Способ неинвазивной диагностики эндометриоза по липидному профилю сухих капель менструальной крови Российский патент 2024 года по МПК G01N33/92 G01N30/72 G01N33/49 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии, к способам неинвазивной диагностики эндометриоза различной локализации с помощью анализа содержания липидов в сухих пятнах менструальной крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС). Метод может быть использован для неинвазивной диагностики эндометриоза как дополнение/замена к стандартным методам, таким как УЗИ органов малого таза и бимануальное влагалищное исследование.

Эндометриоз - хроническое воспалительное заболевание, поражающее 10% женщин репродуктивного возраста. Из-за прогрессирующего характера эндометриоза, ранняя диагностика является приоритетом исследований не только для оптимизации ресурсов здравоохранения, но и для обеспечения качества жизни пациенток, применяя индивидуальный подход к каждой женщине с эндометриозом [1, 2]. Идеальная диагностика должна основываться на жалобах пациентки и данных УЗИ органов малого таза, как наиболее доступного из существующих методов. Гетерогенность клинических проявлений усложняют эту задачу, помимо всего не всегда есть корреляция между степенью выраженности эндометриоза, локализацией и жалобами пациенток [1, 3]. Эндометриоз значимо влияет на качество жизни женщины [4]. Проблема своевременной диагностики эндометриоза является одной из самых острых, так как клинические проявления неспецифичны и совпадают с другими гинекологическими заболеваниями [5]. Основные симптомы эндометриоза это боль и бесплодие, но эндометриоз также поражает кишечник, мочевой пузырь и другие органы, вызывая соответственные клинические проявления. В ряде случаев эндометриоз может протекать бессимптомно, что приводит к значимой задержке в постановке диагноза, которая по разным данным составляет до 10 лет [6]. Отсутствие своевременно поставленного верного диагноза приводит к развитию центральной сенситизации и хронической тазовой боли, а также к прогрессированию заболевания до стадии, когда уже необходимо оперативное лечение. Операция помимо экономической нагрузки на систему здравоохранения, ведет к рискам во время операции и ятрогенной преждевременной недостаточности яичников. Все вышеперечисленное не способствует улучшению демографической ситуации, которая, как известно, в настоящее время находится в рецессии [6, 7].

Все доступные в настоящее время маркеры для неинвазивной или малоинвазивной оценки наличия эндометриоза обладают низкой чувствительностью и специфичностью. Лапароскопия с последующим гистологическим подтверждением является золотым стандартом диагностики эндометриоза [8]. УЗИ органов малого таза является оператор-зависимым методом, МРТ органов малого таза - дорогостоящим. Рутинный гинекологический осмотр имеет низкую прогностическую ценность, а технологии визуализации недостаточны для обнаружения спаек таза или поверхностных перитонеальных имплантатов [4, 8]. Этот факт приводит к тому, что средний латентный период от появления симптомов до постановки окончательного диагноза составляет 7-11 лет [9]. Всемирное общество по эндометриозу подтвердило, что разработка надежного неинвазивного диагностического инструмента эндометриоза является одним из главных приоритетов научных исследований в гинекологии [10].

Поэтому изменение липидного профиля сухих капель менструальной крови при патологии может служить основой для новых, высокоточных и специфичных методов дифференциальной диагностики. Определение молекулярного состава биологических объектов является одной из функций масс-спектрометрии (МС) [2]. Данный метод имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными диагностическими инструментами. Вследствие недостаточной информативности какого-либо одного биомаркера, необходимо рассматривать возможность выявления набора веществ, отличающих одно состояние пациента от другого. Масс-спектрометрические подходы для определения изменений липидома крови характеризуются малыми временами и относительной простотой приготовления образцов, а также высокой информативностью получаемых результатов. Регистрируемые в процессе эксперимента характеристические масс-спектры, называемые также "отпечатки пальцев", позволяют создать классификационную модель для отнесения данного образца к группе нормы или патологии. Внедрение предлагаемого метода в практическое здравоохранение позволит создать персонифицированные алгоритмы обследования и ведения пациенток с эндометриозом.

Несмотря на то, что предложено более 100 потенциальных биомаркеров эндометриоза, ни один из них пока не показал высокой диагностической значимости и клинического применения [10, 11]. Показано, что в эктопическом и эутопическом эндометрии достоверно различается уровень пяти различных классов липидов: фосфатидилхолины (PC 32:1, PC O-36:3, PC 38:7, PC 38:6, PC 40:8, PC 40:7, PC 40:6, PC O-42:1), фосфоэтаноламин РЕ 0-20:0, сфингомиелин SM 34:1, диглицерид DG 44:9 и триглицериды (TG 41:2, TG 49:4, TG 52:3) [5, 12, 13]. Фосфатидилхолины и сфингомиелин могут быть потенциальными маркерами повреждения эндометрия, поскольку эти липиды связаны с подавлением апоптоза, окислительным стрессом и пролиферацией клеток [5]. Эти результаты были подтверждены данными Dutta et al. [13], которые также описали повышенную концентрацию фосфатидилхолинов в образцах сыворотки крови больных эндометриозом. Более того, участие сфинголипидов в патофизиологии эндометриоза было также постулировано Lee et al. [14], которые обнаружили изменения в метаболизме сфинголипидов в эктопическом эндометрии, сыворотке крови и перитонеальной жидкости у больных эндометриозом.

Менструальная кровь является неинвазивным источником стромы эндометрия, которую возможно проанализировать на наличие биомаркеров эндометриоза [15]. Обнаружено более 350 уникальных для менструальной крови белков по сравнению с циркулирующей кровью и вагинальной жидкостью [16]. В исследовании Ji S с коллегами в 2023 году показали повышение уровней белков CXCL5 и IL1RN в менструальной крови при эндометриозе [17]. Это подтверждает высокий потенциал молекулярного состава менструальной крови для неинвазивной диагностики эндометриоза.

