ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение в основном относится к новым производным гидрохинона, их получению и способам лечения нарушений путем введения таких соединений теплокровным животным, нуждающимся в этом. Настоящее изобретение относится также к соединениям, которые могут быть использованы для профилактики и/или лечения аутоиммунных, иммунологических, ревматологических, сосудистых заболеваний, офтальмологических заболеваний, фиброзных заболеваний, метаболических и желудочно-кишечных нарушений, нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний, новообразований и связанных с раком заболеваний, гормональных заболеваний и иммунологических нарушений в результате вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний и их осложнений.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Некоторые производные на основе гидрохинона, такие как, например, производные 2,5-дигидроксибензолсульфоновой кислоты и, в частности, добезилат, этамзилат и персилат кальция, известны в данной области как активные средства для лечения мужской сексуальной дисфункции и других сосудистых нарушений эндотелиального происхождения как отдельно, так и в сочетании с другими агентами. Например, в патенте США № 6147112 описан способ применения производных 2,5-дигидроксибензолсульфоновой кислоты, предпочтительно, добезилата, этамзилата и персилата кальция. Добезилат кальция или сульфонат гидрохинона кальция с химическим названием кальциевая соль 2,5-дигидроксибензолсульфоновой кислоты продается как дексиум (Delalande) и доксиум (Carrion), а способ его получения описан в патенте США № 3509207.
Существует много препаратов, содержащих фенольные или катехиновые группы, которые изменяются от преждевременного метаболизма по гидроксильным группам во время всасывания после перорального приема. Предыдущие попытки защитить гидроксильные группы обычно не увенчались успехом, поскольку используемые защитные группы либо слишком лабильны (O=COR или O=CR), либо слишком стабильны (CH3). Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка новых производных гидрохинонов, их фармацевтически приемлемых солей и составов. Эти новые производные гидрохинона обладают особенно сильными антифибротическими, противовоспалительными и антиангиогенными свойствами.
В международной публикации WO 2018160618A1 описаны некоторые замещенные гидрохиноны, 1,4-хиноны, катехолы, 1,2-хиноны, антрахиноны и антрагидрохиноны для использования в качестве медиаторов окислительно-восстановительного потенциала в новых технологиях, таких как опосредованные топливные элементы или проточные батареи с органическими посредниками.
Richter et al, Synthesis, 1976, 1976(3), 192-194, описывают бис-N-арилкарбаматы и 2,5-дигидрокси-3,6-бис[N-арилкарбоксамидо]-1,4-бензохиноны и их получение из 2,5-дигидрокси-1,4-бензохинона и арилизоцианатов.
В японской публикации JP 51026839A описаны бензанилиды I (R=H, OH), обладающие противотуберкулезной, обезболивающей, противовоспалительной активностью и мочевыводящей активностью:
Бензанилиды I
В выданном США патенте US 3973038 также описаны соединения бензоиланилина, имеющие общую формулу:
где (R1=OH, ацилокси; R2=H, OH, низший алкил, галоген, ацилокси; R3=Cl, Br, низший алкил; R4=OH, NH2, низший алкокси, ацилокси; R5=H, галоген, CO2H, низший алкил, ацилокси), обладающие свойствами ингибирования in vivo ферментов, в частности гистаминдеацетилазы и ксантиноксидазы.
Однако ни в одном из документов предшествующего уровня техники не описан новый класс производных гидрохинона по настоящему изобретению, которые особенно полезны для профилактики и/или лечения различных заболеваний, включая аутоиммунные, иммунологические, ревматологические, сосудистые заболевания, офтальмологические заболевания, фиброзные нарушения, метаболические и желудочно-кишечные расстройства, нейровоспалительные и нейродегенеративные заболевания, новообразования и нарушения, связанные с раком, заболевания, связанные с гормонами, и иммунологические нарушения, возникающие в результате вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний и их осложнений.
Изобретение также относится к лечению, предупреждению и уменьшению нарушений обмена веществ, таких как диабет и ожирение. Когда уровень глюкозы в крови повышается после приема пищи, инсулин секретируется и стимулирует клетки периферических тканей (скелетных мышц и жира) к активному поглощению глюкозы из крови в качестве источника энергии. Потеря гомеостаза глюкозы в результате неправильной секреции или действия инсулина обычно приводит к метаболическим нарушениям, таким как диабет, которые могут быть вызваны или дополнительно усугублены ожирением. Поскольку эти состояния часто приводят к летальному исходу, необходимы стратегии восстановления адекватного клиренса глюкозы из кровотока. Нарушения обмена веществ, особенно нарушения регуляции уровня глюкозы и липидов, становятся все более распространенными по мере того, как население промышленно развитых стран стареет, а малоподвижный образ жизни становится все более распространенным явлением. Такие расстройства часто взаимосвязаны и часто являются предикторами или результатами друг друга.
Например, диабет вызывается сочетанием резистентности к инсулину и дефектной секреции инсулина бета-клетками поджелудочной железы. Лица с резистентностью к инсулину часто имеют абдоминальное ожирение, дислипидемию, гипертонию, непереносимость глюкозы и протромбитическое состояние (метаболический синдром). Соответственно, люди с ожирением в целом подвержены более высокому риску приобретения резистентности к инсулину. Таким образом, нарушение метаболического пути может спровоцировать множество нарушений, таких как гиперлипидемия, ожирение, диабет, резистентность к инсулину, непереносимость глюкозы, гипергликемия, метаболический синдром и гипертония, которые, в свою очередь, могут спровоцировать дальнейшую метаболическую дисфункцию, приводящую к системным проблемам и подвергающую людей риску дополнительных осложнений и преждевременной заболеваемости. Уровни глюкозы и липидов частично регулируются печенью, которая играет роль в синтезе, хранении, секреции, трансформации и расщеплении глюкозы, белков и липидов. Заболевание или травматическое повреждение могут значительно снизить способность печени выполнять эти нормальные функции. Таким образом, большинство клинических проявлений дисфункции печени связано с повреждением клеток и нарушением нормальных возможностей печени. Дисфункция печени может быть результатом генетических заболеваний, воспалительных заболеваний, токсинов, таких как наркотики и алкоголь, иммунологических нарушений, сосудистых заболеваний или метаболических состояний. Независимо от причины, поражение печени может оказывать системное влияние на функцию метаболических процессов и регуляцию уровня глюкозы и липидов в сыворотке крови, усугубляя хронические болезненные состояния и приводя к повышению риска дальнейшего заболевания и заболеваемости. Как повышенный, так и пониженный уровень глюкозы в крови запускают гормональные реакции, направленные на восстановление гомеостаза глюкозы. Низкий уровень глюкозы в крови вызывает высвобождение глюкагона из α-клеток поджелудочной железы. Высокий уровень глюкозы в крови вызывает высвобождение инсулина из β-клеток поджелудочной железы. ACTH и гормоны роста, высвобождаемые из гипофиза, повышают уровень глюкозы в крови, подавляя поглощение внепеченочными тканями. Глюкокортикоиды также действуют на повышение уровня глюкозы в крови, ингибируя поглощение глюкозы. Кортизол, основной глюкокортикоид, высвобождаемый корой надпочечников, секретируется в ответ на увеличение циркулирующего ACTH. Гормон мозгового вещества надпочечников, эпинефрин, стимулирует выработку глюкозы путем активации гликогенолиза в ответ на стрессовые раздражители. нарушения обмена веществ, влияющие на метаболизм глюкозы и липидов, такие как гиперлипидемия, ожирение, диабет, резистентность к инсулину, гипергликемия, непереносимость глюкозы, метаболический синдром и гипертензия, имеют долгосрочные последствия для здоровья, приводящие к хроническим состояниям, включая сердечно-сосудистые заболевания и преждевременную заболеваемость. Такие метаболические и сердечно-сосудистые нарушения могут быть взаимосвязаны, усугублять или запускать друг друга и создавать механизмы обратной связи, которые трудно прервать. Современные фармацевтические методы лечения метаболических и сердечно-сосудистых нарушений включают в себя комбинации гиполипидемических препаратов, гипогликемических препаратов, антигипертензивных средств, диету и физическую нагрузку. Тем не менее, сложные терапевтические схемы могут вызвать проблемы полипрагмазии, связанные с усилением побочных эффектов, лекарственными взаимодействиями, несоблюдением режима лечения и учащением ошибок при лечении. Таким образом, в данной области существует насущная, неудовлетворенная потребность в выявлении новых соединений, составов и способов безопасного и эффективного лечения метаболических и сердечно-сосудистых нарушений и состояний, связанных с метаболическими нарушениями.
Примеры метаболических состояний включают, но не ограничиваются ими, боль, заживление ран, лихорадку, нейровоспалительные и нейродегенеративные состояния, воспаление, выработку тепла, гомеотермию, расщепление триглицеридов, гликолиз, цикл Кребса, ферментацию, фотосинтез, скорость метаболизма, биотические и абиотические стресс, выделения, окислительный стресс, стресс, новообразования, состояние кожи, сердечно-сосудистые заболевания, нейровоспалительные и нейродегенеративные состояния, психические и поведенческие расстройства. Такие процессы или состояния могут происходить в клетке, группе клеток или во всем организме.
Недавний прогресс в молекулярной медицине привел к определенным улучшениям в диагностике и лечении опухолевых заболеваний. Несмотря на этот частичный успех, эти патологии остаются серьезной проблемой. Для некоторых видов рака нынешняя терапия в ряде случаев оказывается безуспешной по нескольким причинам. С одной стороны, это присущая опухолевым клеткам резистентность, их способность к постоянной мутации и уклонению от терапии, с другой стороны, это еще и неоднородность опухолевого окружения. Показано, что опухоли одного типа сильно различаются у отдельных субъектов с точки зрения их геномного профиля, что указывает на необходимость так называемой «персональной» терапии. Еще большей проблемой является гетерогенность мутаций в одной и той же опухоли, как это было недавно показано для опухолей почки, и такую ситуацию можно ожидать и для других типов опухолей. По этой причине необходимо искать новые подходы и неизменную точку (точки) вмешательства, общую для всех или большинства злокачественных клеток в опухоли и предпочтительно влияющую на основные функции раковых клеток. По-видимому, такой точкой вмешательства могут быть метаболические уровни, например, митохондрии, т. е. органеллы, которые имеют фундаментальное значение для выработки энергии, необходимой для всех физиологических, а также патофизиологических процессов в клетках. Хотя опухолевые клетки в основном используют так называемый аэробный гликолиз для выработки энергии, митохондриальное дыхание (то есть потребление кислорода, связанное с образованием ATP) присуще большинству (если не всем) типам опухолей. Следовательно, в данной области техники существует неудовлетворенная и насущная потребность в выявлении новых соединений, составов и способов безопасного и эффективного лечения таких неопластических расстройств.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым производным гидрохинона, новому способу получения и новым ключевым промежуточным соединениям. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим терапевтически эффективное количество таких производных гидрохинона и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Изобретение дополнительно относится к способу лечения и/или предотвращения ангиогенной (сосудистой), воспалительной и/или фиброзной патологии, поскольку они обладают антифибротическим, противовоспалительным и антиангиогенным действием. Таким образом, настоящее изобретение, наконец, обеспечивает способ лечения и/или профилактики заболевания или расстройства, включая иммунологические/ревматологические/сосудистые расстройства, офтальмологические расстройства, фиброзные расстройства, метаболические и желудочно-кишечные расстройства, новообразования и связанные с раком расстройства, включающий введение субъекту в нуждаются в терапевтически эффективной дозе соединения и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению, как описано выше. В частности, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики аутоиммунных, иммунологических, ревматологических, сосудистых, офтальмологических, фиброзных, метаболических и желудочно-кишечных заболеваний, нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний, новообразований и раковых заболеваний. расстройства, заболевания, связанные с гормонами, и иммунологические нарушения, возникающие в результате вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний и их осложнений.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
ФИГУРА 1: (A) Конфокальные иммунофлуоресцентные изображения проницаемости сосудов, оцененные по утечке синего красителя Эванса в цельных препаратах сетчатки у репрезентативных мышей из каждой экспериментальной группы. Стрелки указывают место экстравазации. Шкала баров, 30 мкм. (B) Количественная оценка сосудистой утечки путем оценки количества экстравазаций на поле (0,44 мм2). Эффект глазных капель Ic-007a был значительным за счет снижения просачивания сосудов до того же уровня, что и в контрольной группе без диабета. *p < 0,01 по сравнению с другими группами.
ФИГУРА 2: (A) Шкала Шмидта представляет собой оценку эффективности соединений на основе четырех критериев гистопатологической оценки, которые описывают повреждение поджелудочной железы, на основе следующих оценок (число в скобках) для четырех параметров. (a) Интерстициальный отек, отек в баллах (0) Нет (1) Междольковый (2) Вовлеченные дольки (3) Изолированные островковые клетки, подобные ацинарным. (b) Воспалительная инфильтрация=лейкоцитарная инфильтрация в баллах (0) Нет, (1) <20%, (2) 20%-50%, (3) >50%. (c) Паренхиматозный некроз=ацинарно-клеточный некроз в баллах (0) нет, (1) <5%, (2) 5%-20%, (3) >20%. (d) Кровоизлияние вс баллах (0) Нет, (1) 1-2 балла, (2) 3-5 баллов, (3) >5 баллов. Наивысший балл по шкале Шмидта=10 у животных, индуцированных церулеином+обработка носителем, и самый низкий балл=0 у неиндуцированных животных. Оценка по шкале Шмидта представляет собой сумму оценок a+b+c+d, и **** означает статистически значимое различие с группой, индуцированной церулеином, как показано на фигуре 2. Все продукты демонстрируют улучшенный показатель по шкале Шмидта по сравнению с контрольными животными, содержащими церулеин.
ФИГУРЫ 3A-D: На фигурах 3A-B представлен список заболеваний с основными цитокинами, вовлеченными в отдельные заболевания (Akdis M. et al, J Allergy Clin Immunol 2016;138:984-1010), и на фигуре 3C представлена часть результатов поиска с цитокинами и генами, ранжированными по баллам и вероятно вовлеченными в выбранное заболевание, приведенное в качестве примера «диабетическая ретинопатия» после поиска на https://www.targetvalidation.org/. На фигуре 3D показан выполненный поиск с использованием VEGFA в качестве цитокина, чтобы найти список заболеваний, в которых упоминается VEGFA. Только часть заболеваний, в которые вовлечен VEGFA, представлена на фигуре 3D. Ссылка: Open Targets Platform: new developments and updates two years on. Denise Carvalho et al (Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1, 08 January 2019, D1056-D1065, https://doi.org/10.1093/nar/gky1133).
ФИГУРЫ 4 (A-D): представляют собой таблицу, в которой перечислены условия и выходы соединений типа Ia-Id, как описано в примерах 1.1-1.4. Общий выход рассчитан из исходного материала 2,5-дигидрокситерефталевой кислоты.
ФИГУРА 5 (A-C): представляет собой таблицу, в которой перечислены условия и выходы соединений типа IIa-IIc, как описано в примерах 1.5-1.7.
ФИГУРА 6: представляет собой таблицу, в которой перечислены условия и выходы соединений типа IIIa и IIIb, как описано в примерах 1.8 и 1.9.
ФИГУРА 7: представляет собой таблицу, в которой перечислены условия и выходы соединений типа IIIc, как описано в примере 1.10.
ФИГУРА 8: представляет собой таблицу, в которой перечислены способы удаления защитных групп, описанные в примере 1.12, относящиеся к соединениям типа V.
ФИГУРА 9: показаны уровни глюкозы в крови не натощак (среднее±стандартное отклонение для всех животных) в модели диабета, индуцированного STZ, у всех животных каждой группы, отобранных после дня 0 до введения дозы и после 7 и 14 дней ежедневного введения доз внутривенным или пероральным путем.
ФИГУРА 10: показано ускорение заживления ран в модели STZ-индуцированного диабета у 3 животных в группе, отобранных после 7 дней ежедневного введения доз внутривенным или пероральным путем.
ФИГУРА 11: На фигуре 11А показаны репрезентативные изображения фиброза легких на 21-й день лечения; (A1) неиндуцированный (здоровый); A2, блеомицин, индуцированный обработкой носителем; A3, блеомицин, индуцированный лечением пирфенидоном 100 мг/кг; A4, блеомицин, индуцированный обработкой IVc-059a. На Фигуре 11В показана оценка по шкале Эшкрофта у здоровых, нелеченых, индуцированных блеомицином, по сравнению с пирфенидоном по сравнению с IVc-059a.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем документе описаны новые соединения, которые могут быть использованы для лечения субъектов, страдающих от заболевания, расстройства или дисфункции. Примеры таких заболеваний, расстройств или дисфункций включают, без ограничения, аутоиммунные, метаболические, воспалительные, дегенеративные и неопластические расстройства, в частности воспалительные патологии, ангиогенные заболевания и/или фиброзные расстройства, таких как диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, анкилозирующий спондилоартрит, хронический панкреатит, фиброз печени, фиброз почек, а также метаболические заболевания, вызванные дисфункцией поджелудочной железы.
В дальнейшем, если не указано иное, совокупность заболеваний, нарушений или дисфункций, которые можно лечить с использованием описанных в настоящем документе новых соединений, вместе именуются «медицинскими состояниями».
Термин «субъект», как используется в настоящем документе, включает любые и все организмы и включает термин «пациент». Субъектом, подлежащим лечению в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, может быть субъект, который был диагностирован практикующим врачом как страдающий заболеванием. Диагностика может быть выполнена любым подходящим способом. Специалисту в данной области понятно, что субъект, подлежащий лечению в соответствии с настоящим изобретением, мог быть подвергнут стандартным тестам для диагностики медицинских состояний. Как известно среднему специалисту в данной области техники, клинические признаки медицинских состояний описанного здесь типа варьируются в зависимости от патомеханизмов.
В настоящем документе термин «лечение» относится к использованию описанных соединений в терапевтических целях. Терапевтическое лечение может быть назначено, например, субъекту, страдающему заболеванием, для улучшения или стабилизации состояния субъекта. Таким образом, в формуле изобретения и вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, лечение относится к субъекту, которому в терапевтических целях применяются методики, раскрытые в настоящем документе.
Пролекарства, как используется в настоящем документе, относятся к широкой стратегии пролекарств. Например, стратегии получения пролекарств были официально объявлены Адрианом Альбертом в 1958 г. (Albert, A. Chemical aspects of selective toxicity. Nature, 1958, 182, 421-422), но их разработка началась в начале прошлого века, о чем свидетельствуют метенамин, фенацетин и пронтосил. Пролекарства, как правило, представляют собой молекулы с незначительной фармакологической активностью или без нее, но имеющие встроенную структурную лабильность, случайную или преднамеренную, которая обеспечивает биоконверсию in vivo в активное лекарственное средство. Преобразование может происходить посредством химического или ферментативного процесса или их комбинации. Активные молекулы часто связаны с нежелательными физико-химическими свойствами, что создает значительные трудности для их доставки к соответствующей биологической мишени. Пролекарства могут улучшать метаболическую нестабильность, которая обычно связана с печеночным метаболизмом. Точно так же нежелательный кишечный метаболизм лекарств можно преодолеть с помощью стратегий получения селективного пролекарства. Эта нестабильность может значительно уменьшить общее количество лекарственного средства, достигающего системного кровообращения и его мишени. Пролекарства можно использовать для защиты активных лекарств от этого эффекта первого прохождения путем маскирования метаболически лабильной, но фармакологически важной функциональной группы, такой как фенол, во избежание быстрого метаболизма.
Пролекарства, полученные путем структурных модификаций лекарства, предназначены для воздействия на присущие молекуле физико-химические свойства, чтобы обеспечить ее доставку. Эти разработки не всегда учитываются при разработке новых молекул на этапе открытия. Часто аналоговая оптимизация является предпочтительным путем. Реализация стратегии раннего пролекарства может привести к более быстрой клинической разработке и, в конечном итоге, к коммерциализации лекарственного продукта.
Для влияния на липофильность исходного лекарства можно применять многие стратегии пролекарств. Липофильность лекарств была улучшена за счет маскировки их полярных и ионизированных функциональных групп короткоцепочечными углеводородными прогруппами. Гидрофильные гидроксильные, карбоксильные, фосфатные или аминовые и другие отрицательно или положительно заряженные группы были успешно преобразованы в более липофильные алкиловые или ариловые эфиры или N-ацил производные, которые быстро гидролизуются обратно в исходные лекарства в организме повсеместно распространенными эстеразами или пептидазами.
Таким образом, настоящее изобретение относится к соединению формулы (I):
Формула (I)
где:
Ra, Rb=H, C1-4ацил, арилС1-4алкил, C6-C10арилCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7алкилNHCO, фосфоно, фосфонооксиметил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил или C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H или CONH-R10;
R2 и R3 представляют собой H или R5, при условии, что, когда один из R2 и R3 представляет собой R5, другой представляет собой H, и, когда один из R2 и R3 представляет собой H, другой представляет собой R5;
R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R5=R6, R7 или R8;
R6=CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, или CONHCH(COOR4)(CH2)kR9, гетероарил-R9 где k=0-4;
R7=бензогетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов] или фтора;
R8= (CH2)mX(CH2)pR9;
X=O, S, SO2, NH, NAc или N(CH2)qR9;
R9=арил или гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов], фтора, C=O, NHCO-R10;
R10=арил или гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов], фтора;
где арил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 6 до 14 атомов углерода, выбранную из фенильной, нафтильной, бифенильной группы; и гетероарил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 1 до 14 атомов углерода и один или несколько атомов азота; и n, m, p и q независимо обозначают 1-4.
Настоящее изобретение относится также к соединению формулы (I):
(I),
где:
Ra, Rb=H, C1-4ацил, арилС1-4алкил, C6-C10арилCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7алкилNHCO, фосфоно, фосфонооксиметил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил или C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H или CONH-R10;
R2 и R3 представляют собой H или R5, при условии, что, когда один из R2 и R3 представляет собой R5, другой представляет собой H, и, когда один из R2 и R3 представляет собой H, другой представляет собой R5;
R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R5=R6, или R7,
R6=CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, или CONHCH(COOR4)(CH2)kR9; где k=0-4;
R7=бензогетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов] или фтора;
R9=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов], фтора, C=O или NHCO-R10;
R10=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов] или фтора;
где арил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 6 до 14 атомов углерода, выбранную из фенила, нафтила, бифенила; и гетероарил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 1 до 14 атомов углерода и один или несколько атомов азота; и n независимо обозначает 1-4.
Настоящее изобретение относится также к соединению формулы (I):
где:
Ra, Rb=H, C1-4ацил, арилС1-4алкил, C6-C10арилCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7алкилNHCO, фосфоно, фосфонооксиметил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил или C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H или CONH-R10;
R2 и R3 представляют собой H или R5, при условии, что, когда один из R2 и R3 представляет собой R5, другой представляет собой H, и, когда один из R2 и R3 представляет собой H, другой представляет собой R5;
R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R5=R8
R8= (CH2)mX(CH2)pR9;
X=O, S, SO2, NH, NAc или N(CH2)qR9;
R9=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов], фтора, C=O или NHCO-R10;
R10=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов], фтора;
где арил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 6 до 14 атомов углерода, выбранную из фенильной, нафтильной, бифенильной группы; где гетероарил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 1 до 14 атомов углерода и один или несколько атомов азота; и n, m, p и q независимо обозначают 1-4.
Выражение «алкил» относится к насыщенной углеводородной группе с прямой или разветвленной цепью, которая содержит от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно, от 1 до 12 атомов углерода, особенно от 1 до 6 (например, 1, 2, 3 или 4) атомов углерода, например, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил. Кроме того, термин алкил относится к группам, в которых один или несколько атомов водорода заменены атомом галогена (предпочтительно, F или Cl), таким как, например, 2,2,2-трихлорэтильная или трифторметильная группа.
Выражение «ацил» относится к группам (алкил)-C(O)-, (арил)-C(O)-, (гетероарил)-C(O)-, (гетероалкил)-C(O)- и (гетероциклоалкил)-C(O)-, где группа присоединена к исходной структуре через карбонильную функциональную группу. В некоторых вариантах осуществления это C1-C4 ацильный радикал, который относится к общему числу атомов в цепи или кольце алкильной, арильной, гетероарильной или гетероциклоалкильной части ацилоксигруппы плюс карбонильный углерод ацила, то есть три других атома в кольце или цепи плюс карбонил.
Выражение «арил» относится к ароматической группе, которая содержит одно или несколько колец, содержащих от 6 до 14 атомов углерода в кольце, предпочтительно от, 6 до 10 (особенно 6) атомов углерода в кольце.
Выражение «аралкил» или «арилС1-4алкил» относится к группам, содержащим как арильные, так и алкильные, алкенильные, алкинильные и/или циклоалкильные группы в соответствии с приведенными выше определениями, но не ограничиваясь ими, бензил, 2-фенилэтил, 3-фенилпропил и 2-нафт-2-илэтил. Аралкильная группа предпочтительно содержит одну или две ароматические кольцевые системы (1 или 2 кольца), содержащие от 6 до 10 атомов углерода, и одну или две алкильные, алкенильные и/или алкинильные группы, содержащие от 1 или 2 до 6 атомов углерода, и/или циклоалкильные группы, содержащие 5 или 6 атомов углерода в кольце.
Выражение «гетероарил» относится к ароматической группе, которая содержит одно или несколько колец, содержащих от 5 до 14 атомов в кольце, предпочтительно, от 5 до 10 (особенно 5 или 6, или 9, или 10) атомов в кольце, и содержит один или несколько (предпочтительно 1, 2, 3 или 4) кольцевых атомов кислорода, азота, фосфора или серы (предпочтительно, O, S или N Примерами являются группы пиридил (например, 4-пиридил), имидазолил (например, 2-имидазолил), фенилпирролил (например, 3-фенилпирролил), тиазолил, изотиазолил, 1,2,3-триазолил, 1,2,4-триазолил, оксадиазолил, тиадиазолил, индолил, индазолил, тетразолил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, оксазолил, изоксазолил, триазолил, тетразолил, изоксазолил, индазолил, индолил, бензимидазолил, бензоксазолил, бензизоксазолил, бензтиазолил, пиридазинил, хинолинил, изохинолинил, пирролил, пуринил, карбазолил, акридинил, пиримидил, 2,3-бифурил, пиразолил (например, 3-пиразолинил) и изохинолинил.
Выражение «бензогетероарил» или «бензогетероароматический» относится к бициклическим кольцам, включающим фенильное кольцо, конденсированное с моноциклическим гетероароматическим кольцом. Примеры бензогетероарила включают бензизоксазолил, бензоксазолил, бензизотиазолил, бензотиазолил, бензимидазолил, бензофурил, бензотиенил (включая S-оксид и диоксид), хинолил, изохинолил, индазолил, индолил и тому подобное.
Термин «азол» относится к пятичленной гетероарильной группе, имеющей атом азота в кольце и от 0 до 3 дополнительных гетероатомов в кольце, выбранных из N, O или S. Типичными азольными группами являются имидазол, оксазол, тиазол и тетразол.
Выражение «циклоалкил» относится к насыщенной или частично ненасыщенной (например, циклоалкенильная группа) циклической группе, которая содержит одно или несколько колец (предпочтительно, 1 или 2) и содержит от 3 до 14 атомов углерода в кольце, предпочтительно, от 3 до 10 (особенно 3, 4, 5, 6 или 7) кольцевых атомов углерода. Конкретными примерами циклоалкильных групп являются группы циклопропил, циклобутил, циклопентил.
Выражение «необязательно замещенный» относится к группам, в которых по меньшей мере один или, необязательно, два, три или более атомов водорода могут быть заменены атомами фтора, хлора, брома, йода или группами OH, =O, SH, =S, NH2, =NOH, N3 или NO2 s. Это выражение относится, кроме того, к группам, которые могут быть замещены по меньшей мере одним, двумя, тремя или более незамещенными группами C1-C10 алкил, C2-C10 алкенил, C2-C10 алкинил, гетероалкил, C3-C18 циклоалкил, C2-C17 гетероциклоалкил, C4-C20 алкилциклоалкил, C2-C19 гетероалкилциклоалкил, C6-C18 арил, C1-C17 гетероарил, C7-C20 аралкил или C2-C19 гетероаралкил. Кроме того, это выражение относится, в частности, к группам, которые могут быть замещены одним, двумя, тремя или более незамещенными группами C1-C6 алкил, C2-C6 алкенил, C2-C6 алкинил, C1-C6 гетероалкил, C3-C10 циклоалкил, C2-C9 гетероциклоалкил, C7-C12 алкилциклоалкил, C2-C11 гетероалкилциклоалкил, C6-C10 арил, C1-C9 гетероарил, C7-C12 аралкил или C2-C11 гетероаралкил.
В соответствии с предпочтительным вариантом все описанные здесь алкильные, алкенильные, алкинильные, гетероалкильные, арильные, гетероарильные, циклоалкильные, гетероциклоалкильные, алкилциклоалкильные, гетероалкилциклоалкильные, аралкильные и гетероаралкильные группы могут быть необязательно замещены.
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производному гидрохинона формулы (I), где:
(A)
Ra, Rb=H, C1-4ацил, арилС1-4алкил, C6-C10арилCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7алкилNHCO, фосфоно, фосфонооксиметил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил или C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил,
R1=COOR4; R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H, C1-4ацил, арилС1-4алкил, C6-C10арилCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7алкилNHCO, фосфоно, фосфонооксиметил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил или C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил,
R1=COOR4; R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o- метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH-R9.
В первом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение, таким образом, включает соединения в соответствии с таблицей 1:
Таблица 1
R3=R5=CONHR9
R2=R5=CONHR9
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к соединению формулы (I), где:
(A)
Ra, Rb=H;
R1=SO3H;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1= SO3H;
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH-R9.
Во втором варианте осуществления изобретения настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 2:
Таблица 2
R3=R5=CONHR9
соединений
R2=R5=CONHR9
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производному гидрохинона формулы (I), где:
(A)
Ra, Rb=H;
R1=(CH2)nCOOR4; R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил. пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил. C6-C10арил, включая o- метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил. C1-C6ацилокси-1-этил. C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=(CH2)nCOOR4; Rt=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH-R9.
В третьем варианте осуществления изобретения настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 3:
Таблица 3
R3=R5=R6=CONH-R9
R2=R5=R6=CONHR9
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производному гидрохинона формулы (I), где:
(A)
Ra, Rb=H, C1-4ацил, арилС1-4алкил, C6-C10арилCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7алкилNHCO, фосфоно, фосфонооксиметил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил. или C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил;
R1=CONH-R10; R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H, C1-4ацил, арилС1-4алкил, C6-C10арилCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7алкилNHCO. фосфоно, фосфонооксиметил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил или C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил;
R1=CONH-R10; R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH-R9
В четвертом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 4:
Таблица 4
R3=R5=R6=CONH-R9
R2=R5=R6=CONH-R9
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производным гидрохинона формулы (I), где:
(A)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONHCOR9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=COORt; (CH2)nCOOR4; Rt=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONHCOR9.
В пятом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 5:
Таблица 5
R3=R5=R6=CONHCOR9
R2=R5=R6=CONHCOR9
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производному гидрохинона формулы (I), где
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производному гидрохинона формулы (I), где
(A)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH(CH2)n-R9;
Или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; Rt=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH(CH2)n-R9.
В шестом варианте осуществления настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 6:
Таблица 6
R3=R5=R6=CONH(CH2)n-R9
R2=R5=R6=CONH(CH2)n-R9
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производному гидрохинона формулы (I), где:
Ra, Rb=H;
R1=SO3H;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH(CH2)n-R9.
В соответствии с седьмым вариантом осуществления настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 7 ниже:
Таблица 7
R3=R5=CONH(CH2)n-R9
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производному гидрохинона формулы (I) где:
(A)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOORp
R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONHCH(COOR4)(CH2)k-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONHCH(COOR4)(CH2)k-R9.
В соответствии с восьмым вариантом осуществления настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 8 ниже:
Таблица 8
R3=R5=R6=CONHCH(COOR4)(CH2)kR9
нения
R2=R5=R6=CONHCH(COOR4)(CH2)kR9
В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к производным гидрохинона формулы (I), где
(A)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H или CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил. пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил. C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил. C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=гетероарил-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H или CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=гетероарил-R9.
В соответствии с девятым вариантом осуществления настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 9:
Таблица 9
R3=R5=R6=гетероарил-R9
R2=R5=R6=гетероарил-R9
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производному гидрохинона формулы (I), где:
(A)
Ra, RB=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, CONH-R10;
Rt=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R2=H; R3=R5; и
R5=R7=бензогетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов] или фтора; или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H или CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R3=H; R2=R5; и
R5=R7=бензогетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, азолов [5-членных N-содержащих гетероциклов] или фтора.
В соответствии десятым вариантом осуществления настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 10:
Таблица 10
R3=R5=R7
R2=R5=R7
Предпочтительно, настоящее изобретение относится к производному гидрохинона формулы (I), где:
(A)
Ra, Rb=H, C1-4ацил, арилС1-4алкил, C6-C10арилCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7алкилNHCO, фосфоно, фосфонооксиметил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил или C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H или CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R2=H; R3=R5; и
R5=R8=(CH2)mX(CH2)pR9;
где X=O, S, SO2, NH, NAc или N(CH2)qR9;
или
(B)
Ra, Rb=H, C1-4ацил, арилС1-4алкил, C6-C10арилCO, HOOC(CH2)nCO, C1-C6алкилNHCO, фосфоно, фосфонооксиметил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил или C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H или CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилС1-4алкил, функционализированный C1-C6алкил, включая морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C6-C10арил, включая o-метоксифенил (гваяколовый эфир), C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил или (оксодиоксолил)метил;
R3=H; R2=R5; и
R5=R8=(CH2)mX(CH2)pR9;
где X=O, S, SO2, NH, NAc или N(CH2)qR9.
В соответствии с одиннадцатым вариантом осуществления настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 11:
Таблица 11
R3=(CH2)mX(CH2)pR9
q=1;
R9=4-карбокси-2,5-дигидроксифенил
q=1;
R9=4-этокси-карбокси-2,5-дигидроксифенил
R2=(CH2)mX(CH2)pR9
q=1;
R9=3-карбокси-2,5-дигидроксифенил
R=2-морфолиноэтил
q=1:
R9=3-этокси-карбонил-2,5-дигидроксифенил
В соответствии с еще другим вариантом осуществления настоящее изобретение включает соединения в соответствии с таблицей 12:
Таблица 12
Настоящее изобретение также относится к способу получения производного гидрохинона формулы (I), который включает следующие стадии:
Стадия (a): сочетание карбоновой кислоты, полученной из гидрохинона, защищенной по фенольным функциональным группам, с анилином, несущим различные функциональные группы, посредством соответствующего ацилхлорида или с использованием амидного связующего агента, такого как TCFH, в присутствии NMI;
Стадия (b): удаление защитных сложноэфирных групп, как правило, с помощью реакции омыления; и
Стадия (c): удаление защиты у фенольных функциональных групп, как правило, каталитическим гидрированием.
Или, альтернативно,
Стадия (d): восстановление карбоновой кислоты, производной гидрохинона, защищенной по фенольным функциональным группам, с получением бензилового спирта;
(e) активирование функциональной группы бензилового спирта и замещение бензильным нуклеофилом (спиртом, тиолом, первичным или вторичным амином), несущим различные функциональные группы;
(f) удаление защитных сложноэфирных групп, как правило, с помощью реакции омыления; и
(g) удаление защиты у фенольных функциональных групп, как правило, каталитическим гидрированием.
Способ схематически представлен ниже:
Производные гидрохинона по настоящему изобретению могут присутствовать в виде оптически активных форм (стереоизомеров), E/Z-изомеров, энантиомеров, рацематов, диастереоизомеров и их гидратов и сольватов. Сольваты соединений возникают за счет взаимного притяжения между молекулами соединения и используемого инертного растворителя. Сольваты, например, представляют собой моногидраты, дигидраты или алкоголяты.
Производные гидрохинона по настоящему изобретению могут также присутствовать в виде фармацевтически приемлемых солей, при этом исходные производные гидрохинона модифицированы путем получения их кислых или основных солей.
Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, среди прочего, соли минеральных или органических кислот основных остатков, таких как амины; и щелочные или органические соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты и тому подобное. Фармацевтически приемлемые соли могут включать обычные нетоксичные соли или соли четвертичного аммония, которые подходят для всех путей введения соединений, например, из нетоксичных органических или неорганических кислот. Например, указанные обычные нетоксичные соли включают соли, полученные из неорганических кислот, таких хлористоводородная, бромистоводородная, серная, сульфаминовая, фосфорная, азотная и тому подобное; и соли, полученные из органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, памовая, малеиновая, гидроксильная, фенилуксусная, глутаминовая, бензойная, салициловая, сульфаниловая, 2-ацетоксибензойная, фумаровая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, этандисульфоновая, щавелевая, изетионовая, трифторуксусная и тому подобное.
Фармацевтически приемлемые соли описаны для катионов и анионов «Pharmaceutical salts: A summary on doses of salt formers from the Orange Book». Saal C, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 49, 614-623. В качестве примеров катионов можно привести алюминий, аргинин, бензатин, кальций, хлорпрокаин, холин, диэтаноламин, диэтиламин, этаноламин, этилендиамин, лизин, магний, гистидин, литий, меглумин, калий, новокаин, натрий, триэтиламин, цинк. В качестве примеров анионов можно привести ацетат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, безилат, бикарбонат, битартрат, бромид, камзилат, карбонат, хлорид, цитрат, деканоат, эдетат, эзилат, фумарат, глюкептат, глюконат, глутамат, гликолят, гексаноат, гидроксинафтоат, йодид, изетионат, лактат, лактобионат, малат, малеат, манделат, мезилат, метилсульфат, мукат, напсилат, нитрат, октаноат, олеат, памоат, пантотенат, фосфат, полигалактуронат, пропионат, салицилат, стеарат, ацетат, сукцинат, сульфат, тартрат, теоклат, тозилат. Альтернативно, цвиттер-ионы могут быть использованы в виде солей, таких как свободные аминокислоты аргинин или лизин, в качестве катионных противоионов и глутамат или аспартат в качестве анионных противоионов. Короткие пептиды (от 2 до 20 аминокислот) в виде повторяющихся единиц аргинина или лизина и их комбинации с другими нейтральными аминокислотами. Эти катионные пептиды, проникающие в клетки (CPP), могут быть использованы в качестве усилителей проникновения лекарственного средства в клетки.
Фармацевтически приемлемые соли соединений, используемых в настоящем изобретении, могут быть, например, синтезированы из исходного соединения, содержащего основную или кислотную часть, с помощью обычных химических способов. Как правило, указанные соли могут быть получены взаимодействием свободной кислоты или основных форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе, или в их смеси; как правило, предпочтительны неводные среды, такие как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. В обзоре Remingtonʼs Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки, представлены списки подходящих солей.
Подходящие дозировки согласно изобретению и описанные в настоящем документе в различных вариантах осуществления могут варьироваться в зависимости от состояния, возраста и вида субъекта и могут быть легко определены специалистами в данной области. Общие суточные дозы, применяемые как в ветеринарии, так и в медицине человека, должны находиться в диапазоне 0,01-2000 мг/кг массы тела, предпочтительно, от 0,1-1000 мг/кг массы тела, предпочтительно от 1-100 мг/кг, и их можно вводить в виде разовой или разделенной дозы, и, кроме того, верхний предел также может быть превышен, когда это указано. Такая дозировка может быть скорректирована в соответствии с индивидуальными требованиями в каждом случае, включая конкретные вводимые соединения, способ введения, состояние, которое лечат, а также пациента, которого лечат. Однако соединения можно также вводить в виде депо-препаратов (имплантаты, составы с медленным высвобождением и т.д.) еженедельно, ежемесячно или даже с более длительными интервалами. В таких случаях доза может быть намного выше суточной и может быть адаптирована к форме введения, массе тела и конкретному показанию. Подходящая дозировка может быть определена путем проведения обычных модельных испытаний, предпочтительно, моделей на животных. В общем, в случае перорального или парентерального введения взрослым людям с массой тела приблизительно 70 кг должна быть подходящей суточная доза от приблизительно 10 мг до приблизительно 10000 мг, предпочтительно от приблизительно 200 мг до приблизительно 1000 мг, хотя верхний предел может быть превышено, когда это указано. Следует понимать, что вышеуказанные терапевтически эффективные дозы не обязательно должны быть результатом однократного введения и обычно являются результатом введения нескольких стандартных доз. Эти разовые дозы, в свою очередь, могут включать части суточной или недельной дозы, и, таким образом, терапевтически эффективная доза определяется в течение периода лечения (контактирования). Например, при пероральном введении суточная доза может составлять от около 0,04 до около 1,0 мг/кг веса тела, более предпочтительно, от около 0,04 до около 0,20 мг/кг/день, еще более предпочтительно, от около 0,05 до около 0,15 мг/кг/день и, наиболее предпочтительно, около 0,1 мг/кг массы тела. Обычно количество вводимого активного вещества может варьироваться в относительно широком диапазоне для достижения и предпочтительно поддержания желаемой концентрации в плазме. Стандартные лекарственные формы активного ингредиента могут содержать от около 0,1 до около 15 мг. Предпочтительная стандартная лекарственная форма содержит от около 0,1 до около 1 мг агента и может вводиться от 2 до 5 раз в день. Однако следует отметить, что также рассматриваются другие альтернативные пути, такие как непрерывная инфузия со скоростью, предназначенной для поддержания вышеописанной концентрации в плазме. Продолжительность конкретного лечения также может варьироваться в зависимости от тяжести заболевания, от того, предназначено ли лечение для острого проявления или для профилактических целей и тому подобных соображений. Типичное введение продолжается в течение периода времени от около 5 до около 14 дней, при этом обычно курс составляет 7 дней.
Курсы (циклы) введения можно также повторять с месячными интервалами, или парентеральные стандартные дозы можно вводить с недельными интервалами. Пероральные стандартные дозы можно вводить с интервалами от одного до нескольких дней, чтобы обеспечить определенную терапевтически эффективную дозу. Соответствующая дозировка соединений по изобретению будет зависеть от типа заболевания, которое необходимо лечить, от тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли средство в профилактических или терапевтических целях, от анамнеза Определение соответствующей дозы или пути введения явно находится в пределах возможностей действующего врача. Эксперименты на животных служат надежным ориентиром для определения эффективных доз для терапии человека. Межвидовое масштабирование эффективных доз может быть выполнено в соответствии с принципами, установленными Mordenti, J. and Chappell, W. «The use of interspecies scaling in toxicokinetics», Toxicokinetics and New Drug Development, editors Yacobi et al., Pergamon Press, New York, 1989, pp. 42-96.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей (i) терапевтически эффективное количество производного гидрохинона формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, или пролекарства, или стереоизомера, и (ii) фармацевтически приемлемый эксципиент или эксципиенты.
Фармацевтические эксципиенты в соответствии с настоящим изобретением могут быть выбраны из группы, включающей обычные эксципиенты, такие как, но не ограничиваясь ими, солюбилизаторы, связующие, наполнители, разрыхлители, смазывающие вещества, модификаторы pH, усилители проницаемости, модификаторы высвобождения, консерванты, покрывающие агенты, носители, агенты, маскирующие вкус, и их комбинации.
Фармацевтическая композиция соединений по настоящему изобретению с одним или несколькими фармацевтическими компонентами может быть составлена с указанными эксципиентами в виде жидких лекарственных средств, твердых или полутвердых лекарственных средств и/или газообразных медицинских препаратов.
Когда они представлены в виде твердых составов, они могут включать без каких-либо ограничений гранулы, лепешки, таблетки, капсулы, порошки, пленки, леденцы, дробленые таблетки, растворимые таблетки, распадающиеся таблетки, диспергируемые таблетки, таблетки с пленочным покрытием и формы с контролируемым, устойчивым, расширенным или модифицированным высвобождением любой из вышеупомянутых твердых форм. Такие составы также могут быть в формах с немедленным высвобождением, отсроченным высвобождением или модифицированным высвобождением. Кроме того, композиции с немедленным высвобождением могут быть обычными, диспергируемыми, жевательными, растворяющимися во рту или мгновенно растаивающими препаратами, а также композициями с модифицированным высвобождением, которые могут содержать гидрофильные или гидрофобные или комбинации гидрофильных и гидрофобных веществ, контролирующих скорость высвобождения, с образованием матрицы или резервуара или комбинации матричных и коллекторных систем.
Композиции могут быть приготовлены с использованием любого одного или нескольких методов, таких как прямое смешивание, сухая грануляция, влажная грануляция, гомогенизация, измельчение, микронизация, экструзия и сферонизация. Композиции могут быть представлены без покрытия, с пленочным покрытием, с сахарным покрытием, с порошковым покрытием, с энтеросолюбильным покрытием и с покрытием с модифицированным высвобождением. Когда они представлены в виде жидких составов, они могут включать без каких-либо ограничений любые жидкие формы, такие как растворы, суспензии, наносуспензии, дисперсии, коллоиды, эмульсии, лосьоны, кремы, мази, настойки и лиофилизированные композиции. Когда они представлены в виде газообразных составов, они могут включать без каких-либо ограничений размолотый порошок или смесь, микронизированный порошок или смесь, наносуспензии, аэрозоли, спреи, капли, аэрозоли, распыляемые растворы или суспензии и/или атомизированные средства для ингаляции.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать, если это необходимо, добавки, такие как носители, связующие вещества, отдушки, ароматизаторы, подсластители, красители, антисептики, антиоксиданты, стабилизаторы и поверхностно-активные вещества.
Фармацевтические композиции и соединения по настоящему изобретению могут быть составлены для введения энтеральным путем, таким как перорально; парентеральным путем посредством инъекции, такой как внутривенная, подкожная, внутриглазная, внутримышечная или внутрибрюшинная инъекция; путем местного введения, таким как введение в глаз, через слизистые оболочки и трансмукозальный путь, включая подъязычные/буккальные пути; а также легочный, назальный, интраназальный, внутрибронхиальный, внутрилегочный пути. Глазные пути введения включают местное глазное введение, внутриглазное, интравитреальное или ретробульбарное введение.
Предпочтительные составы соединений по настоящему изобретению включают жидкие пероральные составы, глазные составы и составы для внутривенного и внутрибрюшинного введения.
Жидкие лекарственные формы для перорального применения представляют собой растворы и суспензии для перорального введения лекарственных средств, которые широко распространены, удобны и считаются безопасными. Их можно использовать для доставки относительно больших количеств лекарства, и они часто используются в педиатрии и для тех, кто испытывает трудности с глотанием таблеток или капсул. Введение через желудочно-кишечный тракт обеспечивает быстрое растворение и всасывание препарата, однако необходимо учитывать переносимость и взаимодействие с другими веществами в тракте. Свойства активного фармацевтического ингредиента (API) позволяют вводить его в состав простых пероральных растворов на водной основе, однако, когда API плохо растворимы, составы должны разрабатываться касательно вещества для повышения растворимости и биодоступности. Введение поверхностно-активных веществ, растворителей, буферов и масел повышает растворимость и снижает преципитацию и/или деградацию при взаимодействии с желудочным соком. Там, где требуются суспензии, размер частиц часто уменьшают и контролируют для повышения растворимости, проникновения и, в конечном счете, абсорбции лекарственного средства. По мере разработки рецептуры вводятся консерванты и ароматизаторы, чтобы обеспечить соответствие требованиям пациентов и срок годности.
Глазные препараты представляют собой офтальмологические препараты, которые доставляются непосредственно в глаз и часто представляют собой жидкости в виде растворов или суспензий. Введение в глаза позволяет избежать метаболизма в желудочно-кишечном тракте и может использоваться для лекарств, которые плохо всасываются при пероральном введении. Глазные капли стерильны и изотоничны с номинальным pH 4-8, чтобы избежать раздражения глаз. Эксципиенты, включая солюбилизирующие агенты, хелатирующие агенты, полимеры, поверхностно-активные вещества, усилители проницаемости и циклодекстрины, добавляют в состав для улучшения стабильности, изменения вязкости или увеличения растворимости, проницаемости и биодоступности плохо растворимых лекарственных средств.
Внутривенные лекарственные формы обеспечивают быстрое всасывание после парентерального введения всей дозы препарата, достигающей системы пациента для немедленного ответа. Этот способ введения позволяет избежать метаболизма в желудочно-кишечном тракте и может быть использован для препаратов, плохо всасывающихся при пероральном введении. Инъекции обычно представляют собой стерильные изотонические растворы на водной основе и не вызывают боли при введении. Для плохо растворимых лекарственных препаратов составы модифицируют органическими сорастворителями, поверхностно-активными веществами и буферами для повышения растворимости, при этом также приемлемы составы в виде наносуспензий. Для тех молекул, которые нестабильны в растворе, составы могут быть лиофилизированы для разбавления в момент использования.
В настоящем изобретении также предложены наборы, включающие композицию, содержащую терапевтически эффективную дозу одного или нескольких соединений по настоящему изобретению или их составов, а также устройство доставки для введения указанной композиции или состава и дополнительно включающие вкладыш в упаковку, содержащий инструкции по использованию.
Для приготовления настоящих фармацевтических композиций активный ингредиент по изобретению можно смешать с фармацевтически приемлемым носителем, адъювантом и/или эксципиентом в соответствии с обычными методами составления фармацевтических композиций. Фармацевтически приемлемые носители, которые можно использовать в композициях по настоящему изобретению, включают стандартные фармацевтические носители, такие как солевой раствор с фосфатным буфером, вода и эмульсии, такие как эмульсия масло/вода или вода/масло, и различные типы смачивающих агентов. Композиции могут дополнительно содержать твердые фармацевтические эксципиенты, такие как крахмал, целлюлоза, тальк, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат магния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко и тому подобное. Жидкие и полутвердые эксципиенты могут быть выбраны из глицерина, пропиленгликоля, полиэтиленгликоля, воды, этанола и различных масел, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло, и т.д. Жидкие носители, особенно для растворов для инъекций, включают воду, физиологический раствор, водную декстрозу и гликоли. Примеры носителей, стабилизаторов и адъювантов смотри в обзоре Remingtonʼs Pharmaceutical Sciences, edited by E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990).
Композиции также могут включать стабилизаторы и консерванты. Примеры фармацевтически приемлемых растворителей, которые можно использовать в настоящей композиции, можно найти в справочниках, таких как Handbook of Pharmaceutical Excipients (Ninth Edition, Pharmaceutical Press, London and American Pharmacists Association, Washington, 2020), Aultonʼs Pharmaceutics, The Design and Manufacture of Medicines. (Fifth edition, Editors: Kevin Taylor and Michael Aulton, Elsevier, 2017), «Ullmannʼs Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed.» (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker) и «Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems» (ANSEL et al., 1994 et 2011, WILLIAMS & WILKINS). Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых растворителей, которые можно использовать в настоящей композиции, включают, но не ограничиваются ими, пропиленгликоль (также известный как 1,2-дигидроксипропан, 2-гидроксипропанол, метилэтиленгликоль, метилгликоль или пропан-1,2-диол), этанол, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол, глицерин, полиэтиленгликоль (PEG), гликоль, кремофор EL или любые формы полиэтоксилированного касторового масла, дипропиленгликоль, диметилизосорбид, пропиленкарбонат, N-метилпирролидон, гликофурол, тетраэтиленгликоль, сложные эфиры пропиленгликоля и жирных кислот и их смеси.
Соединения в соответствии с изобретением продемонстрировали антифиброзное, противовоспалительное и антиангиогенное действие. Несколько заболеваний, перечисленных в настоящем изобретении, включают не только одну, но две или даже три мишени. Категории заболеваний с преобладанием ангиогенной (сосудистой), воспалительной и/или фиброзной патобиологии.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пролекарствам соединений по настоящему изобретению. Преимущества таких пролекарств достигаются способами, известными специалисту в данной области, например, путем добавления подходящих расщепляемых функциональных групп, которые могут обеспечить, например, лучшую растворимость в воде для парентеральной доставки или для пероральной доставки.
Особенно предпочтительны пролекарства для соединений по изобретению, проявляющие очень полярные и заряженные свойства, поскольку эти функциональные группы могут положительно влиять на пассивную проницаемость через биологические мембраны. Основным препятствием для полярных и заряженных лекарств является их плохая проницаемость через мембраны, что часто приводит к низкой и изменчивой пероральной абсорбции и низкой пероральной биодоступности. Кроме того, пероральное всасывание полярных и заряженных лекарств часто связано со значительной межвидовой изменчивостью. Препараты с плохой проницаемостью также имеют низкие уровни воздействия на определенные органы-мишени даже после местного применения. На сегодняшний день улучшение проницаемости мембран было одной из самых плодотворных областей исследований пролекарств. Для лекарственных средств по изобретению для преодоления местных барьеров на пути к глазу, барьеров слизистой оболочки полости рта, транспортерных эффектов или других местных применений были разработаны различные стратегии получения пролекарств.
Стратегии получения пролекарств были официально объявлены Адрианом Альбертом в 1958 г. (Albert, A. Chemical aspects of selective toxicity. Nature, 1958, 182, 421-422) но их разработка началась в начале прошлого века, о чем свидетельствуют метенамин, фенацетин и пронтосил. Пролекарства, как правило, представляют собой молекулы с незначительной фармакологической активностью или без нее, но имеющие встроенную структурную лабильность, случайную или преднамеренную, которая обеспечивает биоконверсию in vivo в активное лекарственное средство. Преобразование может происходить посредством химического или ферментативного процесса или их комбинации. Активные молекулы часто связаны с нежелательными физико-химическими свойствами, что создает значительные трудности для их доставки к соответствующей биологической мишени.
Пролекарства, полученные путем структурных модификаций лекарства, предназначены для воздействия на присущие молекуле физико-химические свойства, чтобы обеспечить ее доставку. Эти разработки не всегда учитываются при разработке новых молекул на этапе открытия. Часто аналоговая оптимизация является предпочтительным путем. Реализация стратегии раннего пролекарства может привести к более быстрой клинической разработке и, в конечном итоге, к коммерциализации лекарственного продукта.
Стратегии получения пролекарств для наиболее распространенных функциональных групп исходных препаратов описаны Rautio J, 2018 (Jarkko Rautio et al, Nature Reviews Drug Discovery, 2018, 17, 559-587). В этом обзоре описывается возрастающая роль пролекарств в дизайне и разработке современных лекарств, а также стратегии пролекарств для наиболее распространенных функциональных групп исходных лекарств.
Преимущества пролекарств достигаются за счет добавления подходящих расщепляемых функциональных групп, которые могут обеспечить, например, лучшую растворимость в воде для парентеральной доставки или для пероральной доставки. С другой стороны, для очень полярных и заряженных молекул эти функциональные группы могут положительно влиять на пассивную проницаемость через биологические мембраны. Основным препятствием для полярных и заряженных лекарств является их плохая проницаемость мембран, что часто приводит к низкой и изменчивой пероральной абсорбции и низкой пероральной биодоступности.
Кроме того, пероральное всасывание полярных и заряженных лекарств часто связано со значительной межвидовой изменчивостью. Препараты с плохой проницаемостью также имеют низкие уровни воздействия на определенные органы-мишени даже после местного применения. На сегодняшний день улучшение проницаемости мембран было одной из самых плодотворных областей исследований пролекарств. Для влияния на липофильность исходного лекарства можно применять многие стратегии пролекарств. Липофильность лекарств была улучшена за счет маскировки их полярных и ионизированных функциональных групп короткоцепочечными углеводородными прогруппами. Гидрофильные гидроксильные, карбоксильные, фосфатные или аминовые и другие отрицательно или положительно заряженные группы были успешно преобразованы в более липофильные алкиловые или ариловые эфиры или N-ацил производные, которые быстро гидролизуются обратно в исходные лекарства в организме повсеместно распространенными эстеразами или пептидазами.
Большинство липофильных пролекарств были разработаны для улучшения проницаемости мембран и всасывания при пероральном приеме. Та же самая стратегия получения пролекарства может быть применена для улучшения местного применения исходных препаратов, которые всасываются через кожу или глаза. При местном применении на глазах пролекарство легко проникает через роговицу после закапывания, где гидролизуется преимущественно глазной карбоксиэстеразой. Пролекарства также могут использовать транспорт, опосредованный переносчиком. Эти транспортеры представляют собой мембранные белки, которые играют важную роль в контроле поступления и оттока важных полярных эндогенных питательных веществ. Их специфичность не ограничивается эндогенными субстратами, и лекарственные препараты, которые имеют близкое структурное сходство с эндогенными субстратами, также могут переноситься через клеточные мембраны транспортерами. Транспорт, опосредованный переносчиком, особенно важен для полярных и заряженных лекарств, поскольку их пассивная диффузия через биологические мембраны незначительна. Пролекарства, которые могут использовать транспортные механизмы, опосредованные переносчиком, представляют собой интересные мишени для дизайна лекарств. Точно так же пролекарства могут улучшить метаболическую стабильность.
Пролекарства могут улучшать метаболическую нестабильность, которая обычно связана с печеночным метаболизмом. Точно так же нежелательный кишечный метаболизм лекарств можно преодолеть с помощью стратегий получения селективного пролекарства. Эта нестабильность может значительно уменьшить общее количество лекарственного средства, достигающего системного кровообращения и его мишени. Пролекарства можно использовать для защиты активных лекарств от этого эффекта первого прохождения путем маскирования метаболически лабильной, но фармакологически важной функциональной группы, такой как фенол, во избежание быстрого метаболизма.
Чтобы решить проблему недостаточного уровня в плазме и продлить продолжительность действия, лекарства обычно регулируются составами, такими как суспензии и полимерные матрицы, которые контролируют высвобождение лекарства и избегают пиковых эффектов и продлевают их действие. Пролекарства можно использовать для достижения контролируемого высвобождения активного лекарственного средства путем изменения его растворимости в воде и свойств растворения таким образом, что это влияет на скорость высвобождения активного лекарственного средства, скорость абсорбции или его распределение в тканях.
Пролекарства были особенно полезны при разработке нескольких подкожных или внутримышечных инъекций депо с замедленным высвобождением, которые поддерживают терапевтические уровни исходного лекарственного средства в плазме в течение недель или месяцев. Эти пролекарства, как правило, представляют собой сложные эфиры жирных кислот, такие как деканоаты, пальмитаты, энантаты, ципионаты или валераты, которые составлены в носителе на масляной основе, что приводит к медленному высвобождению пролекарства и, следовательно, модулирует распределение исходного лекарства. Высокая липофильность этих пролекарств также приводит к связыванию с белками крови и тканей, что замедляет ферментативное превращение и, следовательно, приводит к медленному поступлению активного лекарственного средства в системный кровоток.
Лучшее нацеливание и более низкие побочные эффекты часто достигаются при нацеливании пролекарств на расщепление в кислой среде опухолевой ткани, в эндосомах или лизосомах с кислотолабильным пролекарством. Подобный подход также достигается с использованием сайт-специфических ферментов, и пролекарство преимущественно расщепляется в желаемом органе или ткани, где фермент находится в самой высокой концентрации. Для заряженных лекарств внутриклеточное расщепление приводит к высокой клеточной концентрации отрицательно или положительно заряженного лекарства, которое остается заключенным в клетке-мишени.
были разработаны для лекарственных средств по изобретению для преодоления местных барьеров на пути к глазу, барьеров слизистой оболочки полости рта, эффектов переносчиков или других местных применений.
Лекарства по изобретению несут заряженные полярные группы. Проблема, которую необходимо решить, зависит от пути введения и необходимости длительного или короткого действия препарата. Были успешно синтезированы примеры пролекарств, которые расщепляются эстеразами мыши, а также тканей человека и крови.
Соединения по изобретению несут карбоксильные функции и фенольные группы. Можно рассмотреть большое разнообразие пролекарств, полученных из этих функций: например, карбоновые кислоты чаще всего преобразуются в сложные эфиры: простые алкиловые сложные эфиры (метиловые, этиловые, изопропиловые и более длинные цепи), функционализированные алкиловые сложные эфиры, такие как морфолиноалкиловые сложные эфиры, пирролидиноалкиловые сложные эфиры, N-метилпиперазиноалкиловые сложные эфиры, а также ариловые сложные эфиры, такие как сложные эфиры, производные гваякола; смешанные сложные эфиры ацеталя, такие как ацилоксиметиловый (или 1-этиловый) или алкоксикарбонилоксиметиловый (или 1-этиловый) эфир и (оксодиоксолил)метиловый эфир, также являются эффективными пролекарственными функциями для карбоновых кислот. В качестве пролекарств на основе фенолов используют разнообразные сложные эфиры и функционализированные эфиры: простые алифатические эфиры, ароматические эфиры, полуэфиры дикарбоновых кислот, эфиры аминокислот, эфиры карбамата, моноэфиры фосфатов, фосфонооксиметиловые эфиры, ацилоксиметиловые (или 1-этиловые) эфиры, алкоксикарбонилоксиметиловые (или 1-этиловые) эфиры, аминоацилоксиметиловые эфиры тому подобное.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения и/или предотвращения аутоиммунных, иммунологических, ревматологических, сосудистых, офтальмологических, фиброзных, метаболических и желудочно-кишечных заболеваний, нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний, новообразований и связанных с раком заболеваний. гормонозависимых заболеваний и иммунологических нарушений, возникающих в результате вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний и их осложнений, включающих введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективной дозы соединений и/или фармацевтических композиций по настоящему изобретению, как описано выше.
Фармацевтические композиции и способы согласно настоящему изобретению особенно подходят для субъекта, который является человеком или животным, отличным от человека.
Соединения в соответствии с изобретением могут воздействовать на заболевания на основе их индивидуальных профилей цитокинов, как описано в BIODATA, предоставленных для нескольких соединений (смотри фигуры 3A-D). На следующем веб-сайте Open Targets Platform (URL: https://www.targetvalidation.org/, Denise Carvalho et al, Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1, 08 January 2019, D1056-D1065, https://doi.org/10.1093/nar/gky1133) дается полная картина, основанная на текущей библиографической информации, и может быть выполнен поиск по заболеванию или цитокину.
