СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПУЗЫРЧАТКИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЛИГАНДА Fas Российский патент 2015 года по МПК A61K39/395 A61P17/00 A61P37/06 C07K16/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к применению антагонистов лиганда Fas человека (также именуется CD95L или Apo1L, а в дальнейшем сокращенно FasL), в частности, к применению гуманизованных антител против FasL для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в особенности для профилактики и/или лечения пузырчатки (пемфигуса).

Уровень техники

Пузырчатка (пемфигус) представляет собой аутоиммунное буллезное заболевание кожи, которое характеризуется утратой адгезии кератиноцитов, вызванной аутоанти-телами, направленными против десмосомных белков (десмоглеинов, dsg). Пузырчатка распространена по всему миру с частотой примерно 1-5 случаев на 100000 в год и преимущественно поражает женщин.

Пузырчатка характеризуется утратой адгезии супрабазальных кератиноцитов, которые округляются в процессе, известном как акантолиз. Патогенез пузырчатки подвергается значительному пересмотру, в основном из-за того, что помимо антител к десмоглеинам акантолиз может вызывать новая группа антител к холинэргическим рецепторам (Kalish, 2000). Кроме того, было показано, что образование пузырьков нельзя объяснить лишь стерическими препятствиями, возникающими при связывании антиген-антитело (Kitajima, 2002). Также было показано, что образование десмосом не подавляется при связывании аутоантител пузырчатки (PvIgG) с пузырьками, тогда как десмосомные соединения диссоциируют через 24-36 ч после обработки аутоантителами PvIgG. В это же время происходит ряд стадий передачи сигналов, запускаемых PvIgG.

Эти наблюдения предполагают, что при пузырчатке определенную роль играет апоптоз. Действительно, пузырчатка представляет собой заболевание, вызванное утратой клеточной адгезии (Payne AS et al., 1978), а апоптоз может возникать в связи с отделением клеток (Marconi et al., 2004). Эти идеи полностью подтверждаются обнаружением апоптоза в пораженной пузырчаткой коже. В частности, акантолитические клетки экспрессируют основные маркеры апоптоза (Wang X et al., 2004). Еще более интересно то, что помеченные методом TUNEL ядра также оказались связанными со сводом пузырьков, что свидетельствует о присутствии апоптотических клеток в окружающей повреждения коже перед отделением. Кроме того, апоптотические клетки, экспрессирующие Ig и активированную каспазу-8, обнаруживаются по краям поражений, в тех местах, где не видно разрушения межклеточных контактов (Wang X et I, 2004). Эти результаты убедительно показывают, что при пузырчатке в кератиноцитах перед акантолизом происходит апоптоз.

Апоптоз играет фундаментальную роль в регуляции клеточного гомеостаза и вовлечен во многие патофизиологические процессы. Апоптоз может сопровождать как разъединение клеток друг от друга (Rezgui et al., 2000; Bergin et al., 2000), так и утрату взаимодействия клеток и матрикса (Giancotti and Ruoslahti, 1999).

Fas (или FasR) является представителем суперсемейства TNF-рецепторов, который при связывания с лигандом Fas (FasL) запускает апоптоз во многих клеточных системах (Sharma et al., 2000). Внутриклеточная передача сигнала при вызванном Fas-FasL апоптозе осуществляется с привлечением целого ряда адапторных молекул типа FADD (Fas-ассоциированный домен смерти) и FLICE (FADD-подобная ICE, каспаза 8), которые в свою очередь ингибируются FLIP (белком, ингибирующим FLICE) (Juo et al., 1998). Взаимодействие Fas-FasL участвует в патологических механизмах некоторых иммуно-воспалительных и инфекционных заболеваний, таких как СПИД (Bahr et al., 1997) и системная красная волчанка (Kovacs et al., 1997). Кожные заболевания, характеризующиеся вовлечением метаболического пути Fas-FasL, включают острую реакцию "трансплантат против хозяина", токсичный эпидермальный некролиз и меланому (Wehrii et al., 2000). Кроме того, сообщалось, что поражения, сходные с акантолитическими, наблюдаются в культуре кератиноцитов, обработанной и PvIgG, и антителами к FasR, тогда как PvIgG вызывает кластеризацию FasR, FasL и каспазы-8 на клеточной мембране за несколько часов до возникновения повреждений (Wang X et al., 2004). Кроме того, сообщалось, что каспаза-1-подобный ингибитор в значительной степени блокирует образование пузырьков в модели пузырчатки на мышах (Li et al., 2006). В целом эти результаты показывают, что FasL и внешний апоптотический путь играют решающую роль в механизмах, лежащих в основе акантолиза.

Какова бы ни была природа аутоантител при пузырчатке, воздействие PvIgG усиливает экспрессию нескольких проапоптозных генов, в том числе FasL, за много часов до акантолиза. Кроме того, внутривенное введение IgG (ivIgG) предотвращает вызванное PvIgG возрастание FasL и апоптоз в кератиноцитах, а также предотвращает акантолиз и апоптоз in vivo (Arredondo J et al., 2005).