В качестве прототипа предлагаемого метода взят способ, описанный в [18], согласно которому методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) с электроспрейной ионизацией (ЭСИ) липидных экстрактов плазмы крови и перитонеальной жидкости продемонстрирована возможность диагностики эндометриоза. Были идентифицированы некоторые характерные липиды как в плазме крови, так и в перитонеальной жидкости. Девять потенциальных биомаркеров эндометриоза (PC 16:0, РЕ O-20:0, РЕ О 34:1, PC 36:2, PC 36:4, PC 36:5, PC 38:4, PC 38:6 и SM 34:1) обнаруживаются как в плазме крови и перитонеальной жидкости, что подтверждает их связь с патологическим процессом. Чувствительность разработанного метода PLS-DA составила 93% при специфичности 95% для плазмы; 90% и 95% - для перитонеальной жидкости. Авторы делают вывод, что плазма крови является наиболее подходящей биологической жидкостью для клинической диагностики эндометриоза. Ограничением данного и других подобных исследований является использование инвазивных биологических образцов - крови и перитонеальной жидкости. Для создания неинвазивного скринингового диагностического инструмента для пациентов с подозрением на эндометриоз и снижения частоты диагностической лапароскопии сухие капли менструальной крови предпочтительнее. В данном случае возможен как самозабор образца, так и отправка его без особых условий хранения (в конверте) в головное медицинское учреждения, обладающее необходимым оборудованием.

Задачей, решаемой изобретением, является способ ранней неинвазивной диагностики эндометриоза различной степени тяжести по липидному профилю сухих капель менструальной крови посредством ВЭЖХ-МС в результате применения классифицирующей модели, построенной на основании метода логистической регрессии для вычисления переменной отклика (у'): с учетом уровней 2 липидов (РЕ Р-16:0/18:1, РЕ Р-18:0/20:4) сухих капель менструальной крови пациентов рассчитывается переменная отклика у' (при значении 0<у'<0.68 делают заключение о том, что пациент относится к группе контроля, при значении 0.68≤у'<1 диагностируется эндомериоз).

Поставленная задача решается предлагаемым способом, заключающимся в подготовке экстракта липидов образцов сухих капель менструальной крови пациентов с известным клиническим диагнозом модифицированным посредством метода Фолча; разделении полученных экстрактов с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии и получении масс-спектров высокого разрешения методом ионизации электрораспылением (ИЭР) в режиме положительных и отрицательных ионов на коммерческом масс-спектрометре с разрешением более 10000 и точностью определения массы не хуже, чем 5-10 ppm; идентификации липидов в соответствии с их точными массами и тандемными (МС/МС) спектрами; отборе статистически значимых липидов, дифференцирующих образцы наблюдаемых группы контроля и пациентов с эндометриозом с использованием непараметрического теста Манна-Уитни (при величине p-value <0,05 различие принимали за статистически значимое); в выборе липидов, играющих ключевую роль в различии профилей образцов пациентов с эндометриозом и контрольной группы; выборе липидов при помощи информационного критерия Акаике (ИКА) для построения классифицирующей модели, которая дифференцирует образцы сухих пятен менструальной крови наблюдаемых группы контроля и пациентов с эндометриозом; удалении переменных (липидов), не удовлетворяющих условию статистически значимого неравенства их коэффициентов нулю (граница значимости равенства нулю α=0,05); вычислении на основании ROC-анализа граничного значения переменной отклика (у'); вычислении значений переменных отклика для классификации новых образцов и отнесения образцов к группе контроля или эндометриоза.

Отбор статистически значимых липидов, дифференцирующих образцы сухих капель менструальной крови наблюдаемых группы контроля и пациентов с эндометриозом, проводили с использованием непараметрического теста Манна-Уитни. Вычисление вероятности равенства уровней липидов осуществлялось в следующей последовательности действий.

Для каждого липида вычисляют критерий Манна-Уитни по формуле:

где n₁ и n₂ - размеры выборок 1 и 2, i, j - порядковые номера образцов в выборках 1 и 2, - площади пиков из выборки 1 и 2. F - функция, возвращающая 1 в случае больше - в случае меньше - в случае равенства.

Вычисляют нормированный критерий Манна-Уитни:

Вычисляют вероятность равенства нулю:

где - распределение квадрата независимой стандартной нормальной случайной величины.

При оценке вероятности равенства нулю липид относят к статистически значимым (р<0,05).

Выбор липидов в финальные модели для разделения образцов группы контроля и группы с эндометриозом осуществлялся выбором по одному из соединений, имевших величину проекции переменной, вычисленной для дискриминантного анализа на скрытые структуры (шаг 1), с целью минимизации ИКА [19] на каждой итерации отбора переменных по алгоритму, содержащем в себе этапы расчета ИКА (шаг 1), выбора минимального ИКА (шаг 2) и сравнения старого и нового ИКА (шаг 3). Шаг 1. Выполняется создание набора соединений-потенциальных маркеров.

