Asp Glu Tyr Gly Leu Tyr Leu Ile Asp Glu Thr Asn Met Glu Thr His

420 425 430

Gly Thr Trp Val Ala Asn Asn Val Glu Arg Pro Glu Asp Gly Ile Pro

435 440 445

Gly Ser Arg Pro Glu Trp Glu Asp Ala Cys Val Asp Arg Ile Asn Ser

450 455 460

Met Met Arg Arg Asp Tyr Asn His Pro Ser Val Leu Ile Trp Ser Leu

465 470 475 480

Gly Asn Glu Ser Ser Ala Gly Glu Val Phe Arg Ala Met Tyr Arg His

485 490 495

Ala His Thr Ile Asp Pro Asn Arg Pro Val His Tyr Glu Gly Ser Val

500 505 510

His Met Arg Glu Phe Glu Asp Val Thr Asp Ile Glu Ser Arg Met Tyr

515 520 525

Ala His Ala Asp Glu Ile Glu Arg Tyr Leu Asn Asp Gly Ser Pro Ala

530 535 540

His Thr Asp Gly Pro Lys Lys Pro Tyr Ile Ser Cys Glu Tyr Met His

545 550 555 560

Ala Met Gly Asn Ser Cys Gly Asn Met Asp Glu Tyr Thr Ala Leu Glu

565 570 575

Arg Tyr Pro Met Tyr Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln

580 585 590

Ala Ile Glu Thr Lys Leu Pro Asp Gly Thr Thr Arg Met Cys Tyr Gly

595 600 605

Gly Asp Phe Gly Asp Arg Pro Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asp Gly

