ПРИМЕНЕНИЕ МЕЛАТОНИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ МУКОЗИТА Российский патент 2016 года по МПК A61K31/4045 A61K9/10 A61P1/04 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей мелатонин (N-ацетил-5-метокситриптамин) или его производные в концентрации 2,5%-5% масса/объем (масс./об.), для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения мукозита. Мукозит предпочтительно вызван лучевой терапией и/или химиотерапией. Изобретение, таким образом, может относиться к области медицины.

Уровень техники

Лечение злокачественных опухолей с применением лучевой терапии или химиотерапии, или их сочетания, становится все более эффективным, однако оно связано с краткосрочными и долгосрочными побочными эффектами. В число этих побочных эффектов входят нарушения функции и целостности слизистой оболочки полости рта. Последствия включают серьезное изъязвление (мукозит) и грибковую суперинфекцию ротовой полости (кандидоз, стоматомикоз). Эти осложнения, вызванные заболеванием и методами его лечения, включают боль при глотании, дисфагию, недостаточное питание, задержки введения химиотерапевтических средств, перебои в режиме лучевой терапии, потерю эффективности методов лечения онкологических заболеваний, длительные госпитализации, увеличение затрат на лечение и у некоторых пациентов потенциально летальные инфекции (сепсис).

Мукозит является воспалительной реакцией, затрагивающей весь желудочно-кишечный тракт от ротовой полости до ануса, и он является одним из основных неблагоприятных побочных эффектов химиотерапии и/или лучевой терапии и трансплантации костного мозга. Мукозит также может быть вызван химическими веществами, такими как кортикостероиды, иммуносупрессивные лекарственные средства (азатиоприн, циклоспорин A), вызывающие сухость во рту лекарственные средства, транквилизаторы, антидепрессанты, антигистаминные препараты, возбуждающие симпатомиметики, антипаркинсонические препараты, антипсихотические препараты, средства для лечения десен, гидантоины или антибиотики широкого спектра.

Мукозит слизистой оболочки полости рта (или оральный мукозит), вызванный ионизирующим излучением (также называемый радиационно-стимулированным мукозитом слизистой оболочки полости рта) и химиотерапевтическими средствами, в настоящее время является одной из основных проблем, связанных с терапией онкологических пациентов. 40% пациентов, получающих химиотерапию и/или лучевую терапию, и до 76% пациентов с трансплантатом костного мозга страдают от проблем с ротовой полостью, наиболее распространенными из которых являются: мукозит, местная инфекция, боль и кровотечение. У 97% пациентов с раком головы и шеи развивается мукозит в той или иной степени, и он также развивается у 100% пациентов, подвергающихся фракционированной лучевой терапии в течение длительного времени (Trotti A et al. Radiotherapy and Oncology 2003, 66: 253-262). Ионизирующие излучения вызывают повреждения за счет прямого и непрямого механизма действия. Прямой эффект обусловлен мутагенным действием излучения на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), тогда как непрямые механизмы действия (примерно 70% таких механизмов) обусловлены действием излучения на молекулы воды, приводящим к образованию свободных радикалов (Trotti A et al. Radiotherapy and Oncology 2003, 66: 253-262).

Согласно Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), различают несколько степеней тяжести мукозита в зависимости от симптомов. Степень 0: нормальное состояние; степень 1: генерализованная эритема, розовая, неболезненная слизистая оболочка с обильным слюноотделением, нормальный голос; степень 2: эритема, язвы не очень распространены, способность к глотанию твердых предметов; степень 3: эритема, отек или распространенное изъязвление, пациент способен глотать только жидкости, боль и затруднения при разговоре; степень 4: очень распространенное изъязвление, кровоточивость десен, инфекции, отсутствие слюны, очень сильная боль, энтеральное или парентеральное питание.

Мукозит возникает как последствие серии биологических событий, которые начинаются в подслизистой оболочке и прогрессируют к эпителию, они являются общими для мукозита, имеющего различные этиологии. При проведении лучевой терапии и химиотерапии было отмечено, что в первой фазе имеет место увеличение содержания активных форм кислорода (ROS) и повреждение ДНК. Активируются транскрипционные факторы, такие как ядерный фактор каппа-B (NF-kB). Повышается продукция провоспалительных цитокинов, включая интерлейкин-1 (IL-1) и фактор некроза опухоли альфа (TNFα), которые вызывают апоптоз и повреждение клеток. Эта воспалительная реакция приводит к повреждению слизистой оболочки с последующим образованием язв. Эти клетки будут колонизированы бактериями, и будут активированы макрофаги, продуцирующие больше цитокинов, ответственных за все повреждения тканей. На протяжении всего этого процесса сильно возрастает содержание свободных радикалов, которые способствуют усилению воспалительного процесса и повреждению клеток. Во второй фазе лучевая терапия и/или химиотерапия подавляют репликацию эпителиальных клеток, уменьшая обновление клеток. В третьей фазе колонизация бактериями и изъязвление поверхности продолжают возрастать, способствуя началу развития системной инфекции (Volpato L.E. et al. Mol Cancer Ther 2007, 6: 3122-3130). Мукозит представляет собой воспалительную патологию, которая не поддается лечению известными противовоспалительными средствами. Мукозит является процессом, в который может вмешиваться биохимический механизм, отличный от механизмов остальных воспалительных процессов, такой как путь образования инфламмасом (Escames G., et al. Hum Genet, июль 2011 г., DOI 10.1007/s00439-011-1057). В настоящее время не существует лечение, которое полностью излечивает мукозит или которое полностью предотвращает его возникновение.

Множество различных методов лечения было использовано до настоящего времени с целью лечения и предотвращения мукозита, которые в результате не приводили к полному избавлению от мукозита, например, описано лечение с использованием ацикловира, бензидамина, бета-каротина, фосфата кальция, полоскание аллопуринолом, алоэ вера, хлоргексидином, ромашкой, использование этопозида, фолиновой кислоты, глютамина, гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), нистатина, мизонидазола, повидона, пилокарпина, гематотоксифиллина, преднизона или сукралфата (Worthington H.V. et al. Cochrane Database Syst Rev. октябрь 2007 г., 17;(4) DOI: 10.1002/14651858.CD000978.pub3; Clarkson J.E. et al., Cochrane Database Syst Rev. август 2010 г., 4;(8)), DOI: 10.1002/14651858.CD001973.pub4.

Соответственно, существует потребность в средстве, которое позволит полностью излечивать и предотвращать мукозит, в частности, у пациентов, подвергающихся лучевой терапии и/или химиотерапии.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей мелатонин или его производное в концентрации 2,5-5% масс./об., для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения мукозита.

Приведены полученные in vivo результаты по защите слизистой оболочки полости рта от повреждений, вызываемых лучевой терапией или химиотерапией. Композиция по изобретению полезна для защиты слизистой оболочки полости рта, а также слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Настоящее изобретение свидетельствует о том, что более низкие концентрации, чем те, которые описаны для композиции по изобретению, не способны полностью излечивать мукозит, в то время как концентрации, равные или превышающие 3% масс./об., способны лечить и полностью излечивать мукозит, вызываемый ионизирующими излучениями. Приведены результаты при различных способах введения, при этом топический способ введения является способом, обеспечивающим наилучшую защиту от мукозита слизистой оболочки полости рта.

На основании описания, настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей мелатонин или его производное в концентрации 2,5-5% масс./об., для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения мукозита. Далее в настоящем документе она называется «композиция по изобретению».

«Концентрация 2,5-5% масс./об.» означает, что композиция содержит от 2,5 до 5 граммов мелатонина или его производного в 100 мл конечной композиции. Сокращение «масс./об.» означает масса/объем или вес/объем (вес/об.).

Предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда концентрация мелатонина или его производного составляет 3% масс./об. Таким образом, указанная предпочтительная композиция представляет собой композицию, содержащую 3 грамма мелатонина или его производного в 100 мл общего объема композиции. Далее в настоящем документе она называется «предпочтительная композиция по изобретению».

Любое соединение, охваченное общей формулой I, а также его фармацевтически приемлемые соли, сольваты или пролекарства, которые применимы для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения мукозита, понимается как «мелатонин или его производное».