Без лечения смертность от пузырчатки обыкновенной достигает 100%. Ранняя системная терапия необходима для сдерживания пузырчатки, но побочные эффекты системной терапии являются главным осложнением. Лечение включает введение кортикостероидов, препаратов, содержащих золото, противовоспалительного препарата дапсона или препаратов, подавляющих иммунную систему (как-то азатиоприна, метотрексата, циклоспорина, циклофосфамида или микофенолата мофетил). В настоящее время наиболее распространенным способом лечения пузырчатки являются стероиды, которые необходимо вводить в течение всей жизни и которые могут вызывать тяжелые побочные эффекты. Большинство больных пузырчаткой умирают от этих побочных эффектов. Также эффективны некоторые антибиотики, в частности миноциклин и доксициклин. Иногда применяется внутривенное введение иммуноглобулина (ivIg). Плазмаферез представляет собой процесс, с помощью которого из крови удаляют плазму, содержащую антитела, и заменяют ее вводимой внутривенно жидкостью или донорской плазмой. Плазмаферез можно применять в дополнение к системным препаратам, чтобы снизить количество антител в кровотоке. В разработке находятся и несколько новых молекул: микофенолат мофетил, PI-0824, PRTX-100 и антитела против CD20 представляют собой иммуносупрессорные препараты, которые воздействуют на Т- и В-клетки.

Текущий уровень смертности все еще составляет от 5 до 25%; наиболее частой причиной смерти являются инфекции, а одним из важнейших факторов, по-прежнему вызывающих высокий уровень смертности, является долгосрочная иммуносупрессорная терапия (в основном кортикостероидами). Иммуноглобулин может вызывать некоторое кратковременное улучшение, но вроде как не дает длительной ремиссии, а его стоимость делает долгосрочное применение нецелесообразным.

Также есть некоторые возражения против применения плазмафереза. Больные, ослабленные применением преднизона или других иммуносупрессорных средств, и подвергающиеся плазмаферезу, находятся в группе повышенного риска внезапной смерти от сепсиса. Кроме того, это очень дорогое лечение, а для его применения необходим 2-недельный срок госпитализации. Таким образом, из-за риска внезапной смерти от сепсиса и высокой стоимости плазмаферез показан только в самых трудных, не поддающихся лечению случаях, когда больной несомненно подвергается риску умереть от самого заболевания.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является получение терапевтического средства для лечения пузырчатки. Разработка нового препарата, блокирующего FasL, позволит полностью предотвратить отделение клеток и возникновение поражений кожи.

В общем, настоящее изобретение касается лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, посредством введения антагониста FasL. Антагонисты FasL могут быть выбраны из антител против FasL, в частности гуманизированных или человеческих антител против FasL, из молекул нуклеиновых кислот, воздействующих на экспрессию Fas, как-то антисмысловых молекул или молекул, способных к интерференции с РНК, например, молекул siPHK; из растворимых молекул рецептора Fas, нейтрализующих FasL мутеинов, и низкомолекулярных химических соединений, ингибирующих взаимодействие Fas-FasL. Антагонисты FasL предотвращают апоптоз кератиноцитов и последующее межклеточное разъединение (акантолиз). Таким образом, антагонисты FasL особенно подходят для профилактики и/или лечения пузырчатки, напр., для профилактики и/или лечения кожно-слизистой пузырчатки.

Настоящее изобретение касается лекарственных препаратов, содержащих по меньшей мере одно соединение, подавляющее биологические эффекты FasL. Выражение "соединение, подавляющее биологические эффекты FasL", в настоящем изобретении относится ко всем соединениям, которые способны полностью или хотя бы существенно ингибировать или нейтрализировать биологические эффекты FasL. Например, ингибирующий или нейтрализирующий эффект может основываться на подавлении связывания FasL со своим природным рецептором и тем самым вызванной им передачи сигналов. Это достигается, к примеру, с помощью антител, связывающихся с FasL самим по себе или с растворимыми рецепторами, имитирующими Fas, или с помощью нейтрализирующих FasL мутеинов, блокируя при этом связывание FasL с клеточными рецепторами. Интерферируя с экспрессией Fas или FasL, siRNA будет блокировать систему Fas/FasL.

Терапия с помощью антагонистов FasL является либо монотерапией, либо комбинированной терапией вместе с другими лекарственными средствами, пригодными для лечения пузырчатки или других кожных заболеваний, в частности, как описано выше. Например, комбинированная терапия антагонистами FasL и стероидами может обеспечить радикальное снижение дозировки стероидов.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения предусмотрено терапевтическое средство для лечения пузырчатки, включающее антитело против лиганда Fas человека либо его активный фрагмент в качестве активного ингредиента. Предпочтительно антитело представляет собой химерное, гуманизированное или человеческое антитело против FasL либо его антигенсвязывающий фрагмент или производное, напр., рекомбинантное одноцепочечное антитело. При необходимости антитела могут быть конъюгированы с эффекторными молекулами, напр., цитостатическими, цитотоксическими и/или радиоактивными соединениями.

Предпочтительные гуманизированные антитела, подходящие для лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности пузырчатки, в соответствии с настоящим изобретением, описаны в WO 1997/002290A1 ("Anti-Fas ligand antibodies and assay method using the same antibody") или в WO 1998/010070 Al ("Humanized immunoglobulin reacting specifically with Fas ligand or active fragments thereof and region inducing apoptosis originating in Fas ligand humanized antibodies"), содержание которых включено путем ссылки. Другие предпочтительные гуманизированные антитела, подходящие для лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности пузырчатки, в соответствии с настоящим изобретением, описаны в US 7,262,277 ("Antagonistic anti-hFas ligand human antibodies and fragments thereof), содержание которого также включено путем ссылки.

