Иммобилизованный на геле гиалуроновой кислоты бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид с химической формулой [Ge(Thr)(OH)] и способ его получения Российский патент 2024 года по МПК C07F7/30 A61K9/10 A61K31/28 A61K47/36 A61P31/04 

Изобретение относится к области биологически активных соединений и фармакологии и может быть использовано в различных областях техники, преимущественно, в медицине, фармации.

Патентом RU 2233286 (опубликован 20.06.2015) защищен комплекс германийорганического соединения с лекарственным препаратом или биологически активным веществом формулы Lк(ГОС)m(Раств.)n, где L - лекарственный препарат или биологически активное вещество, ГОС - германийорганическое соединение, для терапевтического, профилактического, пищевого, гигиенического и ветеринарного использования, Раств. - неорганический или органический растворитель. Комплекс обладает низкой токсичностью и повышенной активностью. За счет образования комплекса с ГОС расширяется спектр действия исходных косметических и лечебно-косметических средств. Комплексное действие на кожу характеризуется усилением сосудоукрепляющего, регенерирующего, противовоспалительного, бактерицидного и противовирусного действия, что приводит к заметному лечебному и омолаживающему эффекту. Однако для достижения эффективного достижения заявленного результата препарат должен дополнительно включать, по меньшей мере, один лекарственный компонент или биологически активное вещество, выбранное из группы антибактериальных средств.

Патентом RU 2464025 (опубликован 20.10.2012) защищен препарат для лечения и профилактики заболеваний на основе германийорганического соединения формулы C₂₄H₁₀N₃O₁₃Ge, которое является производным пиридиндикарбоновой кислоты и обладает иммуномодулирующей, антибактериальной, антигрибковой и антигельминтной активностями. Однако препарат не обладает пролонгированным действием.

Патентом RU 2171259 (опубликован 27.07.2001) описывается новый германиевый комплекс германия и ароматической или неароматической, циклической или гетероциклической 1,3-дикарбоновой кислоты, например, бис(пиридин-2,6-дикарбонат) германия, обладающий антибактериальной, интерферониндуцируемой и иммуномоделирующей активностью. Однако известный германиевый комплекс не обладает пролонгированным действием и не обладает фунгицидным действием.

Патентом RU 2752934 (опубликован 11.08.2021) описан способ получения комплексного соединения германия, содержащего ациклический полиол, а также аминокислоту или гидроксикислоту и необязательно дополнительно катион металла,

общей формулы (I): Ge[L]_a[A]_b[M]_c (I), где L – ациклический полиол общей формулы (HOCH₂[CH(OH)]_nCH₂OH), где n = 2, 3 или 4, A – аминокислота или гидроксикислота, M – катион металла 2 или 12 группы периодической системы, a = 1 или 2, b = 1, при этом c = 0, когда A представляет собой аминокислоту, или с = 0 или 1, когда A представляет собой гидроксикислоту, причем с не равным 0 значением b. Указанное комплексное соединение необязательно представляет собой этанольный сольват. Все L в комплексном соединении являются одинаковыми или разными. Предложенные соединения обладают антибактериальной активностью и могут быть использованы для профилактики или лечения различных заболеваний полости рта. Однако недостатком является присутствие катионов токсичных металлов (кадмий, ртуть).

Задачей настоящего изобретения является создание способа получения эффективного бактерицидного и фунгицидного препарата пролонгированного действия путем иммобилизации на геле гиалуроновой кислоты бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида для усиления его антимикробного действия.

Раскрытие изобретения

Иммобилизованный бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид на гиалуроновой кислоте представляет собой гель, обладающий повышенной и пролонгированной антимикробной (бактерицидной и фунгицидной) активностью.

Способ получения иммобилизованного на геле гиалуроновой кислоты бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида с химической формулой [Ge(Thr)₂(OH)₂] характеризуется тем, что для приготовления геля смешивают гиалуроновую кислоту с дистиллированной водой в соотношении (0.5-10)/100 в течение 30-40 минут при комнатной температуре, отстаивают полученную смесь в течение 12 часов, повторно перемешивают в течение 30-40 минут и добавляют при перемешивании бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид к полученной гелевой основе в массовом соотношении ≥1/100.