Соединения общей формулы I имеют следующую структуру:

Формула (I)

где:

«n» представляет собой целое число от 1 до 4;

R₁ и R₃, идентичные или разные, представляют собой линейную или разветвленную (C₁-C₄) алкильную группу; и

R₂ представляет собой водород, линейный или разветвленный C₁-C₄ алкил, -C(=O)O-Ra группу или -C(=O)-N(H)-Ra группу, где Ra представляет собой линейную или разветвленную C₁-C₄ алкильную группу.

В настоящем изобретении термин «алкил» означает линейные или разветвленные алифатические цепи с 1-4 атомами углерода, например, метил, этил, н-пропил, и-пропил, н-бутил, трет-бутил, втор-бутил, н-пентил и так далее. Алкильная группа предпочтительно содержит от 1 до 2 атомов углерода. Более предпочтительно, она представляет собой метильную группу.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения R₁ и R₃ представляют собой метильную группу. Более предпочтительно, n равно 1, и еще более предпочтительно, R₂ представляет собой водород.

Термин «мелатонин» означает N-ацетил-5-метокситриптамин, также упоминаемый в литературе как мелатонин, мелатол, меловин, циркадин, регулин, ацетамид, N-ацетилметокситриптамин, 5-метокси-N-ацетилтриптамин, N-[2-(5-метокси-1H-индол-3-ил)этил]ацетамид или N-[2-(5-метоксииндол-3-ил)этил]ацетамид, или, если R₁ и R₃ представляют собой метильную группу в соединении общей формулы (I), n равно 1 и R₂ представляет собой водород. Регистрационный номер CAS для мелатонина 73-31-4.

Мелатонин является эндогенным нейрогормоном, который физиологически вырабатывается у животных, включая людей, шишковидной железой (epiphysis cerebri) и другими органами, такими как, например, желудочно-кишечный тракт, сетчатка, лимфоциты и клетки костного мозга.

Мелатонин вырабатывается у животных, включая людей, из серотонина (5-гидрокситриптамина, 5-ГТ), который, в свою очередь, образуется из аминокислоты триптофана. Таким образом, настоящее изобретение может также относиться к применению композиции, содержащей любой из предшественников мелатонина (5-ГТ, триптофан или промежуточные продукты, такие как N-ацетилсеротонин или NAS) в достаточной концентрации, так что они превращаются в организме человека в мелатонин, имеющий концентрацию, описанную в настоящем изобретении, для получения фармацевтической композиции для лечения и/или предотвращения мукозита.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтически приемлемым солям мелатонина или его производных, которые могут быть получены химическими методами, известными специалисту в данной области, например, путем реакции с кислотой в воде или в органическом растворителе, или в смеси из них обоих. В качестве органического растворителя можно использовать эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Примеры кислотно-аддитивных солей включают кислотно-аддитивные соли минеральных кислот, такие как, например, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, нитрат, фосфат, и кислотно-аддитивные соли органических кислот, такие как, например, ацетат, малеат, фумарат, цитрат, оксалат, сукцинат, тартрат, малат, манделат, метансульфонат и п-толуолсульфонат.

Используемый в настоящем документе термин «пролекарство» относится к химическому соединению, которое подверглось химической модификации, например, замене или добавлению дополнительной химической группы, для изменения любого из его физико-химических свойств, таких как растворимость или биодоступность, но без изменения технических характеристик исходной молекулы. Пролекарство может представлять собой, например, сложноэфирное, эфирное или амидное производное. Биодоступность означает его доступность в определенном биологическом компартменте.

В соответствии с данным изобретением термин «сольват» следует понимать как производное мелатонина, которое связано с другой молекулой, например, полярным растворителем, нековалентной связью. Примеры таких сольватов включают гидраты и алкоголяты, например, метаноляты.

Соли, сольваты и пролекарства можно получать с помощью методов, известных в данной области. Не фармацевтически приемлемые соли, сольваты или пролекарства также входят в объем изобретения, поскольку они могут быть полезны для получения фармацевтически приемлемых солей, сольватов или пролекарств.

Композиция по изобретению или предпочтительная композиция по изобретению может также означать композицию, содержащую функциональный биологический эквивалент мелатонина в концентрации, которая эквивалентна концентрации, описанной для композиции по изобретению.

Используемый в настоящем документе термин «функциональный биологический эквивалент» или «биоэквивалентный вариант» означает молекулу с теми же функциями, что и описанная молекула, которая может иметь небольшие вариации относительно описанной молекулы, без добавления указанными вариациями какого-либо дополнительного технического эффекта указанной молекуле. Таким образом, настоящее изобретение относится к вариантам мелатонина, обладающим такой же функцией и имеющим небольшие вариации, без добавления указанными вариациями какого-либо дополнительного технического эффекта мелатонину.

«Концентрация, которая является эквивалентной» означает такую концентрацию, которая необходима для того, чтобы функциональный биологический эквивалент мелатонина производил такой же эффект, как тот, который описан в настоящем изобретении для композиции по изобретению.

Мелатонин также вырабатывается растениями. Например, описано наличие мелатонина в водорослях, съедобных растениях, зернах, фруктах, семенах, корнях, стеблях, листьях и лекарственных травах (Paredes S.D. et al. J Exp Bot 20089, 60(1): 57-69). Например, описано наличие мелатонина в какао-бобах, винограде, помидорах, чае, зеленом чае, водорослях, зерне и оливках. Источником мелатонина в композиции по изобретению может быть растительный источник. Мелатонин из растительного источника (также известный как фитомелатонин) можно получать любым методом, известным специалисту в данной области для данной цели.

Источник мелатонина, используемого в композиции по изобретению, может также быть синтетическим. Мелатонин можно химически синтезировать с помощью методов, известных специалисту в данной области для данной цели.

Термин «фармацевтическая композиция» или «лекарственный препарат», относится к любому веществу, используемому для предотвращения, диагностики, облегчения, терапии или лечения заболевания у человека или животных. В контексте настоящего изобретения он относится к композиции, способной лечить и/или предотвращать мукозит.

В настоящем изобретении термин «лечение и/или предотвращение» относится как к терапевтическому, так и к профилактическому лечению или превентивным мерам. Ситуации, в которых применяют лечение, включают те, которые уже связаны с изменениями, а также те, в которых изменения предотвращаются. «Изменение» представляет собой любое состояние, которое может улучшаться в результате лечения композицией по изобретению, описанной в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «мукозит», главным образом, относится к заболеванию, связанному с воспалением слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, то есть, слизистой оболочки ротовой полости, глотки, пищевода, желудка и кишечника, и оно характеризуется тем, что оказывает влияние на целостность и функцию слизистой оболочки, что может приводить к ее изъязвлению и инфицированию. Мукозит может быть вызван различными причинами, в их числе лечение лучевой терапией, химиотерапевтическое лечение, трансплантация костного мозга или лечение лекарственными средствами.

Предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда мукозит вызван лучевой терапией и/или химиотерапией.

Лучевую терапию понимают как лечение, основанное на использовании ионизирующих излучений, способных ионизировать вещество, таких как рентгеновские лучи или радиоактивность, например, которая включает как гамма-лучи, так и альфа-частицы. Настоящее изобретение относится к лечению ионизирующими излучениями, используемыми при лечении рака, и включающему любое лечение, известное специалисту в данной области, приводящее к развитию мукозита.

Химиотерапию понимают как лечение, основанное на введении средства, которое вызывает подавление роста опухоли, и включающее любое лечение, известное специалисту в данной области, приводящее к развитию мукозита. Например, химическим веществом может быть метотрексат, прокарбазин, тиогуанин, меркаптопурин, цитарабин, фторурацил, флоксуридин, винбластин, винкристин, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, митрамицин, блеомицин, аспарагиназа или иринотекан.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда мукозит является мукозитом ротовой полости, глотки, пищевода, желудка или кишечника. Другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда мукозит является мукозитом слизистой оболочки полости рта.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда мукозит развивается у человека.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент или адъювант.

