СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 A61K47/10 A61K9/08 A61P43/00 G09B23/28 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано в научных исследованиях для моделирования постнекротического цирроза печени, поиска новых эффективных способов его лечения, а также в ходе биомедицинских исследований у лабораторных животных.

Уровень техники

Известны различные способы моделирования цирроза печени.

Так известен способ моделирования цирроза печени путем длительного введения малых доз гепатотропного яда в виде четыреххлористого углерода (CCl₄). При вскармливании собак 2 раза в неделю с пищей по 3-5 мл раствора CCl₄ цирроз развивается спустя 6 месяцев (Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени. Будапешт: Изд-во АН Венгрии. - 1961. - 215 с.).

Однако в этих условиях воспроизводимость цирроза печени невелика и не превышает 30-40%, следовательно, результаты опыта практически не прогнозируемы, а его реализация очень длительна и негативно сказывается на общем состоянии экспериментальных животных.

Также известен способ моделирования цирроза печени по методике Д.С. Саркисова (1965), в ходе которой моделирование цирроза печени проводилось введением подопытным кроликам 40% раствора четыреххлористого углерода в персиковом масле из расчета 2,0 мл/кг два раза в неделю. При этом процесс формирования цирроза печени начинается через 1,5-2 месяцев от начала эксперимента с отчетливым выражением патологического процесса спустя 3-4 месяца (Руководство по экспериментальной хирургии / С.А. Шалимов, А.П. Радзиховский, Л.В. Кейсевич. М.: Медицина. - 1989. - 272 с.).

Также известен способ создания модели гепатита и цирроза печени млекопитающих, где в качестве химического вещества берут формалин и вводят его путем вдыхания воздуха, содержащего 17,5-18,5 мг/л формалина (Заявка на изобретение РФ № 94026117, МПК G09B 23/28, опубл. 27.08.1996).

Известный способ моделирования цирроза печени является продолжительным, трудоемким и опасным: ежедневные ингаляционные опыты в течение 7 месяцев. Кроме того, 70%-ный раствор формалина представляет собой водный раствор формальдегида, который обладает резко выраженным раздражающим и сенсибилизирующим действием, средняя смертельная концентрация для крыс 588 мг/м³.

Недостатками данного способа являются несколько факторов. Предельно допустимая концентрация паров формальдегида в воздухе рабочей зоны 0,5 мг/м³, 2 класс опасности. Вещество остронаправленного механизма действия, способное вызывать аллергические заболевания в условиях производства и требующее автоматического контроля за его содержанием в воздухе. При концентрации формалина 17,5-18,5 мг/л (или 17500-18500 мг/м³) возможно развитие острого отравления всего организма с воспалительными и некробиотическими изменениями слизистых оболочек верхних дыхательных путей и легких. В условиях производства хроническое воздействие высоких концентраций формалина недопустимо.

Также известен способ хирургического моделирования цирроза печени, предусматривающий одновременное пережатие сосудистых ножек долей печени, при этом количество одновременно пережимаемых сосудистых ножек долей печени составляет по меньшей мере четыре, а время, в течение которого осуществляют пережатие, составляет не более 40 мин (патент на изобретение РФ №2192669, МПК G09B 23/28, опубл. 10.11.2002).

Недостатком данного способа является длительное оперативное вмешательство на экспериментальной биологической модели, что сказывается негативно на общем состоянии экспериментальных животных.

Также известен способ моделирования цирроза печени путем введения в желудок вводят два раза в неделю в течение месяца 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела и 10%-ный раствор этанола вместо воды для питья (патент РФ №2197018, МПК G09B 23/28, опубл. 20.01.2003).

Предлагаемый способ также вызывает трудности, связанные с необходимостью длительного эксперимента, что также негативно сказывается на общем состоянии экспериментальных животных.

Известен способ инициации токсического поражения печени путем перорального введения 40% этилового спирта в дозе 14 мл/кг в течение 60 суток (Доркина Е.Г. Гепатопротекторные свойства флавоноидов: автореф. дис. д-ра биол. наук / Е.Г. Доркина. - Волгоград, 2010. - 45 с.).

Однако известно, что в результате данного эксперимента у животных обычно развивается только жировой гепатоз и/или токсический гепатит, но никак не фиброз и цирроз. В связи с этим приходилось усиливать гепатотоксическое действие этанола при помощи иных гепатотоксикантов и наоборот (Popper Н. Histogenesis of alcoholic fibrosis and cirrhosis in the baboon / H. Popper, C.S. Lieber // Am. J. Pathol. - 1980. - Vol. 98, №3. - P. 695-716).