Преимуществом настоящего изобретения является синергетический антимикробный эффект при иммобилизации бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида на геле гиалуроновой кислоты.

Кроме геля гиалуроновой кислоты для иммобилизации бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида в качестве биополимерной матрицы использовали также гель карбоксиметилцеллюлозы, хитозана и пектина.

Способ включает приготовление водного раствора биополимерной матрицы. Иммобилизацию проводили путем введения при перемешивании в гель биополимерной матрицы бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид. Перемешивание проводили до образования однородной смеси.

Вначале было экспериментально определено массовое соотношение гельобразующей биополимерной матрицы и воды. Установлено оптимальное соотношение, обеспечивающее консистенцию геля, пригодную как для иммобилизации бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида, так и для экспериментального изучения антимикробной активности.

Далее было экспериментально установлено соотношение бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида и геля биополимерной матрицы, которое обеспечивало максимальную биологическую активность. Для всех исследуемых гелей биополимерных матриц оптимальное соотношение бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида /гель биополимерной матрицы находился в интервале ≥1/100. Снижение содержания бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида менее 1 массовых частей на 100 массовых частей геля биополимерной матрицы приводило к снижению фунгицидной активности.

Получение геля производили путем смешивания 0.1 грамма гиалуроновой кислоты с 10 г дистиллированной воды в течение 30-40 минут при комнатной температуре. После отстаивания в течение 12 часов проводили повторное перемешивание в течение 30-40 минут. Далее 0.1 г бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида добавляли в полученную гелевую основу при постоянном перемешивании на протяжении 2 часов. Здесь и далее процент адсорбированного соединения определяли по разнице его содержания в суспензии до и после иммобилизации на биополимерной матрице. Иммобилизация составила 80-90% действующего вещества на биополимерной матрице.

Иммобилизацию бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида на карбоксиметилцеллюлозе проводили следующим образом. В реакторе с водяным термостатом в 68 г смеси дистиллированной воды и глицерина, нагретой до температуры 55^оС, растворяли при перемешивании карбоксиметилцеллюлозу массой 2.72 г до образования гомогенной однородной массы. Далее в раствор вводили сорбат калия, используемый в качестве консерванта. Далее добавляли в раствор 0.75 г белого аморфного порошка бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида и перемешивали до образования однородной массы.

Иммобилизацию бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида на хитозане проводили следующим образом. Для увеличения удельной площади поверхности порошок хитозана вначале измельчали в фарфоровой шаровой мельнице. Далее рассеивали на лабораторных микронных ситах. К 50 мг хитозана добавляли 50 мг белого аморфного порошка бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида и растворяли в 5 г 0.05 М глицинового буфера с рН=10.5 при постоянном перемешивании.

Иммобилизацию бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида на пектине проводили следующим образом. Получение геля производили путем смешивания 5 г пектина с 25 г дистиллированной водой в течение 30-40 минут при комнатной температуре. После отстаивания в течение 12 часов проводили повторное перемешивание в течение 30-40 минут. Иммобилизацию проводили путем внесения 0.3 г бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида в раствор пектина при постоянном перемешивании магнитной мешалкой в течение 10 минут.

Для доказательства пролонгированного антимикробного эффекта бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида, иммобилизованного на геле гиалуроновой кислоты, были проведены микробиологические исследования. Для этого использовали свежеприготовленный бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид, иммобилизованный на геле гиалуроновой кислоты в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), а также бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида, иммобилизованное на геле гиалуроновой кислоты, находившееся в ЗФР в течение 3-х и 7 дней (время лечения неосложненных инфекций).

Определяли минимальную ингибирующую (МИК) и минимальную бактерицидную/фунгицидную (МБК) концентрации бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида в свежеприготовленным растворе, а также после 3-х и 7 дней нахождения соединения в ЗФР.