Два типичных примера: (а) специфический поиск диабетической ретинопатии приводит к следующим цитокинам, описанным с высокой корреляцией с заболеванием (фигура 3С). Три основных цитокина, например, для поиска диабетической ретинопатии, показывают, что оценка VEGFA=1 (фактор роста эндотелия сосудов А), оценка HFE=1 (гомеостатический регулятор железа) и оценка TNF=0,86 (фактор некроза опухоли) и (b) поиск VEGFA: приводит к заболеваниям нервной системы, сосудистым заболеваниям, заболеваниям глаз, ретинопатии и ряду других заболеваний, показанных на рисунке 3D.
Чтобы проиллюстрировать эффективность соединений в отношении небольшой группы воспалительных цитокинов, эффекты соединений оценивали на цельной крови человека (пример 3.6) и их значения IC50 на ингибирование воспаления, индуцированного ЛПС (таблица 13, в мкМ).
Таблица 13
Иммунологические/ревматологические/сосудистые нарушения могут включать, например, перитонит, болезнь Кавасаки (KD), артериит Такаясу (TA), микроскопический полиангиит (MP), гигантоклеточный артериит (GCA), антифосфолипидный синдром (APS), болезнь Бехчета (BD), гранулематоз с полиангиитом (GPA) или гранулематоз Вегенера (WG), эозинофильный гранулематоз с полиангиитом, синдром Чарга-Стросса (EGPA) и розацеа (RO).
Ревматологические расстройства, в частности, поражают суставы, сухожилия, связки и кости с болью, потерей подвижности и воспалением. К ним относятся многие виды артрита, такие как остеоартрит (ОА), ревматоидный артрит (RA), волчанка, спондилоартропатии: анкилозирующий спондилоартрит (AS) и псориатический артрит (PsA), синдром Шегрена, подагра, склеродермия, инфекционный артрит, ювенильный идиопатический артрит, ревматическая полимиалгия.
Перитонит представляет собой воспаление брюшины, обычно вызванное бактериальной или грибковой инфекцией. Различают два типа перитонита. Первый тип представляет собой спонтанный перитонит, который может развиться как осложнение заболевания печени, например, цирроза, или заболевания почек. Вторичный перитонит может возникнуть в результате перфорации брюшной полости или как осложнение других заболеваний. При отсутствии лечения перитонит может привести к тяжелой, потенциально опасной для жизни инфекции.
Болезнь Кавасаки вызывает воспаление стенок артерий среднего калибра по всему телу. В первую очередь поражает детей. Воспаление имеет тенденцию поражать коронарные артерии, которые снабжают кровью сердечную мышцу. Болезнь Кавасаки иногда называют синдромом кожно-слизистых лимфатических узлов, поскольку она также поражает лимфатические узлы, которые увеличиваются во время инфекции, кожу и слизистые оболочки рта, носа и горла.
Артериит Такаясу представляет собой редкий тип васкулита, группу заболеваний, вызывающих воспаление кровеносных сосудов. При артериите Такаясу воспаление повреждает аорту и ее основные ветви. Заболевание может привести к сужению или закупорке артерий или к аневризме. Артериит Такаясу также может привести к боли в руке или груди, высокому кровяному давлению и, в конечном итоге, к сердечной недостаточности или инсульту. Лекарства необходимы для контроля воспаления в артериях и предотвращения осложнений.
Гранулематоз с полиангиитом представляет собой редкое заболевание, вызывающее воспаление кровеносных сосудов в носу, придаточных пазухах, горле, легких и почках. Ранее называвшееся гранулематозом Вегенера, это состояние относится к группе заболеваний кровеносных сосудов, называемых васкулитами. Замедляет приток крови к некоторым органам. В пораженных тканях могут образовываться участки воспаления, называемые гранулемами, которые могут влиять на работу этих органов. Без лечения состояние может быть фатальным.
Гигантоклеточный артериит представляет собой воспаление слизистой оболочки артерий. Чаще всего поражаются артерии в области головы, особенно в области висков. По этой причине гигантоклеточный артериит иногда называют височным артериитом. Гигантоклеточный артериит часто вызывает головные боли, болезненность кожи головы, боль в челюсти и проблемы со зрением. Без лечения это может привести к слепоте.
Антифосфолипидный синдром возникает, когда иммунная система ошибочно вырабатывает антитела, повышающие вероятность свертывания крови. Это может вызвать опасные тромбы в ногах, почках, легких и мозге. У беременных антифосфолипидный синдром также может привести к выкидышу и мертворождению. Антифосфолипидный синдром неизлечим. Только доступные лекарства могут снизить риск образования тромбов. Болезнь Бехчета, также называемая синдромом Бехчета, представляет собой редкое заболевание, вызывающее воспаление кровеносных сосудов. Заболевание может привести к многочисленным признакам и симптомам, которые на первый взгляд могут показаться несвязанными. Они могут включать язвы во рту, воспаление глаз, кожную сыпь и поражения, а также язвы на половых органах. Текущее лечение может помочь уменьшить симптомы болезни Бехчета и предотвратить серьезные осложнения, такие как слепота.
Синдром Чарга-Стросса представляет собой заболевание, характеризующееся воспалением кровеносных сосудов. Это воспаление может ограничивать приток крови к органам и тканям, иногда необратимо повреждая их. Это состояние также известно как эозинофильный гранулематоз с полиангиитом (EGPA). Астма является наиболее частым признаком синдрома Чарга-Стросса. Расстройство также может вызывать другие проблемы, такие как сенная лихорадка, сыпь, желудочно-кишечное кровотечение, боль и онемение рук и ног. Синдром Чарга-Стросса неизлечим. Текущие лекарства включают стероиды и другие мощные иммунодепрессанты, которые помогают контролировать симптомы.
Розацеа представляет собой распространенное кожное заболевание, которое вызывает покраснение и видимые кровеносные сосуды на лице. Также могут образовываться маленькие, красные, заполненные гноем шишки. Эти признаки и симптомы могут обостряться в течение нескольких недель или месяцев, а затем исчезать на некоторое время. Розацеа может быть ошибочно принята за акне, другие проблемы с кожей или естественный румянец. Лекарства от розацеа нет, но лечение может контролировать и уменьшать признаки и симптомы. Остеоартрит является наиболее распространенной формой артрита, поражающей миллионы людей во всем мире. Это происходит, когда защитный хрящ со временем изнашивается. Хотя остеоартрит может повредить любой сустав, это заболевание чаще всего поражает суставы рук, колени, бедра и позвоночник. Симптомы остеоартрита обычно можно контролировать, хотя повреждение суставов нельзя обратить вспять.
Волчанка является аутоиммунным заболеванием. Это заставляет иммунную систему вырабатывать белки, называемые аутоантителами, которые атакуют собственные ткани и органы, включая почки. Волчаночный нефрит является частым осложнением у людей с системной красной волчанкой (обычно известной как волчанка). Волчаночный нефрит возникает, когда волчаночные аутоантитела поражают структуры почек. Это вызывает воспаление почек и может привести к крови в моче, белку в моче, высокому кровяному давлению, нарушению функции почек или даже почечной недостаточности.
Склеродермия представляет собой группу редких заболеваний, сопровождающихся уплотнением и уплотнением кожи и соединительных тканей. Существует много различных типов склеродермии. У некоторых людей склеродермия поражает только кожу. Но у многих людей склеродермия также поражает структуры за пределами кожи, такие как кровеносные сосуды, внутренние органы и пищеварительный тракт (системная склеродермия). От склеродермии нет лекарства.
Синдром Шегрена представляет собой расстройство иммунной системы, которое определяется двумя наиболее распространенными симптомами: сухостью глаз и сухостью во рту. Состояние часто сопровождает другие нарушения иммунной системы, такие как ревматоидный артрит и волчанка. При синдроме Шегрена в первую очередь обычно поражаются слизистые оболочки и влагосекретирующие железы глаз и рта, что приводит к уменьшению количества слез и слюны.
Инфекционный или септический артрит представляет собой болезненную инфекцию в суставе, которая может исходить от микробов, попадающих в кровоток из другой части тела. Септический артрит также может возникнуть, когда проникающие ранения, такие как укус животного или травма, доставляют микробы непосредственно в сустав. Люди с искусственными суставами также подвержены риску септического артрита. Чаще всего поражаются колени, но септический артрит также может поражать бедра, плечи и другие суставы. Инфекция может быстро и серьезно повредить хрящи и кости в суставе, поэтому крайне важно быстрое лечение.
Ювенильный идиопатический артрит, ранее известный как ювенильный ревматоидный артрит, является наиболее распространенным типом артрита у детей в возрасте до 16 лет. Ювенильный идиопатический артрит может вызывать постоянную боль в суставах, отек и скованность. Некоторые дети могут испытывать симптомы в течение всего нескольких месяцев, в то время как у других симптомы сохраняются в течение многих лет. Некоторые виды ювенильного идиопатического артрита могут вызывать серьезные осложнения, такие как проблемы роста, повреждение суставов и воспаление глаз.
Ревматическая полимиалгия представляет собой воспалительное заболевание, вызывающее мышечную боль и скованность, особенно в плечах и бедрах. Признаки и симптомы ревматической полимиалгии обычно проявляются быстро и усиливаются по утрам. Большинство людей, у которых развивается ревматическая полимиалгия, старше 65 лет. Это состояние связано с другим воспалительным заболеванием, называемым гигантоклеточным артериитом.
Офтальмологические расстройства могут включать, например, без каких-либо ограничений, возрастную дегенерацию желтого пятна (AMD или ARMD, сухая и влажная формы), птеригиум (PTE), диабетическую ретинопатию (DR), диабетический макулярный отек (DME), болезнь Штаргардта (SD), пролиферативный витреоретинопатия (PVR), синдром сухого глаза (DYS), эндофтальмит, центральную серозную хориоретинопатию (CSC), пигментный ретинит (RP), глаукома и осложнения, связанные с глаукомой, и увеит (UVE).
Влажная дегенерация желтого пятна представляет собой хроническое заболевание глаз, которое вызывает нечеткость зрения или слепое пятно в поле зрения. Как правило, это вызвано аномальными кровеносными сосудами, которые просачивают жидкость или кровь в макулу. Макула находится в части сетчатки, отвечающей за центральное зрение. Влажная дегенерация желтого пятна является одним из двух типов возрастной дегенерации желтого пятна. Влажный тип всегда начинается с сухого типа. Сухая дегенерация желтого пятна встречается чаще и менее тяжелая. Это также вызывает нечеткость или снижение центрального зрения из-за истончения макулы. Сухая дегенерация желтого пятна может сначала развиться в одном или обоих глазах, а затем поразить оба глаза. Потеря зрения обычно центральная, но сохраняется периферическое зрение.
Диабетическая ретинопатия представляет собой осложнение диабета, поражающее глаза. Это вызвано повреждением кровеносных сосудов сетчатки. Сначала диабетическая ретинопатия может не вызывать никаких симптомов или вызывать лишь легкие проблемы со зрением. В конце концов, это может привести к слепоте. Заболевание может развиться у любого человека, страдающего диабетом 1 или 2 типа. DME представляет собой серьезное глазное осложнение, которое возникает, когда микроаневризмы выпячиваются из стенок сосудов, просачиваясь или просачиваясь в сетчатку, что вызывает отек макулы.
Болезнь Штаргадта представляет собой заболевание глаз, которое вызывает потерю зрения у детей и молодых людей. Это наследственное заболевание, поэтому дети передаются от родителей. Болезнь Штаргардта является формой дегенерации желтого пятна и часто называется ювенильной дегенерацией желтого пятна.
PVR представляет собой заболевание, развивающееся как осложнение регматогенной отслойки сетчатки. PVR возникает примерно у 8-10% пациентов, перенесших первичную операцию по поводу отслойки сетчатки, и препятствует успешной хирургической коррекции регматогенной отслойки сетчатки. PVR можно лечить хирургическим путем, чтобы прикрепить отслоившуюся сетчатку, но визуальный результат операции очень плохой.
Болезнь сухого глаза представляет собой распространенное состояние, которое возникает, когда слезы не могут обеспечить адекватную смазку глаз. Слезы могут быть неадекватными и нестабильными по многим причинам. Например, сухость глаз может возникнуть, если у вас недостаточно слез или слезы неудовлетворительного качества. Эта нестабильность слезы приводит к воспалению и повреждению поверхности глаза.
Эндофтальмит представляет собой воспаление внутренней части глаза, которое может возникнуть после инъекции в глаз или операции. Типичными признаками являются: помутнение зрения или другие изменения зрения, боль в глазах, покраснение глаз, чувствительность глаз к свету или слезотечение.
Пигментный ретинит (RP) представляет собой группу редких генетических заболеваний, которые связаны с разрушением и потерей клеток сетчатки - светочувствительной ткани, выстилающей заднюю часть глаза. Общие симптомы включают трудности со зрением ночью и потерю бокового (периферийного) зрения.
Глаукома представляет собой группу заболеваний глаз, при которых повреждается зрительный нерв, здоровье которого жизненно важно для хорошего зрения. Это повреждение часто вызвано аномально высоким глазным давлением. Глаукома является одной из основных причин слепоты у людей старше 60 лет. Она может возникнуть в любом возрасте, но чаще встречается у пожилых людей. Многие формы глаукомы не имеют настораживающих признаков. Эффект настолько постепенный, что зрение не меняется до тех пор, пока состояние не перейдет в продвинутую стадию.
Увеит представляет собой форму воспаления глаз. Он поражает средний слой ткани в стенке глаза или сосудистой оболочке глаза. Предупреждающие признаки увеита часто появляются внезапно и быстро ухудшаются. Они включают покраснение глаз, боль и помутнение зрения. Возможными причинами увеита являются инфекция, травма, аутоиммунное или воспалительное заболевание. Увеит может быть серьезным, приводя к необратимой потере зрения.
Соединения и фармацевтические композиции по настоящему изобретению также можно использовать в способе лечения и/или профилактики нейродегенеративного заболевания сетчатки, выбранного из группы, включающей диабетическую ретинопатию, возрастную дегенерацию желтого пятна, глаукому и пигментный ретинит.
Нейродегенеративные заболевания сетчатки относятся к состояниям сетчатки, характеризующимся прогрессирующей потерей нейронов. Диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна, глаукома и пигментный ретинит считаются заболеваниями сетчатки, в которых нейродегенерация играет существенную роль.
Согласно этому предпочтительному варианту осуществления соединения по настоящему изобретению можно комбинировать с другими активными агентами для повышения терапевтической эффективности состояния, подлежащего лечению, и, в частности, с ингибитором дипептидилпептидазы-4 (DPPIV) или его фармацевтически приемлемой солью, для применение для местного лечения глаз и/или профилактики нейродегенеративного заболевания сетчатки. Ингибитор DPPIV может быть выбран из группы, включающей ситаглиптин, саксаглиптин, вилдаглиптин, линаглиптин, анаглиптин, тенелиглиптин, алоглиптин, трелаглиптин, гемиглиптин, омариглиптин, его фармацевтически приемлемые соли и их смеси.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением можно также успешно комбинировать с лечением против VEGF, чтобы уменьшить количество внутриглазных инъекций анти-VEGF антитела, необходимых пациентам. Введение пациентам с нейродегенеративными заболеваниями сетчатки, такими как, например, диабетическая ретинопатия, возрастная дегенерация желтого пятна, замедляет прогрессирование этих заболеваний и снижает потребность пациентов в анти-VEGF фармакотерапии.
Фиброзные расстройства могут включать, например, без каких-либо ограничений, кистозный фиброз, забрюшинный фиброз, идиопатический легочный фиброз, комбинированный легочный фиброз и эмфизему (CPFE), эозинофильный ангиоцентрический фиброз, кишечный фиброз, фиброз яичников, нефротенический системный фиброз, оральный подслизистый фиброз (OSMF) и фиброз печени.
Муковисцидоз (CF) представляет собой наследственное заболевание, вызывающее серьезное поражение легких, пищеварительной системы и других органов в организме. Поражает клетки, вырабатывающие слизь, пот и пищеварительные соки. Вместо того, чтобы действовать как смазка, выделения закупоривают трубки, протоки и проходы, особенно в легких и поджелудочной железе.
Легочный фиброз представляет собой заболевание легких, которое возникает, когда легочная ткань повреждается и рубцуется. Эта утолщенная, жесткая ткань затрудняет правильную работу легких. Рубцевание, связанное с легочным фиброзом, может быть вызвано множеством факторов. Повреждение легких, вызванное легочным фиброзом, невозможно исправить, но лекарства и методы лечения иногда могут помочь облегчить симптомы и улучшить качество жизни.
Эмфизема представляет собой заболевание легких, которое вызывает одышку. Альвеолы повреждаются, и со временем внутренние стенки альвеол ослабевают и разрываются, создавая большие воздушные пространства вместо множества маленьких. Это уменьшает площадь поверхности легких и, в свою очередь, количество кислорода, попадающего в кровоток. Поврежденные альвеолы не работают должным образом, что приводит к задержанию старого воздуха и не оставляет места для поступления свежего, богатого кислородом воздуха.
Метаболические и желудочно-кишечные расстройства могут включать, например, без каких-либо ограничений, осложнения, вызванные диабетом: диабетическую нефропатию (DN), диабетическую ретинопатию (DR), диабетическую кардиомиопатию (DCDM) или диабетическую язву стопы (DFU). Заболевания печени могут включать неалкогольную жировую болезнь печени (NAFLD), неалкогольный стеатический гепатоз (NASH), первичный билиарный холангит (PBC), фиброз или цирроз печени (HF), воспалительное заболевание кишечника (IBD): язвенный колит, болезнь Крона, фиброз кишечника. Помимо диабетической нефропатии, другие заболевания почек могут включать поликистозную болезнь почек (PKD), хроническую болезнь почек (CKD), нефрогенный системный фиброз (NSF) и панкреатит (острый и хронический).
Диабетическая нефропатия является серьезным почечным осложнением сахарного диабета 1 и 2 типа. Его также называют диабетической болезнью почек. Примерно у 25% людей с диабетом в конечном итоге развивается заболевание почек. Диабетическая нефропатия влияет на способность почек выполнять свою обычную работу по удалению отходов и лишней жидкости из организма. В течение многих лет это состояние медленно повреждает тонкую систему фильтрации почек и может прогрессировать до почечной недостаточности, также называемой терминальной стадией почечной недостаточности. Почечная недостаточность является опасным для жизни состоянием.
Неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) является общим термином для целого ряда заболеваний печени, поражающих людей, которые употребляют мало алкоголя или вообще не употребляют его. Как следует из названия, основной характеристикой NAFLD является чрезмерное накопление жира в клетках печени. Наиболее распространенная форма хронического заболевания печени. У некоторых людей с NAFLD может развиться неалкогольный стеатогепатит (NASH), агрессивная форма жировой болезни печени, которая характеризуется воспалением печени и может прогрессировать до выраженного рубцевания (цирроза) и печеночной недостаточности. Этот ущерб подобен ущербу, вызванному употреблением алкоголя в больших количествах.
Первичный билиарный холангит представляет собой хроническое аутоиммунное заболевание, при котором медленно разрушаются желчные протоки в печени. Когда желчные протоки повреждены, желчь может застаиваться в печени, что иногда приводит к необратимому циррозу печени. Комбинация генетических и экологических факторов вызывает заболевание.
IBD описывает расстройства, которые включают хроническое воспаление пищеварительного тракта. Типы IBD включают язвенный колит, который включает язвы вдоль поверхностной оболочки толстой и прямой кишки, а также болезнь Крона, которая характеризуется воспалением слизистой оболочки пищеварительного тракта, которое часто может поражать более глубокие слои пищеварительного тракта. И язвенный колит, и болезнь Крона обычно характеризуются диареей, ректальным кровотечением, болями в животе, утомляемостью, потерей веса и иногда приводят к опасным для жизни осложнениям.
Новообразования и связанные с раком расстройства могут включать, например, без каких-либо ограничений, рак поджелудочной железы: в основном фиброзная, почечно-клеточная карцинома, радиационно-индуцированный фиброз, первичный миелофиброз, десмоплазия, фибросаркома, гепатоцеллюлярная карцинома, ретинобластома, внутриглазная лимфома и меланома (десмопластическая, конъюнктивальная, увеальная).
Изобретение также относится к лечению, предупреждению и уменьшению вирусных инфекций посредством связывания с сайтами связывания гепарансульфата вирусных белков. Соединения по изобретению взаимодействуют с областью связывания гепарансульфата факторов роста (FGF, VEGF и других факторов роста) и рецепторов факторов роста (FGFR, VEGFR и других). Известно, что многие вирусы взаимодействуют с клетками млекопитающих, используя их сродство к фрагментам гепарансульфата, связанным с клеточными мембранами. Вирусы, несущие на своей поверхности белки, связывающие гепарансульфат (HS), используют это сродство к HS в качестве одной из главных входных дверей, чтобы приблизиться к клеткам и заразить их, а также связываться с гепарансульфатом, прикрепленным к клеткам. Прикрепляясь к HS, вирусы способны инфицировать клетки, используя различные механизмы вторжения, специфичные для каждого вируса. Сильное взаимодействие соединений по изобретению с гепаран-связывающим доменом белков и, в частности, вирусных белков, предотвращает вирусную инфекцию клеток крови, эндотелиальных клеток, выстилающих кровеносные сосуды и органы, а также поверхностных эпителиальных клеток, присутствующих во рту, слизистой оболочке носа и легких, а также в желудочно-кишечном тракте. Известно несколько видов вирусов с высоким сродством к гепарансульфатам, таких как, но не ограничиваясь ими, респираторно-синцитиальный вирус, метапневмовирус человека, грипп (H1N1 и т.п.), риновирус человека (HRV), риносинцитиальный вирус (RV), вирус чикунгунья, коронавирус, такой как CoV, SARS-CoV, MERS-Cov, COVID-19 (SARS-CoV-2 и их варианты). HS является необходимым кофактором для инфекции SARS-CoV-2. HS взаимодействует с рецептор-связывающим доменом гликопротеина шипа SARSCoV-2, прилегающим к ACE2, сдвигая структуру шипа в открытую конформацию, чтобы облегчить связывание ACE2. Вирусные и бактериальные инфекционные заболевания могут также включать септический шок, воспаление глаз, такое как эндофтальмит, вызванный операцией или инфекцией.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Синтез соединений и промежуточных соединений
Пример 1.1: Молекулы типа 1a: Моноамиды, 25 примеров
СИНТЕЗ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ
Схема 1. Синтетические промежуточные соединения KI-1 и KI-6
Способы :
Синтез KI-1 и KI-6 (стадии [1],[2])
Диэтил 2,5-бис(бензилокси)терефталат (KI-0) (стадия [1]). В перемешиваемый раствор диэтил 2,5-дигидрокситерефталата (200,0 г, 0,79 моль) в ДМФ (800,0 мл) при температуре окружающей среды в течение 15 мин по частям добавляли карбонат калия-325 меш (326,1 г, 2,4 моль). Затем в реакционный сосуд по каплям в течение 30 мин добавляли бензилбромид (280,0 мл, 2,4 моль) и полученную смесь нагревали при температуре 100°C в течение 2 ч, что приводило к образованию густого осадка кремового цвета. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и обрабатывали насыщенным водным раствором хлорида аммония (2 л). Полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин, затем фильтровали. Твердое вещество промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония (2×200 мл). Твердый продукт затем суспендировали в этаноле (400 мл), фильтровали и сушили в вакуумной печи с получением желаемого продукта в виде твердого вещества белого цвета (341,0 г, 0,785 моль, 99,8%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,36 мин, ионизация не наблюдалась, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,51-7,44 (м, 6H), 7,44-7,36 (м, 4H), 7,36-7,28 (м, 2H), 5,17 (с, 4H), 4,29 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 1,26 (т, J=7,1 Гц, 6H).
2,5-Бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)бензойная кислота (KI-1) и 2,5-бис(бензилокси)терефталевая кислота (KI-6); (стадия [2])
К раствору диэтил 2,5-бис(бензилокси)терефталата (100 г, 0,23 моль) в 1,4-диоксане (1 л) быстро добавляли раствор гидроксида калия (14,2 г, 0,25 моль) в воде (200,0 мл) и полученную смесь перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды. Растворитель удаляли в вакууме с получением в результате взвеси белого цвета. Сырой продукт суспендировали в EtOH (500 мл) и фильтровали, и собранный твердый продукт сушили в вакуумной печи с получением сырого диэтил 2,5-бис(бензилокси)терефталата (23,0 г, 0,053 моль, 23%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,36 мин, ионизация не наблюдалась, площадь пика 98%.
Этанольный фильтрат концентрировали с получением масла. Добавляли этилацетат (500 мл), образовывался осадок, который фильтровали и промывали этилацетатом (200 мл) с получением 2,5-бис(бензилокси)терефталевой кислоты (KI-6) в виде твердого вещества белого цвета (18,9 г, 0,042 моль, 18%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,22 мин, m/z 377,1 [M-H]-, площадь пика 95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,52-7,45 (м, 4H), 7,41-7,33 (м, 4H), 7,33-7,26 (м, 4H), 5,13 (с, 4H).
Фильтрат промывали насыщенным водным раствором карбоната натрия (200 мл), 1М соляной кислотой (500 мл) и насыщенным солевым раствором (500 мл), затем сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали досуха с получением 2,5-бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)бензойной кислоты (KI-1) в виде твердого вещества белого цвета (53 г, 0,130 моль, 57,0%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,22 мин, m/z 405,3 [M-H]-, площадь пика 96%
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,52-7,27 (м, 13H), 5,17 (с, 4H), 4,28 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,26 (т, J=7,1 Гц, 3H).
ПРОТОКОЛ МАСШТАБНОГО СИНТЕЗА KI-1
В 10-литровый сосуд с рубашкой загружали диэтил 2,5-бис(бензилокси)терефталат (500,00 г, 1,15 моль), 1,4-диоксан (2,5 л), гидроксид калия (71,00 г, 1,26 моль) и воду (500 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Анализ ЖХ-МС показал, что реакция прошла наполовину, демонстрируя также побочный продукт (дикислота) и исходный продукт (сложный диэфир) в соотношении (диэфир:монокислота:дикислота=28:58:14) (дикислота: 4,44 rt, монокислота: 5,08 rt, сложный диэфир: 5,68 rt). На этой стадии растворитель удаляли в вакууме. Неочищенный продукт помещали в смесь 2:1 этанола и воды (3 л) в 10-литровом сосуде с рубашкой, перемешивали в течение ночи и фильтровали с получением:
твердого вещества: (сложный диэфир:моно-кислота:дикислота=86: 12:2, 110,00 г, бесцветное твердое вещество),
фильтратов: (сложный диэфир:монокислота:дикислота 3:63:34).
Фильтраты концентрировали в вакууме, чтобы получить масло. Это масло помещали в этилацетат (2,5 л), перемешивали в течение ночи в 10 л сосуде с рубашкой и фильтровали с получением твердого вещества белого цвета (150,00 г). Твердое вещество: (сложный диэфир:монокислота:дикислота=следы: 40:60).
Фильтраты собирали, промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (100 мл), 1н раствором соляной кислоты (200 мл) и насыщенным солевым раствором (200 мл), сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением желаемого продукта, 2,5-бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)бензойной кислоты (KI-1), в виде твердого вещества белого цвета, которое сушили в вакуумной печи при температуре 50°C в течение 48ч (225,00 г, 49%-ный выход) (выход варьируется в диапазоне 49-65%).
Схема 2: Синтетическое промежуточное соединение KI-1Bn
Способ :
Синтез KI-1Bn :
2,5-Бис(бензилокси)-4-(бензилоксикарбонил)бензойная кислота (KI-1Bn). К раствору 2,5-дигидрокситерефталевой кислоты (1,97 г, 10 ммоль) в ДМФ (20 мл) при перемешивании при температуре 0°C добавляли гидрид натрия (2,0 г, 50 ммоль), затем по каплям в течение 5 мин бензилбромид (5,95 мл, 50 ммоль, 5 экв.), и полученную смесь выдерживали при комнатной температуре, в течение 2 ч. Смесь затем нагревали при температуре 60°C в течение 18 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и осторожно обрабатывали MeOH (5 мл). Смесь концентрировали при пониженном давлении, и оставшееся вещество упаривали совместно с гептаном (3×). Остаток помещали в DCM (30 мл), органическую фазу промывали 1M HCl (25 мл), выделенный водный слой экстрагировали DCM (3×30 мл) и объединенные органические фазы сушили (MgSO4) и концентрировали. Сырой твердый продукт перекристаллизовывали из EtOH (~30 мл) с получением сырого KI-0Bn (2,286g, 41%). Образец KI-0Bn (282 мг, 0,5 ммоль) добавляли к смеси 1,4-диоксана (10 мл) и гидрат гидроксида лития (22 мг, 0,52 ммоль) и смесь нагревали при температуре 80°C в течение 3 дней. Смесь охлаждали до комнатной температуры, помещали в AcOEt (30 мл) и раствор промывали 1M HCl (2 мл). Органическую фазу сушили и концентрировали и остаток подвергали колоночной хроматографии с получением сложного моноэфира KI-1Bn, загрязненного около 16% сложного диэфира KI-0Bn.
KI-0Bn: 1H ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 7,51 (с, 2H), 7,36-7,30 (м, 20H), 5,34 (с, 4H), 5,11 (с, 4H).
KI-1Bn: 1H ЯМР (250 МГц, CDCl3): δ 7,86 (с, 1H), 7,61 (с, 1H), 7,41-7,30 (м, 20H), 5,36 (с, 2H), 5,26 (с, 2H), 5,16 (с, 2H).
СИНТЕЗ МОНОАМИДОВ
Схема 3. Синтез моноамидов Ia
Общий способ A амидного связывания [3A]
Связывание посредством ацилхлорида, исходя из KI-1 или KI-6
Модельная реакция (Ia-013a)
Диметил 2-(2,5-бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)-бензоиламино)изофталат . 2,5-Бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)-бензойную кислоту (KI-1, 1,1 г, 2,8 ммоль) растворяли в тионилхлориде (6 мл) и полученную смесь перемешивали в течение 5 мин. Добавляли несколько капель ДМФ и полученную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 18 ч. Избыток тионилхлорида удаляли в вакууме и остаток перегоняли вместе с толуолом (3×20 мл) с получением ацилхлорида. К раствору амина (диметил 2-аминоизофталат, 210 мг, 3,1 ммоль) и N, N-диизопропилэтиламина (0,53 мл, 3,045 ммоль) в DCM (10 мл) при температуре окружающей среды быстро добавляли раствор ацилхлорида в DCM (10 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавляли DCM (70 мл) и промывали 1 M соляной кислотой (100 мл), водой (100 мл), сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали с получением сырого продукта, который очищали хроматографией на силикагеле, элюируя градиентом этилацетат (от 0 до 25%) в изогексане до желаемого продукта в виде твердого вещества белого цвета (1,24 г, 2,075 ммоль, 75%). СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,37 мин; m/z=598,2 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,60 (с, 1H), 8,02 (д, J=7,8 Гц, 2H), 7,69 (с, 1H), 7,59-7,23 (м, 12H), 5,49 (с, 2H), 5,19 (с, 2H), 4,28 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 3,71 (с, 6H), 1,26 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Общий способ B амидного связывания [3B]
Связывание с использованием конденсирующего агента исходя из KI-1 или KI-6
Модельная реакция (Ia-001a)
Метил 2-(2,5-бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)-бензоиламино)бензоат . К смеси 2,5-бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)бензойной кислоты (KI-1, 12,95 г, 32 ммоль) и метил антранилата (5,729 г, 38 ммоль, 1,190 экв.) в MeCN (150 мл) при температуре окружающей среды добавляли 1-метилимидазол (13,0 мл, 163 ммоль). В течение 30 мин по частям добавляли гексафторфосфат хлор-N, N,Nʼ,Nʼ-тетраметилформамидиния (TCFH) (10,728 г, 0,038 моль) и полученную смесь перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды. Реакционную смесь обрабатывали 1М соляной кислотой (700 мл). Полученную суспензию перемешивали в течение 10 мин, затем фильтровали. Твердое вещество промывали водой (2×200 мл). Твердый продукт затем суспендировали в этаноле (200 мл), фильтровали, промывали эфиром (100 мл) и сушили в вакуумной печи с получением желаемого продукта в виде твердого вещества белого цвета (14,7 г, 27 ммоль, 86%) СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,43 мин; m/z=540,2 [M+H]+, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,87 (с, 1H), 8,65 (д, J=8,4 Гц, 1H), 7,98 (дд, J=8,0, 1,7 Гц, 1H), 7,81-7,61 (м, 2H), 7,59-7,12 (м, 12H), 5,41 (с, 2H), 5,20 (с, 2H), 4,28 (кв, J =7,1 Гц, 2H), 3,74 (с, 3H), 1,27 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Общие способы удаления защитных групп [4], [5]
Омыление
Модельная реакция (Ia-013a)
2-(2,5-Бис(бензилокси)-4-карбоксибензоиламино)изофталевая кислота . Раствор гидроксида лития (42 мг, 1 ммоль) в воде (4 мл) добавляли к раствору диметил 2-(2,5-бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)бензоиламино)изофталата (100 мг, 0,167 ммоль) в ТГФ (6 мл) и полученную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 18 ч. В реакционную смесь добавляли дополнительное количество LiOH (6 экв.) в воде (4 мл) и перемешивали в течение дополнительных 23 ч. После завершения реакции в реакционную смесь добавляли воду (50 мл) и смесь промывали этилацетатом (50 мл). Водный слой подкисляли 1М соляной кислотой до pH=2 и экстрагировали этилацетатом (2×50 мл). Органические слои собирали, сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета (82 мг, 0,151 ммоль, 91%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,02 мин; m/z=542,1 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,18 (с, 2H), 11,74 (с, 1H), 8,00 (д, J=7,8 Гц, 2H), 7,71 (с, 1H), 7,58-7,43 (м, 5H), 7,40-7,24 (м, 7H), 5,47 (с, 2H), 5,14 (с, 2H).
Дебензилирование
Модельная реакция (Ia-013a)
2-(2,5-Дигидрокси-4-карбоксибензоиламино)изофталевая кислота (Ia-013a). К раствору 2-(2,5-бис(бензилокси)-4-карбоксибензоиламино)изофталевой кислоты (0,94 г, 1,74 ммоль) в смеси 10:30 EtOH и DCM добавляли Pd/C (94 мг, 10%). Смесь помещали в водород при атмосферном давлении при температуре окружающей среды и перемешивали в течение 18 ч. После завершения реакции смесь фильтровали через целит и промывали DCM и MeOH. Фильтрат и промывки объединяли и концентрировали при пониженном давлении с получением желаемого продукта Ia-013a в виде твердого вещества желтого цвета (644 мг, 1,69 ммоль, 98%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,91 мин; m/z =362,0 [M+H]+, площадь пика >98%
1H ЯМР (ДМСО-d 6) δ: 13,11 (с, 2H), 11,70 (с, 1H), 11,13 (с, 1H), 7,97 (д, J=7,8 Гц, 2H), 7,47 (с, 1H), 7,41 (с, 1H), 7,38 (т, J=7,7 Гц, 1H).
Схема 4a. Синтез моноамидов Ia исходя из KI-1Bn
Общий способ исходя из KI-1Bn
Связывание посредством ацилхлорида
Модельная реакция: синтез Ia-032a
Бензил 4-(2,5-бис(бензилокси)-4-(бензилоксикарбонил)бензоиламино)фенилацетат . К раствору KI-1Bn (233 мг, 84%-ная чистота) в DCM (10 мл) добавляли SOCl2 (1,8 мл, 60 экв.) и смесь нагревали при температуре 50°C в течение 3 ч. Растворители упаривали и остаток упаривали совместно с толуолом (3×10 мл) с получением сырого продукта ацилхлорида (237 мг, 99%). Это вещество растворяли в DCM (3 мл) и добавляли диизопропилэтиламин (0,08 мл, 1,15 экв.), затем раствор бензил 4-аминофенилацетата (92 мг, 0,95 экв.) в DCM (3 мл). Окончательный объем реакционной смеси был 10 мл. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Смесь разбавляли DCM (15 мл), промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония (12 мл). Отделенную водную фазу экстрагировали DCM (2×2 мл), органические фазы объединяли, сушили (MgSO4) и концентрировали. Сырой продукт подвергали колоночной хроматографии (петр. эфир/DCM 1:1, затем градиент до 100% DCM) с получением первой фракции чистого KI-0Bn и второй фракции, содержащей чистый желаемый продукт (237 мг, 86%, с поправкой на чистоту KI-1Bn).
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 10,10 (с, 1H), 8,08 (с, 1H), 7,65 (с, 1H), 7,53-7,30 (м, 20H), 7,22-7,13 (шир. AB, 4H), 5,39, 5,22, 5,21, 5,12 (4с, 4×2H), 3,61 (с, 2H).
4-(4-(Карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота (Ia-032a). К раствору предшественника, полученного выше (225 мг, 0,33 ммоль), в DCM (20 мл) добавляли 5% Pd на угле (72 мг), затем EtOH (20 мл). Колбу заполняли Ar (3×) затем наполняли водородом (атмосферное давление) и смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Катализатор удаляли путем фильтрования через миллипоровый фильтр, фильтрат упаривали и остаток сушили с получением продукта Ia-032a в виде твердого вещества светло-желтого цвета (107 мг, 99%).
1H ЯМР (250 МГц, ДМСО-d6): δ 12,28 (шир., 1H), 10,92 (с, 1H), 10,44 (с, 1H), 7,65 (шир. д, 2H), 7,41 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 7,25 (шир. д, 2H), 3,55 (с, 2H).
Например:
Относительно условий и выходов: см. фигуры 4A-D
1) 4-(2-Карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение Ia-001a
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,95 мин, m/z=316 [M-H]-, площадь пика >97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 12,22 (с, 1H), 10,85 (с, 1H), 8,65 (д, J=8,4 Гц, 1H), 8,01 (дд, J=8,0, 1,7 Гц, 1H), 7,71-7,56 (м, 1H), 7,41 (д, J=6,9 Гц, 2H), 7,22 (т, J=7,6 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12NO7: 318,06083, найдено: 318,06080.
Биологические данные: Ia-001a: FGF-1 IC50 [мкМ]=41; FGF-2 IC50 [мкМ]=39; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=7,3;
Ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=2,25; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=48;
PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,355; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=44,3; цельная кровь:
GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=30,5; IL-1β IC50 [мкМ]=34,4; IL-2 IC50 [мкМ]=94,3; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=1,24; IL-9 IC50 [мкМ]=5,63; IL-10 IC50 [мкМ]=>100; IL-12p70 IC50 [мкМ]=1,5; IL-13 IC50 [мкМ]=26,4; IL-17A IC50 [мкМ]=0,1; IL-17F IC50 [мкМ]=14,7; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=>100; IL-33 IC50 [мкМ]=19,3; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,02; TNFβ IC50 [мкМ]=13,2.
Сложный диэтиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,39 мин, m/z=372,2 [M-H]-, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,96 (с, 1H), 11,05 (с, 1H), 9,87 (с, 1H), 8,57 (дд, J=8,5, 1,2 Гц, 1H), 7,99 (дд, J=7,9, 1,7 Гц, 1H), 7,65 (ддд, J=8,7, 7,3, 1,7 Гц, 1H), 7,49 (с, 1H), 7,40 (с, 1H), 7,25 (тд, J=7,6, 1,2 Гц, 1H), 4,35 (м, 4H), 1,33 (м, 6H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C19H20NO7: 374,12342, найдено: 374,12354.
Биологические данные: Ia-001a-E2: FGF-1 IC50 [мкМ]=9,2; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=123; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=1,25; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=51,47; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=2,58; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=50,5.
2) 4-(2-(1H-Тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-001aTz:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,17 мин; m/z =342,0 [M+H]+, площадь пика >96%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,60 (с, 1H), 10,90 (с, 2H), 8,47 (д, J=8,4 Гц, 1H), 7,93 (д, J=7,9 Гц, 1H), 7,61 (т, J=7,9 Гц, 1H), 7,50-7,32 (м, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12N5O5: 342,08329, найдено: 342,08318.
Биологические данные: Ia-001a-Tz: FGF-1 IC50 [мкМ]=6,2; FGF-2 IC50 [мкМ]=20; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=17; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,23; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=54,33; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,54; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=69,75; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=>100; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=7,99; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,75; IL-9 IC50 [мкМ]=8,63; IL-10 IC50 [мкМ]=26,1; IL-12p70 IC50 [мкМ]=32,4; IL-13 IC50 [мкМ]=32,1; IL-17A IC50 [мкМ]=0,11; IL-17F IC50 [мкМ]=46,5; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=>100; IL-33 IC50 [мкМ]=23,6; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,63; TNFβ IC50 [мкМ]=53.
Сложный этиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,08 мин, m/z=370,1 [M+H]+, площадь пика >97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,48 (с, 1H), 9,88 (с, 1H), 8,46 (д, J=8,4 Гц, 1H), 7,89 (дд, J=7,8, 1,6 Гц, 1H), 7,62 (ддд, J=8,6, 7,4, 1,6 Гц, 1H), 7,47 (с, 1H), 7,42-7,34 (м, 2H), 4,37 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,34 (т, J=7,1 Гц, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C17H16N5O5: 370,11460, найдено: 370,11458.
Биологические данные: Ia-001a-Tz-El: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=3,8; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=75,97; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=98,88.
Сложный этиловый эфир диацетат:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,57 мин, m/z=454,1 [M+H]+, площадь пика >97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,23 (с, 1H), 8,23 (д, J=8,6 Гц, 1H), 7,96 (дд, J=7,9, 1,7 Гц, 1H), 7,84 (с, 1H), 7,73 (с, 1H), 7,64 (т, J=7,5 Гц, 1H), 7,43 (тд, J=7,6, 1,2 Гц, 1H), 4,32 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 2,34 (с, 3H), 2,18 (с, 3H), 1,32 (т, J=7,1 Гц, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C21H20N5O7: 454,13572, найдено: 454,13542.
Биологические данные: Ia-001a-Tz-El-A2: FGF-1 IC50 [мкМ]=60; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=49,85; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=98,2.
3) 2,5-Дигидрокси-4-(2-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота, соединение Ia-001c:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,73 мин; m/z =352,0 [M-H]-, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,54 (с, 1H), 10,99 (с, 1H), 8,34 (д, J=8,2 Гц, 1H), 7,74 (дд, J=7,7, 1,7 Гц, 1H), 7,42-7,28 (м, 3H), 7,12 (тд, J=7,5, 1,2 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C14H12NO8S: 354,02781, найдено: 354,02754.
Биологические данные: Ia-001c: FGF-1 IC50 [мкМ]=21; FGF-2 IC50 [мкМ]=13; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=100; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=3,31; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=40,36; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=2,4; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=31,33; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=0,44; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=12,8; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,95; IL-9 IC50 [мкМ]=46,9; IL-10 IC50 [мкМ]=1,9; IL-12p70 IC50 [мкМ]=0,44; IL-13 IC50 [мкМ]=86,1; IL-17A IC50 [мкМ]=0,09; IL-17F IC50 [мкМ]=89,7; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=>100; IL-33 IC50 [мкМ]=>100; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,05; TNFβ IC50 [мкМ]=29,7.
4) 4-(3-Карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение Ia-002a:
1H-ЯМР (250 МГЦ, ДМСО-d6) δ ~13 (очень шир., 1H), 10,82 (шир. с, 1H), 10,60 (шир. с, 1H), 8,38 (с, 1H), 7,92 (д, 1H), 7,71 (д, 1H), 7,49 (т, 1H), 7,39 (с, 2H).
Биологические данные: Ia-002a: FGF-1 IC50 [мкМ]=20; FGF-2 IC50 [мкМ]=59; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=71; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=5,7; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=42,1; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,312; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=27,92.
5) 4-(3-(1H-Тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-002aTz:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,13 мин; m/z =342,0 [M+H]+, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,81 (с, 1H), 10,67 (с, 1H), 8,54 (с, 1H), 7,91-7,84 (м, 1H), 7,79 (дт, J=7,8, 1,4 Гц, 1H), 7,60 (т, J=7,9 Гц, 1H), 7,41 (д, J=2,2 Гц, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12N5O5: 342,08329, найдено: 342,08317.
Биологические данные: Ia-002a-Tz: FGF-1 IC50 [мкМ]=10; FGF-2 IC50 [мкМ]=53; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=57; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=66,61; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,86; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=38,5.
6) 2,5-Дигидрокси-4-(3-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота, соединение Ia-002c:
1H-ЯМР (250 МГЦ, ДМСО-d6) δ 11,04 (с, 1H), 10,53 (с, 1H), 7,96 (с, 1H), 7,69 (д, 1H), 7,43 (с, 2H) и 7,40-7,28 (м, 2H).
Биологические данные: Ia-002c: FGF-1 IC50 [мкМ]=14; FGF-2 IC50 [мкМ]=150; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=150; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=38,9; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,405; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=1,87.
7) 4-(4-Карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение Ia-003a:
1H-ЯМР (250 МГц, ДМСО-d6) δ 12,8 (шир., 1H), 10,73 (с, 1H), 10,68 (с, 1H), 7,94 (д для AB, 2H), 7,84 (д для AB, 2H), 7,39 (с, 1H), 7,34 (с, 1H).
МСВР (AX033)
Биологические данные: Ia-003a: FGF-1 IC50 [мкМ]=12; FGF-2 IC50 [мкМ]=34; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=150; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=44,4; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,414; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=39,1.
8) 4-(4-(1H-Тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-003aTz:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,79 мин; m/z =342,0 [M+H]+, площадь пика >97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,77 (с, 1H), 10,70 (с, 1H), 8,04 (д, J=8,7 Гц, 2H), 7,96 (д, J=8,5 Гц, 2H), 7,41 (с, 1H), 7,37 (с, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12N5O5: 342,08329, найдено: 342,08326.
Биологические данные: Ia-003a-Tz: FGF-1 IC50 [мкМ]=6,7; FGF-2 IC50 [мкМ]=45; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=13; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=6,4; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=62,21; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=2,49; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=30,33; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=2,95; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=43; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=1,41; IL-9 IC50 [мкМ]=3,62; IL-10 IC50 [мкМ]=6,94; IL-12p70 IC50 [мкМ]=1,26; IL-13 IC50 [мкМ]=89,6; IL-17A IC50 [мкМ]=0,07; IL-17F IC50 [мкМ]=83,9; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=1,49; IL-33 IC50 [мкМ]=72,2; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,18; TNFβ IC50 [мкМ]=55.
9) 2,5-Дигидрокси-4-(4-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота, соединение Ia-003c:
1H-ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,90 (с, 1H), 10,51 (с, 1H), 7,66 (д для AB, 2H), 7,58 (д для AB, 2H), 7,40 (с, 1H), 7,39 (с, 1H).
Биологические данные: Ia-003c: FGF-1 IC50 [мкМ]=35; FGF-2 IC50 [мкМ]=150; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=150; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,4; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=N.D.; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]-; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=N.D.
10) 4-(3-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-004a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 6,5 мин): rt=1,40 мин; m/z =332,0 [M-H]-, площадь пика >96%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,94 (с, 1H), 10,37 (с, 1H), 8,20 (д, J=2,7 Гц, 1H), 7,74 (дд, J=8,9, 2,8 Гц, 1H), 7,39 (с, 1H), 7,34 (с, 1H), 6,93 (д, J=8,9 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12NO8: 334,05574, найдено: 334,05572.
Биологические данные: Ia-004a: FGF-1 IC50 [мкМ]=32; FGF-2 IC50 [мкМ]=15; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=28; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=7,7; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=64,61; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=28,38.
Сложный этиловый метиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,16 мин, m/z=376,1 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,90 (с, 1H), 10,50 (с, 1H), 10,36 (с, 1H), 9,91 (с, 1H), 8,26 (д, J=2,7 Гц, 1H), 7,76 (дд, J=8,9, 2,8 Гц, 1H), 7,43 (с, 1H), 7,36 (с, 1H), 7,01 (д, J=8,9 Гц, 1H), 4,37 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 3,91 (с, 3H), 1,34 (т, J=7,1 Гц, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C18H18NO8: 376,10269, найдено: 376,10259.
Биологические данные: Ia-004a-E2: FGF-1 IC50 [мкМ]=35; FGF-2 IC50 [мкМ]=36; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=6,1; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=85,34; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=97,65
11) 4-(2-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-006a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,81 мин; m/z =334,0 [M+H]+, площадь пика >96%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,33 (с, 1H), 11,86 (с, 1H), 10,90 (с, 1H), 9,66 (с, 1H), 8,39 (д, J=9,0 Гц, 1H), 7,40 (д, J=6,8 Гц, 2H), 7,03 (дд, J=9,0, 3,0 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12NO8: 334,05574, найдено: 334,05562.
Биологические данные: Ia-006a: FGF-1 IC50 [мкМ]=89; FGF-2 IC50 [мкМ]=224; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=100; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=11,8; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=60,56; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,2; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=25,33.
12) 3-(4-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота, соединение Ia-011a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,69 мин; m/z=360,1 [M-H]-, площадь пика >89%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,46 (с, 2H), 11,37 (с, 1H), 10,97 (с, 1H), 8,33 (дд, J=8,2, 1,3 Гц, 1H), 7,63 (дд, J=7,7, 1,3 Гц, 1H), 7,57 (т, J=7,9 Гц, 1H), 7,52 (с, 1H), 7,44 (с, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H12NO9: 362,05065, найдено: 362,05036.
Биологические данные: Ia-011a: FGF-1 IC50 [мкМ]=35; FGF-2 IC50 [мкМ]=110; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=57,71; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=42,32.
13) 2-(4-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)терефталевая кислота, соединение Ia-012a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,12 мин; m/z=362,1 [M+H]+, площадь пика >96%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,41 (шир. с, 2H), 12,29 (с, 1H), 10,94 (с, 1H), 9,26 (д, J=1,7 Гц, 1H), 8,09 (д, J=8,2 Гц, 1H), 7,73 (дд, J=8,2, 1,7 Гц, 1H), 7,42 (с, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H12NO9: 362,05065, найдено: 362,05046.
Биологические данные: Ia-012a: FGF-1 IC50 [мкМ]=38; FGF-2 IC50 [мкМ]=36; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=30; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=59,52; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,85; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=28,5.
14) 2-(4-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота, соединение Ia-013a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,91 мин; m/z=362,0 [M+H]+, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,11 (с, 2H), 11,70 (с, 1H), 11,13 (с, 1H), 7,97 (д, J=7,8 Гц, 2H), 7,47 (с, 1H), 7,41 (с, 1H), 7,38 (т, J=7,7 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H12NO9: 362,05065, найдено: 362,05041.
Биологические данные: Ia-013a: FGF-1 IC50 [мкМ]=29; FGF-2 IC50 [мкМ]=18; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=17; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=38,52; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=2,38; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=27,67.
15) 4-(4-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота, соединение Ia-014a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,98 мин; m/z=362,1 [M+H]+, площадь пика >94%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,76 (с, 1H), 10,70 (с, 1H), 8,14 (с, 1H), 7,94-7,84 (м, 2H), 7,38 (с, 1H), 7,30 (с, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H12NO9: 362,05065, найдено: 362,05047.
Биологические данные: Ia-014a: FGF-1 IC50 [мкМ]=20; FGF-2 IC50 [мкМ]=20; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=88;
ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=61,3;
PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=9,667.
16) 5-(4-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота, соединение Ia-015a:
1H ЯМР (250 МГц, ДМСО-d6) δ 10,74 (с, 1H), 8,56 (узкий д, 2H), 8,22 (узкий т, 1H), 7,41 (с, 1H) и 7,37 (с, 1H).
Биологические данные: Ia-015a: FGF-1 IC50 [мкМ]=20; FGF-2 IC50 [мкМ]=9,3; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=19; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,15; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=43,8; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,387; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=17,38; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=2,76; IFNγ IC50 [мкМ]=>100; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=7,08; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,77; IL-9 IC50 [мкМ]=1,47; IL-10 IC50 [мкМ]=5,27; IL-12p70 IC50 [мкМ]=0,12; IL-13 IC50 [мкМ]=0,15; IL-17A IC50 [мкМ]=0,05; IL-17F IC50 [мкМ]=0,15; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=57,2; IL-33 IC50 [мкМ]=0,24; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,17; TNFβ IC50 [мкМ]=0,3.
17) 3-(4-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотиновая кислота, соединение Ia-023a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,63 мин; m/z=319,1 [M+H]+, площадь пика >93%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 12,17 (с, 1H), 11,03 (с, 1H), 9,78 (с, 1H), 8,46 (д, J=5,0 Гц, 1H), 7,82 (д, J=5,0 Гц, 1H), 7,45 (с, 1H), 7,43 (с, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C14H11N2O7: 319,05608, найдено: 319,05610.
Биологические данные: Ia-023a: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=63; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=143; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=61,95; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=13,37.
Сложный диэтиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,87 мин, m/z=375,1 [M+H]+, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,79 (с, 1H), 11,23 (с, 1H), 9,87 (с, 1H), 9,68 (с, 1H), 8,50 (д, J=5,0 Гц, 1H), 7,81 (дд, J=5,1, 0,7 Гц, 1H), 7,53 (с, 1H), 7,41 (с, 1H), 4,46-4,27 (м, 4H), 1,41-1,25 (м, 6H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C18H19N2O7: 375,11867, найдено: 375,11867.
Биологические данные: Ia-023a-E2: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=76; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=141; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=6,6; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=69,47; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=34.
18) 4-(4-(Карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-032a:
1H ЯМР (250 МГц, ДМСО-d6): δ 12,28 (шир., 1H), 10,92 (с, 1H), 10,44 (с, 1H), 7,65 (шир. д, 2H), 7,41 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 7,25 (шир. д, 2H), 3,55 (с, 2H).
Биологические данные: Ia-032a: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=91; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=N.D.; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]-; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=N.D.
19) 4-(3-(Карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-033a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 6,5 мин): rt=1,71 мин; m/z=332,1 [M+H]+, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,89 (с, 1H), 10,46 (с, 1H), 7,65 (с, 1H), 7,59 (д, J=8,1 Гц, 1H), 7,40 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 7,03 (д, J=7,6 Гц, 1H), 3,57 (с, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H14NO7: 332,07647, найдено: 332,07644.
Биологические данные: Ia-033a: FGF-1 IC50 [мкМ]=60; FGF-2 IC50 [мкМ]=165; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=281; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=57,73; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,32; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=38.
20) 4-(2-(Карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-034a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,82 мин; m/z=332,1 [M+H]+, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,78 (д, J=8,1 Гц, 1H), 7,31 (д, J=3,0 Гц, 2H), 7,28 (д, J=7,6 Гц, 2H), 7,15 (т, J=7,4 Гц, 1H), 3,63 (с, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H14NO7: 332,07648, найдено: 332,07641.
Биологические данные: Ia-034a: FGF-1 IC50 [мкМ]=79; FGF-2 IC50 [мкМ]=14; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=102; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=49,07; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=2,28; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=15.
21) 4-(3,4-Дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-035a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,02 мин; m/z=320,1 [M+H]+, площадь пика >91%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,56 (с, 1H), 9,21 (т, J=5,9 Гц, 1H), 8,91 (с, 1H), 8,79 (с, 1H), 7,46 (с, 1H), 7,28 (с, 1H), 6,72 (д, J=2,1 Гц, 1H), 6,67 (д, J=8,0 Гц, 1H), 6,57 (дд, J=8,0, 2,1 Гц, 1H), 4,32 (д, J=5,8 Гц, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H14NO7: 320,07648, найдено: 320,07650.
Биологические данные: Ia-035a: FGF-1 IC50 [мкМ]=20; FGF-2 IC50 [мкМ]=71; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=36; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=75,13; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,41; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=27.
22) 4-(2-(3,4-Дигидроксифенил)этиламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia- 035a-2:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,77 мин; m/z=332,0 [M-H]-, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,50 (с, 1H), 8,85 (т, J=5,6 Гц, 1H), 8,76 (с, 1H), 8,66 (с, 1H), 7,41 (с, 1H), 7,28 (с, 1H), 6,67-6,60 (м, 2H), 6,48 (дд, J=8,0, 2,1 Гц, 1H), 3,44 (кв, J=6,8 Гц, 2H), 2,67 (дд, J=8,6, 6,0 Гц, 2H), 11,56 (с, 1H), 9,21 (т, J=5,9 Гц, 1H), 8,91 (с, 1H), 8,79 (с, 1H), 7,46 (с, 1H), 7,28 (с, 1H), 6,72 (д, J=2,1 Гц, 1H), 6,67 (д, J=8,0 Гц, 1H), 6,57 (дд, J=8,0, 2,1 Гц, 1H), 4,32 (д, J=5,8 Гц, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H16NO7: 334,09213, найдено: 334,09242.
Биологические данные: Ia-035a-2: FGF-1 IC50 [мкМ]=10; FGF-2 IC50 [мкМ]=65; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=109; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=10; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=58,81; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,1; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=21,5.
23) 4-(1-Карбокси-2-(3,4-дигидроксифенил)этиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение Ia-035a-3:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,70 мин; m/z=376,0 [M-H]-, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 12,90 (с, 1H), 11,11 (с, 1H), 8,98 (д, J=7,4 Гц, 1H), 8,73 (д, J=13,1 Гц, 2H), 7,45 (с, 1H), 7,31 (с, 1H), 6,61 (дд, J=5,1, 2,9 Гц, 2H), 6,47 (дд, J=8,1, 2,1 Гц, 1H), 3,01 (дд, J=13,9, 4,9 Гц, 1H), 2,96-2,84 (м, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C17H16NO9: 378,08196, найдено: 378,08195.
Биологические данные: Ia-035a-3: FGF-1 IC50 [мкМ]=34; FGF-2 IC50 [мкМ]=207; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=198; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=10; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=79,62; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,66; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=22.
24) 4-(Карбокси(3,4-дигидроксифенил)метиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение Ia-036a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,62 мин; m/z=362,1 [M-H]-, площадь пика >92%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,00 (с, 1H), 9,32 (д, J=6,7 Гц, 1H), 9,05 (с, 1H), 8,97 (с, 1H), 7,40 (с, 1H), 7,34 (с, 1H), 6,81 (д, J=2,1 Гц, 1H), 6,75-6,64 (м, 2H), 5,29 (д, J=6,6 Гц, 1H). МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H14NO9: 364,06630, найдено: 364,06615.
Биологические данные: Ia-036a: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=37; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=123; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=1,6; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=87,17; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=30,77.
25) 4-(2-Карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение Ia-053a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,08 мин; m/z=332,0 [M+H]+, площадь пика >97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,09 (с, 1H), 11,19 (с, 1H), 9,34-9,27 (м, 1H), 7,91 (дд, J=7,8, 1,4 Гц, 1H), 7,55 (дд, J=7,5, 1,5 Гц, 1H), 7,46 (д, J=7,9 Гц, 2H), 7,39 (тд, J=7,5, 1,4 Гц, 1H), 7,32 (с, 1H), 4,82 (д, J=5,9 Гц, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H14NO7: 332,07648, найдено: 332,07622.
Биологические данные: Ia-053a: FGF-1 IC50 [мкМ]=150; FGF-2 IC50 [мкМ]=124; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=210; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=52,92; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=2,5; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=18,67.
Схема 4b. Синтез этил 4-амино-2,5-дибензилоксибензоата (анилин A)
Протокол: синтез анилина A
Этил 4-амино-2,5-дибензилоксибензоат (анилин A). В охлаждаемый раствор (ледяная баня) 2,5-бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)бензойной кислота (KI-1) (2,0 г, 4,9 ммоль) и Et3N (1,6 мл, 11,3 ммоль) в ТГФ (25 мл) в инертной атмосфере (N2) медленно добавляли DPPA (1,1 мл, 5,2 ммоль). Смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре в течение 3 ч. Затем добавляли воду (8 мл) и реакционную смесь нагревали до температуры 70°C в течение 2 ч. Реакционную смесь выливали в насыщенный водный раствор гидрокабоната натрия (250 мл) и перемешивали в течение 5 мин, затем экстрагировали EtOAc (3×100 мл). Объединенные органические слои сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением бесцветного масла. Остаток очищали с помощью флеш хроматографии (изогексан/EtOAc 1:0, затем градиент до 30% EtOAc) с получением указанного в заголовке анилина A (1,0 г, 53%) в виде твердого вещества не совсем белого цвета.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,26 мин; m/z=378,2 [M+H]+, площадь пика 94%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,54-7,46 (м, 4H), 7,44-7,36 (м, 4H), 7,35-7,25 (м, 3H), 6,46 (с, 1H), 5,65 (с, NH2), 5,06 (с, 2H), 5,02 (с, 2H), 4,16 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,22 (т, J=7,1 Гц, 3H).
26) 4-(4-Карбокси-2,5-дигидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение Ia-056a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,90 мин; m/z=348,0 [M-H]-, площадь пика 97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,28 (шир. с, 1H), 11,26 (с, 1H), 9,97 (с, 1H), 8,09 (с, 1H), 7,48 (с, 1H), 7,42 (с, 1H), 7,26 (с, 1H).
Сложный диэтиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,86 мин; m/z=404,2 [M-H]-, площадь пика 92%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,48 (шир. с, 1H), 11,32 (шир. с, 1H), 10,28 (с, 1H), 10,07 (шир. с, 1H), 9,88 (с, 1H), 8,12 (с, 1H), 7,58 (с, 1H), 7,39 (с, 1H), 7,28 (с, 1H), 4,46-4,27 (м, 4H), 1,46-1,12 (м, 6H).
Пример 1.2-Молекулы типа lb: Диамиды из диаминов, 1 пример
Схема 5. Синтез диамидов типа Ib
Способы синтеза: смотри общие способы, стадии [3], [4], [5]
Пример:
Относительно условий и выходов: см. фигуры 4A-D
27) 3,5-Бис(2,5-дигидрокси-4-карбоксибензоиламино)бензойная кислота, соединение Ib-010a:
UPFC-MS (кислотный метод, 4 мин): rt=0,98 мин; m/z=511,0 [M-H]', площадь пика >93%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,81 (с, 2H), 10,65 (с, 2H), 8,38 (д, J=2,0 Гц, 1H), 8,12 (д, J=2,0 Гц, 2H), 7,39 (д, J=2,3 Гц, 4H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C23H17N2O12: 513,07760, найдено: 513,07736.