1) Информация об относительной интенсивности пиков в образцах представляется в виде матрицы независимых переменных n*mX, где n - число образцов, m - число соединений. Информация о клиническом состоянии образца представляется в виде столбца переменных отклика у высотой р, где 0 обозначается состояние «контроль», 1 - состояние «эндометриоз»;

2) Выполняется парето-масштабирование матрицы независимых переменных

где X_i - i-ый столбец матрицы X, 〈X_i〉 - среднее значение i-того столбца и sd(X_i) - стандартное отклонение переменных в i-ом столбце;

3) Выполняется парето-масштабирование столбца зависимых переменных

где 〈у〉 - среднее значение переменных отклика, sd(y) - стандартное отклонение переменных отклика;

4) Рассчитываются веса для независимых переменных

5) Выполняется нормализация рассчитанного вектора

6) Рассчитываются предсказательные счета

t=Xw;

7) Рассчитывается предсказательная нагрузка независимых переменных

8) Вычисляется вектор ортогональных нагрузок

w_o=р-w^Tpw;

9) Выполняется нормализация рассчитанного вектора ортогональных нагрузок

10) Рассчитываются ортогональные счета

t_o=Xw_o;

11) Рассчитывается ортогональная нагрузка независимых переменных

12) Вычисляются данные, не содержащие ортогональной составляющей

Х_р=X-t_o^Tp_o',

13) Вычисляются предсказательные счета от независимых переменных, не содержащих ортогональной составляющей

t_p=X_pw;

14) Вычисляется предсказательная нагрузка от независимых переменных, не содержащих ортогональной составляющей

15) Вектор, содержащий предсказательную нагрузку от независимых переменных без ортогональной составляющей, нормируется

16) Рассчитывается вектор, содержащий значения проекций переменной

17) Выбираются соединения, для которых VIP>1.

Шаг 2. Произвольно выбирают переменную из набора переменных, сформированного на шаге 1. Далее следует этап расчета ИКА.

1) Строят лог-функция правдоподобия:

где y_i - переменная отклика, принимающая значения 0 или 1, x_i - объединенный вектор единицы и независимых переменных, β - объединенный вектор свободного члена и коэффициентов при переменных.

2) Выполняют дифференцирование функции по β, получают уравнение:

3) Рассчитывают вторую производную:

4) На основе метода Ньютона-Рафсона рассчитывают вектор β:

β^k+1=(X^TWX)^-1X^T(y-р),

где k - номер итерации, X - матрица единичного вектора и независимых переменных, W - диагональная матрица с элементами у - вектор переменной отклика и р - вектор вероятности Вычисление β^k происходит, пока Относительная разница модулей векторов между итерациями от нуля δ=0,01.

5) Подставляют вычисленные значения в лог-функцию правдоподобия из п. 1).

6) Рассчитывают информационный критерий по формуле:

где AIC - информационный критерий Акаике, N - число независимых переменных, задействованных в регрессиях.

Шаг 3. Повторяют шаг 2 для всех m переменных.

Шаг 4. Выбирают переменную, для которой рассчитанное значение AIC будет минимальным (шаг 3). Обозначим это значение как AIC'.

Шаг 5. Выполняют 2 и 3 шаги для комбинации «выбранная ранее переменная + каждая из оставшихся переменных».

Шаг 6. Сравнивают AIC со значением AIC' (шаг 3).

Шаг 7. Если AIC из п. 6 больше AIC', повторяют шаги 2-4, имея в качестве постоянных переменных переменные, отобранные ранее, и обозначив как AIC' значение из п. 6., если AIC из п. 6 больше AIC', п. 8.

Шаг 8. Переменные, при которых было получено AIC' и рассчитанные для них коэффициенты, используют дальше.

Проверку переменных с удалением не удовлетворяющих условию статистически значимого неравенства их коэффициентов нулю выполняют следующим образом:

1. С использованием выбранных ранее переменных строится лог-функция правдоподобия:

где y_i - переменная отклика, принимающая значения 0 или 1, x_i - объединенный вектор единицы и независимых переменных, β - объединенный вектор свободного члена и коэффициентов при переменных;

2. Выполняют дифференцирование функции по β, получая уравнения:

3. Рассчитывают вторую производную:

4. Рассчитывают вектор β на основе метода Ньютона-Рафсона:

β^k+1=β^k-(X^TWX)^-1X^T(y-р);

где k - номер итерации, X - матрица единичного вектора и независимых переменных, W - диагональная матрица с элементами у - вектор переменной отклика и р - вектор вероятности Вычисление β^k происходит, пока

Относительная разница модулей векторов между итерациями от нуля δ=0,01.

5. Подставляют вычисленные значения β в матрицу и вычисляют значения стандартной ошибки для коэффициента где j - порядковый номер коэффициента в векторе β;

6. Вычисляют вероятность равенства нулю коэффициента где - распределение квадрата независимой стандартной нормальной случайной величины: если существует p_i>α, где α - некая критическая величина и i>0, то переменная, соответствующая p_i, исключается из задействованного набора переменных и действия 1-6 повторяются (граница значимости равенства нулю α=0,05).

Граничные значения переменной отклика вычисляют на основании ROC-анализа результатов перекрестного контроля, выполненного с использованием разбиения данных «тренировка»/«тест» 70/30 с 100-кратным повтором. В качестве граничного значения переменной отклика у' используется значение, при котором максимизируется сумма значений чувствительности и специфичности.

Для классификации образцов вычисляют значение у' с использованием формулы:

где у' - переменная отклика, β - вектор коэффициентов, вычисленный ранее, х - вектор формата (интенсивность липидов-маркеров).

Итоговую классификацию выполняют по результатам сравнения у' с граничным значением у' для данной модели.

