Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного Российский патент 2024 года по МПК G01N21/31 G01N1/40 B01D11/02 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.).

В медицинской практике применяются не только фармакопейные, но и другие растения, которые издавна используются в народной медицине. Одним из перспективных является Авран лекарственный (Gratiola officinalis L.) – растение семейства подорожниковые, достаточно широко распространен в Европейской части Российской Федерации и является компонентом противоопухолевого сбора Здренко. Известно также, что трава аврана лекарственного обладает противоглистным, противотуберкулезным, противомутагенным, антиоксидантным и противоопухолевым действиями. [Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). – Самара, 2016. – 1279 с.; Большой энциклопедический словарь лекарственных растений: учебное пособие под ред. Г. П. Яковлева. – Санкт-Петербург: СпецЛит, 2015. – 759 с.]. Качество сырья аврана лекарственного ранее было регламентировано временной фармакопейной статьей 42-2358-85. Однако растение до сих пор является малоизученным. В настоящее время действующей ФС на Авран лекарственный не существует, что создаёт необходимость создания нормативной документации.

Известны способы количественного определения флавоноидов в лекарственных травах [патенты RU №№ 2806035, 2696770, 2806047, 2786835, 2786440], включающие в себя экстракцию сырья лекарственной травы этиловым спиртом на кипящей водяной бане с последующей пробоподготовкой и определение оптической плотности методом дифференциальной спектрофотометрии. Проводят реакцию комплексообразования с хлоридом алюминия. Затем определяют количественное содержание суммы флавоноидов в траве лекарственного растения в пересчете стандартный образец СО на лютеолин-7-глюкозида.

Однако особенность химического состава аврана лекарственного, содержащего несколько групп биологически активных соединений (алкалоиды, тритерпеновые сапонины, флавоноиды), с различной фармакологической активностью не позволяет применять унифицированные методики количественного определения отдельных групп биологически активных соединений.

Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ определения флавоноидов в густом экстракте аврана лекарственного [Фомина Ю.А., Шестопалова Н.Б. Разработка и валидация методики количественного определения содержания суммы флавоноидов в густом экстракте аврана лекарственного // Week of Russian science (WeRuS-2023): сб. материалов ХII Всероссийской недели науки с международным участием, посвященной году педагога и наставника. Саратов, 2023.– С. 893-896] методом дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 398 нм по реакции комплексообразования в течение 40 минут. Способ включает растворение густого экстракта аврана лекарственного этиловым спиртом в концентрации 70%. Затем проводят реакцию комплесообразования с соотношением объемов раствора густого экстракта и 5% спиртового раствора хлорида алюминия 1:2. Определение суммы флавоноидов в густом экстракте аврана лекарственного в пересчете на лютеолин-7-глюкозид производят по формуле: где A – оптическая плотность испытуемого раствора А; A_о – оптическая плотность раствора СО лютеолин-7-глюкозида; а – навеска густого экстракта, г; а_о – навеска СО лютеолин-7-глюкозида, г; P – содержание основного вещества в СО лютеолин-7-глюкозида, %; W – потеря в массе при высушивании, %.

Однако способ определения суммы флавоноидов, представленный для густого экстракта не может быть непосредственно применен для разработки способа содержания флавоноидов в траве аврана лекарственного. Ключевой стадией является процедура получения флавоноидсодержащего извлечения из сырья и приготовление растворов, пригодных для спектрофотометрирования. Для этого необходимо подобрать оптимальные условия экстракции: выбор экстрагента, его концентрацию, продолжительность проведения экстракции, температуру, степень измельченности сырья, соотношение «сырье:экстрагент».

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного, обладающего высокой специфичностью и точностью за счет обработки многомерных спектральных данных.

Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе количественного определения суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного, включающем экстракцию сырья этиловым спиртом в концентрации 70%, с последующим определением суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 398 нм по реакции комплексообразования в течение 40 минут с 5% спиртовым раствором хлорида алюминия в пересчете на лютеолин-7-глюкозид, при этом для реакции комплексообразования используют соотношение объемов извлечения из сырья травы аврана лекарственного и 5% спиртового раствора хлорида алюминия 1:2, для получения водно-спиртового извлечения из травы аврана лекарственного проводят экстракцию на кипящей водяной бане в течение 60 минут, сырье предварительно подготавливают путем измельчения травы аврана лекарственного до 2 мм, соотношение «сырье-экстрагент» составляет 1:100, содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где A – оптическая плотность испытуемого раствора Б;

A_о – оптическая плотность раствора СО лютеолин-7-глюкозида;

А – навеска сырья, г;

а_о – навеска СО лютеолин-7-глюкозида, г;

P – содержание основного вещества в СО лютеолин-7-глюкозида, %;

W – влажность сырья, %;

в случае отсутствия стандартного образца лютеолин-7-глюкозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 398 нм - 318:

где A – оптическая плотность испытуемого раствора Б;

– удельный показатель поглощения комплекса лютеолин-7-глюкозида с алюминия хлоридом при длине волны 398 нм, равный 318;

А – навеска сырья, г;

W – влажность сырья, %.

Технический результат заявляемого изобретения.

Точность положения длины волны максимума спектров поглощения достигается обработкой многомерных данных, включающих набор значений оптической плотности растворов в диапазоне 200-550 нм с шагом сканирования минимум 0,5 нм. Совпадение дифференциальных спектров с максимумами поглощения при аналитической длине волны 398 нм комплексов водно-спиртовых растворов лютеолин-7-глюкозида и извлечений из травы аврана лекарственного с добавкой хлорида алюминия подтверждает, что сопутствующие вещества, переходящие в раствор при экстрагировании сырья, не искажают результат, что подтверждает специфичность методики.

Оптимальным условием реакции комплексообразования, удовлетворяющим специфичности методики выбран 5% раствор хлорида алюминия в 70% спирте этиловом при соотношении объемов извлечения и хлорида алюминия – 1:2. Определение точного соотношения компонентов к 5% раствору хлорида алюминия позволяет выбрать в качестве СО лютеолин-7-глюкозид с обеспечением высокой специфичности методики.

Заявляемое изобретение поясняется с помощью фиг. 1-4, на которых изображено:

на фиг. 1 - электронные спектры поглощения водно-спиртового извлечения из травы аврана лекарственного (1) и водно-спиртового извлечения из травы аврана лекарственного с добавлением хлорида алюминия (2);

на фиг. 2 - электронные спектры поглощения водно-спиртового раствора СО-7-глюкозида (1) и водно-спиртового раствора СО лютеолин-7-глюкозида с добавлением хлорида алюминия (2);

на фиг. 3 - дифференциальные спектры поглощения комплексов: а) водно-спиртовых растворов СО лютеолин-7-глюкозида и извлечения из травы аврана лекарственного с добавлением хлорида алюминия б) водно-спиртового раствора извлечения и водно-спиртового раствора извлечения с добавлением 75 мкг СО лютеолина-7-глюкозида;

на фиг. 4 - дифференциальные спектры поглощения комплексов водно-спиртовых извлечений из травы аврана лекарственного при добавлении различного количества 5% раствора хлорида алюминия.

Определение суммы флавоноидов в растительном сырье основано на реакции комплексообразования флавоноидов с хлоридом трехвалентного алюминия, в результате чего происходит батохромный сдвиг полосы поглощения с 330-350 нм до 390=410 нм, что позволяет проводить количественное определение искомых соединений в растворе по разнице аналитического сигнала тех же растворов без добавления солей алюминия. [Природные флавоноиды / Д.Ю. Корулькин, Ж.А. Абилов, Р.А. Музычкина, Г.А. Толстиков – Рос. акад. наук, Сиб. отд., Новосиб. ин-т органической химии. – Новосибирск: Академическое изд-во "Тео", 2007. – 232 c.].

Погрешность спектрофотометрического определения зависит от концентрации веществ в растворе, минимальная погрешность соответствует значению оптической плотности раствора 0,43. Растворы для спектрофотометрирования должны быть приготовлены таким образом, чтобы их оптическая плотность находилась в диапазоне от 0,12 до 1,2.

