СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРОТИВОРАКОВЫХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА КОЖУ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/71 

Данная заявка испрашивает приоритет преимущества по подаче предварительной заявки на патент США №62/950,624, поданной 19 декабря 2019 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам оценки потенциальной способности противораковых терапевтических средств вызывать побочные эффекты, связанные с кожей. Настоящее изобретение также относится к способам оценки эффективности композиции для снижения воздействия противораковых терапевтических средств на кожу.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Противоопухолевые терапевтические средства, направленные на пролиферативные клетки, часто связаны с кожными нежелательными лекарственными реакциями (кожные НЛР). Кожные НЛР встречаются у 45-100% пациентов, получающих ингибиторы киназы, и могут значительно влиять на качество жизни пациентов. На Фиг. 1a-1f представлены фотографии, иллюстрирующие примеры таких кожных нежелательных реакций, включая зуд (Фиг. 1а); сухую, шелушащуюся, потрескавшуюся кожу (Фиг. 1b); красную сыпь (Фиг. 1с); чувствительность к солнечному свету (Фиг. 1d); покраснение лица (Фиг. 1е); и повышенную сухость кожи рук (Фиг. 1f).

Кожные НЛР часто приводят к изменению дозы или прекращению приема лекарственного средства, что нарушает протокол лечения.

Противоопухолевые лекарственные средства снижают пролиферацию кератиноцитов и снижают их дифференциацию. См. Таблицу 1 ниже, а также Фиг. 2, которая представляет собой схему, демонстрирующую здоровую кожу и кожу, поврежденную в результате применения противоопухолевых лекарственных средств.

Эпидермис состоит из стратифицированного эпителия, в основном состоящего из кератиноцитов. Он обеспечивает первую защиту организма-хозяина от агрессоров из окружающей среды, включая патогены, и предотвращает обезвоживание путем контроля скорости потери воды через кожу. Этот барьер сильно зависит от процессов дифференциации кератиноцитов, от клеток базального слоя до терминальных корнеоцитов в роговом слое. Противоопухолевые терапевтические средства нацелены на пролиферативные клетки в основном с применением ингибиторов киназы. Поскольку эпидермальный эпителий обычно включает пролиферативные клетки, разумно предположить, что он также становится мишенью для таких видов терапии [1], процесс, который может привести к кожным нежелательным лекарственным реакциям (кожным НЛР) вследствие неправильной эпидермальной дифференциации, изменения кожного равновесия и дисфункции барьера [2].

Ингибиторы тирозинкиназы (TKi) нацелены на различные рецепторы фактора роста, такие как рецепторы эпидермального фактора роста (EGF), сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и фактора роста тромбоцитов (PDGF), а также рецептор EGF человека 2 (HER2). Сверхактивация этих путей в опухолях приводит к повышению пролиферации клеток, ангиогенеза и генетических отклонений, а также к подавлению апоптоза [3, 4]. У пациентов, которые первоначально отвечают на TKi, в течение 9-13 месяцев после начала терапии вырабатывается резистентность, обусловленная мутациями, что требует смены терапевтического режима для устранения появления таких мутаций [5, 6]. За первыми поколениями TKi, разработанными в начале 2000-х годов, последовала разработка второго и третьего поколений лекарственных средств для подавления появления мутаций в опухолевых клетках. Третье поколение EGFRi необратимо ингибирует EGFR, несмотря на появление мутации Т790М, способствуя улучшению выживаемости без прогрессирования и снижению кожных НЛР по сравнению со стандартной химиотерапией [7, 8].

Длительное лечение с помощью TKi также может напрямую влиять на пролиферативные кератиноциты на базальном уровне эпидермиса, снижая скорость роста клеток, миграцию клеток и способствуя апоптозу клеток, прикреплению клеток, дифференциации кератиноцитов и экспрессии провоспалительных цитокинов [9, 10]. В этом случае получаемое нарушение структуры эпидермиса и дисфункция кожного барьера могут коррелировать с клинически наблюдаемыми кожной сыпью, зудом, ксерозом, ладонно-подошвенным синдромом, изменениями состояния ногтей и волос. Такие кожные НЛР, также связанные с болью и вторичными инфекциями, проявляются у 45-100% пациентов, получающих лечение с применением TKi, и могут оказывать значительное влияние на качество жизни пациентов [5]. Для предотвращения развития более тяжелых симптомов необходимо медицинское обследование у дерматологов и онкологов для понимания природы и тяжести симптомов и площади пораженной поверхности тела. Может потребоваться корректировка дозы или даже прекращение приема лекарственного средства, что приводит к нарушению протокола противоопухолевой терапии [11]. Однако, как ни парадоксально, появление кожной сыпи во время лечения коррелирует с лучшей выживаемостью пациента [12].

В патенте США №10,092,495 компании Laboratoires Expanscience описан способ лечения рака кожи, включающий введение эффективного количества по меньшей мере одного сахара С7 или его производного.

В патенте США №10,175,230 компании Laboratoires Expanscience описан способ оценки эффективности сахара С7 или его производного в профилактике и/или лечении по меньшей мере одного недостатка кожного барьера субъекта.

В опубликованной заявке на патент США №20190242880 компании Laboratoires Expanscience описаны способы оценки эффективности составов in vitro в профилактике явлений обезвоживания кожи у детей.

Целью изобретения является предложение решений для интегрированного терапевтического подхода, направленного на улучшение качества жизни и обеспечение оптимальных результатов терапии лекарственным средством для пациентов, проходящих лечение лекарственным средством.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Поскольку путь EGFR является ключевым для эпидермальных кератиноцитов, разумно предположить, что ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста (EGFRi), нацеленные на карциномы, также влияют на эти клетки и, следовательно, препятствуют формированию эпидермальной структуры и нарушают функцию кожного барьера.

Для проверки этой гипотезы влияние EGFRi и ингибиторов рецепторов сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFRi) в терапевтически значимых концентрациях (3, 10, 30, 100 нМ) оценивали на маркеры пролиферации и дифференциации кератиноцитов человека в новой 3D-модели культуры ткани микроэпидермиса.