Наиболее близким к заявляемому является способ моделирования экспериментального цирроза печени, включающий дозированное введение этанола крысам. Этанол вводят внутрижелудочно в течение 3-х недель через день в дозе 3 г/кг, одновременно осуществляют внутрибрюшинное введение в течение 4-х последовательных дней каждой недели 1% раствора диметилнитрозамина (ДМНА) в дозе 5 мг/кг (патент РФ №2669024, МПК G09B 23/28, опубл. 05.10.2018). Способ позволяет повысить воспроизводимость, сократить срок моделирования цирроза печени с 6 недель до 3 недель и приблизить модель к клиническому течению данной патологии у человека

Однако способ требует нескольких вмешательств, что увеличивает срок моделирования. Для реализации требуется дорогостоящий препарат (диметилнитрозамин).

Раскрытие сущности изобретения

Технической проблемой изобретения является разработка способа, наиболее приближенного к клиническому течению цирроза печени вследствие развития необратимых структурных и функциональных изменений в печеночных дольках, обеспечивающего фиброз паренхимы печени с сохранением гепатоцитов и их функциональной активности.

Технический результат заключается в обеспечении воспроизводимости моделирования при сокращенных сроках и в более упрощенном виде.

Технический результат достигается тем, что в способе моделирования экспериментального цирроза печени у лабораторных крыс путем воздействия этанолом, согласно изобретению, воздействие осуществляют путем прямого интраоперационного введения 0,3-0,5 мл 60 - 79% раствора этанола под глиссонову капсулу вглубь паренхимы печени животного.

Краткий перечень чертежей

Изобретение поясняется чертежами, фиг. 1 и фиг. 2, на которых приведены результаты микроскопии препаратов печени после проведенного эксперимента, окраска: гематоксилин-эозин, где:

1. здоровая ткань печени;

2. демаркационная зона;

3. зона цирроза.

Осуществление изобретения

Способ осуществляется следующим образом.

По стандартной методике проводят общую анестезию лабораторных животных. В асептических условиях выполняют микро-лапаротомию в правом подреберье для обеспечения хирургического доступа к правой доли печени. Под глиссонову капсулу вглубь паренхимы печени с помощью инсулинового шприца вводят раствор этанола. Количество вводимого раствора в зависимости от его концентрации было установлено экспериментальным путем. Операционную рану зашивают.

По описанной выше методике был проведен эксперимент на лабораторных крысах. Через 2 недели выполнили повторную лапаротомию. Наблюдали характерную макроскопическую картину крупноочагового цирроза печени. В ходе второй операции брали фрагмент измененной печени для морфологического исследования - выполняли эксцизионную биопсию. Морфологическое исследование показало формирование выраженного фиброза паренхимы печени со структурной перестройкой печеночных долек, что является характерным признаком цирроза печени (см. фиг.1 и 2).

Применяли различные дозы и концентрации этанола для выявления оптимальных условий моделирования цирроза печени (Таблица 1).

Таблица 1. Использованные диапазоны концентрации и объема этанола.

Концентрация
раствора
этанола (%)
Объем
Раствора
Этанола(мл) 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 0,1-0,2 - - - - - 0,2-0,3 - - - - - 0,3-0,4 - - + + - 0,4-0,5 - - + + - 0,5-0,6 - - - - -

При использовании низких концентраций (40-49%; 50-59%) и объема (0,1-0,2 мл; 0,2-0,3 мл) введенного раствора этанола не наблюдали морфологической картины цирроза печени. При использовании высоких концентраций (80-89% и >) и объема (0,5-0,6 мл и >) раствора этанола наблюдали тотальное поражение печени со смертью лабораторных животных.

Благодаря данной методике цирроз моделируется в срок 14 суток от проведения эксперимента у 100% животных и имеет выраженные морфологические (макро- и микроскопические) признаки.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к хирургии. Лабораторным крысам вводят интраоперационно под глиссонову капсулу вглубь паренхимы печени 60-79% раствора этанола в дозе 0,3-0,5 мл. Способ позволяет воспроизвести модель цирроза печени при сокращенных сроках и в более упрощенном виде, что в свою очередь дает возможность наблюдать формирование выраженного фиброза паренхимы печени со структурной перестройкой печеночных долек, что является характерным признаком цирроза печени. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ моделирования экспериментального цирроза печени у лабораторных крыс путем воздействия этанолом, отличающийся тем, что воздействие осуществляют путем интраоперационного введения от 0,3 до 0,5 мл 60-79% раствора этанола под глиссонову капсулу в паренхиму печени животного.