Термин «эксципиент» означает вещество, которое способствует абсорбции фармацевтической композиции или лекарственного средства по изобретению, стабилизирует указанную фармацевтическую композицию или вносит вклад в ее создание в том смысле, что придает ей определенную консистенцию или сообщает ей вкус и аромат, которые делают ее более приемлемой. Таким образом, эксципиенты могут иметь функцию объединения ингредиентов, такие как, например, крахмалы, сахара или целлюлозы; функцию подслащивания; функцию в качестве красителя; функцию защиты лекарственного средства, такую как, например, изоляция его от воздуха и/или влаги; функцию в качестве наполнителя для таблетки, капсулы или любой другой лекарственной формы, такие как, например, двухосновный фосфат кальция; функцию дезинтеграции для облегчения растворения компонентов и абсорбции их в кишечнике, не исключая эксципиенты другого типа, не упомянутые в данном параграфе. Эссенцию, такую как, например, эссенция корицы, лимона, апельсина, мандарина или ванили, можно добавлять для того, чтобы композиция по изобретению имела приятный вкус.

Термин «адъювант» означает любое вещество, усиливающее ответную реакцию на субстанцию лекарственного средства. В настоящем изобретении указанный термин означает любое вещество, которое усиливает эффекты композиции по изобретению; он может означать любой адъювант, известный специалисту в данной области.

Термин «фармацевтически приемлемый» относится к рассматриваемому соединению, одобренному и аттестованному с точки зрения того, что оно не наносит вред организму, в который его вводят.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда композиция дополнительно содержит гелеобразующее вещество. Гелеобразующее вещество предпочтительно выбирают из списка, включающего сополимеры полиэтилена и полипропилена, целлюлозу и гуаровую камедь. Оно предпочтительно является сополимером полиэтилена и полипропилена. На основании того, что описано в настоящем документе, другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда композиция представляет собой гель (или также называемый «гидрогель»).

Термин «гелеобразующее вещество» означает вещество, которое образует гель, то есть, трехмерную сетку, сформированную гелеобразующим веществом, и, как правило, содержит жидкую фазу. Гелеобразующее вещество, которое можно использовать, может быть веществом, известным специалисту в данной области и используемым для получения фармацевтической композиции. Например, из сополимеров полиэтилена и полипропилена можно использовать полоксамерные сополимеры (или полоксамер), например, средства, называемые плюроник^®, включая плюроник^® F127 (регистрационный номер CAS 9003-11-6) или плюроник^® F127NF.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда композиция дополнительно содержит по меньшей мере один консервант.

Консервант означает вещество, которое сохраняет свойства лекарственного средства, подавляя загрязняющие патогенные микроорганизмы; он может быть ионным или неионным консервантом. Используемый консервант будет нетоксичным, химически стабильным и будет совместимым с мелатонином. В качестве консервантов можно использовать консерванты, известные в данной области, например, консервант может представлять собой бензойную кислоту, натрия бензоат, аскорбиновую кислоту, калия сорбат, метилпарабен, этилпарабен или бутилпарабен. «Патогенные микроорганизмы» означают любую клетку, которая способна расти и размножаться в композиции по изобретению, например, бактерии, грибки и дрожжи.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда композиция дополнительно содержит антиоксидант.

Термин «антиоксидант» означает вещество, которое способно задерживать или предотвращать окисления. В качестве антиоксидантов можно использовать антиоксиданты, известные в данной области, например, токоферол, аскорбиновую кислоту, натрия аскорбат, виннокаменную кислоту, бутилгидроксианизол, лимонную кислоту, витамин A или витамин E.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда композиция дополнительно содержит по меньшей мере одну другую лекарственную субстанцию.

Используемые в настоящем документе термины «лекарственная субстанция», «активная субстанция», «фармацевтически активная субстанция», «активный ингредиент» или «фармацевтически активный ингредиент» означают любой компонент, который может потенциально проявлять фармакологическую активность или другой отличающийся эффект при диагностике, терапии, облегчении последствий, лечении или предотвращении заболевания, или который может влиять на структуру или функцию организма людей или других животных. Например, можно использовать аллопуринол.

Другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармакологически приемлемый носитель» относится к таким веществам или сочетаниям веществ, известным в фармацевтической области, которые используют в получении фармацевтических лекарственных форм и которые включают, но не ограничиваются ими, твердые вещества, жидкости, растворители или сурфактанты. Носитель может быть инертным веществом или иметь активность, подобно любому из соединений по настоящему изобретению. Функция носителя заключается в облегчении включения в состав композиции продукта экспрессии по изобретению, а также других соединений, создании возможности для лучшей дозировки и введения или в придании консистенции и формы фармацевтической композиции. Если лекарственная форма является жидкостью, носитель представляет собой разбавитель. Фармацевтически приемлемые носители, которые можно использовать по изобретению, могут представлять собой носители, известные специалисту в данной области, например, лизосомы, милликапсулы, микрокапсулы, нанокапсулы, губчатые материалы, миллисферы, микросферы, наносферы, милличастицы, микрочастицы и наночастицы.

Фармацевтическая композиция по изобретению может быть сформулирована для введения в виде множества различных форм, известных в данной области. Такие препараты можно вводить животному, и предпочтительно млекопитающему, и более предпочтительно человеку, различными способами, включая, но без ограничения, топический, пероральный, парентеральный, внутрибрюшинный, внутривенный, внутрикожный, внутриочаговый, внутриартериальный, внутримышечный, интраназальный или подкожный способ введения.

На основании того, что описано в настоящем документе, другой предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда композиция находится в лекарственной форме, подходящей для топического, перорального, внутрибрюшинного, внутрикожного или подкожного введения. Еще более предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда композиция находится в лекарственной форме, подходящей для топического введения.

Термин «топическое введение» в настоящем изобретении относится к композиции, наносимой на поверхность слизистой оболочки. Введение можно осуществлять на слизистую оболочку любой части пищеварительного тракта, предпочтительно на слизистую оболочку полости рта. Введение композиции по изобретению можно проводить путем промывания ротовой полости в течение нескольких минут так, что слизистая оболочка полости рта импрегнируется, и затем композиция может быть проглочена для импрегнирования и контакта со слизистой оболочкой всего желудочно-кишечного тракта.

В случае топического введения препараты композиции по изобретению, которые можно использовать, могут быть следующими: эмульсии типа масло-в-воде, эмульсии типа вода-в-масле, молочко, лосьоны, гели, помады, бальзамы, пены, масла для тела, мыло, пластинки, карандаши, паровые ингаляторы, кремы, жидкие мази, мази, сыворотки и муссы. Композиция также может быть заключена в твердую подложку, выбранную из группы, состоящей из гидрогелей, салфеток, пластырей и масок для лица.

Дозировка для получения терапевтически эффективного количества зависит от множества факторов, таких как возраст, вес, пол или, например, переносимость у конкретного животного, предпочтительно млекопитающего, и более предпочтительно человека. В том смысле, в котором оно употребляется в настоящем документе, выражение «терапевтически эффективное количество» означает фармацевтически эффективное количество композиции, которое производит желаемый эффект, и оно, как правило, будет определяться, в числе прочего, типичными характеристиками указанной фармацевтической композиции и желаемым терапевтическим эффектом.

Предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к применению в случае, когда введенная суточная доза составляет от 37,5 мг до 75 мг. Еще более предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда введенная суточная доза составляет 45 мг. Другой более предпочтительный вариант осуществления относится к применению в случае, когда дозу вводят в режиме по 15 мг 3 раза в сутки.