EGFRi непосредственно влияет на рост базальных кератиноцитов, что приводит к уменьшению размера ткани и переходу кератиноцитов из пролиферативного в дифференцирующий фенотип, о чем свидетельствует снижение окрашивания Ki67 и повышение экспрессии филаггрина, десмоглеина-1 и инволукрина. Эти эффекты приводят к нарушению кожного барьера, которое можно наблюдать в восстановленной модели эпидермиса человека, демонстрирующей снижение скорости трансэпидермальной потери воды. С другой стороны, ингибиторы панкиназы, в основном нацеленные на VEGFR, слабо влияют на дифференциацию кератиноцитов и скорее способствуют развитию пролиферативного фенотипа.

Это исследование способствует пониманию механики клинически наблюдаемой кожной НЛР во время терапии с применением EGFRi. Эти результаты, полученные в ходе исследования in vitro, свидетельствуют о конкретном способе действия EGFRi путем прямого воздействия на рост кератиноцитов и барьерную функцию.

Противоопухолевая терапия, и в частности применение EGFRi, непосредственно влияет на рост базальных кератиноцитов, что приводит к уменьшению размера ткани и переходу кератиноцитов из пролиферативного в дифференцирующий фенотип. Такие процессы способствуют нарушению барьера и ухудшению состояния кожи.

Считается, что поддержка кожного барьера может способствовать уменьшению кожных высыпаний/состояний, связанных с терапией.

Целью изобретения является предложение решений для интегрированного терапевтического подхода, направленного на улучшение качества жизни и обеспечение оптимальных результатов терапии лекарственным средством для пациентов, проходящих лечение лекарственным средством.

В соответствии с данным изобретением модель реконструированного эпидермиса человека (RHE), способная функционально воспроизводить нарушение барьера из-за противоопухолевого лечения, применяли для тестирования композиций, которые могут устранить влияние противораковых средств на структуру и функцию кожного барьера. На Фиг. 3а представлена фотография модели, а на Фиг. 3b представлена схема, иллюстрирующая оценку барьерной функции и биомолекулярных маркеров.

Чтобы оценить влияние таких терапевтических молекул на эпидермис, кератиноциты выращивали в присутствии ингибиторов киназы в течение 3 суток с высокой концентрацией кальция для достижения дифференциации кератиноцитов и получения 3D-стратифицированного дифференцированного эпидермиса. Воздействие лекарственного средства на развитие эпидермиса оценивали с помощью различных маркеров кератиноцитов, включая:

- Ki-67, универсально экспрессируемый белок в пролиферирующих клетках и отсутствующий в покоящихся клетках [13];

- филаггрин, взаимодействующий с филаментами белок, который связывается с кератиновыми волокнами и представляет собой маркер терминальной дифференциации [14];

- десмоглеин-1, компонент десмосом и маркер дифференциации, экспрессируемый во всем эпидермальном слое над базальным слоем [15]; и

- инволукрин, маркер ранней дифференциации, экспрессируемый в шиповатом и зернистом слоях, и белок-предшественник эпидермальной роговой оболочки [16].

ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг. 1a-1f представлены фотографии, иллюстрирующие примеры таких кожных нежелательных реакций, включая зуд (Фиг. 1а); сухую, шелушащуюся, потрескавшуюся кожу (Фиг. 1b); красную сыпь (Фиг. 1с); чувствительность к солнечному свету (Фиг. 1d); покраснение лица (Фиг. 1е); и повышенную сухость кожи рук (Фиг. 1f).

На Фиг. 2 представлена схема, демонстрирующая здоровую кожу и кожу, поврежденную в результате применения противоопухолевых лекарственных средств.

На Фиг. 3а представлена фотография модели реконструированного эпидермиса человека (RHE), а на Фиг. 3b представлена схема, иллюстрирующая оценку барьерной функции и биомолекулярных маркеров.

На Фиг. 4а-4f представлены графики, демонстрирующие, что афатиниб уменьшает размер эпидермиса и увеличивает маркеры дифференциации кожи. Микроэпидермис обрабатывали афатинибом в количестве 3, 10, 30 нМ. Физиологию микроэпидермиса оценивали путем количественного определения объема ткани, интенсивности экспрессии актина и интенсивности и локализации инволукрина, филаггрина и десмоглеина-1. * р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001.

На Фиг. 5а и 5b представлены графики, демонстрирующие влияние афатиниба на жизнеспособность клеток (Фиг. 5а) и апоптоз клеток (Фиг. 5b). А) Жизнеспособность кератиноцитов снижается после воздействия афатиниба. В) Афатиниб не вызывает апоптоз в кератиноцитах. Кератиноциты подвергали воздействию каждого из представленных условий в течение 24 ч. Процентные значения представляют относительный эффект по сравнению с носителем. Стауроспорин в концентрации 1 мкМ применялся в качестве положительного контроля и соответствовал 100% апоптоза клеток. Апостериорный тест Даннетта * р<0,05, **** р<0,0001.

На Фиг. 6 представлен график, демонстрирующий, что функция кожного барьера RHE ухудшается на 2-е сутки лечения афатинибом. Функцию кожного барьера оценивали путем измерения скорости трансэпидермальной потери воды. Местное нанесение вазелина на RHE применяли в качестве отрицательного контроля, а местное воздействие 0,5% раствора SDS на RHE применяли в качестве положительного контроля.

На Фиг. 7 представлен график, демонстрирующий влияние успокаивающего и восстанавливающего бальзама AVEENO® Restorative Skin Therapy Itch Relief Balm и восстанавливающего крема AVEENO® Restorative Skin Therapy Oat Repairing Cream на функции кожного барьера после лечения афатинибом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Материалы и способы

Определение несвязанной концентрации лекарственного средства в плазме

Был выбран диапазон воздействия лекарственного средства in vitro в терапевтически значимых концентрациях (3-100 нм) вместо микромолярного и миллимолярного диапазона, которые ранее применяли в литературе [17, 18]. Эти концентрации оказались более подходящими для изучения долгосрочного воздействия лечения на эпидермис. С помощью опубликованных исследований была определена максимальная концентрация лекарственного средства в плазме крови у здорового пациента после однократного приема рекомендованной суточной дозы лекарственного средства. Процент несвязанной фракции по отношению к белку плазмы определяли или рассчитывали с помощью максимальной концентрации C_max в плазме крови и процентного содержания несвязанной фракции в плазме. Связывание TKi с белками плазмы в исследовании варьировалось от 0,3% до 5%. Максимальная концентрация несвязанной формы препарата в плазме наблюдается для эрлотиниба (80 нМ; Togashi et al. 2010), а минимальная - для дакомитиниба (0,42 нМ; Giri et al. 2015). Равновесные константы диссоциации (K_D) EGFRi были представлены Claeger et al. [19]. Представлялось возможным сравнить EGFRi, применяемые в данном исследовании. Активность лекарственного средства EGFRi, включая афатиниб с K_D 2 нМ и эрлотиниб, лекарственное средство первого поколения, с K_D 2164 нМ (таблица 2). Неожиданно было обнаружено, что активность осимертиниба, третьего поколения EGFRi, не была снижена по сравнению с лекарственным средством второго поколения, таким как афатиниб, лапатиниб и дакомитиниб. K_D VEGFRi сравнивали с помощью литературы.