Человеческие или гуманизированные антитела имеют по меньшей мере три возможных преимущества перед мышиными, а в некоторых случаях перед химерными антителами для применения при лечении человека: 1) поскольку эффекторная часть происходит из человека, она может лучше взаимодействовать с другими частями системы человека; 2) иммунная система человека не будет распознавать каркасный участок или С-участок гуманизированного антитела в качестве чужеродного, поэтому антительный ответ на такое введенное антитело должен быть слабее, чем на совершенно чужеродное мышиное антитело или частично чужеродное химерное антитело; 3) введенные гуманизированные антитела предположительно будут иметь период полужизни, более близкий к природным антителам человека, что позволит вводить меньшие и менее частые дозы.

Другими предпочтительными антагонистами FasL являются растворимые молекулы FasR, включающие внеклеточную растворимую часть Fas-рецептора, или молекулы модифицированных антагонистов FasL, обладающие активностью конкурентных или неконкурентных антагонистов. Такие молекулы ингибируют взаимодействия FasL/FasR тем, что FasL связывается с растворимым аналогом рецептора или молекула-антагонист FasL связывается с природным рецептором, тем самым ослабляя или полностью устраняя связывание биологически активного FasL с природным рецептором. При лечении с помощью siRNA для определения типа лечения и курса терапии для лечения субъекта можно использовать анализ уровня белка или РНК Fas и/или FasL. Мониторинг уровня белка или РНК Fas и/или FasL может применяться для предсказания исхода лечения и для определения эффективности соединений и композиций, модулирующих уровень и/или активность некоторых белков Fas и/или FasL, связанных с каким-либо признаком, состоянием или заболеванием.

В одном особенно предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается применения:

(i) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к белку лиганда Fas человека (FasL), причем данное моноклональное антитело включает по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, причем аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность (CDRs) тяжелой цепи, представляют собой:

(a₁) CDR H1: Asn Tyr Trp Ile Gly (SEQ ID NO:1),

(b₁) CDR H2: Tyr Leu Tyr Pro Gly Gly Leu Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly (SEQ ID NO:2),

(c₁) CDR H3: Tyr Arg Asp Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr (SEQ ID NO:3) или

(d₁) последовательность, полученную путем замены 1, 2 или 3 аминокислот в SEQ ID NOs: 1,2 и/или 3,

и/или аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность (CDRs) легкой цепи, представляют собой:

(а₂) CDR L1: Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Thy Leu Gly (SEQ ID NO:4),

(b₂) CDR L2: Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO:5),

(c₂) CDR L3: Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr (SEQ ID NO:6) или

(d₂) последовательность, полученную путем замены 1, 2 или 3 аминокислот в SEQ ID NOs: 4, 5 и/или 6;

либо

(ii) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, распознающего тот же самый эпитоп FasL человека, что и антитело (i),

для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности пузырчатки.

Во втором особенно предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается применения:

(i) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к белку лиганда Fas человека (FasL), причем данное моноклональное антитело вырабатывается клетками гибрид омы с номером доступа FERM ВР-5045, либо антитела или фрагмента антитела, происходящего из него, либо

(ii) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, распознающего тот же самый эпитоп FasL человека, что и антитело (i),

для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности пузырчатки.

В третьем особенно предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается применения:

(i) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к белку лиганда Fas человека (FasL), причем данное моноклональное антитело включает по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, причем аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность (CDRs) тяжелой цепи, представляют собой:

(a₁) CDR H1: Glu Tyr Pro Met His (SEQ ID NO:7),

(b₁) CDR H2: Met Ile Tyr Thr Asp Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Glu Phe Lys Gly (SEQ ID NO:8),

(c₁) CDR H3: Phe Tyr Trp Asp Tyr Phe Asp Tyr (SEQ ID NO:9) или

(d₁) последовательность, полученную путем замены 1, 2 или 3 аминокислот в SEQ ID NOs: 7, 8 и/или 9,

и/или аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность (CDRs) легкой цепи, представляют собой:

(а₂) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn (SEQ ID NO:10),

(b₂) CDR L2: Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser (SEQ ID NO:11),

(с₂) CDR L3: Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr (SEQ ID NO:12) или

(d₂) последовательность, полученную путем замены 1, 2 или 3 аминокислот в SEQ ID NOs: 10, 11 и/или 12;

либо

(ii) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, распознающего тот же самый эпитоп FasL человека, что и антитело (i),

для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности пузырчатки.

В четвертом предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается применения:

(i) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к белку лиганда Fas человека (FasL), причем данное моноклональное антитело вырабатывается клетками гибридомы с номером доступа PERM BP-5533, FERM ВР-5534 и/или FERM BP-5535, либо антитела или фрагмента антитела, происходящего из него, либо

(ii) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, распознающего тот же самый эпитоп FasL человека, что и антитело (i),

для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности пузырчатки.

В особенно предпочтительном воплощении настоящее изобретение направлено на применение человеческих антител против FasL или их антигенсвязывающих частей, включающих вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи, как описано в US 7262277, содержание которого включено путем ссылки. В частности, предпочтительные человеческие антитела против FasL, пригодные для лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов в соответствии с настоящим изобретением, включают вариабельную область легкой цепи, включающую полипептид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 2 из US 7262277 (включенного путем ссылки), а также включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую полипептид с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO 10 или 18 из US 7262277 (включенного путем ссылки). В частности, изобретение касается применения человеческого антитела 3Е1 (вырабатывается клетками гибридомы с номером доступа АТСС РТА-4017) и/или 4G11 (вырабатывается клетками гибридомы с номером доступа АТСС РТА-4018) против hFas, как описано в US 7262277 (включенном путем ссылки) для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности пузырчатки.