Исследование проводили на чистых культурах Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Candida albicans. Для приготовления бактериальной суспензии использовали чистые культуры бактерий в мясопептонном бульоне (МПБ) после 24-часового культивирования (37ºC) («суточная» культура). Для культивирования кандид использовали декстрозный бульон Сабуро. Осуществляли посев исследуемых микроорганизмов в концентрации 0.5 по McFarland в объёме 100 мкл бульона в 96-луночные планшеты. Затем в лунки добавляли по 100 мкл суспензии бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида в качестве контроля в лунки с суспензией микроорганизмов добавляли по 100 мкл питательной среды. Планшеты термостатировали 24 ч. при 37°С. По окончании инкубации определяли минимальную ингибирующую концентрацию бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида. Проводили высев (по 50 мкл) из каждой лунки планшета без видимого роста микроорганизмов на чашки Петри с мясопептонным агаром, посевы инкубировали 24 ч. при 37°С. По окончании инкубации производили определение
минимальной бактерицидной/фунгицидной концентрации бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида. Было установлено, что антимикробная активность бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида в жидкости полностью сохраняется, как минимум, на протяжении 7 суток. (табл. 1).

Синергизм бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида и различных вариантов гелей биополимерных матриц (гиалуроновая кислота, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан, пектин) характеризуется тем, что при нахождении бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида в геле биополимерной матрицы требуется его меньшая концентрация в композиционном материале для получения антимикробного эффекта (таблица 2). Вещества, входящие в состав геля биополимерных матриц (гиалуроновая кислота, карбоксиметилцеллюлоза, хитозан, пектин) не обладают собственной антимикробной активностью. Однако, они способны удерживать мелкодисперсные частицы бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида вблизи обрабатываемой поверхности, обеспечивая между ними очень плотный длительный контакт. Увеличение адгезии и биодоступности бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида для обрабатываемой поверхности усиливает тем самым его антимикробное воздействие.

Таблица 1. Минимальная ингибирующая (МИК) и минимальная бактерицидная/фунгицидная (МБК) концентрации свежеприготовленного бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида, а также иммобилизованного на гель гиалуроновой кислоты бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида после длительной экспозиции (3, 7 суток) в забуференном физиологическом растворе

Название м/о Свежеприготовленный [Ge(Thr)₂(OH)₂], иммобилизованный на гель гиалуроновой кислоты [Ge(Thr)₂(OH)₂], иммобилизованный на гель гиалуроновой кислоты после 3-х сутокинкубации в ЗФР [Ge(Thr)₂(OH)₂], иммобилизованный на гель гиалуроновой кислоты после 7 сутокинкубации в ЗФР МИК, мг/мл МБК, мг/мл МИК, мг/мл МБК, мг/мл МИК, мг/мл МБК, мг/мл Staphylococcus aureus 2.5 10 2.5 10 2.5 10 Enterococcus faecalis 10 40 10 40 10 40 Escherichia coli 2.5 20 2.5 20 2.5 20 Klebsiella pneumoniae 10 40 10 40 10 40 Pseudomonas aeruginosa 2.5 10 2.5 10 2.5 10 Acinetobacter baumannii 10 10 10 10 10 10 Candida albicans 10 20 10 20 10 20

Таблица 2. Минимальная ингибирующая (МИК) и минимальная бактерицидная/ фунгицидная (МБК) концентрации бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида, а также бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида, иммобилизованного на различных биополимерных матрицах

Название м/о бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид Гиалуроновая кислота бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид на геле карбоксиметилцеллюлозе бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид на геле хитозана бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид на геле пектина бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид на геле гиалуроновой кислоты, пред-лагаемый способ МИК, мг/мл МБК, мг/мл МИК, мг/мл МБК, мг/мл МИК, мг/мл МБК, мг/мл МИК, мг/мл МБК, мг/мл МИК, мг/мл МБК, мг/мл МИК, мг/мл МБК, мг/мл Staphylococcus aureus 2.5 10 - - 2 10 2 10 2.5 7.5 2 7.5 Enterococcus faecalis 10 40 - - 7.5 40 7.5 40 10 30 7.5 30 Escherichia coli 2.5 20 - - 2.5 20 2.5 20 2.5 15 2 10 Klebsiella pneumoniae 10 40 - - 10 30 10 30 10 40 7.5 30 Pseudomonas aeruginosa 2.5 10 - - 2.5 10 2.5 10 2.5 10 2 7.5 Acinetobacter baumannii 10 10 - - 10 10 10 10 10 7.5 7.5 7.5 Candid aalbicans 10 20 - - 10 20 10 20 10 20 7 10

Для подтверждения усиления антимикробного эффекта (синергизма), обеспечиваемого иммобилизацией бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида на биополимерной матрице, использовали субстанции в различных концентрациях бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида (табл.2). Определяли МИК и МБК бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида, включенного в различные биополимерные матрицы.