Биологические данные и данные активности VEGFRi и EGFRi. Данные о биологическом воздействии были собраны из информации, предоставленной вебсайтом dragcentral.org (доступ получен в ноябре 2019 г.). В контексте данного документа «серьезный кожный эффект» представляет собой наиболее частую кожную нежелательную реакцию, о которой сообщается в Системе сообщений о неблагоприятных событиях FDA. NSCLC: немелко клеточный рак легких. Данные о K_D лекарственного средства и определение концентрации в плазме после однократного введения дозы у человека в данном документе приводятся из литературы. Данные из Klaeger et al. 2017 были применены для сравнения K_D лекарственного средства для EGFRi. Несвязанная фракция лекарственного средства в плазме крови определялась в литературе как концентрация в наномолярном масштабе.

Получение лекарственного средства

Выбранные лекарственные средства, соответствующие значимым концентрациям в плазме (3, 10, 30, 100 нМ) после введения однократной дозы и при концентрации лекарственного средства 1 мкМ, получали из 10 мМ маточного раствора, растворенного в DMSO. Следовательно, конечная концентрация DMSO составляла 0,01% для наивысшей концентрации 1 мкМ. Носители состояли из того же объема DMSO, что и лечение лекарственным средством. Ацетаминофен применяли в качестве отрицательного контроля в той же пропорции DMSO.

Оценка функции кожного барьера

Влияние лекарственных средств на функцию кожного барьера оценивали путем измерения скорости трансэпидермальной потери воды (TEWL) на модели реконструированного эпидермиса человека (RHE) SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (Episkin, г. Лион, Франция) с применением Tewitro® TW 24 (Courage+Khazaka electronic GmbH, г. Кельн, Германия). Этот инструмент позволяет проводить 24 одновременные измерения на RHE. TEWL анализировали при 33°С в инкубаторе. Измерения проводили после стабилизации TEWL в течение 1 ч и усреднения измерений TEWL в течение 5 мин. Эксперименты проводили в трех повторностях, результаты нормировали до 100% к TEWL контроля. На поверхность RHE добавляли 0,5% раствор SDS в PBS для повреждения структуры эпидермиса и, следовательно, увеличения TEWL (положительный контроль). Вазелин, высокогидрофобный углеводород, который является водоотталкивающим и нерастворимым в воде, применяли для блокирования испарения воды с поверхности RHE (отрицательный контроль). Афатиниб добавляли в концентрации в среде 100 нМ и обновляли каждые 2 или 3 суток для моделирования продолжительного воздействия лекарственного средства. DMSO применяли в той же пропорции в носителе.

SkinEthic™ RHE (Episkin, г. Лион, Франция) представляет собой реконструированный in vitro эпидермис человека из нормальных кератиноцитов человека, культивируемых на инертном поликарбонатном фильтре на поверхности раздела воздух-жидкость в химически определяемой среде. Эта модель существует на разных стадиях созревания. Эта модель гистологически аналогична эпидермису человека in vivo. См. https://www.episkin.com/SkinEthic%20RHE.

Измерение трансэпидермальной потери воды в культивируемых образцах кожи

Tewitro® TW 24 представляет собой устройство, которое измеряет испарение воды из наборов культивируемых тканей (лунки на планшете со средой) до 24 лунок одновременно. См. https://www.courage-khazaka.de/en/16-wissenschartlicrie-produkte/alle-produkte/159-tewitro-e.

Протокол EpiScreen™

Клетки эпидермальных кератиноцитов человека (HPEK) от неполовозрелого донора европеоидной расы (CellnTec, Швейцария) культивируют в колбах в пролиферативной среде. Кератиноцины высевают на 6 пересев в планшеты EpiScreen™ (Abzena, г. Кембридж, Великобритания), содержащие покрытые коллагеном 1 дисковые микроузоры (CYTOO, г. Гренобль, Франция). Через четыре часа неприсоединенные клетки смывают и добавляют среду с высокой концентрацией кальция для стимулирования дифференциации кератиноцитов. На следующие сутки кератиноциты обрабатывают исследуемыми соединениями и добавляют трихостатин А в концентрации 0,3 мкМ в качестве внутреннего положительного контроля. Через трое суток лечения микроэпидермисы фиксируют 10%-м раствором формалина в течение 30 минут, затем пермеабилизируют с помощью 0,1% Triton. Проводят несколько иммуноокрашиваний: актин (Acti-Stain 555, PHDH1, Cytoskeleton), ядра (Hoechst, Н3570, Invitrogen) и один интересующий биомаркер на лунку - анти-инволукрин (НРА055211, Sigma), анти-филаггрин (НРА030189, Sigma) или анти-десмоглеин-1 (НРА022128, Sigma). Антитела добавляют на ночь при 4°С перед окрашиванием вторичным антителом, антителом к кроличьему иммуноглобулину 488 (711-545-152, Jackson), в течение 2 часов при комнатной температуре.

Получение и анализ изображений

Изображения каждой лунки получают с помощью платформы Operetta HCS (Perkin Elmer, г. Уолтем, штат Массачусетс, США) с применением объектива с 10-кратным увеличением в конфокальном режиме в восьми z-плоскостях от 2 мкм до 44 мкм с шагом 6 мкм в каждом из 3 каналов: актин, ядра и один интересующий биомаркер. Первая стадия анализа изображения заключается в обнаружении структур микроэпидермиса в первой z-плоскости путем сегментации окрашивания актина. Микроструктуры эпидермиса проверяют на основе нескольких критериев минимальной и максимальной площади и отклонения от круглости. Затем измеряют площадь окрашивания каждого биомаркера внутри действительных масок микроэпидермиса в каждой z-плоскости. Для всех однородных окрашиваний биомаркеров измеряют их интенсивность в различных плоскостях.