В следующем предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается применения:

(i) моноклонального человеческого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к белку лиганда Fas человека (FasL), причем данное моноклональное антитело включает по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, причем аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность (CDRs) тяжелой цепи, представляют собой:

(a₁) CDR H1: Arg His Gly Ile Thr (SEQ ID NO:13) или

(а₂) CDR H1: Ser His Gly Ile Ser (SEQ ID NO:14),

(b₁) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (SEQ ID NO:15) или

(b₂) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln Gly (SEQ ID NO:16),

(c₁) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (SEQ ID NO:17) или

(c₂) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Cys Asp Tyr (SEQ ID NO:18), или

(d₁) последовательность, полученную путем замены 1, 2 или 3 аминокислот в SEQ ID NOs 13, 14, 15, 16, 17 и/или 18,

и/или аминокислотные последовательности участков, определяющих комплемен-тарность (CDRs) легкой цепи, представляют собой:

(а₃) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (SEQ ID NO:19),

(b₃) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO:20),

(с₃) CDR L3: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEQ ID NO:21) или

(d₃) последовательность, полученную путем замены 1, 2 или 3 аминокислот в SEQ ID NOs: 19, 20 и/или 21;

либо

(ii) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, распознающего тот же самый эпитоп FasL человека, что и антитело (i),

для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности пузырчатки.

В заключительном предпочтительном аспекте настоящее изобретение касается применения:

(i) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к белку лиганда Fas человека (FasL), причем данное моноклональное антитело вырабатывается клетками гибридомы с номером доступа АТСС РТА-4017 и/или АТСС РТА-4018, либо антитела или фрагмента антитела, происходящего из него, либо

(ii) моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, распознающего тот же самый эпитоп FasL человека, что и антитело (i),

для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности пузырчатки.

Клетки гибридом с номерами доступа АТСС РТА-4017 и АТСС РТА-4018 были депонированы 29 января 2002 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 (США).

Лекарственное средство настоящего изобретения может быть представлено в виде фармацевтической композиции вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Предпочтительно фармацевтическая композиция вводится с помощью инъекции или инфузии, напр., внутривенно, внутриартериально, подкожно, внутрибрюшинно или иным подходящим способом. Композиция может вводиться местно или системно. Предпочтительно композиция вводится системно.

Фармацевтические композиции, подходящие для применения в изобретении, включают активное средство в эффективном количестве для достижения намеченной цели. Эффективная доза лекарственного средства настоящего изобретения может составлять от 0,1 мкг до 100 мг, вплоть до общей дозы в 1 г, в зависимости от способа введения. Фармацевтические композиции можно вводить ежедневно, напр., один или несколько раз, либо каждые 2-4 дня, каждую неделю или раз в две недели. Лекарственное средство можно вводить в одном единственном цикле лечения, состоящем из введения одного или нескольких лекарственных средств, или в нескольких циклах лечения, каждый из которых состоит из введения одного или нескольких лекарственных средств. Каждый цикл лечения может иметь продолжительность от одного дня до нескольких недель, месяцев или даже лет.

Поэтому, в соответствии с настоящим изобретением лекарственное средство также можно применять в комбинированной терапии вместе с по меньшей мере одной дополнительной терапией, эффективной против кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в частности, против пузырчатки. Лекарственное средство должно применяться само по себе или же в комбинации с другими иммуносупрессорными препаратами, в частности, со стероидами, с тем, чтобы уменьшить их дозу и/или свести к минимуму хронические побочные эффекты. При комбинированном применении лекарственное средство предпочтительно вводится на ежемесячной основе. При применении лекарственного средства самого по себе оно предпочтительно вводится постоянно в течение какого-то срока, зависящего от индивидуального случая.

Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно на следующих примерах.

ПРИМЕРЫ

Сначала методом окрашивания TUNEL оценивали наличие апоптоза в эпидермисе кожи вокруг очагов повреждения в замороженных срезах от больных пузырчаткой, не получавших лечения. Флуоресцентные образцы анализировали методом конфокальной сканирующей лазерной микроскопии. В супрабазальных слоях эпидермиса вокруг очагов повреждения большая часть кератиноцитов была апоптозной по сравнению с нормальной кожей (фиг.1).

Для того чтобы подтвердить наличие апоптоза в пузырчатых повреждениях, мы использовали фиксированные формалином и залитые парафином биопсии и детектировали активную форму каспазы-3. Методика окрашивания выполнялась с помощью системы Ultra Vision LP Detection System АР Polymer и Fast Red Chromogen (Lab Vision Corporation, CA, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Визуализацию проводили с помощью таблеток Fast Red в нафтол-фосфатном субстрате. В пораженных пузырчаткой образцах оказалось, что фрагмент каспазы-3 локализован и в своде, и в основании пузырьков, а некоторые клетки были позитивными в эпидермисе вокруг очагов повреждения (фиг.2). Видимо, этот результат свидетельствует о том, что клеточная гибель кератиноцитов происходит до отделения кератиноцитов, ведущего к акантолизу.

Поскольку апоптозные кератиноциты широко представлены при пузырчатке, мы решили исследовать, способна ли сыворотка крови больных пузырчаткой вызывать апоптоз в нормальных кератиноцитах человека. Для этого кератиноциты высеивали на планшеты и культивировали в свободной от сыворотки среде (KGM) до состояния предконфлюэнтности. Затем клетки культивировали в базальной среде для кератиноцитов и обрабатывали в течение 48 часов добавлением 25% сыворотки либо от больных, не получавших лечения, либо от больных, получавших кортикостероиды системно. В качестве контроля использовали сыворотку крови здоровых субъектов. Апоптоз оценивали методом окрашивания TUNEL in situ. Оценивали примерно 100 клеток в выбранных случайным образом полях и подсчитывали содержание TUNEL-позитивных клеток. Сыворотка больных пузырчаткой, но не сыворотка здоровых субъектов или больных, подвергавшихся лечению стероидами, вызывала апоптоз в кератиноцитах человека (фиг.3 А-В).