На всем протяжении описания и формулы изобретения слово «включает» и его варианты не должно подразумевать исключение других технических характеристик, добавок, компонентов или этапов. Для квалифицированных специалистов в данной области другие цели, преимущества и характерные особенности изобретения будут понятны частично из описания и частично из практики изобретения. Следующие примеры и чертежи приведены с иллюстративными целями и не должны ограничивать настоящее изобретение.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Уровни окислительного стресса в гомогенате языка крысы. Представлены данные по индексу перекисного окисления липидов (LPO) у контрольных крыс, облученных крыс и облученных крыс, получавших гель с 1%, 3% или 5% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости. Контрольная группа (C); облученная группа (IR); облученные группы, получавшие гель с 1%, 3% или 5% мелатонина (IR+мелатонин). MDA, малонилдиальдегид; 4-HDA, гидроксиалкенал; **p<0,01 и ***p<0,001 относительно C;∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 2. Уровни окислительного стресса в митохондриях языка крысы. Представлены данные по индексу перекисного окисления липидов (LPO) у контрольных крыс, облученных крыс и облученных крыс, получавших гель с 1%, 3% или 5% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости. Контрольная группа (C); облученная группа (IR); облученные группы, получавшие гель с 1%, 3% или 5% мелатонина (IR+мелатонин). MDA, малонилдиальдегид; 4-HDA, гидроксиалкенал; **p<0,01 и ***p<0,001 относительно C; ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 3. Уровни глутатиона в языке крысы. Приведены данные по уровням глутатиона у контрольных крыс, облученных крыс и облученных крыс, получавших гель с 1%, 3% или 5% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости. A, уровни восстановленного глутатиона (GSH); B, окисленного (GSSG); C, общий глутатион (GT); D, отношение (GSSG/GSH) в митохондриях языка у контрольных крыс (C), облученных крыс (IR) и крыс, получавших 1%, 3% и 5% мелатонина (IR+мелатонин). ***p<0,001 относительно C; ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 4. Активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы в митохондриях языка крысы. Представлены данные по активности: A, глутатионпероксидазы (GPx) и B, глутатионредуктазы (GRd), как для контрольных крыс, облученных крыс, так и для облученных крыс, получавших гель с 1%, 3% или 5% масс./об. мелатонина. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR) и облученные крысы, получавшие гель с 1%, 3% или 5% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости (IR+мелатонин). **p<0,01 и ***p<0,001 относительно C; ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 5. Макроскопическое изображение языка крысы после лечения композицией по изобретению. Представлены макроскопические изображения языка у контрольных крыс, облученных крыс и облученных крыс, получавших гель с 1%, 3% или 5% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости. Контрольные крысы, облученные крысы (IR) и облученные крысы, получавшие гель с 1%, 3% или 5% масс./об. мелатонина (IR+1% MT; IR+3% MT, и IR+5% MT, соответственно).

Фигура 6. Сравнение топического введения и внутрибрюшинного введения с точки зрения уровней глутатиона в языке крысы. Представлены данные по уровням глутатиона у контрольных крыс, облученных крыс и облученных крыс, получавших 3% масс./об. мелатонин топическим способом введения или 3% масс./об. мелатонин внутрибрюшинным (в/б) способом введения. A, уровни восстановленного глутатиона (GSH); B, уровни окисленного глутатиона (GSSG); C, уровни общего глутатиона (GT) и D, отношение GSSG/GSH в митохондриях языка крысы. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR), крысы, получавшие гель с 3% мелатонина (IR+3%), и крысы, получавшие мелатонин в/б (IR+в/б). ***p<0,001 относительно C;∗∗p<0,01 и ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 7. Активность и экспрессия GPx в языке у облученных крыс, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. A, активность GPx; B, денситометрический анализ вестерн-блота GPx; C, фотография вестерн-блота GPx в митохондриях языка у контрольных крыс (C), облученных крыс (IR), крыс, получавших гель с 3% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости (IR+3%) и получавших 3% масс./об. мелатонин в/б (IR+в/б). **p<0,01 и ***p<0,05 относительно C;∗∗ p<0,01 и ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 8. Активность и экспрессия GRd в языке у облученных крыс, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. A, активность GRd; B, денситометрический анализ вестерн-блота GRd и C, фотография вестерн-блота GRd в митохондриях языка у контрольных крыс (C), облученных крыс (IR), крыс, получавших гель с 3% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости (IR+3%) и получавших 3% масс./об. мелатонин в/б (IR+в/б). ***p<0,001 относительно C; ∗p<0,05 и ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 9. Активность комплексов CI, CII, CIII и CIV дыхательной цепи митохондрий в митохондриях языка у облученных крыс, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. A, комплекс I; B, комплекс II; C, комплекс III; D, комплекс IV. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR), крысы, получавшие гель с 3% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости (IR+3%) и получавшие 3% масс./об. мелатонин в/б (IR+в/б). *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001 относительно C; ∗,05 и ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 10. Экспрессия комплексов CI, CIII, CIV и CV дыхательной цепи митохондрий в языке, продемонстрированная методом вестерн-блоттинга, у облученных крыс, получавших гель с 3% мелатонина и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. A, денситометрия полосы вестерн-блота, соответствующей комплексу I; B, комплексу III; C, комплексу IV; D, комплексу V. E. Фотография полос вестерн-блота, соответствующих комплексам I, III, IV и V. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR), крысы, получавшие гель с 3% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости (IR+3%) и получавшие 3% масс./об. мелатонин в/б (IR+в/б). *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001 относительно C;∗p<0,05 и ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 11. Уровни мелатонина в митохондриях языка у облученных крыс, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR), облученные крысы, получавшие гель с 3% масс./об. мелатонина топическим нанесением в ротовой полости (IR+3% aMT), и облученные крысы, получавшие 3% масс./об. мелатонин, введенный в/б (IR+в/б). ***p<0,001 относительно C; ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 12. Макроскопическое изображение языка крысы после лечения композицией по изобретению, введенной внутрибрюшинным способом введения. Представлены макроскопические изображения языка у облученной крысы, получавшей 3% масс./об. мелатонин внутрибрюшинным способом введения.

Фигура 13. Экспрессия PGC-1α, NRF1 и TFAM, продемонстрированная методом вестерн-блоттинга, в гомогенате языка у облученных крыс, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. A, денситометрия полосы вестерн-блота, соответствующей PGC-1α; B, NRF1; C, TFAM; D, Фотография полос вестерн-блота, соответствующих PGC-1α, NRF1 и TFAM. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR), крысы, получавшие гель с 3% масс./об. мелатонина (+3% aMT) и получавшие мелатонин в/б (+в/б aMT). *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001 относительно C; ∗∗∗p<0,001 относительно IR.

Фигура 14. Экспрессия NFkB, продемонстрированная методом вестерн-блоттинга, в языке у облученных крыс, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. A, денситометрия полосы вестерн-блота, соответствующей NFkB в цитозоле; B, NFkB в ядре; C, Фотография полос вестерн-блота, соответствующих NFkB в цитозоле и NFkB в ядре. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR), крысы, получавшие гель с 3% масс./об. мелатонина (+3% aMT) и получавшие мелатонин в/б (+в/б aMT). ***p<0,001 и **p<0,01 относительно C; ∗∗p<0,01 относительно IR.

Фигура 15. Экспрессия NLRP3, ASC и каспазы 1, продемонстрированная методом вестерн-блоттинга, в гомогенате языка у облученных крыс, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. A, денситометрия полосы вестерн-блота, соответствующей NLRP3; B, ASC; C, каспазе 1 (касп. 1); D, Фотография полос вестерн-блота, соответствующих NLRP3, ASC и каспазе 1. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR), крысы, получавшие гель с 3% масс./об. мелатонина (+3% aMT) и получавшие мелатонин в/б (+в/б aMT). ***p<0,001 относительно C;∗p<0,05 относительно IR.

Фигура 16. Экспрессия IL-1 и TNF-α, продемонстрированная методом вестерн-блоттинга, в гомогенате языка у облученных крыс, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. A, денситометрия полосы вестерн-блота, соответствующей IL-1; B, TNF-α; C, Фотография полос вестерн-блота, соответствующих IL-1 и TNF-α. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR), крысы, получавшие гель с 3% масс./об. мелатонина (+3% aMT) и получавшие мелатонин в/б (+в/б aMT). **p<0,01 и *p<0,05 относительно C; ∗∗p<0,01 и ∗∗p<0,05 относительно IR.

Фигура 17. Экспрессия P53, Bax и Bcl2, продемонстрированная методом вестерн-блоттинга, в гомогенате языка у облученных крыс, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения. A, денситометрия полосы вестерн-блота, соответствующей P53; B, Bax; C, Bcl2; D, отношение Bax/Bcl2; E, Фотография полос вестерн-блота, соответствующих P53, Bax и Bcl2. Контрольные крысы (C), облученные крысы (IR), крысы, получавшие гель с 3% масс./об. мелатонина (+3% aMT) и получавшие мелатонин в/б (+в/б aMT). ***p<0,001, **p<0,01 и *p<0,05 относительно C; ∗∗∗p<0,001 и ∗∗p<0,01 относительно IR.