Реконструкция 3D-изображений микроэпидермиса

На основе 50 80 структур микроэпидермиса в лунке строят «среднее» 3D-изображение, отражающее фенотип микроэпидермиса в данной лунке. Структуры микроэпидермиса обнаруживают с помощью окрашивания актина в первой z-плоскости и выбирают на основе критериев площади и отклонения от круглости.

Актиновую сеть каждого микроэпидермиса анализируют в каждой z-плоскости для того, чтобы определить средние края 3D-структуры. Интенсивность биомаркера измеряют в каждой z-плоскости для каждой структуры, а затем усредняют с другими результатами, полученными в одной и той же лунке. На основании данных, полученных на двух предыдущих стадиях, генерируют среднее реконструированное 3D-изображение. Оно состоит из сетки, ограничивающей края структуры, и цветного масштабированного объема, соответствующего распределению и экспрессии биомаркеров.

Анализ жизнеспособности и пролиферации

Набор для колориметрической оценки пролиферации клеток на основе водорастворимых тетразолиевых солей (WST-8) (Promokine, г. Гейдельберг, Германия) обеспечивает быстрый и чувствительный способ количественной оценки пролиферации и жизнеспособности клеток. Пролиферация клеток вызывает увеличение количества образующегося формазанового красителя, которое можно количественно оценить путем измерения поглощения раствора красителя при 440 нм с помощью считывающего устройства для микротитровальных планшетов (Perkin Elmer En Vision 2103 Multilabel Reader, г. Уолтем, штат Массачусетс, США). Клеточная пролиферация вызывает увеличение активности митохондриальных дегидрогеназ, которые расщепляют тетразолиевую соль WST-1 на формазан. На 96-луночный планшет высевали 15 000 кератиноцитов на лунку, после достижения конфлюэнции концентрация лекарственного средства составляла +/- ½ log от плазматической концентрации. Добавляли 10 мкл из набора для колориметрической оценки пролиферации клеток и дополняли 360 мкл культуральной среды, результаты считывали через 4 ч при 450 нм для определения жизнеспособности клеток. Результаты получали от 6 доноров кератиноцитов в 2 экспериментах

Набор для флуорометрического анализа каспазы-3

Набор (Biotium, г. Фримонт, штат Калифорния, США) обеспечивает гомогенную систему анализа для быстрого и высокочувствительного обнаружения активности каспазы-3 путем флуоресценции в ферментативной реакции или клетках млекопитающих. Флуорогенный субстрат (Ac-DEVD)2-R110 содержит два тетрапептида DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) и полностью гидролизуется ферментом в двух последовательных стадиях. Расщепление первого пептида DEVD приводит к образованию промежуточного соединения монопептида Ac-DEVD-R110, которое имеет длину волны поглощения и излучения, аналогичную длине волны R110 (Ex/Em = 496/520 нм), но имеет только около 10% флуоресценции последнего. Гидролиз второго пептида DEVD высвобождает краситель R110, что приводит к значительному увеличению флуоресценции. Кератиноциты высевали в количестве 15 000 клеток на лунку в 100 мкл среды в 96-луночный черный микропланшет. Им давали прикрепиться и расти в течение ночи в инкубаторе при 37°С, 5% CO2. Затем их обрабатывали в течение 20 ч серией разведений 1:2 стауроспорина, индуктора каспазы-3 [20]. Визуализацию проводили на считывающем устройстве Perkin Elmer En Vision 2103 Multibeter Reader с длиной волны возбуждения 490 нм и длиной волны излучения 535 нм. Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин, защищая от света. Результаты получали от 6 доноров кератиноцитов в 2 экспериментах

Статистика

Данные представлены в виде средних значений +/- стандартного отклонения. Все эксперименты проводили в по меньшей мере трех повторностях. Статистический анализ проводили с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и t-критерия Стьюдента. Статистическая значимость разницы между двумя группами была принята на уровне р<0,05.

Результаты

Воздействие 8 онкологических молекул, выбранных из EGFRi первого поколения и ингибиторов панкиназы, которые в основном нацелены на VEGFR, и терапевтических средств второго и третьего поколений, нацеленных на основные мутации, связанные с резистентностью к лекарственным средствам первого поколения, оценивали in vitro с помощью 3D-модели микроэпидермиса. Концентрации инкубации лекарственного средства (3, 10, 30, 100 нМ) были выбраны для отражения клинически значимого (несвязанного) воздействия лекарственного средства (таблица 2). Влияние лекарственного средства оценивали путем анализа размера ткани и пролиферации кератиноцитов с помощью окрашивания Ki-67 и дифференциации кератиноцитов с помощью окрашивания филаггрина, десмоглеина-1 и инволукрина.

Увеличение размера микроэпидермиса и окрашивание Ki-67 с сопутствующим снижением экспрессии филаггрина, десмоглеина-1 и инволукрина рассматривали как предпролиферативный эффект исследуемой молекулы. С другой стороны, эффект преддифференциации определяли как уменьшение размера микроэпидермиса и окрашивания Ki-67, а также увеличение экспрессии филаггрина, десмоглеина-1 и инволукрина.

Ингибиторы панкиназы практически не влияют на структуру микроэпидермиса и маркеры дифференциации

Сунитиниб не влияет на размер эпидермиса, а сорафениб сильно уменьшает размер эпидермиса. Оба ингибитора панкиназы не влияют на экспрессию белков десмоглеина-1 и инволукрина и значительно снижают экспрессию белка филаггрина. Следует отметить, что такое воздействие ингибиторов панкиназы было достигнуто при концентрации 100 нМ, более низкие концентрации не влияли на маркеры, наблюдаемые в исследовании. Сунитиниб был единственным TKi, подвергшимся оценке, который не демонстрировал какой-либо токсичности при самой высокой испытываемой концентрации (1 мкМ). Эти результаты показывают, что VEGFRi оказывают предпролиферативное воздействие на кератиноциты.

EGFRi влияют на эпидермальную структуру и маркеры дифференциации

Большинство испытанных EGFRi (таблица 3), включая афатиниб, лапатиниб и дакомитиниб, демонстрировали воздействие на экспрессию десмоглеина-1, инволукрина и филаггрина в зависимости от дозы. Гефитиниб увеличивал в зависимости от дозы только экспрессию десмоглеина-1. Эрлотиниб и осимертиниб не влияли на экспрессию соединительных белков. Для всех испытанных EGFRi эпидермальная токсичность при концентрации 1 мкМ была значительной, влияющей на эпидермальное развитие настолько, что ткань становилась непригодной для дальнейшего анализа данных. (Таблица 3) При концентрации несвязанного лекарственного средства в плазме 3, 10 и 30 нМ все EGFRi первого и второго поколений демонстрировали снижение пролиферации кератиноцитов, размера микроэпидермиса и увеличение экспрессии белков десмоглеина-1, инволукрина и филаггрина, что свидетельствует об эффекте преддифференциации.

