Гемотест-система Российский патент 2024 года по МПК G01N33/564 G01N33/53 G01N33/68 

Изобретение относится к биотехнологии и персонализированной медицине, в частности к in vitro анализу цитокинового статуса крови пациентов для выявления у них аутовоспалительных заболеваний. А также для анализа противовоспалительной активности веществ, выбранных из группы биологических, генно-инженерных препаратов, любой известной панели лекарств.

В основе ряда серьёзных заболеваний опорно-двигательной, сердечно-сосудистой, выделительной, центральной нервной и других систем организма лежат аутовоспалительные процессы, обусловленные активацией инфламмасом. При этом происходит выброс провоспалительных агентов, в том числе, в кровяное русло, развитие тканевых повреждений без аутоиммунных нарушений. Ведущую роль в развитии этих процессов играют клетки крови – макрофаги, моноциты, нейтрофилы.

Оценить цитокиновый статус крови у таких пациентов очень важно, в том числе, для подбора им индивидуальной эффективной противовоспалительной терапии. Нередко эти больные проходят длительный путь в поиске «своего» препарата, что негативно сказывается на их состоянии и нередко вызывает перекрёстные аллергические реакции и другие осложнения.

Инфламмасомы представляют собой молекулярные комплексы, которые создаются в цитоплазме клеток в ответ на воздействие двух классов молекул PAMPs и DAMPs [1,2]. Общепринятая двухсигнальная система развития аутовоспалительных заболеваний через активацию инфламмасом NLRP3 продемонстрирована на Фигуре 1 на примере развития подагры. Считается, что первый триггер (PAMPs/DAMPs) сенсибилизирует клетки через ТОЛЛ-подобные рецепторы (priming). После первичной сенсибилизации клетки становятся чувствительны ко второму триггеру, которым, в случае подагры, является мочевая кислота, что вызывает активацию инфламмасом [3].

Активированные инфламмасомы NLRP3 способствуют высвобождению фермента Каспазы -1, который переводит неактивные формы про- IL-1β и про-IL -18 в зрелые активные IL-1β и IL-18, соответственно. Активированные инфламмасомы через Gasdermin-D-опосредованный каскад реакций обеспечивают образование мембранных пор, через которые идет секреция зрелых IL-1β и IL-18 в окружающую клетки среду, кровеносное русло.

С открытием инфламмасом системные воспалительные болезни условно делят на аутовоспалительные (ранее именуемые, как асептические) и аутоиммунные. Более часто встречается смешанный тип аутовоспалительных заболеваний, к которым относят подагру, артриты, васкулиты, воспаления кишечника, почек и нейродегенеративные заболевания.

В целях диагностики и мониторинга патологий воспалительной и аутоиммунной природы в последние годы популярно изучение секреции молекул-медиаторов воспаления клетками крови, в частности, МКПК/ PBMC. В работах было продемонстрировано, что МКПК от уже больных доноров вырабатывают совершенно другой профиль цитокинов по сравнению с МКПК от здоровых доноров. Так, клетки МКПК от здоровых доноров, стимулированные бактериальным липосахаридом (E. coli LPS) вырабатывали больше IL-8 и меньше IL-6 и TNF-α, чем LPS-стимулированные клетки от больных с хроническим периодонтитом [4,5,6].

Таким образом, создание тест-систем для оценки цитокинового статуса крови пациента, имеющего или подозреваемого на развитие аутовоспалительного процесса, подбор оптимального лекарственного препарата для его лечения представляет актуальную проблему.

Известен способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью, включающий смешивание исследуемого вещества с фиксированным количеством триггера воспаления - человеческим ТNF-α и добавления этой смеси к культуре хондральных человеческих клеток, полученных из ткани пальцев шестипалых младенцев, способных отвечать на ТNF-α индукцию и ТNF-α ингибирование после криоконсервации [7]. Было показано, что такие хондральные клетки способны отвечать на ТNF-α стимуляцию продукцией молекул медиаторов воспаления IL -6 и IL -8.

Эту тест-систему можно использовать для исследования противовоспалительной активности веществ при заболеваниях, патогенез которых связан с поражением хрящевой ткани. Однако для исследования крови пациентов при аутовоспалительных заболеваниях, связанных с активацией инфламмасом, данная тест-ситсема не применима. Способ взят нами за прототип.

