Способ лечения цирроза печени Российский патент 2023 года по МПК A61M37/00 A61K31/517 A61K31/475 A61K38/18 A61P1/16 

Изобретение относится к области медицины, а именно к терапии и гепатологии, и может быть использовано для повышения эффективности лечения экспериментального цирроза печени и ускорения регенерации.

Печень является жизненно важным органом и ее заболевания остаются серьезной проблемой здравоохранения. Ежегодно в мире регистрируется более 2 миллионов случаев смерти от заболеваний печени, из них 1 миллион связан с циррозом печени (ЦП) или его осложнениями [Asrani S.K., 2019]. В России патология печени, в том числе ЦП, занимает ведущее место в структуре гастроэнтерологической смертности [Цуканов В.В., 2021]. ЦП - это форма фиброза печени, вызванная различными заболеваниями печени, включая вирусный гепатит, алкогольное поражение печени, неалкогольный стеатогепатит и аутоиммунные заболевания печени [Nishikawa K, 2018]. В 50% случаев развитие ЦП связано с токсическим воздействием алкоголя [Bataller R., 2015]. ЦП возникает в результате различных механизмов повреждения печени, но все они приводят к некровоспалительному процессу и фиброгенезу. Гистологически ЦП характеризуется диффузной узловатой регенерацией, окруженной плотными фиброзными перегородками с последующим отмиранием паренхимы и коллапсом структур печени [Tsochatzis ЕА, 2014]. Терапия ЦП является симптоматической, а на терминальной стадии единственным методом лечения является трансплантация печени. ЦП приводит к различным осложнениям (печеночной недостаточности, портальной гипертензии и повышенному риску канцерогенеза), что приводит к неблагоприятному прогнозу; поэтому разработка новых методов лечения ЦП является важной задачей [Nishikawa K, 2018].

Известен способ коррекции нарушений в ткани печени под влиянием специфического антагониста 5-НТ 2 -рецепторов - кетансерина [Vorobioff J, 1989]. Кетансерин - ингибитор серотонина, снижает давление в воротной вене печени и путем улучшения гемодинамики печени повышает эффективность терапии [Vorobioff J, 1989].

Данный способ является близким к заявляемому и выбран в качестве прототипа.

Недостатком способа являются частые побочные эффекты кетансерина и недостаточная его эффективность, которые могут ограничивать его клиническое применение [Vorobioff J, 1989].

Перспективным для лечения цирроза печени может являться комплексное влияние на ткань печени - поликомпонентная терапия (кетансерин, резерпин, фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов) оказывает выраженное противовоспалительное и антифибротическое действие, стимулирует процессы регенерации печени и восстанавливает функцию гепатоцитов.

Задачей данного изобретения является разработка способа лечения цирроза печени за счет последовательной коррекции типовых патологических процессов: воспаления, фиброза, а также стимуляции ангиогенеза и ускорение неогенеза гепатоцитов.

Для достижения нового технического результата в способе лечения цирроза печени путем введения кетансерина, дополнительно вводят резерпин, фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов, при этом препараты вводят в следующие сроки и в следующей последовательности: кетансерин вводят с 85-х по 95-е сутки в дозе 0,2 мг/кг от первого введения тетрахлоруглерода, резерпин вводят на 96-е сутки и на 100-е сутки в дозе 1 мг/кг, фактор роста эндотелия сосудов вводят на 96-102-е сутки в дозе 200 нг/животное, фактор роста гепатоцитов вводят на 100-е сутки в дозе 300 нг/животное.

Новым в предлагаемом изобретении является совместное последовательное использование кетансерина, резерпина, фактора роста эндотелия сосудов и фактора роста гепатоцитов при лечении экспериментального цирроза печени.

Кетансерин («Ketanserinum», Sigma, США) - специфический антагонист 5-НТ2-рецепторов; кроме того, оказывает умеренное альфа-адреноблокируюшее действие. Кетансерин блокирует разные эффекты серотонина, оказывает влияние на агрегацию тромбоцитов. При блокировании рецепторов 5-НТ2А кетансерином снижается содержание коллагена, проколлагена 1 и 3 в легких животных с пневмофиброзом, т.о. проявляется его антифибротический эффект [Fabre А., 2008].