При изучении спектральных характеристик было установлено, что характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения в области от 250 до 500 нм имеет максимум поглощения при длине волны (333±2) нм и плечо от 280 нм до 310 нм (фиг. 1). При добавлении хлорида алюминия наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы, характерный для комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия. Изучение спектров поглощения водно-спиртовых растворов СО лютеолина-7-глюкозида с хлоридом алюминия и без него показало батохромный сдвиг длинноволновой полосы на 35-40 нм с уменьшением интенсивности поглощения (фиг. 2). Максимальное поглощение наблюдается при длине волны, не превышающей 400 нм. В связи с этим, лютеолин-7-глюкозид может быть применен в качестве СО, на который производится расчет суммарного содержания флавоноидов в траве аврана лекарственного.

Изучение дифференциальных спектров поглощения водно-спиртового раствора лютеолин-7-глюкозида и водно-спиртового извлечения из травы аврана лекарственного показало, что формы спектров в длинноволновой области совпадают, максимумы поглощения наблюдаются при длине волны 398 нм, что может быть использовано для выбора аналитической длины волны (фиг. 3а). Для подтверждения специфичности использовали метод добавки СО и установили совпадение спектральных характеристик комплексов водно-спиртовых растворов лютеолин-7-глюкозида и извлечений из травы аврана лекарственного с добавкой хлорида алюминия (фиг. 3б).

Изучено влияние добавления разных количеств хлорида алюминия на спектральные характеристики. При увеличении концентрации хлорида алюминия в спектрах поглощения наблюдаются батохромный (от 391 нм до 405 нм) и гипохромный сдвиги (фиг. 4).

Для разработки способа количественного определения суммы флавоноидов установлены следующие параметры: концентрация экстрагента; продолжительность, кратность и температурный режим экстракции; степень измельченности сырья; соотношение «сырье-экстрагент»; время реакции комплексообразования.

Нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции (табл. 1,). В результате эксперимента оптимальным экстрагентом, обеспечивающим наиболее высокий выход флавоноидов, и удовлетворяющим требованиям специфичности методики (по положению максимума поглощения), является 70% спирт этиловый.

Таблица 1 – Зависимость выхода флавоноидов из травы аврана лекарственного от концентрации экстрагента

Экстрагент Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид абсолютно сухое сырье, % 30% спирт этиловый 1,58±0,07 50% спирт этиловый 1,48±0,06 70% спирт этиловый 1,46±0,11 95% спирт этиловый 0,92±0,08

Проанализированы образцы травы с размером частиц 1, 2 и 3 мм. Максимальный выход суммы флавоноидов достигался при экстракции сырья, измельченного до размера частиц, проходящих через сито с диаметром отверстий 2 мм (табл. 2).

Таблица 2 – Зависимость выхода флавоноидов из травы аврана лекарственного от степени измельченности сырья

Степень измельченности сырья Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и абсолютно сухое сырье, % 1 мм 1,26±0,11 2 мм 1,48±0,02 3 мм 1,37±0,03

Из таблицы 3 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:100, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.

Таблица 3 – Зависимость выхода флавоноидов из травы аврана лекарственного от соотношения «сырье-экстрагент»

Соотношение
«сырье-экстрагент» Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и абсолютно сухое сырье, % 1:50 1,22±0,06 1:100 1,56±0,08

Существенное влияние на скорость процесса экстрагирования и полноту извлечения флавоноидов из растительного сырья оказывает температурный режим экстракции на водяной бане. В таблице 4 представлена зависимость выхода флавоноидов из травы аврана лекарственного от температуры (60°С, 80°С и 100°С). Максимальный выход флавоноидов из травы аврана лекарственного при однократном извлечении сырья наблюдался на кипящей водяной бане.

Таблица 4 – Зависимость выхода флавоноидов из травы аврана лекарственного от температуры (60°С, 80°С и 100°С)

Температурный режим водяной бани Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и абсолютно сухое сырье, % 60°С 1,51±0,06 80°С 1,54±0,04 100°С 1,55±0,05

Нами было изучено влияние продолжительности экстракции на кипящей водяной бане (табл. 5). Время проведения извлечения флавоноидов из травы Аврана лекарственного варьировали от 30 минут до 90 минут.