610 615 620

Leu Leu Phe Ala Asp Arg Thr Pro Ser Pro Lys Ala Gln Glu Val Lys

625 630 635 640

Gln Leu Tyr Ala Asn Val Lys Ile Ala Val Ser Val Asp Glu Ala Arg

645 650 655

Ile Thr Asn Asp Asn Leu Phe Val Ser Thr Gly Asp Tyr Arg Phe Val

660 665 670

Leu Arg Ile Leu Ala Asp Gly Lys Pro Val Trp Ser Thr Thr Arg Arg

675 680 685

Phe Asp Val Ala Ala Gly Glu Ser Ala Ser Phe Glu Val Asp Trp Pro

690 695 700

Val Asp Asp Tyr Arg Ser Asn Ala Glu Glu Leu Val Leu Glu Val Ser

705 710 715 720

Gln Gln Leu Gly Asn Ala Cys Asp Trp Ala Pro Ala Gly Tyr Glu Leu

725 730 735

Ala Phe Gly Gln Cys Val Val Ala Gly Ala Lys Thr Thr Ala Asp Ala

740 745 750

Val Asp Ala Ala Gly Ala Pro Ala Asp Gly Thr Val Thr Leu Gly Arg

755 760 765

Trp Asn Ala Gly Val Arg Gly Gln Gly Arg Glu Ala Leu Phe Ser Arg

770 775 780

Thr Gln Gly Gly Met Val Ser Tyr Thr Phe Gly Glu Arg Glu Phe Val

785 790 795 800

Leu Arg Arg Pro Ser Ile Thr Thr Phe Arg Pro Leu Thr Asp Asn Asp

805 810 815

Arg Gly Ala Gly His Ala Phe Glu Arg Ala Ala Trp Ala Val Ala Gly

820 825 830

Lys Tyr Ala Arg Cys Val Asp Cys Ala Ile Ala Asn Arg Gly Glu Asn

835 840 845

Ala Val Glu Ala Thr Tyr Thr Tyr Glu Leu Ala Ile Pro Gln Arg Thr

850 855 860

Lys Val Thr Val Arg Tyr Val Ala Asp Thr Ala Gly Leu Val Ser Leu

865 870 875 880

Asp Val Glu Tyr Pro Gly Glu Lys Asn Gly Asp Leu Pro Thr Ile Pro

885 890 895

Ala Phe Gly Ile Glu Trp Ala Leu Pro Val Glu Tyr Ala Asn Leu Arg

900 905 910

Phe Tyr Gly Ala Gly Pro Glu Glu Thr Tyr Ala Asp Arg Arg His Ala

915 920 925

Lys Leu Gly Val Trp Ser Thr Thr Ala Gly Asp Asp Cys Ala Pro Tyr

930 935 940

Leu Leu Pro Gln Glu Thr Gly Asn His Glu Asp Val Arg Trp Ala Glu

945 950 955 960

Ile Thr Asp Asp Ser Gly His Gly Val Arg Val Lys Arg Gly Ala Gly

965 970 975

Ala Lys Pro Phe Ala Met Ser Leu Leu Pro Tyr Ser Ser Thr Met Leu

980 985 990

Glu Glu Ala Leu His Gln Asp Glu Leu Pro Lys Pro Arg His Met Phe

995 1000 1005

Leu Arg Leu Leu Ala Ala Gln Met Gly Val Gly Gly Asp Asp Ser

1010 1015 1020

Trp Met Ser Pro Val His Glu Gln Tyr Gln Leu Pro Ala Asp Gln

1025 1030 1035

Pro Leu Ser Leu Asn Val Gln Leu Lys Leu Phe

1040 1045

<210> 33

<211> 1023

<212> PRT

<213> Bifidobacterium adolescentis

<400> 33

Met Ala Asn Glu Thr Arg Ile Glu His Ala Ser Glu Thr Trp Leu Ala

1 5 10 15

Asp Ser Thr Val Phe Glu Val Asn Arg Val Pro Ala His Ser Asp His

20 25 30

Lys Cys Tyr Ala His Asp Ser Gln Thr Asn Glu Trp Ser Asp Leu Arg

35 40 45

Gln Ser Leu Asp Gly Glu Trp Arg Val Glu Val Val Gln Ala Ser Asp

50 55 60

Ile Glu Phe Asn Glu Glu Pro Phe Val Arg Glu Asn Phe Asp Asp Ser

65 70 75 80

Ala Phe Glu Arg Ile Gln Val Pro Gly His Leu Gln Met Ala Gly Leu

85 90 95

Met Asn Asn Lys Tyr Val Asn Ile Gln Tyr Pro Trp Asp Gly His Glu

100 105 110

Asn Pro Ala Glu Pro Asn Ile Pro Glu Asn Asn His Val Ala Leu Tyr

115 120 125

Arg Lys Thr Phe Thr Met Ala Asn Arg Leu Ala Asp Thr Lys Asn Ala

130 135 140

Gly Gly Thr Val Ser Ile Val Phe His Gly Met Ala Thr Ala Ile Tyr

145 150 155 160

Val Trp Val Asn Gly Met Phe Val Gly Tyr Gly Glu Asp Gly Phe Thr

165 170 175

Pro Asn Glu Phe Asp Ile Thr Glu Met Leu His Asp Gly Glu Asn Val

180 185 190

Val Ala Val Ala Cys Tyr Glu Tyr Ser Ser Ala Ser Trp Leu Glu Asp

195 200 205

Gln Asp Phe Trp Arg Leu His Gly Leu Phe Arg Ser Val Glu Leu Ala

210 215 220

Ala Gln Pro His Val His Ile Glu Asn Met Gln Ile Glu Ser Asp Trp

225 230 235 240

Asp Pro Glu Ser Gly Ser Ala Ser Leu Asp Ala Ala Leu Thr Val Arg

245 250 255

Asn Ala Ala Asp Ala Ala Thr Ile Ser Ala Thr Leu Lys Asp Ser Asp

260 265 270

Gly Asn Val Val Trp Glu Thr Ala Asn Cys Ala Asp Pro Asp Thr Ser

275 280 285

Ile Ser Thr Gly Ser Leu Asn Gly Ile Arg Pro Trp Ser Ala Glu Asp

290 295 300

Pro Val Leu Tyr Glu Phe Glu Val Thr Val Ile Asp His Ala Gly Asn

305 310 315 320

Ile Ala Glu Val Ala Val Gln Lys Val Gly Phe Arg Arg Phe Arg Ile

325 330 335

Glu Asp Gly Ile Met Thr Ile Asn Gly Lys Arg Ile Val Phe Lys Gly

340 345 350

Ala Asp Arg His Glu Phe Asp Pro Lys Arg Gly Arg Ala Ile Thr Glu

355 360 365

Gln Asp Met Ile Asp Asp Val Val Phe Cys Lys Arg His Asn Leu Asn

370 375 380

Ala Ile Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn Gln Glu Arg Trp Tyr Glu Leu

385 390 395 400

Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Tyr Leu Ile Asp Glu Thr Asn Leu Glu Thr

405 410 415

His Gly Ser Trp Cys Leu Pro Gly Asp Val Leu Thr Glu Glu Thr Ala

420 425 430

Val Pro Gly Ser Lys Ala His Trp Glu Gly Ala Cys Val Asp Arg Val

435 440 445

Asn Ser Met Val Arg Arg Asp Tyr Asn His Pro Ser Val Leu Ile Trp

450 455 460

Ser Leu Gly Asn Glu Ser Tyr Thr Gly Asp Val Phe Arg Ala Met Tyr

465 470 475 480

Lys Arg Val His Asp Ile Asp Pro Asn Arg Pro Val His Tyr Glu Gly

485 490 495

Val Thr His Asn Arg Asp Tyr Asn Asp Val Thr Asp Ile Glu Thr Arg

500 505 510

Met Tyr Ala His Ala Asp Ala Ile Glu Glu Tyr Leu Lys Asn Asp Pro

515 520 525

Gln Lys Pro Tyr Ile Ser Cys Glu Tyr Met His Ala Met Gly Asn Ser

530 535 540

Cys Gly Asn Met Asp Glu Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Tyr Pro Lys Tyr

545 550 555 560

Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Phe Ile Asp Gln Ala Ile Tyr Ala Thr