Способ был реализован на масс-спектрометре Maxis Impact qTOF (BrukerDaltonics, Bremen, Germany), с предварительным хроматографическим разделением и ионизацией электроспреем в положительной и отрицательной модах. Экстракты липидов получали в соответствии с модифицированным методом Фолча. Для этого выбивается пятно в микропробирку вместимостью 2 мл, добавляется 480 μL CHCl3/МеОН (2:1, об.:об.) с последующим действием ультразвука в течение 15 минут, добавляется 150 μL воды HPLC-grade и снова действие ультразвука в течение 15 минут, центрифугирование 10 минут на 15000 оборотах в минут при комнатной температуре, отбор органического слоя 150 μL в эппендорф вместимостью 1,5/2 мл, повторное добавление 250 μL CHCl3/МеОН в исходный образец и перемешивание 5 минут, центрифугирование 10 минут на 15000 оборотах в минуту при комнатной температуре, отбор органического слоя 250 μL и добавление в эппендорф с предыдущими 150 μL, высушивание в токе азота 30 минут при 40°С, перерастворение в 150 μL изопропанол/ацетонитрил (1/1) и перемешивание 5 минут, центрифугирование 5 минут на 15000 оборотах в минуту при комнатной темпертуре, перенос 100 μL полученного образца в виалу со вставкой для дальнейшего хромато-масс-спеткрометрического анализа.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) проводили с использованием колонки Agilent Zorbax XDB-C18 (3,5 мкм, длина 150 мм, внутренний диаметр 0,5 мм, Agilent, USA) и хроматографической системой 3000 Ultimate Nano LC (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Соединения в образце элюировали с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Подвижная фаза «А» состояла из смеси ацетонитрил:вода (60:40), а подвижная фаза «Б» - из смеси изопропанол:ацетонитрил:вода (90:8:2). Обе фазы содержали модификаторы (0,1% муравьиной кислоты и 10 мМ формиата аммония). Элюцию проводили градиентом подвижной фазы «Б» со скоростью потока 35 μL/мин: 0-0,5 мин при 15%, с последующим 15-минутным градиентом от 10% до 99%. Далее проводили 4-минутную промывку 99% фазы «Б», после чего фаза восстанавливалась до исходной концентрации (15% фазы «Б») в течение 0,5 мин и колонка балансировалась в течение 2 мин. Общее время хроматографии для каждого образца составило 22 мин.

Детекция метаболитов проводилась с помощью гибридного квадрупольного времяпролетного масс-спектрометра Bruker MaXis Impact (Bruker Daltoniks, Бремен, Германия) в двух повторностях на образец. Для стабильного электрораспыления липидного экстракта образца устанавливали оптимальные параметры, которые зависят от модели прибора. В случае масс-спектрометра Maxis Impact использовались следующие параметры: напряжение на капилляре 4.1 кВ, давление распыляющего газа 0.7 бар, скорость потока осушающего газа 6 л/мин, температура осушающего газа 200°С; на высокоэффективном жидкостном хроматографе Dionex UltiMate 3000 (Thermo Scientific, Гермеринг, Германия, колонка Zorbax XDB-C18 (250×0.5 мм, 5 мкм; Agilent, США) поддерживалась температура 50°С, скорость потока 35 мкл/мин. Масс-спектры снимали с разрешением 50000 в диапазоне 100-1700 m/z в обеих полярностях. Тандемная МС проводится методом результат-зависимого анализа - DDA - со следующими параметрами: три наиболее интенсивных пика выбираются после полного сканирования всего диапазона масс и подвергаются фрагментации посредством столкновительной диссоциации с энергией 35 эВ, время исключения иона из анализа составило 1 минуту. Полученные масс-спектрометрические данные подверглись предобработке и последующей статистической обработке согласно последовательности действий вышеописанного способа. Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью скриптов, написанных на языке R в RStudio [20, 21]. В результате для отнесения пациентов к группе контроля или к группе эндометриоза была разработана формула расчета переменной отклика на основании отобранных липидов РЕ Р-16:0/18:1 и РЕ Р-18:0/20:4, идентифицированных в режиме отрицательных ионов (номенклатура липидов соответствует LipidMaps [22]):

с граничным значением переменной отклика равным 0.68. При у'<0.68 пациент относится к здоровым, а при у'>=0.68 - к пациентам с эндометриозом.

На Фиг. 1а приведены примеры хроматограмм ионного тока по базовому пику положительных ионов липидов и на фиг. 1б приведен пример хроматограмм ионного тока по базовому пику отрицательных ионов липидов, полученной при ВЭЖХ-МС анализе липидных экстрактов сухих пятен менструальной крови от четырех пациенток с гистологически верифицированным эндометриозом. На хроматограммах выделены области, соответствующие 5 классам липидов, идентифицированных в сухих пятнах менструальной крови: (лизо)фосфатидилхолинам, (лизо)фосфатидилэтаноламинам, церамидам, сфингомиелинам, триглицеридам, окисленным липидам, и плазменил- и плазманил- липидам. Всего было идентифицировано 98 липидов в режиме положительных ионов и 107 липидов в режиме отрицательных ионов. Статистически значимо различались уровни 40 липидов, относящихся к церамидам, кардиолипинам, (окисленным) фосфатидилхолинам, фосфатидилэтаноламинам, в том числе плазманил-и плазменил-, сфингомиелины и триглицеролы.

На Фиг. 2 приведена диаграмма рассеяния образцов в пространстве главных компонент (1я и 2я главные компоненты) при анализе главных компонент (PCA, без обучения) для группы контроля (зеленые точки) и группы «эндометриоза» (красные точки) (Фиг. 2). В данное обсервационное исследование по типу «случай-контроль», проведенного на базе ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России, были включены 24 пациента 1 группы (основная) с гистологически верифицированным эндометриозом I-IV стадий по rAFS и 16 образцов группы контроля. Забор менструальной крови у пациентов 1 группы проведен до оперативного вмешательства. Критериями включения для 1 группы были гистологически верифицированный эндометриоз I-IV стадий по rAFS, возраст пациентов от 18 до 45 лет, информированное согласие на участие в исследовании. Группу контроля составили условно здоровых женщин с реализованной репродуктивной функцией, наличие патологии у которых было исключено при ультразвуковом исследовании органов малого таза. Критериями невключения являлись беременность, онкологические заболевания, прием гормональной терапии за 3 месяца до включения в исследование.