Поскольку система Fas/FasL вовлечена во многие апоптотические процессы также и на уровне кожи (Wehrli et al., 2000), мы измеряли уровень FasL в сыворотке крови у больных пузырчаткой методом двухцентрового ферментативного иммуноанализа (ELISA). Концентрацию в сыворотке определяли по поглощению при 450 нм против стандарта - рекомбинантного белка FasL человека. Уровень FasL был очень высоким в сыворотке больных, не получавших лечения, и находился ниже предела обнаружения в сыворотке больных, получавших кортикостероиды, или в сыворотке здоровых субъектов. В качестве положительного контроля использовали сыворотку больных HBV (фиг.4А). У одного больного уровень FasL прогрессивно снижался при системной стероидной терапии (фиг.4В).

Поскольку FasL содержится в большом количестве в сыворотке крови больных пузырчаткой, мы изучили экспрессию его собственного рецептора FasR. Для этого использовали фиксированные формалином и залитые парафином биопсии и детектировали активную форму каспазы-3. Методика окрашивания выполнялась с помощью системы UltraVision LP Detection System АР Polymer и Fast Red Chromogen (Lab Vision Corporation, CA, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Визуализацию проводили с помощью таблеток Fast Red в нафтол-фосфатном субстрате.

В то время, как в нормальной коже FasR экспрессировался только в базальных кератиноцитах, в очагах повреждения при активной пузырчатке FasR выявлялся как в базальных, так и в супрабазальных клетках. Еще более интересно то, что при кожно-слизистой пузырчатке (РМС) FasR как будто экспрессируется во всех слоях эпидермиса и даже еще до образования пузырьков (фиг.5).

FasL является одним из главных спусковых механизмов активируемого каспазой-8 внешнего апоптотического пути. Поэтому мы решили оценить, играет ли он какую-то роль в апоптозе при пузырчатке. Для этого сыворотку крови больных предварительно обрабатывали нейтрализующим антителом против FasL или ингибитором каспазы-8, которые добавляли в культуры кератиноцитов. Кератиноциты культивировали в среде КОМ и обрабатывали сывороткой больных пузырчаткой или сывороткой больных, не получавших лечения. Сыворотки предварительно обрабатывали нейтрализующим антителом против FasL (2,5 мг на мл в течение 30 минут) или ингибитором каспазы-8 Z-IETD-FMK (100 мкМ в течение 30 минут). Апоптоз оценивали методом окрашивания TLTNEL. Добавление нейтрализующего антитела против FasL или ингибитора каспазы-8 частично предотвращало апоптоз кератиноцитов, вызванный сывороткой больных пузырчаткой (фиг.6).

Кроме того, кератиноциты обрабатывали так же, как на фиг.6, и добавляли либо антитело против FasL, либо посторонние иммуноглобулины. Затем клетки гомогенизировали в буфере RIPA для анализа методом western-блоттинга. Мембраны инкубировали с антителами против каспазы-8 человека или против β-актина. Относительную интенсивность полос на авторадиограммах анализировали количественно методом сканирующей лазерной денситометрии. Результаты показали, что каспаза-8 заметно активировалась в кератиноцитах, обработанных сывороткой больных пузырчаткой, по сравнению с необработанными клетками, тогда как каспазная активность частично ингибировалась при предварительной обработке антителом против FasL (фиг.7).

В целом эти результаты свидетельствуют о том, что сыворотка больных пузырчаткой вызывает апоптоз кератиноцитов через внешний апоптотический путь, запускаемый системой Fas/FasL.

Недавние исследования показали, что компоненты комплекса адгезии кадгерин-катенин в эпителиальных адгезионных контактах являются мишенями для каспаз в процессе апоптоза (Weiske et al., 2001). Чтобы оценить, способен ли апоптотический путь, индуцируемый Fas/FasL, вызывать разделение десмосом, мы обрабатывали в течение 72 часов достигшие конфлюэнтности кератиноциты, культивируемые в среде КОМ в присутствии 1,8 мМ CaCl₂, сывороткой больных пузырчаткой, подвергавшихся или не подвергавшихся терапии. Белковые экстракты из культур анализировали методом western-блоттинга, используя антитела против Dsg1 и Dsg3. В качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Мы обнаружили, что сыворотка больных пузырчаткой способна расщеплять Dsg1 и Dsg3. В частности, сыворотка больных, не получавших лечения, но не больных при терапии стероидами, поразительно расщепляла Dsg1 и Dsg3 (фиг.8).

Наиболее важно то, что обработка кератиноцитов возрастающими дозами FasL (0,1, 10, 100 нг/мл) в течение 72 часов вызывала расщепление белков dsg дозозависимым образом. Белковые экстракты из культур анализировали методом western-блоттинга, используя антитела против Dsg1 и Dsg3. В качестве внутреннего контроля использовали β-актин. Такие дозы соответствуют дозам, обнаруженным в сыворотке крови больных пузырчаткой (фиг.9).