565 570 575

Gln Pro Asp Gly Thr Thr Ser Leu Arg Tyr Gly Gly Asp Phe Gly Asp

580 585 590

Arg Pro Ser Asp Tyr Glu Phe Ser Gly Asn Gly Leu Val Phe Ala Asp

595 600 605

Arg Lys Pro Thr Pro Lys Ala Gln Glu Val Lys Gln Leu Tyr Ser Asn

610 615 620

Val His Ile Asp Val Ala Glu Asp Ser Val Thr Ile Lys Asn Asp Asn

625 630 635 640

Leu Phe Thr Ser Thr Gly Glu Tyr Thr Phe Val Leu Arg Val Leu Ala

645 650 655

Asp Gly Glu Pro Val Trp Gln Ser Glu Arg Arg Phe Asp Val Pro Ala

660 665 670

Gly Ser Thr Glu Lys Leu Asp Val Asp Trp Pro Leu Asp Leu Tyr Arg

675 680 685

Asp Gly Ala Ser Glu Leu Val Leu Glu Val Ser Gln Arg Leu Ala Lys

690 695 700

Ala Thr Asn Trp Ala Val Ala Gly Tyr Glu Leu Ala Phe Gly Gln Thr

705 710 715 720

Val Val Ala Gly Ser Lys Lys Ala Ser Ala Pro Val Lys Pro Val Asp

725 730 735

Gly Ile Val Thr Val Gly Arg Trp Asn Val Gly Val Gln Gly Ser Gly

740 745 750

Arg Glu Val Leu Leu Ser Arg Thr Gln Gly Gly Leu Val Ser Tyr Thr

755 760 765

Phe Asn Asn Arg Glu Phe Val Leu Arg Arg Pro Ala Val Thr Thr Phe

770 775 780

Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Ala Gly His Gly Phe Glu Arg

785 790 795 800

Ala Gln Trp Leu Gly Ala Gly Arg Tyr Ala Arg Cys Ile Gly Asn Glu

805 810 815

Ile Glu Gln Ile Asp Glu Asn Thr Val Lys Ala Ser Tyr Thr Tyr Glu

820 825 830

Leu Ala Thr Pro Gln Arg Thr Lys Val Thr Val Ser Tyr Thr Ala Asp

835 840 845

Thr Thr Gly Arg Val Asn Leu His Val Glu Tyr Pro Gly Glu Pro Gly

850 855 860

Asp Leu Pro Thr Ile Pro Ala Phe Gly Ile Glu Trp Thr Leu Pro Val

865 870 875 880

Gln Tyr Ser Asn Leu Arg Phe Phe Gly Ala Gly Pro Glu Glu Thr Tyr

885 890 895

Gln Asp Arg Lys His Ala Lys Leu Gly Val Trp Ser Thr Asp Ala Phe

900 905 910

Lys Asp His Ala Pro Tyr Leu Met Pro Gln Glu Thr Gly Asn His Glu

915 920 925

Asp Val Arg Trp Ala Glu Ile Thr Asp Glu Lys Gly His Gly Leu Arg

930 935 940

Ile Ser Arg Ala Glu Gly Ala Glu Pro Phe Ala Met Ser Leu Gln Pro

945 950 955 960

Tyr Ser Ser Phe Met Leu Glu Glu Ala Gln His Gln Asp Glu Leu Pro

965 970 975

Ala Pro Lys His Met Phe Leu Arg Val Leu Ala Glu Gln Met Gly Val

980 985 990

Gly Gly Asp Asp Ser Trp Met Ser Pro Val His Pro Gln Tyr His Ile

995 1000 1005

Pro Ala Asp Gln Pro Ile Ser Leu Asp Val Asp Leu Asp Leu Ile

1010 1015 1020

<210> 34

<211> 1305

<212> PRT

<213> Bifidobacterium bifidum

<400> 34

Met Val Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Ser Thr Thr Gln Met Ser Ser

1 5 10 15

Thr Pro Glu Val Val Tyr Ser Ser Ala Val Asp Ser Lys Gln Asn Arg

20 25 30

Thr Ser Asp Phe Asp Ala Asn Trp Lys Phe Met Leu Ser Asp Ser Val

35 40 45

Gln Ala Gln Asp Pro Ala Phe Asp Asp Ser Ala Trp Gln Gln Val Asp

50 55 60

Leu Pro His Asp Tyr Ser Ile Thr Gln Lys Tyr Ser Gln Ser Asn Glu

65 70 75 80

Ala Glu Ser Ala Tyr Leu Pro Gly Gly Thr Gly Trp Tyr Arg Lys Ser

85 90 95

Phe Thr Ile Asp Arg Asp Leu Ala Gly Lys Arg Ile Ala Ile Asn Phe

100 105 110

Asp Gly Val Tyr Met Asn Ala Thr Val Trp Phe Asn Gly Val Lys Leu

115 120 125

Gly Thr His Pro Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Ser Phe Asp Leu Thr Gly

