Способ увеличения частоты оплодотворения при использовании сперматозоидов, полученных при биопсии яичка, с помощью внеклеточных везикул семенной плазмы Российский патент 2025 года по МПК G01N33/50 A61B17/435 

Семенная плазма представляет собой сложную биологическую жидкость, которая необходима для выполнения различных функций мужских половых клеток в процессе оплодотворения: от поддержания подвижности сперматозоидов до изменения иммунного ответа женского репродуктивного тракта во время оплодотворения. Семенная плазма очень богата внеклеточными везикулами (ВВ), вырабатываемыми железами внутренней секреции мужского полового тракта (простата, эпидидимис, семенные пузырьки и бульбоуретральных желез) (Roca et al., 2022; Neyroud et al., 2021). Подобно ВВ, циркулирующим в других жидкостях организма, ВВ в семенной плазме относятся к гетерогенной популяции, демонстрирующей заметные различия в размере, форме, электрической плотности и составе. ВВ из семенной плазмы связываются и обмениваются активными молекулами со зрелыми сперматозоидами и эпителиальными клетками эндометрия, то есть участвуют во множестве репродуктивных событий (Roca et al., 2022). Соответственно, ВВ будут вовлечены в регуляцию подвижности сперматозоидов, капацитации и акросомной реакции - всех функциональных свойств мужских половых клеток, необходимых для оплодотворения. Более того, состав ВВ различается при нормозооспермии и при патологии сперматогенеза у мужчин (Chang et al., 2024). ВВ семенной плазмы также способствуют безопасному прохождению сперматозоидов по женским половым путям, регулируя иммунный ответ матки. В совокупности эти результаты указывают на то, что ВВ вовлечены в фертильность человека.

Сперматозоиды, выделенные из ткани яичек, при азооспермии считаются некомпетентными для оплодотворения независимо от их полностью развитого морфологического вида на заключительном этапе сперматогенеза (Chang et al., 2024). Завершение последующих последовательных и скоординированных событий, таких как взаимодействие сперматозоидов с эпителием половых путей, модификации поверхности мембраны сперматозоидов компонентами репродуктивных путей и взаимодействие сперматозоидов с кумулюсными клетками обеспечивает успешное слияние гамет и развитие эмбриона. После того, как сперматозоиды покинули семенные канальцы именно потеря цитоплазматической капли, активация и инактивация каскадов сигналов, связанных с подвижностью и липидным профилем плазматической мембраны клетки, вносят вклад в функциональную компетентность сперматозоида для оплодотворения. Мужская половая клетка - генетически и трансформационно инертна, поскольку проактивная трансляция белка и рециркуляция мембраны посредством внутриклеточного транспорта везикул прекратились. Единственным механизмом регуляции деятельности гаметы является взаимодействие посредством внеклеточных везикул жидкостей репродуктивных органов и тканей, что крайне важно для успешного оплодотворения.

Посттестикулярные модификации поверхности мембраны сперматозоидов начинаются, когда сперматозоиды достигают различных сегментов придатка яичка. Эти изменения в составе мембраны включают добавление/удаление белков, липидов и даже мРНК на поверхности сперматозоидов. Известно, что этот обмен является результатом либо прямого взаимодействия сперматозоидов с эпителием придатка яичка (Chen et al. 2021), либо прикрепления секреторных пузырьков эпителия, известных как эпидидимосомы (Barrachina et al. 2022). После того, как сперматозоиды покидают придаток яичка, они смешиваются с семенной жидкостью при эякуляции. Известно, что семенная плазма поддерживает необходимый рН, осмолярность и обеспечивает сперматозоиды достаточным количеством питательных веществ для нормальной подвижности и выживания.

При оперативном получении сперматозоидов в программах лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий мужские гаметы обладают меньшим потенциалом к оплодотворению, поскольку не происходит соприкосновения семенной плазмы с гаметами, то есть отсутствует постэякуляторная трансформация сперматозоидов, необходимая для их дозревания. Именно поэтому в программах ВРТ при использовании таких сперматозоидов наблюдают крайне низкую частоту оплодотворения и формирования зигот (Klami et al., 2024).

Логичным этапом увеличения частоты оплодотворения может быть использование всей семенной плазмы мужчины, однако данный метод показан свою непригодность в силу большого числа микроорганизмов, содержащихся в семенной плазме (Saldarriaga et al., 2024). При использовании всей семенной плазмы резко возрастает риск загрязнения культуральной среды на эмбриологическом этапе программ ВРТ. Одним из путей повышения эффективности ВРТ является использование выделенных ВВ семенной плазмы и повышение с их помощью фертильных свойств сперматозоидов.

Целью настоящего изобретения является разработка метода использования внеклеточных везикул семенной плазмы для повышения частоты оплодотворения в программах ВРТ.