На Фиг. 3 приведен график распределения образцов контрольной группы (зеленый) и эндометриоза (красный) по предсказательной и ортогональной компоненте, полученных при OPLS-DA анализе (с обучением). В данный анализ были включены образцы 1 (основной) группы (n=24) и группы контроля (n=16). Разделение образцов на два кластера, соответствующих клиническим диагнозам подтверждает высокий потенциал липидома менструальной крови для определения эндометриоидного поражения.

На Фиг. 4 приведены примеры хроматограмм по выбранному иону липидов-маркеров, плазменил-фосфатилэтаноламинов РЕ Р-16:0/18:1 и РЕ Р-18:0/20:4, для экстракта липидов сухих пятен менструальной крови в режиме положительных ионов (а) и отрицательных ионов (б). Красная кривая на Фиг. 1а соответствует образцу от пациента с подтвержденным РЯ, зеленая - образцу группы контроля. Красная кривая на Фиг. 1б соответствует образцу от пациента с РЯ III-IV стадии, черная - образцу от пациента с РЯ I-II.

На Фиг. 5а приведена диаграмма рассеяния образцов в пространстве, определенных значениями соединений-маркеров - плазменил-фосфатилэтаноламинов РЕ Р-16:0/18:1 и РЕ Р-18:0/20:4, использованных для дифференциации образцов сухих пятен менструальной крови наблюдаемых группы контроля (зеленые точки, n=16) и пациентов с эндометриозом I-IV стадии (красные точки, n=24) посредством логистической регрессии. Созданная статистическая модель на основе логистической регрессии для дифференциальной диагностики образцов сухих капель менструальной крови пациентов группы контроля от пациентов с эндометриозом характеризуется точностью (Фиг. 6), определенной с использованием перекрестного контроля с разбитием данных в отношении тренировочные/тестовые данные 70/30 и 100 повторениями, и равной 86%. Это свидетельствует о хорошей прогнозирующей способности метода и позволяет предложить предлагаемую модель для отнесения анализируемых образцов к той или иной клинической подгруппе. Чувствительность и специфичность данной модели на основе логистической регрессии, достигают 87% и 88%, соответственно. Площадь под ROC-кривой равна 0.90.

Как продемонстрировано на диаграмме размаха уровней соединений-маркеров в исследуемых образцах (Фиг. 5,), уровень плазменил-фосфатилэтаноламина РЕ Р-16:0/18:1 статистически значимо снижен при эндометриозе по сравнению с группой контроля, а уровень плазменил-фосфатилэтаноламина РЕ Р-18:0/20:4 - статистически значимо повышен при эндометриозе. На Фиг. 5в представлены примеры хроматограмм по выделенному ионному току двух липидов-маркеров для образца пациента контрольной группы (зеленый цвет) и пациента с эндометриозом (красный цвет).

В качестве иллюстрации применения метода приведен расчет переменной отклика, у', (Фиг. 6) на основании уровней липидов РЕ Р-16:0/18:1 и РЕ Р-18:0/20:4 в образцах сухих пятен менструальной крови новых четырех пациентов (2 пациента - контроля, и 2 пациента - наличие эндометриоза), клиническое описание которых приведено ниже. Для всех пациентов был поставлен корректный диагноз на основании значения переменной отклика: 0<у'<0.68 - контроль и 0.68≤у'<1 - эндометриоз.

Пациентка С., 29 лет, обратилась на консультацию к врачу-акушеру-гинекологу в отделение гинекологической эндокринологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России с жалобами на постоянные боли внизу живота различной интенсивности, усиливающиеся в дни менструации и боли при половом контакте. По результатам ультразвукового исследования органов малого таза, выполненного по месту жительства, определяется объемное образование правого яичника - эндометриома размерами 5.0×6.4×2.8 см ORADS 2. При бимануальном исследовании обращает на себя внимание резкая болезненность при тракции за шейку матки. Учитывая жалобы пациентки, результаты физикального обследования, принимая во внимание данные литературы о возможном сопутствующем глубоком инфильтративном эндометриозе (около 50%) при наличии эндометриомы яичников, было решено произвести магнитно-резонансную томографию органов малого таза. Помимо подтверждения эндометриоидной кисты правого яичника, выявлен очаг ретроцервикального эндометриоза 2.3×2.1×2.8 см без убедительных признаков инвазии в прилежащие органы. По данным лабораторных обследований отмечается повышение онкомаркера СА125 до 67 (норма - до 35) Ед/мл, НЕ4 - 34 (норма - до 70) пмоль/л - в пределах референса; расчетный индекс ROMA1 - 3,4%; АМГ - 4,7 нг/мл. Выполнено оперативное лечение в объеме: лапароскопия, адгезиолизис, резекция правого яичника, иссечение ретроцервикального эндометриоза и очагов наружного генитального эндометриоза. Поставлена стадия 4 по классификации rAFS. По данным гистологического заключения эндометриоз был подтвержден. Учитывая отсутствие заинтересованности пациентки в реализации репродуктивной функции, женщине рекомендовано проведение длительной противорецедивной терапии Диеногестом 2 мг.

Пациентка Ш., 26 лет, обратилась в НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова с целью обследования в связи с планированием беременности. Жалоб не предъявляет. Проведен осмотр в зеркалах - видимой патологии не выявлено, при бимануальном обследовании - объемные образования в малом тазу не пальпируются. По результатам лабораторного обследования выявлен латентный дефицит железа и недостаточность витамина Д. На этапе предгравидарной подготовки назначена фолиевая кислота, а для компенсации обнаруженных дефицитов назначены адекватные дозировки соответствующих препаратов. По данным ультразвукового исследования органов малого таза выявлена эндометриоидная киста левого яичника малых размеров 1.8×1.3×1.5 см. Онкомаркеры СА125, НЕ4, расчетный индекс ROMA1 - в пределах референсных значений. Пациентка обратилась на внеплановый прием с жалобой на задержку менструации. Сдана кровь на В-ХГ, уровень соответствует 6 неделям беременности. Данные ультразвукового исследования органов малого таза подтвердили маточную беременность. Беременность протекала без осложнений, закончилась своевременными самопроизвольными родами. За период беременности эндометриодная киста левого яичника без динамики роста. Рекомендовано плановое обследование у гинеколога через 6 месяцев после родов.