Целью изобретения является создание гемотест-системы для оценки цитокинового статуса крови пациентов, анализа противовоспалительной активности препаратов.

Эта цель достигается тем, что гемотест-система включает 96-луночный планшет, вакуумную пробирку для забора цельной крови у людей с предполагаемыми заболеваниями аутовоспалительной природы, культуральную среду RPMI, вторичный триггер воспаления; осуществляют забор цельной крови в вакуумную пробирку, переносят её в центрифужную пробирку, разбавляя в ней кровь культуральной средой RPMI, берут три аликвоты разбавленной крови, создавая три реакционные смеси – контрольную, в которую дополнительно вносят 0,9% физиологический раствор; стимулированную, в которую добавляют вторичный триггер воспаления и нейтрализованную, в которую наряду с вторичным триггером воспаления вносят исследуемое вещество, ингибирующее действие активации инфламмасомного воспаления; высеивают в планшет и культивируют при 5% СО2 и 37°С; инкубируют, собирают среды из лунок и сравнивают в них уровень продукции молекул-медиаторов воспаления, оценивая противовоспалительную активность крови и исследуемого вещества.

Гемотест-система исследует цельную кровь пациентов, подозреваемых на наличие заболеваний аутовоспалительной природы. В случае такого заболевания их клетки крови уже сенсибилизированы первичным триггером. В приведённых ниже исследованиях мы исследовали кровь здоровых людей и пациентов с лабораторно подтверждённым диагнозом подагра.

В качестве вторичных триггеров воспаления в состав гемотест-системы могут входить любые вторичные сигнальные молекулы DAMPs [2]. Вторичные триггеры ответственны за активацию инфламмасом и включение сигнального каскада синтеза медиаторов воспаления, включая воспалительные цитокины, хемокины и другие. Мочевая кислота является одним из хорошо-изученных вторичных триггеров аутовоспаления, контролирующих активацию инфламмасомы NLRP3 [8]. В приведённых ниже исследованиях в качестве вторичного триггера в составе гемотест-системы мы использовали мочевую кислоту.

Разбавление крови культуральной средой RPMI позволяет максимально сохранить популяционный набор клеток крови, которые уже были сенсибилизированы первичным триггером in vivo.

Взятые три аликвоты разбавленной крови помогают сформировать в составе гемотест-системы три реакционные смеси – контрольную, в которую дополнительно вносят 0,9% физиологический раствор; стимулированную, в которую добавляют вторичный триггер воспаления и нейтрализованную, в которую наряду с вторичным триггером воспаления вносят исследуемое вещество, ингибирующее действие активации инфламасомного воспаления.

В приведённом ниже исследовании в качестве исследуемого вещества мы изучали колхицин.

Гемотест-система включает 96-луночный планшет, вакуумную пробирку для забора цельной крови у людей с предполагаемыми заболеваниями аутовоспалительной природы, культуральную среду RPMI, вторичный триггер воспаления; осуществляют забор цельной крови в вакуумную пробирку, переносят её в центрифужную пробирку, разбавляя в ней кровь культуральной средой RPMI, берут три аликвоты разбавленной крови, создавая три реакционные смеси – контрольную, в которую дополнительно вносят 0,9% физиологический раствор; стимулированную, в которую добавляют вторичный триггер воспаления и нейтрализованную, в которую наряду с вторичным триггером воспаления вносят исследуемое вещество, ингибирующее действие активации инфламмасомного воспаления; высеивают в планшет и культивируют при 5% СО2 и 37°С; инкубируют, собирают среды из лунок и сравнивают в них уровень продукции молекул-медиаторов воспаления, оценивая противовоспалительную активность крови и исследуемого вещества.

Предварительно в рамках исследования цитокинового статуса для сравнительного анализа уровня цитокина ИЛ-18, освобождаемого при активации инфламмосом при подагре нами были выбраны потенциально здоровые доноры с разными концентрациями мочевой кислоты (МК) (195 -374 мкмол/л) и пациенты с ранее лабораторно подтвержденным диагнозом «подагра», у которых на момент исследования концентрация мочевой кислоты в сыворотке варьировала от 405 до 498.3 мкмол/л.