130 135 140

Asn Ala Lys Phe Gly Gly Glu Asn Thr Ile Val Val Lys Val Glu Asn

145 150 155 160

Arg Leu Pro Ser Ser Arg Trp Tyr Ser Gly Ser Gly Ile Tyr Arg Asp

165 170 175

Val Thr Leu Thr Val Thr Asp Gly Val His Val Gly Asn Asn Gly Val

180 185 190

Ala Ile Lys Thr Pro Ser Leu Ala Thr Gln Asn Gly Gly Asn Val Thr

195 200 205

Met Asn Leu Thr Thr Lys Val Ala Asn Asp Thr Glu Ala Ala Ala Asn

210 215 220

Ile Thr Leu Lys Gln Thr Val Phe Pro Lys Gly Gly Lys Thr Asp Ala

225 230 235 240

Ala Ile Gly Thr Val Thr Thr Ala Ser Lys Ser Ile Ala Ala Gly Ala

245 250 255

Ser Ala Asp Val Thr Ser Thr Ile Thr Ala Ala Ser Pro Lys Leu Trp

260 265 270

Ser Ile Lys Asn Pro Asn Leu Tyr Thr Val Arg Thr Glu Val Leu Asn

275 280 285

Gly Asp Thr Val Leu Asp Thr Tyr Asp Thr Glu Tyr Gly Phe Arg Trp

290 295 300

Thr Gly Phe Asp Ala Thr Ser Gly Phe Ser Leu Asn Gly Glu Lys Val

305 310 315 320

Lys Leu Lys Gly Val Ser Met His His Asp Gln Gly Ser Leu Gly Ala

325 330 335

Val Ala Asn Arg Arg Ala Ile Glu Arg Gln Val Glu Ile Leu Gln Lys

340 345 350

Met Gly Val Asn Ser Ile Arg Thr Thr His Asn Pro Ala Ala Lys Ala

355 360 365

Leu Ile Asp Val Cys Asn Glu Lys Gly Val Leu Val Val Glu Glu Val

370 375 380

Phe Asp Met Trp Asn Arg Ser Lys Asn Gly Asn Thr Glu Asp Tyr Gly

385 390 395 400

Lys Trp Phe Gly Gln Thr Ile Ala Gly Asp Asn Ala Val Leu Gly Gly

405 410 415

Asp Lys Asp Glu Thr Trp Ala Lys Phe Asp Leu Thr Ser Thr Ile Asn

420 425 430

Arg Asp Arg Asn Ala Pro Ser Val Ile Met Trp Ser Leu Gly Asn Glu

435 440 445

Met Met Glu Gly Ile Ser Gly Ser Val Ser Asp Phe Pro Ala Thr Ser

450 455 460

Ala Lys Leu Val Ala Trp Thr Lys Ala Ala Asp Ser Thr Arg Pro Met

465 470 475 480

Thr Tyr Gly Asp Asn Lys Ile Lys Ala Asn Trp Asn Glu Ser Asn Thr

485 490 495

Met Gly Asp Asn Leu Thr Ala Asn Gly Gly Val Val Gly Thr Asn Tyr

500 505 510

Ser Asp Gly Ala Asn Tyr Asp Lys Ile Arg Thr Thr His Pro Ser Trp

515 520 525

Ala Ile Tyr Gly Ser Glu Thr Ala Ser Ala Ile Asn Ser Arg Gly Ile

530 535 540

Tyr Asn Arg Thr Thr Gly Gly Ala Gln Ser Ser Asp Lys Gln Leu Thr

545 550 555 560

Ser Tyr Asp Asn Ser Ala Val Gly Trp Gly Ala Val Ala Ser Ser Ala

565 570 575

Trp Tyr Asp Val Val Gln Arg Asp Phe Val Ala Gly Thr Tyr Val Trp

580 585 590

Thr Gly Phe Asp Tyr Leu Gly Glu Pro Thr Pro Trp Asn Gly Thr Gly

595 600 605

Ser Gly Ala Val Gly Ser Trp Pro Ser Pro Lys Asn Ser Tyr Phe Gly

610 615 620

Ile Val Asp Thr Ala Gly Phe Pro Lys Asp Thr Tyr Tyr Phe Tyr Gln

625 630 635 640

Ser Gln Trp Asn Asp Asp Val His Thr Leu His Ile Leu Pro Ala Trp

645 650 655

Asn Glu Asn Val Val Ala Lys Gly Ser Gly Asn Lys Val Pro Val Val

660 665 670

Val Tyr Thr Asp Ala Ala Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Pro Lys Gly

675 680 685

Ser Thr Glu Lys Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ser Phe Thr Lys Lys Thr

690 695 700

Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Tyr Gln Val Tyr Glu Gly Thr Asp Lys Asp