Таблица 5 – Зависимость выхода флавоноидов из травы аврана лекарственного от времени экстракции на кипящей водяной бане

Продолжительность экстракции Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и абсолютно сухое сырье, % 30 минут 1,43±0,06 45 минут 1,43±0,05 60 минут 1,47±0,08 90 минут 1,42±0,12

Максимальное количество флавоноидов извлекается при экстракции продолжительностью 60 мин, дальнейшее увеличение времени до 90 мин не приводит к увеличению выхода флавоноидов.

Изучение оптимального времени реакции комплексообразования флавоноидов с хлоридом алюминия показало, что значения оптической плотности растворов возрастало и после 40 мин оставались стабильными. Таким образом, оптимальным временем реакции комплексообразования было выбрано 40 минут.

Таким образом, были установлены оптимальные условия для определения суммы флавоноидов из травы аврана лекарственного в пересчете на лютеолин-7-глюкозид экстракция сырья с размером частиц 2 мм этиловым спиртом 70% на кипящей водяной бане в течение 60 минут при соотношении «сырье-экстрагент» - 1:100. (извлечение:хлорид алюминия Количество 5% раствора хлорида алюминия в 70% этиловом спирте, необходимого для комплексообразования – 1:2) в течение 40 минут.

Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного реализуется следующим образом.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельчённого сырья помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл спирта 70%. Таким образом, соотношение «сырье-экстрагент» составляет 1:100. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Доводят объём раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (испытуемый раствор А).

Для реакции комплексообразования используют в соотношении к водно-спиртовому извлечению из травы аврана лекарственного 5% спиртовой раствор хлорида алюминия 1:2, например, 2,5 мл испытуемого раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 5,0 мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида в 70% этиловом спирте, доводят объем раствора спиртом 70% до метки и перемешивают (испытуемый раствор Б).

Оптическую плотность испытуемого раствора Б измеряют через 40 мин на спектрофотометре при длине волны 398 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 2,5 мл испытуемого раствора А, доведенного этиловым спиртом 70% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО лютеолин-7-глюкозида в таких же условиях. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 7,5 мл раствора СО лютеолин-7-глюкозида, доведенного этиловым спиртом 7% до метки в мерной колбе вместимостью 50 мл.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле: где A – оптическая плотность испытуемого раствора Б; A_о – оптическая плотность раствора СО лютеолин-7-глюкозида; а – навеска сырья, г; а_о – навеска СО лютеолин-7-глюкозида, г; P – содержание основного вещества в СО лютеолин-7-глюкозида, %; W – влажность сырья, %.

В случае отсутствия СО лютеолин-7-глюкозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 398 нм - 318:

где A – оптическая плотность испытуемого раствора Б; – удельный показатель поглощения комплекса лютеолин-7-глюкозида с алюминия хлоридом при длине волны 398 нм, равный 318; а – навеска сырья, г; W – влажность сырья, %.

Приготовление раствора СО лютеолин-7-глюкозида. Около 0,010 г (точная навеска) СО лютеолин-7-глюкозида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 80 мл спирта 70%, перемешивают при нагревании до полного растворения, охлаждают, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Пример 1

Аналитическую пробу сырья аврана лекарственного измельчают до размера частиц 2 мм (заготовлено в Саратовской области, июль 2022 г.). 1,0004 г измельченного сырья помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 70% этилового спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 минут. После охлаждения полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Доводят объём раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (испытуемый раствор А).

Испытуемый раствор для анализа суммы флавоноидов готовят следующим образом:

2,5 мл испытуемого раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 5,0 мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида в 70% этиловом спирте, доводят объем раствора спиртом 70% до метки и перемешивают (испытуемый раствор Б).

Раствор сравнения готовят следующим образом: 2,5 мл испытуемого раствора А, доведенного этиловым спиртом 70% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор СО лютеолин-7-глюкозида, добавляют к нему 5% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 398 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.

Приготовление раствора СО лютеолин-7-глюкозида

Около 0,010 г (точная навеска) СО лютеолин-7-глюкозида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 80 мл спирта 70%, перемешивают при нагревании до полного растворения, охлаждают, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (раствор СО 1).