Резерпин («Reserpine», «Sigma», США) - 3,4,5-триметоксибензоат метилрезерпата. Индольный алкалоид, выделенный из растения Rauvolfia serpentina. Основным фармакологическим свойством резерпина является его симпатолитическое действие, обусловленное тем, что под его влиянием ускоренно высвобождаются катехоламины из гранулярных депо пресинаптических нервных окончаний. Высвобожденные катехоламины подвергаются инактивирующему действию моноаминоксидазы (МАО), что ведет к уменьшению катехоламинов в синаптической щели и ослаблению адренергических влияний на эффекторные системы периферических органов [Машковский, 2020]. Симпатолитик резерпин уменьшает инфильтрацию легочной ткани воспалительными клетками и препятствует отложению соединительной ткани в паренхиме легких у мышей в условиях введения блеомицина [Дыгай A.M., 2018].

Фактор роста эндотелия сосудов («Vascular Endothelial Growth Factor», VEGF, Sigma, США) - секретируется эндотелиальными клетками и перицитами в ответ на гипоксию, стимулирует ангиогенез и вызывает повышенную проницаемость микрососудов.

Фактор роста гепатоцитов («Hepatocyte Growth Factor», HGF, Sigma, США) - является мощным митогеном для гепатоцитов и различных типов клеток, включая эндотелиальные и эпителиальные клетки. Он также опосредованно влияет на морфогенез эпителия.

Таким образом, задачей изобретения является разработка способа лечения цирроза печени и ускорения регенерации за счет последовательной коррекции типовых патологических процессов: фиброза кетансерином, воспаления резерпином и далее стимуляция ангиогенеза фактором роста эндотелия сосудов (VEGF) и ускорение неогенеза гепатоцитов фактором роста гепатоцитов (HGF).

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.

Способ основан на данных источников информации и анализе результатов экспериментальных исследований. Эффективность способа доказана в эксперименте на крысах-самцах Wistar в возрасте 12 недель. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (сертификат имеется). Исследование было одобрено этическим комитетом НИИФиРМ имени Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ РАН. Животные разделены на 4 группы: 1 - контрольная группа (8 крыс), 2 - группа патологического контроля (8 крыс), 3 - группа с циррозом печени, получавшая кетансерин (8 крыс). 4 - группа с циррозом печени, получавшая политерапию (8 крыс).

Способ будет понятен из следующего описания и приложенных к нему фигур 1 и 2.

На фигуре 1 изображена печень крыс-самцов Wistar на 102-е сутки эксперимента, при окрашивании ткани гематоксилином и эозином: а - интактной, 6 - получавшей алкоголь и ТХУ, в - получавшей кетансерин; г - получавшей кетансерин, резерпин, фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов на фоне моделирования цирроза печени. Увеличение × 100.

На фигуре 2 изображена печень крыс-самцов Wistar на 102-е сутки эксперимента, при окрашивании ткани на соединительную ткань по Ван-Гизону: а - интактной, б - получавшей алкоголь и ТХУ, в - получавшей кетансерин; г - получавшей кетансерин, резерпин, фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов на фоне моделирования цирроза печени. Увеличение × 100.

Способ осуществляют следующим образом.

Цирроз печени моделируют введением в течение 12 недель перорально 40% масляного раствора тетрахлоруглерода (ТХУ, «ЭКОС-1», Россия) в объеме 0,2 мл на 100 грамм массы тела 1 раз в неделю. Для потенцирования гепатотропного эффекта животным предоставляется на протяжении всего эксперимента в свободном доступе 5%-ный раствор этанола и глюкозы. [Мяделец О.Д., 2017; Евсеенко Д.А., Дундаров З.А., 2018]. Тетрахлоруглерод - хлорорганическое соединение, ССЦ. Ядовит как в жидком, так и парообразном виде. При попадании в организм быстро выводится и через 48 часов не обнаруживается. Метаболизируется до хлороформа и диоксида углерода. Оказывает токсическое действие на печень, результатом может быть желтая атрофия печени, а также ее цирроз.

Специфический антагонист 5-НТ2-рецепторов кетансерин («Ketanserinum», Sigma, США) вводят внутрибрюшинно в дозе 0,2 мг/кг, начиная с 85-х по 95-е сутки от начала моделирования цирроза печени, ежедневно.

Симпатолитик резерпин («Reserpine», Sigma, США) вводят внутрибрюшинно на 96-е и 100-е сутки в дозе 1 мг/кг.

Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, Sigma, США) вводят внутривенно на 96-102 сутки в дозе 200 нг/животное.

Фактор роста гепатоцитов (HGF, Sigma, США) вводят внутривенно однократно в дозе 300 нг/животное на 100-е сутки от начала моделирования цирроза печени.

Заявляемые дозы и режим введения подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата. Повышение дозы и кратности введения отменяют получение заявленного технического результата. В качестве фона используют интактных животных (интактный контроль). На 102-е сутки после начала моделирования цирроза печени проводят эвтаназию крыс передозировкой СО₂ и изучают морфологическую картину печени и биохимические показатели сыворотки крови. Для гистологического исследования печени по стандартной методике готовят парафиновые блоки. С каждого блока получают срезы, которые окрашивают гематоксилином и эозином для изучения содержания лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и по Ван-Гизону на соединительную ткань [Меркулов Г.А., 1969]. Определение содержания в сыворотке щелочной фосфатазы, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, общего и прямого билирубина, холестерина проводят по общепринятым методикам, используя автоматический биохимический анализатор «Весктап Coulter AU480» (США) и стандартные наборы фирмы «Весктап Coulter» (США).

Математическую обработку результатов производят с применением стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивают с использованием параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического U критерия Манна-Уитни.

Пример

При курсовом введении тетрахлоруглерода (ТХУ) и алкоголя в ткани печени отмечается развитие выраженной воспалительной реакции, в том числе лимфо-гистиоцитарная инфильтрация портальных трактов, жировая и гидропическая дистрофия гепатоцитов (фиг. 1б), фиброз с формированием ложных долек (фиг. 2б), ступенчатые некрозы гепатоцитов по периферии долек, при этом выявляются признаки холестаза. В тоже время моделирование цирроза печени вызывает достоверное уменьшение количества синусоидных капилляров печени (табл. 1).

При монотерапии кетансерином у животных с токсическим алкогольным циррозом печени отмечается слабо выраженный терапевтический эффект: некоторое снижение интенсивности жировой и белковой дистрофии, уменьшается отложение фибротических масс (фиг. 1в, 2в). В составе воспалительного инфильтрата помимо мононуклеаров появились нейтрофилы. Применение кетансерина положительно сказывается и на микрососудистом русле печени, о чем свидетельствует достоверно большее количество синусоидных капилляров в печени (табл.1).

Поликомпонентная терапия экспериментального цирроза печени кетансерином, резерпином, VEGF и HGF приводит к значительному снижению выраженности жировой и белковой дистрофии гепатоцитов (фиг. 1г). При этом наблюдается снижение интенсивности воспалительной инфильтрации паренхимы печени и дополнительно выявляется меньшее количество некротизированных гепатоцитов. Площадь фиброзной ткани снижается, выявляются большие участки печеночной ткани, имеющей нормальное строение (фиг. 2 г). Отмечается усиление процессов регенерации печеночных клеток, что подтверждается появлением крупных гепатоцитов с гипертрофией ядер и двуядерных печеночных клеток. При исследовании микрососудистого русла печени крыс леченых кетансерином, резерпином, VEGF и HGF имеет место увеличение количества синусоидных капилляров в печени, при этом значение данного показателя превосходит таковой у животных, изолировано получавших только кетансерин (табл. 1).

Массивное разрушение гепатоцитов под действием алкоголя и ТХУ приводит к достоверному повышению уровней щелочной фосфатазы (ЩФ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), биллирубина и холестерина в плазме крови крыс (табл. 2).

В условиях моделирования цирроза печени блокада С2 серотониновых рецепторов кетансерином неоднозначно влияет на биохимические показатели сыворотки крови. Так, монотерапия достоверно увеличивает уровень АсАТ, АлАТ, общего и прямого билирубина у крыс с циррозом печени, при этом кетансерин достоверно уменьшает концентрацию холестерина (табл. 2).

Результатом политерапии выступает значительное снижение уровней сывороточных ЩФ, АсАТ и АлАТ (табл. 2).

Моделирование цирроза приводит к достоверному увеличению площади соединительной ткани в печени (табл. 3). При введении кетансерина наблюдается снижение площади соединительной ткани в печени животных с циррозом. Политерапия приводит к значительному снижению площади соединительной ткани в печени (табл. 3).