705 710 715 720

Ser Thr Ala His Lys Asn Met Tyr Leu Thr Trp Asn Val Pro Trp Ala

725 730 735

Glu Gly Thr Ile Ser Ala Glu Ala Tyr Asp Glu Asn Asn Arg Leu Ile

740 745 750

Pro Glu Gly Ser Thr Glu Gly Asn Ala Ser Val Thr Thr Thr Gly Lys

755 760 765

Ala Ala Lys Leu Lys Ala Asp Ala Asp Arg Lys Thr Ile Thr Ala Asp

770 775 780

Gly Lys Asp Leu Ser Tyr Ile Glu Val Asp Val Thr Asp Ala Asn Gly

785 790 795 800

His Ile Val Pro Asp Ala Ala Asn Arg Val Thr Phe Asp Val Lys Gly

805 810 815

Ala Gly Lys Leu Val Gly Val Asp Asn Gly Ser Ser Pro Asp His Asp

820 825 830

Ser Tyr Gln Ala Asp Asn Arg Lys Ala Phe Ser Gly Lys Val Leu Ala

835 840 845

Ile Val Gln Ser Thr Lys Glu Ala Gly Glu Ile Thr Val Thr Ala Lys

850 855 860

Ala Asp Gly Leu Gln Ser Ser Thr Val Lys Ile Ala Thr Thr Ala Val

865 870 875 880

Pro Gly Thr Ser Thr Glu Lys Thr Val Arg Ser Phe Tyr Tyr Ser Arg

885 890 895

Asn Tyr Tyr Val Lys Thr Gly Asn Lys Pro Ile Leu Pro Ser Asp Val

900 905 910

Glu Val Arg Tyr Ser Asp Gly Thr Ser Asp Arg Gln Asn Val Thr Trp

915 920 925

Asp Ala Val Ser Asp Asp Gln Ile Ala Lys Ala Gly Ser Phe Ser Val

930 935 940

Ala Gly Thr Val Ala Gly Gln Lys Ile Ser Val Arg Val Thr Met Ile

945 950 955 960

Asp Glu Ile Gly Ala Leu Leu Asn Tyr Ser Ala Ser Thr Pro Val Gly

965 970 975

Thr Pro Ala Val Leu Pro Gly Ser Arg Pro Ala Val Leu Pro Asp Gly

980 985 990

Thr Val Thr Ser Ala Asn Phe Ala Val His Trp Thr Lys Pro Ala Asp

995 1000 1005

Thr Val Tyr Asn Thr Ala Gly Thr Val Lys Val Pro Gly Thr Ala

1010 1015 1020

Thr Val Phe Gly Lys Glu Phe Lys Val Thr Ala Thr Ile Arg Val

1025 1030 1035

Gln Arg Ser Gln Val Thr Ile Gly Ser Ser Val Ser Gly Asn Ala

1040 1045 1050

Leu Arg Leu Thr Gln Asn Ile Pro Ala Asp Lys Gln Ser Asp Thr

1055 1060 1065

Leu Asp Ala Ile Lys Asp Gly Ser Thr Thr Val Asp Ala Asn Thr

1070 1075 1080

Gly Gly Gly Ala Asn Pro Ser Ala Trp Thr Asn Trp Ala Tyr Ser

1085 1090 1095

Lys Ala Gly His Asn Thr Ala Glu Ile Thr Phe Glu Tyr Ala Thr

1100 1105 1110

Glu Gln Gln Leu Gly Gln Ile Val Met Tyr Phe Phe Arg Asp Ser

1115 1120 1125

Asn Ala Val Arg Phe Pro Asp Ala Gly Lys Thr Lys Ile Gln Ile

1130 1135 1140

Ser Ala Asp Gly Lys Asn Trp Thr Asp Leu Ala Ala Thr Glu Thr

1145 1150 1155

Ile Ala Ala Gln Glu Ser Ser Asp Arg Val Lys Pro Tyr Thr Tyr

1160 1165 1170

Asp Phe Ala Pro Val Gly Ala Thr Phe Val Lys Val Thr Val Thr

1175 1180 1185

Asn Ala Asp Thr Thr Thr Pro Ser Gly Val Val Cys Ala Gly Leu

1190 1195 1200

Thr Glu Ile Glu Leu Lys Thr Ala Thr Ser Lys Phe Val Thr Asn

1205 1210 1215

Thr Ser Ala Ala Leu Ser Ser Leu Thr Val Asn Gly Thr Lys Val

1220 1225 1230

Ser Asp Ser Val Leu Ala Ala Gly Ser Tyr Asn Thr Pro Ala Ile

1235 1240 1245

Ile Ala Asp Val Lys Ala Glu Gly Glu Gly Asn Ala Ser Val Thr

1250 1255 1260

