Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого S1P5 рецептора Российский патент 2023 года по МПК C12N15/62 C07K14/705 C12N15/63 

Модифицированная генетическая конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации человеческого S1P5 рецептора

Изобретение относится к молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологиям и касается новых генетических конструкций и продуцентов, обеспечивающих экспрессию рекомбинантного человеческого сфингозин-1-фосфатный рецептор типа 5 класса GPCR, пригодного к дальнейшим структурно-функциональным исследованиям.

Известна конструкция дикого типа S1P5, депонированная в базе данных UniProtKB - Q9H228 (S1PR5_HUMAN, https://www.uniprot.org/uniprot/Q9H228)

Существует большое количество патентов, касающихся создания прототипов лекарственных препаратов, лигандов, антагонистов, имеющих своими мишенями S1P5 и методов их использования:

1. Производные тетрагидронафталина - модуляторы S1P5 (https://patents.google.com/patent/US20190031605A1/)

2. Орально биодоступные агонисты и антагонисты S1P5 (https://patents.google.com/patent/US7638637B2)

3. Гетероциклические соединения для лечения болезней, модулирующие рецепторы S1P (https://patents.google.com/patent/US20200325135A1/, https://patents.google.com/patent/WO2018211323A1/)

4. Соединения, обладающие агонистической активностью в отношении S1P5 (https://patents.google.com/patent/BR112020017036A2/)

5. Смеси и методы модуляции активности естественных киллеров и T-клеток через S1P5 (https://patents.google.com/patent/WO2009053481A1/)

6. Агенты, модулирующие ответ на S1P (https://patents.google.com/patent/US9765016B2)

7. Агонисты и антагонисты S1P5, а также методы их использования (https://patents.google.com/patent/CA2749960A1/)

8. Селективные модуляторы сфингозин-1-фосфатных рецепторов и методы хирального синтеза (включая озанимод) (https://patents.google.com/patent/ES2673160T3/)

9. N-(бензил)аминоалкилкарбоксилаты, фосфинаты, фосфонаты и тетразолы как агонисты edg-рецепторов (Edg-рецепторы - S1P_1-5 И LPA_1-3)

10. Соединения, активные в передаче сигналов сфингозин-1-фосфата (https://patents.google.com/patent/US7560477B2/)

11. В том числе финголимод (пример - https://patents.google.com/patent/CA2539033A1/), озанимод (https://patents.google.com/patent/US11111223B2/), сипонимод (https://patents.google.com/patent/JP2020535147A/)

Существуют генетические конструкции для проведения функциональных тестов рецептора S1P5 и поиска его лигандов (https://patents.google.com/patent/WO2011131747A1/), однако из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам неизвестно, чтобы существовала конструкция S1P5 рецептора, обеспечивающая кристаллизацию белка методом in meso.

Отличительным признаком изобретения являются: комбинация N-концевых пептидных фрагментов, обеспечивающих рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности, а также ее детекцию; положение партнерного белка в третьей внутриклеточной петле, способствующего стабилизации белка и помогающего образованию кристаллических контактов; транкирование неупорядоченного C-конца S1P5 рецептора, препятствующего формированию кристаллов, комбинация С-концевых пептидных фрагментов, обеспечивающих очистку рецептора.

Данное изобретение обеспечивает синтез модифицированного рецептора S1P5 при помощи бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых, а также возможность получения его гомогенного стабилизированного препарата в количестве не менее 0.5 мг с литра клеточной культуры, подходящего для исследований методом рентгеноструктурного анализа и биофизическими функциональными тестами

Техническим результатом изобретения является возможность получения дифрагирующих кристаллов указанной конструкции, полученных методом кристаллизации в липидной кубической фазе, а также проведения функциональных тестов: анализа связывания лигандов, анализа стабилизирующего эффекта различных буферных растворов.

Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.

Ген дикого типа был приобретен в компании cdna.org (США), плазмида, ген белка-партнера был синтезирован компанией GenScript (США). Используемый плазмидный вектор pFastBac1 (Invitrogen, США), модифицировался методом безлигазного клонирования с использованием праймеров, синтезированных в компании Евроген (Россия). Применялась ПЦР-смесь accuprime (Invitrogen, США), для избавления от исходной плазмиды использовалась DpnI рестриктаза (NEB, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя. Для амплификации вектора использовался бактериальный копийный штамм E.coli, TOP10.

Сущность изобретения поясняется фигурами 1-5.

На фиг. 1 представлена заявляемая ДНК-последовательность.