Таким образом, на модели токсического цирроза печени показано, что введение кетансерина, резерпина, фактора роста эндотелия сосудов и фактора роста гепатоцитов оказывает более выраженное противовоспалительное, антифибротическое действие, чем в случае применения кетансерина изолированно, кроме того наблюдается стимуляция ангиогенеза в печени и неогенеза гепатоцитов, происходит восстановление функции печени.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания

1. Asrani S.K., Devarbhavi Н., Eaton J., Kamath P.S. Burden of liver diseases in the world // Journal of hepatology. -2019. - Vol. 70, №. 1. - P. 151-171.

2. Цуканов B.B., Васютин A.B., Тонких Ю.Л. Бремя цирроза печени в современном мире // Доктор.Ру. - 2021. - Том 20, № 4. - С. 21-25.

3. Nishikawa K, Osawa Y, Kimura К. Wnt/p-Catenin Signaling as a Potential Target for the Treatment of Liver Cirrhosis Using Antifibrotic Drugs // Int J Mol Sci. - 2018. - Vol. 19(10). - P. 3103.

4. Bataller R., Gao B. Liver fibrosis in alcoholic liver disease // Semin. Liver Dis. - 2015. Vol. 35, № 2. - P. 146-156.

5. Tsochatzis EA, Bosch J, Burroughs AK. Liver cirrhosis. Lancet. - 2014. - Vol.383(9930). - P. 1749-61.

6. Vorobioff J, Garcia - Tsao G, Gamen M, Picabea E. Long-term hemodynamic effects of ketanserin, a 5-hydrotrjptamine blocker, in portahypertenzie patients // Hepatology. - 1989. - Vol. 9, №1. - P. 88-91.

7. Fabre, A. Modulation of bleomycin-induced lung fibrosis by serotonin receptor antagonists in mice / A. Fabre, J. Marchal-Somme, S. Marchand-Adam, et al. // Eur Respir J. - 2008. - Vol. 32. - P. 426-436.

8. Машковский M. Д. Лекарственные средства.- 16-е изд., перераб., испр. и доп, - М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2020,- 1216 с.

9. Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Крупин В.А. Фиброз легких и стволовые клетки: новые подходы лечения. Москва: РАН, 2018. - 200 с.

10. Мяделец О.Д., Лебедева Е.И. Дегенеративные и регенераторные процессы в печени белых крыс при моделировании токсического цирроза. Изменения овальных клеток // Журнал ГрГМУ. - 2017. - № 3. - С. 294-300.

11. Евсеенко Д.А., Дундаров 3.А. Экспериментальное формирование цирроза печени животных в лабораторных условиях [Электронный ресурс] // Гепатол и Гастроэнтерол. - 2018. - Т. 2, № 2. - С. 122-128.

12. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - СПб: Медицина, 1969. - С. 14, 36-38, 58, 98-100, 163, 170.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и гепатологии, и может быть использовано для лечения цирроза печени у крыс. Способ включает введение кетансерина, резерпина, фактора роста эндотелия сосудов и фактора роста гепатоцитов. Препараты вводят в следующие сроки и в следующей последовательности: кетансерин вводят с 85-х по 95-е сутки в дозе 0,2 мг/кг от первого введения тетрахлоруглерода, резерпин вводят на 96-е сутки и на 100-е сутки в дозе 1 мг/кг, фактор роста эндотелия сосудов вводят на 96-102-е сутки в дозе 200 нг/животное, фактор роста гепатоцитов вводят на 100-е сутки в дозе 300 нг/животное. Использование изобретения позволяет осуществить лечение цирроза печени за счет последовательной коррекции типовых патологических процессов: воспаления, фиброза, а также стимуляции ангиогенеза и ускорение неогенеза гепатоцитов. 2 ил., 3 табл., 1 пр.

Способ лечения цирроза печени у крыс путем введения кетансерина, отличающийся тем, что дополнительно вводят резерпин, фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов, при этом препараты вводят в следующие сроки и в следующей последовательности: кетансерин вводят с 85-х по 95-е сутки в дозе 0,2 мг/кг от первого введения тетрахлоруглерода, резерпин вводят на 96-е сутки и на 100-е сутки в дозе 1 мг/кг, фактор роста эндотелия сосудов вводят на 96-102-е сутки в дозе 200 нг/животное, фактор роста гепатоцитов вводят на 100-е сутки в дозе 300 нг/животное.