Биологические данные: Ib-010a: FGF-1 IC50 [мкМ]=14; FGF-2 IC50 [мкМ]=3,8; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=15;
ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=1,6; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=71,84;
PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,06; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=1,5; цельная кровь:
GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=2,22; IL-1β IC50 [мкМ]=33,3; IL-2 IC50 [мкМ]=2,74; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=1,02; IL-9 IC50 [мкМ]=11,58; IL-10 IC50 [мкМ]=>100; IL-12p70 IC50 [мкМ]=0,27; IL-13 IC50 [мкМ]=>100; IL-17A IC50 [мкМ]=0,42; IL-17F IC50 [мкМ]=>100; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=67,8; IL-33 IC50 [мкМ]=31,3; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,31; TNFβ IC50 [мкМ]=49,3.
Сложный триэтиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,29 мин, m/z=597,1 [M+H]+, площадь пика >96%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,80 (с, 2H), 10,68 (с, 2H), 9,95 (с, 2H), 8,40 (т, J=2,0 Гц, 1H), 8,15 (д, J=2,0 Гц, 2H), 7,42 (с, 2H), 7,39 (с, 2H), 4,42-4,33 (м, 6H), 1,38-1,33 (м, 9H). МСВР: [M+H]+, вычисл. для C29H29N2O12: 597,17150, найдено: 597,17131.
Биологические данные: Ib-010a-E3: FGF-1 IC50 [мкМ]=26; FGF-2 IC50 [мкМ]=226; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,09; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=36,41; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=6,52; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=79,5; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=2,79; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=36,2; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,24; IL-9 IC50 [мкМ]=26,8; IL-10 IC50 [мкМ]=>100; IL-12p70 IC50 [мкМ]=0,84; IL-13 IC50 [мкМ]=33; IL-17A IC50 [мкМ]=0,52; IL-17F IC50 [мкМ]=34,2; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=>100; IL-33 IC50 [мкМ]=20; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,98; TNFβ IC50 [мкМ]=38,2.
Сложный триэтиловый эфир тетраацетат:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,19 мин, m/z=782,1 [M+NH4]+, площадь пика 91%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,84 (с, 2H), 8,40 (м, 1H), 8,08 (д, J=2,0 Гц, 2H), 7,80 (с, 2H), 7,63 (с, 2H), 4,45-4,22 (м, 6H), 2,32 (с, 6H), 2,23 (с, 6H), 1,38-1,27 (м, 9H).
Биологические данные: Ib-010a-E3-A4: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,54; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=54,86; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,49; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=96.
Пример 1.3.-Молекулы типа Ic: Диамиды из дикислот, 4 примера
Схема 6. Синтез амидов типа Ic с R=Rʼ
Способы: смотри общие способы исходя из KI-6 [3], [4], [5]
Примеры:
Относительно условий и выходов: см. фигуры 4A-D
28) N1,N4-Бис(2-(1H-тетразол-5-ил)фенил)-2,5-дигидрокситере-фталамид, соединение Ic-001aTz2:
UPFC-MS (кислотный метод, 2 мин): rt=0,97 мин; m/z=485,1 [M+H]+, площадь пика >97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,53 (с, 1H), 10,98 (с, 1H), 8,49 (дд, J=8,4, 1,2 Гц, 1H), 7,90 (дд, J=7,8, 1,6 Гц, 1H), 7,62 (ддд, J=8,7, 7,4, 1,6 Гц, 1H), 7,58 (с, 1H), 7,37 (тд, J=7,6, 1,2 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C22H17N10O4: 485,14287, найдено: 485,17274.
Биологические данные: Ic-001aTz2: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=70; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=45; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=2,2; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=60,64; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=97,15; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=1,38; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=9,45; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,52; IL-9 IC50 [мкМ]=9,13; IL-10 IC50 [мкМ]=>100; IL-12p70 IC50 [мкМ]=29,1; IL-13 IC50 [мкМ]=0,12; IL-17A IC50 [мкМ]=0,31; IL-17F IC50 [мкМ]=0,15; IL-18 IC50 [мкМ]=33,9; IL-21 IC50 [мкМ]=32; IL-33 IC50 [мкМ]=0,23; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,1; TNFβ IC50 [мкМ]=0,41.
29) 5-(4-(3-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота, соединение Ic-007a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,80 мин; m/z=469,1 [M+H]+, площадь пика >91%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 8,08 (с, 2H), 7,65 (с, 2H), 7,59 (с, 2H), 7,30-6,89 (м, 5H), 6,79 (д, J=8,8 Гц, 2H).
13C ЯМР (100 МГц, ДМСО-d6) δ 172,1, 165,2, 158,3, 150,1, 130,2, 129,2 (CH), 122,8, 122,6 (CH), 117,7 (CH), 117,3 (CH), 113,3.
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C22H17N2O10: 469,08777, найдено: 469,08739.
Биологические данные: Ic-007a: FGF-1 IC50 [мкМ]=13; FGF-2 IC50 [мкМ]=5,4; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=3,2; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,09; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=57,99; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=2,7; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=57,5; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=1,44; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=>100; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,09; IL-9 IC50 [мкМ]=27,1; IL-10 IC50 [мкМ]=12,5; IL-12p70 IC50 [мкМ]=0,49; IL-13 IC50 [мкМ]=30,1; IL-17A IC50 [мкМ]=0,04; IL-17F IC50 [мкМ]=22,9; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=1,9; IL-33 IC50 [мкМ]=18,4; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,27; TNFβ IC50 [мкМ]=6,52.
Сложный диметиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,13 мин, m/z=497,0 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,08 (с, 2H), 10,48 (с, 2H), 10,38 (с, 2H), 8,27 (д, J=2,8 Гц, 2H), 7,89-7,74 (м, 2H), 7,56 (с, 2H), 7,03 (д, J=8,9 Гц, 2H), 3,93 (с, 6H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C24H21N2O10: 497,11907, найдено: 497,11874.
Биологические данные: Ic-007a-E2: FGF-1 IC50 [мкМ]=23; FGF-2 IC50 [мкМ]=49; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,25; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=21,33; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=7,9; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=2.
Альтернативный масштабный синтез Ic-007a
a) Сложный метиловый эфир 5-(4-(3-метоксикарбонил-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дибензилоксибензамидо)-2-гидроксибензойной кислоты
В колбу с фланцем объемом 5 л загружали 2,5-бис(бензилокси)терефталевую кислоту (KI-6, 141,00 г, 0,373 моль), бензилтриэтилхлорид аммония (850 мг, 3,73 ммоль, 0,01 экв.) и хлороформ (2,5 л). Затем ее снабжали впускным отверстием для азота, термометром, капельной воронкой для выравнивания давления, выпускным отверстием для пустой бутылки Дрешеля и барботером с гидроксидом натрия. Перемешиваемый раствор нагревали до температуры 55°C и в течение периода 40 мин добавляли по каплям тионилхлорид (59 мл, 0,802 моль, 2,15 экв.). Раствор выдерживали при температуре 55°C в течение 6 ч, затем давали охладиться до комнатной температуры в течение ночи. Аликвоту обрабатывали ультразвуком в этаноле в течение 5 минут, затем анализировали методом ЖХМС, который показывал только диэтиловый эфир. Смесь переносили в две круглодонные колбы и летучие вещества удаляли в вакууме; хлорангидрид подвергали азеотропной перегонке с толуолом (по 800 мл в каждой колбе). В 10-литровый сосуд с рубашкой загружали метил 5-амино-2-гидроксибензоат (137,00 г, 0,819 моль, 2,2 экв.) и дихлорметан (2,5 л, 18 объемов); раствор охлаждали до температуры 15°C. Хлорангидрид растворяли в дихлорметане (2,5 л, 18 объемов) и добавляли к перемешиваемой реакционной смеси. В результате реакции немедленно образовывался большое количество твердого вещества, и перемешивание становилось затруднительным; также реакция была экзотермична до температуры 30°C. Однако при длительном перемешивании смесь превращалась в мелкодисперсную розово-фиолетовую суспензию. Смесь перемешивали при температуре 25°С в течение 72 часов. Суспензию фильтровали, промывали дихлорметаном (2 л, 14 объемов) и полученное твердое вещество сушили в вакуумной печи с получением 240,00 г продукта (выход 94%).
b) 5-(4-(3-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидрокси бензойная кислота, Ic-007a
Омыление: В трехгорлую круглодонную колбу объемом 5 л загружали свежеизмельченный метиловый эфир 5-(4-(3-метоксикарбонил-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дибензилоксибензамидо)-2-гидроксибензойной кислоты (150,00 г, 0,22 моль) и изопропанол (1,5 л, 10 объемов). Смесь нагревали до температуры 50°C и добавляли гидроксид тетрабутиламмония (444 мл, 0,67 моль, 3 экв.) и воду (1,1 л, 7 объемов). Через 1 ч оставалось некоторое количество твердых веществ, поэтому добавляли еще 60 мл раствора гидроксида тетрабутиламмония вместе с водой (120 мл), смесь перемешивали при температуре 50°С в течение 6 ч, затем оставляли охлаждаться до комнатной температуры в течение ночи. Добавляли дополнительное количество гидроксида тетрабутиламмония (80 мл) и смесь дополнительно перемешивали при температуре 60°С в течение 1 часа до полного исчезновения твердого вещества. Гидрирование: Реакционную смесь дегазировали (3 цикла с N2), затем добавляли катализатор (30,00 г, 10%-ный Pd на C) в виде взвеси в воде (100 мл). Реакционную смесь дополнительно дегазировали (3 цикла с N2, 2 с H2) и помещали в атмосферу H2 (баллонное давление) при температуре 50°C в течение ночи. Реакционную смесь перезаряжали водородом и выдерживали при температуре 50°C в течение еще 4 ч, после этого анализ ЖХМС показал завершение реакции. Реакционную смесь дегазировали (3 цикла с N2), фильтровали через слой из целита и промывали теплой смесью вода/изопропанол (1 л, 1:1, 60°C). Объем уменьшали до ~1,2 л в вакууме. Смесь переносили в 5 л колбу с фланцем с водой (~3 л). Колбу снабдили подвесной мешалкой (большой якорной) и подкислили соляной кислотой (35%). Во время добавления образовывался тяжелый осадок. Смесь нагревали при температуре 55°C в течение 6 ч, затем давали охладиться до комнатной температуры в течение 72 ч. Смесь фильтровали и твердый продукт переводили во взвесь в 1M водн. HCl (3 л) и нагревали при температуре 50°C в течение 3 ч, затем давали охладиться до комнатной температуры в течение ночи. Смесь фильтровали, промывали 1M водн. HCl (2 л), водой (1,5 л) и ацетон (1 л). Твердый продукт сушили в вакуумной печи с получением 100,00 г продукта, все еще загрязненного ~5 моль% соли тетрабутиламмония (ЯМР). Это твердое вещество перемешивали в 1М соляной кислоте (3 л) при температуре 70°C в течение 8 ч, затем давали охладиться до комнатной температуры в течение ночи. Твердый продукт фильтровали, промывали водой и сушили в вакуумной печи. Количество тетрабутиламмония уменьшалось до -0,62 моль% (85,90 г, 82%-ный выход) (коричневый порошок).
30) 2-(2,5-Дигидрокси-4-(4-гидрокси-2-карбоксифениламино-карбонил)бензамидо)-5-гидроксибензойная кислота, соединение Ic-009a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,85 мин; m/z=469,0 [M+H]+, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,31 (с, 2H), 11,93 (с, 2H), 10,85 (с, 2H), 9,64 (с, 2H), 8,41 (д, J=9,0 Гц, 2H), 7,55 (с, 2H), 7,39 (д, J=3,0 Гц, 2H), 7,03 (дд, J=9,0, 3,0 Гц, 2H).
МСВР: вычисл. для C22H17N2O10: 469,08777, найдено: 469,08755.
Биологические данные: Ic-009a: FGF-1 IC50 [мкМ]=32; FGF-2 IC50 [мкМ]=202; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=208; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=72,85; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=72,21.
Сложный диметиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,03 мин, m/z=497,1 [M+H]+, площадь пика >92%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,69 (с, 2H), 11,01 (с, 2H), 9,75 (с, 2H), 8,36 (д, J=9,0 Гц, 2H), 7,62 (с, 2H), 7,37 (д, J=3,0 Гц, 2H), 7,07 (дд, J=9,0, 3,0 Гц, 2H), 3,87 (с, 6H).
МСВР: вычисл. для C24H21N2O10: 497,11907, найдено: 497,11913.
Биологические данные: Ic-009a-E2: FGF-1 IC50 [мкМ]=23; FGF-2 IC50 [мкМ]=30; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,02; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=24,12; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=41,05.
Схема 7. Синтез амидов типа Ic с R≠Rʼ
Способы синтеза: смотри общий способ исходя из KI-1.
Пример:
Относительно условий и выходов: см. фигуры 4A-D
31) 5-(4-(2-(1H-Тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота, соединение Ic-001aTz/004a:
UPFC-MS (кислотный метод, 4 мин): rt=1,40 мин; m/z=477,2 [M-H]-, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,92 (с, 1H), 10,42 (с, 1H), 8,47 (дд, J=8,4, 1,2 Гц, 1H), 8,25 (д, J=2,7 Гц, 1H), 7,98-7,88 (м, 1H), 7,76 (дд, J=8,9, 2,8 Гц, 1H), 7,63-7,56 (м, 2H), 7,51 (с, 1H), 7,37 (тд, J=7,6, 1,2 Гц, 1H), 6,97 (д, J=8,9 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C22H17N6O7: 477,11532, найдено: 477,11475.
Биологические данные: Ic-001a-Tz/004a: FGF-1 IC50 [мкМ]=19; FGF-2 IC50 [мкМ]=87; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=25; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=2,6; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=82,83; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=96,99; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=3,4; IFNγ IC50 [мкМ]=0,61; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=4,91; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=3,04; IL-9 IC50 [мкМ]=8,48; IL-10 IC50 [мкМ]=19,5; IL-12p70 IC50 [мкМ]=12,2; IL-13 IC50 [мкМ]=1,5; IL-17A IC50 [мкМ]=0,02; IL-17F IC50 [мкМ]=2,4; IL-18 IC50 [мкМ]=46,6; IL-21 IC50 [мкМ]=0,3; IL-33 IC50 [мкМ]=1,67; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,002; TNFβ IC50 [мкМ]=3,02.
Сложный метиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,06 мин, m/z=491,1 [M+H]+, площадь пика >89%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,55 (с, 1H), 10,90 (с, 1H), 10,45 (с, 1H), 10,37 (с, 1H), 8,47 (дд, J=8,4, 1,2 Гц, 1H), 8,30 (д, J=2,7 Гц, 1H), 7,91 (дд, J=7,8, 1,6 Гц, 1H), 7,76 (дд, J=8,9, 2,7 Гц, 1H), 7,63 (ддд, J=8,7, 7,4, 1,6 Гц, 1H), 7,58 (с, 1H), 7,51 (с, 1H), 7,38 (тд, J=7,6, 1,2 Гц, 1H), 7,02 (д, J=8,8 Гц, 1H), 3,93 (с, 4H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C23H19N6O7: 491,13097, найдено: 491,13071.
Биологические данные: Ic-001a-Tz/004a-E1: FGF-1 IC50 [мкМ]=104; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=35; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,1; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=73,97; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=97,56.
Пример 1.4. Молекулы типа Id: Бензимидазол-связанные, 1 пример
Схема 8. Синтез соединений типа Id
Способ синеза: смотри общий способ исходя из KI-1 [3], [4], [5]
Стадия циклизации: смотри фигуры 4A-D
Пример:
32) 2-(4-Карбокси-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-4-карбоновая кислота, соединение Id-030a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,99 мин; m/z=313,1 [M-H]-, площадь пика >97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 8,10 (д, J=8,2 Гц, 1H), 8,05 (д, J=7,7 Гц, 1H), 7,80 (с, 1H), 7,68 (т, J=8,0 Гц, 1H), 7,62 (с, 1H).
Биологические данные - нестабилен в ДМСО
Сложный этиловый метиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=2,09 мин, m/z=357,1 [M+H]+, площадь пика >89%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6+D2O 10%) δ 7,97 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,90-7,83 (м, 2H), 7,44-7,36 (м, 2H), 4,35 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 3,94 (с, 3H), 1,33 (т, J=7,1 Гц, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C18H17N2O6: 357,10811, найдено: 357,10827.
Биологические данные: Id-030a-E2: FGF-1 IC50 [мкМ]=115; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,33; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=0; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=43.
Пример 1.5: Молекулы типа IIa: Моноамиды, 16 примеров
СИНТЕЗ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ
Схема 9a. Синтез промежуточных соединений KI-2 и KI-7
Способы:
Синтез KI-2 и KI-7
2,6-Ди(этоксикарбонил)циклогексан-1,4-дион [стадия 1] [ссылка: Rodriguez et al. Synth. Comm. 28 (1998) 2259-69]: 1,3- К суспензии диэтил 1,3-ацетондикарбоксилата (18 мл, 0,1 моль) и карбоната калия-325 меш (21,5 г, 0,15 моль) в ТГФ (1 л) при температуре кипения с обратным холодильником в течение периода 30 мин добавляли по каплям дихлорацетон (12,5 г, 0,1 моль) в ТГФ (500 мл). Через 2 ч реакция завершалась и смесь охлаждали до комнатной температуры, затем фильтровали через целит®; твердый остаток промывали ТГФ (200 мл), растворитель затем удаляли при пониженном давлении. Сырой продукт очищали с помощью флеш хроматографии (гексаны/EtOAc, от 0 до 20%) с получением указанного в заголовке соединения (9,3 г, 37%-ный выход).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,01 мин; m/z=257,1 [M+H]-, площадь пика >74%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) сложная смесь енола и цис/транс изомеров δ 12,10 (с), 4,23 (кв, J=7,1 Гц), 4,11 (м), 3,85-3,77 (м), 3,70 (с), 3,10-2,89 (м), 2,89-2,80 (м), 2,62-2,58 (м), 1,25 (т, J=7,1 Гц), 1,22-1,15 (м, 9H).
Диэтил 2,5-дигидроксиизофталат [стадия 2]: [протокол был взят у Zhong et al.: Chem Eur. J. 25 (2019) 8177-8169]: В перемешиваемый раствор 2,6-ди(этоксикарбонил)-циклогексан-1,4-диона (5,0 г, 20 ммоль) в AcOH (17 мл) при комнатной температуре по частям в течение 30 мин добавляли NBS (3,5 г, 20 ммоль). После дополнительных 20 мин реакцию гасили добавлением воды (100 мл). Желаемый продукт выделяли в виде твердого вещества. После фильтрования и сушки указанное в заголовке соединение выделяли в виде твердого вещества белого цвета (4,6 г, 93%-ный выход).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,00 мин; m/z=253,1 [M-H]-, площадь пика >90%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,85 (с, 1H), 9,57 (с, 1H), 7,39 (с, 2H), 4,32 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 1,31 (т, J=7,1 Гц, 6H).
Диэтил 2,5-бис(бензилокси)изофталат [стадия 3]: К суспензии диэтил 2,5-дигидроксиизофталата (19,0 г, 75 ммоль) и карбоната калия-325 меш (82,6 г, 598 ммоль) в ДМФ (83 мл) в течение 10 мин добавляли по каплям бензилбромид (43,0 мл, 362 ммоль). Реакционную смесь нагревали при температуре 100°C в течение 2 ч. После охлаждения до комнатной температуры растворитель удаляли при пониженном давлении.
Затем к остатку добавляли воду (500 мл). Смесь экстрагировали EtOAc (3×250 мл), собранные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (300 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали, затем концентрировали при пониженном давлении. Сырое вещество очищали с помощью флеш хроматографии (гексаны/EtOAc, от 0 до 15%) с получением указанного в заголовке соединения (29,4 г, 90%-ный выход).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,38 мин; m/z=435,2 [M+H]+, площадь пика >90%
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,50 (с, 2H), 7,49-7,45 (м, 2H), 7,44-7,37 (м, 5H), 7,37-7,29 (м, 3H), 5,17 (с, 2H), 4,95 (с, 2H), 4,26 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 1,22 (т, J=7,1 Гц, 6H).
2,5-бис(бензилокси)-3-(этоксикарбонил)бензойная кислота (KI-2) [стадия 4]: Раствор гидроксида калия (4,4 г, 79 ммоль) в воде (66 мл) быстро добавляли к раствору диэтил 2,5-бис(бензилокси)изофталата (31,3 г, 72 ммоль) в 1,4-диоксане (430 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч. 1,4-диоксан удаляли при пониженном давлении, затем добавляли насыщенный водный раствор Na2CO3 (1 л), водный слой экстрагировали EtOAc (3×500 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали и растворитель удаляли в вакууме. Остаток очищали фильтрованием через слой из силикагеля с использованием смеси гексаны/EtOAc (1/1), затем EtOAc (1% об./об. AcOH) в качестве элюента с получением двух разных фракций:
Исходное вещество: диэтил 2,5-бис(бензилокси)изофталат (20,4 г, 65%-ный выход).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,38 мин; m/z=435,2 [M+H]+, площадь пика >78%
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,50 (с, 2H), 7,49-7,45 (м, 2H), 7,44-7,37 (м, 5H), 7,37-7,29 (м, 3H), 5,17 (с, 2H), 4,95 (с, 2H), 4,26 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 1,22 (т, J=7,1 Гц, 6H).
Желаемый продукт, 2,5-бис(бензилокси)-3-(этоксикарбонил)бензойная кислота в виде пушистого твердого вещества белого цвета, (KI-2) (3,5 г, 12%-ный выход).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,22 мин; m/z=405,1 [M-H]-, площадь пика >90%
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,30 (с, 1H), 7,48 (т, J=3,0 Гц, 2H), 7,46-7,42 (м, 5H), 7,39 (м, 3H), 7,37-7,31 (м, 2H), 5,17 (с, 2H), 4,96 (с, 2H), 4,25 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,22 (т, J=7,1 Гц, 3H). Затем исходный насыщенный водный раствор Na2CO3 подкисляли до pH~7, используя концентрированную соляную кислоту. Затем экстрагировали EtOAc (2×500 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением смеси of KI-2 и KI-7 (3,0 г, 11%-ный выход).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,00 мин; m/z=377,1 [M-H]-, площадь пика 25%, rt=1,22 мин; m/z=405,1 [M-H]-, площадь пика 56%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,23 (с, 2H), 7,52-7,29 (м, 12H), 5,17 (с, 2H), 4,97 (с, 2H).
Схема 9b: Альтернативный синтез KI-7
2,6-Диметил-1,4-фенилен диацетат [стадия 1]: В перемешиваемый раствор 2,6-диметилгидрохинон (5,0 г, 36 ммоль) в пиридине (10 мл) быстро добавляли уксусный ангидрид (10 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Растворитель затем удаляли при пониженном давлении и остаток растворяли в EtOAc (250 мл) и последовательно промывали водным раствором соляной кислоты (1M, 250 мл), насыщенным водным раствором NaHCO3 (250 мл) и водой (250 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали и растворитель удаляли в вакууме с получением указанного в заголовке соединения (7,4 г, 92%) в виде твердого вещества белого цвета.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,07 мин; m/z=240,2 [M+NH ]+, площадь пика >90%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 6,88 (HAr, 2H), 2,37-2,30 (м, 3H), 2,27-2,21 (м, 3H), 2,12-2,02 (м, 6H).
2,6-Бис(дибромметил)-1,4-фенилен диацетат [стадия 2]: В перемешиваемый раствор 2,6-диметил-1,4-фенилен диацетата (6,34 г, 29 ммоль) в 1,2-дихлорэтане (130 мл) последовательно добавляли 2,2ʼ-азобис(2-метилпропионитрил) (AIBN) (0,93 г, 6 ммоль) и N-бромсукцинимид (NBS) (25,39 г, 143 ммоль). Раствор перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 24 ч. Добавляли дополнительное количество 2,2ʼ-азобис(2-метилпропионитрил) (AIBN) (0,93 г, 6 ммоль) и N-бромсукцинимида (NBS) (5,08 г, 28,6 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение еще 24 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и остаточное твердое вещество удаляли путем фильтрования и промывали DCM (250 мл). Фильтрат промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (250 мл), водным раствором соляной кислоты (1M, 250 мл) и насыщенным солевым раствором (250 мл). Органический слой затем сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (9,38 г, 61%) в виде масла оранжевого цвета.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,23 мин; m/z=553,1 [M+NH ]+, площадь пика >88%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,69 (с, 2H), 7,31 (с, 2H), 2,49 (с, 3H), 2,32 (с, 3H).
2,5-Дигидроксиизофтальальдегид [стадия 3]: К перемешиваемой суспензии 2,6-бис(дибромметил)-1,4-фенилен диацетата (3,89 г, 7,23 ммоль) в муравьиной кислоте (50 мл) добавляли воду (5 мл). Смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 18 ч. Реакционную смесь затем медленно выливали в насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (300 мл). Образовавшийся осадок затем выделяли путем фильтрования с получением указанного в заголовке соединения (0,94 г, 78%) в виде твердого вещества коричневого цвета.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,74 мин; m/z=165,0 [M-H]-, площадь пика >98%.
2,5-Бис(бензилокси)изофтальальдегид [стадия 4]: В перемешиваемый раствор 2,5-дигидроксиизофтальальдегида (0,94 г, 5,7 ммоль) в ДМФ (6 мл) при температуре окружающей среды добавляли карбонат калия-325 меш (2,34 г, 17,0 ммоль). Затем в реакционный сосуд добавляли бензилбромид (2,0 мл, 17,0 ммоль) и полученную смесь нагревали при температуре 100°C в течение 18 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и обрабатывали насыщенным водным раствором хлорида аммония (100 мл). Полученную суспензию перемешивали в течение 30 мин, затем фильтровали. Твердое вещество промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония (2×50 мл). Твердый продукт затем растирали в этаноле (5 мл), сушили отсасыванием с получением желаемого продукта в виде твердого вещества коричневого цвета (1,58 г, 68%)
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,28 мин, ионизация не наблюдалась, площадь пика 78%
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,14 (с, 2H), 7,63 (с, 2H), 7,53-7,28 (м, 10H), 5,23 (с, 2H), 5,21 (с, 2H).
2,5-Бис(бензилокси)изофталевая кислота (KI-7) [стадия 5]: 2,5-бис(бензилокси)изофтальальдегид (1,58 г, 4,5 ммоль) растворяли в растворе 2-метил-2-бутена в ТГФ (2,0 M, 25 мл). Затем добавляли раствор хлорита натрия (5,1 г, 45,0 ммоль) и дигидрофосфата калия (4,6 г, 33,8 ммоль) в воде (25 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Реакционную смесь затем выливали в насыщенный водный раствор NaHCO3 (400 мл). Водный слой промывали EtOAc (3×100 мл), затем подкисляли конц. соляной кислотой (pH~1). Водный слой затем экстрагировали DCM (2×150 мл) и Et2O (2×200 мл), собранный органический слой сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток затем растирали в н-пентане (3×50 мл) с получением указанного в заголовке соединения KI-7 в виде твердого вещества белого цвета (0,98 г, 58%). СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,03 мин, m/z=379,1 [M+H]+, площадь пика >96%.
Ac2O H2SO4
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,23 (с, 2H), 7,57-7,28 (м, 12H), 5,17 (с, 2H), 4,97 (с, 2H).
Схема 9c: Синтез KI-2Ac2
Метил 2,5-диацетокси-3-метилбензоат. 3-Метилсалициловую кислоту окисляли персульфатом, как описано Nudenberg et al (J. Org. Chem. 1943, 8, 500-508). 3-Метилсалициловую кислоту (15,0 г, 98,6 ммоль) растворяли в растворе гидроксида натрия (15,0 г, 375 ммоль, 3,8 экв.) в воде (37,5 мл).
Светло-коричневый раствор охлаждали до температуры 20°C и обрабатывали при перемешивании порциями по 7,75 мл 40%-го раствора гидроксида натрия и порциями по 33,8 мл 10%-го раствора персульфата калия, начиная с гидроксида, с такой скоростью, чтобы температура 30-35°С поддерживалась до тех пор, пока не было добавлено по десять порций каждого. После завершения добавления перемешивание продолжали в течение 1 часа, смесь оставляли стоять при комнатной температуре 16-20 часов, и затем добавляли конц. HCl до синего цвета лакмусовой бумаги. Непрореагировавшая 3-метилсалициловая кислота отделялась в этот момент в виде твердого вещества и ее удаляли фильтрованием. Фильтрат несколько раз экстрагировали эфиром (5×50 мл) для извлечения остатка 3-метилсалициловой кислоты. Затем водный раствор обрабатывали концентрированной HCl (100 мл) и кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч для разложения промежуточного моносульфата. Теплому раствору давали остыть до комнатной температуры и выпавшее в осадок кристаллическое твердое вещество почти черного цвета отфильтровывали, промывали водой и сушили. Экстракция водного фильтрата эфиром давала дополнительную партию 2,5-дигидрокси-3-метилбензойной кислоты в виде твердого вещества коричневого цвета (всего: 7,71 г, 47%). Т. пл. 212-214°C; 1H ЯМР (250 МГц, ДМСО): δ 10,94 (шир. с, 1H), 7,00 (дд, J=3,0 и 0,75, 1Har), 6,86 (дд, J=3,0 и 0,75, 1Har), 2,12 (с, 3H).
Этерификация. К раствору 2,5-дигидрокси-3-метилбензойной кислоты (2,05 г, 12,2 ммоль) в MeOH (7 мл) при температуре 0°С и в атмосфере азота осторожно добавляли концентрированную серную кислоту (0,7 мл). Затем реакционную смесь перемешивали в течение 6 ч при температуре 100°С. После охлаждения до комнатной температуры растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт растворяли в этилацетате (50 мл) и раствор промывали водой (20 мл), 10%-ным водным раствором NaHCO3 (20 мл), 5% водным раствором HCl (20 мл) и насыщенным солевым раствором (20 мл), и затем сушили (MgSO4). После фильтрования органический слой концентрировали в вакууме с получением остатка, который очищали флеш хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=9/1) с получением метил 2,5-дигидрокси-3-метилбензоата в виде твердого вещества белого цвета (370 мг, 75%). Т. пл. 101-103°C; 1H ЯМР (250 МГц, CDCI3): δ 10,56 (д, J=0,50 Гц, 1H), 7,12 (дд, J=3,25 и 0,50 Гц, 1Har), 6,90 (дт, J=3,00 и 0,50 Гц, 1Har), 4,45 (с, 3H), , 2,24 (с, 3H); МСВР (ESI+): m/z вычисл. для C9H11O4 [M+H]+: 183,0652; найдено 183,0651.
Ацетилирование. К раствору метил 2,5-дигидрокси-3-метилбензоата (4,43 г, 24,3 ммоль) в пиридине (10 мл) в атмосфере аргона добавляли избыток уксусного ангидрида (10 мл). После 12 ч перемешивания при комнатной температуре пиридин и уксусный ангидрид удаляли совместным выпариванием с толуолом (25 мл) при пониженном давлении. Затем сырой продукт растворяли в этилацетате (15 мл) и раствор промывали последовательно 2% водн. HCl (5 мл), насыщенным водн. NaHCO3 (5 мл) и насыщенным солевым раствором (5 мл). Органическую фазу сушили (MgSO4) и растворитель упаривали при пониженном давлении. Полученное бесцветное масло очищали флеш хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=8/2) с получением ацетилированного указанного в заголовке продукта (2,5-ацетокси-3-метилбензоат) в виде твердого вещества белого цвета (6,25 г, 97%). Т. пл. 69-71°C; 1H ЯМР (250 МГц, CDCl3): δ 7,58 (дд, J=3,00 и 0,50 Гц, 1Har), 7,18 (дд, J=3,00 и 0,75 Гц, 1Har), 3,85 (с, 3H), 2,37 (с, 3H), 2,30 (с, 3H), 2,22 (с, 3H); МСВР (ESI+): m/z вычисл. для C13H18NO6 [M+NH4]+: 284,1129; найдено 284,1128.
Метил 2,5-диацетокси-3-дибромметилбензоат. Раствор метил 2,5-ацетокси-3-метилбензоата (2,15 г, 8,08 ммоль), N-бромсукцинимида (2,87 мг, 16,2 ммоль, 2,0 экв.) и азобисизобутиронитрила (AIBN, 27,0 мг, 0,162 ммоль, 0,02 экв.) в тетрахлориде углерода (45 мл) кипятили с обратным холодильником в течение около 12 ч до тех пор, пока на поверхности не всплывало белое твердое вещество. После охлаждения смесь фильтровали и фильтрат затем концентрировали при пониженном давлении. Полученное бесцветное масло очищали флеш хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=9/1) с получением дибромированного продукта в виде твердого вещества белого цвета (3,29 г, 84%). Т. пл. 117-119°C; 1H ЯМР (250 МГц, CDCl3): δ 7,86 (д, J=2,75 Гц, 1Har), 7,78 (д, J=2,75 Гц, 1Har), 6,81 (с, 1H), 3,86 (с, 3H), 2,42 (с, 3H), 2,33 (с, 3H); МСВР (ESI+): m/z вычисл. для C13H12Br2NaO6 [M+Na]+: 444,8893; найдено 444,8896.
Метил 2,5-диацетокси-3-формилбензоат. Раствор метил 2,5-диацетокси-3-дибром-метилбензоата (2,30 г, 5,42 ммоль) и нитрата серебра (2,29 г, 13,5 ммоль, 2,5 экв.) в смеси ацетон-H2O (4,7:1, 40 мл) перемешивали при комнатной температуре и в темноте в течение 12 ч. Смесь затем фильтровали и фильтрат экстрагировали этилацетатом (2×20 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным солевым раствором (5 мл), сушили (MgSO4) и концентрировали при пониженном давлении. Полученное таким образом бесцветное масло очищали флеш хроматографией на силикагеле (петролейный эфир/этилацетат=9/1) с получением альдегида в виде твердого вещества желтого цвета (1,14 г, 75%). Т. пл. 102-104°C; 1H ЯМР (250 МГц, CDCl3): δ 10,17 (с, 1H), 8,00 (д, J=3,00 Гц, 1Har), 7,82 (д, J=3,00 Гц, 1Har), 3,90 (с, 3H), 2,44 (с, 3H), 2,34 (с, 3H).
Метиловый моноэфир 2,5-диацетоксиизофталевой кислоты (KI-2Ac2). Раствор гидрофосфата натрия (1,35 г, 9,81 ммоль, 2,5 экв.) в воде (3,5 мл) добавляли по каплям к раствору метил 2,5-диацетокси-3-формилбензоата (1,10 г, 3,93 ммоль) в ДМСО (14 мл). Смесь затем охлаждали до температуры 0°C и медленно добавляли раствор хлорита натрия (1,06 г, 9,34 ммоль, 2,4 экв.) в воде (3,5 мл). После 72 ч перемешивания при комнатной температуре смесь гасили насыщенным водным раствором NaHCO3 (10 мл) и экстрагировали этилацетатом (2×30 мл). Водную фазу затем подкисляли 1M HCl до pH=1 и экстрагировали этилацетат (2×30 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным солевым раствором (5 мл), сушили (MgSO4) и концентрировали при пониженном давлении. Полученное масло оранжевого цвета использовали на следующей стадии без какой-либо очистки.
СИНТЕЗ МОНОАМИДОВ
Схема 10. Синтез моноамидов IIa
Протоколы: Синтез моноамидов
Способы связывания амида и удаления защитных групп
Смотри общие способы исходя из KI-1 и KI-6, стадии [3], [4], [5], те же способы исходя из KI-2, KI-2Ac2 и KI-7
Примеры
Относительно условий и выходов: смотри таблицу 2 (фигуры 5A-C)
33) 3-(2-Карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение IIa-001a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,86 мин; m/z=318,0 [M+H]+, площадь пика >92%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,49 (с, 1H), 12,16 (с, 1H), 9,54 (с, 1H), 8,70 (дд, J=8,5, 1,2 Гц, 1H), 7,99 (дд, J=7,9, 1,7 Гц, 1H), 7,70-7,51 (м, 2H), 7,42 (д, J=3,3 Гц, 1H), 7,20 (тд, J=7,6, 1,2 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12NO7: 318,06083, найдено: 318,06082.
Биологические данные: IIa-001a: FGF-1 IC50 [мкМ]=8,6; FGF-2 IC50 [мкМ]=11; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=150;
ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=30,5;
PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,408; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=36,24.
34) 3-(2-(1H-Тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение IIa-001aTz:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,71 мин; m/z=342,1 [M+H]+, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,40 (с, 1H), 9,49 (с, 1H), 8,51 (д, J=8,3 Гц, 1H), 7,87 (д, J=7,7 Гц, 1H), 7,72-7,51 (м, 2H), 7,51-7,26 (м, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12N5O5: 342,08329, найдено: 342,08317.
Биологические данные: IIa-001a-Tz: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=9,8; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=187; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=74,15; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=24,18.
Сложный этиловый эфир
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,46 мин; m/z=370,1 [M+H]+, площадь пика >92%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,51 (с, 1H), 11,37 (с, 1H), 9,63 (с, 1H), 8,47 (д, J=8,3 Гц, 1H), 7,92 (дд, J=7,8, 1,6 Гц, 1H), 7,66-7,57 (м, 2H), 7,43 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,38 (тд, J=7,6, 1,2 Гц, 1H), 4,40 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,36 (т, J=7,1 Гц, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C17H16N5O5: 370,11460, найдено: 370,11444.
Биологические данные: IIa-001aTz-El: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=42; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=68,86; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=81,94.
35) 2,5-Дигидрокси-3-(2-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота, соединение IIa-001c:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,63 мин; m/z=354,0 [M+H]+, площадь пика >80%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,18 (с, 1H), 9,48 (с, 1H), 8,34-8,27 (м, 1H), 7,72 (дд, J=7,7, 1,7 Гц, 1H), 7,52 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,41-7,31 (м, 2H), 7,08 (тд, J=7,5, 1,2 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C14H12NO8S: 354,02781, найдено: 354,02781.
Биологические данные: IIa-001c: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=71; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=283; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=72,62; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=43,53.
36) 3-(3-Карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение IIa-002a:
1H ЯМР (250 МГц, CD3OD): d 8,37 (т, 1H), 7,93 (шир. д, 1H), 7,81 (шир. д, 1), 7,76 (д, 1H), 7,52 (д, 1H), 7,48 (т, 1H).
МСВР (ESI-): [M-H]-, вычисл. для C15H10NO7: 316,0461, найдено: 318,0463.
Биологические данные: IIa-002a: FGF-1 IC50 [мкМ]=19; FGF-2 IC50 [мкМ]=131; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=150; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=43,3; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,299; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=17,39.
37) 3-(4-Карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота)амид, соединение IIa-003a:
1H ЯМР (250 МГц, CD3OD): δ 8,06 (BBʼ из AAʼBBʼ, 2H), 7,85 (AAʼ из AAʼBBʼ, 2H), 7,75 (д, 1H), 7,58 (д, 1H).
МСВР (ESI-): вычисл. для C15H10NO7 [M-H]-: 316,0461; найдено: 316,0462
Биологические данные: IIa-003a: FGF-1 IC50 [мкМ]=22; FGF-2 IC50 [мкМ]=13; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=150; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=2,5; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=59,3; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=35,27.
38) 3-(3-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение IIa-004a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,76 мин; m/z=334,0 [M+H]+, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 14,02 (шир. с, 1H), 11,07 (шир. с, 1H), 10,32 (с, 1H), 9,47 (шир. с, 1H), 8,27 (д, J=2,7 Гц, 1H), 7,76 (дд, J=8,9, 2,7 Гц, 1H), 7,42 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,36 (д, J=3,2 Гц, 1H), 6,96 (д, J=8,9 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12NO8: 334,05574, найдено: 334,05571.
Биологические данные: IIa-004a: FGF-1 IC50 [мкМ]=47; FGF-2 IC50 [мкМ]=33; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=63,5; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,002; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=36.
39) 3-(2-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение IIa-006a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,65 мин; m/z=334,0 [M+H]+, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,36 (с, 1H), 11,83 (с, 1H), 9,62 (с, 1H), 9,47 (с, 1H), 8,47 (д, J=9,1 Гц, 1H), 7,64 (д, J=3,3 Гц, 1H), 7,41 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,37 (д, J=3,0 Гц, 1H), 7,03 (дд, J=9,1, 3,0 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H12NO8: 334,05574, найдено: 334,05548.
Биологические данные: IIa-006a: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=43; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=121; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=2,9; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=84,29; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=20,29.
40) 3-(3-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота, соединение IIa-011a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,72 мин; m/z=360,1 [M-H]-, площадь пика >77%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,83 (с, 1H), 9,55 (с, 1H), 8,43 (дд, J=7,9, 1,5 Гц, 1H), 7,73 (д, J=3,3 Гц, 1H), 7,63-7,53 (м, 2H), 7,46 (д, J=3,3 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H12NO9: 362,05066, найдено: 362,05045.
Биологические данные: IIa-011a: FGF-1 IC50 [мкМ]=141; FGF-2 IC50 [мкМ]=123; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=58,1; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,18; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=26.
41) 2-(3-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)терефталевая кислота, соединение IIa-012a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,73 мин; m/z=362,0 [M+H], площадь пика >97%.
1H ЯМР (ДМСО-d6) δ: 13,81 (с, 1H), 13,34 (с, 1H), 12,23 (с, 1H), 9,50 (с, 1H), 9,30 (д, J=1,6 Гц, 1H), 8,06 (д, J=8,2 Гц, 1H), 7,71 (дд, J=8,2, 1,7 Гц, 1H), 7,64 (д, J=3,3 Гц, 1H), 7,43 (д, J=3,3 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H12NO9: 362,05066, найдено: 362,05046.
Биологические данные: IIa-012a: FGF-1 IC50 [мкМ]=150; FGF-2 IC50 [мкМ]=150; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=32; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=3,31; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=44,8; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,313; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=7,5.
42) 2-(3-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота, соединение IIa-013a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,68 мин; m/z=362,0 [M+H]+, площадь пика >96%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,12 (шир. с, 3H), 11,71 (с, 1H), 9,47 (с, 1H), 7,96 (с, 1H), 7,94 (с, 1H), 7,66 (д, J=3,3 Гц, 1H), 7,44 (д, J=3,3 Гц, 1H), 7,35 (т, J=7,8 Гц, 1H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H12NO9: 362,05066, найдено: 362,05047.
Биологические данные: IIa-013a: FGF-1 IC50 [мкМ]=137; FGF-2 IC50 [мкМ]=12; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=34; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=57,68; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=2,54; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=15,75.
43) 4-(3-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота, соединение IIa-014a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,63 мин; m/z=362,1 [M+H]+, площадь пика >88%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,80 (с, 1H), 9,45 (с, 1H), 8,01 (д, J=2,2 Гц, 1H), 7,86 (дд, J=8,5, 2,2 Гц, 1H), 7,74 (д, J=8,5 Гц, 1H), 7,45-7,33 (м, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H12NO9: 362,05066, найдено: 362,05048.
Биологические данные: IIa-014a: FGF-1 IC50 [мкМ]=40; FGF-2 IC50 [мкМ]=61; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=91; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=17,6; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=73,94; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=21,5.
44) 5-(3-Карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота, соединение IIa-015a:
1H ЯМР (250 МГц, CD3OD): δ 8,60 (д, J=1,5 Гц, 2H), 8,44 (т, J=1,5 Гц, 1H), 7,75 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,56 (д, J=3,2 Гц, 1H).
МСВР (ESI+): m/z вычисл. для C16H12NO9 [M+H]+: 362,0507; найдено 362,0505 [LM-163].
Биологические данные: IIa-015a: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=125; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=N.D.; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=N.D.
45) (3-(3-(Карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение IIa-033a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,78 мин; m/z=330,1 [M-H]-, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,40 (с, 1H), 9,45 (с, 1H), 7,66 (т, J=1,9 Гц, 1H), 7,63-7,57 (м, 1H), 7,45 (д, J=3,3 Гц, 1H), 7,38 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,29 (т, J=7,8 Гц, 1H), 7,05-6,95 (м, 1H), 3,56 (с, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H14NO7: 332,07648, найдено: 332,07644.
Биологические данные: IIa-033a: FGF-1 IC50 [мкМ]=35; FGF-2 IC50 [мкМ]=32; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=4,9; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=50,64; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,914; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=11,75.
46) 3-(2-(Карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение IIa-034a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,74 мин; m/z=332,0 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 12,48 (с, 1H), 10,65 (с, 1H), 9,30 (с, 1H), 7,97 (д, J=8,3 Гц, 1H), 7,64 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,40 (д, J=3,3 Гц, 1H), 7,33-7,26 (м, 2H), 7,13 (тд, J=7,5, 1,3 Гц, 1H), 3,70 (с, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H14NO7: 332,07648, найдено: 332,07653.
Биологические данные: IIa-034a: FGF-1 IC50 [мкМ]=22; FGF-2 IC50 [мкМ]=5,7; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=86; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=100; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=69,2; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=26,58.
Сложный диэтиловый эфир
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,12 мин; m/z=388,1 [M+H]+, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,81 (с, 1H), 9,58 (с, 1H), 7,77 (т, J=8,5 Гц, 1H), 7,65 (д, J=3,4 Гц, 1H), 7,42 (д, J=3,4 Гц, 1H), 7,36-7,31 (м, 2H), 7,20 (т, J=7,4 Гц, 1H), 4,39 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 4,05 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 3,77 (с, 2H), 1,36 (т, J=7,1 Гц, 3H), 1,13 (т, J=7,1 Гц, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C20H22NO7: 388,13907, найдено: 388,13887.
Биологические данные: IIa-034a-E2: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=164; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=68,73; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=11,86.
47) 3-(3,4-Дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение IIa-035a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,69 мин; m/z=318,0 [M-H]-, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 9,38 (с, 1H), 8,84 (с, 1H), 8,75 (с, 1H), 7,55 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,34 (д, J=3,2 Гц, 1H), 6,74 (д, J=2,1 Гц, 1H), 6,67 (д, J=8,0 Гц, 1H), 6,58 (дд, J=8,1, 2,1 Гц, 1H), 4,34 (д, J=5,7 Гц, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C15H14NO7: 320,07647, найдено: 320,07625.
Биологические данные: IIa-035a: FGF-1 IC50 [мкМ]=16; FGF-2 IC50 [мкМ]=61; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=45; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,52; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=76,99; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=36,67.
48) 3-(2-Карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-бензойная кислота, соединение IIa-053a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,08 мин; m/z=332,0 [M+H]+, площадь пика >97%.
1H ЯМР (ДМСО-d6) δ: 13,13 (шир. с, 1H), 12,73 (шир. с, 1H), 9,40 (с, 1H), 9,05 (с, 1H), 7,91 (дд, J=7,8, 1,4 Гц, 1H), 7,65-7,29 (м, 5H), 4,80 (д, J=6,1 Гц, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H14NO7: 332,07648, найдено: 332,07626.
Биологические данные: IIa-053a: FGF-1 IC50 [мкМ]=84; FGF-2 IC50 [мкМ]=18; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=37; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,27; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=63,13; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,62; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=20; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=1,04; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=1,67; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=2,2; IL-9 IC50 [мкМ]=1,41; IL-10 IC50 [мкМ]=>100; IL-12p70 IC50 [мкМ]=0,27; IL-13 IC50 [мкМ]=29,9; IL-17A IC50 [мкМ]=>100; IL-17F IC50 [мкМ]=28,8; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=>100; IL-33 IC50 [мкМ]=12,1; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,02; TNFβ IC50 [мкМ]=91,5.
Пример 1.6. Молекулы типа IIb: Диамиды из диаминов, 1 пример
Схема 11синтез диамидов типа IIb
Способ: смотри общий способ исходя из KI-1 [3], [4], [5]
Например:
Относительно условий и выходов: смотри таблицу 2 (фигуры 5A-C)
49) 3,5-Бис(2,5-дигидрокси-3-карбоксибензоиламино)бензойная кислота, соединение IIb-010a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,98 мин; m/z=511,1 [M-H]-, площадь пика >93%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,81 (с, 2H), 10,65 (с, 2H), 8,38 (м, 1H), 8,12 (д, J=2,0 Гц, 2H), 7,39 (д, J=2,3 Гц, 4H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C23H17N2O12: 513,07760, найдено: 513,07774.
Биологические данные: IIb-010a: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=102; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=28; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=81,87; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=59,84.
Пример 1.7. Молекулы типа IIc: Диамиды из дикислот, 2 примера
Схема 12. Синтез амидов типа IIc с R=Rʼ
Способ: смотри общий способ исходя из KI-6 [3], [4], [5]
Например
Относительно условий и выходов: смотри таблицу 2 (фигуры 5A-C)
50) 5-(3-(3-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота, соединение IIc-007a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,20 мин; m/z=469,1 [M+H]+, площадь пика >91%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,41 (с, 2H), 9,51 (с, 1H), 8,22 (д, J=2,7 Гц, 2H), 7,79 (дд, J=9,0, 2,7 Гц, 2H), 7,58 (с, 2H), 6,98 (д, J=8,9 Гц, 2H),
13C ЯМР (100 МГц, ДМСО-d6) δ 172,1, 166,1, 158,3, 152,0, 149,4, 130,2, 129,5 (CH), 122,8 (CH), 120,3, 119,8 (CH), 117,7 (CH), 113,0.
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C22H17N2O10: 469,08777, найдено: 469,08803.
Биологические данные: IIc-007a: FGF-1 IC50 [мкМ]=11; FGF-2 IC50 [мкМ]=91; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=8,2; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,44; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=93,04; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=64,61 ; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=26; IFNγ IC50 [мкМ]=0,11; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=12,8; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,05; IL-9 IC50 [мкМ]=2,14; IL-10 IC50 [мкМ]=17,9; IL-12p70 IC50 [мкМ]=3,37; IL-13 IC50 [мкМ]=0,25; IL-17A IC50 [мкМ]=0,01; IL-17F IC50 [мкМ]=0,26; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=9,41; IL-33 IC50 [мкМ]=0,18; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,03; TNFβ IC50 [мкМ]=0,29.
Альтернативный масштабный синтез IIc-007a
2,5-Дибензилоксиизофталевая кислота (KI-7)
В 5-литровый сосуд с рубашкой загружали 2,5-дибензилоксиизофтальальдегид (схема 9b) (300г, 866 ммоль), резорцин (286 г, 2,60 моль), KH2PO4 (354 г, 2,60 моль), ацетон (1,5 л) и воду (516 мл). Взвесь перемешивали при температуре 15-25°C. В течение 90 минут (экзотермический эффект) при температуре 15-30°C помещали раствор 80% NaClO2 (294 г, 2,60 моль) в воде (1 л). После завершения добавления реакционную смесь перемешивали при температуре 15-25°C в течение 1 ч. В течение 10 мин при температуре <30°C (экзотермический эффект) помещали раствор 85% H3PO4 (85 мл, 1,24 моль) в воде (1175 мл) [~1M] с образованием осадка. Партию охлаждали до температуры 0-5°C и фильтровали. Твердые продукты промывали водой (3×1,2 л) и сушили в печи (50°C) с получением 325,6 г дикислоты KI-7. ВЭЖХ: 98,9%; ЯМР >95%. Уточненный выход (90,6%).
Метиловый эфир 5-(3-(3-метоксикарбонил-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дибензилоксибензамидо)-2-гидроксибензойной кислоты. В 2-литровый сосуд с рубашкой помещали дикислоту KI-7 (80 г, 211 ммоль), HBTU (гексафторфосфат 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония) (176,8 г, 466 ммоль) и ТГФ (560 мл). Партию перемешивали при температуре 15-25°C и загружали N-метилимидазол (50,6 мл, 635 ммоль). Через 30 мин загружали метил 5-амино-2-гидроксибензоат (77,8 г, 466 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при температуре 25°C в течение ночи. Добавлял воду (1,2 л) и партию перемешивали при температуре 20°C в течение 30 мин. Партию фильтровали, промывали водой (2×480 мл), затем MeCN (320 мл). Полученное твердое вещество (236 г) помещали обратно в сосуд вместе с MeCN (800 мл). Взвесь нагревали до температуры 50°C в течение 40 мин, затем охлаждали до температуры 20°C. Партию фильтровали и промывали MeCN (320 мл). ЯМР-анализ твердого вещества (156 г) показал отсутствие TMU, HOBt, NMI или HBTU. Вещество сушили при температуре 50°C в течение ночи с получением 125 г диамида. ВЭЖХ: 98,2%. ЯМР: >97%. Выход: 88%.
5-(3-(3-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дибензилоксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота. В 2-литровый сосуд с рубашкой помещали предыдущий диамид (110 г, 163 ммоль), ТГФ (550 мл) и воду (1100 мл). Партию перемешивали при температуре 15-25°C и загружали 85% KOH (32,2 г, 488 ммоль) (незначительный экзотермический эффект). Раствор нагревали до температуры 50°C в течение 4 ч, затем охлаждали до температуры 20°C и перемешивали в течение ночи. Затем в течение 30 мин при температуре 15-25°C добавляли 6M водн. AcOH (550 мл, 3,3 моль). После завершения добавления партию перемешивали в течение 30 мин и затем фильтровали. Твердые продукты промывали водой (3×550 мл), затем сушили в печи при температуре 50°C. Это давало 102 г свободной дикислоты. ВЭЖХ: 98,9% (0,3% моноамид, 0,19% монокислота). ЯМР: >97%. Выход: 97%.
5-(3-(3-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота IIc-007a. В 2-литровый сосуд с рубашкой в атмосфере N2 помещали 10% Pd/C (10 г, 50% влажн., тип 87L) затем предыдущую дикислоту (100 г, 154 ммоль), AcOH (5 мл, 88 ммоль) и ТГФ (1200 мл). Партию перемешивали, затем барботировали H2 и нагревали при температуре 40°C в течение 2 ч. Партию барботировали N2 и затем фильтровали (GF/F). Сосуд промывали ТГФ (300 мл) и эту промывку использовали для промывки катализатора на фильтре. Фильтрат помещали в сосуд и объем доводили до 2 л с помощью ТГФ (400 мл). Раствор нагревали до температуры 30°C, добавляли SPM32 (10 г) и партию перемешивали при температуре 30°C в течение ночи. SPM32 отфильтровывали и промывали ТГФ (200 мл). Растворитель удаляли в вакууме с получением твердого вещества светло-желтого цвета (110 г). ЯМР-анализ показал 28% ТГФ. Вещество переводили во взвесь в EtOH (1 л) при температуре 20°C в течение 2 ч и затем отфильтровывали. Твердые продукты промывали EtOH (400 мл) и сушили в печи при температуре 60°C в течение ночи. ЯМР показывал 8,7% EtOH, без ТГФ. Вещество далее сушили при температуре 80°C в течение 4 ночей с получением 66,5 г IIc-007a в виде твердого вещества не совсем белого цвета с выходом 92%. ВЭЖХ: 99,5% (0,31% моноамид). ЯМР: 4,6% EtOH, без ТГФ. Pd по данным ICP-OES: <2 частей на миллион.
IIc-007a-ТГФ сольват: Концентрирование фильтрата ТГФ дает твердое вещество желтого цвета, обычно содержащее 25-30% ТГФ по данным ЯМР, которое не может быть удалено сушкой, что указывает на нестехиометрический сольват. Небольшой образец сольвата ТГФ (1,45 г) нагревали при температуре 50°С в ТГФ (10 мл) в течение 1 часа, охлаждали до комнатной температуры и выделяли, промывая 3 мл ТГФ. Это давало 1,13 г IIc-007a-ТГФ. ЯМР: 27% ТГФ. ВЭЖХ: 99,6% (0,1% моноамид). Выделение сольвата ТГФ фильтрованием приводит к повышению чистоты и эффективному удалению основной примеси (моноамид, IIa-004a) с 0,7% до 0,1%. Выход извлечения: 78%. Растворимость ТГФ сольвата в ТГФ рассчитана как ~25 мг/мл при температуре 20°C.
Были проведены исследования десольватации вещества в ацетоне, EtOH и EtOAc. Каждую партию нагревали в течение 1 часа при температуре 50°С в 20 объемах растворителя, затем выделяли при комнатной температуре и сушили в печи (60°С). В качестве растворителя для десольватации был выбран этанол из-за низкого уровня EtOH, включенного в продукт после сушки, и превосходного удаления ТГФ из системы. Стадию десольватации проводили с 12,1 г продукта (25% ТГФ). К веществу добавляли EtOH (20 объемов) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Образец отфильтровывали, что указывало на успешную десольватацию при комнатной температуре. Общий выход: 8,67 г. ВЭЖХ: 99,4%. ЯМР: >97% (0,8% EtOH). Порошковый рентгеноструктурный анализ показывал высокую степень кристалличности выделенного продукта.
Продукт IIc-007a также образует сольваты с ДМСО (соотношение ДМСО:продукт 3:2).
51) 2-(3-(2-Карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-5-гидроксилбензойная кислота, соединение IIc-009a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,79 мин; m/z=469,1 [M+H]+, площадь пика >95%
1H ЯМР (400 МГц, DMF-d7) δ 10,11 (с,1H), 10,01 (с,2H), 8,71 (д, J=9,0 Гц, 2H), 8,01 (с, 2H), 7,82 (д, J=3,0 Гц, 2H), 7,46 (д, J=8,9 Гц, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C22H17N2O10: 469,08777, найдено: 469,08714
Биологические данные: IIc-009a: FGF-1 IC50 [мкМ]=30; FGF-2 IC50 [мкМ]=N.D.; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=182; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=1,7; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=75,31; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=53,15; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=0,54; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=19,6; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,27; IL-9 IC50 [мкМ]=18,9; IL-10 IC50 [мкМ]=11,31; IL-12p70 IC50 [мкМ]=>100; IL-13 IC50 [мкМ]=0,13; IL-17A IC50 [мкМ]=0,001; IL-17F IC50 [мкМ]=0,13; IL-18 IC50 [мкМ]=2,95; IL-21 IC50 [мкМ]=8,01; IL-33 IC50 [мкМ]=0,29; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,11; TNFβ IC50 [мкМ]=6,94.
Пример 1.8: Молекулы типа IIIa: Моноамиды, 4 примера
Синтез предшественников
Схема 13. Синтетические промежуточные соединения: KI-8 и KI-9 исходя из KI-1
Протоколы синтеза
Промежуточных соединений KI-8 и KI-9 (при помощи KI-10 и KI-11)
Этил 2,5-бис(бензилокси)-4-(гидроксиметил)бензоат (KI-10) [стадия 1]: К охлажденному до температуры -20°C раствору KI-1 (62,3 г, 153 ммоль) в ТГФ (700 мл) в положительном потоке инертного газа (N2) медленно добавляли a заранее охлажденный раствор BH3∙ТГФ (615,0 мл, 615 ммоль) (при температуре -10°C). Добавление производили таким образом, чтобы внутренняя температура реакционной смеси никогда не превышала -15°C. Реакционную смесь слегка нагревали, внутренней температуре не давали превысить -7°C. Смесь выдерживали при этой температуре в течение 2,5 часов. Затем реакционную смесь выливали в смесь лед/вода (8 л). Полученные мутно-белые смеси оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 2 часов, а оставшуюся белую суспензию фильтровали через воронку с пористым стеклом (пористость 3). Полученное таким образом белое твердое вещество затем сушили в вакуумной печи при температуре 40°C в течение ночи с получением этил 2,5-бис(бензилокси)-4-(гидроксиметил)бензоата (KI-10) (60,5 г, 97%-ный выход) в виде твердого вещества белого цвета.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,25 мин; m/z=391,2 [M-H]-, площадь пика >68%ю
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,54-7,48 (м, 2H), 7,48-7,43 (м, 2H), 7,43-7,35 (м, 4H), 7,35-7,27 (м, 4H), 5,28 (т, J=5,4 Гц, 1H), 5,13 (с, 2H), 5,11 (с, 2H), 4,58 (д, J=5,4 Гц, 2H), 4,25 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,26 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Альтернативно, промежуточное соединение KI-10 может быть получено исходя из KI-1 с помощью смешанного ангидрида (обработка KI-1 изобутилхлорформиатом в ТГФ в присутствии триэтиламина) с последующим восстановлением смешанного ангидрида боргидридом натрия в ТГФ (выход 85-90%, в масштабе 150 г).
Этил 2,5-бис(бензилокси)-4-(хлорметил)бензоат (KI-11) [стадия 2]: К охлаждаемому (ледяная баня) раствору KI-10 (25,0 г, 64 ммоль), DIPEA (12,2 мл, 70 ммоль) и DMAP (0,778 г, 6 ммоль) медленно добавляли тозилхлорид (17,0 г, 70 ммоль) в ДХМ (260 мл). Реакционную смесь перемешивали при температуре 60°С в течение 30 ч, после чего реакцию считали завершенной. Добавляли DCM (100 мл) и органический слой отделяли, промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия (4×50 мл), водой (2×50 мл) и насыщенным солевым раствором (50 мл), сушили сульфатом натрия и концентрировали. Сырой продукт подвергали колоночной хроматографии (гексаны/EtOAc 0-20%) с получением этил 2,5-бис(бензилокси)-4-(хлорметил)бензоата (KI-11) (23,5 г, 75%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,39 мин; m/z=нет иона, площадь пика >84%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,54-7,44 (м, 4H), 7,43-7,36 (м, 6H), 7,36-7,28 (м, 2H), 5,18 (с, 2H), 5,13 (с, 2H), 4,76 (с, 2H), 4,26 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,25 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Альтернативно промежуточное соединение KI-11 может быть получено обработкой KI-10 тионилхлоридом (1,14 эквив.) в дихлорметане при температуре -10°С, затем выпариванием растворителя и осаждением из гептана (выход 90%, в масштабе 300 г).
Этил 2,5-бис(бензилокси)-4-(цианометил)бензоат [стадия 3]: Суспензию KI-11 (7,5 г, 18,2 ммоль) в смеси EtOH (90 мл) и H2O (45 мл) обрабатывали цианистым калием (1,8 г, 27,4 ммоль). Реакционную смесь нагревали до температуры 75°C и перемешивали при этой температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляли водой (500 мл) и экстрагировали EtOAc (2×200 мл), объединенные органические фазы затем промывали насыщенным солевым раствором (200 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Сырой продукт выделяли в виде смеси этил 2,5-бис(бензилокси)-4-(цианометил)бензоата и 2,5-бис(бензилокси)-4-(цианометил)бензойной кислоты (7,1 г), продукт использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,30 мин; m/z=402,2 [M+H]+, площадь пика >65% и rt=1,15 мин; m/z=374,1 [M+H]+, площадь пика >8%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,56-7,27 (м, 12H), 5,19 (с, 2H), 5,14 (с, 2H), 4,26 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 3,95 (с, 2H), 1,25 (т, J=7,1 Гц, 3H).