ATGAAGACCATCATCGCTCTGTCCTACATCTTCTGCCTCGTGTTCGCCGACTACAAGGACGATGACGATGCTGGGCGCGCCatggaatcgggactcttgcgtccggctcctgtctctgaggtcatcgttctgcattacaactacactggaaaactgaggggtgcgaggtaccagcctggagctggattgagagctgacgcagtggtctgcctggcagtttgtgcgttcatcgtgctcgagaacttggctgtgctgctcgtcctgggaaggcacccaagattccatgctccgatgttcttgctgctcggttcactcaccttgagtgatttgctggctggcgctgcctacgcagcgaacatcctcttgtcgggaccactgaccctcaagttgtccccggctctgtggttcgccagagagggtggcgtcttcgttgctctgactgccagcgtcctctctctgctcgcaattgcgttggaacgctccctgacaatggcacgccgtggaccagcaccggtgtccagcagaggacgtacgctcgctatggctgcagcagcatggggagtctcattgctgctcggtttgctgccagctctgggatggaactgcctgggaagactcgacgcctgttccactgttctgccgctctacgctaaggcctacgttctcttctgcgtgttggccttcgtcggcatcctcgctgccatttgcgcattgtacgcgaggatctactgtcaggtgagagcaaacgctGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGcgccgtaaaccacgtagcctggctctcttgaggacactctctgttgtgctgctcgctttcgtcgcctgctggggaccactgttcttgctgctcttgctggacgtcgcatgccctgcgcgtacgtgtcccgttctcttgcaagccgatcctttcttgggtctggctatggccaactctctgctcaaccccatcatttacacattgacgaaccgcgacctgcgtcacgctttgctgaggctggtgGGAAGACCTCTGGAGGTGCTCTTCCAGGGTCCCCACCATCATCACCATCATCACCACCACCACTAA

На фиг.2 представлена схема с аминокислотной последовательностью.

Оценка эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась следующим образом. Плазмидой трансформировались бактериальные клетки E.coli штамма DH10Bac, в котором методом сайт-специфичной транспозиции ген интереса встраивался в челночный вектор бакмиду, содержащую геном бакуловируса AcNPV. Клетки Sf9 трансфецировались бакмидой, и формировался вирус, в геноме которого содержался ген S1P5 рецептора. В результате чего получалась клеточная культура, экспрессирующая белок на клеточной мембране, что проверялось методом проточной цитометрии. После наработки биомассы проводилось выделение мембранной фракции путем лизиса клеток в гипотоническом буфере и отделения цитозольной фракции в гипертоническом буфере, затем солюбилизация белка мягким детергентом и очистка при помощи металл-аффинной хроматографии, белок при этом стабилизировался добавлением лиганда, начиная с шага солюбилизации. Чистота белкового препарата проверялась электрофоретическим методом. Затем исследовалась степень агрегации рецептора методом аналитической гель-фильтрационной ВЭЖХ и стабильность методом анализа кривой плавления с CPM красителем (C1484, Sigma, США). Чистота препарата составляла более 90%, степень мономерности - более 90%, температура плавления составляла 63 градусов с лигандом и 45 градусов для Апо формы. Проводилась кристаллизация в липидной кубической фазе, и были получены белковые кристаллы с обратным агонистом ONO-5430608, продифрагировавшие до 2.2 Å (фиг. 3).

На фиг. 3. представлены характеристика и кристаллизация S1P5-ONO-5430608: (a) Анализ очищенного S1P5 в комплексе с ONO-5430608 методом гель-фильтрации, показывающий преимущественно мономерный белковый препарат (пик мономера показан стрелкой); (b) Анализ термического сдвига с использованием флуоресценции CPM. Обратный агонист (ONO-5430608) повышает термостабильность S1P5 на 19°С. (с) Микрофотографии в поляризованном и видимом свете характерных кристаллов комплексов с лигандом ONO-5430608

Использование заявляемой генетической конструкции позволяет проводить рентгеноструктурный анализ кристаллов S1P5 рецептора и изучать белок при помощи различных биофизических методов исследования.

На фиг. 4 представлены примеры дифракционных картин, полученных на PAL XFEL. (a) Дифракционная картины, (b) радиальный профиль.

Кристаллы, полученные с помощью этой конструкции, достигали размера 30 мкм и давали кристаллические данные разрешением до 4 Å при криоохлаждении на синхротронном источнике. Также оптимизировались условия для получения большого количества более мелких (5-10 мкм) кристаллов, которые пригодны для измерений с помощью серийной фемтосекундной кристаллографии при комнатной температуре на рентгеновском лазере на свободных электронах.