Физиология микроэпидермиса нарушается после воздействия EGFRi и VEGFRi.

Размер эпидермиса и экспрессию белкового соединения десмоглеина-1 (DSG1), инволукрина (IVL) и филаггрина (FLG) оценивали путем иммуноокрашивания и сравнивали с необработанным контролем. Лекарственные средства классифицировали по семейству и поколению лекарственных средств. Ответы на дозу определяли путем сравнения вариации экспрессии белка при концентрации 3, 10, 30 нМ для EGFRi и 3, 10, 30, 100 нМ для VEGFRi. * р<0,05 при 30 нМ (EFGRi) или 100 нМ (VEFGRi); ** р<0,01 при 30 нМ (EFGRi) или 100 нМ (VEFGRi) и *** р<0,001 при 30 нМ (EFGRi) или 100 нМ (VEFGRi).

Интересно, что осимертиниб, третье поколение EGFRi, разработанное для нацеливания на клетки, резистентные к лекарственным средствам, а также для обеспечения лучшей толерантности к лекарственному средству, оказался единственным EGFRi, который не продемонстрировал какое-либо воздействие на все параметры, за исключением клеточной токсичности, при более высокой концентрации (1 мкМ).

Афатиниб влияет на белковую экспрессию, жизнеспособность и пролиферацию кер атиноцитов

Лечение афатинибом (Фиг. 4а 4f) привело к значительному снижению объема эпидермиса в реконструированной 3D-модели микроэпидермиса по сравнению с носителем. Экспрессия инволукрина и десмоглеина-1 значительно увеличивалась при 3, 10, 30 нМ в зависимости от дозы, а экспрессия филаггрина значительно увеличивалась при 10 нМ и 30 нМ в зависимости от дозы. Более высокая концентрация лекарственного средства выше 1 мкМ была токсичной и приводила к некрозу эпидермиса.

Воздействие афатиниба на функцию эпидермального барьера оценивали на моделях RHE путем измерения скорости TEWL. Добавление вазелина (отрицательный контроль) приводило к значительному снижению скорости TEWL на 48%, 77%, 75% и 82% соответственно на сутки 1, 2, 5 и 7 после нанесения по сравнению с необработанным контролем. Поверхностно-активное вещество додецилсульфоксид натрия (SDS, в концентрации 0,5%, применяли в качестве положительного контроля) значительно повышало скорость TEWL на 98%, 77% и 58% соответственно на сутки 1, 2 и 5 после нанесения. На 7-е сутки после нанесения SDS наблюдали незначительное повышение скорости TEWL. Афатиниб значительно повышал скорость TEWL на 22% на 2-е сутки, в то время как на 5-е и 7-е сутки не наблюдалось значительного изменения.

Дополнительные результаты показывают, что афатиниб оказывал значительное воздействие на жизнеспособность клеток (Фиг. 5а) в зависимости от дозы. С другой стороны, афатиниб не демонстрировал какого-либо воздействия на апоптоз клеток при концентрации 2,59 нМ и 25,89 нМ (Фиг. 5b). В совокупности эти результаты показывают, что афатиниб нарушает жизнеспособность и пролиферацию кератиноцитов в модели микроэпидермиса, но не вызывает апоптоз кератиноцитов. Ацетаминофен, применяемый в качестве контроля, не продемонстрировал воздействия на какой-либо из измеренных параметров, включая клеточную токсичность, при концентрации 1 мкМ.

Для оценки способности успокаивающего и восстанавливающего бальзама AVEENO® Restorative Skin Therapy Itch Relief Balm и восстанавливающего крема AVEENO® Restorative Skin Therapy Oat Repairing Cream противодействовать воздействию лечения афатинибом на функцию кожного барьера были измерены емкость и скорость трансэпидермальной потери воды (TEWL).

Добавляют 36 мкл состава бальзама или крема и распределяют по всей поверхности RHE с помощью пипетки Пастера. Затем бальзам или крем стабилизируют в течение по меньшей мере 48 ч в сухом инкубаторе для удаления содержания влаги, чтобы не нарушить процедуру измерения TEWL.

Лекарственное средство в среде добавляют в соответствии с описанным выше протоколом и инкубируют RHE. В случае комбинации лекарственного средства и состава лекарственное средство необходимо добавлять по схеме Сутки + 1 после добавления состава с целью стабилизации состава в верхней части RHE. Бальзам содержит следующие ингредиенты:

• Активный ингредиент: Прамоксин HCl (0,5%)

• Неактивные ингредиенты: вода, глицерин, хлорид дистеарилдимония, вазелин, изопропил пальмитат, цетиловый спирт, пантенол, диметикон, мука из зерен овса (avena sativd), бензиловый спирт, цетил гидроксиэтилцеллюлоза, хлорфенезин, стеарет-20, экстракт из листьев алоэ барбаденсис, хлорид натрия, экстракт из зерен овса (avena sativd)

Крем содержит следующие ингредиенты:

• Вода, глицерин, хлорид дистеарилдимония, вазелин, изопропил пальмитат, цетиловый спирт, пантенол, диметикон, мука из зерен овса (avena sativd), бензиловый спирт, стеарет-20, экстракт из листьев алоэ барбаденсис, хлорид натрия, экстракт из зерен овса (avena sativd)

Результаты представлены на Фиг. 7.

Обсуждение

Появление TKi при лечении рака позволило успешно повысить уровень пятилетней выживаемости пациентов. С момента своего появления EGFRi и VEGFRi привели к значительному прогрессу в лечении различных солидных опухолей, а новое поколение значительно повысило их эффективность [21]. Нацеливаясь на пролиферативные клетки, противоопухолевые лекарственные средства могут спровоцировать развитие кожных НЛР, что потенциально нарушает протокол лечения и влияет на качество жизни пациента [7]. Механизмы, приводящие к кожным НЛР, все еще плохо изучены. До сих пор влияние TKi на кератиноциты все еще неизвестно, а опубликованные исследования касались только относительно высоких концентраций лекарственного средства без учета соответствующей концентрации в плазме, влияющей на кератиноциты продолжительным образом. Результаты, представленные в данной работе, впервые обеспечивают лучшее понимание способа воздействия противоопухолевой терапии на патофизиологию кожных НЛР.