Эта задача решается с помощью выделения ВВ семенной плазмы методом глубинной фильтрации и сокультивирования ВВ со сперматозоидами, выделенными из ткани яичка, с последующим оплодотворением в программах ВРТ.

Технология глубинной фильтрации через полупроницаемую мембрану является относительно новым, но при этом простым (не требующим дорогостоящего оборудования) методом. Ранее было показано, что данный метод выделения ВВ может быть использован для других биологических жидкостей (Chernyshev et al., 2022). По сравнению с классическим ультрацентрифугированием, используются промышленно изготовленные пробирки («Простагност», Москва, Сколково, Россия) и любая лабораторная центрифуга, присутствующая в лаборатории эмбриологии.

Протокол выделения ВВ семенной плазмы и их инкубация со сперматозоидами, выделенными из ткани яичка, включает следующие этапы.

1. Сбор эякулята мужчины в день хирургического выделения сперматозоидов из ткани яичка. Сбор осуществляется путем мастурбации в стерильный пластиковый нетоксичный контейнер после 3-5 дней полового воздержания.

2. Выделение внеклеточных везикул осуществляют при помощи дифференциального центрифугирования, включающих стадию отмывки от крупной фракции (30 минут при 15 000g) и последующее пропускание через полупроницаемую мембрану с центрифугированием в течение 30 минут при 400 g согласно инструкции производителя («Простагност», Москва, Сколково, Россия). Выделение ВВ семенной плазмы осуществляют на традиционных культуральных HEPES-средах, используемых в ВРТ. Выделенные ВВ семенной плазмы в объеме 400 мкл используют на этапе оплодотворения.

3. Подготовка чашки Петри для оплодотворения. Разлить чашку Петри для ИКСИ согласно рисунку 1, создав каплю с внеклеточными везикулами семенной плазмы. В 20 мкл культуральной среды, содержащей HEPES, добавить 20 мкл выделенных внеклеточных везикул семенной плазмы (40 мкл, капля 2). Покрыть чашку культуральным маслом.

4. Добавление сперматозоидов. Добавить в каплю со средой (капля 2), содержащей HEPES, сперматозоиды, полученные хирургическим путем. Выдержать в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин. Далее выполнять ИКСИ традиционно, согласно утвержденным стандартным операционным процедурам лаборатории.

Разработанный метод позволяет подготовить сперматозоиды к оплодотворению за счет имитации естественного пребывания мужских половых клеток в семенной плазме после эякуляции.

Клинические примеры

1. Супружеская пара В., женщина 30 лет, мужчина 39 лет. В анамнезе 3 года отсутствия беременности при регулярной половой жизни. По результатам полного клинико-лабораторного анализа выявлена причина бесплодия - обструктивная азооспермия, требующая получения сперматозоидов хирургическим путем. Супружеской паре предложен метод повышения частоты оплодотворения сперматозоидами, выделенными из ткани яичка, с помощью внеклеточных везикул семенной плазмы. Пара подписала информированное добровольное согласие. Начата стимуляция функции яичников для программы экстракорпорального оплодотворения. В день трансвагинальной пункции фолликулов получено 10 ооцит-кумулюсных комплексов, 9 ооцитов зрелых на стадии МII. Также в день оперативного вмешательства у супруга получен эякулят. По результатам спермограммы - половые клетки отсутствуют. Проведена операция microTESA. Также выполнено выделение внеклеточных везикул семенной плазмы путем глубинной фильтрации на полупроницаемой мембране. Все зрелые ооциты были поделены на две когорты: 5 ооцитов оплодотворяли сперматозоидами, предварительно проинкубированными с ВВ семенной плазмы, 4 - традиционным способом. Частота оплодотворения при инкубации с ВВ семенной плазмы 4 из 5 ооцитов (80%), при традиционном ИКСИ- 2/4 (50%).

2. Супружеская пара Г., женщина 40 лет, мужчина 48 лет, обратилась по поводу лечения бесплодия (3 года половой жизни без предохранения, повторный брак) методами ВРТ и переноса эмбрионов. Проведено полное клиническое обследование супругов. Из анамнеза женщины - наружный генитальный эндометриоз II стадии распространения, беременностей 0.