Полученные дифракционные картины позволили определить структуру S1P5 с разрешением 2.2 Å в комплексе с обратным агонистом (депонирована в PDB под идентификатором 7YXA). Соответствующая публикация доступна по адресу https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.02.25.480536v1

На фиг. 5. Представлена структура S1P5 в комплексе с обратным агонистом в сравнении с (a) структурой неактивного S1P1 в комплексе с ML056 (структура 3V2Y в PDB, получена методом рентгеноструктурного анализа) (b) структурой активного S1P5 в комплексе с сипонимодом (структура 7EW1 в PDB, получена методом криоэлектронной микроскопии)

Изобретение создано при выполнении работ по госзаданию FSMG-2020-0003, по теме "Влияние аллостерических модуляторов на структуру и конформационную динамику A2a-аденозинового рецептора», Соглашение №075 03 2022-107 от 14.01.2022, заказчик- Министерство науки и высшего образования Российской Федерации.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Modified S1P5

sequence.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.1"

productionDate="2022-07-19">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>11111111</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-07-19</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>11111111111</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-07-19</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский

физико-технический институт (национальный исследовательский

университет)»</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Moscow Institute of Physics and

Technology</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Ляпина Елизавета

Алексеевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Lyapina Elizaveta</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Модифицированная генетическая

конструкция для рекомбинантной экспрессии и кристаллизации

человеческого S1P5 рецептора</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1377</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1377</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaagaccatcatcgctctgtcctacatcttctgcctcgtgttcgccg

actacaaggacgatgacgatgctgggcgcgccatggaatcgggactcttgcgtccggctcctgtctctga

ggtcatcgttctgcattacaactacactggaaaactgaggggtgcgaggtaccagcctggagctggattg

agagctgacgcagtggtctgcctggcagtttgtgcgttcatcgtgctcgagaacttggctgtgctgctcg

tcctgggaaggcacccaagattccatgctccgatgttcttgctgctcggttcactcaccttgagtgattt

gctggctggcgctgcctacgcagcgaacatcctcttgtcgggaccactgaccctcaagttgtccccggct

ctgtggttcgccagagagggtggcgtcttcgttgctctgactgccagcgtcctctctctgctcgcaattg

cgttggaacgctccctgacaatggcacgccgtggaccagcaccggtgtccagcagaggacgtacgctcgc

tatggctgcagcagcatggggagtctcattgctgctcggtttgctgccagctctgggatggaactgcctg

ggaagactcgacgcctgttccactgttctgccgctctacgctaaggcctacgttctcttctgcgtgttgg

ccttcgtcggcatcctcgctgccatttgcgcattgtacgcgaggatctactgtcaggtgagagcaaacgc

tgctgatctggaagacaattgggaaactctgaacgacaatctcaaggtgatcgagaaggctgacaatgct

gcacaagtcaaagacgctctgaccaagatgagggcagcagccctggacgctcagaaggccactccaccta

agctcgaggacaagagcccagatagccctgaaatgaaagactttcggcatggattcgacattctggtggg

acagattgatgatgcactcaagctggccaatgaagggaaagtcaaggaagcacaagcagccgctgagcag

ctgaagaccacccggaatgcatacattcagaagtacctgcgccgtaaaccacgtagcctggctctcttga

ggacactctctgttgtgctgctcgctttcgtcgcctgctggggaccactgttcttgctgctcttgctgga

cgtcgcatgccctgcgcgtacgtgtcccgttctcttgcaagccgatcctttcttgggtctggctatggcc

aactctctgctcaaccccatcatttacacattgacgaaccgcgacctgcgtcacgctttgctgaggctgg

tgggaagacctctggaggtgctcttccagggtccccaccatcatcaccatcatcaccaccaccactaa</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению сфингозин-1-фосфатного рецептора типа 5 (Sphingosine-1-phosphate receptor 5, S1P5), и может быть использовано для экспрессии S1P5 рецептора. Предложена генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью, которая оптимизирована для экспрессии S1P5 рецептора. Изобретение обеспечивает рекомбинантную экспрессию в эукариотической системе на клеточной поверхности за счет комбинации N-концевых пептидных фрагментов и положения партнерного белка в третьей внутриклеточной петле, что также стабилизирует белок и помогает образованию кристаллических контактов. 5 ил.

Генетическая конструкция с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No: 1, кодирующая человеческий сфингозин-1-фосфатный рецептор типа 5 (human sphingosine-1-phosphate receptor 5, S1P5).