Учитывая то, что FasL играет важную роль в патогенезе пузырчатки, мы протестировали антитело против FasL (NOK2 - антитело, вырабатываемое линией клеток гибридомы NOK2, номер доступа FERM ВР-5045). Достигшие конфлюэнтности кератиноциты, культивируемые в KGM с 1,8 мМ CaCl₂, обрабатывали в течение 72 часов: 1) только KGM; 2) антителом к FasL (NOK2, 15 мкг/мл), 3) FasL (500 нг/мл); 4) FasL + антителом к FasL. Мы получили данные о том, что антитело против FasL (NOK2) предотвращает вызванное FasL расщепление dsg. Мы также показали, что антитело против FasL (NOK2) ингибирует апоптоз, вызванный каспазой-8 (фиг.10А). Из фиг.10В видно, что антитело против FasL (NOK2) предотвращает вызванное FasL межклеточное разъединение, т.е акантолиз.

Для того, чтобы дополнительно подтвердить центральную роль FasL, мы использовали и другие антитела против FasL (F918-7-3 - антитело, вырабатываемое линией клеток гибридомы с номером доступа FERM BP-5533; F918-7-4 - антитело, вырабатываемое линией клеток гибридомы с номером доступа FERM BP-5534; F919-9-18 - антитело, вырабатываемое линией клеток гибридомы с номером доступа FERM ВР-5535). Достигшие конфлюэнтности кератиноциты, культивируемые в KGM с 1,8 мМ CaCl₂, обрабатывали в течение 72 часов: только KGM; рекомбинантным FasL (50 нг/мл); гибридомной средой, разведенной 1:1 в KGM; FasL + гибридомной средой в различных разведениях в KGM. Мы получили данные о том, что антитела к FasL предотвращают вызванное FasL расщепление dsg3 дозозависимым образом (фиг.11А и фиг.11В), ингибируя вызванную каспазой-8 активацию апоптоза (фиг.11А). Из фиг.11С видно, что антитело к FasL, содержащееся в среде из линии клеток гибридомы FERM BP-5535, предотвращает вызванное FasL межклеточное разъединение, т.е. акантолиз.

Чтобы установить, вызывает ли внешний апоптотический путь расщепление dsg, мы предварительно обрабатывали достигшие конфлюэнтности кератиноциты ингибитором каспазы-8 Z-IETD-FMK (100 мкМ в течение 30 минут) или антителом к FasL (NOK2, 15 мкг/мл). Затем клетки инкубировали в течение 72 часов с сывороткой крови здоровых субъектов или не получавших лечения больных пузырчаткой. Белковые экстракты из культур анализировали методом western-блоттинга, используя антитела против Dsg3 и против каспазы-8. В качестве внутреннего контроля использовали винкулин (фиг.12А). Из фиг.12В видно, что разъединение клеток (т.е. акантолиз) предотвращается антителом к FasL или ингибитором каспазы-8. Эти результаты указывают на то, что ингибирование FasL или апоптотического пути, активируемого каспазой-8, предотвращает как активацию каспазы-8, так и расщепление dsg, тем самым блокируя акантолиз.

Для того, чтобы оценить и роль человеческих антител против FasL (человеческое антитело 3Е1, вырабатываемое линией клеток гибридомы с номером доступа АТСС РТА-4017 (антитело РТА-4017), и человеческое антитело 4G11, вырабатываемое линией клеток гибридомы с номером доступа АТСС РТА-4018 (антитело РТА-4018)), кератиноциты культивировали в КОМ (1,8 мМ CaCl₂) и обрабатывали рекомбинантным FasL (50 нг/мл) одним или в комбинации с антителами РТА-4017 и РТА-4018 при различных разведениях. В качестве контроля использовали гуманизированные антитела ВР-5035 и ВР-5045 против FasL, уже протестированные на фиг.10-12. Из фиг.13А видно, что в то время, как FasL сам по себе расщепляет Dsg3 и активирует каспазу-8, человеческие антитела РТА-4017 и РТА-4018 и гуманизированные антитела ВР-5035 и ВР-5045 предотвращают этот эффект (western-блоттинг). Из фиг.13В видно, что в то время, как FasL сам по себе вызывает разъединение клеток и акантолиз, человеческие антитела РТА-4017 и РТА-4018 против FasL в различных концентрациях предотвращают этот эффект.

В заключение мы показали, что FasL проявляет двойную активность, активируя как внешний апоптотический путь, опосредованный каспазой-8, так и расщепление Dsg. В соответствии с нашей работой Wang и соавторы (Wang et al., 2004) предположили, что апоптоз может быть причиной явления акантолиза. Они показали, что PV-IgG и антитела против Fas-рецептора (анти-FasR) вызывают повреждения in vitro сходным образом, вызывая: (1) секрецию растворимого FasL; (2) повышение клеточного содержания FasR, FasL (растворимого и мембранного), белков Вах и р53; (3) снижение уровня клеточного Bcl-2; (4) возрастание каспазы-8 и активацию каспаз 1 и 3; (5) совместную агрегацию FasL и FasR с каспазой-8 в мембранном сигнальном комплексе, индуцирующем клеточную смерть (DISC), Поэтому сигнальный путь клеточной смерти, опосредованный Fas, по-видимому, участвует в образовании очагов повреждения.

Для изучения пузырчатки долгое время широко применялась хорошо обоснованная модель на животных. Пассивный перенос PvIgG в новорожденных мышей вызывает разъединение клеток и образование пузырьков. Эта модель применялась для оценки вовлечения апоптоза и FasL в патогенезе пузырчатки. Мы вводили подкожно PvIgG (5 мг/г массы тела), очищенный из сыворотки больных, новорожденным мышам C57BL/6N CrI. В качестве контроля использовали нормальных новорожденных мышей, получавших IgG, очищенный из сыворотки здоровых субъектов (NIgG). Животных забивали через 20 часов после инъекции.