Примеры вариантов осуществления изобретения

Следующие конкретные примеры, приведенные в данном патентном документе, служат для иллюстрации сущности настоящего изобретения. Данные примеры включены исключительно с иллюстративными целями и не должны рассматриваться как ограничения изобретения, заявленного в настоящем документе. Таким образом, примеры, описанные ниже, иллюстрируют изобретение, не ограничивая область его применения.

Далее изобретение проиллюстрировано с помощью проведенных авторами изобретения тестов, отчетливо демонстрирующих полезность геля мелатонина при мукозите, и результаты приведены для различных концентраций.

A. Материалы и методы:

Композицию по изобретению вводили животным, используемым в экспериментах, различными способами введения и, кроме того, также проводили эксперименты с участием пациентов людей.

Для топического введения в ротовой полости используемой композицией был гидрогель (гель), который содержал 1%, 3% или 5% мелатонина (1, 3 или 5 граммов мелатонина в 100 мл конечного объема композиции, соответственно), и в котором в качестве гелеобразующего вещества использовали 20% раствор сополимеров полиэтилена и полипропилена. В качестве сополимеров полиэтилена и полипропилена использовали плюроник^® F127 (полоксамер). 0,3% раствор натрия бензоата использовали в качестве консерванта. Была использована 0,5% эссенция сладкого апельсина. Все использованные компоненты приобретали у компании FAGRON IBERICA, S.A.U., регистрационные номера: мелатонин, 33457-27; плюроник^® F127, 33353-SP; натрия бензоат, 31360-12; эссенция апельсина, 30620-08. Химическая структура мелатонина приведена ниже:

В качестве экспериментальных животных использовали крыс весом 280 г, их облучали ионизирующим излучением в контролируемых условиях в отделении экспериментальной радиологии Биомедицинского исследовательского центра университета Гранады. Животных подвергали облучению, в общей сложности, дозой 50 грей (Гр). Доза облучения, используемая каждый день, составляла 10 Гр, ее вводили в условиях 100,75 сГр/мин, 210 киловольт (кВ) и 12 миллиампер (мА), и животного помещали на расстоянии 40 см от источника излучения.

Животные получали различные препараты, как указано далее. Препарат наносили топически в ротовой полости перед облучением, еще раз после облучения, затем последовательно наносили каждые 8 часов в течение 21 дня. Животных умерщвляли через 21 день после начала облучения, когда наивысшая степень мукозита наблюдалась у облученных животных, не получавших мелатонин. Препараты, применяемые к экспериментальным животным, были следующими: гель плюроника F-127 с 1%, 3% или 5% мелатонина (1, 3 или 5 граммов мелатонина/100 мл геля, соответственно), наносимый три раза в сутки топически в ротовой полости в объеме 500 мкл/каждый раз, что в общей сложности составляло 1,5 мл/сутки. Топическое нанесение в ротовой полости означает, что животные глотали гель, нанесенный в ротовую полость.

Также проводили эксперименты с введением животным мелатонина в той же концентрации, которая была использована в случае 3% масс./об. гидрогеля, но внутрибрюшинным способом введения, для выяснения того, способен ли мелатонин в плазме уменьшать мукозит, или указанную молекулу следует наносить топическим способом. Для парентерального способа введения использовали изотонический раствор, содержащий 70% по объему (объем/объем) изотонического солевого раствора и 30% по объему пропиленгликоля, измеренные относительно общего объема раствора. Мелатонин в суточной дозе 45 мг вводили инъекциями в течение 21 дня. Животных умерщвляли через 21 день после начала облучения, как и животных, получавших гель с мелатонином топическим нанесением в ротовой полости.

Также оценивали защитное действие композиции 3% масс./об. мелатонина у пациентов с раком головы и шеи, подвергаемых лучевой терапии. Исследование было двойным слепым исследованием (5 пациентов получали гель с 3% масс./об. мелатонина и 5 пациентов получали только гель без мелатонина). Пациенты полоскали ротовую полость гелем, описанным выше, используя 500 микролитров геля три раза в сутки, то есть, пациенты получали в общей сложности 45 мг/сутки мелатонина в режиме по 15 мг 3 три раза в сутки. Пациенты держали гель с мелатонином в ротовой полости в течение 2 минут, а затем проглатывали его, так что гель мог импрегнировать всю слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта. Два еженедельных обследования проводили во время запланированного посещения врача для определения объективной степени орального мукозита (RTOG (группа онкологической лучевой терапии) шкала объективной токсичности, рекомендованная ВОЗ): степени 0-4.

B. Оцениваемые параметры

B.1. Маркеры окислительного повреждения

- Оценка окисления клеточной мембраны и субклеточной мембраны (LPO)

Очень важным механизмом, посредством которого свободные кислородные радикалы могут вызывать повреждение клеток, является перекисное окисление липидов как клеточных, так и митохондриальных мембран. Перекисное окисление липидов происходит в результате действия свободных радикалов на полиненасыщенные жирные кислоты. Эти изменения структуры клеточной мембраны вызывают изменения в ее физико-химических свойствах с увеличением проницаемости и прогрессивной потерей функций, что может приводить к последующей гибели клеток. Измеренная степень перекисного окисления липидов мембран всегда считалась очень важным параметром в качестве индикатора окислительного стресса. Индекс перекисного окисления липидов (LPO) получают путем количественного определения присутствующих в образце малонилдиальдегида и 4-гидроксиалкенала (MDA+4-HDA), которые являются важными продуктами распада пероксидов, образующихся из полиненасыщенных жирных кислот и родственных сложных липидов. Концентрации малонилдиальдегида и 4-гидроксиалкенала, а также концентрация гидропероксидов, определяют соответствующий индекс перекисного окисления липидов.

B.2. Оценка антиоксидантной защиты

В клеточной антиоксидантной системе существует группа ферментов, ответственных за нейтрализацию свободных радикалов в клетке в физиологических условиях, этими ферментами, в основном, являются:

- Глутатионпероксидаза (GPx): этот фермент использует восстановленный глутатион в качестве кофактора и утилизирует пероксид водорода (H₂O₂).

- Глутатионредуктаза (GRd): этот фермент обратно преобразует окисленный глутатион, полученный в результате активности глутатионпероксидазы, в восстановленный глутатион.

Соотношение, представляющее собой частное от деления количества окисленного глутатиона/количество восстановленного глутатиона (GSSG/GSH), также является важным соотношением для оценки состояния окисления-восстановления.

B.3. Оценка маркеров митохондриальной активности

Митохондриальная дисфункция, связанная с увеличением продукции свободных радикалов, является причиной гибели клеток. Вследствие этого, измерение активности комплексов дыхательной цепи митохондрий (I, II, III и IV) и экспрессии комплексов имеет основополагающее значение для определения степени повреждения митохондрий.

B.4. Митохондрии и окислительный стресс: активация инфламмасом:

Производство активных форм кислорода (ROS) возрастает в митохондриях, поврежденных излучением, вызывая окислительные изменения в митохондриальных компонентах и открытие митохондриальных временных пор (MTP). Проницаемость митохондриальной мембраны представляет собой точку невозврата в активации путей программируемой клеточной гибели, которые заканчиваются апоптозом или некрозом (Schroder K, et al. Cell. 2010; 140: 821-832; Latz E, Curr. Opin. Immunol, 2010; 22: 28-33. Электронная публикация 2010).

Недавние исследования показали, что митохондрии также регулируют врожденный иммунный ответ (Kastner D.L., et al. Eur J Immunol. 2010; 40: 611-615). Было отмечено, что свободные радикалы, образующиеся в митохондриях, ответственны за активацию клеточных воспалительных механизмов, в частности, так называемых инфламмасом, например, NLRP3 (член семейства NOD-подобных рецепторов, содержащий пириновый домен белок 3) (Zhou R., et al. Nature 2011; 469: 221-226). NLRP3 представляет собой белковый комплекс, опосредующий продукцию иммунного мессенджера IL-1 бета и воспаление.