ИФА анализ в сыворотках продемонстрировал повышенные концентрации ИЛ-18 в сыворотках больных подагрой по сравнению со здоровыми донорами (Фигура 2) и выявил четко выраженные различия в продукции ИЛ-18 при использовании гемотест-системы у больных и здоровых доноров (Фигура 3). Была подтверждена зависимость повышения содержания в крови пациентов с высоким содержанием мочевой кислоты уровня цитокина ИЛ-18.

На Фигуре 4 представлен анализ продукции инфламмасомо-регулируемого цитокина IL-18ИЛ-18 в культуральной среде, содержащей клетки крови здоровых доноров (Д) и пациентов с подагрой (П) без добавления МК (0 МК) и в присутствии мочевой кислоты (МК). Было показано, что сенсибилизированные клетки крови пациентов с подагрой (П) продуцировали значимо большее количество инфламмасомо-регулируемого ИЛ-18 по сравнению со здоровыми донорами (Д).

Примеры работы гемотест-системы для анализа эффективности исследуемого вещества продемонстрированы на Фигуре 5 и Фигуре 6.

На Фигуре 5 представлено исследование крови у больных подагрическим артритом. На Фигуре 6 исследование крови у пациентов с шизофренией.

К аутовоспалительным заболеваниям смешанного типа относятся многие психиатрические заболевания, включая шизофрению [9]. Известно, что в период обострения шизофрении уровень мочевой кислоты в сыворотке крови больных значимо выше, чем в стабильной фазе. Была обнаружена статистически значимая корреляция между уровнем мочевой кислоты в сыворотке пациентов и шкалой PANSS после 1 месяца лечения. [10,11].

В обоих примерах применения гемотест-системы исследовали в качестве вещества, ингибирующего действие активации инфламмасомного воспаления колхицин. А в качестве вторичного триггера использовали мочевую кислоту.

Брали три аликвоты разбавленной крови в соответствии с представленным способом и формировали три реакционные смеси – контрольную (0), в которую дополнительно вносили 0,9% физиологический раствор; стимулированную, в которую добавляли вторичный триггер воспаления – мочевую кислоту (МК) и нейтрализованную, в которую наряду с вторичным триггером воспаления вносили исследуемое вещество (МК+колхицин), ингибирующее действие активации инфламмасомного воспаления (Фигуры 5 и 6).

В первом примере было доказано, что колхицин достоверно ингибирует инфламмасомо-регулируемую продукцию цитокина ИЛ-1β у пациента с аутовоспалительным заболеванием – подагрическим артритом (Фигура 5).

Во втором примере было доказано, что колхицин достоверно ингибирует инфламмасомо-регулируемую продукцию цитокина ИЛ-18 у пациента с аутовоспалительным заболеванием – шизофренией (Фигура 6).

Таким образом, предлагаемая гемотест-система и принципы ее работы могут использоваться в фармацевтике для поиска новых лекарственных препаратов, сравнения биологической активности дженериков, биоаналагов, контрафактной продукции и в персонифицированной медицине, в частности для оценки цитокинового статуса крови пациентов, выявления у них аутовоспалительных заболеваний, оценки эффективности веществ, ингибирующих действие активации инфламмасомного воспаления.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Seok JK, Kang HC, Cho YY, Lee HS, Lee JY. Regulation of the NLRP3 Inflammasome by Post-Translational Modifications and Small Molecules. Front Immunol. 2021;11:618231. Published 2021 Feb 2. doi:10.3389/fimmu.2020.618231.

2. Land WG. The Role of Damage-Associated Molecular Patterns in Human Diseases: Part I - Promoting inflammation and immunity. Sultan Qaboos Univ Med J. 2015 Feb;15(1):e9-e21. Epub 2015 Jan 21. PMID: 25685392; PMCID: PMC4318613.

3. Martinon F, Petrilli V, Mayor A, Tardivel A, Tschopp J. Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome. Nature. 2006;440(7081):237 –41.