Пациентки из группы контроля 33 и 37 лет обратились в Центр для планового осмотра с целью подбора гормональной контрацепции. Женщины с реализованной репродуктивной функцией, жалоб не предъявляют. Проведено полное клинико-лабораторно-инструментальное обследование. Противопоказаний для гормональной контрацепции не выявлено. Пациентке 33 лет рекомендован прием комбинированных оральных препаратов. Женщине 37 лет была введена внутриматочная система с левоноргестрелом. Даны рекомендации о необходимости ежегодного обследования гинекологом.

Возможность реализации заявляемого метода с получением заявленного технического результата иллюстрируют нижеследующие примеры анализа образцов сухих пятен менструальной крови пациенток для демонстрации воспроизводимости метода, возможности дифференциации пациенток группы контроля и группы с эндометриозом, идентификация возможных маркерных веществ для диагностики эндометриоза, создание диагностической модели на основании логистической регрессии по уровню маркерных веществ (липидов) в сухом пятне менструальной крови пациенток.

В качестве ПРИМЕРА 1, демонстрирующего воспроизводимость метода получения масс-спектров образцов сухих пятен менструальной крови пациенток, на Фиг. 1а приведен пример хроматограмм ионного тока по базовому пику положительных ионов липидов и на фиг. 1б приведен пример хроматограмм ионного тока по базовому пику отрицательных ионов липидов, полученной при ВЭЖХ-МС анализе липидных экстрактов сухих пятен менструальной крови четырех пациенток с гистологически верифицированным эндометриозом. На хроматограмме наблюдаются группы пиков, соответствующие лизофосфолипидам (времена удерживания 3-6 минут); фосфолипидам (времена удерживания 10-15 минут); триглицеридам (времена удерживания более 15 минут). Для повышения воспроизводимости результатов перед расчетами величины значений площади пиков соединений были перенормированы на полный ионный ток. Относительное стандартное отклонение интенсивности пика составляет менее 5% для одного образца.

В качестве ПРИМЕРА 2, демонстрирующего возможности работы метода для неинвазивной диагностики пациенток с эндометриозом приведена диаграмма рассеяния для группы контроля (зеленые точки) и группы «эндометриоза» (красные точки) (Фиг. 2). Данные результаты получены в рамках обсервационного исследования «случай-контроль», проведенного на базе ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Объект исследования: группа 1 (основная) - 24 пациентов с гистологически верифицированным эндометриозом I-IV стадий по rAFS, у которых до оперативного вмешательства был выполнен забор менструальной крови, группа 2 (контроль) - 16 условно здоровых женщин с реализованной репродуктивной функцией, наличие патологии у которых было исключено при клиническом обследовании (ультразвуковое исследование органов малого таза). Группы были сопоставимы по возрасту и индексу массы тела. Диагноз эндометриоза был подтвержден гистологически во время проведения лапароскопии, решение о проведении оперативного лечения было принято на основании анализа клинических проявлений и данных инструментального обследования.

Критерии включения пациентов в группы исследования:

1. Гистологически верифицированный эндометриоз I-IV стадий по rAFS.

2. Возраст пациентов от 18 до 45 лет.

3. Информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии невключения: беременность, онкологические заболевания, прием гормональной терапии за 3 месяца до включения в исследование.

В качестве ПРИМЕРА 3, демонстрирующего возможности неинвазивной диагностики эндометриоза было проведено сравнение липидного профиля образцов сухих пятен менструальной крови пациентов групп контроля (n=16) и пациентов с I-IV стадиями эндометриоза (n=24). Использованы критерии включения и невключения, аналогичные представленным в ПРИМЕРЕ 2. На основании уровней липидов, удовлетворяющих условию статистической значимости согласно тесту Манна-Уитни и минимизации при помощи применения ИКА, выполнено построение классифицирующей модели на основе логистической регрессии согласно действиям алгоритма (Фиг. 3, 5а, 5б, 5в). Воспроизводимость ВЭЖХ-МС анализа уровней данных двух маркерных липидов представлена на Фиг. 4а и Фиг. 4б для образца пациента контрольной группы и пациента с гистологически подтвержденным эндометриозом.

Уровни двух липидов-маркеров в сухих пятнах менструальной крови подставляют в модели на основе логистической регрессии (РЕ Р-16:0/18:1, РЕ Р-18:0/20:4), для которых рассчитывают переменную отклика (у') по формуле:

Уровень маркерного липида РЕ Р-16:0/18:1 статистически значимо ниже в сухих пятнах менструальной крови пациентов с эндометриозом, а уровень РЕ Р-18:0/20:4 - статистически значимо выше в таких образцах (Фиг. 5б, 5в).

Вычисленная у' позволила дифференцировать пациентов группы контроля (0<у'<0. 0.68) от пациентов с эндомериозом I-IV стадий (0.68≤у'<1). Предлагаемый метод ВЭЖХ-МС обнаружил высокую диагностическую значимость, что подтверждено результатами ROC-анализа: чувствительность составила 87% при 88% специфичности, AUC=0.90; и позволяет провести классификацию образцов из анализируемых клинических групп (Фиг. 6).