Множество различных факторов могут активировать врожденный иммунный ответ, включая патогены или молекулы, вызывающие повреждение клеток в результате увеличения стресса. Когда NLRP3 активирован, он образует мультибелковый комплекс, состоящий из NLRP3, адаптерной молекулы ASC (апоптоз-ассоциированный крапчато-подобный белок, содержащий домен рекрутинга каспазы), а также прокаспазы-1. В ситуациях клеточного стресса NLRP3 рекрутирует белок ASC и прокаспазу 1, которая активирует каспазу-1, вызывая серию внутриклеточных реакций, включая активацию провоспалительных цитокинов.

B.5. Воспалительный ответ и NF-kB

Путь ядерного фактора каппа B (NF-kB) также участвует в воспалительном ответе. Отличие от инфламмасомы заключается в том, что путь NF-kB активируется через Toll-подобные рецепторы (TLR) на мембране, в то время как инфламмасома активируется через цитозольные NOD-подобные рецепторы (рецепторы, подобные нуклеотид-связывающему домену олигомеризации) (NLRs).

NF-kB и NLRP3 действуют совместно, активируя провоспалительные цитокины, такие как IL-1β. Параллельно, этот цитокин может вызывать повреждение митохондрий и увеличение продукции ROS, а ROS вызывают повреждение митохондриальной ДНК (мтДНК) и открытие MTP, приводящее к апоптозу.

Кроме того, NF-kB активирует экспрессию множества различных генов, вовлеченных в воспалительный ответ, таких как гены циклооксигеназы 2 (COX-2), индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) и сосудистых молекул адгезии (VCAM-1). Таким образом, облучение приводит к возрастанию числа провоспалительных молекул, способствующих апоптозу, и, таким образом, вызывающих начало мукозита.

B.6. Механизмы апоптоза:

Белки, регулирующие апоптоз, сгруппированы в антиапоптотические белки, такие как Bcl2 (белок 2 B-клеточной лимфомы), и проапоптотические белки, такие как Bax. Таким образом, отношение Bax/Bcl2 является очень важным отношением, поскольку оно непосредственно отражает уровень апоптоза. Белок p53 активирует ферменты репарации ДНК для исправления обнаруженного повреждения. Вхождение в апоптоз является конечным механизмом защиты, если повреждение ДНК не поддается исправлению, для предотвращения пролиферации клеток, содержащих аномальную ДНК. p53 активирует экспрессию проапоптотических генов, таких как ген BAX.

Таким образом, последствия повышенной продукции ROS в митохондриях, повреждений мтДНК и открытия MTP поддерживают воспалительный процесс, следовательно, лечение, направленное на инфламмасомы, может являться новым направлением в лечении воспалительных заболеваний, которые не поддаются лечению противовоспалительными средствами, как это происходит в случае вызванного лучевой терапией мукозита.

C. ПРИМЕР 1: Результаты, полученные в экспериментах с языком крысы

C.1 - Применение геля с мелатонином в концентрации 1%, 3% и 5% масс./об. топическим нанесением в ротовой полости

Окислительный стресс, вызванный облучением, явился причиной повреждения клеточных мембран, которое нашло отражение в возрастании окисления мембранных липидов более чем на 50% относительно контроля (фигура 1, p<0,001). Это повреждение указывает на то, что излучения повредили эти ткани, вызвав мукозит. Мелатонин в концентрации 3% полностью обращал вспять эффекты лучевой терапии, в то время как мелатонин в концентрации 1% лишь частично изменял уровни LPO. Использование мелатонина в концентрации, большей чем 3%, например, 5%, оказывало такое же действие, что и в случае концентрации 3%, с точки зрения противодействия окислительному стрессу (фигура 1).

Облучение также вызывало интенсивное повреждение митохондрий, что находило отражение в возрастании LPO в мембранах митохондрий (фигура 2). Это повреждение митохондрий вызывало гибель клеток (Acuna-Castroviejo et al. Curr Top Med Chem 2010, 11(2): 221-240). При лечении облученных крыс мелатонином сильный антиоксидантный эффект мелатонина наблюдали, когда его применяли в концентрации 3%, при этом полностью обращались вспять эффекты лучевой терапии (p<0,001) в митохондриях. В настоящее время неизвестны молекулы, которые способны оказывать подобное действие. Однако при нанесении мелатонина в концентрации 1% он не имел практически никакого эффекта противодействия окислительному повреждению, вызываемому облучением, в митохондриях. При использовании мелатонина в концентрации 5% он имел те же эффекты противодействия окислительному стрессу, что и в концентрации 3%.

Облучение также вызывало очень значительное снижение уровней GSH (p<0,001) (фигура 3A) в митохондриях языка, при том, что в то же время уровни GSSG (p<0,001) возрастали (фигура 3B), вызывая увеличение содержания общего глутатиона (GSH+GSSG) (фигура 3C). Эти изменения отражали значительное увеличение окислительного стресса митохондрий, что являлось отражением неблагоприятных эффектов, вызываемых облучением. Возрастание отношения GSS/GSH (p<0,001) (фигура 3D), которое является лучшим показателем внутриклеточного, и в данном случае внутримитохондриального окислительного стресса, поддерживало такое вредное воздействие облучения. В свою очередь, введение 1% мелатонина не было способно повысить уровни GSH (фигура 3A) и снизить уровни GSSG (фигура 3B), и не могло нормализовать отношение GSSG/GSH (фигура 3D), таким образом, нейтрализуя окислительный стресс. При использовании мелатонина в концентрации 5% он имел те же эффекты противодействия окислительному стрессу митохондрий, что и в концентрации 3%, полностью обращая вспять эффект облучения в обоих случаях.

При измерении активности глутатионпероксидазы (GPx) (фигура 4A) наблюдали возрастание активности, вызванное облучением, как ответ на возрастание количества продуцируемых пероксидов. Введение геля с 3% мелатонина частично противодействовало эффектам облучения. Мелатонин в концентрации 5% имел те же эффекты, что и в концентрации 3%, в то время как в концентрации 1% он не имел эффекта.

При измерении активности глутатионредуктазы (GRd) (фигура 4B) также наблюдали, что мелатонин в концентрации 5% имел те же эффекты, что и в концентрации 3%, в то время как в концентрации 1% он не имел эффекта. Митохондриальная GRd является ферментом, легко ингибируемым окислительным стрессом, и в результате ее активность значительно снижалась при облучении (фигура 4B, p<0,001), эффект, который обращался вспять введением мелатонина в концентрации как 3%, так и 5% (p<0,001).

Важность этого действия мелатонина основана на том, что в дополнение к вышеупомянутым биохимическим изменениям, уменьшение окислительного стресса митохондрий приводило к полному предотвращению мукозита, при этом никакой другой тип повреждений не наблюдался у получавших лечение крыс (фигура 5). Фотографии животных, получавших гель с 1% мелатонина, не включены, поскольку указанная концентрация не имела эффекта.

Таким образом, минимальная эффективная доза для лечения мукозита соответствует концентрации 3% мелатонина в геле, наносимом три раза в сутки (500 мкл при каждом нанесении), что составляет суточную дозу 45 мг мелатонина.

C.2 - Сравнение нанесения геля с 3% масс./об. мелатонина и введения мелатонина в той же концентрации парентеральным способом введения

Для определения наиболее подходящего способа введения для лечения мукозита сравнивали введение геля с 3% мелатонина топическим нанесением в ротовой полости и введение мелатонина в той же дозе (45 мг в сутки) внутрибрюшинным способом введения (в/б).

Было отмечено, что эффекты мелатонина, введенного с гелем, и мелатонина, введенного парентеральным способом введения, отличались в ряде ключевых аспектов, например, более низкой эффективностью в/б введения для восстановления уровня GSH и для снижения уровня GSSG, в результате чего сохранялось более высокое отношение GSSG/GSH, свидетельствующее о более высоком уровне внутримитохондриального окислительного стресса, чем после нанесения геля (фигура 6). На фигуре 6 приведено сравнение уровней глутатиона в языке у крыс, получавших 3% гель и получавших мелатонин внутрибрюшинным способом введения.