2,5-Бис(бензилокси)-4-(карбоксиметил)бензойная кислота (KI-9) [стадия 4]: К суспензии этил 2,5-бис(бензилокси)-4-(цианометил)бензоата (7,1 г, 13,2 ммоль) в EtOH (20 мл) добавляли раствор гидроксида натрия (8,5 г, 212,5 ммоль) в воде (50 мл) и реакционную смесь перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавляли водой (100 мл) и полученный раствор промывали EtOAc (2×100 мл), полученный таким образом органический слой экстрагировали водой (100 мл) и все водные слои собирали. Затем водный слой подкисляли до pH ~3 насыщенным водным раствором лимонной кислоты, образовавшийся осадок фильтровали и сушили при пониженном давлении. Твердое вещество дополнительно сушили в вакуумной печи при температуре 40°C в течение ночи с получением 2,5-бис(бензилокси)-4-(карбоксиметил)бензойной кислоты (KI-9) (6,4 г, 92%-ный выход) в виде твердого вещества желтоватого цвета.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,07 мин; m/z=393,2 [M+H]+, площадь пика >74%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 12,46 (с, 2H), 7,55-7,27 (м, 11H), 7,19 (с, 1H), 5,11 (с, 2H), 5,09 (с, 2H), 3,61 (с, 2H).
2,5-Бис(бензилокси)-4-(2-этоксикарбонилметил)бензойная кислота (KI-8) [стадия 5]: KI-9 (5,5 г, 14,0 ммоль) суспендировали в EtOH (30 мл) и суспензию обрабатывали тионилхлоридом (0,52 мл, 7,1 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем реакционную смесь выливали в насыщенный раствор бикарбоната натрия (1 л), что приводило к получению белой суспензии. Твердое вещество выделяли фильтрованием и далее растирали в Et2O (2×20 мл). Твердое вещество дополнительно сушили в вакуумной печи в течение ночи с получением 2,5-бис(бензилокси)-4-(2-этоксикарбонилметил)бензойной кислоты (KI-8) (4,2 г, 64%) в виде твердого вещества белого цвета.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,23 мин; m/z=419,3 [M-H]-, площадь пика >79%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 12,68 (шир. с, 1H), 7,58-7,27 (м, 11H), 7,19 (с, 1H), 5,11 (с, 2H), 5,08 (с, 2H), 4,01 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 3,66 (с, 2H), 1,11 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Синтез моноамидов
Схема 14. Синтез моноамидов IIIa
Протоколы синтеза
Способы связывания амида и удаления защитных групп:
Смотри общие способы исходя из KI-1 и KI-6, стадии [3], [4], [5]
Примеры
Относительно условий и выходов: смотри таблицу 3 (фигура 6)
52) 2-(4-(Карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)бензойная кислота, соединение IIIa-001a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,89 мин; m/z=332,1 [M+H]+, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,38 (с, 1H), 12,17 (с, 1H), 10,67 (с, 1H), 9,23 (с, 1H), 8,64 (дд, J=8,5, 1,2 Гц, 1H), 8,00 (дд, J=7,9, 1,7 Гц, 1H), 7,62 (ддд, J=8,7, 7,3, 1,7 Гц, 1H), 7,33 (с, 1H), 7,19 (тд, J=7,6, 1,2 Гц, 1H), 6,80 (с, 1H), 3,49 (с, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H14NO7: 332,07648, найдено: 332,07666.
Биологические данные: IIIa-001a: FGF-1 IC50 [мкМ]=62; FGF-2 IC50 [мкМ]=10; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=32;
ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=74,79; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=30,4.
Сложный этиловый метиловый эфир
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,14 мин; m/z=374,2 [M+H]+, площадь пика >96%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,91 (с, 1H), 10,78 (с, 1H), 9,25 (с, 1H), 8,60 (дд, J=8,5, 1,2 Гц, 1H), 7,97 (дд, J=8,0, 1,7 Гц, 1H), 7,64 (ддд, J=8,7, 7,3, 1,7 Гц, 1H), 7,38 (с, 1H), 7,26-7,18 (м, 1H), 6,81 (с, 1H), 4,08 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 3,88 (с, 3H), 3,56 (с, 2H), 1,19 (т, J=7,1 Гц, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C19H20NO7: 374,12342, найдено: 374,12333.
Биологические данные: IIIa-001a-E2: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=33; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=43; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=69,66; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=44,46.
53) (2-(1H-Тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидрокси-фенил)уксусная кислота, соединение IIIa-001aTz:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,87 мин; m/z=356,1 [M+H], площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 12,22 (с, 1H), 11,43 (с, 1H), 10,74 (с, 1H), 9,21 (с, 1H), 8,46 (дд, J=8,5, 1,2 Гц, 1H), 7,87 (д, J=8,1 Гц, 1H), 7,60 (тд, J=8,6, 7,9, 1,6 Гц, 1H), 7,39-7,30 (м, 2H), 6,80 (с, 1H), 3,48 (с, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H14N5O5: 356,09894, найдено: 356,09889.
Биологические данные: IIIa-001aTz: FGF-1 IC50 [мкМ]=51; FGF-2 IC50 [мкМ]=14; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=12; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,71; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=69,35; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=39,74; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=18,9; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=>100; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=1,98; IL-9 IC50 [мкМ]=3,01; IL-10 IC50 [мкМ]=7,78; IL-12p70 IC50 [мкМ]=0,48; IL-13 IC50 [мкМ]=0,15; IL-17A IC50 [мкМ]=0,17; IL-17F IC50 [мкМ]=0,16; IL-18 IC50 [мкМ]=27,7; IL-21 IC50 [мкМ]=3; IL-33 IC50 [мкМ]=0,14; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,31; TNFβ IC50 [мкМ]=0,23.
Сложный этиловый эфир:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,56 мин; m/z=384,2 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,34 (с, 1H), 10,73 (с, 1H), 9,25 (с, 1H), 8,45 (дд, J=8,5, 1,2 Гц, 1H), 7,85 (дд, J=7,8, 1,6 Гц, 1H), 7,61 (ддд, J=8,7, 7,4, 1,6 Гц, 1H), 7,39-7,30 (м, 2H), 6,80 (с, 1H), 4,08 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 3,56 (с, 2H), 1,19 (т, J=7,1 Гц, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C18H18N5CO5: 384,13024, найдено: 384,12999.
Биологические данные: IIIa-001aTz-El: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,32; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=70,03; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=91,76.
54) 2-(4-(Карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота, соединение IIIa-013a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,82 мин; m/z=376,0 [M+H]+, площадь пика >89%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,67-11,48 (м, 3H), 10,82 (с, 1H), 9,19 (с, 1H), 7,95 (д, J=7,8 Гц, 2H), 7,36 (с, 1H), 7,33 (т, J=7,8 Гц, 1H), 6,79 (с, 1H), 3,48 (с, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C17H14NO9: 376,06630, найдено: 376,06638.
Биологические данные: IIIa-013a: FGF-1 IC50 [мкМ]=17; FGF-2 IC50 [мкМ]=31; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=43; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=1,3; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=76,55; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=30,667; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=27,8; IFNγ IC50 [мкМ]=0,15; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=57,1; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=3,55; IL-9 IC50 [мкМ]=11,9; IL-10 IC50 [мкМ]=37,3; IL-12p70 IC50 [мкМ]=0,5; IL-13 IC50 [мкМ]=0,37; IL-17A IC50 [мкМ]=0,15; IL-17F IC50 [мкМ]=0,41; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=1,63; IL-33 IC50 [мкМ]=1,11; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,51; TNFβ IC50 [мкМ]=0,89.
55) 5-(4-(Карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота, соединение IIIa-015a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,93 мин; m/z=376,0 [M+H]+, площадь пика >96%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6+10% D2O) δ 8,34 (с, 2H), 8,18 (с, 1H), 7,38 (с, 1H), 6,71 (с, 1H), 3,39 (с, 2H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C17H14NO9: 376,06630, найдено: 376,06665.
Биологические данные: IIIa-015a: FGF-1 IC50 [мкМ]=16; FGF-2 IC50 [мкМ]=114; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=202; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,89; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=78,76; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=12,13.
Этил сложный диметиловый эфир
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,69 мин; m/z=432,1 [M+H]+, площадь пика >97%.
1H ЯМР(400 МГц, ДМСО-d6) δ 9,23 (с, 1H), 8,58 (с, 1H), 8,58 (с, 1H), 8,23-8,21 (м, 1H), 7,31 (с, 1H), 6,81 (с, 1H), 4,08 (кв, J=7,0 Гц, 2H), 3,91 (с, 6H), 3,58 (с, 2H), 1,19 (т, J=7,1 Гц, 3H), МСВР: [M+H]+, вычисл. для C21H22NO9: 432,12891, найдено: 432,02903.
Биологические данные: IIIa-015a-E3: FGF-1 IC50 [мкМ]=N.D.; FGF-2 IC50 [мкМ]=191; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=87; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=7,2; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=91,37; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=61,22.
Пример 1.9. Молекулы типа IIIb: Диамиды из диаминов, 1 пример
Схема 15 синтез диамидов типа IIIb
Способ: смотри общий способ исходя из KI-1 стадии [3], [4], [5]
Например:
Относительно условий и выходов: смотри таблицу 3 (фигура 6)
56) 3,5-Бис(2,5-дигидрокси-4-карбоксиметилбензоиламино)бензойная кислота, соединение IIIb-010a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,08 мин; m/z=539,2,1 [M-H]-, площадь пика 80%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,85 (шир. с, 2H), 10,57 (шир. с, 2H), 9,20 (с, 2H), 8,26 (м, 1H), 8,09 (д, J=2,0 Гц, 2H), 7,36 (с, 2H), 6,82 (с, 2H), 3,50 (с, 4H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C23H17N2O12: 513,07760, найдено: 513,07774.
Сложный триэтиловый эфир
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,81 мин; m/z=623,3 [M-H]-, площадь пика 94%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,87 (с, 2H), 10,65 (с, 2H), 9,23 (с, 2H), 8,31-8,28 (м, 1H), 8,10 (д, J=2,0 Гц, 2H), 7,35 (с, 2H), 6,81 (с, 2H), 4,35 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 4,08 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 3,58 (с, 4H), 1,35 (т, J=7,1 Гц, 3H), 1,19 (т, J=7,1 Гц, 6H).
Биологические данные: IIIb-010a-E3: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,65; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=N.D.; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=0.
Пример 1.10: МОЛЕКУЛЫ ТИПА IIIc. Димеры, 6 примеров
Схемы синтеза и способы
Схема 16: X=O
Способы синтеза
Образование эфирной связи исходя из KI-10 и KI-11
Этил 2,5-дибензилокси-4-[(2,5-дибензилокси-4-этоксикарбонилфенил)метоксиметил]бензоат [стадия 1]: К раствору KI-11 (340 мг, 0,83 ммоль) и KI-10 (250 мг, 0,64 ммоль) в ДМФ (6 мл), охлаждаемому на ледяной бане, добавляли по частям гидрид натрия (76 мг, 1,9 ммоль). Через 1 ч реакционную смесь выливали в насыщенный водный раствор хлорида аммония (50 мл) и вещество экстрагировали EtOAc (3×30 мл), органическую фазу далее промывали водой (2×50 мл) и насыщенным солевым раствором (50 мл), сушили сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Сырой продукт очищали с помощью флеш хроматографии (гексаны/EtOAc, от 0 до 20%) с получением указанного в заголовке соединения (161 мг, 33%-ный выход) в виде твердого вещества коричневого цвета.
Способы удаления защитных групп:
Смотри общие способы [4], [5]
Например
Относительно условий и выходов: смотри таблицу 4 (удаление защиты) (фигура 7)
57) 4-((2,5-Дигидрокси-4-карбоксифенил)метоксиметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение IIIc-060a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,94 мин; m/z=349,1 [M-H]-, площадь пика >90%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,20 (с, 2H), 6,92 (с, 2H), 4,56 (с, 4H).
Биологические данные: IIIc-060a: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=51; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=114; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=1,3; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=86,84; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=41,38.
Схема 17: X=NH
Способы синтеза
Образование аминной связи исходя из KI-12 и KI-13 через KI-10 и KI-11
Этил 2,5-Бис(бензилокси)-4-формилбензоат (KI-12): К раствору KI-10 (3,4 г, 8,6 ммоль) в дихлорметане (50 мл) добавляли диоксид магния (4,5 г, 51,9 ммоль). Полученную суспензию перемешивали при кипячении с обратным холодильником в течение 4 ч. Реакционную смесь фильтровали через слой из целита® и твердый продукт промывали дихлорметаном (300 мл), растворитель затем удаляли при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (3,2 г, 94%-ный выход) в виде твердого вещества желтоватого цвета.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,33 мин; m/z=нет иона, площадь пика >93%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,39 (с, 1H), 7,56 (с, 1H), 7,54-7,26 (м, 11H), 5,28 (с, 2H), 5,20 (с, 2H), 4,30 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,27 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Этил 4-(азидометил)-2,5-бис(бензилокси)бензоат: К суспензии KI-10 (3,0 г, 7,6 ммоль) и 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ена (DBU) (1,5 мл. 9,9 ммоль) в толуоле (30 мл) добавляли дифенилфосфорилазид (DPPA) (2 мл, 9,1 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Добавляли водный раствор 1M соляной кислоты (200 мл) и продукт экстрагировали EtOAc (3×100 мл), объединенные органические слои промывали водой (2×50 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью флеш хроматографии (гексаны/EtOAc, от 0 до 20%) с получением указанного в заголовке соединение (3,1 г, 98%) в виде бесцветного масла, которое со временем превращалось в твердое вещество белого цвета.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,37 мин; m/z=390,2, [M+H-N2]+, площадь пика >93%
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,53-7,46 (м, 4H), 7,44-7,26 (м, 8H), 5,16 (с, 2H), 5,14 (с, 2H), 4,48 (с, 2H), 4,26 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,25 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Этил 4-(аминометил)-2,5-бис(бензилокси)бензоат (KI-13): К раствору этил 4-(азидометил)- 2,5-бис(бензилокси)бензоата (2,8 г, 6,7 ммоль) в ТГФ (60 мл) и воде (6 мл) добавляли связанный с полимером трифенилфосфин (4,7 г, ~ загрузка 3 ммоль/г) и полученную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре на 18 часов. Смолу удаляли фильтрованием и промывали водой (100 мл) и EtOAc (2×100 мл). Фазы разделяли и водный слой дополнительно экстрагировали EtOAc (100 мл), собранные органические слои промывали насыщенным солевым раствором (200 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (KI-13) (1,8 г, 70%-ный выход) в виде твердого вещества белого цвета.
СВЭЖХ-МС (основной метод, 2 мин): rt=1,20 мин; m/z=392,2, [M+H]+, площадь пика >93%
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,60-7,22 (м, 12H), 5,14 (с, 2H), 5,10 (с, 2H), 4,24 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 3,75 (с, 2H), 1,25 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Этил 2,5-дибензилокси-4-[(2,5-дибензилокси-4-этоксикарбонилфенил)метиламинометил]бензоат: KI-12 (500 мг, 1,3 ммоль) и KI-13 (641 мг, 1,6 ммоль) растворяли в DCM (35 мл) затем добавляли активированные молекулярные сита (10 шариков). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Затем добавляли триацетоксиборгидрид натрия (654 мг, 3,1 ммоль) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Добавляли DCM (25 мл), реакционную смесь декантировали в делительную воронку и промывали водой (50 мл), сушили сульфатом натрия и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией ((гексаны/EtOAc, от 0 до 50%) с получением указанного в заголовке соединения (631 мг, выход 64%) в виде бесцветного масла, которое со временем становилось твердым.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,37 мин; m/z=766,3, [M+H]+, площадь пика >92%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,47-7,42 (м, 4H), 7,38-7,25 (м, 20H), 5,08 (с, 4H), 5,04 (с, 4H), 4,25 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 3,76 (с, 4H), 1,25 (т, J=7,1 Гц, 6H).
Способы удаления защитных групп: смотри общие способы [4], [5]
Относительно условий и выходов: смотри фигуру 7.
Например
58) Бис(4-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)амин, соединение IIIc-056a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,57 мин; m/z=350,0 [M+H]+, площадь пика >96%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 9,97 (с, 2H), 9,08 (с, 2H), 7,31 (с, 2H), 7,02 (с, 2H), 4,11 (с, 4H). МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H16NO8: 350,08704, найдено: 350,08706.
Биологические данные: IIIc-056a: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=35; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=90,07; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=35.
Схема 18: X=NAc
Способы синтеза
N, N-Бис-[2,5-дибензилокси-4-этоксикарбонилфенилметил]-ацетамид: К раствору N, N-бис-[2,5-дибензилокси-4-этоксикарбонилфенилметил]амина (300 мг, 0,39 ммоль) и пиридин (0,2 мл, 2,4 ммоль) в DCM (6 мл) в атмосфере азота добавляли уксусный ангидрид (0,2 мл, 2,1 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью флеш хроматографии (гексаны/EtOAc, от 0 до 50%) с получением указанного в заголовке соединения (316 мг, 92%-ный выход) в виде бесцветного масла.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,44 мин; m/z=808,2 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,49-7,17 (м, 22H), 6,92 (с, 1H), 6,72 (с, 1H), 5,03 (с, 2H), 5,00 (с, 2H), 4,96 (с, 2H), 4,94 (с, 2H), 4,46 (с, 4H), 4,31-4,16 (м, 4H), 1,96 (с, 3H), 1,28-1,20 (м, 6H).
Способы удаления защитных групп:
Смотри общие способы [4], [5]
Например
Относительно условий и выходов: смотри фигуру 7 (удаление защиты)
59) N, N-Бис(4-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)ацетамид, соединение IIIc-057a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,84 мин; m/z=392,1 [M+H]+, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 9,50 (с, 1H), 9,34 (с, 1H), 7,22 (с, 1H), 7,17 (с, 1H), 6,63 (с, 1H), 6,53 (с, 1H), 4,48 (с, 2H), 4,39 (с, 2H), 2,11 (с, 3H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C18H18NO9: 392,09761, найдено: 392,09766.
Биологические данные: IIIc-057a: FGF-1 IC50 [мкМ]=87; FGF-2 IC50 [мкМ]=77; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=38; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,2; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=90,34; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=40,04; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=0,9; IL-1β IC50 [мкМ]=16,2; IL-2 IC50 [мкМ]=24,2; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,19; IL-9 IC50 [мкМ]=11,1; IL-10 IC50 [мкМ]=>100; IL-12p70 IC50 [мкМ]=0,73; IL-13 IC50 [мкМ]=4,73; IL-17A IC50 [мкМ]=1,32; IL-17F IC50 [мкМ]=5,06; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=1,56; IL-33 IC50 [мкМ]=2,93; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,15; TNFβ IC50 [мкМ]=1,58.
Схема 19: X=NCH2C6H3(OH)2COOH
Способы синтеза
Получение третичного амина исходя из KI-11 и NH3
Трис(4-этоксикарбони-2,5-дибензилоксифенилметил)амин: В герметически закрываемую пробирку загружали KI-11 (32,5 г, 79 ммоль), йодид натрия (0,79 г, 5 ммоль), раствор аммиака в МеОН (7 н) (38 мл, 264 ммоль) и EtOAc (80 мл). Затем пробирку герметически закрывали и реакционную смесь нагревали при температуре 60°С в течение 24 часов. Через 24 часа исходное вещество (KI-11) расходовалось, и реакционная смесь содержала желаемый продукт, а также мономерные и димерные структуры. Добавляли воду (100 мл) и полученную смесь экстрагировали EtOAc (3×100 мл), собранный органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в EtOAc (165 мл) и добавляли KI-11 (2,5 г, 6 ммоль), йодид натрия (0,79 г, 5 ммоль), DIPEA (10 мл, 58 ммоль) и полученный раствор нагревали при температуре 60°С. Через 18 ч добавляли воду (100 мл) и полученную смесь экстрагировали EtOAc (3×100 мл), собранный органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали перекристаллизацией, используя в качестве растворителя смесь EtOH/EtOAc 95/5 (20 мл), с получением указанного в заголовке соединения (15,0 г, 50%) в виде белых кристаллов.
СВЭЖХ-МС (основный метод, 2 мин): rt=1,71 мин; m/z=1140,3 [M+H]+, площадь пика >99%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 6,56-6,49 (м, 12H), 6,48-6,38 (м, 24H), 4,22 (с, 6H), 4,04 (с, 6H), 3,42 (кв, J=7,1 Гц, 6H), 3,00 (с, 6H), 0,42 (т, J=7,1 Гц, 9H).
Альтернативно, продукт можно очистить с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле: масштаб до 270 г; прибор: Combiflash Torrent; картридж: колонка RediSep, силикагель 3 кг; тип загрузки: неочищенный, растворенный в 1 л смеси гептан:толуол (1:1). Элюирование смесью этилацетат/гептан. Детекция: УФ-240 нм.
Способы удаления защитных групп: см. общие способы [4], [5].
Условия и выходы: см. фигуру 7 (удаление защитных групп).
Альтернативные масштабные способы удаления защитных групп:
Омыление. В круглодонную колбу емкостью 5 л помещали трис(4-этоксикарбони-2,5-дибензилоксифенилметил)амин (95,00 г, 0,083 моль), гидроксид натрия (40,00 г, 0,99 моль), воду (570 мл) и тетрагидрофуран (1,9 л). Реакционную смесь нагревали, используя температурный блок, при 80°С (температура кипения с обратным холодильником 65°С) в течение 48 часов, затем перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем растворители удаляли в вакууме. Сырой продукт собирали и дополнительно разбавляли водой (2,85 л). В другой 10-литровой колбе при комнатной температуре перемешивали смесь уксусной кислоты (180 мл) и воды (950 мл). К смеси уксусной кислоты в течение 30 минут при перемешивании верхнеприводной мешалкой добавляли смесь сырого продукта в воде, осаждалось твердое вещество кремового цвета. Реакционную смесь перемешивали еще в течение 1 часа и твердое вещество выделяли фильтрованием; рН маточного раствора 4,2. Выделенное твердое вещество перемешивали с водой (1425 мл) в течение 1 ч, затем фильтровали. рН маточного раствора 4,5. Извлеченное твердое вещество перемешивали с дополнительным количеством воды (1425 мл) в течение 1 ч, затем фильтровали; рН маточного раствора 4,5. Вышеупомянутое твердое вещество перемешивали с ацетоном (950 мл) в течение 1 часа и фильтровали. Твердое вещество кремового цвета сушили в вакуумной печи при температуре 50°С в течение 48 часов, затем анализировали (82,00 г, выход 93%) (выход варьируется в пределах 90-95%).
Примечание: рН является критическим параметром в процессе промывки, чтобы сохранить продукт в виде свободной кислоты и удалить из продукта избыток уксусной кислоты.
Идеальный pH: от 4,2 до 4,5 (конечное содержание натрия варьируется от 2 до 20 частей на миллион).
Гидрирование и выделение. В 2-литровую круглодонную колбу помещали трис(4-карбокси-2,5-дибензилоксифенилметил)амин (58,00 г, 54,00 ммоль, 1 экв.) и тетрагидрофуран (1160 мл). Смесь дегазировали азотом, затем продували циклом водород/вакуум 4-5 раз. К реакционной смеси добавляли палладий-на-угле (JM 10% 424 Pd/C, 70 г, загрузка 15%) и перемешивали при температуре 25°C в течение 5-6 часов. Затем реакционную смесь дегазировали и катализатор удаляли фильтрованием через слой целита, который промывали тетрагидрофураном (3×1160 мл). Наконец, фильтраты концентрировали при пониженном давлении. Неочищенное твердое вещество собирали, перемешивали с гептаном (1160 мл) и фильтровали с получением серого твердого вещества, которое сушили в вакуумной печи при температуре 50°C в течение ночи (32,50 г, выход >100% в пересчете на неочищенное вещество). Собранный сырой продукт растворяли в этаноле (325 мл) и нагревали до температуры 60°С (прозрачный раствор). Затем при температуре 60°С медленно добавляли воду (325 мл) (поддерживая температуру не ниже 50°С во время добавления) в течение 15-20 мин. На этой стадии наблюдалась мутная жидкость. Мутную реакционную смесь перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 30 мин.
По истечении этого времени реакционной смеси давали остыть до комнатной температуры еще 30 мин. Осажденное твердое вещество отделяли фильтрованием и промывали смесью этанол:вода 1:1 (66 мл). Твердое вещество сушили в вакуумной печи при температуре 50°C в течение по меньшей мере 72 часов перед анализом, чтобы получить желаемый продукт IIIc-061a (22,00 г, выход 76%) (выход варьируется в пределах 65-75%). ЖХ-МС: >95%, ЯМР: чистота >95%.
Трис(4-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)амин, соединение IIIc-061a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,74 мин; m/z=516,0 [M+H]+, площадь пика >86%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,27 (с, 3H), 6,83 (с, 3H), 4,33 (с, 6H).
13C ЯМР (100 МГц, ДМСО-d6) δ 172,0, 154,3, 148,3, 134, 117,8 (CH), 114,9 (CH), 112,4, 53,6 (CH2). МСВР: [M+H]+, вычисл. для C24H22NO12: 516,11365, найдено: 516,11389
Биологические данные: IIIc-061a: FGF-1 IC50 [мкМ]=9; FGF-2 IC50 [мкМ]=7,6; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=21; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=4,3; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=92,5; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=58,69; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=31,2; IFNγ IC50 [мкМ]=2,48; IL-1β IC50 [мкМ]=>100; IL-2 IC50 [мкМ]=>100; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,18; IL-9 IC50 [мкМ]=8,85; IL-10 IC50 [мкМ]=17,9; IL-12p70 IC50 [мкМ]=37,2; IL-13 IC50 [мкМ]=0,31; IL-17A IC50 [мкМ]=0,04; IL-17F IC50 [мкМ]=0,32; IL-18 IC50 [мкМ]=32,4; IL-21 IC50 [мкМ]=6,38; IL-33 IC50 [мкМ]=0,31; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,03; TNFβ IC50 [мкМ]=0,81.
Сложный триэтиловый эфир
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,05 мин; m/z=600,2 [M+H]+, площадь пика >82%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,02 (с, 3H), 9,54 (с, 3H), 7,17 (с, 3H), 7,00 (с, 3H), 4,33 (кв, J=7,1 Гц, 6H), 3,59 (с, 6H), 1,31 (т, J=7,1 Гц, 9H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C30H34NO12: 600,20755, найдено: 600,20790.
Биологические данные: IIIc-061a-E3: FGF-1 IC50 [мкМ]=200; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,34; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=N.D.; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=N.D.; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=10,4.
Схема 20: X=S
Способы синтеза
Образование тиоэфирной связи исходя из KI-11
Смотри схему 21. Те же условия для образования тиоэфирной связи.
Способы удаления защитных групп: смотри общие способы [4], [5]
Например
Относительно условий и выходов: смотри фигуру 7 (удаление защиты)
60) 4-((2,5-Дигидрокси-4-карбоксифенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение IIIc-058a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,84 мин; m/z=365,1 [M-H]-, площадь пика >79%.
1H ЯМР (400 МГц, Methanol-d4) δ 7,25 (с, 2H), 6,83 (с, 2H), 3,69 (с, 4H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H15O8S: 367,04822, найдено: 367,04768.
Биологические данные: IIIc-058a: FGF-1 IC50 [мкМ]=12; FGF-2 IC50 [мкМ]=12; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=124;
ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,29; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=61,22; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1,17; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=23.
Схема 21: X=SO2
Способы синтеза
Окисление тиоэфирной связи
Смотри получение IVc-059a: те же условия окисления.
Способы удаления защитных групп: смотри общие способы [4], [5]
Например
Относительно условий и выходов: смотри фигуру 7 (удаление защиты)
61) 4-((2,5-Дигидрокси-4-карбоксифенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение IIIc-059a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,72 мин; m/z=397,1 [M-H]-, площадь пика >97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,94 (шир. с, 2H), 10,63 (шир. с, 2H), 9,71 (с, 2H), 7,27 (с, 2H), 6,91 (с, 2H), 4,44 (с, 4H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H15O10S: 399,03804, найдено: 399,03768.
Биологические данные: IIIc-059a: FGF-1 IC50 [мкМ]=47; FGF-2 IC50 [мкМ]=50; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=3,61; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=66,39; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=1; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=14,67.
Пример 1.11: Соединения типа IVc
Схема 22: X=S
Синтез через диметиловый эфир
Способы синтеза
Синтез из 5-O-метилгентизиновой кислоты
3-Формил-2-гидрокси-5-метоксибензойная кислота. К смеси 2-гидрокси-5-метоксибензойной кислоты (24,0 г, 0,143 моль) в трифторуксусной кислоте (190,0 мл) добавляли гексаметилентетрамин (40,019 г, 0,285 моль). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 18 ч. После завершения реакции реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и к смеси добавляли раствор 2M соляной кислоты (700 мл) и перемешивали при температуре окружающей среды в течение 24 ч. Выпавший осадок фильтровали, промывали водой (500 мл) и сушили в вакуумной печи с получением 3-формил-2-гидрокси-5-метоксибензойной кислоты в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (21,30 г, 0,11 моль, 77,0%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,69 мин; m/z=195,1 [M-H]-, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,36 (с, 1H), 7,62 (д, J=3,4 Гц, 1H), 7,44 (д, J=3,4 Гц, 1H), 3,78 (с, 3H).
Метил 3-формил-2,5-диметоксибензоат. К смеси 3-формил-2-гидрокси-5-метоксибензойной кислоты (10,0 г, 0,05 моль) и карбонат калия-325 меш (28,18 г, 0,20 моль) в ДМФ (100,0 мл) добавляли метил йодид (6,7 мл, 0,107 моль). Полученную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 18 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и обрабатывали холодной водой (400 мл), что приводило к образованию осадка. Полученную суспензию перемешивали в течение 10 мин, затем фильтровали и сушили в вакуумной печи с получением метил 3-формил-2,5-диметоксибензоата в виде твердого вещества желтого цвета (8,90 г, 0,04 моль, 78,0%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,95 мин; m/z=225,1 [M+H]+, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,27 (с, 1H), 7,55 (д, J=3,4 Гц, 1H), 7,41 (д, J=3,4 Гц, 1H), 3,88 (с, 3H), 3,87 (с, 3H), 3,83 (с, 3H).
Метил 3-(гидроксиметил)-2,5-диметоксибензоат. К раствору метил 3-формил-2,5-диметоксибензоата (48,0 г, 0,214 моль) в MeOH (900 мл) при температуре 0°C медленно добавляли боргидрид натрия (16,198 г, 0,428 моль) и полученную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 15 мин. Растворитель удаляли в вакууме и остаток растворяли в DCM (200 мл), затем промывали водой (200 мл). Органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали досуха с получением метил 3-(гидроксиметил)-2,5-диметоксибензоата в виде твердого вещества белого цвета (45,6 г, 0,20 моль, 95,0%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,84 мин; нет ионизации, площадь пика >98%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,20 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,08 (д, J=3,3 Гц, 1H), 5,24 (т, J=5,7 Гц, 1H), 4,54 (д, J=5,6 Гц, 2H), 3,83 (с, 3H), 3,76 (с, 3H), 3,68 (с, 3H).
Метил 3-(хлорметил)-2,5-диметоксибензоат. К раствору метил 3-(гидроксиметил)-2,5-диметоксибензоата (45,60 г, 0,20 моль) в течение 30 мин при температуре окружающей среды добавляли по каплям тионилхлорид (17,2 мл, 0,235 моль). Полученную смесь перемешивали в течение 18 ч при температуре окружающей среды. После завершения реакции реакционную смесь промывали насыщенным водным раствором карбоната натрия (3×500 мл) и насыщенным солевым раствором (500 мл). Органический слой сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали досуха с получением метил 3-(хлорметил)-2,5-диметоксибензоата в виде твердого вещества коричневого цвета (49,1 г, 0,18 моль, 90%,)
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,10 мин; нет ионизации, площадь пика >92%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,29 (д, J=5,2 Гц, 1H), 7,22 (д, J=53 Гц, 1H), 4,74 (с, 2H), 3,85 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,76 (с, 3H).
Метил 3-(ацетилтиометил)-2,5-диметоксибензоат. К раствору метил 3-(хлорметил)-2,5-диметоксибензоата (22,20 г, 0,091 моль) в ТГФ (500,0 мл) при температуре окружающей среды добавляли тиоацетат калия (15,54 г, 0,136 моль). Реакционную смесь перемешивали при температуре 75°C в течение 18 ч. После завершения реакции растворитель удаляли при пониженном давлении с получением маслянистого остатка красного цвета, который обрабатывали насыщенным солевым раствором (500 мл), затем экстрагировали диэтиловым эфир (2×250 мл). Органические фазы объединяли, сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали досуха с получением метил 3-(ацетилтиометил)-2,5-диметоксибензоата в виде твердого вещества коричневого цвета (25,50 г, 0,09 моль, 99%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,10 мин; нет ионизации, площадь пика >92%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,12 (д, J=5,5 Гц, 1H), 7,10 (д, J=3,2 Гц, 1H), 4,10 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,74 (с, 3H), 3,70 (с, 3H), 2,35 (с, 3H).
Метил 3-(меркаптометил)-2,5-диметоксибензоат. К раствору метил 3-(ацетилтиометил)-2,5-диметоксибензоата (25,5 г, 89,68 ммоль) в сухом метаноле (800 мл) по каплям при температуре 0°C добавляли раствор метанолата натрия (5,81 г, 107,62 ммоль) в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 45 мин, затем гасили ионобменной смолой Dowex X8(H+) и перемешивали в течение 15 мин. После фильтрования растворитель упаривали при пониженном давлении с получением сырого продукта в виде масла коричневого цвета (который содержал желаемый продукт и соответствующий дисульфид соединение в соотношении 2:1). Остаток растворяли в ДМФ (400,0 мл) и обрабатывали дитиотреитолом (DTT) (33,95 г, 0,26 моль) в атмосфере азота. Реакционную смесь перемешивали при температуре 75°C в течение 18 ч. После завершения преобразования дисульфида в тиол растворитель упаривали. Полученный остаток растворяли в DCM (1 л), промывали насыщенным солевым раствором (7×500 мл), сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали досуха с получением гомогенного метил 3-(меркаптометил)-2,5-диметоксибензоата в виде масла коричневого цвета (21,40 г, 88,32 ммоль, 99%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,05 мин; m/z=243,1 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,19 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,09 (д, J=3,3 Гц, 1H), 3,83 (с, 3H), 3,76 (с, 3H), 3,73 (с, 3H), 3,71 (д, J=8,0 Гц, 2H), 2,93 (т, J=8,0 Гц, 1H).
Диметил 3,3'-(тиобис(метилен))бис(2,5-диметоксибензоат). К раствору метил 3-(меркаптометил)-2,5-диметоксибензоата (21,40 г, 88,32 ммоль) и метил 3-(хлорметил)-2,5-диметоксибензоата (22,69 г, 92,74 ммоль) в атмосфере азота добавляли триэтиламин (19,0 мл, 136,61 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 18 ч. После завершения реакции растворитель удаляли в вакууме с получением маслянистого остатка коричневого цвета, который обрабатывали водой (1 л), затем экстрагировали диэтиловым эфиром (3×500 мл). Органические фазы объединяли, промывали насыщенным солевым раствором (5×250 мл), сушили над Na2SO, фильтровали и концентрировали досуха с получением сырого продукта в виде масла коричневого цвета, который очищали хроматографией на силикагеле: элюирование проводили градиентом этилацетата (от 0 до 20%) в изогексане с получением диметил 3,3ʼ-(тиобис(метилен))бис(2,5-диметоксибензоат) в виде твердого вещества коричневого цвета (29,9 г, 66,37 ммоль, 76%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,22 мин; m/z=451,2 [M+H]+, площадь пика >92%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,12-7,08 (м, 4H), 3,83 (с, 6H), 3,76 (с, 4H), 3,73 (с, 6H), 3,67 (с, 6H).
3,3'-(Тиобис(метилен))бис(2,5-диметоксибензойная кислота). К раствору диметил 3,3'-(тиобис(метилен))бис(2,5-диметоксибензоат) (2,0 г, 4,44 ммоль) в ТГФ (100,0 мл) добавляли раствор моногидрата гидроксида лития (1,0 г, 23,83 ммоль) в воде (30,0 мл). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 48 ч. После завершения реакции в реакционную смесь добавляли воду (100 мл) и смесь промывали этилацетатом (100 мл). Водный слой подкисляли 1М соляной кислотой до pH=2 и экстрагировали этилацетатом (3×100 мл). Органические слои собирали, сушили (Na2SO4), фильтровали и концентрировали с получением 3,3'-(тиобис(метилен))бис(2,5-диметоксибензойной кислоты) в виде твердого вещества коричневого цвета (1,91 г, 4,11 ммоль, 93%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,93 мин; m/z=421,1 [M-H]-, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 12,96 (с, 2H), 7,10 (д, J=3,3 Гц, 2H), 7,08 (д, J=3,2 Гц, 2H), 3,76 (с, 4H), 3,73 (с, 6H), 3,69 (с, 6H).
3-[(2,5-Дигидрокси-3-карбоксифенил)метилтиометил]-2,5-дигидроксибензойная кислота. К раствору предшествующего тиоэфира (5,0 г, 0,01 моль) в DCM (200,0 мл) при температуре 0°C медленно добавляли 1M раствор трибромборана в DCM (100,7 мл, 0,101 моль) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 48 ч. После этого твердый продукт фильтровали, промывали DCM (500 мл) и затем суспендировали в растворе 1M соляной кислоты (50 мл). Полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 ч. Полученную суспензию коричневого цвета фильтровали и сушили с получением сырого продукта, который очищали обращенно фазовой колоночной хроматографией (25 г, MeCN:H2O от 5% до 95% в течение 12 CV) с получением 2,5-дигидрокси-3-[(2,5-дигидрокси-3-карбоксифенил)-метилтиометил]бензойной кислоты в виде твердого вещества белого цвета (1,1 г, 0,003 моль, 26%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,70 мин; m/z=365,1 [M-H]-, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,86 (с, 2H), 11,09 (с, 2H), 9,14 (с, 2H), 7,08 (д, J=3,1 Гц, 2H), 7,02 (д, J=3,1 Гц, 2H), 3,65 (с, 4H).
Пример:
62) 3-((2,5-Дигидрокси-3-карбоксифенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение IVc-058a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,70 мин; m/z=365,1 [M-H]-, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,86 (с, 2H), 11,09 (с, 2H), 9,14 (с, 2H), 7,08 (д, J=3,1 Гц, 2H), 7,02 (д, J=3,1 Гц, 2H), 3,65 (с, 4H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H15O8S: 367,04822, найдено: 367,04734.
Биологические данные: IVc-058a: FGF-1 IC50 [мкМ]=36; FGF-2 IC50 [мкМ]=4,9; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=83; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=0,53; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=77,04; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,29; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=43,5; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=10,6; IL-1β IC50 [мкМ]=27,5; IL-2 IC50 [мкМ]=3,82; IE-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,21; IL-9 IC50 [мкМ]=31,1; IL-10 IC50 [мкМ]=16,4; IL-12p70 IC50 [мкМ]=4,23; IL-13 IC50 [мкМ]=55,9; IL-17A IC50 [мкМ]=0,1; IL-17F IC50 [мкМ]=86,8; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=3,2; IL-33 IC50 [мкМ]=33,9; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,18; TNFβ IC50 [мкМ]=59,3.
Схема 23: X=SO2
Синтез из соединения IVc-058a
3-((2,5-Дигидрокси-3-карбоксифенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота. К раствору тиоэфира IVc-058a (4,25 г, 9,28 ммоль) в ДМФ (20,0 мл) медленно добавляли раствор 3-хлорбензен-1-карбоперокси кислота (mCPBA степень чистоты <77%, 5,80 г, 25,88 ммоль) в ДМФ (20,0 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч при температуре окружающей среды. Сырой продукт подвергали очистке ВЭЖХ (смотри общие условия) с получением твердого вещества белого цвета (3,20 г), который растирали в 1M HCl (50 мл) с получением желаемого продукта в виде твердого вещества белого цвета (2,55 г, 6,40 ммоль, 56%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,68 мин; m/z=397,1 [M-H]-, площадь пика >95%.
63) 3-((2,5-Дигидрокси-3-карбоксифенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота, соединение IVc-059a:
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,68 мин; m/z=397,1 [M-H]-, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 11,24 (с, 1H), 9,32 (с, 1H), 7,21 (д, J=3,1 Гц, 1H), 7,09 (д, J=3,1 Гц, 1H), 4,44 (с, 2H).
13C ЯМР (100 МГц, ДМСО-d6) δ 172,4, 153,4, 149,2, 117,4, 116,1 (CH), 113,3 (CH), 53,6 (CH2). МСВР: [M+H]+, вычисл. для C16H15O10S: 399,03804, найдено: 399,03775.
Биологические данные: IVc-059a: FGF-1 IC50 [мкМ]=6,7; FGF-2 IC50 [мкМ]=2,7; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=12; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=4,8; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=74; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=0,147; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=10; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=>100; IFNγ IC50 [мкМ]=4,34; IL-1β IC50 [мкМ]=38,6; IL-2 IC50 [мкМ]=21,2; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,11; IL-9 IC50 [мкМ]=0,4; IL-10 IC50 [мкМ]=1,31; IL-12p70 IC50 [мкМ]=42; IL-13 IC50 [мкМ]=>100; IL-17A IC50 [мкМ]=0,16; IL-17F IC50 [мкМ]=>100; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=1,87; IL-33 IC50 [мкМ]=27,5; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,16; TNFβ IC50 [мкМ]=0,33.
Сложный диметиловый эфир
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,94 мин; m/z=427,1 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,28 (с, 2H), 9,43 (с, 2H), 7,21 (д, J=3,1 Гц, 2H), 7,13 (д, J=3,1 Гц, 2H), 4,47 (с, 4H), 3,91 (с, 6H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C18H19O10S: 427,06934, найдено: 427,06942.
Биологические данные: IVc-059a-E2: FGF-1 IC50 [мкМ]=78; FGF-2 IC50 [мкМ]=94; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=200; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=2,7; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=45,67; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=2,64; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=50,5.
Сложный диметиловый эфир тетраацетат
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,05 мин; m/z=593,1 [M-H]-, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,75 (д, J=2,8 Гц, 2H), 7,53 (д, J=2,9 Гц, 2H), 4,65 (с, 4H), 3,81 (с, 6H), 2,31 (с, 6H), 2,23 (с, 6H).
МСВР: [M+H]+, вычисл. для C26H27O14S: 595,11160, найдено: 595,11149.
Биологические данные: IVc-059a-E2-A4: FGF-1 IC50 [мкМ]=54; FGF-2 IC50 [мкМ]=200; VEGF-A1 IC50 [мкМ]=25; ингибирование VEGFR-фосфорилирования IC50 [мкМ]=ND; PMN ROS [ингибирование при 0,3 мкМ [%]=29,17; PMN ROS ингибирование IC50 [мкМ]=4,13; ингибирование адгезии нейтрофилов [%]=87,5; цельная кровь: GM-CSF IC50 [мкМ]=1,83; IFNγ IC50 [мкМ]=3,5; IL-1β IC50 [мкМ]=14,1; IL-2 IC50 [мкМ]=10,4; IL-4 IC50 [мкМ]=>100; IL-5 IC50 [мкМ]=>100; IL-6 IC50 [мкМ]=0,99; IL-9 IC50 [мкМ]=2,9; IL-10 IC50 [мкМ]=16,8; IL-12p70 IC50 [мкМ]=51,4; IL-13 IC50 [мкМ]=18,7; IL-17A IC50 [мкМ]=0,02; IL-17F IC50 [мкМ]=25,8; IL-18 IC50 [мкМ]=>100; IL-21 IC50 [мкМ]=>100; IL-33 IC50 [мкМ]=23,2; TGFβ IC50 [мкМ]=>100; TNFα IC50 [мкМ]=0,3; TNFβ IC50 [мкМ]=19,4. Cs2CO3
Альтернативный масштабный синтез IVc-059a
Схема 24: синтез IVc-059a из 2,5-дибензилоксифтальальдегида
2,5-Бис(бензилокси)-3-(гидроксиметил)бензальдегид [стадия 1]: 2,5-Бис(бензилокси)-изофтальальдегид (25,0 г, 72,1 ммоль) (смотри схему 9b) растворяли в ТГФ (150 мл) и добавляли EtOH (15 мл). Раствор коричневого цвета выдерживали в положительном токе азота и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем по частям в течение 20 мин добавляли твердый NaBH4 (695 мг, 18,37 ммоль), внутренней температуре реакционной смеси не давали подняться выше 25°C (использовали водяную баню). Реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 мин, затем каждые 15 мин добавляли дополнительное количество NaBH4 до полного преобразования исходного вещества (всего: 107 мг, в две порции). Реакционную смесь затем выливали в воду (1,2 л) и перемешивали в течение 20 мин. Полученный таким образом осадок коричневого цвета выделяли путем фильтрования и полученный твердый продукт далее сушили в вакуумной печи при температуре 40°C до постоянной массы с получением указанного в заголовке соединения (22,9 г, 76% уточненный выход) в виде масла коричневого цвета. Профиль ЯМР показывал 83% желаемого продукта, 15% более восстановленного диола, 2% исходного продукта, вещество переносили на следующую стадию без дополнительной очистки. СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,19 мин, 86%, m/z=347,2 [M-H]- 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,11 (с, 1H), 7,52-7,28 (м, 11H), 7,19 (д, J=3,3 Гц, 1H), 5,34 (т, J=5,6 Гц, 1H), 5,15 (с, 2H), 4,99 (с, 2H), 4,60 (д, J=5,6 Гц, 2H).
2,5-Бис(бензилокси)-3-(гидроксиметил)бензойная кислота [стадия 2]: 2,5-Бис(бензилокси)-3-(гидрокси-метил)бензальдегид (44,3 г, 103 ммоль, 81%-ная чистота) и KH2PO4 (25,9 г, 190 ммоль) растворяли в ацетоне (440 мл) и водой (130 мл). Добавляли резорцин (21,0 г, 191 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. В течение 30 мин медленно добавляли раствор хлорита натрия (21,5 г, 191 ммоль) в воде (60 мл), не давая внутренней температуре подняться выше 25°C. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч и добавляли 2M водный раствор H3PO4 (95 мл). Смесь перемешивали в течение 20 мин и охлаждали до температуры 6°C на ледяно бане, затем фильтровали. Твердый продукт далее промывали водой до достижения pH фильтрата ~6. Полученный твердый продукт суспендировали в воде (приблизительно 300 мл) и добавляли заранее охлажденный (5-10°C) раствор NaOH (17 г, 412 ммоль) в воде (200 мл). Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем фильтровали на воронке с фильтром из спекшегося стекла. Выделенное твердое вещества далее промывали 1M водным NaOH (2×50 мл) и водой (50 мл). Щелочной маточный раствор затем подкисляли, используя заранее охлажденный водный раствор 6н HCl (5-10°C) до pH ~1. Полученную суспензию перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 20 мин, затем фильтровали, полученный твердый продукт далее сушили в вакуумной печи при температуре 40°C до постоянной массы с получением указанного в заголовке соединение в виде твердого вещества светло-желтого цвета (34,8 г, 88%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,06 мин, 99%, m/z=363,2 [M-H]-.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,02 (с, 1H), 7,51-7,31 (м, 10H), 7,28 (д, J=3,2 Гц, 1H), 7,22 (д, J=3,3 Гц, 1H), 5,21 (с, 1H), 5,12 (с, 2H), 4,88 (с, 2H), 4,53 (с, 2H).
Этил 2,5-бис(бензилокси)-3-(гидроксиметил)бензоат [стадия 3]: 2,5-Бис(бензилокси)-3-(гидроксиметил)бензойную кислоту (32,5 г, 89,3 ммоль) и Cs2CO3 (32,3 г, 99,2 ммоль) суспендировали в ДМФ (200 мл) и в реакционную смесь добавляли этилйодид (9,0 мл, 112 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 3 ч реакционную смесь выливали в насыщенный водный раствор NH4C1 (1 л) и добавляли твердый NaCl (~30 г). После перемешивания в течение 10 мин вещество экстрагировали EtOAc (2×500 мл). Собранный органический слой промывали насыщенным солевым раствором (2×500 мл), сушили сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением маслянистого остатка коричневого цвета (42,0 г, сырой, 89,3 ммоль). Сырое вещество переносили на следующую стадию без дополнительной очистки.
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,24 мин, 93%, m/z=слабая ионизация.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,51-7,32 (м, 10H), 7,31 (д, J=3,3 Гц, 1H), 7,22 (д, J=3,3 Гц, 1H), 5,24 (т, J=5,6 Гц, 1H), 5,13 (с, 2H), 4,87 (с, 2H), 4,54 (д, J=5,6 Гц, 2H), 4,26 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,24 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Этил 2,5-бис(бензилокси)-3-(хлорметил)бензоат (KI-14) [стадия 4]: Этил 2,5-бис(бензилокси)-3-(гидроксиметил)бензоат (42 г сырое вещество из предыдущей стадии, 89,3 ммоль) растворяли в DCM (200 мл) в инертной атмосфере (N2), затем при температуре 0°C (ледяная баня) добавляли SOCl2 (9,8 мл, 133,9 ммоль) и реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры. Через 2 ч летучие вещества удаляли при пониженном давлении с последующей азеотропной перегонкой с использованием толуола (3×100 мл), что приводило к полутвердому коричневому маслу (38,0 г, неочищенное, 89,3 ммоль).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,40 мин, 91%, m/z=слабая ионизация.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,54-7,26 (м, 12H), 5,14 (с, 2H), 4,95 (с, 2H), 4,71 (с, 2H), 4,28 (кв, J=7,1 Гц, 2H), 1,28-1,22 (т, J=7,1 Гц, 3H).
Бис(2,5-дибензилокси-3-этоксикарбонилфенилметил)сульфид [стадия 5]: К раствору KI-14 (38,0 г, сырое вещество, 89,3 ммоль) в ДМФ (420 мл) добавляли тиоацетамид (8,4 г, 111,8 ммоль), затем добавляли K2CO3-325 меш (16,7 г, 120,8 ммоль). Реакционную смесь нагревали при температуре 45°C в течение 48 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, затем добавляли тиоацетамид (2,5 г, 33,3 ммоль) и K2CO3-325 меш (5,0 г, 36,1 ммоль) и далее перемешивали при температуре 45°C в течение 18 ч до завершения реакции. Реакционную смесь выливали в воду (4 л). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин, затем добавляли EtOAc (2 л), затем твердый NaCl (~60 г). Фазы разделяли, затем дополнительно экстрагируют, используя EtOAc (1,5 л). Собранный органический слой промывали насыщенным солевым раствором (1,5 л), сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением сырого указанного в заголовке соединения (39,8 г, 44,6 ммоль) в виде масла коричневого цвета, которое использовали на следующей стадии без очистки.
UPЖХМС (кислотный метод, 2min): rt=1,57 мин, m/z=800,5 [M+NH4]+, площадь пика 77%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,46-7,17 (м, 24H), 5,05 (с, 4H), 4,83 (с, 4H), 4,23 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 3,73 (с, 4H), 1,20 (т, J=7,1 Гц, 6H).
Бис(2,5-дибензилокси-3-этоксикарбонилфенилметил)сульфон [стадия 6]: К раствору бис(2,5-дибензилокси-3-этоксикарбонилфенилметил)сульфида (39,8 г, сырой, 44,6 ммоль) в уксусной кислоте (850 мл) медленно добавляли 30 мас% раствора перекиси водорода (50 мл, 490 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Реакционную смесь выливали в лед/вода (5 л) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин затем добавляли EtOAc (2 л) и твердый NaCl (~40 г). После отделения фазы, водный слой экстрагировали еще раз EtOAc (1 л). Собранный органический слой промывали насыщенным солевым раствором (1,5 л), сушили над Na2SO4, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением твердого вещества коричневого цвета. Твердый продукт суспендировали в MTBE (250 мл) и перемешивали с помощью магнитной мешалки в течение 30 мин, затем фильтровали и далее растирали в MTBE (150 мл) с получением указанного в заголовке соединение (23,56 г, 28,9 ммоль, 64%-ный выход в течение 4 стадии).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,48 мин; m/z=832,5 [M+NH4]+, площадь пика 96%
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 7,50-7,24 (м, 24H), 5,08 (с, 4H), 4,85 (с, 4H), 4,50 (с, 4H), 4,26 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 1,25-1,17 (м, 6H).
Бис(2,5-дибензилокси-3-карбоксифенилметил)сульфон [стадия 7]: Раствор гидроксида лития (9,7 г, 233 ммоль) в воде (100 мл) добавляли к раствору бис(2,5-дибензилокси-3-этоксикарбонилфенилметил)сульфона (33,3 г, 38,8 ммоль) в ТГФ (350 мл) и полученную смесь перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 18 ч. После этого времени большую часть ТГФ удаляли при пониженном давлении, что приводило к суспензии белого цвета. После добавления воды (3 л) и водного раствора гидроксида натрия (1M, 1 л) смесь оставалась суспензией. Суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч и водный слой подкисляли до pH~1 путем добавления раствора 6M соляной кислотой и полученное твердое вещество собирали путем фильтрования и промывали водой до тех пор, пока жидкости не становились нейтральными, полученное таким образом твердое вещество белого цвета далее сушили в вакуумной печи при температуре 40°C до постоянной массы с получением указанного в заголовке соединения в виде белого твердого вещества (29,4 г, 38,7 ммоль, 99%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,39 мин; m/z=757,1 [M-H]-, площадь пика 100%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,23 (с, 2H), 7,47-7,25 (м, 24H), 5,08 (с, 4H), 4,88 (с, 4H), 4,48 (с, 4H).
Бис(2,5-дигидрокси-3-карбоксифенилметил)сульфон [стадия 8], IVc-059a: К суспензии бис(2,5-дибензилокси-3-карбоксифенилметил)сульфона (10,08 г, 13,28 ммоль) в EtOH (140 мл) и ТГФ (140 мл) добавляли палладий на угле (20 мас%, 2 г) в виде суспензии в воде (20 мл). После нескольких циклов вакуум/водород смесь выдерживали в атмосфере H2 при температуре 25°C и перемешивали в течение 20 ч. После завершения реакции смесь фильтровали через целит®, используя ТГФ. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением твердого вещества не совсем белого цвета. Остаток затем суспендировали в ацетонитриле (100 мл) и нагревали при температуре кипения с обратным холодильником при перемешивании с помощью магнитной мешалки, смесь затем охлаждали до температуры -5°C, затем фильтровали и потом промывали холодным ацетонитрилом. Продукт далее сушили в вакуумной печи при температуре 40°C до постоянной массы с получением желаемого продукта в виде твердого вещества белого цвета (5,35 г, 12,78 ммоль, 96%).
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,67 мин; m/z=397,1 [M-H]-, площадь пика 100%
Данные ЯМР: смотри выше.
Пример 1.12-Молекулы типа V: Эталонные соединения
Диамиды, полученные из 5-гидроксиизофталевой кислоты, 2 примера
Схемы синтеза и способы
Схема 25: синтез V-001a
Образование амидной связи
Смотри общий способ B для связывания амида [3B] с использованием анилина A (2 моль) или метил 5-аминосалицилата
Способы удаления защитных групп: смотри общие способы [4], [5]
Подробности смотри на фигуре 8
Например
64) Бис-N-(4-карбокси-2,5-дигидроксифенил)амид 5-гидроксиизофталевой кислоты (V-001a)
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=0,72 мин; m/z=483,0 [M+H]+, площадь пика >95%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,28 (с, 1H), 9,83 (с, 2H), 9,48 (с, 2H), 7,92 (с, 1H), 7,68 (с, 2H), 7,52 (д, J=1,5 Гц, 2H), 7,30 (с, 2H).
Сложный диэтиловый эфир
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 2 мин): rt=1,09 мин; m/z=539,2 [M-H]-, площадь пика 94%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,23 (с, 2H), 9,92 (с, 2H), 9,49 (с, 2H), 7,91 (с, 1H), 7,73 (с, 2H), 7,51 (д, J=1,5 Гц, 2H), 7,32 (с, 2H), 4,35 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 1,34 (т, J=7,1 Гц, 6H).
65) Бис-N-(3-карбокси-4-гидроксифенил)амид 5-гидроксиизофталевой кислоты (V-002a)
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,00 мин; m/z=451,1 [M-H]-, площадь пика 97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,31 (с, 2H), 10,11 (с, 1H), 8,28 (д, J=2,7 Гц, 2H), 7,98 (м, 1H), 7,89 (дд, J=9,0, 2,7 Гц, 2H), 7,50 (д, J=1,5 Гц, 2H), 6,97 (д, J=9,0 Гц, 2H).
Звенья гентизиновой кислоты, связанные с мочевиной, 1 пример
Схема синтеза и способы
Схема 26: синтез V-003a
Образование мочевинной связи
Способ исходя из KI-1:
N,N'-Бис(2,5-дибензилокси-4-этоксикарбонилфенил)мочевина. В охлаждаемый раствор (ледяная баня) 2,5-бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)бензойной кислоты (KI-1) (2,0 г, 4,9 ммоль) и Et3N (1,6 мл, 11,3 ммоль) в ТГФ (25 мл) в инертной атмосфере (N2) медленно добавляли DPPA (1,1 мл, 5,2 ммоль). Смесь медленно нагревали до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре в течение 3 ч. Затем добавляли tBuOH (8 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Реакционный профиль показывал большую часть продукта связывания мочевины вместо желаемого Вос-анилина. Смесь выливали в насыщенный водный раствор гидрокабоната натрия (250 мл) и перемешивали в течение 5 мин, затем экстрагировали EtOAc (3×50 мл). Объединенные органические слои сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением бесцветного масла. Остаток очищали с помощью флеш хроматографии (изогексан/EtOAc 1:0, затем градиент до 30% EtOAc) с получением указанного в заголовке соединение (1,1 г, 56%) в виде твердого вещества не совсем белого цвета.
СВЭЖХ-МС (основной метод, 2 мин): rt=1,50 мин; m/z=781,2 [M+H]+, площадь пика 85%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 9,49 (с, 2H), 8,18 (с, 2H), 7,58-7,45 (м, 8H), 7,43-7,35 (м, 8H), 7,35-7,28 (м, 6H), 5,27 (с, 4H), 5,11 (с, 4H), 4,22 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 1,24 (т, J=7,1 Гц, 6H).
Способы удаления защитных групп: смотри общие способы [4], [5]
Подробности смотри на фигуре 8
Например
66) N,N'-Бис(2,5-дигидрокси-4-карбоксифенил)мочевина (V-003a)
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=0,90 мин; m/z=363,1 [M-H]-, площадь пика 93%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 13,36 (с, 2H), 10,86 (с, 2H), 9,64 (с, 2H), 9,48 (с, 2H), 7,77 (с, 2H), 7,17 (с, 2H).
Сложный диэтиловый эфир
СВЭЖХ-МС (кислотный метод, 4 мин): rt=1,79 мин; m/z=419,2 [M-H]-, площадь пика 97%.
1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 10,26 (с, 2H), 9,74 (с, 2H), 9,53 (с, 2H), 7,81 (с, 2H), 7,20 (с, 2H), 4,32 (кв, J=7,1 Гц, 4H), 1,33 (т, J=7,1 Гц, 6H).
Пример 1.13: Образование солей
a) Твердые вещества.
Общий протокол: соли получали в виде твердых веществ путем добавления соответствующего количества эквивалента основания к растворам или суспензиям желаемых соединений в воде, обработки ультразвуком до полного растворения, при необходимости доводя рН до значений от 7,0 до 7,4 путем добавления водного раствора HCl или избытка основания, затем лиофилизируя раствор. Альтернативно некоторые соли можно получить растворением в ДМСО с последующим осаждением этанолом (IIc-007a). Твердые вещества получали из следующих оснований: гидроксид натрия, диэтиламин (DEA), лизин (Lys), менлумин (Meg), триэтаноламин (TEA).
Например:
Натриевые и диэтиламмониевые (DEA) соли Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a в виде твердых веществ получали по общему протоколу без регулирования pH.
- Примерная растворимость в воде:
Ic-007a-DEA2: <10 мг/мл
Ic-007a-DEA3: >20 мг/мл
IIc-007a-DEAl: >10 мг/мл
IIc-007a-DEA2: >20 мг/мл
IIIc-061a-DEA3: >25 мг/мл
- Стабильность свободных кислот и солей в твердом состоянии:
Свободные кислоты Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a и следующие соли Ic-007a-DEA2, IIc-007a-DEA2, IIIc-061a-DEA3 были стабильны в твердом состоянии до 56 дней при температуре 4°C, 20°C и 40°C; соль Ic-007a-DEA3 была стабильна при тех же температурах до 36 дней.
b) Растворы
Общий протокол: соли получали в виде растворов путем добавления соответствующего количества эквивалента основания к растворам или суспензиям желаемых соединений в воде, обработки ультразвуком до полного растворения, при необходимости доводя рН до значений от7,0 и 7,4 путем добавления водного раствора HCl или лишняя база. Были исследованы следующие основания: этиламин, триэтиламин, этилендиамин, диэтаноламин, триэтаноламин, холин, меглумин, лизин и аргинин.
Например:
Соли Ic-007a:
Растворимые соли были получены с меглюмином, лизином и диэтаноламином после перемешивания смеси в течение 2 дней при температуре 40°C. Твердую форму соли Ic-007a-Lys2 получали осаждением из раствора ДМСО этанолом. Соль была стабильна в виде раствора в воде не менее 7 дней при комнатной температуре.
Соли IIc-007a:
DEAl-соль: в небольшом масштабе монодиэтиламмониевую соль получали по общей методике без регулирования pH. Растворимость: 17,4 мг/мл в сравнении с 1,8 мг/мл для исходной двухосновной кислоты.