Val Leu Pro Ala His Asp Asn Val Ile Arg Val Ile Thr Glu Ser

1265 1270 1275

Glu Asp His Val Thr Arg Lys Thr Phe Thr Ile Asn Leu Gly Thr

1280 1285 1290

Glu Gln Glu Phe Pro Ala Asp Ser Asp Glu Arg Asp

1295 1300 1305

<210> 35

<211> 1025

<212> PRT

<213> Kluyveromyces lactis

<400> 35

Met Ser Cys Leu Ile Pro Glu Asn Leu Arg Asn Pro Lys Lys Val His

1 5 10 15

Glu Asn Arg Leu Pro Thr Arg Ala Tyr Tyr Tyr Asp Gln Asp Ile Phe

20 25 30

Glu Ser Leu Asn Gly Pro Trp Ala Phe Ala Leu Phe Asp Ala Pro Leu

35 40 45

Asp Ala Pro Asp Ala Lys Asn Leu Asp Trp Glu Thr Ala Lys Lys Trp

50 55 60

Ser Thr Ile Ser Val Pro Ser His Trp Glu Leu Gln Glu Asp Trp Lys

65 70 75 80

Tyr Gly Lys Pro Ile Tyr Thr Asn Val Gln Tyr Pro Ile Pro Ile Asp

85 90 95

Ile Pro Asn Pro Pro Thr Val Asn Pro Thr Gly Val Tyr Ala Arg Thr

100 105 110

Phe Glu Leu Asp Ser Lys Ser Ile Glu Ser Phe Glu His Arg Leu Arg

115 120 125

Phe Glu Gly Val Asp Asn Cys Tyr Glu Leu Tyr Val Asn Gly Gln Tyr

130 135 140

Val Gly Phe Asn Lys Gly Ser Arg Asn Gly Ala Glu Phe Asp Ile Gln

145 150 155 160

Lys Tyr Val Ser Glu Gly Glu Asn Leu Val Val Val Lys Val Phe Lys

165 170 175

Trp Ser Asp Ser Thr Tyr Ile Glu Asp Gln Asp Gln Trp Trp Leu Ser

180 185 190

Gly Ile Tyr Arg Asp Val Ser Leu Leu Lys Leu Pro Lys Lys Ala His

195 200 205

Ile Glu Asp Val Arg Val Thr Thr Thr Phe Val Asp Ser Gln Tyr Gln

210 215 220

Asp Ala Glu Leu Ser Val Lys Val Asp Val Gln Gly Ser Ser Tyr Asp

225 230 235 240

His Ile Asn Phe Thr Leu Tyr Glu Pro Glu Asp Gly Ser Lys Val Tyr

245 250 255

Asp Ala Ser Ser Leu Leu Asn Glu Glu Asn Gly Asn Thr Thr Phe Ser

260 265 270

Thr Lys Glu Phe Ile Ser Phe Ser Thr Lys Lys Asn Glu Glu Thr Ala

275 280 285

Phe Lys Ile Asn Val Lys Ala Pro Glu His Trp Thr Ala Glu Asn Pro

290 295 300

Thr Leu Tyr Lys Tyr Gln Leu Asp Leu Ile Gly Ser Asp Gly Ser Val

305 310 315 320

Ile Gln Ser Ile Lys His His Val Gly Phe Arg Gln Val Glu Leu Lys

325 330 335

Asp Gly Asn Ile Thr Val Asn Gly Lys Asp Ile Leu Phe Arg Gly Val

340 345 350

Asn Arg His Asp His His Pro Arg Phe Gly Arg Ala Val Pro Leu Asp

355 360 365

Phe Val Val Arg Asp Leu Ile Leu Met Lys Lys Phe Asn Ile Asn Ala

370 375 380

Val Arg Asn Ser His Tyr Pro Asn His Pro Lys Val Tyr Asp Leu Phe

385 390 395 400

Asp Lys Leu Gly Phe Trp Val Ile Asp Glu Ala Asp Leu Glu Thr His

405 410 415

Gly Val Gln Glu Pro Phe Asn Arg His Thr Asn Leu Glu Ala Glu Tyr

420 425 430

Pro Asp Thr Lys Asn Lys Leu Tyr Asp Val Asn Ala His Tyr Leu Ser

435 440 445

Asp Asn Pro Glu Tyr Glu Val Ala Tyr Leu Asp Arg Ala Ser Gln Leu

450 455 460

Val Leu Arg Asp Val Asn His Pro Ser Ile Ile Ile Trp Ser Leu Gly

465 470 475 480

Asn Glu Ala Cys Tyr Gly Arg Asn His Lys Ala Met Tyr Lys Leu Ile

485 490 495

Lys Gln Leu Asp Pro Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Asp Leu Asn