Сунитиниб и сорафениб, два ингибитора панкиназы, главным образом нацеленные на VEGFRi, имеют несвязанные плазматические фракции 2 нМ и 23,6 нМ соответственно с равновесными константами диссоциации (K_D) 1,5 нМ и 59 нМ. Исследование на микроэпидермисе, проведенное в том же диапазоне концентраций, не оказало влияния на структуру эпидермиса, только экспрессия филаггрина была значительно повышена как для сунитиниба, так и для сорафениба. Следует отметить, что сунитиниб был единственным лекарственным средством в панели по изобретению, который не приводил к токсичности кератиноцитов при концентрации 1 мкМ. Можно предположить, что отрицательное воздействие VEGFRi на кожу потенциально может быть вызвано повреждением от васкуляризации кожи, нарушающей рост кератиноцитов [22]. Отсутствие воздействия с применением сорафениба в более высокой концентрации могло бы подтвердить гипотезу авторов изобретения.

И напротив, EGFRi явно влияет на рост кератиноцитов в базальном слое, что приводит к снижению объема эпидермиса в модели микроэпидермиса. Афатиниб приводит к снижению объема эпидермиса при 3 нМ. С другой стороны, афатиниб усиливал экспрессию десмоглеина-1, инволукрина и филаггрина, что указывает на то, что EGFRi способствует поздней терминальной дифференциации при уменьшении пролиферации кератиноцитов в базальном слое.

Было неожиданно обнаружено, что осимертиниб не влияет на развитие эпидермиса. Эти данные, а также высокое значение K_D (155 нМ) (Таблица 2) по сравнению с предыдущими поколениями лекарственных средств можно объяснить тем, что осимертиниб нацелен на основные мутации (Т790 и C797S), возникающие после длительного периода лечения лекарственными средствами первого и второго поколений. Следовательно, осимертиниб демонстрирует более высокое ингибирование мутированного рецептора по сравнению с рецептором дикого типа [23] и практически не воздействует на развитие микроэпидермиса в данном исследовании.

Афатиниб представляет собой необратимый ингибитор EGFRi, ассоциированный с самой низкой концентрацией несвязанной формы в плазме, C_max и K_D данной панели. См. структуру ниже.

Афатиниб влияет на все параметры исследования (т.е. размер эпидермиса, маркеры кожного барьера). Следовательно, был исследован ответ на дозу афатиниба (Фиг. 4а-4f) при концентрации 3, 10 и 30 нМ, соответствующей диапазону концентрации несвязанной формы в плазме для определения роста кератиноцитов в эпидермальном развитии. Размер микроэпидермиса значительно уменьшался при 3 и 30 нМ. Кроме того, инволукрин, десмоглеин-1 и филаггрин увеличивались в зависимости от дозы. В совокупности афатиниб влияет на все исследованные маркеры путем уменьшения пролиферации кератиноцитов в базальном слое и индуцирования дифференциации кератиноцитов, эффект, который оказывает измеримое воздействие на функцию кожного барьера.

Функциональные последствия воздействия афатиниба исследовали на барьерной функции на реконструированном эпидермисе (Фиг. 5а и 5b). Уровни TEWL значительно выросли на вторые сутки. Этот результат демонстрирует, что афатиниб быстро влияет на кожный барьер. Восстановление значений TEWL на 5-е сутки после воздействия на RHE афатинибом может быть связано с повышением экспрессии филаггрина, десмоглеина-1 и инволукрина, вызванным афатинибом, как описано выше. Сообщалось, что клинически симптомы кожных НЛР появляются в первые дни лечения, а затем исчезают и появляются вновь только через один-два месяца после непрерывного воздействия противоопухолевых лекарственных средств [24]. Результаты по изобретению, указывающие на то, что афатиниб вызывает ранний рост TEWL, согласуются с данным клиническим наблюдением. Позднее проявление кожных НЛР может быть связано со снижением пролиферации и клеточной усталостью.

Был проведен дополнительный анализ для выяснения влияния афатиниба на кератиноциты. Апоптотическая активность кератиноцитов не влияла на какую-либо из испытываемых доз, что указывает на то, что уменьшение размера эпидермиса не связано с апоптозом, а скорее связано с уменьшением количества клеток (Ошибка! Источник ссылки не найден). Все эти данные позволяют предположить, что кожные НЛР провоцируются пониженной пролиферацией кератиноцитов, нарушающей регенерацию кожи и приводящей к снижению размеров эпидермиса, а не индуцированием апоптоза кератиноцитов в эпидермисе.

В целом, при воздействии лекарственных средств кератиноциты быстро переходят от пролиферативного к дифференцирующему фенотипу в ответ на повреждающее воздействие. При более длительном периоде воздействия уменьшение количества предшественников кератиноцитов, способных обновлять эпидермис, может объяснить появление сыпи, сухости кожи, которые становятся заметными через несколько недель воздействия лекарственного средства.

Наконец, при новом поколении противоопухолевой терапии с использованием иммунотерапии также сообщалось о важных кожных НЛР, аналогичных возникающим при лечении малыми молекулами, нацеленными на TKi. Следовательно, лучшее понимание влияния таких лекарственных средств на физиологию кожи все еще необходимо для управления такими нарушениями для улучшения качества жизни пациента.

Выводы

Оценивали in vitro влияние молекул противоопухолевой терапии в концентрациях ниже токсического уровня на развитие эпидермиса. Эти соответствующие концентрации позволяют авторам изобретения продемонстрировать, что противоопухолевая терапия нарушает рост кератиноцитов и, следовательно, влияет на кожный барьер. Эти результаты обосновывают необходимость профилактики для поддержания функции кожного барьера во время противоопухолевой терапии и, следовательно, уменьшения появления таких кожных НЛР.

Следует понимать, что хотя различные аспекты настоящего описания были проиллюстрированы и описаны с помощью примеров, заявляемое в настоящем документе изобретение ими не ограничивается, но может быть реализовано иными различными способами в соответствии с объемом формулы изобретения, включенной в настоящую и/или любую родственную настоящей заявку на патент.