4. Gonçalves TO, Costa D, Brodskyn CI, et al.Release of cytokines by stimulated peripheral blood mononuclear cells in chronic periodontitis. Arch OralBiol.2010;55(12):975-980.doi:10.1016/J.ARCHORALBIO.2010.08.002

5. Nikolaos Antonakos, Thomas Tsaganos, Volker Oberle, et al. Decreased cytokine production by mononuclear cells after severe gram-negative infections: Early clinical signs and association with final outcome.Critical Care. 2017; 1 (21):1–10. doi:10.1186/s13054-017-1625-1

6. Schirmer M, Smeekens SP, Vlamakis H, et al. Linking the Human Gut Microbiome to Inflammatory Cytokine Production Capacity. Cell. 2016;167(7):1897. doi:10.1016/j.cell.2016.11.046].

7. Патент РФ на изобретение № 2683277 от 27.03.2019 «Способ использования хондральных клеток для скринирования веществ, обладающих противовоспалительной активностью»

8. Braga TT, Forni MF, Correa-Costa M, et al. Soluble Uric Acid Activates the NLRP3 Inflammasome. Sci Rep. 2017;7:39884. Published 2017 Jan 13. doi:10.1038/srep39884.

9. Hylén U, Eklund D, Humble M, Bartoszek J, Särndahl E, Bejerot S. Increased inflammasome activity in markedly ill psychiatric patients: An explorative study. J Neuroimmunol. 2020;339:577119. doi:10.1016/j.jneuroim.2019.577119

10. Cavalcanti NG, Marques CD, Lins E Lins TU, Pereira MC, Rêgo MJ, Duarte AL, Pitta Ida R, Pitta MG. Cytokine Profile in Gout: Inflammation Driven by IL-6 and IL-18? Immunol Invest. 2016 Jul;45(5):383-95. doi: 10.3109/08820139.2016.1153651. Epub 2016 May 24. PMID: 27219123.

11. Borovcanin MM, Janicijevic SM, Mijailovic NR, Jovanovic IP, Arsenijevic NN, Vesic K. Uric Acid Potential Role in Systemic Inflammation and Negative Symptoms After Acute Antipsychotic Treatment in Schizophrenia. Front Psychiatry. 2022 Feb 14;12:822579. doi: 10.3389/fpsyt.2021.822579.

Изобретение относится к биотехнологии и персонализированной медицине. Предложен способ использования гемотест-системы in vitro для выявления цитокинового статуса крови с предполагаемыми заболеваниями аутовоспалительной природы и противовоспалительной активности исследуемого вещества, включающий исследование уровня молекул-медиаторов воспаления в культуральных средах, содержащих клетки крови после их инкубирования с триггером воспаления, смесью триггера и исследуемого вещества. Изобретение может использоваться в фармацевтике для поиска новых лекарственных препаратов, сравнения биологической активности дженериков, биоаналагов, контрафактной продукции и в персонифицированной медицине, в частности для оценки цитокинового статуса крови пациентов, выявления у них аутовоспалительных заболеваний, оценки эффективности веществ, ингибирующих действие активации инфламмасомного воспаления. 6 ил.

Способ использования гемотест-системы in vitro для выявления цитокинового статуса крови с предполагаемыми заболеваниями аутовоспалительной природы и противовоспалительной активности исследуемого вещества, включающий исследование уровня молекул-медиаторов воспаления в культуральных средах, содержащих клетки крови после их инкубирования с триггером воспаления, смесью триггера и исследуемого вещества, отличающийся тем, что осуществляют забор цельной крови у людей с предполагаемыми заболеваниями аутовоспалительной природы в вакуумную пробирку, переносят её в центрифужную пробирку, разбавляя в ней кровь культуральной средой, берут три аликвоты разбавленной крови, создавая три реакционные смеси – контрольную, в которую дополнительно вносят 0,9% физиологический раствор; стимулированную, в которую добавляют вторичный триггер воспаления, и нейтрализованную, в которую наряду с вторичным триггером воспаления вносят исследуемое вещество, ингибирующее действие активации воспаления; высеивают в планшет и культивируют при 5% СО₂ и 37°С; инкубируют, собирают среды из лунок и сравнивают в них уровень продукции молекул-медиаторов воспаления, выявляя цитокиновый статус крови и противовоспалительную активность исследуемого вещества.