500 505 510

Ala Leu Ser Ala Asp Ile Phe Ser Phe Met Tyr Pro Thr Phe Glu Ile

515 520 525

Met Glu Arg Trp Arg Lys Asn His Thr Asp Glu Asn Gly Lys Phe Glu

530 535 540

Lys Pro Leu Ile Leu Cys Glu Tyr Gly His Ala Met Gly Asn Gly Pro

545 550 555 560

Gly Ser Leu Lys Glu Tyr Gln Glu Leu Phe Tyr Lys Glu Lys Phe Tyr

565 570 575

Gln Gly Gly Phe Ile Trp Glu Trp Ala Asn His Gly Ile Glu Phe Glu

580 585 590

Asp Val Ser Thr Ala Asp Gly Lys Leu His Lys Ala Tyr Ala Tyr Gly

595 600 605

Gly Asp Phe Lys Glu Glu Val His Asp Gly Val Phe Ile Met Asp Gly

610 615 620

Leu Cys Asn Ser Glu His Asn Pro Thr Pro Gly Leu Val Glu Tyr Lys

625 630 635 640

Lys Val Ile Glu Pro Val His Ile Lys Ile Ala His Gly Ser Val Thr

645 650 655

Ile Thr Asn Lys His Asp Phe Ile Thr Thr Asp His Leu Leu Phe Ile

660 665 670

Asp Lys Asp Thr Gly Lys Thr Ile Asp Val Pro Ser Leu Lys Pro Glu

675 680 685

Glu Ser Val Thr Ile Pro Ser Asp Thr Thr Tyr Val Val Ala Val Leu

690 695 700

Lys Asp Asp Ala Gly Val Leu Lys Ala Gly His Glu Ile Ala Trp Gly

705 710 715 720

Gln Ala Glu Leu Pro Leu Lys Val Pro Asp Phe Val Thr Glu Thr Ala

725 730 735

Glu Lys Ala Ala Lys Ile Asn Asp Gly Lys Arg Tyr Val Ser Val Glu

740 745 750

Ser Ser Gly Leu His Phe Ile Leu Asp Lys Leu Leu Gly Lys Ile Glu

755 760 765

Ser Leu Lys Val Lys Gly Lys Glu Ile Ser Ser Lys Phe Glu Gly Ser

770 775 780

Ser Ile Thr Phe Trp Arg Pro Pro Thr Asn Asn Asp Glu Pro Arg Asp

785 790 795 800

Phe Lys Asn Trp Lys Lys Tyr Asn Ile Asp Leu Met Lys Gln Asn Ile

805 810 815

His Gly Val Ser Val Glu Lys Gly Ser Asn Gly Ser Leu Ala Val Val

820 825 830

Thr Val Asn Ser Arg Ile Ser Pro Val Val Phe Tyr Tyr Gly Phe Glu

835 840 845

Thr Val Gln Lys Tyr Thr Ile Phe Ala Asn Lys Ile Asn Leu Asn Thr

850 855 860

Ser Met Lys Leu Thr Gly Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Phe Pro Arg Val

865 870 875 880

Gly Tyr Glu Phe Trp Leu Gly Asp Ser Tyr Glu Ser Phe Glu Trp Leu

885 890 895

Gly Arg Gly Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Glu Ser Gln Arg

900 905 910

Phe Gly Leu Tyr Asp Ser Lys Asp Val Glu Glu Phe Val Tyr Asp Tyr

915 920 925

Pro Gln Glu Asn Gly Asn His Thr Asp Thr His Phe Leu Asn Ile Lys

930 935 940

Phe Glu Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Phe Gln Lys Glu Lys Pro Phe

945 950 955 960

Asn Phe Lys Ile Ser Asp Glu Tyr Gly Val Asp Glu Ala Ala His Ala

965 970 975

Cys Asp Val Lys Arg Tyr Gly Arg His Tyr Leu Arg Leu Asp His Ala

980 985 990

Ile His Gly Val Gly Ser Glu Ala Cys Gly Pro Ala Val Leu Asp Gln

995 1000 1005

Tyr Arg Leu Lys Ala Gln Asp Phe Asn Phe Glu Phe Asp Leu Ala

1010 1015 1020

Phe Glu

1025

<210> 36

<211> 30

<212> ДНК

<213> Праймер

<220>

<221> прочий_признак

<222> (9)..(9)

<223> n представляет собой остаток дезоксиурацила в 9-х положениях

<400> 36

attaaccang cgacgcaact tcgaatggcc 30

<210> 37

<211> 31

<212> ДНК

<213> Праймер

<220>

<221> прочий_признак

<222> (9)..(9)

<223> n представляет собой остаток дезоксиурацила в 9-х положениях

<400> 37

atcttctcnt taccgcctta ccacgagcac g 31

<210> 38

<211> 33

<212> ДНК

<213> Праймер

<220>

<221> прочий_признак

<222> (9)..(9)

<223> n представляет собой остаток дезоксиурацила в 9-х положениях

<400> 38

agagaagant ttcagcctga tacagattaa atc 33

<210> 39

<211> 33

<212> ДНК

<213> Праймер

<220>

<221> прочий_признак

<222> (9)..(9)

<223> n представляет собой остаток дезоксиурацила в 9-х положениях

<400> 39

atggttaant cctcctgtta gcccaaaaaa cgg 33

<210> 40

<211> 22

<212> ДНК

<213> Праймер

<400> 40

cggcgtcaca ctttgctatg cc 22

<210> 41

<211> 20

<212> ДНК

<213> Праймер

<400> 41

ccgcgctact gccgccaggc 20

<---

Группа изобретений относится к молочной промышленности и биотехнологии. Способ получения молочного продукта включает: (а) смешивание субстрата на молочной основе, содержащего лактозу в концентрации по меньшей мере 10 г/л, и пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, в концентрации от 10 до 55 мг/л; (б) инкубацию смеси при температуре от 1°C до 10°C в течение периода времени, достаточного для снижения концентрации лактозы в смеси до менее 2 г/л, где pH на стадии (б) составляет от 4 до 7, и где пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, представляет собой: пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 31, или его обладающие ферментативной активностью фрагменты, или аминокислотную последовательность любого из них, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 90% с SEQ ID NO: 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 25 или 31. Также описан способ содержания лактозы в субстрате на молочной основе с использованием указанного пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, и его применение в способе получения молочного продукта. Группа изобретений позволяет эффективно использовать ферменты, обладающие бета-галактозидазной активностью для снижения содержания лактозы в молочных продуктах. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 30 ил., 3 табл., 30 пр.