Масштабный способ и характеристика:
К IIc-007a (20 г, 42,7 ммоль) добавляли EtOH (200 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре с получением взвеси. Загружали DEA (4,4 мл, 42,7 ммоль) и реакционную смесь нагревали при температуре 50°C в течение 2 ч. Партию охлаждали до комнатной температуры и твердые продукты отфильтровывали. Слой на фильтре промывали EtOH (50 мл) и сушили в печи при температуре 40°C с получением 21,5 г моно-DEA соли в виде твердого вещества желтого цвета с 98%-ным выходом. ЯМР: 1,6% EtOH, 1,04 экв. DEA. ВЭЖХ: 99,6%.
Данные твердотельного состояния для моно-DEA соли IIc-007a показывали четкую кристаллическую структуру в порошковом рентгеноструктурном анализе. Кривая ТГА показала потерю незначительного количества EtOH <120°C, что указывает на то, что EtOH может высохнуть при температуре 60-80°C. Затем наблюдали потерю DEA (теоретически 13,5 мас.% для соли 1:1), связанную с эндотермой расплава в DSC (пик при температуре 273,8°C), за которой следует расплав в форме свободной кислоты.
DEA2-соль, pH отрегулирован: получена общим способом с доведением pH (дополнительно 0,51 экв. Et2NH требуется для достижения pH=7,25). Соль в растворе демонстрирует явное разложение через 21 день при 40°C и обширное разложение через 24 часа при 80°C.
DEA2-соль, pH не отрегулирован: получена общим способом без доведения pH. pH раствора=5,87. Соль в растворе не демонстрирует разложение после 21-ый день при температуре 4°C, 20°C и 40°C.
Lys2-соль, pH не отрегулирован: получена общим способом, используя 2 эквив. L-лизина. pH раствора=5,74.
ПРИМЕЧЕНИЕ: по аналогии с (N-метил)амидом 2-гидроксиизофталевой кислоты (pKa фенола=6,81), группа 2-OH of ядра изофталевого бисамида IIc-007a является очень кислой, и ее ионизация приводит к деградация молекулы. Этот эффект не наблюдается для Ic-007a (ожидаемый pKa фенольных функций в диапазоне 9,8-10,0). Таким образом, важно не регулировать pH растворов дикатионовых солей IIc-007a.
Соли IIIc-061a:
DEA3-соль, pH отрегулирован: получена общим способом, используя 3 эквив. Et2NH с установлением pH (дополнительно 0,8 экв. HCl (0,5 М) требуется для достижения конечного pH=7,22). Соль в растворе не демонстрирует разложение после 21-го дня при температуре 4°C, 20°C, и легкое разложение при температуре 40°C после 33-го дня.
Meg3-соль, pH отрегулирован: получена общим способом, используя 3 эквив. менлумина с установлением pH до конечного pH=7,22 (HCl 0,5M). Соль в растворе не демонстрирует разложение после 21-го дня при температуре 4°C, 20°C и 40°C после 14-го дня.
Соли IVc-059a,
DEA2-соль, pH отрегулирован: получена общим способом с доведением pH (для достижения pH=7,3 требуется 0,32 дополнительных экв. Et2NH). Соль в растворе проявляет стабильность через 26 дня при температуре 4°C, 20°C и 40°C.
Пример 1.14: Пролекарства
Пролекарства Ic-007a
1) 2-Морфолиноэтил 5-[[2,5-дигидрокси-4-[[4-гидрокси-3-(2-морфолиноэтоксикарбонил)фенил]карбамоил]бензоил]амино]-2-гидроксибензоат (Ic-007a-mpe2)
Этерификация. Суспензию 5-[[2,5-дибензилокси-4-[(3-карбокси-4-гидроксифенил)карбамоил]бензоил]амино]-2-гидрокси-бензойной кислоты (130 мг, 0,2 ммоль) в N, N-диметилформамиде (4 мл) перемешивали при комнатной температуре. Добавляли N, N-диметилпиридин-4-амин (49 мг, 0,4 ммоль) и раствор 2-морфолиноэтанола (53 мг, 0,4 ммоль) в N, N-диметилформамиде (0,5 мл). Добавляли гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (115 мг, 0,6 ммоль) и реакционную смесь нагревали в микроволновом реакторе при температуре 60°C в течение 1,5 часов. Реакционную смесь фильтровали, фильтрат разбавляли тетрагидрофураном и растворитель упаривали. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, элюируя 0-40% метанолом в дихлорметане с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества белого цвета (80 мг, 45%). ЖХМС (m/z) [M+H] 875,1.
Гидрирование: Готовили раствор сложного диэфира, полученного выше (80 мг, 0,092 ммоль), в тетрагидрофуране (12 мл) и воде (4 мл) и добавляли 10%-ный палладий на углероде (50 мг, 10%-ная паста). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 17 часов. Катализатор удаляли путем фильтрования и растворитель упаривали. Остаток очищали обращенно фазовой препаративной ВЭЖХ на колонке C18, используя градиент от 10-97% (ацетонитрил+0,1%-ная муравьиная кислота):(вода+0,1%-ная муравьиная кислота). Остаток растирали в диэтиловом эфире и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке соединения Ic-007a-mpe2 в виде твердого вещества желтого цвета (22 мг, 35%).
1H ЯМР(d6-ДМСО, м. д.) δ 11,16-11,00 (шир. с, 1H), 10,46 (с, 1H), 10,45-10,15 (шир. с, 1H), 8,25 (д, J=2,7 Гц, 1H), 7,77 (дд, J=9,0, 2,7Гц, 1H), 7,53 (с, 1H), 7,01 (д, J=9,0 Гц, 1H), 4,46 (т, J=5,4 Гц, 2H), 3,62-3,56 (м, 4H), 2,77-2,69 (м, 2H), 2,56-2,50 (м, 4H, частично перекрыт пиком ДМСО). ЖХМС (m/z) [M+H] 695,0.
2) 5-[[2,5-Дигидрокси-4-[[4-гидрокси-3-(2-морфолиноэтокси-карбонил)фенил]карбамоил]бензоил]амино]-2-гидроксибензойная кислота (Ic-007a-mpel)
Этерификация. Раствор 5-[[2,5-дибензилокси-4-[(3-карбокси-4-гидроксифенил)карбамоил]бензоил]амино]-2-гидрокси-бензойной кислоты (324 мг, 0,5 ммоль) и триэтиламина (101 мг, 0,15 мл, 1 ммоль) в N, N-диметилформамиде (7 мл) перемешивали при комнатной температуре. Добавляли раствор 2-морфолиноэтанола (66 мг, 0,5 ммоль) в N, N-диметилформамиде (1 мл) и N, N-диметилпиридин-4- амин (122 мг, 1 ммоль). Добавляли гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (115 мг, 0,6 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, затем нагревали в микроволновом реакторе при температуре 60°C в течение 4 часов. Реакцию повторяли в таком же масштабе и реакционные смеси объединяли. Растворитель упаривали и остаток растирали в диэтиловом эфире с получением смеси сложных моно и диэфиров (230 мг). ЖХМС (m/z) [M+H] 762,0 (сложный моноэфир).
Гидрирование. Смесь сложных моно и диэфиров (230 мг), полученных выше, растворяли в уксусной кислоте (10 мл), тетрагидрофуране (15 мл) и воде (5 мл) и добавляли 10%-ный палладий на углероде (150 мг, 10%-ная паста). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 16 часов. Катализатор удаляли путем фильтрования и растворитель упаривали с получением смолы желтого цвета (140 мг). Остаток очищали обращенно фазовой препаративной ВЭЖХ на колонке C18, используя градиент от 10-70% (ацетонитрил+0,1%-ная муравьиная кислота): (вода+0,1%-ная муравьиная кислота). Остаток растирали в диэтиловом эфире и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке сложного моноэфира Ic-007a-mpel в виде твердого вещества желтого цвета (11 мг).
1H ЯМР (d6-ДМСО, м. д.) δ 11,33-11,29 (шир. с, 1H), 11,13-10,08 (шир. с, 1H), 10,50-10,44 (шир. с, 2H), 10,36-10,30 (шир. с, 1H), 8,25 (д, J=2,4 Гц, 1H), 8,06-8,02 (м, 1H), 7,78 (дд, J=9,0, 2,4Гц, 1H), 7,69-7,60 (м, 2H), 7,52 (с, 1H), 7,01 (д, J=9,0 Гц, 1H), 6,75 (д, J=8,7 Гц, 1H), 4,50-4,45 (м, 2H), 3,65-3,55 (м, 4H), 2,81-2,71 (м, 2H), 2,60-2,50 (м, 4H, частично перекрыт пиком ДМСО). ЖХМС (m/z) [M+H] 582,0.
3) 1-(2,2-Диметилпропаноилокси)этил 5-[[4-[[3-[1-(2,2-диметилпропаноилокси)этоксикарбонил]-4-гидрокси-фенил]карбамоил]-2,5-дигидрокси-бензоил]амино]-2-гидрокси-бензоат (Ic-007a-pive2) и
4) 5-[[4-[[3-[1-(2,2-Диметилпропаноилокси)этоксикарбонил]-4-гидрокси-фенил]карбамоил]-2,5-дигидрокси-бензоил]амино]-2-гидроксибензойная кислота (Ic-007a-pivel)
Этерификация. Раствор 5-[[2,5-дибензилокси-4-[(3-карбокси-4-гидрокси-фенил)карбамоил]бензоил]амино]-2-гидроксибензойной кислоты (324 мг, 0,5 ммоль) и триэтиламина (152 мг, 0,21 ммоль) в N, N-диметилформамиде (10 мл) перемешивали при температуре 0°C и добавляли 1-йодэтил 2,2-диметилпропаноат (572 мг, 2 ммоль). Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Диметилформамид упаривали и остаток распределяли между дихлорметаном и водным раствором метабисульфита натрия. Органическую фазу сушили над безводным сульфатом магния и упаривали с получением смеси 1:1 сложных моно и диэфиров (187 мг). Реакцию повторяли и смеси 1:1 сложных эфиров объединяли. ЖХМС (m/z) [M+H] 777,0 (сложный моноэфир) и 905,1 (сложный диэфир).
Гидрирование
Смесь сложных моно и диэфиров (320 мг), полученных выше, растворяли в тетрагидрофуране (50 мл) и воде (5 мл) и добавляли 10%-ный палладий на углероде (300 мг, 10%-ная паста). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 20 часов. Катализатор удаляли путем фильтрования и растворитель упаривали. Данные ЖХМС указывали, что достигалось лишь частичное удаление защитных групп. Остаток растворяли в тетрагидрофуране (36 мл) и воде (6 мл) и добавляли 10%-ный палладий на углероде (600 мг, 10%-ная паста). Реакционную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение 22 часов. Катализатор удаляли путем фильтрования и растворитель упаривали. Остаток очищали обращенно фазовой препаративной ВЭЖХ на колонке C18, используя градиент от 40-97% (ацетонитрил+0,1%-ная муравьиная кислота):(вода+0,1%-ная муравьиная кислота). Остатки растирали в диэтиловом эфире и сушили в вакууме с получением указанных в заголовке соединений:
Сложный диэфир (Ic-007a-pive2): твердое вещество желтого цвета (60 мг). 1H ЯМР (d6-ДМСО, м. д.) δ 11,05 (с, 1H), 10,46 (с, 1H), 10,18 (с, 1H), 8,18 (шир. с, 1H), 7,83-7,77 (м, 1H), 7,52 (с, 1H), 7,05-6,96 (м, 2H), 1,58 (д, J=5,5 Гц, 3H), 1,17 (с, 9H). ЖХМС (m/z) [M+H] 724,9.
Биологические данные: T1/2 (плазма мыши): 62,2 мин (расщепленный сложный эфир; 65% оставшегося через 1 ч); T1/2 (плазма человека): >180 мин.
Сложный моноэфир (Ic-007a-pivel): твердое вещество желтого цвета (35 мг). 1H ЯМР (d6-ДМСО, м. д.) δ 11,13 (с, 1H), 11,06 (с, 1H), 10,46 (с, 1H), 10,42 (с, 1H), 10,18 (с, 1H), 8,21-8,18 (м, 2H), 8,78-8,72 (м, 2H), 7,55 (с, 1H), 7,52 (с, 1H), 7,03-6,92 (м, 3H), 1,58 (д, J=5,5 Гц, 3H), 1,17 (с, 9H). ЖХМС (m/z) [M+H] 596,9
Биологические данные: T1/2 (плазма мыши): 44,6 мин (расщепленный сложный эфир; 49% оставшегося через 1 ч); T1/2 (плазма человека): >180 мин.
Пролекарства IIc-007a
1) 2,2-Диметилпропаноилоксиметил 5-[[3-[[3-(2,2-диметилпропаноилоксиметоксикарбонил)-4-гидрокси-фенил]карбамоил]-2,5-дигидрокси-бензоил]амино]-2-гидрокси-бензоат (IIc-007a-pivm2)
Этерификация. Готовили раствор 5-[[2,5-дибензилокси-3-[(3-карбокси-4-гидрокси-фенил)карбамоил]бензоил]амино]-2-гидрокси-бензойной кислоты (280 мг, 0,432 ммоль) в N, N-диметилформамиде и добавляли хлорметил 2,2-диметилпропаноат (137 мкл, 0,95 ммоль), затем триэтиламин (167 мкл, 1,2 ммоль)) и йодид натрия (143 мг, 0,95 ммоль). Перемешиваемый раствор нагревали при температуре 50°C в течение 18 часов. Раствор затем охлаждали и распределяли между насыщенным раствором хлорида аммония и этилацетатом. Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, используя градиент от 100% изогексана до 50% этилацетата, 50% изогексана с получением сложного диэфира в виде бесцветной смолы (192 мг, 51%). ЖХМС (m/z) [M+H] 876,9.
Гидрирование: Готовили раствор сложного диэфира, полученного выше (192 мг, 0,219 ммоль), в тетрагидрофуране (4,5 мл) и добавляли к перемешиваемой суспензии 10%-ного палладия на углероде (40 мг, 0,04 ммоль) в воде (1,5 мл). Перемешиваемую реакционную смесь помещали в атмосферу водорода на 18 часов.
Реакционную смесь фильтровали для удаления катализатора и раствор упаривали с получением твердого вещества кремового цвета (142 мг). Твердый продукт очищали с помощью ВЭЖХ на колонке C18, используя градиент от 60% ацетонитрила, 40% воды до 100% ацетонитрила (0,1%-ная муравьиная кислота) с получением указанного в заголовке сложного диэфира IIc-007a-pivm2 в виде твердого вещества белого цвета (75 мг, 49%). 1H ЯМР (ДМСО-d6, м. д.) δ 13,03 (шир. с, 1H), 10,43 (шир. с, 2H), 10,16 (с, 2H), 9,52 (шир. с, 1H 8,17 (д, J=2,7Гц, 2H), 82 (дд, J=8,9Гц, 2,7Гц, 2H), 7,55 (с, 2H),02 (д, J=8,9Гц, 2H), 5,98 (с, 4H), 1,17 (с, 18H). ЖХМС (m/z) [M-H] 694,9.
2) 5-[[3-[[3-[1-(2,2-Диметилпропаноилокси)этоксикарбонил]-4-гидроксифенил]карбамоил]-2,5-дигидроксибензоил]амино]-2-гидроксибензойная кислота (IIc-007a-pive1)
Этерификация. Раствор 5-[[2,5-дибензилокси-3-[(3-карбокси-4-гидроксифенил)карбамоил]бензоил]амино]-2-гидроксибензойной кислоты (324 мг, 0,5 ммоль) и триэтиламина (101 мг, 0,14 мл, 1,0 ммоль) в N, N-диметилформамиде (10 мл) перемешивали при температуре 0°C. Добавляли 1-йодэтил 2,2-диметилпропаноат (154 мг, 0,6 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 21 часов. При комнатной температуре в течение 1 часа добавляли дополнительное количество триэтиламина (0,14 мл, 1,0 ммоль) и 1-йодэтил 2,2-диметилпропаноата (154 мг, 0,6 ммоль) и реакционную смесь перемешивали. Растворитель упаривали. Остаток распределяли между дихлорметаном и раствором метабисульфита натрия. Органические экстракты объединяли, промывали насыщенным солевым раствором и сушили, пропуская раствор через гидрофобную фритту. Фильтрат упаривали с получением смесь сложных моно и диэфиров. Остаток очищали хроматографией на силикагеле, элюируя 5-100% этилацетатом в изогексане, затем 10% метанолом в дихлорметане с получением сложного моноэфира в виде твердого вещества желтого цвета (121 мг). ЖХМС (m/z) [M+H] 777.
Гидрирование. Раствор сложного моноэфира, полученного выше (121 мг, 0,15 ммоль), в тетрагидрофуране (16 мл) и воде (4 мл), содержащий 10%-ный палладий на углероде (250 мг, 10%-ная паста), перемешивали в атмосфере водорода в течение 18 часов. Катализатор удаляли фильтрацией и растворитель упаривали. Остаток очищали обращенно фазовой препаративной ВЭЖХ, используя градиент от 40-97% (ацетонитрил+0,1%-ная муравьиная кислота):(вода+0,1%-ная муравьиная кислота) с получением сложного моноэфирного IIc-007a-pivel в виде твердого вещества желтого цвета (34 мг). 1H ЯМР (ДМСО-d6, м. д.) δ 13,15 (шир. с, 1H), 10,47 (шир. с, 2H), 10,18 (с, 1H), 9,47 (шир. с, 1H), 8,21 (д, J=3 Гц 1H), 8,17 (д, J=3 Гц 1H), 7,82 (дд, J=9, 3 Гц 1H), 7,78 (дд, J=9, 3 Гц 1H), 7,59-7,55 (м, 2H), 7,03 (д, J=9 Гц 1H), 6,99 (кв, J=5,4 Гц 1H), 7,96 (д, J=9 Гц 1H), 1,58 (д, J=5,4 Гц, 3H), 1,17 (с, 9H). ЖХМС (m/z) [M-H] 595,1.
Пролекарства IVc-059a
1) 2,5-Дигидрокси-3-[[2,5-гидрокси-3-(2-морфолиноэтокси-карбонил)фенил]метилсульфонилметил]бензойная кислота (IVc-059a-mpel)
Этерификация. Готовили раствор 2,5-дибензилокси-3-[(2,5-дибензилокси-3-карбоксифенил)метилсульфонилметил]бензойной кислоты (300 мг, 0,40 ммоль) и 2-морфолиноэтанола (53 мг, 0,40 ммоль) в N, N-диметилформамиде (93 мл) и добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC, 93 мг, 0,48 ммоль) и N, N-диметилпиридин-4-амин (10 мг, 0,08 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Полученный раствор упаривали досуха и остаток очищали с помощью ВЭЖХ на колонке C18, используя градиент от 30% ацетонитрила, 70% воды до 100% ацетонитрила (0,1%-ная муравьиная кислота) с получением сложного морфолиноэтилового эфира в виде бесцветной смолы (111 мг, 32%). ЖХМС (m/z) [M+H] 872,1.
Гидрирование. Раствор сложного моноэфира выше (111 мг, 0,127 ммоль) в тетрагидрофуране (3 мл) добавляли к перемешиваемой суспензии 10%-ного палладия на углероде (20 мг, 0,019 ммоль) в воде (1 мл). Перемешиваемую реакционную смесь помещали в атмосферу водорода на 18 часов.
Реакционную смесь фильтровали для удаления катализатора и раствор упаривали с получением твердого вещества коричневого цвета. Твердый продукт очищали с помощью ВЭЖХ на колонке C18, используя градиент от 10% ацетонитрила, 90% воды до 60% ацетонитрила, 40% воды (0,1%-ная муравьиная кислота) с получением твердого вещества белого цвета (20,5 мг). Твердый продукт растирали в диэтиловом эфире и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке соединения IVc-059a-mpel в виде твердого вещества белого цвета (5 мг, 8%).
1H ЯМР (ДМСО-d6, м. д.) δ 10,33 (шир. с, 1H), 9,30 (с, 1H) 8,92 (с, 1H), 7,08-7,15 (м, 3H), 6,91 (д, J=3,1Гц, 1H), 4,40 (т, J=5,0Гц, 2H), 4,36 (с, 2H), 3,65-3,72 (м, 4H), 3,05 (т, J=5,0Гц, 2H), 2,78-2,87 (м, 4H). ЖХМС (m/z) [M+H] 511,9.
Биологические данные: стабилен до 60 мин в плазме мыши
2) 2-Морфолиноэтиловый эфир (2,5-дигидрокси-3-[[2,5-гидрокси-3-(2-морфолиноэтоксикарбонил)фенил]-метилсульфонилметил]бензойной кислоты (IVc-059a-mpe2)
Готовили раствор 2,5-дибензилокси-3-[(2,5-дибензилокси-3-карбоксифенил)метилсульфонилметил]бензойной кислоты (69 мг, 0,091 ммоль) и 2-морфолиноэтанола (25 мг, 0,19 ммоль) в N, N-диметилформамиде (1 мл) и добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (42 мг, 0,48 ммоль) и N, N-диметилпиридин-4-амин (5 мг, 0,04 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Полученный раствор упаривали досуха и остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, используя 10% метанол, 90% дихлорметан с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветной смолы (58 мг, 65%). ЖХМС (m/z) [M+H] 985,0.
Готовили раствор сложного диэфира, полученного выше (58 мг, 0,059 ммоль), в тетрагидрофуране (1,5 мл) и добавляли к перемешиваемой суспензии 10%-ного палладия на углероде (5 мг, 0,005 ммоль) в воде (0,5 мл). Перемешиваемую реакционную смесь помещали в атмосферу водорода на 18 часов. Реакционную смесь фильтровали для удаления катализатора и раствор упаривали с получением твердого вещества коричневого цвета. Твердый продукт очищали с помощью ВЭЖХ на колонке C18, используя градиент от 10% ацетонитрила, 90% воды до 60% ацетонитрила, 40% воды (0,1%-ная муравьиная кислота) с получением твердого вещества белого цвета (13,7 мг).
Твердый продукт растирали в диэтиловом эфире и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке соединения IVc-059a- mpe2 в виде твердого вещества белого цвета (9,1 мг, 25%).
1H ЯМР (CD3OD, м. д.) δ 8,34 (шир. с, 2H), 7,32 (д, J=3,1Гц, 2H), 7,16 (д, J=3,1Гц, 2H), 4,52 (т, J=5,5Гц, 4H), 4,45 (с, 4H), 3,68-3,73 (м, 8H), 2,83 (т, J=5,5Гц, 4H), 2,58-2,65 (м, 8H). ЖХМС (m/z) [M+H] 625,0.
Биологические данные: стабилен до 60 мин в плазме мыши; T1/2 (плазма человека): >180 мин.
3) 1-(2,2-Диметилпропаноилокси)этиловый эфир 3-[[3-[1-(2,2-диметилпропаноилокси)этоксикарбонил]-2,5-дигидроксифенил]-метилсульфонилметил]-2,5-дигидроксибензойной кислоты (IVc-059a-pive2)
Этерификация. Готовили раствор 2,5-дибензилокси-3-[(2,5-дибензилокси-3-карбоксифенил)метилсульфонилметил]бензойной кислоты (200 мг, 0,263 ммоль) в безводном N, N-диметилформамиде (5 мл) и добавляли триэтиламин (88 мкл, 0,63 ммоль), йодид натрия (8 мг, 0,053 ммоль) и сырой 1-йодэтил 2,2-диметилпропаноат (прибл. 4,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Полученный раствор упаривали до небольшого объема и остаток распределяли между дихлорметаном и раствором тиосульфата натрия. Органический слой фильтровали через гидрофобную фритту и упаривали. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, элюируя градиентом от 100% изогексана до смеси 50:50 этилацетат/изогексан с получением сложного диэфира в виде бесцветной смолы (110 мг, 41%). ЖХМС (m/z) [M+Na] 1037,0
На той же колонке выделяли также сложный моноэфир в виде бесцветной смолы (90 мг, 40%). ЖХМС (m/z) [M+Na] 909,6.
Гидрирование:
Раствор of сложный диэфир выделенного выше (110 мг, 0,108 ммоль) в тетрагидрофуране (3 мл) добавляли к перемешиваемой суспензии 10%-ного палладия на углероде (20 мг, 0,02 ммоль) в воде (1 мл). Перемешиваемую реакционную смесь помещали в атмосферу водорода на 48 часов. Реакционную смесь фильтровали для удаления катализатора, раствор упаривали и остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, элюируя градиентом от 100% дихлорметана до 10% метанола, 90% дихлорметана с получением указанного в заголовке соединения IVc-059a-pive2 в виде твердого вещества кремового цвета (55 мг, 78%).
1H ЯМР (CDCl3, м. д.) δ 10,55 (с, 2H), 7,24-7,28 (м, 2H), 7,14-7,18 (м, 2H), 7,05 (кв, J=5,4Гц, 2H), 6,18 (шир. с, 2H), 4,30-4,50 (м, 4H), 1,60 (д, J=5,4Гц, 6H), 1,21 (с, 18H). ЖХМС (m/z) [M-H] 653,9. Биологические данные: быстро гидролизуется в плазме мыши и человека.
4) 3-[[3-[1-(2,2-Диметилпропаноилокси)этоксикарбонил]-2,5-дигидроксифенил]метилсульфонилметил]-2,5-дигидроксибензойная кислота (IVc-059a-pivel)
Гидрирование:
Раствор сложного моноэфира, выделенного выше (90 мг, 0,104 ммоль), в тетрагидрофуране (3 мл) добавляли к перемешиваемой суспензии 10%-ного палладия на углероде (20 мг, 0,02 ммоль) в воде (1 мл). Перемешиваемую реакционную смесь помещали в атмосферу водорода на 48 часов. Реакционную смесь фильтровали для удаления катализатора, раствор упаривали и остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, элюируя градиентом от 100% дихлорметана до 20% метанола, 80% дихлорметана с получением указанного в заголовке соединения IVc-059a-pivel в виде твердого вещества кремового цвета (22,5 мг, 43%).
1H ЯМР (CD3OD, м. д.) δ 7,39 (д, , J=3,1Гц, 1H), 7,25 (д, J=3,1Гц, 1H), 7,18 (д, J=3,1Гц, 1H), 7,05 (кв, J=5 4Гц, 1H), 6,96 (д, J=3,1Гц, 1H), 4,40-4,45 (м, 4H), 1,61 (д, J=5,4Гц, 3H), 1,21 (с, 9H). ЖХМС (m/z) [M-H] 524,9.
Биологические данные: быстро гидролизуется в плазме мыши
5) 2,2-Диметилпропаноилоксиметил 2,5-дигидрокси-3-[[2,5-дигидрокси-3-(2,2-диметилпропаноилоксиметоксикарбонил)фенил]-метилсульфонилметил]бензоат (IVc-059a-pivm2)
Этерификация. Готовили раствор 2,5-дибензилокси-3-[(2,5-дибензилокси-3-карбоксифенил)метилсульфонилметил]бензойной кислоты (100 мг, 0,131 ммоль) в безводном N, N-диметилформамиде (1 мл) и добавляли хлорметил 2,2-диметилпропаноат (91 мкл, 0,631 ммоль), затем триэтиламин (110 мкл, 0,789 ммоль) и йодид натрия (87 мг, 0,579 ммоль). Реакционную смесь нагревали при температуре 50°C в течение 6,5 часов. Полученный раствор упаривали и остаток распределяли между этилацетатом и водой. Органический слой сушили над сульфатом натрия, фильтровали и упаривали. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, элюируя градиентом от 100% изогексана до 50% этилацетата, 50% изогексана с получением сложного диэфирного продукта в виде бесцветной смолы (85 мг, 66%). ЖХМС (m/z) [M+Na] 1010,0.
Гидрирование: Раствор сложного диэфира, полученного выше (85 мг, 0,086 ммоль), в тетрагидрофуране (3 мл) добавляли к перемешиваемой суспензии 10%-ного палладия на углероде (20 мг, 0,02 ммоль) в воде (1 мл). Перемешиваемую реакционную смесь помещали в атмосферу водорода на 18 часов. Реакционную смесь фильтровали для удаления катализатора, раствор упаривали и остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, элюируя градиентом от 100% изогексана до 60% этилацетата, 40% изогексана с получением сложного диэфира IVc-059a-pivm2 в виде твердого вещества белого цвета (31 мг, 57%).
1H ЯМР (CDCl3, м. д.) δ 7,29 (д, J=2,9Гц, 2H), 7,19 (д, J=2,9Гц, 2H), 5,97 (с, 4H), 4,42 (с, 4H), 1,22 (с, 18H). ЖХМС (m/z) [M-H] 624,8.
Биологические данные: быстро гидролизуется в плазме мыши, T1/2=14,1 мин; T1/2 (плазма человека): >180 мин.
6) 2,5-Дигидрокси-3-[[2,5-дигидрокси-3-(2,2-диметил-пропаноилоксиметоксикарбонил)фенил]метилсульфонилметил]-бензойная кислота (IVc-059a-pivm1)
Этерификация: Готовили раствор 2,5-дибензилокси-3-[(2,5-дибензилокси-3-карбоксифенил)метилсульфонилметил]бензойной кислоты (300 мг, 0,395 ммоль) в безводном N, N-диметилформамиде (3 мл) и добавляли хлорметил 2,2-диметилпропаноат (57 мкл, 0,395 ммоль), затем триэтиламин (68 мкл, 0,489 ммоль) и йодид натрия (129 мг, 0,870 ммоль). Реакционную смесь нагревали при температуре 50°C в течение 4 часов. Полученный раствор охлаждали, затем упаривали. Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, элюируя градиентом от 20% этилацетата, 80% изогексана до 80% этилацетата, 20% изогексана с получением сложного моноэфирного продукта в виде твердого вещества белого цвета (121 мг, 35%). ЖХМС (m/z) [M-H] 871,0.
Гидрирование: Раствор сложного моноэфира, полученного выше (121 мг, 0,138 ммоль), в тетрагидрофуране (3 мл) добавляли к перемешиваемой суспензии 10%-ного палладия на углероде (20 мг, 0,02 ммоль) в воде (1 мл). Перемешиваемую реакционную смесь помещали в атмосферу водорода на 48 часов. Реакционную смесь фильтровали для удаления катализатора, раствор упаривали и остаток очищали с помощью ВЭЖХ на колонке C18, элюируя градиентом от 30% ацетонитрила, 70% воды до 100% ацетонитрила (0,1%-ная муравьиная кислота) с получением сложного моноэфирного IVc-059a-pivm1 в виде твердого вещества белого цвета (30 мг, 42%).
1H ЯМР (CD3OD, м. д.) δ 7,34 (д, J=3,0Гц, 1H), 7,27 (д, J=3,1Гц, 1H), 7,20 (д, J=3,1Гц, 1H), 7,08 (д, J=3,0Гц, 1H) , 6,01 (с, 2H), 4,45 (с, 4H), 1,22 (с, 9H). ЖХМС (m/z) [M-H] 510,9.
Биологические данные: быстро гидролизуется в плазме мыши, T1/2=6,7 мин; T1/2 (плазма человека): >180 мин.
ПРИМЕР 2: Общие экспериментальные методы
ЯМР-спектроскопия
Спектры 1H ЯМР записывали на частоте 400 МГц на ЯМР-спектрометре Bruker Advance III. Образцы готовили в дейтерированном хлороформе (CDCl3) или диметилсульфоксиде (ДМСО-d6) и исходные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Mnova NMR. Масс-спектры высокого разрешения регистрировали на масс-спектрометре сверхвысокого разрешения MaXis ESI qTOF.
СВЭЖХ-МС анализ
СВЭЖХ-МС анализ проводили на системе Waters Acquity UPLC, состоящей из Acquity I-Class Sample Manager-FL, Acquity I-Class Binary Solvent Manager и Acquity I-Class UPLC Column Manager. УФ-детектирование осуществляли с использованием детектора Acquity I-Class UPLC PDA (сканирование от 210 до 400 нм), тогда как масс-обнаружение проводили с использованием детектора Acquity QDa (массовое сканирование от 100 до 1250 Да; положительный и отрицательный режимы одновременно). Для разделения аналитов использовали колонку Waters Acquity UPLC BEH C18 (2,1×50 мм, 1,7 мм).
Образцы готовили путем растворения (с обработкой ультразвуком или без нее) в 1 мл смеси 1:1 (об./об.) MeCN в H2O. Полученные растворы перед отправкой на анализ фильтровали через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм. Все используемые растворители (включая муравьиную кислоту и 36% раствор аммиака) были пригодны для ВЭЖХ.
Для этой работы использовались четыре различных аналитических метода, детали которых представлены ниже.
Кислотный цикл (2 мин): 0,1% об./об. муравьиной кислоты в воде [элюент A]; 0,1% об./об. муравьиной кислоты в MeCN [элюент B]; скорость потока 0,8 мл/мин; объем инъекции 2мкл и время уравновешивания между образцами 1,5 мин.
Таблица 14
Кислотный цикл (4 мин): 0,1% об./об. муравьиной кислоты в воде [элюент A]; 0,1% об./об. муравьиной кислоты в MeCN [элюент B]; скорость потока 0,8 мл/мин; объем инъекции 2 мкл и время уравновешивания между образцами 1,5 мин.
Таблица 15
Кислотный цикл (6,5 мин): 10 мМ формиата аммония+0,1% об./об. муравьиной кислоты [элюент A]; 0,1% об./об. муравьиной кислоты в MeCN [элюент B]; скорость потока 0,6 мл/мин; объем инъекции 2 мкл.
Таблица 16
Основный цикл (2 мин): 0,1% аммиака в воде [элюент A]; 0,1% аммиака в MeCN [элюент B]; скорость потока 0,8 мл/мин; объем инъекции 2 мкл и время уравновешивания между образцами 1,5 мин.
Таблица 17
Основный цикл (4 мин): 0,1% аммиака в воде [элюент A]; 0,1% аммиака в MeCN [элюент B]; скорость потока 0,8 мл/мин; объем инъекции 2 мкл и время уравновешивания между образцами 1,5 мин.
Таблица 18
Основный цикл (6,5 мин): 10 мМ бикарбоната аммония+0,1% об./об. 35%-ный раствор аммиака [элюент A]; 0,1% об./об. муравьиной кислоты в MeCN [элюент B]; скорость потока 0,6 мл/мин; объем инъекции 2 мкл.
Таблица 19
Очистка препаративной ВЭЖХ
Препаративную ВЭЖХ проводили с использованием системы автоочистки Waters с колонкой XBridge Prep C18 (19×150 мм). Система Waters состояла из бинарного подготовительного насоса Waters 2545, устройства управления образцами Waters 2767, устройства для упорядочивания колонок Waters SFO, устройства DAD Waters 2998, подпиточного насоса Waters 515 и масс-спектрометра Acquity QDa.
Система очистки управлялась программным обеспечением MassLynx (версия 4.2) с модулем Open Access Login.
Подвижные фазы состояли из (А) 10 мМ формиата аммония (+0,1% об./об. муравьиной кислоты) и (В) ацетонитрила (+0,1% об./об. муравьиной кислоты).
Образцы готовили путем растворения в 10% об./об. воде в ДМСО до получения концентрации ~150 мг/мл. На колонку загружали подготовленный образец объемом 320 мл и очищали с помощью градиентного элюирования при комнатной температуре со скоростью потока 25 мл/мин. Между инъекциями было 1,5-минутное уравновешивание.
Таблица 20: Градиент
ПРИМЕР 3: Методы скрининга in vitro
ПРИМЕР 3.1: Метод ингибирования FGF1, FGF2 и VEGF-A в клетках HUVEC in vitro
Целью этого метода in vitro является оценка действия соединений на индуцированное FGF-2, FGF-1 или VEGF-A разрастание эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) в анализе клеточного ангиогенеза на основе сфероидов. Перед добавлением к клеткам факторов роста их предварительно инкубировали с соединением. Сунитиниб тестировали в качестве контроля (без предварительной инкубации).
Контрольный сунитиниб ингибировал разрастание HUVEC, индуцированное FGF-2, FGF-1 и VEGF-A, как и ожидалось. Значения IC50, определенные для тестируемых соединений, выражены в мкМ [мкМ], а значения ингибирования роста, индуцированного FGF-1, FGF2 и VEGF-A (прорастания), указаны после каждого соединения в примерах после химической характеристики.
Испытание на прорастание проводили для соединений, растворенных в ДМСО, для получения 100-кратно концентрированных исходных растворов и растворенных в культуральной среде. Сунитиниб в качестве эталонного соединения был предоставлен компанией ProQinase GmbH. Факторы роста были приобретены у rhFGF-basic (FGF-2), Peprotech, New Jersey, USA, #100-18C, Lot# 0415571; для стимуляции роста клеток HUVEC использовали rhFGF-кислотный (FGF-1), Peprotech, New Jersey, USA, #100-17A, Lot# 031207; hVEGF-A165 (ProQinase GmbH, Freiburg, Germany; 05.02.2010).
Тест-система: Эндотелиальные клетки из пупочной вены человека (HUVEC) от объединенных доноров хранили замороженными с 70% средой, 20% FCS, 10% ДМСО в концентрации примерно 1×106 клеток/ампулу. Клетки HUVEC, первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (PromoCell, Heidelberg, Germany), использовали после 3-4 пассажа. Морфология клеток представляет собой прилипшие, похожие на булыжник растущие в виде монослоя, и их культивировали в среде для роста эндотелиальных клеток и в базовой среде (ECGM/ECBM, PromoCell). Субкультура была разделена 1:3; каждые 3-5 дней, посев прибл. 1×104 клеток/см2 и инкубирование при температуре 37°C с 5% CO2 со временем удвоения 24-48 часов
Разведение исследуемых соединений: Готовили 100-кратные концентрированные растворы (относительно конечных концентраций анализа) каждого исследуемого соединения с соответствующим растворителем (в ДМСО или в воде). Эти 100-кратные растворы соединений далее разводили в среде для роста эндотелиальных клеток и базовой среде (ECBM) 1:7,5 с получением 13,33-кратного концентрированного раствора. 75 мкл 13,33-кратного раствора затем смешивали с 25 мкл 40-кратного концентрированного стимула (растворенного в ECBM), в результате чего получали 10-кратную концентрированную смесь стимул/соединение. Эту смесь (100 мкл) инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С, а затем добавляли к 900 мкл геля, содержащего сфероиды HUVEC (получая конечную концентрацию для анализа).
Метод исследования: эксперименты проводили в модификации первоначально опубликованного протокола (Korff и Augustin: J Cell Sci 112: 3249-58, 1999). Вкратце, сфероиды были приготовлены, как описано (Korff and Augustin: J Cell Biol 143: 1341-52, 1998), путем пипетирования 400 HUVEC в виде висячей капли на пластиковых чашках для обеспечения агрегации сфероидов в течение ночи. Затем 50 сфероидов HUVEC высевали в 0,9 мл коллагенового геля и пипеткой вносили в отдельные лунки 24-луночного планшета для полимеризации. Исследуемые соединения предварительно инкубировали с факторами роста (конечная концентрация FGF-1, FGF-2 или VEGF-A 25 нг/мл) в 10-кратно концентрированном растворе, а затем 100 мкл этого раствора добавляли поверх полимеризованного гель. Все соединения разводили в растворителе (ДМСО или воде) сначала в виде 100-кратных исходных растворов (что означает, что в растворителе готовили 100-кратные исходные растворы каждой конечной концентрации анализа). Затем эти исходные растворы дополнительно разводили в среде (в результате чего получали 13,33-кратные запасы каждой конечной аналитической концентрации) с исследованными конечными концентрациями: 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13 и 1,56×10-6 М). Планшеты инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов и фиксировали добавлением 4% PFA (Roth, Karlsruhe, Germany).
Количественная оценка ингибирования фактора роста: Интенсивность прорастания сфероидов HUVEC, обработанных фактором роста и ингибиторами, количественно определяли с помощью системы анализа изображений, определяющей кумулятивную длину прорастания на сфероид (CSL). Фотографии отдельных сфероидов были сделаны с использованием инвертированного микроскопа и программного обеспечения для обработки цифровых изображений NIS-Elements BR 3.0 (Nikon). Впоследствии изображения сфероидов были загружены на домашнюю страницу компании Wimasis для анализа изображений. Совокупную длину ростка каждого сфероида определяли с помощью инструмента анализа изображений WimSprout. Среднее значение кумулятивной длины проростков 10 случайно выбранных сфероидов анализировали как отдельную точку данных. Для определения IC50 необработанные данные преобразовывали в процент прорастания HUVEC относительно контроля растворителя (содержащего стимул), который был установлен на 100%, и базального контроля (без стимуляции), который был установлен на 0%. Значения IC50 определяли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5 с ограничением нижнего предела до 0 и верхнего предела до 100 с использованием кривой нелинейной регрессии, подобранной с переменным наклоном холма.
Полученные результаты: Для всех соединений оценивали взаимосвязь доза-реакция на индуцированное фактором роста прорастание эндотелиальных клеток. Значения IC50 определяли с использованием стандартных параметров на основе сигнала контроля растворителя в качестве верхнего ограничения (100% прорастания HUVEC) и сигнала базового контроля в качестве нижнего ограничения (0%). Соответствующие значения IC50 для каждого соединения на FGF1, FGF2 и VEGFA суммировали для каждого соединения ниже его химической характеристики в разделе Биологические данные.
Пример 3.2: Адгезия нейтрофилов in vitro в статических условиях, метод
Нейтрофилы человека, полученные из лейкоцитарных пленок здоровых доноров, суспендировали в концентрации 3×106/мл в буфере для адгезии (PBS, содержащий 1 мМ CaCl2/MgCl2 и 10% FCS, pH 7,2). Нейтрофилы предварительно инкубировали в течение 30 мин при температуре 37°С с 40 мкМ и 80 мкМ соединений.
Анализы адгезии проводили на 18-луночных предметных стеклах, покрытых на 18 ч при температуре 4°С человеческим фибриногеном (20 мкг/лунку в PBS, не содержащем эндотоксинов); в каждую лунку добавляли по 20 мкл клеточной суспензии и стимулировали в течение 1 мин при температуре 37°С 5 мкл конечной концентрации fMLP 1 нМ. После промывания прилипшие клетки фиксировали в 1,5% глутаральдегиде в PBS и подсчитывали с помощью компьютерного подсчета. Статистический анализ проводили путем расчета среднего значения и стандартного отклонения (SD); значимость рассчитывали с помощью непарного t-критерия. Все статистические анализы проводились с использованием GraphPad Prism 6 (программное обеспечение GraphPad).
Соответствующее ингибирование адгезии нейтрофилов, выраженное в [%] для каждого соединения, суммировано для каждого соединения под его химической характеристикой в разделе Биологические данные.
Пример 3.3: Исследование in vitro на ингибирование образования активных форм кислорода (ROS) в нейтрофилах человека
NADPH-оксидаза, расположенная в плазматической мембране и в мембранах специфических гранул, продуцирует супероксид-анионы, из которых образуются другие ROS, такие как перекись водорода, синглетный кислород, гипохлорит и активные гидроксильные радикалы. ROS высвобождаются в окружающую среду или в окруженную мембраной субклеточную органеллу. Одним из быстрых и чувствительных методов измерения образования этих метаболитов является хемилюминесценция (CL). Техника CL, усиленная изолюмином, очень чувствительна и широко используется для изучения респираторного взрыва (в основном внеклеточного производства ROS), индуцированного нейтрофилами.
Нейтрофилы человека выделяли из лейкоцитарных пленок, полученных от здоровых доноров. Выделенные нейтрофилы (3×106/мл) суспендировали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) с кальцием и магнием. Нейтрофилы предварительно инкубировали с соединениями в различных концентрациях (0,1, 0,3, 1, 3 и 10 мкМ) в течение 30 мин при температуре 37°С. Черные 96-луночные планшеты для культивирования клеток покрывали человеческим фибриногеном (0,25 мг/мл в PBS) и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С или 2 ч при температуре 37°С. Затем планшеты промывали свободным от эндотоксина PBS. Нейтрофилы инкубировали (примирование) с TNF-α (20 нг/мл) в течение 10 минут при температуре 37°С. После этого в каждую лунку добавляли по 75 мкл клеточной суспензии и по 75 мкл (раствора изолюминол+HRP). Хемилюминесценцию регистрировали (каждые 25 с в течение 250 с) после активации fMLP (1 мкМ) с помощью Multilabel Reader victor3 (Perkin Elmer, USA). Фоновые значения, определенные как средние значения хемилюминесценции изолюминола, разведенного в HBSS, вычитали из всех показаний (CPS, счет в секунду). Анализы проводили в двух- или трехкратной повторности.
Результаты, полученные в анализе CL с усилением изолюминолом, показали, что соединения сильно снижали уровень ROS зависимым от концентрации образом в PMN, стимулированных fMLP+TNF-α.
Ингибирование PMN ROS при 0,3 мкМ, выраженное в [%], и IC50 [мкМ] были суммированы для каждого соединения под их химической характеристикой в разделе Биологические данные.
Пример 3.4: Продуцирование воспалительных цитокинов человеческими нейтрофилами и моноцитами человека in vitro, метод
Нейтрофилы и моноциты выделяли из лейкоцитарных пленок здоровых доноров в условиях отсутствия эндотоксинов. Вкратце, лейкоцитарные пленки расслаивали в градиенте Ficoll-Paque PLUS, а затем центрифугировали при 400×g в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем собирали нейтрофилы и подвергали седиментации декстраном с последующим гипотоническим лизисом для удаления эритроцитов. Вместо этого моноциты выделяли из РВМС после центрифугирования в градиентах Перколла. Нейтрофилы и моноциты человека суспендировали в концентрации 5×106/мл и 2,5×106/мл, соответственно, в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS с низким эндотоксином (<0,5 EU/мл; от компании BioWhittaker-Lonza, Basel, Switzerland), а затем высевали на 24-луночные планшеты для тканевых культур при температуре 37°C, атмосфере 5% CO2, в присутствии или отсутствии различных концентраций (20-40 мкМ) соединений. После 1 ч обработки препаратами моноциты стимулировали 0,1 мкг/мл, а нейтрофилы 1 мкг/мл сверхчистого LPS из штамма E. coli 0111:B4 (InvivoGen). После 6 ч стимуляции LPS нейтрофилы и моноциты собирали и вращали при 300×g в течение 5 мин. Бесклеточные супернатанты сразу замораживали при температуре -80°С.
Концентрацию цитокинов в бесклеточных супернатантах измеряли с помощью имеющихся в продаже наборов ELISA, специфичных для человека: CXCL8, IL-6, TNF-α (Mabtech, Sweden). Пределы обнаружения этих ELISAs были: 4 пг/мл для CXCL8, 10 пг/мл для IL-6 и 4 пг/мл для TNF-α.
Статистический анализ проводили путем расчета среднего значения и стандартного отклонения (SD); значимость рассчитывали с помощью непарного t-критерия. Все статистические анализы проводились с использованием GraphPad Prism 6 (программное обеспечение GraphPad).
Значения цитокинов выражали в нг/мл для каждого соединения и суммировали для каждого соединения под их химической характеристикой в разделе Биологические данные.
Пример 3.5: Ингибирование in vitro соединениями VEGF-165 индуцированного фосфорилирования VEGF-рецептора на первичных эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC), метод
Культура клеток: Первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) обычно культивировали в предварительно покрытых 0,1% желатином колбах или чашках до пассажа 6. Влияние отдельных соединений в различных концентрациях (0, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мкМ) жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора CCK-8 с использованием устройства для считывания микропланшетов Tecan (Genios). Для измерения влияния соединений на VEGF-индуцированную жизнеспособность клеток HUVEC (1×104 клеток/лунку) обрабатывали VEGF (25 нг/мл), предварительно смешанным с различными концентрациями соединений (0, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мкМ) в культуральной среде без сыворотки и факторов роста (бедная среда) в течение 24 ч и 48 ч. Соединения в этом диапазоне концентраций не влияли на жизнеспособность клеток.
Кроличьи первичные антитела к VEGFR-2, p-Tyr1175 были приобретены у компании Cell Signaling Technology (Leiden, The Netherlands). Набор для сэндвич-ИФА Phospho-VEGFR-2 (Tyr1175) был приобретены у компании и Cell Signaling Technology.
HUVEC предварительно инкубировали с соединениями в концентрациях 0, 0,16, 0,31, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 и 20 мкМ в течение 60 минут с тремя последующими стадиями промывки теплой средой, затем стимуляцией VEGF165 (25 нг/мл) в течение 2 минут. Вестерн-блот анализ проводили с использованием анти-фосфо-VEGFR-2 антитела, и в качестве контроля загрузки после удаления мембраны использовали общий VEGFR-2.
Результаты ингибирования фосфорилирования VEGFR-2 выражены как IC50 в мкМ [мкМ] по сравнению с контролем HUVEC, обработанным VEGF, без ингибирующего соединения.
Соответствующие значения IC50, выраженные в [мкМ] для каждого соединения, суммированы для каждого соединения под его химической характеристикой в разделе Биологические данные.
Пример 3.6: Ингибирование высвобождения цитокинов in vitro соединениями после индукции LPS в цельной крови человека
Целью этого метода in vitro является оценка воздействия соединений на высвобождение группы цитокинов из цельной крови после воспалительной реакции, индуцированной липополисахаридом (LPS). Цельную кровь инкубировали с соединениями в течение 1 часа перед индукцией LPS. Уровни цитокинов в крови измеряли с помощью мультиплексной панели на основе FACS.
Значения IC50, определенные для исследуемых соединений, выраженные в микроM [мкМ], и значения ингибирования цитокинов были перечислены для каждого соединения.
Влияние на высвобождение цитокинов после индукции LPS проводили на соединениях, растворенных в ДМСО или Н2О до получения 10-кратно концентрированных маточных растворов и растворенных в культуральных средах.
Тест-система. Цельную кровь брали у одного донора (в пробирки, покрытые литий-гепарином; BD Vacutainer; 367886) и разбавляли 1:5 с помощью RPMI 1640 (Thermo Fisher, 61870036). В течение 30 минут после отбора крови кровь инкубировали с соединениями в течение 1 часа перед стимуляцией ЛПС (O111:B4 - Sigma L4391; конечная концентрация 10 нг/мл). Стимуляцию продолжали в стандартных условиях культивирования клеток (37°C с 5% CO2) в течение ночи (18 ч), после чего планшеты центрифугировали, удаляли надосадочную жидкость и замораживали при температуре -80°C до использования для анализа.
Разведение исследуемых соединений: Готовили 10-кратные концентрированные растворы (относительно конечных концентраций анализа) каждого тестируемого соединения с соответствующим растворителем (в ДМСО или в воде). Затем эти 10-кратные растворы соединения (10 мкл) добавляли к 90 мкл предварительно разбавленной цельной крови (цельная кровь: RPMI1640, 1:5), получая конечную концентрацию для анализа.
Метод исследования: Разведенную цельную кровь (80 мкл) предварительно инкубировали с соединениями (10 мкл) для получения конечных концентраций анализа 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 и 0,1×10-6M. Кровь инкубировали при температуре 37°C с 5% CO2 в течение 1 ч. LPS разводили в среде для культивирования клеток до концентрации 110 нг/мл; 10 мкл добавляли к цельной крови для получения конечной концентрации 10 нг/мл. Планшеты инкубировали при температуре 37°C в течение 18 ч. Планшеты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут при температуре 4°C и удаляли супернатант и замораживали при температуре -80°C, затем проводили анализ FACS.
Высвобождение цитокинов измеряли с использованием специальной мультиплексной системы (ELISA Genie) в соответствии с инструкциями производителей. Подготовленные образцы анализировали на проточном цитометре Attune NxT (Thermo Fisher).
Количественная оценка ингибирования высвобождения цитокинов: известные стандарты концентрации использовали как часть панели цитокинов, чтобы обеспечить возможность количественного определения концентрации каждого цитокина в каждом образце. Это было выполнено с использованием программного обеспечения FCAP Array v3.0. Для определения IC50 необработанные данные были преобразованы в концентрацию в процентах относительно контроля растворителя, который был установлен на 100%. Значения IC50 определяли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8 с ограничением нижнего предела до 0 и верхнего предела до 100, используя кривую нелинейной регрессии, подобранную с переменным наклоном холма.
Полученные результаты: Для всех соединений оценивали взаимосвязь доза-реакция с высвобождением цитокинов после индукции ЛПС воспалительной реакции в цельной крови. Значения IC50 определяли для каждого соединения для панели цитокинов (GM-CSF, IFN-гамма, IL-1бета, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-18, IL-21, IL-22, IL-33, TGF-бета, TNF-альфа, TNF-бета). Значения IC50 соответствующих цитокинов, выраженные в [мкМ] для каждого соединения, были суммированы для каждого соединения ниже его химической характеристики в разделе Биологические данные и также в таблице 13.
ПРИМЕР 4: Составы соединений
Пример 4.1: Пероральные составы соединения Ic-007a
Были разработаны и проверены на пригодность пять составов. Это были как суспензия, так и растворы, подробное описание которых приведены в следующей таблице.
Таблица 21: Подробный состав суспензии и растворов соединения Ic-007a
Производство: Суспензия А и раствор D:
Пример метода для 100 мл (масштабируйте в соответствии с требуемым конечным объемом). Исходный растворитель готовили, отмеряя 5 мл ДМСО в чистом сосуде. Отвешивали 1 г соединения Ic-007a и постепенно добавляли к раствору ДМСО при перемешивании на шейкере, встряхивании или обработке ультразвуком, если необходимо. Солютол расплавляли на водяной бане при температуре 60°C в чистом сухом сосуде. По мере затвердевания солютола при комнатной температуре расплавленный солютол выдерживали на водяной бане при температуре 60°С во время приготовления состава. 10 г (10% мас./об.) расплавленного солютола добавляли в нагретую подходящую маркированную (до конечного объема 100 мл) емкость. 10 мл PEG400 добавляли к солютолу в подогретом контейнере на 100 мл. Исходный раствор лекарственного средства в ДМСО добавляли к смеси солютола и PEG400, содержимое мгновенно перемешивали, добавляли 35 мл деионизированной воды и перемешивали на бане при температуре 40°C с периодическим встряхиванием для растворения крупных частиц. Состав охлаждали до комнатной температуры и доводили до конечного объема 100 мл деионизированной водой.
Производство растворов A, B и C:
Пример метода для 100 мл (масштабируйте в соответствии с требуемым конечным объемом). Исходный растворитель готовили, отмеряя 5 мл ДМСО в чистом сосуде. Отвешивали 1 г соединения Ic-007a и постепенно добавляли к раствору ДМСО при перемешивании на шейкере, встряхивании или обработке ультразвуком, если необходимо). Солютол расплавляли на водяной бане при температуре 60°C в чистом сухом сосуде. Поскольку солютол затвердевает при комнатной температуре, расплавленный солютол выдерживают на водяной бане при температуре 60°C во время приготовления состава. Отвешивали 10 г (10% масс./об.) расплавленного солютола в нагретую подходящую маркированную (до конечного объема 100 мл) емкость. К солютолу в подогретом контейнере на 100 мл добавляли 10 мл ПЭГ 400. Исходный раствор лекарственного средства в ДМСО добавляли в отмеченный контейнер со смесью солутола и PEG400 и мгновенно смешивали с содержимым. Добавляли 35 мл деионизированной воды, смешивали с содержимым и помещали в баню с температурой 40°C при периодическом встряхивании для растворения крупных частиц. Композицию охлаждали до комнатной температуры и дополнительно доводили рН композиции с помощью 1М раствора гидроксида натрия (NaOH) до рН 6, 7, 8 и 9. Исходные композиции готовили в масштабе 1 мл и имели начальный рН 4,3. Добавляли 3 мкл NaOH 1M для достижения pH 6 (раствор A), 22 мкл для pH 8 (раствор B) и 43 мкл для pH 9 (раствор C). Эти препараты были дозированы сразу после изготовления.
Было обнаружено, что состав суспензии 10 мг/мл и состав раствора 1 мг/мл физически стабильны в течение двух недель в условиях окружающей среды.
Пример 4.2: Пероральные составы соединения Ia-001a-Tz
Соединение Ia-001a-Tz получали в виде a 10 мг/мл для перорального применения с концентрацией 10 мг/мл в составах с составом носителя, показанным в таблице ниже.
Носитель представлял собой носитель или инертную среду, используемую в качестве растворителя (или разбавителя), в котором лекарственно активный агент был составлен и/или введен.
Таблица 22: Подробное содержание перорального состава соединений Ia-001aTz
Способ изготовления
Чтобы приготовить раствор с концентрацией 10 мг/г, во флакон точно отвешивали 10 мг соединения, и 1 мл носителя добавляли непосредственно к API и встряхивали, получая раствор.
Получение носителей
Состав A: 10 г носителя получали путем отвешивания 4 г PEG400 в чистый стеклянный сосуд объемом 20 мл. Добавляли 1 г транскутола и компоненты смешивали при перемешивании. Добавляли 1 г солютола HS15, а затем 4 г воды типа 1. Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав B: 10 г носителя получали путем отвешивания 4 г PEG400 в чистый стеклянный сосуд объемом 20 мл. Добавляли 1 г транскутола и компоненты смешивали при перемешивании. Добавляли 1 г солютола HS15. 0,5% водный раствор HPMC 606 получали путем отвешивания 50 мг HPMC 606 в чистый стеклянный сосуд. Добавляли 9,95 г воды типа 1. Компоненты перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре для обеспечения адекватного перемешивания. К раствору PEG400, транскутола и солютола HS15 затем добавляли4 г водного раствора, содержащего 0,5% HPMC 606. Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав C: 10 г носителя получали путем отвешивания 4 г PEG400 в чистый стеклянный сосуд объемом 20 мл. Добавляли 1 г транскутола и компоненты смешивали при перемешивании. Добавляли 1 г солютола HS15. Водный раствор 0,5% коллидона VA64 получали путем отвешивания 50 мг коллидона VA64 в чистый стеклянный сосуд. Добавляли 9,95 г воды типа 1. Компоненты перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре для обеспечения адекватного перемешивания. К раствору PEG400, транскутола и солютола HS15 затем добавляли 4 г водного раствора, содержащего коллидон VA64. Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав D: 10 г носителя получали путем отвешивания 4 г PEG400 в чистый стеклянный сосуд объемом 20 мл. Добавляли 1 г транскутола и компоненты смешивали при перемешивании. Добавляли 1 г кремофора RH40, затем 4 г воды 1 типа. Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав E: 10 г носителя получали путем отвешивания 4 г PEG400 в чистый стеклянный сосуд объемом 20 мл. Добавляли 1 г транскутола и компоненты смешивали при перемешивании. Добавляли 1 г витамина E TPGS и, затем 4 г воды 1 типа. Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав F: 10 г носителя получали путем отвешивания 4 г PEG400 в чистый стеклянный сосуд объемом 20 мл. Добавляли 1 г транскутола и компоненты смешивали при перемешивании. Добавляли 0,5 г солутола HS15, затем 4,5 г воды 1 типа. Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав G: 10 г носителя получали путем отвешивания 4 г PEG400 в чистый стеклянный сосуд объемом 20 мл. Добавляли 1 г транскутола и компоненты смешивали при перемешивании. Добавляли 0,5 г солутола HS15. Водный раствор 1% коллидона VA64 получали путем отвешивания 100 мг коллидона VA64 в чистый стеклянный сосуд. Добавляли 9,9 г воды 1 типа. Компоненты перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре для обеспечения адекватного перемешивания. К раствору PEG400, транскутола и солютола HS15 затем добавляли 4,5 г водного раствора, содержащего коллидон VA64. Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Пример 4.3. Пероральные составы соединения IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a
Соединения IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a получали в виде пероральных составов, используя компоненты, подробно описанных в таблице ниже.
Таблица 23: Детали перорального состава для перорального состава соединений IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a
Получение 15%-ного водного раствора SLS в масштабе 50 мл:
7,5 г SLS точно отвешивали в мерную колбу на 50 мл. Добавляли воду до объема 50 мл и перемешивали до полного растворения.
Получение носителей составов:
Состав 1: 100 г носителя получали путем отвешивания 40 г PEG400 (40,0%) в пластиковом стакане. 3,5 г транскутола (3,5%), 12,5 г кремофора RH40 (12,5%), 4,0 г менлумина (4,0%), 5 г ДМСО (5,0%), и 35 г 15%-ного водн. раствора SLS (35,0%, конечный SLS 5,25%). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав 2: 100 г носителя получали путем отвешивания 40 г PEG400 (40,0%) в пластиковом стакане. 10,0 г транскутола (10,0%), 15,0 г кремофора RH40 (15,0%), 4,0 г менлумина (4,0%), 5 г ДМСО (5,0%), и 35 г 15%-ного водн. раствора SLS (35,0%, конечный SLS 5,25%). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Носитель добавляли непосредственно к каждому соединению, затем встряхивали и обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут. При необходимости рН препарата корректировали 1М гидроксидом натрия или 1М соляной кислотой для достижения диапазона рН, подходящего для перорального дозирования. Растворы IIc-007a готовили в концентрациях до 70 мг/мл включительно. Растворы IIIc-061a готовили в концентрациях до 40 мг/мл включительно. Растворы IVc-059a готовили в концентрациях до 150 мг/мл включительно.
Пример 4.4: Составы для внутривенного введения (в.в.)
Соединения Ia-001a, Ia-001a-Tz, Ia-001a-Tz/004a, Ic-007a, Ib-010a, IVc-059a, IIIc-061a получали в виде препаратов для внутривенного введения.
Подробные описания состава, приведенные в следующей таблице 24, использовали для внутривенного введения в различных доклинических моделях in vivo . Растворы каждого соединения готовили путем регулирования рН раствором гидроксида натрия до получения раствора.
Таблица 24: Содержание в.в состава
Способ изготовления:
Пример метода для 10 мл (масштабируйте в соответствии с требуемым конечным объемом). Исходный растворитель готовили, отмеряя 0,5 мл ДМСО в чистый сосуд. Отвешивали 100 мг каждого соединения и постепенно добавляли к раствору ДМСО при перемешивании на шейкере, встряхивании или обработке ультразвуком, если необходимо. Раствор расплавляли на водяной бане при температуре 60°С в чистом сухом сосуде. Поскольку солютол затвердевает при комнатной температуре, расплавленный солютол выдерживают на водяной бане при температуре 60°C во время приготовления состава. 1 г (10% масс./об.) расплавленного солютола отвешивали в нагретую подходящую маркированную (до конечного объема 10 мл) емкость. К солютолу в подогретом контейнере на 10 мл добавляли 1 мл ПЭГ400. В отмеченный контейнер со смесью солютола и PEG400 добавляли исходный раствор лекарственного средства в ДМСО и мгновенно смешивали с содержимым. Добавляли 0,9% солевой раствор* для достижения 85% целевого объема и перемешивали содержимое в ванне с температурой 40°C при периодическом встряхивании для растворения крупных частиц. Композицию охлаждали до комнатной температуры, доводили до конечного целевого объема (10 мл) 0,9% солевым раствором* и рН композиции доводили до рН 7,4 с помощью 1М раствора гидроксида натрия (NaOH). Составы фильтровали с использованием фильтра 0,2 мкм в стерильный флакон внутри биологической камеры класса II. Препараты использовали для дозирования у животных.