В качестве Примера 4, приведена иллюстрация применения метода на новых образцах сухих пятен менструальной крови от четырех пациентов (2 пациента - контроль и 2 пациента - наличие эндометриоза), клиническое описание которых приведено выше. На Фиг. 7 приведены значения переменной отклика у' и диагноза, поставленного на основании данного расчета: 0<у'<0.68 - контроль и 0.68≤у'<1 - эндометриодное поражение. Для всех пациентов был поставлен корректный диагноз.

Вышеизложенное свидетельствует о том, что, на основании данных, полученных с помощью масс-спектрометрии (визуальное представление модели, липидный профиль из единиц, отличие которых в группах является статистически значимым), можно с высокой точностью различить липидный профиль здорового человека и пациентов при наличии эндометриоза, обеспечивая своевременную диагностику и лечение при наличии патологии, а также возможность избежать ненужного оперативного вмешательства в объеме диагностической лапароскопии.

Колоссальная задержка в постановке диагноза эндометриоз, потенцирует большинство последующих проблем. Неинвазивная диагностика одно из актуальных направлений нозологии эндометриоза. Золотым стандартом диагностики остается лапароскопия, симптомы неспецифичны, в настоящее время, обсуждается возможность эмпирической терапии, поэтому своевременное постановка диагноза, будет способствовать раннему началу терапии. По сравнению с инвазивной диагностикой в виде лапароскопии, которая сопряжена с интраоперационными рисками, метод ВЭЖХ-МС позволяет выявлять пациентов с эндометриозом без проведения этапа лапаросокопии. Таким образом, описание вышеописанных клинических наблюдений подтверждает информативность нового метода исследования в дифференциальной диагностике пациенток с эндометриозом и без.

Список литературы

1. Huang С., Freter С. Lipid metabolism, apoptosis and cancer therapy // Int. J. Mol. Sci. 2015. Vol.16, №1. P. 924-949.

2. Kononikhin A. et al. A novel direct spray-from-tissue ionization method for mass spectrometric analysis of human brain tumors // Anal. Bioanal. Chem. 2015. Vol. 407, №25. P. 7797-7805.

3. Alberici R.M. et al. Ambient mass spectrometry: Bringing MS into the "real world" // Anal. Bioanal. Chem. 2010. Vol. 398, №1. P. 265-294.

4. Адамян Л.В. et al. Эндометриоз: диагностика, лечение и реабилитация. Федеральные клинические рекомендации по ведению больных. Москва: Российское общество акушеров-гинекологов, 2013. 66 р.

5. Vouk K. et al. Discovery of phosphatidylcholines and sphingomyelins as biomarkers for ovarian endometriosis // Hum. Reprod. 2012. Vol. 27, №10. P. 2955-2965.

6. Адамян Л.В., Сонова М.М., Логинова О.Н. Сравнительный анализ эффективности диеногеста и лейпрорелина в комплексном лечении генитального эндометриоза // Проблемы репродукции. 2013. Р. 33-38.

7. Dmowski W.P. et al. Apoptosis in endometrial glandular and stromal cells in women with and without endometriosis // Hum. Reprod. 2001. Vol. 16, №9. P. 1802-1808.

8. Мельников M.B., Чупрынин В.Д., Аскольская C.B. et al. Диагностика и тактика хирургического лечения инфильтративного эндометриоза у пациенток репродуктивного возраста // Акушерство и гинекология. 2012. №7. Р. 42-49.

9. Burney R.О., Guidice L.С. Pathogenesis and Pathophysiology of Endometriosis Richard // Am. Soc. Reprod. Med. 2012. Vol. 98, №3. P. 19-25.

10. Johnson N.P., Hummelshoj L. Consensus on current management of endometriosis // Hum. Reprod. 2013. Vol. 28, №6. P. 1552-1568.

11. Burlev V.A., Pavlovich S.V, Il'yasova N.A. Apoptosis and proliferative activity in endometrium during peritoneal endometriosis // Bull. Exp.Biol. Med. 2006. Vol. 141, №2. P. 204-207.

12. Борисова A.B., Стародубцева Н.Л., Козаченко A.B. et al. Исследование очагов эндометриоза различной локализации методом прямой масс-спектрометрии // Акушерство и гинекология. 2016. №9. Р. 101-108.

13. Dutta М. et al. A metabonomics approach as a means for identification of potential biomarkers for early diagnosis of endometriosis // Mol. Biosyst. 2012. Vol. 8, №12. P. 3281-3287.

14. Lee Y.H. et al. Dysregulated sphingolipid metabolism in endometriosis // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2014. Vol. 99, №10. P. E1913-E1921.

15. Bozorgmehr M. et al. Endometrial and Menstrual Blood Mesenchymal Stem / Stromal Cells: Biological Properties and Clinical Application // Front. Cell Dev. Biol. 2020. Vol. 8, № July. P. 497.

16. Yang H. et al. Proteomic analysis of menstrual blood // Mol. Cell. Proteomics. 2012. Vol. 11, №10. P. 1024-1035.

17. Ji S. et al. DIA-based analysis of the menstrual blood proteome identifies association between CXCL5 and ILlRN and endometriosis // J. Proteomics. Elsevier В.V., 2023. Vol. 289, № July. P. 104995.

18. Starodubtseva N. et al. Identification of potential endometriosis biomarkers in peritoneal fluid and blood plasma via shotgun lipidomics // Clin. Mass Spectrom. The Association for Mass Spectrometry: Applications to the Clinical Lab (MSACL), 2019. Vol. 13. P. 21-26.

19. Akaike H. Information Theory and an Extension of the Maximum Likelihood Principle // Sel. Pap.Hirotugu Akaike. 1998. P. 199-213.

20. R team. R Studio: Integrated Development for R. Boston, MA: R Studio, Inc., 2016.

21. CoreTeam R. R: A Language and Environment for Statistical Computing. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing, 2021.