Окрашивание гематоксилином и эозином показало, что пузырьки возникают только у мышей, получавших PvIgG, но не у мышей, получавших нормальный IgG человека (фиг.14А). Апоптоз обнаруживался либо методом TUNEL, либо по активации каспазы-3 только у мышей, получавших PvIgG (фиг.14В).

Для того, чтобы оценить роль FasL in vivo, мышей обрабатывали с помощью PvIgG или PvIgG плюс антитело против FasL (клон MFL3, специфичный для мыши). Антитело против FasL (40 мкг/мышь) вводили через 3 часа после инъекции PvIgG, и оно предотвращало образование пузырьков у мышей, как видно по окрашиванию Н&Е. Кроме того, протяженность щелей у мышей, обработанных антителом к FasL, значительно уменьшалась (фиг.15).

Для сравнения эффективности различных анти-FasL антител (фиг.16) человеческие кератиноциты культивировали в KGM с 1,8 мМ СаСl₂ и обрабатывали PVIgG (1,5 мг/мл), очищенной от сыворотки пациентов, содержащей антитела против Dsgl и Dsg3, либо отдельно, либо в комбинации с анти-FasL антителами в концентрации 10 мкг/мл. Были использованы следующие антитела: человеческие антитела против человеческого FasL, продуцируемые гибридомной клеточной линией АТСС РТА-4017, человеческие антитела против человеческого FasL, продуцируемые гибридомной клеточной линией АТСС РТА- 4018, и мышиные антитела против человеческого FasL уровня техники (Puviani et al., 2003). Вестерн-блоттинг демонстрирует, что хотя PVIgG индуцирует расщепление Dsg3, человеческие анти-FasL РТА-4017 являются более эффективными в предотвращении расщепления десмоглеина (акантолиз) по сравнению с человеческими анти-FasL РТА-4018 и мышиными анти-FasL уровня техники (Puviani et al., 2003). На правой панели показан денситометрический анализ Вестерн-блоттинга.

В заключение мы показали, что FasL проявляет двойную активность, активируя как внешний апоптотический путь, опосредованный каспазой-8, так и расщепление Dsg. Наиболее важно то, что блокирование FasL защищает от акантолиза in vitro и in vivo.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Aoudjit F and Vuori K. Matrix attachment regulates FAS-induced apoptosis in endothelial cells: a role for c-FLIP and implications for anoikis: J Cell Biol 152:633-643, 2001

Arredondo J et al., Am J Pathol 167:1531-1544, 2005

Bahr GM, Capron A, Dewulf J, Nagata S, Tanaka M, Bourez JM, Mouton Y: Elevated serum level of Fas ligand correlates with the asymptomatic stage of human immunodeficiency virus infection. Blood 90:896-898, 1997

Bergin E, Levine JS, Koh JS, Lieberthal W: Mouse proximal tubular cell-cell adhesion inhibits apoptosis by a cadherin-dependent mechanism. Am J Physiol Renal Physiol 278:F758-F768, 2000

Du Z. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 226, 595-600

Frisch SM: Evidence for a function of death-receptor-related, death-domain-containing proteins in anoikis. Current Biol 9:1047-1049, 1999

Frisch SM, Francis H: Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. J Cell Biol 124:619-626, 1994

Frisch SM, Screaton RA: Anoikis mechanisms. Curr Opin Cell Biol 13:555-562, 2001

Giancotti FG, Ruoslahti E: Integrin signaling. Science 285:1028-1032, 1999

Gniadecki R, Jemec GBE, Thomson BM, Hansen M: Relationship between keratinocyte adhesion and death: anoikis in acantholytic diseases. Arch Dermatol Res 290:528-532, 1998

Grossman J, Walther K, Artinger M, Kiessling S, Scholmerich J: Apoptotic signaling during initiation of detachment-induced apoptosis ("anoikis") of primary human intestinal epithelial cells. Cell Growth & Diff 12:147-155, 2001

Jolles S, Hughes J, Whittaker S: Dermatological uses of high-dose intravenous immunoglobulin. Arch Dermatol 134:80-86, 1998

Juo P, Kuo CJ, Yuan J, Blenis J: Essential requirement for caspase-8/FLICE in the initiation of the Pas-induced apoptotic cascade. Curr Biol 8:1001-1008, 1998

Kalish RS: Pemphigus vulgaris: the other half of the story. J Clin Invest 106:1433-1435, 2000

Kitajima Y: Mechanisms of desmosome assembly and disassembly. Clin Exp Dermatol. 27:684-90, 2002

Kovacs В, Liossis SN, Dennis GJ, Tsokos GC: Increased expression of functional Fas ligand in activated T-cells from patients with systemic lupus erythematosus. Autoimmunity 25:213-221, 1997

Lee J. et al., Endocrinology, 1997, 138, 2081-2088

Li N, Zhao M, Liu Z, Diaz LA: Pathogenic role of apoptosis in experimental pemphigus. J Invest Dermatol 126:173 Abstract, 2006

Marconi A, Atzei P, Panza C, Fila C, Tiberio R, Truzzi F, Wachter T, Leverkus M, Pincelli C: FLICE/caspase-8 activation triggers anoikis induced by β₁ integrin blockade in human keratinocytes. J Cell Sci 117:5815-5823, 2004

Marconi A, Vaschieri C, Zanoli S, Giannetti A, Pincelli C: Nerve growth factor protects human keratinocytes from ultraviolet-B-induced apoptosis. J Invest Dermatol 113:920-927, 1999