У мужчины в предыдущем браке 2 детей, вазектомия. По результатам спермограммы - азооспермия. В анамнезе 1 неудачная попытка с полным отсутствием оплодотворения криоконсервированными сперматозоидами, выделенными из ткани яичек. Супружеской паре предложено сокультивирование сперматозоидов с внеклеточными везикулами семенной плазмы, на которую они согласились, подписав добровольное информированное согласие. Супруге была проведена стимуляция овуляции по модифицированному короткому протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормонами, выполнена трансвагинальная пункция фолликулов, получено 4 зрелых ооцита. В день трансвагинальной пункции жены были разморожены сперматозоиды, хранящиеся в условиях жидкого азота, и сокультивированы с внеклеточными везикулами семенной плазмы, которые предварительно (за 2 часа) выделили из эякулята мужчины. Из 4 ооцитов оплодотворение наступило в 3 (1 ооцит не оплодотворился). Частота оплодотворения составила 75%.

Таким образом, разработанная техника использования внеклеточных везикул семенной плазмы мужчины для повышения частоты оплодотворения на эмбриологическом этапе программ лечения бесплодия методами ВРТ не увеличивает трудозатраты и финансовую составляющую цикла экстракорпорального оплодотворения, при этом дает надежду на оплодотворение большего числа женских половых клеток, что в конечном итоге увеличивает число эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки и/или криоконсервации.

ФИГ. 1 - Дизайн чашки для оплодотворения методом ИКСИ для сокультивирования сперматозоидов, выделенных из ткани яичка, с внеклеточными везикулами семенной плазмы пациента.

Список литературы

1. Roca, J. et al. Extracellular vesicles in seminal fluid and effects on male reproduction. An overview in farm animals and pets. Animal Reproduction Science, 2022. 246: p.106853.

2. Neyroud, A.S., Chiechio, R., Yefimova, M. et al. Extra-cellular vesicles of the male genital tract: new actors in male fertility? Basic Clin. Androl. 31, 25 (2021). https://doi.org/10.l186/sl2610-021-00141-9

3. Chang W.C., Li S.H., Tsai P.S. Seminal Vesicle-Derived Exosomes for the Regulation of Sperm Activity. Adv Anat Embryol Cell Biol. 2024 Sep 18. doi: 10.1007/102_2024_6. Epub ahead of print. PMID: 39287631.

4. Klami R., Tomás C., Mankonen H., Perheentupa A. ICSI outcome after microdissection testicular sperm extraction, testicular sperm aspiration and ejaculated sperm. Reprod Biol. 2024 Mar; 24 (1): 100825. doi: 10.1016/j.repbio.2023.100825. Epub 2023 Nov 24. PMID: 38000348.

5. Saldarriaga López Y.M., Santacruz Restrepo V., Cardona Maya W.D., Puerta Suárez J. The microbiota of sexual intercourse and its effect on prostatitis. Rev Int Androl. 2024 Mar; 22 (l): 38-43. doi: 10.22514/j.androl.2024.006. Epub 2024 Mar 30. PMID: 38735876.

6. Chen H., Murray E., Sinha A., Laumas A., Li J., Lesman D., Nie X., Hotaling J., Guo J., Cairns B.R., Macosko E.Z., Cheng C.Y., Chen F. Dissecting mammalian spermatogenesis using spatial transcriptomics. Cell Rep.2021 Nov 2; 37 (5): 109915. doi: 10.1016/j.celrep.2021.109915. PMID: 34731600; PMCID: PMC8606188.

7. Barrachina F., Battistone M.A., Castillo J., Mallofre C., Jodar M., Breton S., Oliva R. Sperm acquire epididymis-derived proteins through epididymosomes. Hum Reprod. 2022 Apr 1; 37 (4): 651-668. doi: 10.1093/humrep/deac015. PMID: 35137089; PMCID: PMC8971652.

8. Chernyshev V.S. et al. Asymmetric depth-filtration: A versatile and scalable method for high-yield isolation of extracellular vesicles with low contamination // Journal of Extracellular Vesicles. - 2022. - Т. 11. - №. 8. - C. el2256.

Изобретение относится к репродуктивной медицине и клинической эмбриологии и может быть использовано для повышения частоты оплодотворения ооцитов сперматозоидами. Для этого применяют внеклеточные везикулы семенной плазмы мужчины, выделенные из семенной плазмы. Затем их сокультивируют с тестикулярными сперматозоидами непосредственно до процедуры оплодотворения методом ИКСИ в модифицированной чашке Петри. Изобретение обеспечивает повышение частоты оплодотворения на эмбриологическом этапе программ лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий, оплодотворение большего числа женских половых клеток, что в конечном итоге увеличивает число эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки и/или криоконсервации. 1 ил., 2 пр.

Способ повышения частоты оплодотворения ооцитов сперматозоидами, выделенными из ткани яичка, с помощью внеклеточных везикул семенной жидкости, отличающийся тем, что применяют внеклеточные везикулы семенной плазмы мужчины, выделенные из семенной плазмы, и последующее их сокультивирование с тестикулярными сперматозоидами непосредственно до процедуры оплодотворения методом ИКСИ в модифицированной чашке Петри.