Перечень сокращений

Кожные НЛР кожные нежелательные лекарственные реакции

TKi - ингибиторы тирозинкиназы

EGFRi - ингибиторы рецепторов епидермального фактора роста

VEGFRi - ингибиторы рецепторов сосудистого ендотелиального фактора роста

3D - трехмерный

HER2 - рецептор епидермального фактора роста человека 2

C_max - максимальная концентрация

K_D - константа диссоциации

нМ - наномоляр

мкМ - микромоляр

DMSO - диметилсульфоксид

TEWL - трансэпидермальная потеря воды

RHE - реконструированный эпидермис человека

SDS - додецилсульфат натрия

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор

WST-8 - водорастворимые тетразолиевые соли

СО - стандартное отклонение

ММ - молекулярная масса

NSCLC - немелкоклеточный рак легкого

DSG1 - десмоглеин

IVL - инволукрин

FLG - филаггрин

Ссылки

1. Peus D, Hamacher L, Pittelkow MR. EGF-receptor tyrosine kinase inhibition induces keratinocyte growth arrest and terminal differentiation. J Invest Dermatol. 1997; 109: 751-6.

2. Tischer B, Huber R, Kraemer M, Lacouture ME. Dermatologic events from EGFR inhibitors: the issue of the missing patient voice. Support Care Cancer. 2017; 25: 651-60. doi:10.1007/s00520-016-3419-4.

3. Kwak EL, Shapiro GI, Cohen SM, Becerra CR, Lenz H-J, Cheng W-F, et al. Phase 2 trial of afatinib, an ErbB family blocker, in solid tumors genetically screened for target activation. Cancer. 2013; 119: 3043-51. doi: 10.1002/cncr.28120.

4. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011; 144: 646-74. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013.

5. Lacouture ME. Mechanisms of cutaneous toxicities to EGFR inhibitors. Nat Rev Cancer. 2006; 6: 803-12.

6. Gao X, Le X, Costa DB. The safety and efficacy of osimertinib for the treatment of EGFR T790M mutation positive non-small-cell lung cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 2016; 16: 383-90.

7. Takeda M, Nakagawa K. First-and second-generation EGFR-TKIs are all replaced to osimertinib in chemo-naive EGFR mutation-positive non-small cell lung cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2019;20:146. doi:10.3390/ijms20010146.

8. Goss G, Tsai C-M, Shepherd FA, Bazhenova L, Lee JS, Chang G-C, et al. Osimertinib for pretreated EGFR Thr790Met-positive advanced non-small-cell lung cancer (AURA2): a multicentre, open-label, single-arm, phase 2 study. Lancet Oncol. 2016; 17: 1643-52. doi:10.1016/S1470-2045 (16) 30508-3.

9. Kari C, Chan TO, Rocha de Quadros M, Rodeck U. Targeting the epidermal growth factor receptor in cancer: Apoptosis takes center stage. Cancer Res. 2003; 63: 1-5.

10. Mascia F, Mariani V, Girolomoni G, Pastore S. Blockade of the EGF Receptor Induces a Deranged Chemokine Expression in Keratinocytes Leading to Enhanced Skin Inflammation. 2003.

11. Cubero DIG, Abdalla BMZ, Schoueri J, Lopes FI, Turke KC, Guzman J, et al. Cutaneous side effects of molecularly targeted therapies for the treatment of solid tumors. Drugs Context. 2018; 7: 1-11.

12. Perez-Soler R, Saltz L. Cutaneous adverse effects with HER1/EGFR-targeted agents: is there a silver lining? J Clin Oncol. 2005;23:5235-46. doi:10.1200/JCO.2005.00.6916.

13. Yerushalmi R, Woods R, Ravdin PM, Hayes MM, Gelmon KA. Ki67 in breast cancer: prognostic and predictive potential. Lancet Oncol. 2010; 11: 174-83. doi:10.1016/S1470-2045 (09) 70262-1.

14. Sandilands A, Sutherland C, Irvine AD, McLean WHI. Filaggrin in the frontline: role in skin barrier function and disease. J Cell Sci. 2009; 122 Pt 9: 1285-94. doi: 10.1242/jcs.033969.

15. Getsios S, Amargo E V., Dusek RL, Ishii K, Sheu L, Godsel LM, et al. Coordinated expression of desmoglein 1 and desmocollin 1 regulates intercellular adhesion. Differentiation. 2004; 72: 419 33. doi:10.1111/j.l432-0436.2004.07208008.x.

16. Steinert PM, Marekov LN. Direct evidence that involucrin is a major early isopeptide cross-linked component of the keratinocyte cornified cell envelope. J Biol Chem. 1997; 272: 2021-30. doi:10.1074/jbc.272.3.2021.

17. Paul T, Schumann C, Rudiger S, Boeck S, Heinemann V, Kachele V, et al. Cytokine regulation by epidermal growth factor receptor inhibitors and epidermal growth factor receptor inhibitor associated skin toxicity in cancer patients. Br J Cancer. 2014; 50: 1855-63.

18. Danilenko DM, Phillips GDL, Diaz D. In Vitro Skin Models and Their Predictability in Defining Normal and Disease Biology, Pharmacology, and Toxicity. Toxicol Pathol. 2016; 44: 555-63. doi: 10.1177/0192623316632074.

19. Klaeger S, Heinzlmeir S, Wilhelm M, Polzer H, Vick B, Koenig P-A, et al. The target landscape of clinical kinase drugs. Science. 2017;358. doi:10.1126/science.aan4368.

20. Nicholson DW, Ali A, Thornberry NA, Vaillancourt JP, Ding CK, Gallant M, et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis. Nature. 1995; 376: 37-13. doi:10.1038/376037a0.

21. Rosell R, Carcereny E, Gervais R, Vergnenegre A, Massuti B, Felip E, et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): A multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 2012; 13: 239-16. doi:10.1016/S1470-2045(11)70393-X.

22. Yang Y, Zhang Y, Cao Z, Ji H, Yang X, Iwamoto H, et al. Anti-VEGF- and anti-VEGF receptor-induced vascular alteration in mouse healthy tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110: 12018-23. doi:10.1073/pnas.l301331110.

23. Cross DAEE, Ashton SE, Ghiorghiu S, Eberlein C, Nebhan CA, Spitzler PJ, et al. AZD9291, an irreversible EGFR TKI, overcomes T790M-mediated resistance to EGFR inhibitors in lung cancer. Cancer Discov. 2014; 4: 1046-61. doi: 10.1158/2159-8290.CD-14-0337.