1. Способ получения молочного продукта, включающий:

(а) смешивание субстрата на молочной основе, содержащего лактозу в концентрации по меньшей мере 10 г/л, и пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, в концентрации от 10 до 55 мг/л;

(б) инкубацию смеси при температуре от 1°C до 10°C в течение периода времени, достаточного для снижения концентрации лактозы в смеси до менее 2 г/л,

где pH на стадии (б) составляет от 4 до 7, и

где пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, представляет собой: пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 31, или его обладающие ферментативной активностью фрагменты, или аминокислотную последовательность любого из них, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 90% с SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25 или 31.

2. Способ снижения содержания лактозы в субстрате на молочной основе, включающий:

(а) смешивание субстрата на молочной основе, содержащего лактозу в концентрации по меньшей мере 10 г/л, и пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, в концентрации от 10 до 55 мг/л;

(б) инкубацию смеси при температуре от 1°C до 10°C в течение периода времени, достаточного для снижения концентрации лактозы в смеси до менее 2 г/л,

где pH на стадии (б) составляет от 4 до 7, и

где пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, представляет собой: пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 31, или его обладающие ферментативной активностью фрагменты, или аминокислотную последовательность любого из них, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 90% с SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25 или 31.

3. Способ по любому из пп. 1, 2, где пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, добавляют в концентрации от 35 до 52 мг/л, в концентрации от 40 до 52 мг/л или в концентрации от 45 до 52 мг/л.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где субстрат на молочной основе, содержащий лактозу, представляет собой:

(1) коровье молоко, овечье молоко, козье молоко, буйволиное молоко, верблюжье молоко или указанное молоко в пастеризованной, сырой и/или фильтрованной форме; или

(2) кисломолочный продукт, полученный из молока (1) путем ферментации.

5. Способ по п. 4, где субстрат на молочной основе, содержащий лактозу, представляет собой коровье молоко, содержащее лактозу в концентрации от примерно 37 до 50 г/л, или указанное молоко в термически обработанной, пастеризованной и/или фильтрованной форме.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где стадия инкубации (б) снижает концентрацию лактозы в смеси до от менее 0,1 г/л до 2 г/л или до от 0,1 г/л до 2 г/л.

7. Способ по любому из пп. 1-4, где концентрации лактозы менее 0,2 г/л достигают после инкубации в течение по меньшей мере 4 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 12 часов или по меньшей мере 24 часов.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где температура инкубации на стадии (б) находится в диапазоне от 2°C до 7°C или в диапазоне от 3°C до 6°C.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где при инкубации на стадии (б) концентрация лактозы в смеси снижается до менее 0,05 г/л, до менее 0,02 г/л или до менее 0,01 г/л.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где смесь, содержащую субстрат на молочной основе и пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, нагревают до температуры по меньшей мере 60°C в течение по меньшей мере четырех секунд до или после инкубации смеси при температуре от 1°C до 10°C.

11. Способ по п. 10, при котором смесь, содержащую субстрат на молочной основе и пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, нагревают до температуры 72°C в течение примерно 15 секунд до или после инкубации смеси при низких температурах на стадии (б) или нагревают до температуры 140°C в течение примерно четырех секунд до или после инкубации смеси при температуре от 1°C до 10°C.

12. Способ получения молочного продукта по любому из пп. 1-9, включающий стадию ферментации субстрата на молочной основе с молочнокислыми бактериями.

13. Способ по п. 12, где стадию ферментации выполняют до или после инкубации с пептидом, проявляющим активность бета-галактозидазы.

14. Способ по любому из пп. 1-9, где молочный продукт представляет собой кисломолочный продукт, сыр, йогурт, сливочное масло, молочный спред, пахту, напиток из сквашенного молока, сметану, напиток на основе молочной сыворотки, мороженое, сгущенное молоко, карамелизированное сгущенное молоко или ароматизированный молочный напиток.

15. Применение пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, в способе получения молочного продукта, включающем:

(а) смешивание субстрата на молочной основе, содержащего лактозу в концентрации по меньшей мере 10 г/л, и пептида, проявляющего активность бета-галактозидазы, в концентрации от 10 до 55 мг/л;

(б) инкубацию смеси при температуре от 1°C до 10°C в течение периода времени, достаточного для снижения концентрации лактозы в смеси до менее 2 г/л,

где pH на стадии (б) составляет от 4 до 7, и

где пептид, проявляющий активность бета-галактозидазы, представляет собой: пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 31, или его обладающие ферментативной активностью фрагменты, или аминокислотную последовательность любого из них, имеющую идентичность последовательности по меньшей мере 90% с SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25 или 31.