Что касается митохондриальной глутатионпероксидазы (GPx) (фигура 7), результаты свидетельствовали о возрастании активности (фигура 7A) и экспрессии фермента (фигуры 7B и 7C) в результате облучения, в качестве ответа на увеличение содержания продуцируемых пероксидов. Изучение экспрессии белка проводили методом вестерн-блоттинга (7C), и увеличение количества белка наблюдали при денситометрическом анализе этих вестерн-блотов (фигура 7B), что указывало на возрастание экспрессии указанного фермента при облучении. Как топическое введение, так и внутрибрюшинное введение мелатонина частично противодействовало эффекту облучения.

В случае митохондриальной глутатионредуктазы (GRd) (фигура 8) ситуация совершенно иная. Она представляет собой фермент, легко ингибируемый окислительным стрессом, и в результате ее активность (фигура 8A) и экспрессия (фигуры 8B и 8C) значительно снижались при облучении. Изучение экспрессии белка проводили методом вестерн-блоттинга (8C), и уменьшение количества белка при облучении наблюдали при денситометрическом анализе этих вестерн-блотов (фигура 8B), что указывало на ингибирование экспрессии указанного фермента. Наблюдали значительный эффект геля с мелатонином, приводящий к восстановлению активности и экспрессии GRd, в то время как внутрибрюшинное введение мелатонина было не способно восстановить фермент. При сохранении ингибирования GRd митохондрии не могли противодействовать окислительному повреждению и способствовали гибели клеток.

Облучение вызывало ингибирование комплексов цепи транспорта электронов в митохондриях, в основном, комплексов I, II и IV (фигуры 9A, 9B и 9D). Существенных изменений в комплексе III (фигура 9C) не наблюдали. При повреждении комплексов дыхательной цепи образуется больше свободных радикалов, эффективность дыхательной цепи снижается, продуцируется меньше ATP, апоптотические факторы активируются и апоптоз возрастает. Гель мелатонина являлся более эффективным для восстановления активности комплексов, чем парентеральное введение, даже увеличивая активность выше контрольных значений (фигура 9).

Как и в случае с активностью, облучение также ингибировало экспрессию комплексов дыхательной цепи, при этом ингибирование экспрессии комплексов I, III, IV и V (фигуры 10A, 10B, 10C, 10D и 10E) являлось весьма значительным. Результаты анализа методом вестерн-блоттинга продемонстрировали снижение количества белков комплексов I, III, IV и V, что указывало на снижение синтеза этих комплексов при облучении. Гель с мелатонином был гораздо более эффективным в восстановлении экспрессии комплексов, чем парентеральное введение. Кроме того, можно отметить, что парентеральное введение было совершенно неспособно восстанавливать экспрессию комплекса V или АТФ-синтазы, фермента, ответственного за синтез ATP (фигура 10D). Эти данные очень важны, поскольку, если комплекс V ингибируется, то отсутствует синтез АТФ, и в результате клетка погибает вследствие апоптоза или некроза (Escames G., et al. Hum Genet, июль 2011 г., DOI 10.1007/s00439-011-1057). Согласно приведенным результатам, композиция 3% геля была гораздо более эффективной, чем парентеральный способ введения, для реактивации экспрессии комплексов дыхательной цепи.

Было установлено, что облучение снижало уровни эндогенного мелатонина в языке. Указанные уровни восстанавливались при введении композиции по изобретению топическим нанесением в ротовой полости, способствуя проявлению местного антиоксидантного действия. Однако такие уровни не восстанавливались в языке при парентеральном введении мелатонина (фигура 11). Эти результаты объясняют, почему топическое введение является гораздо более эффективным, чем парентеральное введение мелатонина.

Эти различия в эффективности с точки зрения действия мелатонина в зависимости от способа введения отчетливо наблюдались при анализе макроскопических поражений (фигуры 5 и 12). Действительно, парентеральное введение мелатонина было неспособно восстанавливать повреждения языка после облучения, в то время как топическое нанесение в ротовой полости полностью нормализовало морфологический внешний вид языка.

C.3 - Данные по активации инфламмасом, воспалительному ответу и механизмам апоптоза

При измерении митохондриального биогенеза путем количественного определения PGC1α (коактиватор 1-альфа активируемых пролифератором пероксисом рецепторов-гамма), NRF1 (ядерный респираторный фактор 1) и TFAM (транскрипционный фактор A, митохондриальный) наблюдали, что облучение ингибировало PGC1α, однако было отмечено возрастание количества NRF1 и TFAM для компенсации митохондриальных повреждений (фигура 13).

Установлено, что облучение увеличивало активацию NF-kB, повышая уровни как в ядре, так и в цитозоле (фигура 14A и фигура 14B), и инфламмасомный путь активировался, увеличивая количества NLRP3, ASC и каспазы-1 (фигура 15). В результате активации пути NF-kB и инфламмасомного пути наблюдалось возрастание уровней провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF-α (фигуры 16A и 16B).

Митохондриальные повреждения также влекли за собой возрастание апоптоза, с увеличением количества проапоптотических белков p53 (фигура 17A) и Bax (фигура 17B), а также уменьшением количества антиапоптотических белков, таких как Bcl2 (фигура 17C). Следовательно, имело место увеличение отношения Bax/Bcl2 и уровня p53 (фигура 17D), что указывало на значительное возрастание апоптоза.

Это впервые, когда была продемонстрирована прямая связь митохондриальных повреждений, активации инфламмасом и вызываемого облучением мукозита.

В свою очередь, введение геля с 3% мелатонина нейтрализовало окислительный стресс, увеличивало активность и экспрессию антиоксидантных ферментов, повышало функцию митохондрий, уменьшало продукцию свободных радикалов, снижая активность NF-kB (фигуры 14A и 14B) и инфламмасом (фигура 15).

Таким образом, гель с 3% мелатонина существенно ингибировал апоптоз (фигура 17D), снижая количество индуцирующих апоптоз белков, таких как p53 и Bax (фигуры 17A и 17B), и увеличивая экспрессию антиапоптотических белков, таких как Bcl2 (фигура 17C).

Кроме того, гель с 3% мелатонина увеличивал биогенез митохондрий, повышая уровни PGC1α, который ингибировался облучением.

Все это приводило к увеличению выживаемости клеток. Более того, уровни мелатонина восстанавливались при введении геля топическим нанесением в ротовой полости, способствуя проявлению местного антиоксидантного действия.

Однако такие уровни не восстанавливались в языке при парентеральном введении мелатонина. Эти результаты объясняют, почему топическое введение гораздо более эффективно, чем парентеральное введение мелатонина.

Гистология также демонстрирует макроскопические поражения. Окрашивание гематоксилином-эозином использовали для определения наличия гистологических повреждений в изучаемых тканях. Трехцветное окрашивание по Массону-Голднеру (TRI) позволяет отличать мышечную ткань, которая окрашивается в красный цвет, от соединительной ткани, которая окрашивается в зеленый цвет.

У не подвергавшегося воздействию контрольного животного гистологическая структура языка не менялась. Полистратифицированный кератинизированный эпителий слизистой оболочки сохранялся с наличием нитевидных сосочков в дорзальной зоне и их отсутствием в вентральной зоне. Собственная пластинка слизистой оболочки и подслизистая оболочка, образованная небольшим слоем соединительной ткани и некоторыми сосудами, находились под слизистой оболочкой. Затем шли слои мышц, ориентированных в разных направлениях, с небольшим количеством соединительной ткани между пучками. Этот недостаток соединительной ткани был четко виден при окрашивании TRI, демонстрирующем наличие незначительного зеленого пятна между мышцами языка.

У облученных животных между мышечными волокнами имело место увеличение количества соединительной ткани (фиброз), разделяющей их. Также наблюдалось полнокровие сосудов и значительное увеличение числа сосудов (ангиогенез). В отличие от того, что наблюдалось у контрольного животного, в этом случае окрашенный в зеленый цвет фиброз был выражен гораздо сильнее. Это было особенно заметно в мышечном слое, где волокна были сокращены в поперечном направлении.