24. Chu C, Choi J, Eaby-Sandy B, Langer CJ, Lacouture ME. Osimertinib: A Novel Dermatologic Adverse Event Profile in Patients with Lung Cancer. Oncologist. 2018; 23: 891-9.

25. Li J, Brahmer J, Messersmith W, Hidalgo M, Baker SD. Binding of gefitinib, an inhibitor of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase, to plasma proteins and blood cells: In vitro and in cancer patients. Invest New Drugs. 2006; 24: 291-7.

26. Swaisland HC, Smith RP, Laight A, Kerr DJ, Ranson M, Wilder-Smith CH, et al. Single-dose clinical pharmacokinetic studies of gefitinib. Clin Pharmacokinet. 2005; 44: 1165-77.

27. Togashi Y, Masago K, Fukudo M, Terada T, Ikemi Y, Kim YH, et al. Pharmacokinetics of erlotinib and its active metabolite OSI-420 in patients with non-small cell lung cancer and chronic renal failure who are undergoing hemodialysis. J Thorac Oncol. 2010; 5: 601-5. doi: 10.1097/JTO.0b013e3181d32287.

28. Herbst RS, Johnson DH, Mininberg E, Carbone DP, Henderson T, Kim ES, et al. Phase I/II trial evaluating the anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody bevacizumab in combination with the HER-1/epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor erlotinib for patients with recurrent non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2005; 23: 2544-55.

29. Wind S, Schnell D, Ebner T, Freiwald M, Stopfer P. Clinical Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Afatinib. Clin Pharmacokinet. 2017; 56: 235-50. doi: 10.1007/s40262-016-0440-1.

30. EMEA. European Medicines Agency: EMEA/H/C/002280 - Annual report of the European Medicines Agency 2013. 2013; 44 July. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Public_assessment_report/human/002280/WC500152394.pdf.

31. Wind S, Schmid M, Erhardt J, Goeldner RG, Stopfer P. Pharmacokinetics of afatinib, a selective irreversible ErbB family blocker, in patients with advanced solid tumours. Clin Pharmacokinet. 2013; 52: 1101-9.

32. Hudachek SF, Gustafson DL. Physiologically based pharmacokinetic model of lapatinib developed in mice and scaled to humans. J Pharmacokinet Pharmacodyn. 2013; 40: 157-76. doi:10.1007/sl0928-012-9295-8.

33. Burris HA, Hurwitz HI, Dees EC, Dowlati A, Blackwell KL, O'Neil B, et al. Phase I safety, pharmacokinetics, and clinical activity study of lapatinib (GW572016), a reversible dual inhibitor of epidermal growth factor receptor tyrosine kinases, in heavily pretreated patients with metastatic carcinomas. J Clin Oncol. 2005; 23: 5305-13. doi: 10.1200/JCO.2005.16.584.

34. Giri N, Masters JC, Plotka A, Liang Y, Boutros T, Pardo P, et al. Investigation of the impact of hepatic impairment on the pharmacokinetics of dacomitinib. Invest New Drugs. 2015;33:931-41.

35. Reckamp KL, Giaccone G, Camidge DR, Gadgeel SM, Khuri FR, Engelman JA, et al. A phase 2 trial of dacomitinib (PF-00299804), an oral, irreversible pan-HER (human epidermal growth factor receptor) inhibitor, in patients with advanced non-small cell lung cancer after failure of prior chemotherapy and erlotinib. Cancer. 2014; 120: 1145-54.

36. Reddy VP, Walker M, Sharma P, Ballard P, Vishwanathan K. Development, verification, and prediction of osimertinib drug-drug interactions using PBPK modeling approach to inform drug label. CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol. 2018; 7: 321-30.

37. Rais R, Zhao M, He P, Xu L, Deeken JF, Rudek MA. Quantitation of unbound sunitinib and its metabolite N-desethyl sunitinib (SU12662) in human plasma by equilibrium dialysis and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS): application to a pharmacokinetic study. Biomed Chromatogr. 2012; 26: 230-3.

38. Fabian MA, Biggs WH, Treiber DK, Atteridge CE, Azimioara MD, Benedetti MG, et al. A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors. Nat Biotechnol. 2005; 23: 329-36. doi:10.1038/nbtl068.

39. Villarroel MC, Pratz KW, Xu L, Wright JJ, Smith BD, Rudekl MA. Plasma protein binding of sorafenib, a multi kinase inhibitor: in vitro and in cancer patients. Invest New Drugs. 2012; 30: 1-15.

40. Davis MI, Hunt JP, Herrgard S, Ciceri P, Wodicka LM, Pallares G, et al. Comprehensive analysis of kinase inhibitor selectivity. Nat Biotechnol. 2011; 29: 1046-51. doi:10.1038/nbt.l990.

Дополнительные данные

Гефитиниб

МоА:

Эрлотиниб

МоА: [28]

Афатиниб

МоА: [31]

Лапатиниб

МоА: [33]

Дакомитиниб

МоА: [35]

Осимертиниб

МоА: [23]

Сунитиниб

МоА: [23]

Сорафениб

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки эффективности in vitro композиции для снижения воздействия противоракового терапевтического средства на кожу, включающий в себя применение трехмерной модели эпидермиса in vitro или ex vivo, демонстрирующей дифференцирующие кератиноциты в реконструированном роговом слое; причем указанная модель содержит противораковое терапевтическое средство в количестве, эффективном для имитации продолжительного воздействия лекарственного средства; причем противораковым терапевтическим средством является афатиниб, и при этом функцию кожного барьера оценивают путем измерения скоростей трансэпидермальной потери воды (TEWL) на указанной модели. Способ можно применять для оценки способности противораковых терапевтических средств вызывать побочные эффекты, связанные с кожей. 1 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл.

1. Способ оценки эффективности in vitro композиции для снижения воздействия противоракового терапевтического средства на кожу, включающий в себя применение трехмерной модели эпидермиса in vitro или ex vivo, демонстрирующей дифференцирующие кератиноциты в реконструированном роговом слое; причем указанная модель содержит противораковое терапевтическое средство в количестве, эффективном для имитации продолжительного воздействия лекарственного средства; причем противораковым терапевтическим средством является афатиниб, и при этом функцию кожного барьера оценивают путем измерения скоростей трансэпидермальной потери воды (TEWL) на указанной модели.

2. Способ по п. 1, в котором указанная модель представляет собой модель реконструированного эпидермиса человека (RHE).