* Для некоторых соединений 0,9% солевой раствор был заменен на раствор PBS с pH 7,4.
Пример 4.5: Внутривенные (в.в.) и внутрибрюшинные (в.б.) составы
Соединения Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a получали в виде составов для внутривенного и внутрибрюшинного введения. Составы содержали воду и диэтиламин в молярных эквивалентах каждого соответствующего соединения, как подробно описано в таблице 25. Эти составы использовались для внутривенного и внутрибрюшинного введения в различных доклинических моделях in vivo .
Способ изготовления:
Пример метода для 1 мл (масштабируйте в соответствии с требуемым конечным объемом). 10 мг каждого соединения точно отвешивали в чистый флакон. Во флакон добавляли соответствующее количество диэтиламина. Затем добавляли воду, чтобы довести объем до 1 мл. Содержимое встряхивали или обрабатывали ультразвуком для образования раствора. При необходимости рН раствора изменяли с помощью 1М соляной кислоты, чтобы довести его до диапазона, подходящего для внутривенного или внутрибрюшинного введения.
Таблица 25: Молярные эквиваленты диэтиламина, необходимые для соединений во в.в. и в.б. составах
Пример 4.6: Глазные составы
Несколько соединений по настоящему изобретению были отправлены на разработку рецептуры для глаз. Соединения, их конечная концентрация и форма приведены в следующей таблице 26.
Таблица 26: Глазные составы
Содержание: Содержание состава подробно описано в следующей таблице 27. Концентрация API и их конечная форма варьировались.
Таблица 27: Содержание глазного состава
Способ изготовления:
Для тех соединений, которые образовывали растворы, применяли следующий способ изготовления:
В чистый сухой сосуд отвешивали всего 50 мг коллифора EL. Правильное количество соединения взвешивали и постепенно добавляли к коллифору EL при перемешивании на магнитной мешалке. Нагревание до температуры 30°С способствовало подмешиванию лекарственного средства в препарат коллифор. В отдельном контейнере готовили водный раствор HPMC с концентрацией 0,5% масс./об., повидона с концентрацией 0,5% масс./об. и полисорбата 80 с концентрацией 0,1% при рН 7,4 в фосфатно-солевом буфере (PBS). Объем 600 мкл водного раствора добавляли к коллифору EL и лекарственному средству при перемешивании и сразу же встряхивали. рН доводили до 7,4 с помощью 1 М NaOH в составе при перемешивании. Объем доводили до целевого объема с помощью водного раствора. Композицию фильтровали с использованием фильтра 0,2 мкм в стерильный флакон в биологическом колпаке класса II. Препараты готовы к дозированию.
Для соединений, которые образовывали суспензии, применяли следующий метод изготовления: количество 50 мг коллифора EL отвешивали в чистый сухой сосуд. Правильное количество различных соединений отвешивали и постепенно добавляли к коллифору EL при перемешивании на магнитной мешалке. Нагревание до температуры 30°C помогало смешать препарат с коллифором. В отдельном контейнере готовили водный раствор HPMC с концентрацией 0,5% масс./об., повидона с концентрацией 0,5% масс./об. и полисорбата 80 с концентрацией 0,1% при рН 7,4 в фосфатно-солевом буфере (PBS). Водный раствор фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкм. Объем 600 мкл водного раствора добавляли к коллифору и лекарственному средству при перемешивании, а затем сразу встряхивали. pH доводили до 7,4 с помощью фильтрованного 1 М NaOH при непрерывном перемешивании состава. Объем доводили до целевого объема с помощью водного раствора. Составы обрабатывали ультразвуком перед дозированием, чтобы позволить флокулятам разрушиться и диспергироваться.
Глазной состав соединений Ic-007a, IIc-007a
Таблица 28: Содержание глазного состава с Ic-007a и IIc-007a
Способ изготовления:
В чистый сухой сосуд отвешивали всего 50 мг коллифора EL. Правильное количество соединения взвешивали и постепенно добавляли к коллифору EL при перемешивании на магнитной мешалке. Нагрев до температуры 30°С способствовал подмешиванию лекарственного средства в препарат коллифор. В отдельном контейнере готовили водный раствор HPMC с концентрацией 0,5% масс./об., повидона с концентрацией 0,5% масс./об. и полисорбата 80 с концентрацией 0,1% при рН 7,4 в фосфатно-солевом буфере (PBS). Объем 600 мкл водного раствора добавляли к коллифору EL и лекарственному средству при перемешивании и сразу же встряхивали. рН доводили до 7,4 с помощью 1 М NaOH в составе при перемешивании. Объем доводили до целевого объема с помощью водного раствора. Композицию фильтровали с использованием фильтра 0,2 мкм в стерильный флакон в биологическом колпаке класса II.
Раствор соединения IIc-007a: Всего 50 мг коллифора EL отвешивали в чистый сухой сосуд. Отвешивали нужное количество соединения (целевая концентрация 5 мг/мл) и постепенно добавляли к коллифору EL при перемешивании на магнитной мешалке. Нагрев до температуры 30°С способствовал подмешиванию лекарственного средства в препарат коллифор. В отдельном контейнере готовили водный раствор ГПМЦ с концентрацией 0,5% масс./об., повидона с концентрацией 0,5% масс./об. и полисорбата 80 с концентрацией 0,1% при рН 7,4 в фосфатно-солевом буфере (PBS). Объем 600 мкл водного раствора добавляли к коллифору EL и лекарственному средству при перемешивании и сразу же встряхивали. рН доводили до 7,4 с помощью 0,5 М NaOH в составе при перемешивании. Объем доводили до целевого объема с помощью водного раствора. Композицию фильтровали с использованием фильтра 0,2 мкм в стерильный флакон в биологическом колпаке класса II. Препараты были готовы к дозированию. Перед использованием встряхивают растворы соединения IIc-007a в течение 2 минут и используют в течение 10 минут.
*Может наблюдаться появление гелеобразной/коллоидной структуры, но она повторно диспергируется после встряхивания.
Суспензия соединения Ic-007a: Всего 50 мг коллифора EL отвешивали в чистый сухой сосуд. Отвешивали нужное количество соединения (целевая концентрация 5 мг/мл) и постепенно добавляли к коллифору EL при перемешивании на магнитной мешалке. Нагрев до температуры 30°С способствовал подмешиванию лекарственного средства в препарат коллифор. В отдельном контейнере готовили водный раствор HPMC с концентрацией 0,5% масс./об., повидона с концентрацией 0,5% масс./об. и полисорбата 80 с концентрацией 0,1% при рН 7,4 в фосфатно-солевом буфере (PBS). Водный раствор фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкм. Объем 600 мкл водного раствора добавляли к коллифору EL и лекарственному средству при перемешивании и сразу же встряхивали. рН доводили до 7,4 с помощью 0,5 М NaOH в составе при перемешивании. Объем доводили до целевого объема с помощью водного раствора.
Перед применением суспензию соединения Ic-007a обрабатывали ультразвуком для разрушения флокулятов/агрегатов по следующему протоколу: небольшую чашку Петри/химический стакан наполняли водой внутри ультразвукового аппарата. Флакон помещали в химический стакан/чашку Петри и обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут при температуре 40°С. Через 10 минут флакон удаляли и встряхивали в течение 2 минут и снова обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут. Процесс повторялся в течение 50 минут.
Глазные составы IIc-007a
Состав носителей и концентрация соединения показаны в таблице 29.
Таблица 29: содержание составов A, B и C
0,5% мас./мас. HPMC
0,5% мас./мас. PVP K30
0,1% мас./мас. твин 80
в H2O
5% мас./мас. кремофор EL
в H2O
1,2% мас./мас. PVP K90
0,9% мас./мас. ТРИС
в H2O
в H2O
Чтобы приготовить раствор с концентрацией 10 мг/г, в сосуд точно отвешивали 10 мг соединения и непосредственно к API добавляли 1 мл носителя и встряхивали, чтобы получить раствор.
Чтобы приготовить раствор с концентрацией 5 мг/г, 5 мг соединения точно отвешивали в сосуд и непосредственно к API добавляли 1 мл носителя и встряхивали, чтобы получить раствор.
Получение носителей
Состав A: 50 г носителя получали путем отвешивания 0,25 г HPMC (0,5% мас./мас.) в бутылку из дюранового стекла емкостью 100 мл. 49,25 г воды 1 типа затем в бутылку добавляли затем 0,200 г трис (0,4% мас./мас.), 50 мг Твин 80 (0,1% мас./мас.) и 0,25 г PVP K30 (0,5% мас./мас.). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав B: 50 г носителя получали путем отвешивания 2,5 г кремофора EL (5% мас./мас.) в бутылку из дюранового стекла емкостью 100 мл. Затем в бутылку добавляли 47,3 г воды 1 типа, затем 200 мг трис (0,4% мас./мас.).
Состав C: 50 г носителя получали путем отвешивания 2,5 г кремофора EL (5% мас./мас.) в бутылку из дюранового стекла емкостью 100 мл. Затем в бутылку добавляли 46,45 г воды 1 типа, затем 450 мг трис (0,9% мас./мас.) и 600 мг PVP K90 (1,2% мас./мас.). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав D: Диэтиламин 0,3% мас./об.: 9,9 г диэтиламинового носителя получали путем добавления 9869 мкл воды 1 типа в стеклянный сосуд объемом 14 мл. Затем с помощью пипетки во флакон добавляли 44,2 мкл (31,3 мг) диэтиламина. Раствор оставляли на 5 минут при перемешивании для обеспечения однородности.
Глазные составы IVc-059a
Состав носителей и концентрация соединения показаны в таблице 30.
Таблица 30: содержание составов A, B и C
1,2% мас./мас. PVP K90
0,9% мас./мас. ТРИС
в H2O
в H2O
pH устанавливали диэтиламином
0,5% мас./мас. PVP K30,
0,1% мас./мас. твин 80
в PBS
pH устанавливали с NaOH
Чтобы приготовить раствор с концентрацией 10 мг/г, в сосуд точно отвешивали 10 мг соединения и непосредственно к API добавляли 1 мл носителя и встряхивали, чтобы получить раствор.
Получение носителей
Состав A: 50 г носителя получали путем отвешивания 2,5 г кремофора EL (5% мас./мас.) в бутылку из дюранового стекла емкостью 100 мл. Затем в бутылку добавляли 46,45 г воды 1 типа, затем 450 мг трис (0,9% мас./мас.) и 600 мг PVP K90 (1,2% мас./мас.). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Состав B: Диэтиламин 0,3% об./об.: 9,9 г диэтиламинового носителя получали путем добавления 9869 мкл воды 1 типа в стеклянный сосуд объемом 14 мл. Затем с помощью пипетки во флакон добавляли 44,2 мкл (31,3 мг) диэтиламина. Раствор оставляли на 5 минут при перемешивании для обеспечения однородности.
Состав C: 50 г носителя получали путем отвешивания 49,45 г PBS (способ получения ниже) в бутылку из дюранового стекла емкостью 100 мл. В стеклянную бутылку последовательно добавляли 250 мг HPMC (0,5% мас./мас.), 250 мг PVP K30 (0,5% мас./мас.) и 50 мкл (пипетка с вытеснением жидкости) твина 80 (0,1% мас./мас.). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
PBS получение: точно отвешивали 799,1 мг NaCl, 21,6 мг KCl, 24,9 мг KH2PO4, 180,4 мг Na2HPO4⋅2H2O и растворяли в 100 мл воды 1 типа. pH раствора был 7,6.
Глазные составы Ic-007a и IIc-007a
Соединения готовили в виде растворов в носителях, показанных в таблице 31.
Таблица 31: Содержание составов A, B, C и D
Носитель получение при температуре в масштабе 50 г
Носитель A: 50 г носителя получали путем добавления 0,45 г трис (0,9% мас./мас.) и 2,5 г кремофора EL (5,0% мас./мас.) к 47,05 г воды (94,1% мас./мас.). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Носитель B: 50 г носителя получали путем добавления 0,45 г трис (0,9% мас./мас.), 2,5 г кремофора EL (5,0% мас./мас.) затем 0,1 г коллифора REMO (0,2% мас./мас.) к 46,95 воды (93,9% мас./мас.). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Носитель C: 50 г носителя получали путем добавления 0,45 г трис (0,9% мас./мас.), 2,5 г кремофора EL (5,0% мас./мас.) затем 0,1 г коллифора REMO (0,2% мас./мас.) и 0,2 г PEG400 к 46,75 воды (93,5% мас./мас.). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Носитель D: 50 г носителя получали путем добавления 0,45 г трис (0,9% мас./мас.), 0,5 г меглумина (1,0% мас./мас.), 2,5 г кремофора EL (5,0% мас./мас.) затем 0,1 г коллифора REMO (0,2% мас./мас.) к 46,45 воды (92,9% мас./мас.). Смесь оставляли перемешиваться в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы все компоненты растворились.
Носитель добавляли непосредственно к API для создания концентраций, перечисленных в таблице 32. Образец встряхивали и обрабатывали ультразвуком до получения раствора.
Таблица 32: Концентрация соединения в составах с использованием носителя A, B, C и D
Чтобы приготовить раствор с концентрацией 10 мг/г в сосуд точно отвешивали 10 мг соединения и непосредственно к API добавляли 1 мл носителя и встряхивали, чтобы получить раствор.
Чтобы приготовить раствор с концентрацией 20 мг/г в сосуд точно отвешивали 20 мг соединения и непосредственно к API добавляли 1 мл носителя и встряхивали, чтобы получить раствор.
ПРИМЕР 5: Терапевтическая активность соединений
Пример 5.1: Лечение и/или предупреждение острого панкреатита
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению оценивали на мышиной модели острого панкреатита. Образцы тканей получали для проведения анализа параметров панкреатита при жизни. Для оценки уровней воздействия на животных после введения соединений также получали образцы плазмы.
Животные: Всего для исследования использовали 70 самок мышей Balb/c в возрасте 8-10 недель, весом приблизительно 20-25 г (Charles River). После 7 дней акклиматизации их распределили по разным группам. Мышей помещали в клетки IVC (до 5 мышей на клетку), при этом отдельных мышей идентифицировали по метке на хвосте. Перед использованием клетки, подстилку и воду дезинфицировали. Животным предоставляли подстилку для обогащения Com-o-cobs, чтобы обеспечить обогащение окружающей среды и материал для гнездования. Все животные имели свободный доступ к стандартному сертифицированному коммерческому рациону и воде. Помещение для содержания животных поддерживали следующим образом: комнатная температура 20-24°С, влажность 30-70% и 12-часовой цикл свет/темнота. Хотя животные, использованные в этом исследовании, были иммунокомпетентными, приготовление растворов для дозирования и дозирование/взвешивание животных проводили в ламинарном боксе биологической защиты.
Исследуемое вещество и состав: в первом эксперименте взвешивали и растворяли в ДМСО соединения Ia-001a, Ia-001aTz, Ic-001aTz/004a, Ic-007a, Ib-010a, IIIc-061a, IVc-059a. Окончательный состав состоял из 5% ДМСО, 10% солютола, 10% ПЭГ400, 75% 0,9% солевого раствора, а рН доводили до 7 с помощью 0,5 М раствора NaOH.
Во втором эксперименте соединения Ic-001aTz2, IIc-007a, IIIa-001aTz, IIIc-061a, IIIc-061a-E3, IVc-059a взвешивали и растворяли в ДМСО. Окончательный состав представляет собой 5% ДМСО, 10% солутол, 10% PEG400, 75% 0,9% физиологический раствор, а рН доводят до 7 с помощью 0,5 М раствора NaOH. Для перорального (п.о.) дозирования IVc-059a готовили в воде. Растворы лекарственных средств готовили в день дозирования.
Цели этого исследования состояли в том, чтобы оценить эффективность соединений в модели острого панкреатита (14 дней), получить образцы тканей для проведения анализа параметров панкреатита в течение жизни и получить четыре образца плазмы для оценки уровней воздействия на животных после первой и последней инъекции, полученных из образцы крови, взятые через 1 час и 24 часа после первой и последней инъекции.
Дизайн исследования: В первый день исследования животных случайным образом распределяли по группам лечения, обеспечивая равное распределение массы тела. Мышам (за исключением группы отрицательного контроля) вводили испытуемые соединения за 5 минут до введения дозы церулеина с последующей инъекцией церулеина в дозе 2 мкг/кг внутрибрюшинным путем (в.б.) ежедневно в течение исследования.
Таблица 33: Первый эксперимент
Таблица 34: Второй эксперимент
Обработку исследуемыми соединениями проводили за 5 минут до введения дозы церулеина.
Таблица 35: График исследования
T0+24ч
T13+1ч
Серийные наблюдения
Масса тела: в исследовании ежедневно измеряли и регистрировали массу тела всех мышей; эта информация использовалась для расчета точной дозировки для каждого животного.
Общие признаки и симптомы: мышей наблюдали ежедневно и отмечали любые признаки дистресса или изменения общего состояния, например, неровный волосяной покров, отсутствие движения, затрудненное дыхание.
Отбор проб и прижизненные анализы: в указанное выше время образец цельной крови (60 мкл) брали из латеральной хвостовой вены в пробирки, покрытые K2-EDTA. Образцы плазмы готовили и хранили в замороженном виде при температуре -20°С. Образцы плазмы отправляли поставщику услуг биоанализа Eurofins (FR) для количественного определения соединения.
Терминальный отбор проб: перед завершением исследования животных взвешивали. Животных в конце исследования забивали путем вдыхания CO2. Образец терминальной крови брали путем пункции сердца и готовили плазму. Активности липазы и амилазы измеряли посредством ELISA с использованием имеющихся в продаже наборов ELISA. Оставшуюся плазму сохраняли для будущих анализов цитокинов. Ткань поджелудочной железы вырезали и взвешивали, а срез (50 мкг) мгновенно замораживали и анализировали для количественного определения соединения в образце поджелудочной железы. Срез (50 мкг) обрабатывали для измерения активности MPO, уровней IL-33 и TGF-B с помощью ELISA. Остаток фиксировали в формалине и заливали парафином. Проводили окрашивание гематоксилин-эозином и оценивали срезы по стандартной шкале Шмидта, исследуя: отек, воспалительную инфильтрацию, паренхиматозный некроз, кровоизлияние. Было проведено окрашивание Massons Trichrome, и площадь, покрытая фиброзной тканью, количественно оценивали в цифровом виде с использованием программного обеспечения QuPath. Образцы терминальной сыворотки использовали для оценки химического состава крови с использованием клипсы IdeXX CHEM15 и LYTE4 (4 животных на группу лечения).
Острый панкреатит Результаты после 15 дней внутривенного лечения
Гистопатологическая оценка повреждения поджелудочной железы на основе 4 критериев: отек, воспалительная инфильтрация, паренхиматозный некроз, кровотечение и оценка, как описано ниже.
Таблица 36: Уровни баллов по 4 критериям
Таблица 37: Уровни результатов в баллах для групп животных
(индуцированный церулеином)
(индуцированный церулеином)
(индуцированный церулеином)
(индуцированный церулеином)
(индуцированный церулеином)
(индуцированный церулеином)
(индуцированный церулеином)
(индуцированный церулеином)
(индуцированный церулеином)
Шкала Шмидта
Шкала Шмидта представляет собой оценку эффективности соединений на основе четырех гистопатологических критериев, как описано в таблице ниже. Порядок соединений с возрастающим показателем Шмидта (наивысший балла=10 для индуцированных церулином+обработка носителем и самый низкий балл=0 для неиндуцированных животных). График показателей Шмидта для соединений на фигуре 2: все продукты показывают улучшенный показатель Шмидта по сравнению с контрольным животным с церулином.
Таблица 38: Таблица шкалы Шмидта и четырех параметров
носитель
Здоровые ацинусы с обилием секреторных гранул
Отсутствие признаков некроза
Отсутствие признаков отека
Отсутствие признаков кровотечения
+IIIc-061a
Наблюдается умеренное кровотечение
Наблюдается умеренный некроз ацинарных клеток
Наблюдается умеренная лейкоцитарная инфильтрация
Наблюдается нормальная морфология островков
В отличие от других групп лечения, области имели относительно нормальную общую патологию, однако наблюдался умеренный отек
IVc-059a
Умеренное кровотечение наблюдается реже
Наблюдается умеренный некроз ацинарных клеток
Наблюдается умеренная лейкоцитарная инфильтрация
Наблюдается некоторая гиперплазия островков поджелудочной железы
Нарушение базофильной области
Пирфенидон
Наблюдается умеренное кровотечение
Наблюдается умеренный некроз ацинарных клеток
Наблюдается лейкоцитарная инфильтрация
Нормальная морфология островков наблюдается в областях
Ib-001aTz
Наблюдается умеренное кровотечение
Наблюдается умеренный некроз ацинарных клеток
Лейкоцитарная инфильтрация на всем протяжении
Наблюдается аномальная морфология островков (след)
Нарушение базофильной области
Ic-007a
Наблюдается умеренное кровотечение
Наблюдается умеренный некроз ацинарных клеток
Наблюдается лейкоцитарная инфильтрация
Нарушение базофильной области
Ib-010a
Наблюдается умеренное кровотечение
Наблюдается умеренный некроз ацинарных клеток
Наблюдается лейкоцитарная инфильтрация
Нарушение базофильной области
Ia-001a
Наблюдается кровотечение
Наблюдается умеренный ацинарно-клеточный некроз
Лейкоцитарная инфильтрация на всем протяжении
Наблюдается аномальная морфология островков
Нарушение базофильной области
Ic-001aTz/004a
Наблюдается умеренное кровотечение
Некроз ацинарных клеток
Лейкоцитарная инфильтрация на всем протяжении
Нарушение базофильной области
носитель
Наблюдается кровотечение, особенно в головке поджелудочной железы
Наблюдается некроз ацинарных клеток
Лейкоцитарная инфильтрация на всем протяжении
Нарушение базофильной области
Как показано в таблицах ниже, все соединения Ia-001a, Ia-001aTz, Ic-001aTz/004a, Ic-007a, Ib-010a, IIIc-061a, IVc-059a показали значительное снижение уровней IL33 в ткани поджелудочной железы по сравнению с «индуцированной» группой. Уровни TGF-B были значительно снижены для Ic-007a, Ib-010a, IIIc-061a, IVc-059a. Общие показатели Шмидта особенно улучшились для всех соединений, но особенно для соединений IIIc-061a, IVc-059a.
Таблицы 39 и 40 ниже показывают конечные концентрации МПО поджелудочной железы в образце ткани поджелудочной железы, концентрации IL33 в ткани и концентрации TGF-B.
Таблица 39:
Таблица 40:
Во втором эксперименте соединения Ic-001a-TZ(2), IIc-007a, Ia-015a, IIIc-061a, IVc-059a оценивали в дозе 15 мг/кг в той же модели с использованием пирфенидона в дозе 100 мг/кг в качестве положительного контроля.
Таблица 41: Полученные результаты
(100 мг/кг)
(в.в., 15 мг/кг)
(в.в., 15 мг/кг)
(в.в., 15 мг/кг)
(в.в., 15 мг/кг)
(в.в., 15 мг/кг)
Амилаза: Все исследованные соединения, за исключением Ia-015a, приводили к значительно более низким уровням активности амилазы, чем у контрольных животных, получавших индуцированный носитель, однако уровни не достигали уровней у неиндуцированных животных.
Липаза: активность липазы в сыворотке была выше у животных, индуцированных и получавших носитель, чем у неиндуцированных животных. Лечение положительным контролем пирфенидоном, Ia-015a, IIIc-061a и IVc 059a приводило к значительно более низкой активности липазы, чем у животных, получавших носитель.
Миелопероксидаза (MPO): активность МПО в ткани поджелудочной железы у животных, индуцированных и получавших носитель, была значительно выше, чем у неиндуцированных животных, что свидетельствует о панкреатите. Обработка положительным контролем пирфенидоном, IIIc-061a и IVc-059a приводила к уровням активности MPO, которые были значительно ниже, чем контрольные образцы, обработанные индуцированным носителем.
IL-33 и TGF-B: все лечебные препараты, за исключением доз IIIc-061a и IVc-059a перорально, приводили к уровням IL-33 в поджелудочной железе, которые были ниже, чем в контрольных группах, получавших индуцированный носитель. Как и в случае с сывороточными уровнями TGF-B, уровни TGF-B были значительно ниже, чем у контрольных животных, обработанных индуцированным носителем.
Клинически используемые критерии шкалы Шмидта, основанные на интерстициальном отеке, лейкоцитарной инфильтрации, некрозе ацинарных клеток и кровоизлиянии, использовались для оценки срезов ткани поджелудочной железы, окрашенных H&E. Все протестированные соединения давали значительно более низкие показатели шкалы Шмидта, чем контроли, обработанные индуцированным носителем, при этом IIIc-061a (IV) и IVc-059a (IV) имели более низкие оценки, чем положительный контрольный пирфенидон.
Окрашивание фиброза: Для окрашивания срезов ткани поджелудочной железы на коллаген использовали имеющийся в продаже набор для окрашивания (Abcam; ab150686, Trichrome Stain). Программное обеспечение цифровой обработки изображений QuPath использовалось для количественного определения процентной площади, покрытой коллагеновым (синим) окрашиванием. Все исследованные соединения приводили к значительно меньшим областям окрашивания трихромом, чем контроли, обработанные индуцированным носителем.
Пример 5.2: Лечение и/или предупреждение рака поджелудочной железы и почки:
Цель этого исследования заключалась в доклинической оценке исследования терапевтической эффективности in vivo соединений по настоящему изобретению для лечения сингенной модели рака поджелудочной железы у мышей (Pan02) у самок мышей C57BL/6 и сингенной модели рака почки (Renca) у самок мышей BALB/c.
Животные: самки мышей C57BL/6 (для модели Pan02); Самки мышей BALB/c (для модели Renca), 6-8 недель, >17 г, до 5 мышей в клетке
Лечение и группы модели Pan02: соединения Ia-001a-Tz, Ic-007a, Ib-010a, IVc-059a, IIc-007a ежедневно в течение 5 дней/неделю в течение двух недель посредством внутривенной болюсной инъекции в дозе 15 мг/кг.
Лечение и группы модели Renca: соединения Ia-001a-Tz, Ic-007a, Ib-010a, IVc-059a, IIc-007a ежедневно в течение 7 дней/неделю в течение трех недель посредством внутривенной болюсной инъекции в дозе 15 мг/кг.
Культура клеток: опухолевые клетки Ренка поддерживали in vitro в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO2 в воздухе. Клетки в фазе экспоненциального роста собирали и количественно определяли с помощью счетчика клеток перед инокуляцией опухоли.
Культура клеток: опухолевые клетки Pan02 поддерживали in vitro в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO2 в воздухе. Клетки в фазе экспоненциального роста собирали и количественно определяли с помощью счетчика клеток перед инокуляцией опухоли.
Инокуляция опухоли для модели Ренка: каждой мыши инокулировали подкожно в область правого заднего бока опухолевыми клетками Ренка (1×106) в 0,1 мл PBS для развития опухоли.
Инокуляция опухоли для модели Pan02: каждой мыши инокулировали подкожно в область правого переднего бока опухолевыми клетками Pan02 (3×106) в 0,1 мл PBS для развития опухоли.
Рандомизация: Рандомизацию начинали, когда средний размер опухоли достигал примерно 100 (80-110) мм3. Для обеих моделей в исследование было включено 48 мышей. Все животные были случайным образом распределены на 6 групп исследования. Рандомизацию проводили на основе метода «согласованного распределения» с использованием многозадачного метода (программное обеспечение StudyDirectorTM, версия 3.1.399.19). Дата рандомизации была обозначена как день 0.
Наблюдение и сбор данных: После инокуляции опухолевых клеток животных ежедневно проверяли на заболеваемость и смертность. Во время рутинного мониторинга животных проверяли на любое влияние роста опухоли и лечения на поведение, такое как подвижность, потребление пищи и воды, прибавка/потеря массы тела (массу тела измеряли дважды в неделю после рандомизации), спутывание глаз/волос и любые другие аномалии. Подробно регистрировали смертность и наблюдаемые клинические признаки для отдельных животных.
Наблюдение и сбор данных: После инокуляции опухолевых клеток животных ежедневно проверяли на заболеваемость и смертность. Во время рутинного мониторинга животных проверяли на любое влияние роста опухоли и лечения на поведение, такое как подвижность, потребление пищи и воды, прибавка/потеря массы тела (массу тела измеряли дважды в неделю после рандомизации), спутывание глаз/волос и любые другие аномалии. Подробно регистрировали смертность и наблюдаемые клинические признаки для отдельных животных.
Объемы опухолей измеряли два раза в неделю после рандомизации в двух измерениях с помощью штангенциркуля, а объем выражали в мм3 по формуле: «V=(L×W×W)/2», где V обозначает объем опухоли, L обозначает длину опухоли. (самый длинный размер опухоли), а W обозначает ширину опухоли (самый длинный размер опухоли, перпендикулярный L). Массу опухоли измеряли в конце исследования. Дозирование, а также измерения массы опухоли и тела проводили в боксе с ламинарным потоком.
Конечные точки исследования: Ингибирование роста опухоли (TGI): TGI% использовали как показатель противоопухолевой активности и выражали как: TGI (%)=100*(1-T/C). T и C были средним объемом опухоли (или массой) обработанной и контрольной групп, соответственно, в данный день.
Статистический анализ разницы среднего объема опухоли между группами проводили с использованием одного из приведенных ниже методов:
Используются данные, собранные в последний день дозирования/наблюдения для каждой отдельной группы, несмотря на различную индивидуальную дату окончания.
Используются данные, собранные в день, когда средний объем опухоли в группе носителя достигает гуманных конечных точек, чтобы можно было получить TGI для всех/большинства мышей, включенных в исследование.
Используются данные, собранные в день, когда исследование какой-либо из лечебных или контрольных групп было прекращено, даже если остальные группы лечатся в соответствии с графиком.
Разница в AUC (ΔAUC)=Статистический анализ, выполненный с использованием модели линейной регрессии со смешанным эффектом.
Прекращение исследования: Исследование эффективности проводилось в течение 3 недель.
Статистический анализ: Чтобы сравнить объемы опухолей в разных группах в заранее установленный день, для проверки предположения об однородности дисперсии во всех группах сначала использовали критерий Бартлетта. Когда p-значение теста Бартлетта составляло ≥0,05, для проверки общего равенства средних во всех группах использовался однофакторный ANOVA. Если p-значение однофакторного дисперсионного анализа было <0,05, выполняли апостериорное тестирование с использованием тестов Тьюки HSD (достоверная значимая разница) для всех парных сравнений и критерий Даннета для сравнения каждой группы лечения с группой, получавшей носитель. Когда p-значение теста Бартлетта было <0,05, для проверки общего равенства медиан среди всех групп использовался тест Крускала-Уоллиса. Если p-значение критерия Крускала-Уоллиса было <0,05, выполняли апостериорное тестирование с использованием непараметрического критерия Коновера для всех парных сравнений или для сравнения каждой лечебной группы с группой носителя, оба с одноэтапной корректировкой p-значения. Все статистические анализы проводились на языке R-a и в среде для статистических вычислений и графики (версия 3.3.1). Все тесты являются двусторонними, если не указано иное, и значения p <0,05 считаются статистически значимыми.
Полученные результаты
Таблица 42: Противоопухолевая активность испытуемых образцов с данными, собранными на 13-й день
IVc-059a
Таблица 43: Статистический анализ объема опухоли с данными, собранными на 13-й день
Сводная таблица результатов
В этом исследовании оценивали терапевтическую эффективность in vivo тестируемого соединения IVc-059a для лечения сингенной модели подкожного рака поджелудочной железы у мышей (Pan02) у самок мышей C57BL/6. Соединение IVc-059a, введенное внутривенно в дозе 15 мг/кг, значительно подавляло рост опухоли со значением TGI 20,98% (P<0,05).
Таблица 44: Средний % ингибирования объема опухоли, модель Pan02
Таблица 45: Средний % ингибирования объема опухоли, модель Renca
Пример 5.3: Лечение и/или предупреждение диабетической ретинопатии (DR)
Модель на животных: использовали модель мышей db/db и сравнивали с мышами db/+ в качестве контроля без диабета. Мыши db/db несли мутацию в гене рецептора лептина и были моделью диабета 2 типа, вызванного ожирением. Bogdanov et al. PLoS One, 2014, 9, e97302 сообщали, что мыши db/db воспроизводят признаки нейродегенеративного процесса, происходящего в диабетическом глазу человека. Кроме того, в этой модели развились ранние микрососудистые аномалии (протечка сосудов), вызванные диабетом (Hernandez et al. Diabetes 2016, 65, 172-187; Hernandez et al. Diabetologia 2017, 60, 2285-2298). Следовательно, эту модель рассматривали как подходящую модель для исследования эффективности соединений по настоящему изобретению для лечения ранних стадий диабетической ретинопатии (DR).
Влияние глазных капель, содержащих Ia-007a, на просачивание сосудов, вызванное диабетом, исследовали на модели мышей db/db. Мышей db/db (BKS.Cg-Dock7m +/+Leprdb/J) и мышей без диабета (db/+) в возрасте 8 недель приобретали у компании Charles River Laboratories (Calco, Italy).
Животные имели свободный доступ к корму ad libitum (ENVIGO Global Diet Complete Feed for Rodents, Mucedola, Milan, Italy) и фильтрованной воде. Мышей содержали в жестких условиях окружающей среды с температурой (20°C) и влажностью (60%). Более того, у них были циклы 12 ч/12 ч свет/темнота.
Интервенционное исследование: когда мышам db/db было 10 недель, глазные капли Ia-007a или глазные капли-носители случайным образом вводили непосредственно на верхнюю поверхность роговицы каждого глаза с помощью шприца. По одной капле (5 мкл) Ia-007a (5 мг/мл) в каждый глаз или носитель (5 мкл 0,9% хлорида натрия) в каждый глаз вводили два раза в день в течение 14 дней. На 15-й день глаза животных закапывали каплей Ia-007a или носителя примерно за час до вскрытия. Все эксперименты проводились в соответствии с принципами Европейского сообщества (86/609/CEE).
Проницаемость сосудов сетчатки исследовали ex vivo путем оценки просачивания альбумина из кровеносных сосудов в сетчатку с использованием метода с альбумином Evans Blue. Для этого четырем животным в группе внутрибрюшинно вводили раствор Evans Blue (E2129 SIGMA, Sant Louis, Missouri, USA) (5 мг/мл растворяли в PBS pH 7,4). После инъекции животные синели, что подтверждало поглощение и распределение красителя. Через 2 часа мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков и энуклеировали глаза. Сетчатку каждого животного изолировали, взвешивали и быстро защищали от света. Были получены плоские предметные стекла и на них нанесено покровное стекло с каплей среды для заливки реагента против выцветания Prolong Gold (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Oregon, USA). Цифровые изображения из разных случайных полей всех сетчаток были получены с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа (FV1000; Olympus, Hamburg, Germany) с увеличением ×60 с использованием лазерной линии 561 нм, и каждое изображение было записано с одинаковой интенсивностью луча при размере 1024 пикселя × 1024 пикселя. Для количественного анализа связанного с альбумином синего Эванса подсчитывали количество экстравазаций на поле площадью 0,44 мм2. Этот анализ был выполнен исследователями, не осведомленными о лечении, которое получали мыши.
Полученные результаты
Концентрация глюкозы в крови и масса тела в конце лечения были одинаковыми у мышей db/db, получавших глазные капли Ia-007a, по сравнению с мышами db/db, получавшими носитель. Внесосудистые локализации синего Эванса были идентифицированы в сетчатке мышей с диабетом (фигура 1, белые стрелки). Местное лечение с помощью Ia-007a способно значительно снизить количество экстравазаций на поле, тем самым предотвращая просачивание сосудов из-за нарушения гематоэнцефалического барьера.
Пример 5.4: Лечение и/или предупреждение перитонита
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению оценивали с использованием мышиных моделей индуцированного тиогликолатом перитонита, как описано Cook AD et al. (J Immunol. 2003;171(9):4816-4823) и Tsai JM et al. (J Immunol. 2003;171(9):4816-4823) and Tsai JM et al. (Blood Adv. 2019;3(18):2713-2721. doi:10.1182/bloodadvances.2018024026). Мышам линии C57BL/6J вводили внутрибрюшинно (в.б.) 1 мл соединений в дозе 50 мг/кг за 1 ч до индукции перитонита. Затем индуцировали перитонит 1 мл стерильного 4% (вес/объем) тиогликолатного бульона или PBS в качестве контроля. Через 3 часа мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции раствора PBS, содержащего 5 мг/мл кетамина и 1 мг/мл ксилазина, и брюшные полости промывали 5 мл ледяного стерильного HBSS 1X, не содержащего Ca2+/Mg2+, содержащего 2 мМ EDTA. Клетки перитонеального экссудата (PEC) центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин при температуре 4°С и лизировали эритроциты. PEC промывали, ресуспендировали в PBS 10% FBS, инкубировали с блокаторами анти-CD16/CD32 и mIgG FcR, а затем окрашивали флуоресцентно конъюгированными антителами для характеристики мигрировавших лейкоцитов (анти-CD45, анти-CD11b, анти-Ly6G, анти-CD8a, анти-CD4, анти-CD3). Жизнеспособность клеток измеряли по исключению 7-AAD. Образцы были получены с помощью проточной цитометрии с использованием анализатора MACSQuant Analyzer (Miltenyi Biotec) и проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo.
Животные: четыре мыши C57BL/6J на группу для каждого соединения по сравнению с четырьмя мышами, получавшими носитель.
Лечение соединениями: 50 мг/кг внутрибрюшинным введением соединений
- Ic-007a: Вводимый объем: Ic-007a 68,5 мкл соединения в ДМСО (1,375 мг)+431,5 мкл PBS (общий объем 500 мкл, 5,87 мМ) мыши прибл. 28 г
- IIc-007a: Вводимый объем: 67,25 мкл соединения в ДМСО (1,345 мг)+431,5 мкл PBS (общий объем 500 мкл, 5,74 мМ) мыши прибл. 27 г
- IIIc-061a: Вводимый объем: 58,75 мкл соединения в ДМСО (1,175 мг) +441,25 мкл PBS (общий объем 500 мкл, 4,56 мМ) мыши прибл. 23,5 г
- IVc-059a: Вводимый объем: 52,25 мкл соединения в ДМСО (1,045 мг) +447,75 мкл PBS (общий объем 500 мкл, 5,25 мМ) мыши прибл. 20,9 г
Лечение препаратами Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a, IVc-059a проводили за 60 мин до тиогликолат-индуцированного перитонита. Считывание проводили через 1 час после инъекции тиогликолята.
Метод считывания: проточная цитометрия для характеристики мигрировавших лейкоцитов с использованием анти-CD45, анти-CD11b, анти-Ly6G, анти-CD8a, анти-CD4, анти-CD3.
Полученные результаты и статистический анализ: Полученные результаты были проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo. Данные представлены как среднее значение±стандартная ошибка среднего. Для статистического анализа используется двусторонний t-критерий Стьюдента с уровнем значимости 0,05.
Полученные результаты
Таблица 46: Пример данных для соединения Ic-007a
Таблица 47: Результаты для четырех соединений
Соединение Ic-007a обладало самым сильным противовоспалительным действием и снижало рекрутирование лейкоцитов (48%), с очень сильным действием на PMN (80%), CD8+-лимфоциты (71%) и CD4+ лимфоциты (35%).
Пример 5.5: Лечение и/или предупреждение диабетической кардиомиопатии
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследуют с использованием мышиных моделей диабетической кардиомиопатии, описанных Li C et al. (Cardiovasc Diabetol. 2019; 18(1): 15. Published 2019 Feb 2. doi: 10.1186/s 12933-019-0816-2).
Способ и медикаментозное лечение животных: Тридцать 8-недельных мышей KK-Ay (генетическая модель диабета 2 типа) и мышей C57BL/6J помещают в клетки (по 4-6 на клетку) со свободным доступом к ящикам для питья/корма. Мышей помещают в помещение с температурой 24°C и циклом свет/темнота 12:12 ч.
Мышей с модельным диабетом 2 типа кормят диетой с высоким содержанием жиров. Глюкозу крови измеряют ежедневно. Мышей с концентрацией глюкозы в крови более 15 мМ (200 мг/дл) в течение 2 недель подряд используют для следующих экспериментов. Затем животных случайным образом распределяют по группам (по 15 в группе) и выращивают в течение 8 недель. Группы включают контрольные группы: (1) здоровые мыши C57BL/6J без лечения; (2) мыши KK-Ay с диабетом 2 типа без лечения; и (3) мыши KK-Ay с диабетом 2 типа, обработанные соединениями по настоящему изобретению.
Эхокардиографическая оценка: Эхокардиографическое измерение проводят до экспериментального вмешательства и в конце периода исследования. Используется эхокардиография в М-режиме, оснащенная системой преобразователя с линейной матрицей 17,5 МГц (система визуализации высокого разрешения Vevo 2100™; Visual Sonics). Оценивают частоту сердечных сокращений (HR) и следующие структурные переменные: внутренний размер левого желудочка в диастолу (LVIDD), внутренний размер левого желудочка в систолу (LVIDS), толщину межжелудочковой перегородки в систолу (IVSs) и диастолу (IVSd), и толщину задней стенки LV в систолу (LVPWs) и диастолу (LVPWd). Массу LV рассчитывают по формуле [(LVIDd +LVPWd+IVSd)3-(LVIDd)3×1,04×0,8+0,6]. Функция LV оценивается по следующим параметрам, включая фракционное укорочение (FS), фракцию выброса (EF) и соотношение E/A. Все измерения проводятся одним исследователем, который не имеет доступа к экспериментальным группам.
Концентрация миокардиального гидроксипролина: Концентрация миокардиального гидроксипролина в левом желудочке измеряется для оценки содержания миокардиального коллагена. Измерения проводят спектрофотометром с использованием коммерческого набора (BioVision, Mountain View, CA, USA) в соответствии с протоколами производителя.
Определение уровней липидов, глюкозы, инсулина и HbA1c в сыворотке: В конце исследования мышей анестезируют путем вдыхания 3% изопентана в воздухе. Образцы крови натощак собирают в коммерческие пробирки, содержащие гепарин лития в качестве антикоагулянта, через подъязычную вену от каждого животного и центрифугируют в течение 6 мин при 3000 об/мин. Плазму хранят в простой пробирке при температуре - 20°C до анализа. Концентрации общего холестерина (TC), триглицеридов (TG), холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C) и холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL-C) в плазме определяют спектрофотометрическими методами. Уровни глюкозы в крови измеряют с помощью глюкометра (ACCU-CHEK, Roche, USA). После ночного голодания уровни инсулина и проинсулина натощак определяют с использованием наборов иммуноферментного анализа (ELISA) мышиного инсулина и проинсулина соответственно (Nanjing Jiancheng Biotech, China). Кровь также сохраняется для измерения HbA1c с помощью набора для хроматографо-спектрофотометрического ионного обмена (Biosystems, Spain).
Оценка окислительного стресса в ткани сердца: Животных подвергают эвтаназии, сердца извлекают и в конце исследования ретроградно промывают раствором Кребса-Рингера (115 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,2 мМ KH2PO4, 25 мМ NaHCO3, 1,2 мМ MgSO4, 1,25 мМ CaCl2 и 11 мМ глюкозы). Температуру перфузионного раствора поддерживают на уровне 37°С. Затем сердца взвешивают и ткани сердца гомогенизируют на льду в охлажденном фосфатно-солевом буфере (PBS) при pH 7,4, содержащем 1 мМ ЭДТА. Гомогенаты центрифугируют в холодном солевом растворе в течение 10 мин при 7000 об/мин. Концентрацию белка в супернатанте определяют с помощью набора для определения бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Супернатанты используют для анализа уровня гидропероксида липидов и уровней глутатионпероксидазы (GSH-Px), супероксиддисмутазы (SOD) и малонового диальдегида (MDA). Измерения проводят спектрофотометром с использованием коммерческих наборов (Solarbio, China) по протоколам производителя. Уровень гидропероксида липидов выражается в нмоль/мг белка. Уровни GSH-Px, SOD и MDA выражают в мкмоль/мг белка, нмоль/мг белка и ммоль/мг белка, соответственно. Уровень экспрессии NOX4 измеряют вестерн-блоттингом. Используют мышиное моноклональное анти-Nox4 антитело (1:1000, Abcam) и вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (CWBIO). В качестве эталона используют β-актин (1:1000, Abcam).
Гистологический и иммуногистохимический анализ: Ткани сердца фиксировали в 4% параформальдегиде в 0,1М фосфатном буфере в течение 48 ч, обезвоживали и заливали парафином, делали срезы толщиной 4 мкм и помещали на предметные стекла. Для оценки степени фиброза сердечной мышцы использовали трихромное окрашивание по Массону.
Для выделения антигена депарафинированные предметные стекла выдерживали в растворе 10 мМ цитрата натрия (рН 6,0) в течение 10 мин при температуре 100°С. Затем срезы инкубировали в 3% перекиси водорода для блокирования активности эндогенной пероксидазы и инкубировали с первичными антителами (мышиные моноклональные антитела к TGF-β1, коллагену I и коллагену III; Abcam) в течение 1,5 ч, а затем с соответствующими вторичными антителами в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Затем срезы трижды промывали в PBS и инкубировали в 0,02% растворе диаминобензидина в течение 2-8 мин. После контрастного окрашивания гематоксилином предметные стекла ненадолго промывали, заливали смолой и исследовали в световом микроскопе.
Анализ пути Nrf2/ARE и TGF-β/SMAD с помощью вестерн-блоттинга: Протокол вестерн-блоттинга описан в предыдущем исследовании авторов изобретения. Вкратце, ткань миокарда лизировали в ледяном буфере RIPA (150 мМ хлорида натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 0,5% дезоксихолата натрия, 1,0% NP-40, PMSF 1 мМ и 50 мМ Трис, pH 8,0) для экстракции общего белка. Концентрацию общего белка определяли с помощью набора BCA Protein Assay Kit (Medchem Express, USA). Равные количества белка разделяли электрофорезом в 12% SDS-полиакриламидном геле (PAGE). Затем белок переносили из геля на поливинилиденфторидную мембрану. После блокировки 5% обезжиренным молоком мембрану инкубировали в течение ночи в первичных антителах (Nrf2, HO-1, TGF-β1, p-Smad2, Smad2, p-Smad3, Smad3, Smad7, α-SMA 1:1000, Abeam). Полосы выявляли с помощью специфического вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (CWBIO). В качестве эталона общего клеточного белка использовали β-актин (1:1000, Abeam).
Пример 5.6: Лечение и/или предупреждение диабета и диабетического заживления ран
Для оценки эффективности соединений по настоящему изобретению для заживления ран при диабете и получения образцов тканей, позволяющих провести анализ кожной ткани после прижизненной терапии, использовали мышиные модели диабета с использованием стрептозотоцина (диабет, индуцированный STZ).
Животные: всего в исследовании были задействованы 104 самки мышей CD-1 в возрасте 5-7 недель, весом приблизительно 25-30 г. Они были куплены у компании Charles River, и их акклиматизировали в течение 7 дней по прибытии.
Содержание животных: Мышей помещали в клетки IVC (до 5 мышей на клетку), при этом отдельных мышей помечали меткой на хвосте. Клетки, подстилку и воду перед использованием дезинфицировали. Животным предоставляли подстилку из кукурузных початков, чтобы обеспечить обогащение окружающей среды и материал для гнездования. Каждую клетку четко помечали карточкой с указанием количества животных, пола, линии, DOB, номера исследования, даты начала и лечения. Клетки меняли один раз в неделю, при необходимости меняли корм и воду.
Помещение для содержания животных поддерживали следующим образом: комнатная температура 20-24°C, влажность 30-70% и 12-часовой цикл свет/темнота.
Асептическая техника и дозирование: Хотя животные, которые использовались в этом исследовании, являлись иммунокомпетентными, приготовление растворов для дозирования и дозирование/взвешивание животных проводили в стерильном боксе биобезопасности. Внутривенное дозирование: Соединения готовили в смеси 5% ДМСО, 10% солутола, 10% PEG400, 75% PBS, и pH доводили до 7 с помощью 0,5M раствора NaOH. Пероральное дозирование: состав находился в воде.
Растворы лекарственных средств готовили в день дозирования, любые оставшиеся в конце дозирования хранили при температуре -20°С.
Дизайн исследования: Мышам (за исключением группы отрицательного контроля) вводили STZ (55 мг/кг; внутрибрюшинно) ежедневно в течение 5 дней подряд. Мыши голодали в течение 6 часов перед инъекцией. Через неделю после завершения индукции контролировали уровни глюкозы, и мышей с уровнями менее 15 ммл/л (280 мг/г) исключали из исследования, поскольку у них не развивалась идеальная тяжесть диабета. Животным вводили анестезию, и с помощью стерилизованного пробойника для биопсии создавали рану толщиной 6 мм. Раны визуализировали (дни 0). Животных лечили и визуализировали каждые 2 дня вплоть до 14-го дня (в контроле раны у недиабетических мышей заживали). Изображения ран оценивали в цифровом виде для определения площади раны и процента закрытия раны в зависимости от времени, нанесенного графически.
Таблица 48:
Лечение продолжали в течение 2 недель (14 дней). Количество животных в скобках указывали в дозе в течение 7 дней, а затем в середине исследования отбирали образцы для анализа PD.
Таблица 49: график исследования:
(5 дней)
Изображение раны каждые 2 дня
П.о. доза, ежедневно
П.о. доза, ежедневно
Серийные наблюдения
Масса тела: массу тела всех мышей в исследовании измеряли и регистрировали ежедневно; эта информация использовалась для расчета точной дозировки для каждого животного.
Общие признаки и симптомы: мышей наблюдали ежедневно, и отмечали любые признаки дистресса или изменения общего состояния, например, неровный волосяной покров, отсутствие движения, затрудненное дыхание.
Отбор проб в середине исследования: Через 7 дней после введения дозы по 3 животных в группе умерщвляли, раневую ткань удаляли и делили на 2 секции (A) и (B):
(A) Первый срез представляет собой FFPE и окрашен следующими веществами: H&E, трихром Массона, CD31, TGF-β β.
(B) Вторые секции гомогенизировали и использовали для следующих ELISA: уровни SOD, GTPx, каталазы, TNF α, IL-6, TGF-β.
Завершение: Исследуемых животных в конце исследования забивали путем вдыхания CO2. Перед остановкой животных взвешивали. Досрочное уничтожение: досрочное уничтожение животного проводится, если измерена потеря массы ≥20% и для любого больного животного, у которого проявляются критические признаки и симптомы или неспособность есть/пить.
Полученные результаты:
Глюкоза крови: Индукция с помощью STZ приводила к значительному увеличению уровня глюкозы в крови по сравнению с неиндуцированными контрольными носителями. Лечение с помощью Ia-001a, IIIc-061a и IVc-059a IV приводило к значительному снижению уровней глюкозы в крови по сравнению с индуцированными контрольными носителями. Уже через 7 дней все соединения проявляли некоторую степень ускорения заживления ран в модели STZ-индуцированного диабета (фиг. 10, 3 животных в группе, отобранных после введения дозы в течение 7 дней). Брали образец кожной ткани.
Пример 5.7: Лечение и/или предупреждение диабетических язв стопы
Соединения по настоящему изобретению тестируют с использованием крысиной модели диабетических язв, как описано Zhang Y et al. (J Diabetes Res. 2016, 2016, 5782904. doi: 10.1155/2016/5782904).
Заживление ран в коже и других тканях слизистых оболочек включает сложную последовательность событий, включающую свертывание крови, острое и хроническое воспаление, реэпителизацию, образование грануляционной ткани, сокращение раны и ремоделирование соединительной ткани. Однако некоторые генетические и приобретенные состояния, такие как старение, недоедание (например, дефицит витамина С и белка), инфекция, гипоксия и генетические заболевания, такие как синдром Элерса-Данлоса, могут нарушать этот репаративный процесс. Среди этих состояний сахарный диабет является наиболее частой причиной ослабленных или незаживающих ран. Например, клиническое значение длительной гипергликемии подчеркивается тревожными данными, показывающими, что 85% длительно незаживающих диабетических язв стопы в конечном итоге требуют ампутации. «Путь к хронической ране», как отмечают авторы недавнего исследования, сосредоточен на длительном или хроническом воспалении, характеризующемся активацией макрофагов (а также накоплением нейтрофилов), что приводит к повышению уровня провоспалительных цитокинов, активных форм кислорода, матриксные металлопротеиназы (MMP) и другие нейтральные протеиназы (например, эластаза). Все это в сочетании с дефицитом эндогенных ингибиторов протеиназ приводит к «чрезмерной деградации матрикса, деградации факторов роста и нарушению эпителизации».
В первом эксперименте пятнадцати взрослым самцам крыс Sprague-Dawley (масса тела 300-325 г, Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA) в хвостовую вену вводили либо 10 мМ цитратно-солевого буфера с pH 4,5 (недиабетические контроли, NDC), либо тот же раствор, содержащий стрептозотоцин (STZ; ENZO Life Sciences, Inc., Plymouth Meeting, PA; 70 мг/кг массы тела), чтобы вызвать диабет I типа. Затем крыс распределяли по пяти экспериментальным группам, описанным ниже (n=3 крысы/группу). Всем крысам предоставляется неограниченный доступ к пище и воде. В течение 48 часов у крыс, которым вводили STZ, наблюдалось резкое повышение уровня глюкозы в моче. Через три недели после индуцирования диабета кожу на спине всех крыс бреют и с помощью хирургического трепана делают серию из шести стандартных ран на крысу, каждая диаметром 6 мм. Созданы следующие пять экспериментальных групп (в этом начальном эксперименте лечение во всех группах проводилось в течение семи дней; более длительное исследование описано ниже в эксперименте 3): контрольные крысы без диабета (NDC), которых лечили ежедневным местным нанесением желе белого вазелина («носитель»); крысы с диабетом (группа D), которым ежедневно вводили местно только носитель; диабетических крыс, получавших тестируемые соединения.
В конце этого периода шесть круговых ран на крысу клинически оценивают путем измерения штангенциркулем диаметра ран в миллиметрах, собирают образцы крови, крыс умерщвляют и образцы кожи препарируют для гистологического/гистохимического и биохимическая оценка, как описано ниже.
На седьмой день после создания стандартных ран всех животных анестезируют, берут образцы крови для измерения уровня глюкозы в крови (ультра глюкометр One Touch; Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ) и HbA1c (Bayer AICNow Selfcheck, Sunnyvale, CA) и после завершения процедур, описанных ниже, крыс умерщвляют ингаляцией СО2.
Делают фотографии для клинических измерений для оценки закрытия ран (18 ран на экспериментальную группу). Процент уменьшения раневой поверхности рассчитывается путем измерения диаметра (в миллиметрах) каждой раны до и после протокола лечения.
Ткани раны на 7-й день вырезают из двух участков на крысу и объединяют для биохимического анализа. Каждый пул ткани гомогенизируют, экстрагируют при температуре 4°C 5 М мочевины в 50 мМ Трис-HCl-буфере (pH 7,8), содержащем 0,2 M NaCl и 5 мМ CaCl2 в течение ночи, и затем центрифугировали в течение 1 часа при 11000×g, как описано нами ранее. Супернатанты подвергали диализу против буфера Tris-HCl, NaCl и CaCl2, и протеиназы частично очищали добавлением сульфата аммония до 60% насыщения. Осажденные протеиназы анализировали с помощью ELISA на коллагеназы ММР-8 (Sigma-Aldrich Life Sciences Inc., St. Louis, MO) и MMP-13 (TSZ Scientific LLC, Lramingham, MA).
Биоптаты каждого из двух участков раны, включая окружающие неповрежденные ткани, брали и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине на 24 часа, а затем переносили в 50% этанол перед сбором, обезвоживанием спиртом, очисткой ксилолом, заливкой парафином и изготовлением срезов. Пятимикронные срезы окрашивали гематоксилин-эозином и трихромом Массона, а расстояние между краями раны измеряли гистоморфометрически с использованием калиброванного окулярного микрометра и подтвержденного анализа изображения.
В конце 14-дневного и 30-дневного протоколов лечения физические измерения, а также гистологические и гистохимические оценки такие же, как описано выше для 7-дневного эксперимента. Кроме того, для всех трех периодов времени образцы ткани из 6-мм пункционных биопсий дважды гидролизовали в 2н растворе NaOH при 120°C в течение 1 часа каждый раз. Затем аликвоты по 50 мкл гидролизата ткани кожи анализируют на наличие гидроксипролина, аминокислоты, которая в основном содержится только в коллагене.
Пример 5.8: Лечение и/или предупреждение диабетической ретинопатии и диабетической нефропатии
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению оценивали с использованием модели мышей с диабетом, используя линию мышей DBA/2 с индукцией диабета STZ и последующей диабетической ретинопатией, включая повреждение почек. Через пять недель после индукции диабета с помощью инъекций низких доз СТЗ в течение 5 дней подряд соотношение альбумина и хрома в моче увеличивается в 424 раза по сравнению с 36,9 у контрольной группы того же возраста.
Для лечения диабетической нефропатии мышей DBA/2 индуцировали STZ (низкая доза в течение 5 дней подряд). Через неделю после завершения индукции контролировали уровень глюкозы, и мышей с уровнем менее (280 мг/0,1 л) исключали из исследования, поскольку у них не развивался диабет достаточной степени тяжести, чтобы привести к повреждению почек. Уровни глюкозы контролировали еженедельно, а через 5 недель после индукции СТЗ проводили биохимическую оценку повреждения почек путем измерения уровней альбумина и креатинина в моче и подтверждения того, что они находились в желаемом диапазоне. После успешного завершения этого этапа животных распределяли по лечебным группам.
Лечение проводилось в течение четырех недель (внутривенное введение) с еженедельной оценкой уровня глюкозы в крови и уровня альбумина/креатинина в моче. По окончании периода лечения у животных брали следующие пробы:
- Кровь для измерения уровня глюкозы и азота мочевины в крови (BUN)
- Кровь для измерения креатинина сыворотки
- Мочу для окончательного соотношения альбумин/креатинин
- Выполняли резекцию почки и проводили окрашивание FFPE: пикро-сириус красный, трихром Массона и окрашивание H&E для выявления областей фиброза, а также признаков мезангиального склероза, гиалиноза артериол, утолщения базальной мембраны клубочков (GBM).
Чтобы оценить влияние соединения на диабетическую ретинопатию, животных еженедельно снимали с помощью камеры Fundus. Непосредственно перед умерщвлением животным вводили FITC-декстран через хвостовую вену. При отборе проб брали глаза и фиксировали в формалине. Подготавливали плоские препараты сетчатки и исследовали флуоресцентно, наблюдая за влиянием соединения на васкуляризацию и проницаемость сосудов (об этом свидетельствовало сильное фоновое окрашивание). Группы животных (n=8 мышей в группе):
Таблица 50:
Лечение продолжалось в течение 4 недель (28 дней) с еженедельным измерением уровня глюкозы в крови и альбумина/креатинина в моче.
Умерщвление осуществляли после дозирования последнего соединения (агента), забора органов и крови.
Таблица 51: график исследования
Умерщвление
Моча ALB/CREA
Моча ALB/CREA
Моча ALB/CREA
Моча ALB/CREA
Моча ALB/CREA
Моча ALB/CREA
Почки
Глаза
Серийные наблюдения
Масса тела: Массу тела всех мышей, участвовавших в исследовании, измеряли и записывали ежедневно; эта информация использовалась для расчета точной дозировки для каждого животного.
Общие признаки и симптомы: Мышей наблюдали ежедневно и отмечали любые признаки дистресса или изменения общего состояния, например неровную шерсть, отсутствие движения, затрудненное дыхание.
Отбор проб и последующий анализ
Непосредственно перед заключительным отбором проб 4 животным в группе вводили FITC-декстран для оценки плоскостного препарата сетчатки.
Терминальный отбор проб:
Терминальные образцы крови были взяты путем пункции сердца и плазмы/сыворотки, приготовленной у каждого животного.
Измерение уровня глюкозы в крови
Измерение уровня глюкозы в сыворотке
Определение BUN
Моча ALB/креатинин
ELISA для CRP, TNF-α, IL-6 и TGF-β
Оставшуюся плазму сохраняли для анализа цитокинов
o Ткань почки иссекали и взвешивали
Одну почку быстро замораживали для возможного биоанализа или другого анализа.
Одну почку фиксировали в формалине и заливали парафином.
Скрининг на трихромное окрашивание H&E и Masson для
Мезангиальный и гломерулосклероз,
Артериолярный гиалиноз
Утолщение GBM
Ткань глаза должна быть FFPE
Другой глаз (4 на группу лечения) использовался для анализа сетчатки на плоском снимке для измерения сосудистого паттерна
Площадь, покрытая капиллярами
Оценка сосудистой утечки
Завершение: Конечные исследуемые животные были выбракованы путем вдыхания CO2. Перед остановкой животных взвешивали.
Полученные результаты: соединения Ia-001a, IIIc-061 и IVc-059a значительно снижали уровень глюкозы в крови у мышей линии DBA/2 с индукцией диабета STZ, как показано на фигуре 9 (показаны одна и две недели).
Пример 5.9: Лечение и/или предупреждение болезни Бехчета (BD)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследуют на мышиной модели болезни Бехчета, как описано ZHENG et al. (Acta Derm Venereol 2015; 95: 952-958).
Болезнь Бехчета представляет собой хроническое, рецидивирующее, мультисистемное, воспалительное заболевание, поражающее в основном слизистую оболочку полости рта и мочеполовой системы, а также увеальный тракт. Хотя этиология и патогенез болезни Бехчета неизвестны, были предложены многочисленные этиологии, включая экологические, инфекционные и иммунологические факторы; аутоиммунная основа, характеризующаяся циркулирующими иммунными комплексами и активацией комплемента, получила все большее признание. Чтобы проверить и понять иммунопатогенез болезни Бехчета, разрабатываются модели животных на основе загрязнителей окружающей среды, пептидов, полученных из белков теплового шока бактерий и человека, и инъекций вирусов. Использование этих животных моделей по отдельности и/или одновременно позволяет более эффективно исследовать болезнь Бехчета.