Для приготовления бактериальной суспензии использовали чистые культуры Escherichia coli и Staphylococcus aureus бактерий в МПБ после 24-часового культивирования (37ºC). Для культивирования Candida albicans используют бульон

Сабуро. Осуществляли посев исследуемых микроорганизмов в концентрации 0,5 по McFarland в объёме 100 мкл бульона в 96-луночные планшеты. Затем в лунки добавляли по 100 мкл раствора субстанции с соединением германия; в качестве контроля в лунки с суспензией микроорганизмов добавляли по 100 мкл питательной среды. Планшеты термостатировали 24 ч при 37°С. По окончании инкубации определяли минимальную ингибирующую концентрацию соединения германия в субстанции, затем проводили высев (по 50 мкл) из каждой лунки планшета без видимого роста микроорганизмов на чашки Петри с мясопептонным агаром. Посевы инкубировали в течение суток в термостате при 37°С. По окончании инкубации производили определение минимальной бактерицидной/фунгицидной концентрации соединения германия в композиционном материале.

Было установлено, что среди всех изученных образцов, наиболее сильным синергизмом в антимикробной активности обладает бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид, иммобилизованный на геле гиалуроновой кислоты (табл. 3). Данный вариант иммобилизованного бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида показал антимикробное действие как в отношении бактерий Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, так и в отношении микромицетов Candida albicans. Минимальное ингибирующее действие в отношении бактерий отмечается при концентрации бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида 2 мг на 1 г геля гиалуроновой кислоты, а минимальное бактерицидное – при 7.5 мг на 1 г геля. Эффект ингибирования микромицетов заметен при концентрации бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида 7.5 мг на 1 г геля гиалуроновой кислоты, а полное отсутствие роста грибов - при 10 мг на 1 г геля (1/100).

Таким образом экспериментально установлено, что заявляемый эффект достигается при соотношении бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида/гель гиалуроновой кислоты как ≥1/100.

Группа изобретений относится к химии и фармацевтике, а именно к иммобилизованному на геле гиалуроновой кислоты бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксиду с химической формулой [Ge(Thr)₂(OH)₂], обладающему антимикробной активностью пролонгированного действия, и к способу его получения. Предложенный способ характеризуется следующими стадиями: для приготовления геля смешивают гиалуроновую кислоту с дистиллированной водой в массовом соотношении (0,5-10)/100 соответственно в течение 30-40 мин при комнатной температуре; отстаивают полученную гелевую основу в течение 12 ч и повторно перемешивают в течение 30-40 мин; затем добавляют при перемешивании бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид к полученной гелевой основе в массовом соотношении, большем или равном 1/100 соответственно. Группа изобретений обеспечивает синергетический антимикробный эффект. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения иммобилизованного на геле гиалуроновой кислоты бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксида с химической формулой [Ge(Thr)₂(OH)₂], характеризующийся тем, что для приготовления геля смешивают гиалуроновую кислоту с дистиллированной водой в массовом соотношении (0,5-10)/100 соответственно в течение 30-40 мин при комнатной температуре, отстаивают полученную гелевую основу в течение 12 ч и повторно перемешивают в течение 30-40 мин, затем добавляют при перемешивании указанный бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид к полученной гелевой основе в массовом соотношении, большем или равном 1/100 соответственно.

2. Иммобилизованный на геле гиалуроновой кислоты бис(L-треонинат) германия (IV) дигидроксид с химической формулой [Ge(Thr)₂(OH)₂], обладающий антимикробной активностью пролонгированного действия, полученный способом по п.1.