У животных, получавших мелатонин, наблюдалось уменьшение фиброза и ангиогенеза между мышечными волокнами языка, по сравнению с тем, что наблюдалось в языке у облученных животных. Это уменьшение фиброзной соединительной ткани лучше всего было видно при окрашивании методом TRI, поскольку она окрашивалась в зеленый цвет и четко отличалась от мышечных волокон, которые окрашивались в красный цвет. Что касается различия между двумя способами лечения, то гель с 3% мелатонина действовал более эффективно, чем парентеральное введение, поскольку фиброз был значительно менее выражен.

Все эти эффекты облучения приводили к повреждению митохондрий, что можно было наблюдать с помощью электронной микроскопии. У облученных животных можно было наблюдать митохондриальную вакуолизацию, а также разрушенные митохондрии, лишенные их содержимого, что вызывало возрастание количества свободных радикалов и воспалительного ответа.

У животных, получавших гель, разрушенных митохондрий не наблюдали и вакуоли исчезали. Однако разрушенные митохондрии наблюдали у крыс, получавших мелатонин парентеральным способом введения, как и у животных, не получавших лечение.

Таким образом, впервые было продемонстрировано, что мелатонин обеспечивает защиту слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта после лучевой терапии, предотвращая образование повреждений, вызываемых указанными излучениями, таких как мукозит, и излечивая указанные повреждения, при этом введение топическим способом было более эффективным, чем парентеральное введение. Важность этого действия мелатонина базировалась на уменьшении повреждения митохондрий, результатом чего становилось полное предотвращение мукозита, абсолютно никаких повреждений не наблюдалось у получавших лечение крыс на макроскопическом уровне или микроскопическом уровне.

D- ПРИМЕР 2: Результаты, полученные с участием людей:

Пациенты, получавшие гель с 3% мелатонина, переносили лучевую терапию намного лучше, им не требовалось лечение опиоидами. Ни один из этих пациентов не нуждался в назогастральном зонде, никто не был госпитализирован и никому не пришлось прерывать лечение. Все пациенты, не получавшие мелатонин, нуждались в значительном количестве опиоидов, и у всех развивался радиационный дерматит в максимальной степени. Некоторые были госпитализированы и прервали лечение.

E - Вывод из примеров изобретения:

Фармацевтическая композиция, содержащая 1% мелатонина, не оказывала влияния на мукозит, вызванный лучевой терапией. Однако фармацевтическая композиция, содержащая 3% мелатонина, полностью излечивала мукозит, вызванный лучевой терапией, как и композиция, содержащая 5% мелатонина. Эти результаты демонстрируют полезность композиции, содержащей от 3% до 5% мелатонина, в лечении побочных эффектов мукозита, вызванного лучевой терапией.

Приведенные в настоящем документе результаты демонстрируют, что при мукозите имеют место повреждения митохондрий и, таким образом, успех данного лечения основан на пероральном применении геля с мелатонином, который импрегнирует слизистую оболочку и устраняет повреждение митохондрий. Любой другой способ применения мелатонина не оказывает выраженного действия на мукозит, возможно, вследствие того, что мелатонин быстро абсорбируется, имеет очень короткий период полувыведения (30 минут) и не достигает достаточных терапевтических уровней в слизистой оболочке как в ротовой полости, так и в желудочно-кишечном тракте. Однако композиция по изобретению, представляющая собой гель плюроника F-127 и мелатонина в концентрации 3% или выше, импрегнирует слизистые оболочки, достигая эффективной локальной концентрации, что позволяет мелатонину проникать в митохондрии и проявлять свое действие во всем желудочно-кишечном тракте.

Вследствие этого, данные фармацевтические препараты для топического нанесения в ротовой полости, содержащие мелатонин в дозах, подходящих для защиты кожи и слизистой оболочки против сильных повреждений, вызванных излучениями во время лучевой терапии, представляют огромный клинический интерес. Было обнаружено, что парентеральное введение мелатонина не приносит никакой пользы в сравнении с топическим введением в ротовой полости для лечения и/или предотвращения мукозита, не считая того, что хроническое парентеральное введение является травматическим для данных пациентов, топическое же введение геля является гораздо более комфортным.

Митохондрии играют важную роль в контроле выживаемости клеток, и в настоящем документе впервые продемонстрировано, что митохондриальная дисфункция вносит значительный вклад в патофизиологию мукозита (см. результаты). Митохондриальная дисфункция коррелирует с ухудшением мукозита. Впервые установлено, что в митохондриях языка у крыс с мукозитом, в дополнение к биоэнергетическим нарушениям, имеет место возрастание уровней глутатионпероксидазы (GPx), снижение уровней глутатионредуктазы (GRd) и возрастание отношения окисленный глутатион (GSSG)/восстановленный глутатион (GSH) (GSSG/GSH). Последнее является точным маркером внутриклеточного и внутримитохондриального окислительного стресса.

Настоящее изобретение демонстрирует, что мелатонин в концентрации, содержащейся в композиции по изобретению, полностью ликвидирует окислительный стресс митохондрий при мукозите, увеличивая активность митохондриальных антиоксидантных ферментов, главным образом GRd. Параллельно, возрастает активность и экспрессия комплексов дыхательной цепи, которые ингибируются при мукозите. Композиция по изобретению имеет антиоксидантный и противовоспалительный эффекты, которые композиция с более низкой концентрацией не имеет. Топическое и пероральное нанесение мелатонина в концентрации от 3 до 5% (3 и 5 граммов мелатонина в 100 мл конечной композиции) предотвращает нарушение клеточной функции в слизистой оболочке, поврежденной ионизирующими излучениями.

Кроме того, топическое нанесение в ротовой полости геля с мелатонином является более эффективным при мукозите, чем парентеральное введение, что может быть обусловлено тем фактом, что нанесение в ротовой полости подходящего препарата поддерживает более высокие уровни мелатонина в течение более долгого периода времени в ротовой полости (и, как следствие, в желудочно-кишечном тракте), способствуя проявлению местного антиоксидантного и противовоспалительного действия и глубокого принципиального действия внутри митохондрий, предотвращая повреждение тканей и, как следствие, начало мукозита. Таким образом, топическое нанесение мелатонина в концентрации от 3% до 5% в ротовой полости представляет собой мощную систему защиты при данных патологиях. Показано, что композиция по изобретению позволяет защищать слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта при проведении лучевой терапии, предотвращая повреждения, вызываемые указанным излучением, такие как мукозит, и излечивая указанные повреждения. Полученные результаты могут быть экстраполированы на химиотерапию.

Настоящее изобретение относится к применению гелевой композиции, содержащей мелатонин или его соли в концентрации от 2,5% до 5% масс./об., для лечения и/или предотвращения мукозита, причём указанную гелевую композицию местно наносят на слизистую оболочку. Технический результат состоит в уменьшении окислительного стресса митохондрий, что приводит к полному предотвращению стоматита. Мукозит предпочтительно вызван лучевой терапией и/или химиотерапией и предпочтительно является оральным мукозитом. 11 з.п. ф-лы, 17 ил.

1. Применение гелевой композиции, содержащей мелатонин или его соли, в которой указанное соединение находится в концентрации от 2,5 до 5% масс./об., для лечения и/или предотвращения мукозита, где указанную гелевую композицию топически наносят на поверхность слизистой оболочки.

2. Применение по п. 1, где концентрация соединения составляет 3% масс./об.

3. Применение по любому из пп. 1, 2, где мукозит вызван лучевой терапией и/или химиотерапией.

4. Применение по любому из пп. 1, 2, где мукозит является мукозитом ротовой полости, глотки, пищевода, желудка или кишечника.

5. Применение по п. 4, где мукозит является мукозитом ротовой полости.

6. Применение по любому из пп. 1, 2, где мукозит развивается у человека.

7. Применение по любому из пп. 1, 2, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент или адъювант.

8. Применение по любому из пп. 1, 2, где композиция содержит гелеобразующее вещество.

9. Применение по п. 8, где гелеобразующее вещество выбрано из списка, включающего сополимер полиэтилена и полипропилена, целлюлозу и гуаровую камедь.

10. Применение по любому из пп. 1, 2, где композиция дополнительно содержит по меньшей мере один консервант.

11. Применение по любому из пп. 1-2, где композиция дополнительно содержит антиоксидант.

12. Применение по любому из пп. 1-2, где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.