Nishimura S, Adachi M, Ishida T, Matsunaga T, Uchida H, Hamada H, Imai K: Adenovirus-mediated transfection of caspase-8 augments anoikis and inhibits peritoneal dissemination of human gastric carcinoma cells. Cancer Res 61:7009-7014, 2001

O'Connell J. et al., J. Exp. Med., 184, 1075-1082, 1996

Payne AS. Curr Opin Cell Biol 16:536-543, 2004

Pincelli C, Haake AR, Benassi L, Grassilli E, Magnoni C, Ottani D, Polakowska R, Franceschi C, Giannetti A: Autocrine nerve growth factor protects human keratinocytes from apoptosis through its high affinity receptor (trk): a role for bcl-2. J Invest Dermatol 109:757-764, 1997

Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534

Reed JC: Mechanisms of apoptosis. Am J Pathol 157:1415-1430

Rezgui SS, Honore S, Rognoni J-B, Martin P-M, Penel C: Up-regulation of α2β1 integrin cell-surface expression protects A431 cells from epidermal growth factor-induced apoptosis. Int J Cancer 87:360-367, 2000

Rytomaa M, Martins LM, Downward J: Involvement of FADD and caspase-8 signalling in detachment-induced apoptosis. Current Biol 9:1043-1046, 1999

Sharma K, Wang RX, Zhang LY, Yin DL, Luo XY, Solomon JC, Jiang RF, Markos K, Davidson W, Scott DW, Shi YF: Death the Fas way: regulation and pathophysiology of Fas and its ligand. Pharmacol Ther. 88:333-347, 2000

Tiberio R, Marconi A, Fila C, Fumelli C, Pignatti M, Krajewski S, Giannetti A, Reed JC, Pincelli C: Keratinocytes enriched for stem cells are protected from anoikis via an integrin signaling pathway, in a Bcl-2 dependent manner. FEBS Letters 26318:1-6, 2002

Turley J.M. et al., Cancer Res., 1997, 57, 881-890

Viard I, Wehril P, Bullani R, Schneider P, Holler N, Salomon D, Hunzinker T, Saurat J-H, Tschopp J, French L: Inhibition of toxic epidermal necrolysis by blockade of Fas with human intravenous immunoglobulin. Science 282:490-493, 1998

Wang X et al.: Possible apoptotic mechanism in epidermal cell acantholysis induced by pemphigus vulgaris autoimmunoglobulins. Apoptosis 9:131-143, 2004

Wehrli P, Viard I, Bullani R, Tschopp J, French LE: Death receptors in cutaneous biology and disease. J Invest Dermatol 115:141-148, 2000

Weiske J, Schoneberg T, Schroder W, Hatzfeld M, Tauber R, Huber O: The fate of desmosomal proteins in apoptotic cells. J Biol Chem 276:41175-41181, 2001

Yang Y. et al., J. Exp. Med., 1995, 181, 1673-1682

Yu W. et al., Cancer Res., 1999, 59, 953-961

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено применение моноклонального антитела против белка лиганда Fas человека (CD95L, или Apo1L, или FasL) или его антигенсвязывающего фрагмента для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов, в особенности для профилактики и/или лечения пузырчатки (пемфигуса), где антитело содержит аминокислотные последовательности CDR антитела 3Е1 или продуцируется гибридомой ATCC PTA-4017. Применение антитела по изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента обеспечивает более эффективное предотвращение расщепления десмоглеина (dsg3) по сравнению с применением других антител. 2 н. и 9 з. п. ф-лы, 16 ил.

1. Применение моноклонального человеческого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к белку лиганда Fas человека (FasL), в котором
аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность (CDRs) тяжелой цепи, представляют собой:
(a₁) CDR H1: Arg His Gly Ile Thr (SEQ ID NO:13)
(b₁) CDR H2: Trp Ile Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Val Gln Gly (SEQ ID NO:15)
(c₁) CDR H3: Glu Thr Met Val Arg Gly Val Pro Leu Asp Tyr (SEQ ID NO:17)
и аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность (CDRs) легкой цепи, представляют собой:
(а₃) CDR L1: Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala (SEQ ID NO:19)
(b₃) CDR L2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO:20)
(c₃) CDR L3: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEQ ID NO:21)
для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератиноцитов.

2. Применение по п.1, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбрано из частично или полностью гуманизированных антител, частично или полностью гуманизированных одноцепочечных антител либо их фрагментов.

3. Применение по п.1, в котором кожное заболевание связано с активацией апоптотического пути и/или расщеплением десмоглеина.

4. Применение по п.1, в котором кожным заболеванием является пузырчатка (пемфигус).

5. Применение по любому из пп.1-4 в комбинированной терапии вместе с по меньшей мере одной дополнительной терапией, эффективной против данного кожного заболевания.

6. Применение по п.5 в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным иммуносупрессорным препаратом, в частности с по меньшей мере одним дополнительным стероидом.

7. Применение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к белку лиганда Fas человека (FasL), продуцируемого клетками гибридомы с номером доступа АТСС РТА-4017, для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения кожных заболеваний, связанных с акантолизом кератинопитов.

8. Применение по п.7, в котором кожное заболевание связано с активацией апоптотического пути и/или расщеплением десмоглеина.

9. Применение по п.7, в котором кожным заболеванием является пузырчатка (пемфигус).

10. Применение по любому из пп.7-9 в комбинированной терапии вместе с по меньшей мере одной дополнительной терапией, эффективной против данного кожного заболевания.

11. Применение по п.10 в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным иммуносупрессорным препаратом, в частности с по меньшей мере одним дополнительным стероидом.