После чего 7,5 мл раствора СО 1 лютеолин-7-глюкозида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 15 мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида, затем доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 70%. Раствор сравнения готовят следующим образом: 7,5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 70%.

Измерение оптической плотности проводят при длине волны 398 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения через 40 минут после приготовления всех растворов.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где 0,451 – оптическая плотность испытуемого раствора Б;

0,485 – оптическая плотность раствора СО лютеолин-7-глюкозида;

1,0004 – навеска сырья, г;

0,010 – навеска СО лютеолин-7-глюкозида, г;

100 – содержание основного вещества в СО лютеолин-7-глюкозида, %;

9 – влажность сырья, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид равно 1,53%.

Пример 2

При необходимости определения суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного в отсутствии СО лютеолин-7-глюкозида, необходимо провести все действия из примера 1 до приготовления СО. После измерения оптической плотности извлечения из травы аврана лекарственного при длине волны 398 нм, содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения при 398 нм - 318.

0,451 – оптическая плотность испытуемого раствора Б;

318 – удельный показатель поглощения ( ) комплекса лютеолин-7-глюкозида с алюминия хлоридом при длине волны 398 нм, равный 318;

1,0004 – навеска сырья, г;

9 – влажность сырья, %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид равно 1,55%, что сравнимо со значением, полученном в примере 1.

Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила 3,7%. Таким образом, установлено, что расчет суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного в соответствии с заявляемым способом является достоверным с точки зрения установленных параметров комплексообразования с применением СО и определении их в его отсутствии.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Раскрыт способ количественного определения суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного, включающий экстракцию сырья этиловым спиртом в концентрации 70%, с последующим определением суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 398 нм по реакции комплексообразования в течение 40 минут с 5% спиртовым раствором хлорида алюминия в пересчете на лютеолин-7-глюкозид, при этом для реакции комплексообразования используют соотношение объемов извлечения из сырья травы аврана лекарственного и 5% спиртового раствора хлорида алюминия 1:2, для получения водно-спиртового извлечения из травы аврана лекарственного проводят экстракцию на кипящей водяной бане в течение 60 минут, сырье предварительно подготавливают путем измельчения травы аврана лекарственного до 2 мм, при использовании на 1 г навески сырья 100 мл этилового спирта в концентрации 70%, рассчитывают содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и абсолютно сухое сырье. Изобретение обеспечивает разработку способа количественного определения суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного, обладающего высокой специфичностью и точностью за счет обработки многомерных спектральных данных. 4 ил., 5 табл., 2 пр.

Способ количественного определения суммы флавоноидов в траве аврана лекарственного, включающий экстракцию сырья этиловым спиртом в концентрации 70%, с последующим определением суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии при аналитической длине волны 398 нм по реакции комплексообразования в течение 40 минут с 5% спиртовым раствором хлорида алюминия в пересчете на лютеолин-7-глюкозид, при этом для реакции комплексообразования используют соотношение объемов извлечения из сырья травы аврана лекарственного и 5% спиртового раствора хлорида алюминия 1:2, отличающийся тем, что для получения водно-спиртового извлечения из травы аврана лекарственного проводят экстракцию на кипящей водяной бане в течение 60 минут, сырье предварительно подготавливают путем измельчения травы аврана лекарственного до 2 мм, при использовании на 1 г навески сырья 100 мл этилового спирта в концентрации 70%, содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин-7-глюкозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где A – оптическая плотность испытуемого раствора;

A_о – оптическая плотность раствора стандартного образца лютеолин-7-глюкозида;

а – навеска сырья, г;

а_о – навеска стандартного образца лютеолин-7-глюкозида, г;

P – содержание основного вещества в стандартном образце лютеолин-7-глюкозида, %;

W – влажность сырья, %;

в случае отсутствия стандартного образца лютеолин-7-глюкозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения при 398 нм - 318:

где A – оптическая плотность испытуемого раствора;

– удельный показатель поглощения комплекса лютеолин-7-глюкозидас алюминия хлоридом при длине волны 398 нм, равный 318;

А – навеска сырья, г;

W – влажность сырья, %.