Недавно были разработаны модели на животных, чтобы найти эффективные и безопасные варианты лечения. Активация нейтрофилов является одним из аспектов иммунопатогенеза BD. Нейтрофилы играют ключевую роль во врожденных иммунных реакциях. Поскольку типичные поражения ББ, такие как пустулезный фолликулит, патергические реакции и гипопион, имеют значительную инфильтрацию нейтрофилов, были исследованы функции нейтрофилов и статус активации. Имеются противоречивые сообщения о повышенной, нормальной или сниженной базальной и стимулированной fMLP продукции супероксида, фагоцитозе, хемотаксисе и нейтрофильно-эндотелиальной адгезии при BD. В HLA-трансгенной предполагаемой модели BD единственной наблюдаемой аномалией является повышенное высвобождение супероксида в ответ на fMLP. Высокие реакции супероксида также присутствуют у пациентов с HLA-B51+ и у здоровых людей в том же исследовании.
Модель мыши, подобной болезни Бехчета, разработана путем инокуляции HSV типа 1, выращенного в клетках Vero, у самцов мышей, приобретенных в институте исследования рака (ICR) в возрасте 4-5 недель. Вкратце, мочки ушей подопытных мышей прокалывают иглой и дважды с 10-дневным интервалом инокулируют вирусом. За инфицированными мышами наблюдают в течение 16 недель после последней прививки. В качестве модели мышей, подобных BD, используют мышей, инфицированных HSV, проявляющих по меньшей мере 2 симптома Бехчета (n=5). Как неинфицированные мыши ICR (n=2), так и мыши, инфицированные HSV, но бессимптомные.
Пример 5.10: Лечение и/или предупреждение увеита (UVE)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению тестируют с использованием животных моделей аутоиммунного увеита, включая индуцированный эндотоксином увеит (EIU) у крыс, как описано Fruchon S et al. (Molecules. 2013;18(8):9305-9316. Published 2013 Aug 5. doi:10.3390/molecules18089305). Эта модель считается клинически значимой моделью переднего увеита человека. Он заключается в системном введении липополисахарида (LPS), что приводит к острой воспалительной реакции в переднем и заднем сегментах глаза с нарушением гематоофтальмического барьера и воспалительной клеточной инфильтрацией. Клинические признаки EIU отражают изменения, наблюдаемые при заболевании человека. Таким образом, терапевтическое действие соединений по настоящему изобретению тестируют на модели EIU у крыс в сравнении с «золотым стандартом» дексаметазоном.
Животные: Учитывались только животные без видимых признаков глазных дефектов. Животных осматривали в течение предтестового периода, особое внимание уделяли глазам. Их держали под наблюдением в течение одной недели перед экспериментом. Животные содержались индивидуально в стандартных клетках и имели свободный доступ к пище и водопроводной воде.
Исследование глазной переносимости: Исследование состояло из трех групп по три самца крыс Sprague-Dawley. В день 0 животных взвешивали, анестезировали и вводили однократно интравитреально в объеме 5 мкл в оба глаза. Первая группа получала солевой носитель (NaCl 0,9%), а другие группы получали различные дозы соединений по настоящему изобретению. Каждое животное затем оценивали путем клинического наблюдения и осмотра глаз. Офтальмологические исследования включали фундоскопию, исследование роговицы с помощью щелевой лампы (SLE) с использованием флуоресцеинового красителя, позволяющего оценить по шкале Макдональда-Шаддака. Система оценки Макдональда-Шаддака оценивает: параметры конъюнктивы (конгестия, отек и выделения), водянистую гиперемию (интенсивность феномена Тиндаля) как предполагаемое свидетельство нарушения гемато-водного барьера; инъекция вторичных и третичных сосудов в радужку; помутнение, его относительная площадь, неоваскуляризация и целостность эпителия (мечение флуоресцеином) роговицы; целостность объектива. После окончательного осмотра глаз всех животных умерщвляли. Глаза собирали при вскрытии, фиксировали в модифицированном растворе Дэвидсона в течение 12 часов, затем обрабатывали 10% нейтральным забуференным формалином и обрабатывали для гистологии. Срезы ткани, окрашенные гематоксилином-эозином, оценивались с помощью световой микроскопии сертифицированным ветеринарным патологоанатомом.
Эндотоксин-индуцированный увеит (EIU) Крысиная модель: Тридцать шесть самок крыс-альбиносов Льюис случайным образом делили на шесть групп по шесть животных в каждой. EIU вызывали инъекцией 100 мкл стерильного апирогенного физиологического раствора, содержащего 200 мкг LPS (липополисахарид из Salmonella typhimurium, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin, Франция), в подушечку стопы. Животных обрабатывали непосредственно перед индукцией EIU путем интравитреальной инъекции в оба глаза 5 мкл физиологического раствора (NaCl 0,9%), не содержащего активного ингредиента, или с тестируемыми соединениями, или 20 мкг дексаметазона. Животных осматривали на щелевой лампе (SLE) в 24 ч, т. е. в клиническом пике заболевания на данной модели. Интенсивность клинического воспаления глаз оценивали по шкале от 0 до 5 для каждого глаза. 0-я степень указывала на отсутствие воспаления. Степень 1 указывала на наличие минимальной вазодилатации радужной оболочки и конъюнктивы, но без наблюдения бликов или клеток в передней камере (AC). Степень 2 указывала на наличие умеренного расширения радужной оболочки и сосудов конъюнктивы, но без явного выпячивания или клеток в АС. 3 степень указывала на наличие выраженного расширения сосудов радужной оболочки, бликов и менее десяти клеток на поле щелевой лампы в АС. Степень 4 указывала на наличие более тяжелых клинических признаков, чем степень 3, с более чем десятью клетками на поле зрения щелевой лампы в АС, с образованием гипопиона или без него. Степень 5 указывала на наличие выраженной воспалительной реакции, фибринообразования в AC и тотальной замкнутости зрачка. В конце эксперимента, т.е. через 24 ч после заражения ЛПС, крыс анестезировали внутрибрюшинной инъекцией пентобарбитала (30 мг/кг), а затем умерщвляли летальной дозой пентобарбитала.
Измерение концентраций цитокинов в глазных жидкостях: После умерщвления брали водянистую влагу и стекловидное тело из обоих глаз каждого животного. Количество провоспалительных Т-хелперных цитокинов TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-17 и IFNγ, а также противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 определяли мультиплексным анализом.
Измерение концентраций цитокинов в сыворотке: Сыворотки от трех групп крыс (солевой носитель, соединение 10 мкг и дексаметазон) собирали в конце эксперимента и хранят при температуре -80°C. Их использовали для одновременного определения уровней пяти цитокинов (IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4 и IL-10) с помощью набора цитометрических шариков (набор CBA Flex для крыс, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) на проточном цитометре FACS Calibur (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Количества каждого из цитокинов анализировали относительно стандартных кривых с использованием программного обеспечения FCAP ArrayFCAP Array (BD Biosciences).
Пример 5.11: Лечение и/или предупреждение диабетической сенсомоторной полинейропатии и диабетической нейропатии
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали с использованием крысиных моделей диабетической периферической невропатии (Kambiz S. et al. (PLoS One. 2015;10(6):e0131144]; PLoS One. 2015; 10(5):e0126892. Published 2015 May 18. doi: 10.1371/journal.pone,0126892).
Животные: Самки крыс WAG/RijHsd (n=27, возраст 10 недель, вес 130-150 грамм) приобретали у компании Charles River (lʼArbresle, France). Животных помещали попарно в клетки с капюшоном при комнатной температуре по 12-часовому графику свет/темнота и давали воду и корм вволю.
Индукция диабета: Диабет индуцировался у 21 крысы однократной внутрибрюшинной инъекцией STZ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в дозе 65 мг/кг массы тела в 0,05 моль/л цитратно-натриевого буфера, рН 4,5, как описано ранее. Крыс случайным образом распределяют на 3 группы: А, В и С (n=7 в каждой группе). После индукции диабета группа А погибала через 4 недели, группа В через 6 недель и группа С через 8 недель. Контрольная группа состояла из 6 крыс, которым однократно внутрибрюшинно вводили равный объем носителя без STZ. За контрольными крысами наблюдали в течение 8 недель. Глюкозу крови измеряли в крови из хвостовой вены с помощью глюкометра (OneTouch, LifeScan, Milpitas, California, USA). Диабет диагностировали у крыс, когда уровень глюкозы в крови был выше 20 ммоль/л в течение всех 4 недель после индукции диабета.
Кровоток и оксигенация кожи подошвенной поверхности задних лап: комбинированная система лазерной допплеровской флоуметрии и спектрофотометрии (O2C, LEA Medizintechnik, Giessen, Germany) использовалась для неинвазивного измерения кровотока и насыщения кислородом гладкой подошвенной поверхности задних лап. Как у диабетических, так и у контрольных крыс процентное насыщение кислородом и количество кожного кровотока оценивали через 4, 6 и 8 недель.
Скорость согревания после холодового воздействия: Температуру кожи оценивали с помощью встроенной инфракрасной цифровой видеокамеры (320×240 пикселей) с помощью системы сбора данных с частотой 1 Гц (ThermaCAM Researcher 2001 HS; FLIR Systems, Berchem, Belgium), и все данные непрерывно собирали ноутбуком. Расстояние между камерой и задней лапой было 13 см±2 см. Размер пикселя записи температуры был 0,8×0,8 мм. Температуру кожи всей подошвенной части задней лапы регистрировали, когда животное фиксировали после помещения животного на пластину с температурой 14°C на 5 секунд. Минимальную температуру подошвенных задних лап экспортировали в текстовые файлы с помощью ThermaCAM Researcher Pro (версия 2001-HS; FLIR Systems, Wilsonville, Oregon, USA). Интересующую область выбирали путем рисования линии, окружающей все подошвенные задние лапы. Средняя скорость согревания показана как увеличение температуры кожи за 120 секунд.
Термическая чувствительность: Чтобы определить возникновение тепловой гиперчувствительности, проводили тесты на холод и горячую пластину, как описано ранее. Короче говоря, крыс помещали в открытую камеру с прозрачными стенками и температурой поверхности либо 5°C (холодная пластина), либо 50°C (горячая пластина). Эти эксперименты проводили в разные дни, чтобы предотвратить помехи. Наблюдали время до отдергивания или облизывания задних лап.
Тест фон Фрея: В тесте фон Фрея, используемом для определения порога механической чувствительности для ноцицепции, каждую крысу помещали в камеру с металлическим сетчатым полом. Затем 5 раз наносили волоски фон Фрея весом от 2 до 300 граммов, и результат считался положительным, когда наблюдался минимум 3 взмаха лапой (рефлекторная реакция животного на отдергивание), как описано ранее. Контрольная группа служила эталонной группой.
Электромиография (EMG): Иннервацию двигательных аксонов в мышцах оценивали, регистрируя пик-пик вызванных амплитуд СМАР и латентность икроножных мышц в группах диабетиков и контрольных животных. Пиковые амплитуды и задержки CMAP записывали и усредняли по партии из 20 ответов. Средние амплитуды в каждой группе диабета сравнивали с контрольной группой. MNCV рассчитывается как расстояние от стимулирующего электрода до записывающего электрода (мм)/задержка (мс).
Подготовка ткани: Через 4, 6 или 8 недель животных умерщвляли передозировкой пентобарбитала (100 мг/кг внутрибрюшинно). У каждой крысы рассекали подошвенную кожу задней лапы и фиксировали непосредственно погружением в 2% параформальдегид-лизин-периодат (PLP) на 24 часа при температуре 4°С. Кожу дополнительно обрабатывали и заливали желатином, как описано ранее. Наконец, встроенную кожу разрезали на 40 мкм с помощью замораживающего микротома и собирали в глицерине для длительного хранения при температуре -20°C.
Ткань поджелудочной железы крыс собирали, фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина и заливали парафином. Впоследствии эти образцы окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Каждый образец оценивали с помощью светлопольного микроскопа и сканировали в цифровые слайды (серия Nanozoomer 2.0, Hamamatzu, Japan).
Иммуногистохимия: Иммуногистохимию срезов кожи проводили, как описано ранее, для полуколичественного определения плотности чувствительных нервных волокон, иннервирующих кожу, и для оценки наличия CD-31-положительных эндотелиальных клеток. Срезы кожи инкубировали в течение 48 часов в коктейле из 2% БСА, содержащем разбавленное первичное антитело Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5, 1/10000, антикроличьи, Enzo Life Sciences, New York, USA), или анти-CD31+(1/5000, антикроличьи, Spring Bioscience, California, USA) при температуре 4°C. Затем срезы кожи инкубировали с соответствующими вторичными биотинилированными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP) (1/200, Biotine, Sigma-Aldrich, Сен (HRP) (1/200, Biotine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в течение 90 мин при комнатной температуре. Затем использовали реакцию 3,3ʼ-диаминобензидина (DAB) для выявления антигенных сайтов связывания первичных антител. После этого срезы помещали на предметные стекла и срезы, окрашенные CD31+, окрашивали 0,05% тионина в течение 4 минут, который окрашивал кератиноциты в синий цвет. Наконец, все срезы кожи обезвоживали с использованием абсолютного этанола (<0,01% метанола), переносили в ксилол и покрывали покровным стеклом Permount (Fisher Scientific, Hampton, NH).
Каждый срез кожи сканировали в 3 слоя по 8 мкм каждый с помощью серии Nanozoomer 2.0 (серия Nanozoomer 2.0, Hamamatzu, Japan). В четырех проксимальных и 4 дистальных срезах кожи подошвенной части задней лапы определяли количество эпидермальных нервных волокон в центральной части подошвенной задней лапы (80 000 мкм2) с использованием объектива с увеличением 40× в программном обеспечении ImageScope (Aperio ImageScope v11.1.2.760). Среднее число меченых нервных волокон на мм2 и среднюю толщину эпидермиса рассчитывали для каждой крысы. Процент CD31-позитивных клеток подсчитывали с помощью Leica Cell-D (Olympus, программное обеспечение Imaging для биомедицинской микроскопии, USA) в 4 проксимальных и 4 дистальных срезах кожи по всей верхней дерме подошвенной поверхности задней лапы.
Пример 5.12: Лечение и/или предупреждение кишечного фиброза
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследуют с использованием крысиных или мышиных моделей, как описано Pham BT et al. (Physiol Rep. 2015;3(4):e12323. doi: 10.14814/phy2.12323).
Получение ядер кишечника крыс и мышей: Использовали взрослых не голодающих самцов крыс Wistar и мышей C57BL/6 (Harlan PBC, Zeist, The Netherlands). Крыс и мышей помещали на 12-часовой цикл свет/темнота в помещении с регулируемой температурой и влажностью, кормили (Harlan chow no 2018, Horst, The Netherlands) и поили без ограничений. Животным давали акклиматизироваться не менее чем за семь дней до начала эксперимента.
Крыс и мышей анестезировали изофлураном/O2 (Nicholas Piramal, London, UK). Тощую кишку крысы (примерно на 25 см дистальнее желудка и 15 см в длину) и тощую кишку мыши (примерно на 15 см дистальнее желудка и 10 см в длину) вырезали и хранили в ледяном буфере Кребса-Хензелейта (KHB) с добавлением 25 мМ d-глюкозы (Merck, Darmstadt, Germany), 25 мМ NaHCO3 (Merck), 10 мМ HEPES (MP Biomedicals, Aurora, OH), насыщенного карбогеном (95% O2/5% CO2) и доводили до pH 7,4. Тощую кишку очищали путем промывания KHB через просвет и затем делили на сегменты по 2 см. Эти сегменты заполняли 3% (масса/объем) раствором агарозы в 0,9% NaCl при температуре 37°C и встраивали в агарозный блок для встраивания ядер.
Получение ядер кишечника человека: здоровую ткань тощей кишки человека получали для исследования из кишечника, резецированного у пациентов, перенесших панкреатодуоденальную резекцию.
Здоровую тощую кишку хранили в ледяной KHB до процедуры заливки. Подслизистую, мышечную и серозную оболочки осторожно удаляли со слизистой оболочки в течение часа после забора ткани. Слизистую оболочку разделяли на листы размером 0,4 см × 1 см. Эти листы заливали 3% раствором агарозы (масса/объем) в 0,9% NaCl при температуре 37°C и вставляют в блок для встраивания.
Получение PCIS: PCIS готовили в ледяной KHB с помощью слайсера ткани Krumdieck (Alabama Research and Development). Срезы сырой массой 3-4 мг имели расчетную толщину 300-400 мкм. Срезы хранили в ледяной KHB до начала экспериментов.
Инкубирование кишечных срезов: Срезы инкубировали в 12-луночных планшетах для PCIS человека (hPCIS) и PCIS крысы (rPCIS) или в 24-луночных планшетах для PCIS мыши (mPCIS). hPCIS и rPCIS инкубировали по отдельности в 1,3 мл, и mPCIS в 0,5 мл среды Вильямса E с L-глутамином (Invitrogen, Paisly, UK), дополненной 25 мМ глюкозы, 50 мкг/мл гентамицина (Invitrogen) и 2,5 мкг/мл амфотерицина-В (Invitrogen). Во время инкубации (при температуре 37°С и 80% О2/5% СО2) в инкубаторе (МСО-18М, Sanyo) планшеты горизонтально встряхивают при 90 об/мин (амплитуда 2 см). rPCIS инкубировали до 24 часов, mPCIS и hPCIS инкубировали до 72 часов с TGF-β1 человека и без него (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) в диапазоне концентраций от 1 до 10 нг/мл. Все инкубации проводили многократно (с использованием 3-6 срезов, инкубируемых индивидуально в отдельных лунках) и повторяли с кишечником от 3 до 16 разных людей, крыс или мышей.
Жизнеспособность и морфология: Жизнеспособность оценивали путем измерения содержания аденозинтрифосфата (ATP) в PCIS. Вкратце, после инкубации срезы переносили в 1 мл раствора для обработки ультразвуком (содержащего 70% этанола и 2 мМ ЭДТА), мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C. Чтобы определить жизнеспособность, уровни ATP измеряли в супернатанте образцов, обработанных ультразвуком в течение 45 секунд и центрифугированных в течение 2 минут при температуре 4°C при 16000×g с использованием набора для биолюминесценции ATPATP (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Значения ATP (пмоль) нормализовали к общему содержанию белка (мкг) PCIS, оцененному методом Лоури (BIO-rad RC DC Protein Assay, Bio Rad, Veenendaal, The Netherlands). Для оценки морфологии инкубированные срезы фиксируют в 4% формалине и заливают в парафин. Делали срезы размером 4 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (HE). Срезы HE оценивали по модифицированной шкале Парка, описывающей последовательность развития повреждения тканей в кишечнике после ишемии и реперфузии. Целостность семи сегментов PCIS оценивали по шкале от 0 до 3. Жизнеспособность эпителия, стромы, крипт и мышечного слоя оценивали отдельно, оценивая как 0, если некроз отсутствовал, и как 3, если присутствовал массивный некроз. Остальные участки кишечного среза оценивали следующим образом: форма эпителия: 0=кубический эпителий, 3=более 2/3 клеток плоские, уплощение ворсин: 0=нормальная, 3=более 2/3 ворсинки уплощены, степень отека: 0=нет отека, 3=выраженный отек. Максимальный балл 21 указывает на серьезное повреждение. В образцах человека определяют морфологическую оценку мышечной оболочки слизистых оболочек в разделе «мышечный слой». B.T.P., W.T.v.H. и J.N. проводили слепой подсчет очков; рассчитывали среднее из трех общих баллов.
Экспрессия генов: Экспрессию генов фиброза, а именно COL1A1, αSMA, HSP47, CTGF, FN2, TGF-β1, PAI-1, и SYN определяли либо методом Taqman, либо методом SYBRgreen. В hPCIS экспрессию гена ELA также измеряли методом SYBRgreen.
Кишечный фиброз является серьезным, но распространенным исходом у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (IBD). Несмотря на успехи в разработке новых методов лечения хронического воспаления кишечника, характерного для IBD, на сегодняшний день не существует эффективных антифиброзных методов лечения. Таким образом, более глубокое понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе фиброза кишечника, и наличие соответствующих моделей на животных имеют решающее значение для продвижения этой области исследований.
IL-17 и ассоциированные медиаторы: клетки Th17 определяют подгруппу Т-хелперных клеток, которые в основном продуцируют IL-17A, а также IL-17F, IL-21, и IL-22, и все чаще признаются первостепенными при некоторых хронических воспалительных заболеваниях, включая IBD (7). IL-17A участвует в фиброзе многих органов, включая легкие (8), печень (9) и сердце (10); недавние исследования также подтверждают его роль в кишечнике, связывая иммунные ответы IL-17/Th17 и другие связанные медиаторы в патогенезе фиброза кишечника.
Другие животные модели фиброза кишечника описаны ниже:
Таблица 52:
Пример 5.13: Лечение и/или предупреждение фиброза яичников
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали с использованием мышиной модели синдрома гиперстимуляции яичников (OHSS), описанной Pala Ş et al. (Drug Des Devel Ther. 2015;9:1761-1766. Published 2015 Mar 24. doi:10.2147/DDDT.S75266) для изучения влияния исследуемых соединений на гистопатологию яичников, сывороточные уровни VEGF и эндотелина 1 при синдроме гиперстимуляции яичников (OHSS) в экспериментальных условиях.
Животные: Использовали самок белых крыс Wistar в возрасте 22 дней и случайным образом делили на группы. Фолликулостимулирующий гормон в дозе 10 МЕ вводили подкожно 15 крысам 4 дня подряд с индукцией OHSS на 5-й день хорионическим гонадотропином по 30 МЕ. В 1-ю группу входили 35-дневные контрольные крысы, во 2-ю группу входили 35-дневные крысы с OHSS, в 3-ю группу входили 27-дневные крысы с OHSS, получавшие исследуемые соединения в течение 7 сут. Затем всех крыс обезглавливают на 35 день. У всех крыс оценивают сывороточный VEGF, эндотелин 1 и фолликулярный резерв яичников.
Измерения гематокрита и веса проводят на 13-й день, а декапитацию проводят на 35-й день под общей анестезией путем внутрибрюшинного введения кетамина (75 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
Иммуноферментный анализ: От каждой обезглавленной крысы получали приблизительно 3 мл образца крови. Сыворотки отделяли центрифугированием образцов крови при 2500 об/мин в течение 4 минут и выдерживают при температуре -20°C до определения VEGF и эндотелина 1. VEGF анализировали с использованием набора для иммуноферментного анализа мышиного VEGF (EFM-VEGF-001; RayBio, USA) и эндотелин измеряли с использованием эндотелина 1 E/Kit (EK-023-01; Phoenix Pharmaceuticals, USA).
Морфология яичников: После лапаротомии яичники удаляли, очищали от прилипшей ткани в культуральной среде и взвешивали. Ткань яичника фиксировали 10% формальдегидом, а затем образцы ткани, залитые парафином, разрезали на поперечные срезы 4 мкм для оценки среднего количества фолликулов яичника. Срезы окрашивали трихромом Массона для определения OFR под световой микроскопией (Olympus BX-50). Поперечные срезы толщиной 4 мкм монтировали с интервалом 50 мкм на предметные стекла микроскопа, чтобы предотвратить повторный подсчет одной и той же структуры в соответствии с ранее описанным методом. 12 Фолликулы делили на примордиальные, первичные, вторичные и третичные. Атретический фолликул (AF) определяли как фолликул, имеющий более десяти пикнотических ядер; для самых маленьких фолликулов критериями атрезии являются дегенерация ооцита, преждевременное формирование антрального отдела или и то, и другое.
Основные показатели исхода: Основными показателями исхода являются возраст (дни), масса тела (г), гематокрит (%), масса яичников (мг), уровни VEGF в сыворотке (пг/мл) и эндотелина 1 (нг/мл) и общее количество фолликулов с определением количества примордиальных, первичных, вторичных и третичных фолликулов.
Пример 5.14: Лечение и/или предупреждение синдрома поликистозных яичников (PCOS)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали на животной модели индуцированного DHEA, как описано Wang D et al. (J Ovarian Res. 2018;11(1):6. Published 2018 Jan 10. doi:10.1186/s13048-017-0375-7).
Синдром поликистозных яичников (PCOS) является распространенным метаболическим и эндокринным заболеванием, патологические механизмы которого остаются неясными. В следующем исследовании исследуется гиперфиброз яичников, формирующийся через сигнальный путь трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) на крысиной модели синдрома поликистозных яичников (PCOS), индуцированного дегидроэпиандростероном (DHEA).
Животные: Для этого анализа используют 30 самок крыс Sprague-Dawley (SD) в возрасте 21 дня, весом ~50 г. Животных содержали в свободной от специфических патогенов (SPF) среде с температурой 22 ± 1°C, относительной влажностью 50 ± 1% и циклом свет/темнота 12/12 часов. Был предоставлен свободный доступ к еде и воде.
Методы: Тридцать самок крыс Sprague-Dawley случайным образом делили на группу, получавшую холостой раствор, (n = 6), группу, получавшую масло, (n = 6) и эталонную группу, индуцированную маслом+DHEA (n = 6 + 12). Эталонную группу формировали путем подкожной инъекции DHEA в течение 35 последовательных дней. Крыс дополнительно делили на группу носителя (n = 6) и группу лечения (n = 6). Лечение проводится один раз в день, и лечение продолжали в течение 35 дней. Через восемнадцать дней после лечения у всех крыс ежедневно собирали вагинальные мазки путем оценки типов клеток в течение 14 дней, чтобы ежедневно определять их эстральные циклы. На 36-й день всех крыс в группах, получавших холостой раствор и масло, и шесть крыс из эталонных групп, индуцированных DHEA, подвергали эвтаназии (с помощью внутрибрюшинной инъекции избытка 5% хлоралгидрата), собирали кровь (из верхней полой вены), двусторонние яичники и рассекается матка.
Яичники фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 24 ч при температуре 4°яС, а затем заливали парафином. Остальные ткани замораживали при температуре -80°C для дальнейшего вестерн-блоттинга и анализа полимеразной цепной реакцией в реальном времени (RT-PCR).
Оставшихся 12 крыс из модельных групп, индуцированных DHEA, рандомизируют в дополнительные две группы: группу, получающую лечение, и группу, получающую носитель (контрольная группа), по шесть крыс в группе. Во время этого лечения крысам больше не давали DHEA. Лечение продолжали в течение 2 недель, после чего всех животных подвергали эвтаназии, собирали кровь и проводили двустороннее рассечение яичников и маток в соответствии с указанными выше инструкциями.
Морфологию яичников, локализацию и экспрессию фибрина и коллагена в яичниках определяли с помощью окрашивания H&E, иммуногистохимии и окрашивания сириусом красным. Овариальный белок и РНК исследовали с помощью Вестерн-блоттинга и RT-PCR.
Эстральный цикл: На 18-й день после обработки DHEA у всех крыс собирали вагинальные мазки. Затем образцы обрабатывали толуидиновым синим в течение 30 мин, после чего под оптическим микроскопом исследовали морфологию клеток и эстральные циклы (Leica Microsystems, Germany).
Уровень гормонов в сыворотке: Образцы крови брали из верхней полой вены. Сыворотку немедленно отделяли и хранили при температуре -20°C для дальнейшего определения гормонов методом иммуноферментного анализа на основе иммуносорбентов (ELISA) (тестостерон (T), эстрадиол (E2), лютеинизирующий гормон (LH), фолликулостимулирующий гормон (FSH)) (наборы ELISA для крыс T, E2, LH и FSH, USCN, Wuhan, China).
Пример 5.15: Лечение и/или предупреждение первичного билиарного холангита (PBC)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению оценивают с использованием мышиной модели PBC, как описано Hohenester S et al. (Cells. 2020, 9(2), 281. doi: 10.3390/cells9020281).
Холестатические заболевания печени, такие как первичный билиарный холангит (PBC) или первичный склерозирующий холангит (PSC) являются хроническими прогрессирующими заболеваниями, которые часто приводят к циррозу печени с последующими осложнениями. Считается, что гидрофобные соли желчных кислот способствуют фиброзу печени при холестазе. Однако доказательства этой широко распространенной гипотезы остаются скудными.
В установленных животных моделях холестаза, например, при нокауте Mdr2, холестаз и фиброз являются вторичными по отношению к повреждению желчевыводящих путей.
Поэтому, чтобы проверить специфический вклад накопления желчных солей в фиброз печени при холестатическом заболевании, использовали уникальная модель индуцируемого гепатоцеллюлярного холестаза у мышей Atp8b1G308V/G308V, получавших холат. Гликохенодезоксихолат (GCDCA) добавляли для гуманизации пула солей желчных кислот мышей, что подтверждалось ВЭЖХ. Количественно определяли биомаркеры холестаза и фиброза печени. Звездчатые клетки печени (HSC), выделенные от мышей дикого типа, стимулировали солями желчных кислот. Определяли пролиферацию, накопление клеток и отложение коллагена HSC. У холестатических мышей Atp8b1G308V/G308V повышенная экспрессия в печени mRNA αSMA и коллагена 1а, а также избыточное отложение коллагена в печени указывало на развитие фиброза печени только при добавлении GCDCA. In vitro количество миофибробластов и отложение коллагена увеличивалось после инкубации с гидрофобными, но не гидрофильными солями желчных кислот и связывалось с активацией EGFR и MEK1/2. Соли желчных кислот могут оказывать прямое профибротическое действие на HSC, предположительно задействуя передачу сигналов EGFR и MEK1/2.
Эксперименты на животных: Самцов животных использовали для исследований in vivo в возрасте 8 недель. Животных содержали при 12-часовом цикле свет-темнота в обогащенной среде с неограниченным доступом к пище и воде.
Биохимия сыворотки и измерения желчных солей в сыворотке: Уровни щелочной фосфатазы, билирубина и аланинаминотрансферазы в сыворотке количественно определяли из свежей сыворотки на полностью автоматизированном анализаторе respons® 910 (DiaSys, Holzheim, Germany). Уровни общих желчных солей в сыворотке определяли ферментативно с использованием набора для определения общего содержания желчных солей Diazyme (Diazyme Laboratories, Poway, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя.
Гистология печени, иммуногистохимия и количественное определение гидроксипролина: Блоки парафина разрезали на срезы толщиной 4 мкм и помещали на предметные стекла микроскопа (Superfrost plus, Thermo Scientific/Menzel, Braunschweig, Germany). После поэтапной депарафинизации и регидратации препараты окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Иммуногистохимию проводили против альфа-СМА с использованием моноклонального кроличьего антитела против альфа-актина гладких мышц (Abeam, Cambridge, UK). Для количественного определения коллагена предметные стекла окрашивали в течение 1 ч красителем Direct Red 80 (Sirius Red, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) и дважды обесцвечивали в этаноле и один раз в ксилоле. Для количественного определения общей ДНК в качестве суррогата количества клеток HSC инкубировали с PicoGreen® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и регистрировали сигналы флуоресценции с помощью системы CytoFluor 4000 (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, USA). Пролиферацию HSC количественно оценивали с использованием набора для анализа BrdU (Roche, Penzberg, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Для количественного определения общего количества клеток HSC, посеянные в предметные стекла камеры Lab-Tek II (Nunc, Rochester, NY, USA USA), монтировали на предметные стекла с посадочной средой Vectashield, включая DAPI (Vector, Burlingame, CA, USA). Слайды сканировали с помощью Pannoramic Midi Slide Scanner (3DHistech, Budapest, Hungary) и проводили подсчет ядер с помощью программного обеспечения ImageJ2 на полном слайде (0,7 см2).
Коллагеновая количественная оценка in vitro : Клетки промывали PBS и окрашивали в течение 1 ч 0,1% Sirius Red в насыщенной пикриновой кислоте. Затем клетки трижды промывали 100% этанолом, связанный краситель растворяли в смеси 50% метанол/гидроксид натрия (50 ммоль/л) и измеряли поглощение при 540 нм.
Пример 5.16: Лечение и/или предупреждение фиброза или цирроза печени (HF)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению в отношении ингибирования спонтанного хронического воспаления и фиброза печени оценивают с использованием установленных моделей NOD-воспалительного фиброза (N-IF) у мышей, как описано Fransen Pettersson et al. (PLoS One. 2018; 13(9): e0203228. doi: 10.1371/journal.pone.0203228).
Животные: У мышей N-IF спонтанно развивалось хроническое воспаление и фиброз печени, вызванные трансгенными клетками Т-клеточного рецептора (TCR) естественных киллеров T (NKT)-II, созданными у иммунодефицитных мышей NOD.Rag2-/-. Некоторые компоненты патологии печени у мышей N-IF перекрывались с таковыми у человека, при которых прогрессирующее хроническое воспаление предшествовало развитию фиброза. Кроме того, было показано, что фиброз, развивавшийся в печени N-IF мышей, связан с накоплением звездчатых клеток печени, экспрессирующих α-SMA. Эти фенотипические сходства делали модель мыши N-IF уникальной по сравнению с другими доступными моделями фиброза печени на грызунах и предоставляли новый инструмент для проверки эффективности антифиброзных препаратов-кандидатов.
Животных ежедневно осматривали на наличие признаков плохого самочувствия, собирали мочу и измеряли содержание белка в моче. Во время вскрытия регистрировали массу печени и почек. У каждого фиксированного животного вырезали печень и почки, делали срезы и окрашивали Sirius Red и H&E. Для измерения гидроксипролина использовался кусочек каждой печени.
Измерение гидроксипролина: Содержание гидроксипролина в печени и селезенке определяли с использованием набора для колориметрического анализа гидроксипролина (BioVision, Milpitas, CA, USA).
Гистология: После лечения мышей анестезировали и перфузировали PBS посредством внутрисердечной пункции. Печень и селезенку взвешивали, и биоптаты органов фиксировали в 4% нейтральном забуференном формалине, заливали парафином и делали срезы.
Пример 5.17: Лечение и/или предупреждение неалкогольного стеатогепатита (NASH)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению оценивают с использованием мышиной модели NASH, как описано Barbara Ulmasov B. et al. (Hepatology Communications, 2018, 3(2) - https://doi.org/10.1002/hep4.1298).
Мыши: 5-недельных самцов мышей C57BL/6J помещали в стандартные помещения с контролируемыми условиями температуры, влажности и 12-часовым/12-часовым циклом свет/темнота со свободным доступом к воде.
Модель NASH на мышах с дефицитом холина, определением L-аминокислот и высоким содержанием жиров: диета с дефицитом холина, аминокислотами и высоким содержанием жиров (CDAHFD)22 приобретали у компании Research Diets (A06071309; New Brunswick, NJ). Эта диета сформулирована как диета с высоким содержанием жиров и дефицитом холина, которая включает 0,1% метионина и 45% ккал% жира (20% свиного сала, 25% соевого масла). Контрольная диета представляет собой стандартный корм для грызунов, содержащий 13,6% калорий из жира. Начиная с 6-недельного возраста, 30 мышей переводили на CDAHFD и 30 мышей на стандартную диету. По истечении 6 недель по 10 мышей из каждой диетической группы подвергали голоданию в течение 5 часов и умерщвляли. Собирали образцы крови и печени. Печень делили на срезы, которые фиксировали в 10% формалине с фосфатным буфером, замораживали в жидком азоте или помещали в раствор для стабилизации RNA для последующей оценки. Остальных мышей держали на диете еще 4 недели, всего 10 недель, а затем подвергали голоданию, умерщвляли и собирали образцы.
Биохимический анализ. Содержание триглицеридов в печени измеряли с использованием набора для колориметрического анализа триглицеридов (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) в соответствии с инструкциями производителя. Уровни аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST), глюкозы, инсулина, триглицеридов и холестерина в плазме измеряли на коммерческой основе Advanced Veterinary Laboratory (Saint Louis, MO).
RT-PCR: Для расчета изменений содержания mRNA проводили количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в реальном времени.
Гистопатология: Фиксированные формалином срезы печени заливали парафином, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) с использованием стандартного протокола для микроскопической оценки. Для оценки содержания коллагена в печени срезы печени, залитые парафином, окрашивали красителями Sirius Red/Fast Green. Сириус красный связывался со всеми типами коллагена, тогда как быстрый зеленый окрашивал неколлагеновые белки.
Срезы печени предварительно обрабатывали для удаления парафина, а ядра окрашивали раствором железистого гематоксилина Вейгерта. После промывания ткани окрашивали 0,1% сириус красным (Direct Red 80; Sigma, Saint Louis, MO), 0,1% быстрым зеленым сертифицированным FCF (Sigma) в насыщенной пикриновой кислоте в течение 2 часов. Затем предметные стекла промывали водой, обезвоживали этанолом и ксилолом и, наконец, помещали в Permaslip (Alban Scientific, Inc., Saint Louis, MO). Степень накопления коллагена оценивают с помощью морфометрического анализа.
Определение содержания гидроксипролина в печени: Содержание гидроксипролина определяли как меру количества общего коллагена, присутствующего в печени. Ткани печени гомогенизировали в дистиллированной воде, осаждали трихлоруксусной кислотой и гидролизовали в течение 48 часов в 12н HCl при температуре 105°С. Образцы выпаривали, и сухие гранулы восстанавливали в дистиллированной воде. Восстановленные образцы центрифугировали в течение 10 минут при 13000 g, и супернатанты разводили 12н HCl до достижения концентрации 4н HCl в конечных образцах. Содержание гидроксипролина в печени определяли с помощью анализа гидроксипролина в чувствительных тканях.
Иммуногистохимия: Фиксированные формалином ткани печени предварительно обрабатывали от парафина стандартными методами. Активность эндогенной пероксидазы блокировали инкубацией в 3,3% перекиси водорода в метаноле в течение 1 часа при комнатной температуре.
Обнаружение апоптотических клеток в тканях печени: Апоптотические клетки в тканях печени идентифицировали путем мечения и обнаружения разрывов нитей ДНК с помощью метода мечения концевых концов дезоксиуридинтрифосфата, опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TUNEL), с использованием набора для обнаружения пероксидазы AApopTag (Millipore, Temecula, CA). Подсчитывали окрашенные апоптотические клетки с морфологией гепатоцитов. Для обнаружения апоптотических клеток с морфологией HSC ткани печени, окрашенные TUNEL, затем окрашивали антителами к десмину (маркеру HSC), за исключением того, что пероксидазную активность вторичных антител выявляли с помощью набора ImmPACT VIP Peroxidase Substrate (Vector Laboratories).
Вестерн-блоттинг: Вестерн-блоттинг проводили, как описано, с использованием следующих первичных антител: антифосфорилированные материнские антитела против декапентаплегического гомолога 3 (p-SMAD3), ab52903, 1:1,000 (Abeam); антиглицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (анти-GAPDH), sc-25778 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX).
Пример 5.18: Лечение и/или предупреждение диабетической нефропатии или диабетической болезни почек (DN или DKD)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали in vivo на мышиной модели диабета I типа (диабет, индуцированный STZ).
Модель на животных: Самцов мышей 129/SV в возрасте 10 недель (Charles River, Germany) содержали в индивидуально вентилируемых клетках, получая стандартный рацион со свободным доступом к водопроводной воде. Мыши 129/SV с одинаковым весом получали либо 125 мг/кг массы тела STZ (Sigma-Aldrich) в 50 мМ цитрата натрия (pH 4,5), либо в цитратно-натриевом буфере (контрольная группа без диабета) внутрибрюшинно в 1-й и 4-й день для индукции гипергликемии (глюкоза >15 ммоль/л). Мыши не получали инсулин во время исследования.
Диабетическим мышам вводили плацебо (физиологический раствор) в течение 12 недель или испытуемые соединения. Массу тела и уровень глюкозы измеряли каждую неделю. HbA1c (Olympus AU400) и функцию почек (сывороточный креатинин) измеряли через 6 и 12 недель. Альбуминурию оценивают с использованием набора ELISA для мышиного альбумина. Исследования скорости проводимости сенсорного нерва (NCV) проводили у мышей, анестезированных 2% изофлураном на 6-й и 12-й неделе. Сенсорный NCV хвоста определяли путем стимуляции проксимально вдоль хвоста на зарегистрированном расстоянии 3 см. Для измерения использовали нейроэкран от компании Toennies Inc. Через 12 недель наблюдения мышей подвергали эвтаназии, выполняли двустороннюю торакотомию и лапаротомию, а почки перфузировали ледяным физиологическим раствором через левый желудочек сердца.
Иммуногистохимия: Для иммунофлуоресценции обрабатывали фиксированные параформальдегидом и залитые парафином срезы тканей (2 мкм). После блокировки 10% кроличьей сывороткой парафиновые срезы окрашивали антителами против pP38 и F4/80 и вторичными антителами, конъюгированными с Cy3.
Пример 5.19: Лечение и/или предупреждение диабетической нефропатии, диабетической болезни почек и диабетической ретинопатии в модели диабета, индуцированного STZ
Всего для исследования использовали 70 самок мышей CD-1 в возрасте 5-7 недель, весом приблизительно 25-30 г. Они были куплены у компании Charles River, Великобритания, и прошли 7-дневный период акклиматизации. Животных помещали в клетки IVC (до 5 на клетку), при этом отдельных мышей метили меткой на хвосте. Во время исследования всем животным предоставляли свободный доступ к стандартному сертифицированному коммерческому рациону и дезинфицированной воде. Помещение для выдерживания поддерживалось в стандартных условиях: 18-24°C, влажность 55-70% и 12-часовой цикл свет/темнота.
Все протоколы, использованные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по благополучию животных и этике, и все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Закона о животных (научные процедуры) 1986 года.
Мышам (кроме группы отрицательного контроля) вводили STZ (55 мг/кг; внутрибрюшинно) ежедневно в течение 5 дней подряд. Мышей заставляли голодать в течение 6 часов перед инъекцией. Через неделю после завершения индукции контролировали уровни глюкозы, и мышей с уровнями менее 15 ммл/л (280 мг/г) исключали из исследования, поскольку у них не развилась идеальная тяжесть диабета. Уровни глюкозы контролировали еженедельно, а через 5 недель после индукции STZ проводили биохимическую оценку повреждения почек путем измерения уровней альбумина и креатинина в моче и подтверждения того, что они находились в желаемом диапазоне. После успешного завершения этого этапа животных распределяли по лечебным группам.
Таблица 53:
Лечение продолжалось в течение 4 недель (28 дней) с еженедельным измерением уровня глюкозы в крови и альбумина/креатинина в моче. График исследования подробно описан ниже, в нем рассматриваются недельные (с 5 по 9 недели) уровни глюкозы в крови, коэффициенты креатинина альбумина в моче, а также терминальные (9 неделя) биохимический анализ крови и цитокины, гистология почек и просачивание сетчатки глаза.
Таблица 54:
Полученные результаты
Клинические признаки: Первоначальное снижение массы тела наблюдалось во многих группах лечения, этого можно было ожидать, и в большинстве случаев масса тела постепенно восстанавливалась к концу периода дозирования. Масса тела некоторых животных упала ниже 90% от исходной массы тела, однако ни одно животное не было вынуждено отказаться от дозирования.
Глюкоза крови: Индукция с помощью STZ приводила к значительному увеличению уровня глюкозы в крови по сравнению с неиндуцированными контрольными носителями (таблица 55). Лечение IVc-059a IV привело к значительному снижению** уровня глюкозы в крови по сравнению с контролем, индуцированным носителем, на 28-й день. Лечение IVc-061a IV также привело к снижению уровня глюкозы в крови, однако это не достигло статистической значимости.
Таблица 55: Средняя концентрация глюкозы в крови на 0-й день и 28-й день у самок мышей ICR-CD1 в модели диабета, вызванного STZ. Показанные значения являются средними ± стандартное отклонение; n=3 для групп неиндуцированного и индуцированного носителя; n=8 для всех остальных групп лечения
Вес почек:вес: Не было статистических различий ни в сыром весе почек, ни в весе почек в процентах от веса тела животного.
Альбумин мочи:креатинин (ALB:CRE): Мочу собирали еженедельно и объединяли для каждой группы лечения. Обработка Ib-010a, IIIc-061a и IVc-059a приводила к снижению ALB:CREA (таблица 56) в последний день обработки за 28 дней до умерщвления (9 неделя схемы).
Азот мочевины в крови (BUN): Обработка Ic-007, Ib-010a, IIIc-061a и IVc-059a приводила к уровням азота мочевины в крови, которые были значительно ниже, чем в контрольных группах с индуцированным носителем.
ELISA: В конце периода лечения собирали кровь и превращали в сыворотку. Уровни CRP, TGF-β, IL-6 и TNF-α в сыворотке количественно определяли с использованием имеющихся в продаже наборов ELISA, результаты показаны в таблице 56.
CRP в сыворотке: уровни СРБ в сыворотке у самок мышей ICR-CD1 в модели диабета, индуцированного стрептозотоцином, после 28 дней лечения. Уровни CRP в сыворотке были значительно повышены у животных, индуцированных STZ. Лечение Ia-001a, Ia-001aTz и контрольным каптоприлом приводило к значительному снижению уровней СРБ в сыворотке по сравнению с контролем, индуцированным носителем (**p=0,0074, *p=0,0304 и **p=0,0026 соответственно, односторонний ANOVA, таблица 56).
Сывороточный TGF-β: Уровни сывороточного TGF-β были значительно повышены в контрольной группе, индуцированной STZ. Обработка всеми соединениями, кроме Ic-007a и IIIc-061a, приводила к уровням TGF-β, которые были значительно ниже, чем в контролях, индуцированных носителем (p≤0,05; односторонний ANOVA, таблица 56).
Уровни IL-6 в сыворотке были значительно повышены в контрольной группе, индуцированной STZ. Обработка всеми соединениями, кроме IVc-059a и контрольного соединения каптоприла, приводила к уровням IL-6, которые были значительно ниже, чем в контролях, индуцированных носителем (p≤0,05; односторонний ANOVA, таблица 56).
Уровни TNF-α в сыворотке были значительно повышены у STZ-индуцированных контролей. Обработка Ia-001a, Ia-001aTz, Ic-001aTz/1-004a и IIIc-061a приводила к уровням TNF-α, которые были значительно ниже, чем в контролях, индуцированных носителем (p≤0,05; односторонний ANOVA, таблица 56).
Гистология почки: Количественное определение коллагена проводили в конце периода дозирования, животных умерщвляли и резецировали почку. Ткань фиксировали формалином и заливали парафином, а затем окрашивали трихромом Массона в соответствии с инструкциями производителя. Коллаген был количественно определен с использованием опубликованного метода Chen et al., 2017. Покрытие коллагеном было значительно увеличено в контрольных группах с носителем, индуцированных STZ, по сравнению с контролями, не индуцированными носителем. Обработка IIIc-061a и IVc-059a приводила к значительному снижению уровней коллагена по сравнению с контролем, индуцированным носителем (p=0,0210 и p=0,0134 соответственно; односторонний ANOVA, таблица 56).
Оценка заболевания: Оценка заболевания почек была количественно определена с использованием окрашивания H&E и оценки мезангиального и гломерулосклероза, артериолярного гиалиноза и утолщения ГБМ. Очевидно, что показатель заболевания был значительно выше у контролей с носителем, индуцированных STZ, по сравнению с контролями, не индуцированными носителем. Обработка всеми соединениями, кроме Ic-001aTz/1-004a, приводила к значительному снижению балла заболевания по сравнению с контролем, индуцированным носителем (p≤0,005; односторонний ANOVA, таблица 56).
Гистология сетчатки глаза: в конце периода дозирования, непосредственно перед терминальным отбором проб, 4 животным в группе инъецировали FITC-декстран для оценки плоского препарата сетчатки, животных умерщвляли и резецировали глаза. Были приготовлены плоские препараты сетчатки и получены изображения с использованием флуоресцентного микроскопа (EVOS, Thermo Fisher). Площадь, покрытая сосудистой сетью, была значительно увеличена в контролях с носителем, индуцированным STZ, по сравнению с контролями, не индуцированными носителем. Обработка Ic-007a, IIIc-061a и IVc-059a приводила к значительному уменьшению покрытия сосудов по сравнению с контролем, индуцированным носителем (p=0,0432, p=0,0337 и p=0,0131 соответственно; однофакторный ANOVA, таблица 56).
Таблица 56: Соотношение альбумина и креатинина в моче (ALB:CRE), BUN в крови, CRP в крови, TGF-бета в крови, IL-6 в крови, TNF-альфа в крови, окрашивание трихромом (фиброз почек), оценка болезни и площадь глаз на 28-й день лечения (9 неделя графика)
Пример 5.20: Лечение и/или предупреждение поликистоза почек (PKD или PCKD)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали in vivo с использованием мышиной модели Pcy, как описано Lee EC et al. (Nat Commun 10, 4148 (2019).
Доклиническая модель: мышь pcy, генетически значимая модель PKD грызунов, имеет тесную корреляцию с заболеванием человека для использования в оценке эффективности нового агента. Эта модель развивает PKD, связанную с геном, вызывающим заболевание человека, обеспечивая транслируемую модель грызунов, которая точно отражает развитие PKD у человека. Она была тщательно охарактеризована в отношении прогрессирования заболевания и ответа на лечение, что обеспечивает высокий уровень достоверности исследований по открытию новых лекарств.
Модель на животных: мышь pcy, штамм CD-1-pcy Iusm (CrownBio), несущий генную мутацию, связанную с тем же геном, который вызывает у человека нефронофтиз типа 3. Симптомы и прогрессирование заболевания представляют собой медленно прогрессирующую кистозную болезнь почек с образованием кист в собирательных трубочках. и другие сегменты нефрона становятся кистозными по мере прогрессирования заболевания. Заболевание поражает самцов и самок мышей одинаково. Мыши в возрасте 5 недель получают либо обычную диету, либо обычную диету с носителем (отрицательный контроль), либо соответственно положительный контроль и испытуемые соединения, смешанные с обычной диетой. Контроли: носитель, используемый для соединений, использовали в качестве отрицательного контроля в одной группе животных, и толваптан, антагонист рецептора вазопрессина-2 (V2), использовали в качестве положительного контроля в одной группе животных.
Считывание и конечные точки: Еженедельно регистрировали объем кисты и фиброз в почках, включая гистологическую верификацию, вес почки, уровень азота мочевины в сыворотке, концентрацию исследуемого препарата в крови, масса тела и потребление пищи.
Пример 5.21: Лечение и/или предупреждение радиационно-индуцированного фиброза (RIF)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали in vivo с использованием мышиной модели RIF, как описано Ryu SH et al. (Oncotarget. 2016, 7(13), 15554-15565, doi: 10.18632/oncotarget,6952).
Радиационно-индуцированный фиброз (RIF) является одним из наиболее частых поздних осложнений лучевой терапии. В модели RIF на мышах анализ контрактуры ног используется для проверки эффективности соединений in vivo .
Радиационно-индуцированный фиброз (RIF) характеризуется избыточным накоплением внеклеточного матрикса в коже и мягких тканях, а пролиферация фибробластов является одним из наиболее частых поздних осложнений лучевой терапии. Кроме того, RIF представляет собой необратимый процесс для мертвой фиброзной ткани и динамический процесс, связанный с ремоделированием рубцовой ткани реактивированными миофибробластами.
Мышиная модель RIF Для мышиной модели RIF используют самцов мышей BALB/c. Под наркозом правая задняя конечность каждой мыши получает дозу облучения 44 Gy (22 Gy×2 раза в течение 2 недель) с использованием линейного ускорителя. Для защиты остальной части тела использовалось специально разработанное экранирование, а на кожу наносится болюс толщиной 1 см для обеспечения адекватной дозы облучения на поверхности задней ноги. После облучения мышей случайным образом делили на две группы. Каждую группу обрабатывали один раз в день физиологическим раствором (контрольная группа) или соединениями (обработанная группа). Мышей, не получавших облучения или лекарств, использовали в качестве группы отрицательного контроля.
Чтобы продемонстрировать антифибротический эффект соединений в коже и мягких тканях облученных ног, с помощью окрашивания H&E измеряли толщину эпителия от поверхности эпидермиса до основания дермы.
Пример 5.22: Лечение и/или предупреждение болезни Штаргардта (SD)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали in vivo , используя модель мыши SD, как описано Fang Y. et al. (Faseb Journal, 2020, DOI: 10.1096/fj.201901784RR). Животные: пигментированные мыши Abca4-/- (129S4/SvJae-Abca4tmlGht) были приобретены в лаборатории Джексона (Bar Harbor, Maine, USA). Пигментированные мыши дикого типа (WT) (129S2/SvPas) были получены в лаборатории Janvier Labs (Le Genest-Saint-Isle, France). В каждой группе соотношение самок и самцов составляло 1:1. Мышей разводили и содержали при цикле свет 12:12 (примерно 50 люкс в клетках)-темнота с едой и водой без ограничений.
Освещение синим светом (BLI): Пигментированных мышей Abca4-/- и WT соответствующего возраста (9 месяцев) внутрибрюшинно анестезировали трехкомпонентным наркозом, включающим 0,05 мг/кг фентанила, 5 мг/кг мидазолама и 0,5 мг/кг медетомидина. Зрачки расширяли смесью 0,5% тропикамида и 2,5% фенилэфрина гидрохлорида. Для увлажнения роговицы использовали METHOCEL (Omni Vision, Puchheim, Germany). Во время светового освещения на роговицу экспонируемого глаза накладывали стекловидное стекло. Освещенный глаз каждой мыши подвергали воздействию синего света (длина волны: 430 нм) с интенсивностью 50 мВт/см2 в течение 15 минут. Неосвещенный глаз в качестве контроля тщательно прикрывали, чтобы защитить от рассеянного света.
Выполняли ряд тестов, включая оптическую когерентную томографию (OCT), световую микроскопию и просвечивающую электронную микроскопию (TEM), количественный анализ бисретиноидов с помощью ВЭЖХ, а также полнопольную электроретинографию ERG до и через семь дней после BLI.
Пример 5.23: Лечение и/или предупреждение пролиферативной витреоретинопатии (PVR)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали in vivo с использованием мышиной модели PVR, как описано Hou H et al. (Ophthalmic Res 2018;60:195-204. doi: 10.1159/000488492) или Markus B. et al. (FEBS Open Bio. 2017;7(8): 1166-1177. Published 2017 Jun 29. doi: 10.1002/2211-5463.12252).
Образцы животных: Использовали модель PVR на мышах путем интравитреальной инъекции протеолитического фермента, диспазы. Известно, что эта модель вызывает активацию глии, а также образование как эпи-, так и субретинальной мембраны.
Самкам дикого типа в возрасте от 4 до 6 месяцев делали анестезию пентобарбиталом (90 мг⋅кг-1, внутрибрюшинно), а также вводили одну каплю 1% гидрохлорида прокаина (новокаин, EGIS, Budapest, Hungary) для местной анестезии и одну каплю тропикамида (Mydrum, Chauvin Aubeans, Montpellier, France) для расширения радужной оболочки. Интравитреально в правый глаз под стереомикроскопическим контролем (Ctrl) с помощью автоматической пипетки вводили четыре микролитра диспазы (Sigma-Aldrich; 0,4 ЕД⋅мкл-1, растворенной в стерильном физиологическом растворе). Животные контрольной группы получали 4 мкл стерильного физиологического раствора. Чтобы подтвердить индукцию PVR и контролировать прогрессирование заболевания после инъекций получали изображения оптической когерентной томографии слоя (OCT; Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA). Контрольных мышей и мышей, получавших диспазу, умерщвляли на 14-й день после инъекции, когда были очевидны признаки формирования PVR: наличие эпиретинальной мембраны и/или отслойки сетчатки при OCT-исследовании.
Подготовка и очистка образцов: После гильотинного удаления роговицы выделяли стекловидное тело мышей вместе со склеральным галером с помощью лезвия скальпеля с последующим удалением хрусталика. После солюбилизации стекловидного тела лизисным буфером (рН 8,5), содержащим 7 мМ мочевины, 30 мМ Трис, 2 мМ тиомочевины и 4% CHAPS, лизаты обрабатывали ультразвуком на ледяной водяной бане в течение 5 мин и центрифугировали при 16900 g в течение 10 мин при температуре 4°С. Супернатанты переносили в пробирки LoBind Eppendorf и очищали с помощью набора Ready-Prep 2-D CleanUp Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) соответствии с протоколом производителя. Вкратце, после осаждения и центрифугирования осадки сушили и ресуспендировали в 240 мкл буфера для регидратации, содержащего 7 мкл мочевины, 2 мкМ тиомочевины, 4% мас./об. CHAPS, 1% дитиотреитола (DTT), 2% об./об. Bio-Lyte (Bio-Rad) и 0,001% бромфенолового синего, и сразу использовали для изоэлектрофокусировки.
2D-гель-электрофорез: Три образца стекловидного тела из каждой группы подвергали 2-DE. Первые иммобилизованные полоски с градиентом pH (IPG) с IPG (24 см, pH 4-7; Bio-Rad) регидратировали экстрагированными белками стекловидного тела с использованием пассивной регидратации при температуре 20°C в течение ночи. После этого проводили изоэлектрическую фокусировку путем приложения 300 В в течение 3 ч, которое постепенно повышали до 3500 В в течение 5 ч и затем выдерживали при 3500 В в течение 18 ч. После изоэлектрического фокусирования полоски IPG сразу же помещали при температуре -70°C до уравновешивания. Полоски IPG уравновешивали в течение 15 мин в уравновешивающем буфере (500 мМ Трис/HCl, pH 8,5, 6 М мочевина, 2% SDS, 20% глицерин), содержащем 0,6% DTT, и в течение 15 мин в уравновешивающем буфере, содержащем 1,2% йодацетамида. Во втором измерении полоски укладывали поверх 12% полиакриламидных гелей и покрывали агарозой. С использованием ячейки Protean Plus Dodeca Cell (Bio-Rad) проводили электрофорез при 100 мА на гель в течение 24 ч до тех пор, пока краситель бромфеноловый синий не достигал дна геля. Все 12 гелей исследовали вместе в одинаковых условиях. Белки окрашивали с использованием флуоресцентного красителя 25 трис(батофенатролиндисульфонат)рутения II собственного приготовления, и изображения геля записывали с помощью молекулярного имидж-сканера Pharos FX Plus (Bio-Rad). Во всех случаях анализировали три биологические повторности, образцы из контрольной и обработанной диспазой групп обрабатывали вместе в один и тот же день.
Пример 5.24: Лечение и/или предупреждение влажной и сухой возрастной макулярной дегенерации (ARMD или AMD)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали in vivo с использованием мышиной модели AMD, как описано Matsuda Y et al. (Mol Ther Nucleic Acids. 2019;17:819-828. doi:10.1016/j.omtn.2019.07.018).
Животные: Самок мышей C57BF/6J приобретали в лаборатории Charles River Laboratories, Japan. Приобретали самцов крыс BN. Самцов новозеландских белых (NZW) кроликов приобретали у Kitayama Fabes, Japan. Мышей, крыс и кроликов содержали в специальных условиях, свободных от патогенов.
EMT-анализ клеток RPE: Клетки RPE, культивированные при температуре 37°C высевали при 1×105 клеток/лунку в 96-луночные планшеты для микротитрования. После инкубирования в течение 24 ч клетки обрабатывали FGF2 (2 нг/мл) и TGF-β2 (3 нг/мл) с соединениями по настоящему изобретению и без них в течение 3 дней. Уровни экспрессии mRNA биомаркеров EMT α-SMA и коллагена I типа оценивали с помощью количественной PCR в реальном времени.
Анализ матригельной пробки: 0,5 мл раствора Matrigel Matrix GFR (с уменьшенным фактором роста)-PRF (без фенолового красного) (BD Biosciences) смешивалит с 1 мкг FGF2 и подкожно имплантировали в правый бок самкам мышей C57BL/6J (8 недель, n=3). Соединения по настоящему изобретению вводили внутрибрюшинно, и матригельные пробки удаляли и фотографировали на 7-й день после имплантации. Степень ангиогенеза определяли по концентрации гемоглобина в матригеле с использованием цианметгемоглобинового метода в соответствии с инструкциями производителя. Оптическую плотность образцов при 540 нм (OD540) определяли в устройстве для считывания микропланшетов, и концентрации гемоглобина рассчитывали с помощью стандартного раствора гемоглобина (Sigma-Aldrich). Модели CNV на мышах, индуцированные лазером: офтальмологический раствор Mydrin-P закапывали в глаза самцов мышей C57BL/6J для расширения зрачков. Затем проводили лазерное воздействие (длина волны 532 нм, размер пятна 50 мкм, время облучения 0,1 с, мощность лазера 120 мВт) на 6 участков глаза с помощью щелевой лампы (СЛ-130) и многоцветного лазерного фотокоагулятора (MC-300), избегая крупных капилляров сетчатки. Непосредственно после индукции CNV с помощью лазерного облучения исследуемые соединения по изобретению и контроль вводили посредством инъекции в стекловидное тело. Через семь дней после лазерного облучения в хвостовую вену вводили 4% раствор FITC-декстрана в объеме 0,5 мл/животное. Через от одной до пяти минут после введения FITC-декстрана животных усыпляли путем смещения шейных позвонков. Глазные яблоки удаляли и фиксировали в 4% параформальдегидно-фосфатном буфере на 12-24 часа. Под стереоскопическим микроскопом готовили хориоидальные плоские препараты. Фотографии участков CNV делали с использованием конфокального микроскопа. Во всех экспериментах на животных с лазерной индуцированной CNV успешное облучение подтверждалось для каждого облучения образованием пузырьков воздуха в глазах моделей животных.
Модели индуцированной лазером CNV и субретинального фиброза у крыс: Использовался тот же метод на модели крыс с использованием самцов крыс BN. Для модели CNV параметры лазера: размер пятна 80 мкм и время облучения 0,05 с при мощности 120 мВт на 8 участках сетчатки-хориоидеи. Для модели субретинального фиброза CNV используемая мощность лазера составляла 240 мВт. Сразу после лазерного облучения осуществляли интравитреальную инъекцию контрольного и исследуемого соединений по настоящему изобретению. Для исследований субретинального фиброза CNV использовали (1) солевой носитель и (2) соединения по настоящему изобретению (15 мкг/глаз для однократной инъекции или 2 или 3 инъекции с 2-недельными интервалами). После лазерного облучения для исследований CNV использовали протокол FITC-декстран, указанный выше, через 14 дней после лазерного облучения с подготовкой энуклеированных глаз к конфокальной микроскопии хориоидеи с плоским креплением. Для исследования субретинального фиброза через 6 недель животных умерщвляли, и энуклеированные глаза подготавливали к гистопатологическим исследованиям для количественного определения субретинального фиброза с помощью световой микроскопии. Глаза заливали в парафиновые блоки, делали срезы и окрашивали трихромом по Массону в соответствии с обычными методами. Фиброз оценивали анонимно двумя или тремя независимыми исследователями по следующей шкале: 0 степень, нет; 1 степень, минимальный; 2 степень, легкий; 3 степень, умеренный; 4 степень, тяжелый.