22. Sud M. et al. LMSD: LIPID MAPS structure database // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35, № SUPPL. 1. P. 527-532.

Фиг. 1. Хроматограммы по базовому ионному току для образцов липидных экстрактов сухих пятен менструальной крови от четырех пациенток с эндометриозом в режиме а) положительных ионов; б) отрицательных ионов. Указаны области, соответствующие каждому классу липидов: LPC - лизофосфатидилхолины, SM - сфингомиелины, PC - фосфатидилхолины, РЕ - фосфатидилэтаноламины, Cer - церамиды, TG - триацилглицеролы, СЕ - холестериновые эфиры, LPE - лизофосфатидилэтаноламины, ОхРС - оксифосфатидилхолины, CL - кардиолипины, О - плазманил-, Р- - плазменил.

Фиг. 2а. Диаграмма рассеяния образцов в пространстве главных компонент (1я и 2я главные компоненты), построенная с использованием всех идентифицированных липидов: зеленый цвет - группа контроля; красный цвет - группа пациенток с эндометриозом.

Фиг. 2б. Вулканная диаграмма (график рассеяния для большого массива данных), построенная по результатам сравнения уровней всех идентифицированных липидов в образцах пациентов групп контроля и исследуемой группы («Эндометриоз») в пространстве «логарифм отношения медиан - логарифм статистической значимости различий».

Фиг. 3. График распределения образцов контрольной группы (зеленый) и эндометриоза (красный) по предсказательной и ортогональной компоненте, полученных при OPLS-DA анализе с использованием всех идентифицированных липидов.

Фиг. 4а). Хроматограммы по выбранному иону липидов-маркеров РЕ(Р-16:0/18:1) и РЕ(Р-18:0/20:4) в положительной моде: образец пациента контрольной группы - зеленый цвет, образец пациента с эндометриозом - красный цвет.

Фиг. 4б. Хроматограммы по выбранному иону липидов-маркеров РЕ(Р-16:0/18:1) и РЕ(Р-18:0/20:4) в отрицательной моде: образец пациента контрольной группы - зеленый цвет, образец пациента с эндометриозом - красный цвет.

Фиг. 5а. Диаграмма рассеяния образцов контрольной группы (зеленый) и группы с эндометриозом (красный) в пространстве, определенных значениями соединений-маркеров РЕ(Р-16:0/18:1) и РЕ(Р-18:0/20:4): контрольная группы (зеленый) и группа с эндометриозом (красный).

Фиг. 5б. Диаграмма размаха уровней соединений-маркеров РЕ(Р-16:0/18:1) и РЕ(Р-18:0/20:4) в образцах контрольной группы (зеленый) и группы с эндометриозом (красный).

Фиг. 5в. Примеры хроматограмм по выделенному ионному току липидов-маркеров РЕ(Р-16:0/18:1) и РЕ(Р-18:0/20:4) для образца пациента контрольной группы (зеленый) и пациента с эндометриозом (красный).

Фиг. 6. Операционная кривая, полученная при кросс-валидации по отдельному объекту модели.

Фиг. 7. Описание пациенток для демонстрации работы метода с расчетом переменной отклика и диагноза: 0<у'<0.68 - контроль и 0.68≤у'<1 - эндометриоз.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для диагностики эндометриоза. Осуществляют получение образцов менструальной крови пациента, подготовку экстракта липидов образцов сухих капель менструальной крови, получение липидного профиля сухих пятен менструальной крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС). На основании липидов РЕ Р-16:0/18:1 и РЕ Р-18:0/20:4 рассчитывают переменную отклика у':

где I_{PE P-16:0/18:1} ^_ площадь пиков липида-маркера плазменил-фосфатилэтаноламина РЕ Р-16:0/18:1 на хроматограмме образца липидного экстракта сухого пятна менструальной крови пациента, у.е.; I_{PE P-18:0/20:4} ^_ площадь пиков липида-маркера плазменил-фосфатилэтаноламина РЕ Р-18:0/20:4 на хроматограмме образца липидного экстракта сухого пятна менструальной крови пациента, у.е. При значении у' от 0.68 до 1 диагностируют эндометриоз у пациента. При значении у' от 0 до 0.68 диагностируют отсутствие эндометриоза у пациента. Способ обеспечивает возможность ранней неинвазивной диагностики эндометриоза различной степени тяжести за счет анализа липидного профиля сухих капель менструальной крови посредством ВЭЖХ-МС в результате применения классифицирующей модели, построенной на основании метода логистической регрессии для вычисления переменной отклика (у'): с учетом уровней 2 липидов: РЕ Р-16:0/18:1 и РЕ Р-18:0/20:4. 7 ил., 4 пр.

Способ диагностики эндометриоза, включающий получение образцов менструальной крови пациента, подготовку экстракта липидов образцов сухих капель менструальной крови, получение липидного профиля сухих пятен менструальной крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией, характеризующийся тем, что на основании липидов РЕ Р-16:0/18:1 и РЕ Р-18:0/20:4 рассчитывают переменную отклика у':

где I_{PE P-16:0/18:1} ^_ площадь пиков липида-маркера плазменил-фосфатилэтаноламина РЕ Р-16:0/18:1 на хроматограмме образца липидного экстракта сухого пятна менструальной крови пациента, у.е.;

I _{PE P-18:0/20:4} ^_ площадь пиков липида-маркера плазменил-фосфатилэтаноламина РЕ Р-18:0/20:4 на хроматограмме образца липидного экстракта сухого пятна менструальной крови пациента, у.е.;

и при значении у' от 0.68 до 1 диагностируют эндометриоз у пациента, а при значении у' от 0 до 0.68 диагностируют отсутствие эндометриоза у пациента.