Пример 5.25: Лечение и/или предупреждение птеригиума (PTE)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению оценивают по хориоидальному ангиогенезу и росту птеригиума с использованием мышиной модели хориоидального неоваскуляризма (CNV), прямого анализа ангиогенеза in vivo (DIVAA) и мышиной модели птеригиума.
Птеригиум представляет собой доброкачественное фиброваскулярное разрастание поверхности глаза, обычно связанное с дискомфортом и покраснением глаз, а по мере прогрессирования заболевания часто связано со снижением зрения (топографический астигматизм) и ограничением подвижности глаз в тяжелых случаях. В патогенез птеригиума вовлечен широкий спектр провоспалительных цитокинов, индуцированных фиброгенными факторами роста, окислительным стрессом и метилированием ДНК. Поскольку на некоторые из этих факторов влияет воздействие ультрафиолетового (УФ) света, в настоящее время данные из нескольких источников свидетельствуют о том, что люди при сильном воздействии солнечного света подвергаются повышенному риску птеригиума. Несмотря на обширные исследования, нет четкого понимания патогенеза птеригиума, но одним из наиболее важных факторов, влияющих на патогенез, являются неопластические изменения лимбальных стволовых клеток, связанные с воздействием УФ-излучения и возможной ролью онкогенного вируса (вирус папилломы человека).
На сегодняшний день описаны три животных модели птеригиума с использованием инъекций эпителиальных клеток птеригиума человека, экзогенного внеклеточного матрикса или рассеянного УФ-излучения у кроликов и мышей. Результаты, полученные на модели кролика с использованием рассеянного УФ-света, сосредоточены на расчетном прогнозировании размера и формы роста ткани без гистологического анализа. На модели на мышах было показаны гистологические характеристики человеческого птеригиума, однако манипулировать кроликами для офтальмологических процедур легче, учитывая, что структура и размер глаза больше напоминают человеческие.
Методы: Мыши получали воду с исследуемыми соединениями или без них. При исследовании CNV объем неоваскулярного поражения определяли в плоских препаратах пигментного эпителия сосудистой оболочки сетчатки (RPE) с использованием конфокальной микроскопии через семь дней после лазерной индукции. При исследовании DIVAA в бока мышей подкожно имплантировали силиконовые капсулы, содержащие 10000 эпителиальных клеток птеригиума человека. Через одиннадцать дней с помощью спектрофлуориметрии после инъекции в хвостовую вену мышей декстрана, меченного флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), количественно определяли неоваскуляризацию (NV). Модель эпителиальных клеток птеригиума была разработана путем инъекции бестимусным голым мышам в субконъюнктивальное пространство носа 10000 эпителиальных клеток птеригиума человека.
Основные критерии оценки эффективности: Для оценки данных, полученных на моделях CNV и DIVAA, использовали критерий Стьюдента, а для оценки поражений птеригии использовали гистологические препараты.
Пример 5.26: Лечение и/или предупреждение центральной серозной хориоретинопатии (CSC)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали in vivo с использованием животной модели CSC, как описано Wei-Da Chio, et al., Life Sci J 2019; 16(12): 115-126]. ISSN: 1097-8135).
Патогенез центральной серозной хориоретинопатии (CSC) до конца не изучен. Участие кортикостероидов бесспорно, хотя их точная роль не выяснена; другие детали основного механизма CSC были в основном выяснены с помощью методов визуализации, таких как флуоресцеиновая и индоцианиновая зеленая ангиография. Несмотря на то, что большинство случаев РСК являются самоизлечивающимися, существуют как тяжелые, так и рецидивирующие течения, и для этих пациентов доступно лишь ограниченное количество вариантов лечения: лазерная фотокоагуляция с риском развития скотомы и хориоидальной неоваскуляризации, а также фотодинамическая терапия.
Метод: Лечение проводили на самцах крыс SD с CSCR. Правые глаза наблюдаемых случайным образом разделяли на 2 группы (с контролем и с тестируемыми соединениями), которые каждую неделю подвергались серии обследований, включая непрямую офтальмоскопию и OCT-сканирование. Всех крыс SD сначала вводили в модель CSCR. Если CSCR исчезала при OCT-изображении, соединение считалось эффективным.
Пример 5.27: Лечение и/или предупреждение кистозного фиброза (CF), поражающего легкие, а также поджелудочную железу, печень, почки и кишечник
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали in vivo с использованием мышиной модели CF, как описано McCarron A et al. (Respir Res. 2018;19(1):54. Published 2018 Apr 2. doi: 10.1186/s12931-018-0750-y)
У людей муковисцидоз (CF) характеризуется хронической инфекцией, воспалением, ремоделированием дыхательных путей и обструкцией слизистой. Отсутствие легочных проявлений у мышей с муковисцидозом препятствует исследованию патогенеза заболеваний дыхательных путей, а также разработке и исследованию потенциальных терапевтических средств. Тем не менее, недавно созданные модели животных с муковисцидозом, включая модели крыс, хорьков и свиней, продемонстрировали ряд хорошо охарактеризованных фенотипов заболеваний легких с различной степенью тяжести. Доступны различные фенотипы дыхательных путей доступных в настоящее время моделей животных с муковисцидозом, и они представляют потенциальное применение каждой модели в исследованиях муковисцидоза, связанных с дыхательными путями. В частности, были разработаны мутантные аллели с обычными мутациями, вызывающими муковисцидоз у человека (например, Phe508del или Gly551Asp), введенными в последовательность мышиного CFTR.
Пример 5.28: Лечение и/или предупреждение идиопатического легочного фиброза (IPF)
Терапевтическую эффективность соединений по настоящему изобретению исследовали in vivo с использованием животной модели IPF, как описано Chen SS et al. (J Thorac Dis. 2017;9(1):96- 105. doi: 10.21037/jtd.2017.01.22).
IPF представляет собой хроническое прогрессирующее интерстициальное заболевание легких с выраженным легочным фиброзом. Этиология IPF остается неясной. После постановки диагноза IPF пациенты обычно живут только 2-3 года. Заболеваемость и развитие IPF связаны с повреждением эпителиальных клеток, пролиферацией фиброцитов, воспалительными реакциями и отложением внеклеточного матрикса. Патологическим проявлением IPF является обычная интерстициальная пневмония (UIP). В настоящее время смертность больных IPF достаточно высока. Однако эффективные методы лечения IPF отсутствуют. Основной причиной смерти, связанной с IPF, является острое обострение IPF (AE-IPF), на долю которого приходится более 50% смертей, связанных с IPF. Большинство пациентов с AE-IPF не могут переносить бронхоскопию или биопсию легкого из-за их критического состояния. Отсутствие биопсии AE-IPF существенно ограничивает углубленные исследования AE-IPF.
Используются животные модели индуцированного блеомицином (BLM) IPF. Крысиная модель IPF создается путем внутритрахеальной перфузии с помощью BLM. Теоретически, вторая интратрахеальная перфузия с BLM должна вызывать дополнительное повреждение легких у крыс, у которых уже развился легочный фиброз от первой перфузии. Дополнительное повреждение легких может напоминать патологические характеристики AE-IPF.
Крыс Sprague Dawley (SD) случайным образом распределяли в разные группы: контрольная группа, получавшая только соединения, модельная группа AE-IPF с соединениями+BLM+BLM группа, модельная группа AE-IPF (соединение+BLM+BLM группа), модельная группа IPF, получавшая соединения (соединение+BLM группа), модельная группа IPF (BLM группа) и обычная контрольная группа без BLM.
Крысам в BLM+BLM группах проводят вторую перфузию BLM на 28 день после первой перфузии BLM. Крысы в двух других группах получали физиологический раствор в качестве второй перфузии. Шесть крыс в каждой группе умерщвляли на 31-й, 35-й и 42-й день после первой перфузии, соответственно.
Патофизиологические характеристики крыс в BLM+BLM группе напоминали таковые у пациентов с AE-IPF, и, как описано (Chen SS, J Thorac Dis 2017;9(1):96-105), вторая перфузия BLM, по-видимому, вызывает острое обострение легочного фиброза и может быть использована для моделирования AE-IPF у крыс. Эффекты композиций соединений в этой крысиной модели с использованием AE-IPF, индуцированного однократной и, соответственно, двукратной интратрахеальной перфузией блеомицином, должны улучшать результаты гистопатологии (срезы, окрашенные H&E и Masson, проанализированы и оценены для острого повреждения легких), а также выживаемость.
Пример 5.29: Индуцированный блеомицином фиброз легких у мышей C57BL/6 в течение 21 дня
Всего для исследования использовали 40 самцов мышей Balb/c в возрасте 8-10 недель. Они были приобретены у компании Charles River, UK, и прошли 7-дневный период акклиматизации. Животных помещали в клетки IVC (до 5 на клетку), при этом отдельных мышей помечали меткой на хвосте. Во время исследования всем животным был предоставлен свободный доступ к стандартному сертифицированному коммерческому рациону и очищенной воде. Помещение для выдерживания поддерживалось в стандартных условиях: температура 18-24°C, влажность 55-70% и 12-часовой цикл свет/темнота.
Все протоколы, использованные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по защите и этике животных, и все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Закона о животных (научные процедуры) 1986 года.
Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией ксилазина и кетамина. Как только была достигнута соответствующая плоскость анестезии, животным интратрахеально вводили 1,0 ЕД/кг сульфата блеомицина. Общий объем жидкости составлял 50 мкл. Мышей случайным образом распределяли по группам лечения, как показано в таблице 57 ниже:
Таблица 57:
Введение доз внутривенно и положительный контроль (пирфенидон) начинали через 24 часа после инстилляции блеомицина.
Раствор лекарственного средства готовили непосредственно перед дозированием. Для дозы 15 мг/кг (достаточно для 12 мышей весом 30 г) отвешивали 4,5 мг соединения. Добавляли 75 мкл (5%) ДМСО и перемешивали до растворения лекарственного средства.
Добавляли 150 мкл (10%) солютола и осторожно встряхивали, добавляли 150 мкл (10%) PEG400 и осторожно встряхивали. Добавляли 1000 мкл PBS (pH 7) и измеряли матрицу, чтобы гарантировать поддержание pH 7,0. Добавляли оставшийся PBS (всего до 1500 мкл). Соединение оставалось в растворе.
Отбор проб после прекращения (последний день дозирования): в день отбора проб через 2 часа после последней дозы мышей умерщвляли с помощью передозировки анестезии. У животных брали следующие образцы:
Сыворотка: сразу после умерщвления брали кровь путем пункции сердца и помещали в пробирки Эппендорфа. Пробирки хранили при комнатной температуре не менее 20 минут перед центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 минут. Образцы хранили при температуре -80°С.
Макроскопическое вскрытие: после прекращения операции внутренние органы были обнажены и осмотрены. Отмечались любые аномалии.
Легкие: перед резекцией в легкие наливали формалин. Вкратце, обнажали трахею мыши и делали небольшой надрез с помощью лезвия. Шовный материал аккуратно накладывали вокруг задней части трахеи ниже разреза и свободно завязывали. Формалин осторожно вводили в легкие и шов плотно закрывали для обеспечения наливки. Легкие помещали в формалин и окрашивали трихромом и красителем H&E для анализа отложения коллагена и прогрессирования заболевания (шкала Эшкрофта). Срез легочной ткани мгновенно замораживали.
Шкала Эшкрофта:
0 Нормальное легкое
1 Минимальное фиброзное утолщение альвеолярных или бронхиолярных сосудов
2 Между минимальным и умеренным
3 Умеренное утолщение стенок без явного повреждения архитектоники легкого
4 Между умеренным и повышенным фиброзом с поражением легочной структуры
5 Повышенный фиброз с определенным повреждением структуры легкого и образованием фиброзных тяжей или небольших фиброзных масс
6 Между повышенным фиброзом и тяжелым нарушением структуры легкого
7 Сильное искажение структуры и большие волокнистые участки; «сотовое легкое»
8 Тотальная фиброзная облитерация поля
Полученные результаты
Клинические признаки: Никаких изменений в массе тела отмечено не было, и ни у одного животного не было необходимости в перерыве между дозами во время исследования.
Шкала Эшкрофта: Легкие от каждого животного подвергали FFPE, делали срезы и окрашивали H&E в соответствии с внутренним протоколом. Слайды визуализировали на сканере слайдов Glissando, чтобы получить изображения целых слайдов. Каждое легкое оценивали с использованием системы оценки Эшкрофта для измерения степени воспаления/фиброза в соответствии с Hübner et al., 2008. Подсчет баллов производили слепым методом. Как пирфенидон в дозе 100 мг/кг, так и IVc-059a в дозе 15 мг/кг уменьшали начало фиброза в легком мыши (p=0,0018 и 0,0130, соответственно, ANOVA). Лечение пирфенидоном оказывало такое же влияние на начало фиброза, как и лечение IVc-059a (р=0,4441, двусторонний Т-критерий). Репрезентативные изображения показаны на фигуре 11A.
На фигуре 11А показаны репрезентативные изображения фиброза легких на день 21 лечения: Пример изображения окрашивания соединительной ткани трихромом (×20); (A1) неиндуцированный (здоровый); A2, блеомицин, индуцированный обработкой носителем; A3, блеомицин, индуцированный лечением пирфенидоном 100 мг/кг; A4, блеомицин, индуцированный обработкой IVc-059a. На фигуре 11B показана оценка по шкале Эшкрофта у здоровых, нелеченых, индуцированных блеомицином, по сравнению с пирфенидоном и по сравнению с IVc-059a.
Все легкое от каждого животного фиксировали формалином и хранили в 70%-ном этаноле. Эти срезы обезвоживали в этаноле с возрастающей концентрацией перед заливкой в парафин. Срезы нарезали при 5 мкМ и запекали на предметных стеклах Superfrost в течение 2 часов. Срезы окрашивали с использованием имеющегося в продаже набора для соединительной ткани (Abeam abl50686). Процент площади, покрытой трихромным окрашиванием, определяли количественно с использованием программного обеспечения Qupath и Image J.
Пример 5.30: Результаты in vitro и ADME-токсикология
Для соединений Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a и IVc-059a проводили всестороннюю оценку ADME-токсикологии.
Панель QPatch Core для анализа сердечных ионных каналов (CiPA) оценивали на Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a и IVc-059a: для CiPA использовались три следующих анализа: Navi.5 анализ QPatch на основе клеток с ионным каналом натрия человека CiPA, hERG анализ QPatch CiPA с ионно-кальциевым каналом человека на основе клеток, Cav1.2 (L-тип) анализ QPatch CiPA с ионно-кальциевым каналом человека на основе клеток.
Оценивали метаболизм микросом гепатоцитов и гепатоцитов человека. Был оценен комплексный набор анализов связывания, ферментов и анализов поглощения, а также свойств раствора, абсорбции in vitro, метаболизма и токсичности. Гебнетическая токсичность оценивалась с использованием AMES* и микроядерного анализа.
*Ames представляет собой бактериальный анализ для идентификации соединений, которые могут вызывать генные мутации, и он демонстрирует высокую прогностическую ценность при тестах на канцерогенность на грызунах.
** В микроядерных анализах in vitro, используемых для идентификации соединений, вызывающих повреждение хромосом (кластогены и анеугены).
Полученные результаты
Высокополярные соединения демонстрируют низкий метаболизм в микросомах печени с периодом полувыведения более 60 минут. Не наблюдалось значительного токсического действия на клетки гепатоцитов с точки зрения их жизнеспособности. Большинство отрицательно заряженных соединений прочно связаны с белками плазмы. Эффекта генотоксичности не наблюдалось. Соединения не проявляют значительного влияния на тесты флуктуаций Эймса* ТА100-S9, ТА100+S9, ТА1535-S9, ТА1535+S9, ТА1537-S9, ТА1537+S9, ТА98-S9, ТА98+S9 в концентрации от 5 мкМ до 0,1 мМ.
На ТА100-S9, ТА1535-S9, ТА1537-S9, ТА98-S9 бактериальной токсичности не наблюдалось.
В анализе Micronucleus для диапазона оцениваемых концентраций от 8 мкМ до 1 мМ никаких эффектов не наблюдалось. В панели CiPA использовались три клеточных анализа: анализ Cav1.2 (L-типа) человеческого кальциево-ионного канала на основе клеток с автоматическим фиксатором CiPA, анализ hERG на основе человеческого калийно-ионного канала на основе автоматического зажима CiPA и анализ CiPA Navi.5 с ионно-натриевыми каналами человека на основе клеток с автоматическим патч-клеммом: все были оценены при 3 уровнях концентрации, и между 0,1 мкМ и 10 мкМ не наблюдалось значительного ингибирования.
В анализе по оценке безопасности соединения не оказывали или имели очень слабое ингибирующее действие на следующие ферментативные системы, демонстрируя хороший профиль безопасности в отношении 5-НТ-транспортера человека (h) (антагонист радиолиганда; 5-HT1A (h) (агонист радиолиганда); 5-HT1B (h) (антагонист радиолиганда; 5-HT2A (h) (агонист радиолиганда); 5-HT2B (h) (агонист радиолиганда); 5-HT3 (h) (антагонист радиолиганда; A2A (h) (агонист радиолиганда); ацетилхолинэстераза (h); альфа 1A (h) (антагонист радиолиганда; альфа 2A (h) (антагонист радиолиганда; AR(h) (агонист радиолиганда); бета 1 (h) (агонист радиолиганда); бета 2 (h) (антагонист радиолиганда; BZD (центральный) (агонист радиолиганда); Ca2+ канал (L-дигидропиридиновый сайт) (антагонист радиолиганда; CB1 (h) (агонист радиолиганда); CB2 (h) (агонист радиолиганда); CCK1 (CCKA) (h) (агонист радиолиганда); D1 (h) (антагонист радиолиганда; D2S (h) (агонист радиолиганда); дельта (DOP) (h) (агонист радиолиганда); транспортер дофамина (h) (антагонист радиолиганда; ETA (h) (агонист радиолиганда); GR (h) (агонист радиолиганда); H1 (h) (антагонист радиолиганда; H2 (h) (антагонист радиолиганда); каппа (h) (KOP) (агонист радиолиганда); KV канал (антагонист радиолиганда); Lck киназа (h); Ml (h) (антагонист радиолиганда); M2 (h) (антагонист радиолиганда; M3 (h) (антагонист радиолиганда); MAO-A (антагонист радиолиганда); mu (MOP) (h) (агонист радиолиганда); N-нейрональный альфа 4 бета 2 (h) (агонист радиолиганда); Na+ канал (сайт 2) (антагонист радиолиганда); NMDA (антагонист радиолиганда); транспортер норадреналина (h) (антагонист радиолиганда); PDE3A (h); PDE4D2 (h); калиевый канал hERG (человека)-[3H]дофетилид; Via (h) (агонист радиолиганда).
Противовоспалительное действие соединений соответствовало частичному ингибированию ферментов циклооксигеназы, например, Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a и IVc-059a показали частичное ингибирование COX2 (циклооксигеназы-2).
Пример 5.31: Профилирование in vitro с использованием BioMap Plus
Была проведена серия анализов in vitro с использованием анализов на основе первичных клеток человека, моделирующих сложную биологию тканей и заболеваний органов (сосудистую систему, иммунную систему, кожу, легкие) и общую биологию тканей для фенотипического профилирования соединений в условиях, которые сохраняют механизмы перекрестных помех и обратной связи, относящиеся к результатам in vivo .
Активность, селективность, безопасность, механизм действия и признаки заболевания соединений Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a, IVc-059a оценивали при концентрациях 30 мкМ, 10 мкМ, 3,3 мкМ, 1,1 мкМ на следующих клеточных системах. с использованием фенотипического клеточного анализа BioMaps Plus (Eurofins-DiscoverX, San Francisco, CA, USA):
- венулярные эндотелиальные клетки для оценки сердечно-сосудистых заболеваний, хронического воспаления, астмы, аллергии, аутоиммунного заболевания, атопического заболевания;
- РВМС с венулярными эндотелиальными клетками для оценки сердечно-сосудистых заболеваний, хронического воспаления, аутоиммунного заболевания, хронического воспаления;
- В-клетки с РВМС для оценки аутоиммунного заболевания, воспаления;
- клетки бронхиального эпителия для оценки воспаления легких, COPD;
- гладкомышечные клетки коронарных артерий для оценки сердечно-сосудистого воспаления, рестеноза;
- дермальные фибробласты для оценки фиброза, хронического воспаления, заживления ран, ремоделирования тканей, матричной модуляции;
- кератиноциты/дермальные фибробласты для оценки псориаза, дерматита, биологии кожи;
- Фибробласты легких для оценки фиброза, хронического воспаления, ремоделирования матрикса;
- венулярные эндотелиальные клетки с макрофагами для оценки сердечно-сосудистого воспаления, рестеноза, хронического воспаления.
Ссылки BioMpas Plus: Книга: Phenotypic Drug Discovery, Chapter 2 - Development and Validation of Disease Assays for Phenotypic Screening. Ellen L. Berg, Sheryl P. Denker and Alison OʼMahony. https://doi.org/10.1039/9781839160721-00020 ISBN 978-1-83916-072-1
Assessing bioactivity-exposure profiles of fruit and vegetable extracts in the BioMAP profiling system. Wetmore BA, Clewell RA, Cholewa B, Parks B, Pendse SN, Black MB, Mansouri K, Haider S, Berg EL, Judson RS, Houck KA, Martin M, Clewell HJ 3rd, Andersen ME, Thomas RS, McMullen PD. Toxicology in Vitro. 2019,54,41-57.
Полученные результаты
Ic-007a не был цитотоксичен в концентрациях, протестированных в этом исследовании. Ic-007a был антипролиферативным в отношении первичных Т-клеток человека (30 мкМ) и фибробластов (30 мкМ, 10 мкМ, 3,3 мкМ, 1,1 мкМ). IC-007a был активен с 20 аннотированными показаниями, и опосредованные изменения активности ключевых биомаркеров перечислены по биологической классификации и классификации болезней. Ic-007a в основном влиял на активность, связанную с воспалением (снижение VCAM-1, sTNFα, MIP-1α, I-TAC, MIG; повышение IL-8; модулирование IP-10), иммуномодулирующую активность (снижение CD40, M-CSF) и активность ремоделирования тканей (снижение коллагена I, коллагена IV, TIMP-1, tPA, коллагена III, PAI-1, uPAR, bFGF).
IIc-007a не был цитотоксичен в концентрациях, проверенных в этом исследовании. IIc-007a не оказывал антипролиферативного действия на эти первичные клетки человека в испытанных концентрациях.
IIc-007a был активен с 12 аннотированными показаниями, а опосредованные изменения активности ключевых биомаркеров были перечислены по биологической классификации и классификации болезней. В основном IIc-007a влиял на активность, связанную с воспалением (снижение sTNFα, MIP-1α; повышение уровня IL-8; модулирование MCP-1), иммуномодулирующую активность (снижение sIL-10, sIL-2) и активность ремоделирования тканей (снижение коллагена I, коллаген IV, коллаген III, PAI-1).
IIIc-061a не был цитотоксичен в концентрациях, проверенных в этом исследовании. IIIc-061a не оказывал антипролиферативного действия на эти первичные клетки человека в испытанных концентрациях. IIIc-061a был активен с шестью аннотированными показаниями, а опосредованные изменения активности ключевых биомаркеров были перечислены по биологической классификации и классификации болезней. IIIc-061la влияет на активность, связанную с воспалением (снижение I-TAC, MIG), иммуномодулирующую активность (снижение sIL-17A) и активность ремоделирования тканей (снижение коллагена I, коллагена III, PAI-1).
IVc-059a не был цитотоксичен в концентрациях, протестированных в этом исследовании. IVc-059a был антипролиферативным в отношении первичных эндотелиальных клеток человека (1,1 мкМ). IVc-059a был активен с тремя аннотированными показаниями, а опосредованные изменения активности ключевых биомаркеров были перечислены по биологической классификации и классификации болезней. IVc-059a влиял на активность, связанную с воспалением (снижение sTNFa) и иммуномодулирующую активность (снижение sIL-10, sIL-2).
Пример 5.32: Результаты in vitro на пигментных эпителиальных клетках сетчатки человека (RPE) ARPE-19 и эндотелиальных клетках сетчатки человека (HREC)
Соединения Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a и бевацизумаб (BEVA) оценивали по их влиянию на разрушение внутреннего и внешнего гематоретинального барьера, вызванное диабетическими состояниями. Были оценены две разные концентрации соединений: 25 мкМ и 50 мкМ Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a. Механизмы действия, связанные с антипроницаемым эффектом тестируемых препаратов, исследовали путем оценки проницаемости для продукции флуоресцентного декстрана и провоспалительных цитокинов с использованием уровней экспрессии их мРНК с помощью RT-PCR.
Условия внешнего гемато-ретинального барьера : Культуры пигментных эпителиальных клеток сетчатки человека (RPE) ARPE-19, спонтанно иммортализованную линию клеток RPE человека, получали из Американской коллекции типовых культур (Manassas, VA, USA). Клетки ARPE-19 культивировали в эугликемических условиях (D-глюкоза (D-Glc), 5,5 ммоль/л) и гипергликемических условиях (D-глюкоза, 25 ммоль/л) в течение 18 дней при температуре 37°C при 5% (об./об.) CO2 в среде (DMEM/F12) с добавлением 10% (об./об.) FBS (Hyclone; Thermo Fisher Scientific, UT, USA) и 1% (об./об.) пенициллина/стрептомицина (Hyclone; Thermo Fisher Scientific). Использовали клетки ARPE-19 из 20-го пассажа, и среду меняли каждые 3-4 дня. Для исследования проницаемости клетки ARPE-19 высевали в концентрации 400000 клеток/мл (80000 клеток RPE/лунка) в 0,33 см2 HTS-Transwells (Costar; Coming, NY, USA). Для PCR в реальном времени, вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции клетки засевали при концентрации 20000 клеток/мл.
Экспериментальные условия и обработки: помимо эугликемического состояния, в клетках, культивируемых при 25 ммоль/л D-глюкозы, тестировали восемнадцать различных условий:
Условие 1) Контрольные клетки не подвергались какой-либо обработке 5 мМ D-глюкозы.
Условие 2) Клетки обрабатывают диабетической средой 25 мМ D-глюкозы+носитель (15, 16 и 17 дни, одно применение/день) для оценки их эффекта в предотвращении повреждения клеток, спровоцированного диабетической средой.
Условие 3, 4, 5, 6, 7, 8) Клетки обрабатывали 25 мМ D-глюкозы и двумя различными концентрациями каждого продукта: Ic-007a (3, 4) 25 мкг/мл (=53 мкМ) и 50 мкг/мл (=107 мкМ); IIc-007a (5, 6) 25 мкг/мл (=53 мкМ) и 50 мкг/мл (=107 мкМ); IVc-059a (7, 8) 20 мкг/мл (=50 мкМ) и 40 мкг/мл (=100 мкМ) в течение 72 часов (15, 16 и 17 дни при одном применении в день) для оценки их потенциальных цитотоксических эффектов.
Условие 9) Клетки обрабатывали 25 мМ D-глюкозой и бевацизумабом (0,2 мг/мл) в течение 72 часов (15, 16 и 17 дни при одном применении в день) для оценки их потенциальных цитотоксических эффектов.
Условие 10) Диабетическая среда; клетки обрабатывали 25 мМ D-глюкозой+IL-1β (10 нг/мл)+TNF-α (25 нг/мл)+VEGF (25 нг/мл) в течение 48 ч (16 и 17 дни при одном применении/день) с целью спровоцировать нарушение монослоя.
Условие 11, 12, 13, 14, 15, 16) Клетки обрабатывали диабетической средой (25 мМ D-глюкозы+IL-1b (10 нг/мл)+TNF-α (25 нг/мл)+VEGF (25 нг/мл))+две концентрации новых соединений (Ic-007a, IIc-007a и IVc-059a (15, 16 и 17 дни при одном применении/день) для оценки их действия в предотвращении повреждения клеток, вызванного диабетическая среда.
Условие 17) Клетки обрабатывали диабетической средой (25 мМ D-глюкозы+IL-1β (10 нг/мл)+TNF-α (25 нг/мл)+VEGF (25 нг/мл))+бевацизумаб (0,2 мг/мл) (15, 16 и 17 дни по одному применению/день) для оценки их эффекта в предотвращении повреждения клеток, спровоцированного диабетической средой.
Измерение проницаемости ARPE-19. Проницаемость клеток RPE определяли через 18 дней путем измерения апикально-базолатерального движения FITC-декстрана (40 кДа) (Sigma, St Louis, MI, USA) в соответствии с процедурой, описанной ранее Villarroel et al. Exp Eye Res, 2009, 89, 913-920.
Условия внутреннего гемато-ретинального барьера : Первичные эндотелиальные клетки сетчатки человека (HREC) были получены из сосуда с криоконсервированными клетками, приобретенными у компании Innoprot (Vizcay, Spain). Эти клетки выделяли из ткани сетчатки трупных глаз человека, расщепленной 0,1 мг/мл коллагеназы типа I при температуре 37°С в течение 1 часа. Затем эндотелиальные клетки окончательно отбирали с помощью магнитных шариков, покрытых антителами против CD31 (DynaBeads; Dynal, Oslo, Norway). HREC размораживали в лаборатории и культивировали в эндотелиальной базальной среде (EBM), содержащей 5,5 мМ D-глюкозы, 5% FBS (эмбриональная телячья сыворотка), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и добавку ECG (эндотелиальный рост клеток) (Innoprot, Vizcay, Spain). Для прикрепления клеток использовали фибронектин человека (MerckMillipore, Madrid, Spain) в концентрации 5 мкг/мл. Клетки на пассажах 2-3 использовались для экспериментов. Для экспериментов HREC выращивали до слияния, а затем среду для культивирования клеток заменяли на среду с добавлением 1% FBS в течение 24 часов, а затем подвергали различным обработкам.
Условия/обработки: Использовали те же условия, что и для эксперимента с клетками ARPE-19. Измерение проницаемости HREC: Проницаемость монослоев HREC измеряли на проницаемых носителях при 12×105 клеток/лунку (24 лунки, фильтры PCF, Merk Millipore). Вставки инкубировали в течение 48 часов при температуре 37°C в 5% CO2-воздух для формирования монослоя. В конце среда была истощена по сыворотке за 24 часа до начала лечения. Нижняя камера была заполнена 600 мкл полной среды EBM, а верхняя камера 100 мкл суспензии клеток в обедненной сыворотке (1%).
Для обнаружения изменений проницаемости на верхнюю часть вкладыша добавляли 100 мкг/мл флуоресцентного FITC-DEXTRAN (Sigma, Madrid, Spain). Аликвоты по 200 мкл из базального отсека считывали в SpectraMax Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) при длине волны возбуждения/испускания 485/528 нм каждые 30 мин. Наконец, концентрацию декстрана определяли путем экстраполяции показаний флуоресценции на стандартной кривой. Каждое условие тестировалось трижды.
Жизнеспособность клеток и пролиферация: Подсчет клеток и анализ МТТ проводили в HREC для оценки жизнеспособности клеток в тестируемых условиях. Измеряли жизнеспособность и пролиферацию HREC. Вкратце, клетки окрашивали DAPI и делали фотографии (20×) в флуоресцентном инвертированном микроскопе (Olympus iX71 с V-RFL-T Olympus). Ядра клеток подсчитывали с помощью программного обеспечения Image J в трех разных полях для каждого состояния. Опыты повторялись трижды. Кроме того, для оценки жизнеспособности клеток использовали анализ МТТ (Sigma, Madrid, Spain). Вкратце, после обработки в каждую лунку добавляли 10 мкл 5 мг/мл МТТ в PBS и инкубировали еще 1 час при температуре 37°C. Среду удаляли, а полученные гранулы формазана растворяли в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) и определяли оптическую плотность при 562 нм с помощью планшет-ридера для ELISA (ELx800, Bio-Tek Instruments, VT, USA). Этот анализ исключил возможную систематическую ошибку в результатах из-за изменений в пролиферации клеток при различных условиях.
Механизмы действия:
- Провоспалительные цитокины оценивали в клетках ARPE-19 с помощью RT-PCR, а mRNA для IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-18, VEGF, IL-10, FGF измеряли методом двойной дельта-CT 2-AACT со значениями Cts для интересующего гена и эндогенного B-актина человека для получения ACT; значения mENA выражали как относительное изменение по отношению к условиям 25 мМ D-Gluc. (ссылка: Livak KJ, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-AACT Method, Methods, 2001, 25(4), 402-408, doi 10.1006/meth.2001.1262)
- Продукцию ROS оценивали с помощью внутриклеточного анализа ROS OxiSelect™ компании Cell (зеленая флуоресценция) (Bionova, Madrid, Spain). В анализе использовался проницаемый для клеток флуорогенный зонд 2',7'-дихлордигидрофлуоресцин диацетат (DCFH-DA), окисленный до высокофлуоресцентного 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина (DCF) клеточными ROS.
- Экспрессию эндотелина-1, PDGF и VCAM-1 анализировали в монослоях HREC с помощью иммуногистохимического анализа и RT-PCR.
- Экспрессию TJ (ZO) анализировали в монослоях ARPE-19 и HREC с помощью иммуногистохимического анализа.
Полученные результаты:
Результаты проницаемости внешнего гемато-ретинального барьера (монослой ARPE19) и внутреннего гемато-ретинального барьера (HREC) представлены в таблице 58. Соединения Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a уменьшали проницаемость наружного и внутреннего монослоев.
Влияние соединений Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a на продукцию ROS и TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18 и VEGF-mRNA в клетках монослоя ARPE19, подвергшихся воздействию недиабетической и диабетической среды, показаны в таблице 59.
Таблица 58: Проницаемость внешнего гематоэнцефалического барьера и внутреннего гематоэнцефалического барьера с использованием флуоресценции FITC-декстрана (нг/мл/см2)
=ДИАБЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА
Таблица 59: Продукция ROS и TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18 и VEGF mRNA клетками монослоя ARPE19 в недиабетической и диабетической среде
=ДИАБЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА
ROS % до 25 мМ D-глюкозы; R.Q.=Относительное количественное определение значений мРНК для цитокинов и фактора роста, выраженное как относительное изменение в зависимости от условий 25 мМ d-Gluc.
* p<0,05 между 25 мМ D-Glc+VEGF+TNF-α+IL-1β (диабетическая среда) и соединение Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СОЕДИНЕНИЕ, ИМЕЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ, И ЕГО СОЛЬ, И СОДЕРЖАЩАЯ ТАКИЕ СОЕДИНЕНИЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ТРОМБОТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2016 |
|
RU2739915C2 |
| ЗАМЕЩЕННЫЕ N-АРИЛБЕНЗАМИДЫ И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АМИЛОИДНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И СИНУКЛЕИНОПАТИИ | 2005 |
|
RU2381213C2 |
| СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКА | 2020 |
|
RU2820673C2 |
| 2-АРИЛУКСУСНЫЕ КИСЛОТЫ, ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ | 2004 |
|
RU2356887C2 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ ГИДРОКСИБЕНЗАМИДА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ Hsp90 | 2006 |
|
RU2458919C2 |
| БЕНЗОПИРАНОВЫЕ И БЕНЗОКОНДЕНСИРОВАННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ | 1995 |
|
RU2128655C1 |
| НОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ МОДУЛИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ | 2001 |
|
RU2277531C9 |
| КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ СОЛИ ПРИСОЕДИНЕНИЯ КИСЛОТ ЦЕФЕМА, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, СОДЕРЖАЩЕЕ ИХ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 1995 |
|
RU2161619C2 |
| Фосфониевые соли на основе алантолактона, обладающие противоопухолевой активностью, и способ их получения | 2023 |
|
RU2818095C1 |
| НОВЫЕ 4-(АЗАЦИКЛОАЛКИЛ)БЕНЗОЛ-1,3-ДИОЛОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ТИРОЗИНАЗ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ ЧЕЛОВЕКА И В КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВАХ | 2009 |
|
RU2499794C2 |
Изобретение относится к новым производным гидрохинона формулы (I), где Ra, Rb, R1-R3 определены в формуле изобретения, промежуточным соединениям для получения производных гидрохинона формулы (I), а также фармацевтическим композициям для применения в лечении и/или предотвращения, например, аутоиммунных, иммунологических, ревматологических, сосудистых, офтальмологических, фиброзных, метаболических и желудочно-кишечных расстройств, нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний, новообразований и связанных с раком заболеваний, гормональных заболеваний и иммунологических нарушений, возникающих в результате вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний и их осложнений. 4 н. и 15 з.п. ф-лы, 11 ил., 59 табл., 5 пр.
1. Замещенный гидрохинон формулы (I):
где:
Ra, Rb=H или C1-4ацил;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H или CONH-R10;
R2 и R3 представляют собой H или R5, при условии, что один из R2 и R3 представляет собой H, и другой представляет собой R5;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R5=R6, R7, или R8
R6=CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, CONHCH(COOR4)(CH2)kR9; где k=0-4;
R7=бензо(C5-14)гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, OR4, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл, или фтора;
R8=(CH2)mX(CH2)pR9;
X=O, S, SO2, NH, NAc или N(CH2)qR9;
R9=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, OR4, SO3H, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл, фтора, C=O или NHCO-R10;
R10=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, OR4, SO3H, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл, или фтора;
где арил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 6 до 14 атомов углерода, выбранную из фенильной, нафтильной, бифенильной группы; и гетероарил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 1 до 14 атомов углерода и один или несколько атомов азота; и
n, m, p и q независимо обозначают 1-4,
или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение формулы (I) по п.1:
где:
Ra, Rb=H или C1-4ацил;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H или CONH-R10;
R2 и R3 представляют собой H или R5, при условии, что один из R2 и R3 представляет собой H, и другой представляет собой R5;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R5=R6 или R7,
R6=CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, или CONHCH(COOR4)(CH2)kR9; где k=0-4;
R7=бензо(C5-14)гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, OR4, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл, или фтора;
R9=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, OR4, SO3H, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл, фтора, C=O или NHCO-R10;
R10=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, OR4, SO3H, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл, или фтора; где арил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 6 до 14 атомов углерода, выбранную из фенильной, нафтильной, бифенильной группы; и гетероарил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 1 до 14 атомов углерода и один или несколько атомов азота; и n независимо обозначает 1-4,
или его фармацевтически приемлемая соль.
3. Соединение по п.2, где:
(A)
Ra, Rb=H или C1-4ацил;
R1=COOR4;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H или C1-4ацил;
R1=COOR4;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
4-(2-карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(2-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-4-(2-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота;
4-(3-карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(3-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-4-(3-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота;
4-(4-карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(4-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-4-(4-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота;
4-(3-карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(4-карбокси-3-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(4-карбокси-2,5-дигидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(2-карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3,5-бис(2,5-дигидрокси-4-карбоксибензоиламино)бензойная кислота;
3-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота;
2-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)терефталевая кислота;
2-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота;
4-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота;
5-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота;
2-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
2-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотиновая кислота;
6-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
6-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
2-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)-5-фторникотиновая кислота;
6-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиридин-2,5-дикарбоновая кислота;
2-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиридин-3,5-дикарбоновая кислота;
3-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотиновая кислота;
5-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
5-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
3-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
5-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)-2-фторизоникотиновая кислота;
4-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
4-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
4-(4-(карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(3-(карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-4-(3-(1-гидрокси-1H-пиразол-4-ил)фениламинокарбонил)бензойная кислота;
4-(2-(карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
этил 4-(2-(этоксикарбонил)фениламинокарбонил)-2,5-диацетоксибензоат;
этил 4-(2-(этоксикарбонил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензоат;
этил 4-(2-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-диацетоксибензоат;
этил 4-(2-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензоат;
этил 2,5-дигидрокси-4-(4-гидрокси-3-(метоксикарбонил)фениламинокарбонил)бензоат;
этил 3,5-бис(2,5-диацетокси-4-этоксикарбонилбензоиламино)бензоат;
этил 3,5-бис(2,5-дигидрокси-4-этоксикарбонилбензоиламино)бензоат;
этил 3-(4-(этоксикарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотинат;
этил 4-(4-этоксикарбонил-2,5-дигидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензоат; 3-(2-карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(2-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-3-(2-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота;
3-(3-карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(3-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-3-(3-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота;
3-(4-карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(4-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-3-(4-сульфофениламинокарбонил)бензойная кислота;
3-(3-карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(4-карбокси-3-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(2-карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3,5-бис(2,5-дигидрокси-3-карбоксибензоиламино)бензойная кислота;
3-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота;
2-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)терефталевая кислота;
2-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота;
4-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота;
5-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота;
2-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
2-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотиновая кислота;
6-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
6-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
2-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)-5-фторникотиновая кислота;
6-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиридин-2,5-дикарбоновая кислота;
2-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиридин-3,5-дикарбоновая кислота;
3-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотиновая кислота;
5-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
5-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
3-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота
5-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)-2-фторизоникотиновая кислота;
4-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
4-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
3-(4-(карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(3-(карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-3-(3-(1-гидрокси-1H-пиразол-4-ил)фениламинокарбонил)бензойная кислота;
3-(2-(карбоксиметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
этил 3-(2-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензоат; и
этил 3-(2-(этоксикарбонилметил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензоат.
4. Соединение по п.2, где:
(A)
Ra, Rb=H;
R1=SO3H;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=SO3H;
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)бензойная кислота;
2,5-дигидрокси-4-(2-сульфофениламинокарбонил)бензолсульфоновая кислота;
3-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)бензойная кислота;
2,5-дигидрокси-4-(3-сульфофениламинокарбонил)бензолсульфоновая кислота;
4-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)бензойная кислота;
2,5-дигидрокси-4-(4-сульфофениламинокарбонил)бензолсульфоновая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
4-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)-5-гидроксибензойная кислота;
3,5-бис(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)бензойная кислота;
3-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)фталевая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)терефталевая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)изофталевая кислота;
4-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)фталевая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)изофталевая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)никотиновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)изоникотиновая кислота;
6-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)никотиновая кислота;
6-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)пиколиновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)-5-фторникотиновая кислота;
6-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)пиридин-2,5-дикарбоновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)пиридин-3,5-дикарбоновая кислота;
3-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)изоникотиновая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)никотиновая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)пиколиновая кислота;
3-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)пиколиновая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)-2-фторизоникотиновая кислота;
4-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)никотиновая кислота;
4-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)пиколиновая кислота;
(4-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)фенил)уксусная кислота;
(3-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)фенил)уксусная кислота;
(2-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)фенил)уксусная кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)бензойная кислота;
2,5-дигидрокси-3-(2-сульфофениламинокарбонил)бензолсульфоновая кислота;
3-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)бензойная кислота;
2,5-дигидрокси-3-(3-сульфофениламинокарбонил)бензолсульфоновая кислота;
4-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)бензойная кислота;
2,5-дигидрокси-3-(4-сульфофениламинокарбонил)бензолсульфоновая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
4-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)-5-гидроксибензойная кислота;
3-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)-5-(2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)бензойная кислота;
3-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)фталевая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)терефталевая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)изофталевая кислота;
4-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)фталевая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)изофталевая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)никотиновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)изоникотиновая кислота;
6-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)никотиновая кислота;
6-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)пиколиновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)-5-фторникотиновая кислота;
6-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)пиридин-2,5-дикарбоновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)пиридин-3,5-дикарбоновая кислота;
3-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)изоникотиновая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)никотиновая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)пиколиновая кислота;
3-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)пиколиновая кислота;
5-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)-2-фторизоникотиновая кислота;
4-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)никотиновая кислота;
4-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)пиколиновая кислота;
(4-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)фенил)уксусная кислота;
(3-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)фенил)уксусная кислота; и
(2-(2,5-дигидрокси-3-сульфобензамидо)фенил)уксусная кислота.
5. Соединение по п.2, где:
(A)
Ra, Rb=H;
R1=(CH2)nCOOR4;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R2=H или R5, R3=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=(CH2)nCOOR4; R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)бензойная кислота;
(2-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота; (2,5-дигидрокси-4-(2-сульфофениламинокарбонил)фенил)уксусная кислота;
3-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)бензойная кислота;
(2,5-дигидрокси-4-(3-сульфофениламинокарбонил)фенил)уксусная кислота;
4-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)бензойная кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-(4-сульфофениламинокарбонил)фенил)уксусная кислота;
5-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
4-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-5-гидроксибензойная кислота;
3,5-бис(2,5-дигидрокси-4-карбоксиметилбензоиламино)бензойная кислота
3-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота;
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)терефталевая кислота;
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота;
4-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота;
5-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота;
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотиновая кислота;
6-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
6-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-5-фторникотиновая кислота;
6-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиридин-2,5-дикарбоновая кислота;
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиридин-3,5-дикарбоновая кислота;
3-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотиновая кислота;
5-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
5-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
3-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
5-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-фторизоникотиновая кислота;
4-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
4-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
(4-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фенил)уксусная кислота;
(3-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фенил)уксусная кислота;
(2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фенил)уксусная кислота;
метил 2-(4-(этоксикарбонилметил)-2,5-дигидроксибензамидо)бензоат;
этил (4-(2-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)ацетат;
диэтил 5-(4-(этоксикарбонилметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изофталат;
метил 3,5-бис(4-(этоксикарбонилметил)-2,5-дигидроксибензамидо)бензоат;
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)бензойная кислота;
(2,5-дигидрокси-3-(2-сульфофениламинокарбонил)фенил)уксусная кислота;
3-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)бензойная кислота;
(2,5-дигидрокси-3-(3-сульфофениламинокарбонил)фенил)уксусная кислота;
4-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)бензойная кислота;
(2,5-дигидрокси-3-(4-сульфофениламинокарбонил)фенил)уксусная кислота;
5-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
4-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-5-гидроксибензойная кислота;
3,5-бис(2,5-дигидрокси-3-карбоксиметилбензоиламино)бензойная кислота
3-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота;
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)терефталевая кислота;
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота;
4-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фталевая кислота;
5-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изофталевая кислота;
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотиновая кислота;
6-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
6-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-5-фторникотиновая кислота;
6-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиридин-2,5-дикарбоновая кислота;
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиридин-3,5-дикарбоновая кислота;
3-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)изоникотиновая кислота;
5-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
5-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
3-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
5-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-фторизоникотиновая кислота;
4-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)никотиновая кислота;
4-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)пиколиновая кислота;
(4-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фенил)уксусная кислота;
(3-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фенил)уксусная кислота; и
(2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксибензамидо)фенил)уксусная кислота.
6. Соединение по п.2, где:
(A)
Ra, Rb=H или C1-4ацил;
R1=CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H или C1-4ацил;
R1=CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH-R9.
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
5-(4-(2-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота; N1,N4-бис(2-(1H-тетразол-5-ил)фенил)-2,5-дигидрокситерефталамид;
5-(4-(3-карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
5-(2,5-дигидрокси-4-(4-гидрокси-3-сульфофениламинокарбонил)бензамидо)-2-гидроксибензолсульфоновая кислота;
4-(4-(4-карбокси-3-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
4-(2,5-дигидрокси-4-(3-гидрокси-4-сульфофениламинокарбонил)бензамидо)-2-гидроксибензолсульфоновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-(4-гидрокси-2-карбоксифениламинокарбонил)бензамидо)-5-гидроксибензойная кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-(4-гидрокси-2-сульфофениламинокарбонил)бензамидо)-5-гидроксибензолсульфоновая кислота;
метил 5-(4-(2-(1H-тетразол-5-ил)фениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензоат;
метил 5-(2,5-диацетокси-4-(4-ацетокси-3-(метоксикарбонил)фениламинокарбонил)бензамидо)-2-ацетоксибензоат;
метил 5-(2,5-дигидрокси-4-(4-гидрокси-3-(метоксикарбонил)фениламинокарбонил)бензамидо)-2-гидроксибензоат;
метил 2-(2,5-дигидрокси-4-(4-гидрокси-2-(метоксикарбонил)фениламинокарбонил)бензамидо)-5-гидроксибензоат;
1-(2,2-диметилпропаноилокси)этил 5-[[4-[[3-[1-(2,2-диметилпропаноилокси)этоксикарбонил]-4-гидрокси-фенил]аминокарбонил]-2,5-дигидрокси-бензоил]амино]-2-гидроксибензоат;
5-(3-(3-карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
5-(2,5-дигидрокси-3-(4-гидрокси-3-сульфофениламинокарбонил)бензамидо)-2-гидроксибензолсульфоновая кислота;
4-(3-(3-гидрокси-4-карбоксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойная кислота;
4-(2,5-дигидрокси-3-(3-гидрокси-4-сульфофениламинокарбонил)бензамидо)-2-гидроксибензолсульфоновая кислота;
2-(3-(2-карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-5-гидроксиlбензойная кислота; и
2-(2,5-дигидрокси-3-(4-гидрокси-2-сульфофениламинокарбонил)бензамидо)-5-гидроксибензолсульфоновая кислота.
7. Соединение по п.2, имеющее формулу (I):
где:
Ra, Rb=H;
R1 = CONH-R10;
R10 = фенил, замещенный COOR4 и OR4;
R2 = H;
R3 = CONH-R9;
R9 = фенил, замещенный COOR4 и OR4; и
R4 = H;
и где указанное соединение представляет собой 5-(4-(3-карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойную кислоту.
8. Соединение по п.2, имеющее формулу (I):
где:
Ra, Rb=H;
R1 = CONH-R10;
R10 = фенил, замещенный COOR4 и OR4;
R2 = CONH-R9;
R3 = H;
R9 = фенил, замещенный COOR4 и OR4; и
R4 = H;
и где указанное соединение представляет собой 5-(3-(3-карбокси-4-гидроксифениламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензамидо)-2-гидроксибензойную кислоту.
9. Соединение по п.2, где:
(A)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONHCOR9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4;
Rt=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONHCOR9;
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
N-(1,3,4,5-тетрагидроксициклогексилкарбонил) 4-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензоил) 4-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензоил) 4-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3,4-дигидроксибензоил) 4-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3,5-дигидроксибензоил) 4-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(1,3,4,5-тетрагидроксициклогексилкарбонил) 3-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензоил) 3-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензоил) 3-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3,4-дигидроксибензоил) 3-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3,5-дигидроксибензоил) 3-карбокси-2,5-дигидроксибензамид;
N-(1,3,4,5-тетрагидроксициклогексилкарбонил) 4-карбоксиметил-2,5-дигидроксибензамид;
N-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензоил) 4-карбоксиметил-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензоил) 4-карбоксиметил-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3,4-дигидроксибензоил) 4-карбоксиметил-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3,5-дигидроксибензоил) 4-карбоксиметил-2,5-дигидроксибензамид;
N-(1,3,4,5-тетрагидроксициклогексилкарбонил) 3-карбоксиметил-2,5-дигидроксибензамид;
N-(4-карбокси-2,5-дигидроксибензоил) 3-карбоксиметил-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3-карбокси-2,5-дигидроксибензоил) 3-карбоксиmethy1-2,5-дигидроксибензамид;
N-(3,4-дигидроксибензоил) 3-карбоксиметил-2,5-дигидроксибензамид; и
N-(3,5-дигидроксибензоил) 3-карбоксиметил-2,5-дигидроксибензамид.
10. Соединение по п.2, где
(A)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил (оксодиоксолил)метил; или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH(CH2)n-R9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONH(CH2)n-R9;
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
4-(3,4-дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(2-(3,4-дигидроксифенил)этиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(3,5-дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((4,5-дигидрокси-3-оксоциклогекс-1-енил)метиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-4-((3,4,5-тригидроксициклогексил)метиламинокарбонил)бензойная кислота;
4-(2-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(3-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(4-карбоксифенилметиламинокарбонил) 2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(3,4-дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(2-(3,4-дигидроксифенил)этиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(3,5-дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((4,5-дигидрокси-3-оксоциклогекс-1-енил)метиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
2,5-дигидрокси-3-((3,4,5-тригидроксициклогексил)метиламинокарбонил)бензойная кислота;
3-(2-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(3-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(4-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
(4-(3,4-дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(4-(3,5-дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(4-((4,5-дигидрокси-3-оксоциклогекс-1-енил)метиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(2,5-дигидрокси-4-((3,4,5-тригидроксициклогексил)метиламинокарбонил)фенил)уксусная кислота;
(4-(2-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(4-(3-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(4-(4-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(3-(3,4-дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(3-(3,5-дигидроксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(3-((4,5-дигидрокси-3-оксоциклогекс-1-енил)метиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(2,5-дигидрокси-3-((3,4,5-тригидроксициклогексил)метилкарбониламино)фенил)уксусная кислота;
(3-(2-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота;
(3-(3-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота; и
(3-(4-карбоксифенилметиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота.
11. Соединение по п.2, где:
Ra, Rb=H;
R1=SO3H;
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONH(CH2)n-R9;
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
2-((2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)метил)бензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)метил)бензойная кислота; и
4-((2,5-дигидрокси-4-сульфобензамидо)метил)бензойная кислота.
12. Соединение по п.2, где:
(A)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R2=H; R3=R5; и
R5=R6=CONHCH(COOR4)(CH2)kR9;
или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4; (CH2)nCOOR4;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R3=H; R2=R5; и
R5=R6=CONHCH(COOR4)(CH2)kR9;
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
4-(1-карбокси-2-(3,4-дигидроксифенил)этиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-(карбокси(3,4-дигидроксифенил)метиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-(1-карбокси-2-(3,4-дигидроксифенил)этиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота
3-(карбокси(3,4-дигидроксифенил)метиламинокарбонил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
(4-(карбокси(3,4-дигидроксифенил)метиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота; и
(3-(карбокси(3,4-дигидроксифенил)метиламинокарбонил)-2,5-дигидроксифенил)уксусная кислота.
13. Соединение по п.2, где:
(A)
Ra, Rb=H ;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H или CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R2=H; R3=R5; и
R5=R7=бензо(С5-14)гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, OR4, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл, или фтора; или
(B)
Ra, Rb=H;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H или CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R3=H; R2=R5; и
R5= R7=бензо(C5-14)гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из: COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, OR4, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл, или фтора;
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
2-(4-карбокси-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-4-карбоновая кислота;
метил 2-(4-этоксикарбонил-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-4-карбоксиlate;
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)-1H-бензо[d]имидазол-4-карбоновая кислота;
2-(4-карбокси-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-5-карбоновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)-1H-бензо[d]имидазол-5-карбоновая кислота;
2-(3-карбокси-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-4-карбоновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)-1H-бензо[d]имидазол-4-карбоновая кислота;
2-(3-карбокси-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-5-карбоновая кислота;
2-(2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)-1H-бензо[d]имидазол-5-карбоновая кислота;
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-4-карбоновая кислота;
2-(4-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-5-карбоновая кислота;
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-4-карбоновая кислота; и
2-(3-(карбоксиметил)-2,5-дигидроксифенил)-1H-бензо[d]имидазол-5-карбоновая кислота.
14. Соединение формулы (I):
где:
Ra, Rb=H или C1-4ацил;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H или CONH-R10;
R2 и R3 представляют собой H или R5, при условии, что один из R2 и R3 представляет собой R5, и другой представляет собой R5;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или o-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R5=R8
R8= (CH2)mX(CH2)pR9;
X=O, S, SO2, NH, NAc или N(CH2)qR9;
R9=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, OR4, SO3H, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл, фтора, C=O или NHCO-R10;
R10=арил, гетероарил, замещенный по меньшей мере одной или несколькими группами, выбранными из COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, азола, представляющего собой 5-членный N-содержащий гетероцикл или фтора;
где арил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 6 до 14 атомов углерода, выбранную из фенильной, нафтильной или бифенильной группы; и
гетероарил в R9 и R10 представляет собой ароматическую группу, содержащую от 1 до 14 атомов углерода и один или несколько атомов азота; и
n, m, p и q независимо обозначают 1-4,
или его фармацевтически приемлемая соль.
15. Соединение по п.14, где:
(A)
Ra, Rb=H или C1-4ацил;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или о-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R2=H; R3=R5; и
R5=R8=(CH2)mX(CH2)pR9;
где X=O, S, SO2, NH, NAc или N(CH2)qR9;
или
(B)
Ra, Rb=H или C1-4ацил;
R1=COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, CONH-R10;
R4=H, C1-4алкил, арилC1-4алкил, морфолино-C1-C6алкил, пирролидино-C1-C6алкил, N-метилпиперазино-C1-C6алкил, C1-C6ацилоксиметил, C1-C6ацилокси-1-этил, C1-C6алкоксикарбонилоксиметил, C1-C6алкоксикарбонилокси-1-этил, (оксодиоксолил)метил или о-метоксифенил (гваяколовый эфир);
R3=H; R2=R5; и
R5=R8=(CH2)mX(CH2)pR9;
где X=O, S, SO2, NH, NAc или N(CH2)qR9;
или
где указанное соединение выбрано из группы, включающей следующие соединения:
бис(4-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)амин;
4-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенилметиламино)метил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенилметиламино)метил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
бис(2,5-дигидрокси-4-сульфофенилметил)амин;
N, N-бис(4-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)ацетамид;
N-(2,5-дигидрокси-4-сульфофенилметил) N-(4-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)ацетамид;
N-(2,5-дигидрокси-3-сульфофенилметил) N-(4-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)ацетамид;
N, N-бис(2,5-дигидрокси-4-сульфофенилметил)ацетамид;
4-((2,5-дигидрокси-4-карбоксифенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензолсульфоновая кислота;
4-((2,5-дигидрокси-4-карбоксифенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензолсульфоновая кислота; 4-((2,5-дигидрокси-4-карбоксифенил)метоксиметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)метоксиметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)метоксиметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
4-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)метоксиметил)-2,5-дигидроксибензолсульфоновая кислота;
трис (4-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)амин;
трис (4-этоксикарбонил-2,5-дигидроксифенилметил)амин;
бис(3-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)амин;
3-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенилметиламино)метил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенилметиламино)метил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
бис(2,5-дигидрокси-3-сульфофенилметил)амин;
N, N-бис(3-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)ацетамид;
N-(2,5-дигидрокси-3-сульфофенилметил) N-(3-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)ацетамид;
N-(2,5-дигидрокси-4-сульфофенилметил) N-(3-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)ацетамид;
N, N-бис(2,5-дигидрокси-3-сульфофенилметил)ацетамид;
3-((2,5-дигидрокси-3-карбоксифенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)метилтиометил)-2,5-дигидроксибензолсульфоновая кислота;
3-((2,5-дигидрокси-3-карбоксифенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)метилсульфонилметил)-2,5-дигидроксибензолсульфоновая кислота;
3-((2,5-дигидрокси-3-карбоксифенил)метоксиметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)метоксиметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-4-сульфофенил)метоксиметил)-2,5-дигидроксибензойная кислота;
3-((2,5-дигидрокси-3-сульфофенил)метоксиметил)-2,5-дигидроксибензолсульфоновая кислота;
метил 3-((2,5-диацетокси-3-метоксикарбонилфенил)метилсульфонилметил)-2,5-диацетоксибензоат;
метил 3-((2,5-дигидрокси-3-метоксикарбонилфенил)метилсульфонилметил)-2,5-гидроксибензоат;
2-морфолиноэтил 3-((2,5-дигидрокси-3-(2-морфолиноэтоксикарбонил)фенил)метилсульфонилметил)-2,5-гидроксибензоат;
трис (3-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)амин; и
трис (3-этоксикарбонил-2,5-дигидроксифенилметил)амин.
16. Соединение по п.14, имеющее формулу (I):
где:
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4;
R2 = H;
R3 = R8;
R4 = H;
R8 = (CH2)mX(CH2)pR9;
R9 = фенил, замещенный COOR4 и OR4;
X = N(CH2)qR9; и
m, p и q = 1; и
где указанное соединение представляет собой трис (4-карбокси-2,5-дигидроксифенилметил)амин.
17. Соединение по п.14, имеющее формулу (I):
где:
Ra, Rb = H;
R1 = COOR4;
R2 = (CH2)mX(CH2)pR9;
R3 = H;
R9 = фенил, замещенный COOR4 и OR4;
R4 = H;
X = SO2; и
m и q = 1; и
где указанное соединение представляет собой 3-((2,5-дигидрокси-3-карбоксифенил)метилсульонилметил)-2,5-дигидроксибензойную кислоту.
18. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп.1-17 или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый эксципиент, для применения в способе лечения и/или профилактики аутоиммунных, иммунологических, ревматологических, сосудистых заболеваний, офтальмологических заболеваний, фиброзных заболеваний, метаболических и желудочно-кишечных нарушений, нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваний, новообразований и связанных с раком заболеваний, заболеваний, связанных с гормонами, или иммунологических нарушений, возникающих в результате вирусных и/или бактериальных инфекционных заболеваний и/или их осложнений.
19. Промежуточные соединения в синтезе соединений по п.2, выбранные из 2,5-бис(бензилокси)-4-(этоксикарбонил)бензойной кислоты; 2,5-бис(бензилокси)изофталальдегида; 2,5-бис(бензилокси)изофталевой кислоты; этил 2,5-бис(бензилокси)-4-(гидроксиметил)бензоата; или этил 2,5-бис(бензилокси)-3-(гидроксиметил)бензоата.
| US 20080139632 A1, 12.06.2008 | |||
| US 20130172333 A1, 04.07.2013 | |||
| WO 2010142766 A2, 16.12.2010 | |||
| US 20130121919 A1, 16.05.2013 | |||
| CN 109678915 A, 26.04.2019 | |||
| KR 2006033817, 20.04.2006 | |||
| ГИДРОКСИБЕНЗОАТНЫЕ СОЛИ МЕТАНИКОТИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ | 2005 |
|
RU2409566C2 |
| EA 201690829 A1, 31.08.2016 | |||
| US 4208328 A1, 17.06.1980. | |||
