Способ получения низкомолекулярных гидролизных пептидов из молочной сыворотки Российский патент 2024 года по МПК A23J3/34 A23J3/30 A23J1/20 A23J3/08 

Изобретение относится к области переработки молочной сыворотки. Белки, содержащиеся в молочной сыворотке и концентратах сывороточных белков, обладают ценными биологическими свойствами. Наибольшее практическое значение имеют β-лактоглобулин и α-лактоальбумин, доля которых в сывороточных белках составляет 70-80%. Аминокислотный состав этих белков наиболее близок к аминокислотному составу мышечной ткани человека, а по содержанию незаменимых аминокислот (лизина, триптофана, метионина, треонина) и аминокислот с разветвленной цепью (валина, лейцина и изолейцина) они превосходят все остальные белки животного и растительного происхождения.

Гидролиз сывороточных белков может быть осуществлен при действии химических агентов (щелочь, кислота) или ферментных препаратов.

Наибольший интерес вызывает именно ферментативный гидролиз, позволяющий получить гидролизаты с заданными свойствами.

Известно, что белки молочной сыворотки: β-лактоглобулин, α-лактальбумин - являются основными аллергенами молока. Для снижения аллергенных свойств проводят ферментативный гидролиз сывороточных белков. Осуществлен сравнительный анализ гидролизатов белков молока, представленных на мировом рынке, для сопоставления пептидного и аминокислотного профиля продуктов аналогов с учетом специфики применения гидролизатов. Рассмотрены гидролизаты сывороточных белков фирмы Ingredia (Франция) и Hilmar (США) согласно информации, предоставленной производителями. По результатам анализа продуктов аналогов зарубежного производства установлено, что 1) основными характеристиками гидролизатов являются: степень гидролиза белка, пептидный и аминокислотный профили; 2) использование гидролизата как компонента детского и специализированного питания предполагает глубокий гидролиз молочного белка (степень гидролиза преимущественно составляет 22-29%), 99% пептидной фракции должны быть представлены короткоцепочечными пептидами с молекулярной массой менее 10 кДа с отсутствием высокомолекулярной фракции (>20 кДа), а также сбалансированный аминокислотный состав.

В качестве наиболее близкого аналога был выбран патент США US 5356637 А, из которого известен ферментативный гидролизат, богатый ди- и трипептидами, получаемый путем ферментативного протеолиза смеси белков, предварительно подвергнутых термической обработке. Богатый ди- и трипептидами гидролизат извлекается путем разделения жидкости и твердого вещества с последующей ультрафильтрацией, а затем стерилизуется и сушится.

Разработанный способ получения низкомолекулярных гидролизных пептидов из молочной сыворотки основан на гибридном ферментно-электрохимическом гидролизе, при котором раствор концентрата сывороточных белков смешивают с ферментом и пропускают через катодную камеру в электролизере проточного типа.

Электролизер проточного типа с полупроницаемой мембраной - является аппаратом для электрохимического гидролиза (ЭХГ).

Пример 1. Базовый метод

Перед внесением ферментов начальное значение рН доводят путем добавления водного 5% раствора щелочи гидроксида натрия (калия). Раствор белка получают из концентрата сывороточного белка, а гидролиз ведут при температуре 50°С в течение 8 часов, с начальным рН 8,5 ед., ультрафильтрацию гидролизата осуществляют на мембранах с пропускной способностью 10 кДа (до массовой доли сухих веществ в концентрате 20-22%, после чего полученный концентрат пастеризуют при температуре (70-80)°С в течение 30 с и сушат на распылительной сушилке. При этом методе степень гидролиза сывороточных белков составляет не более 31% при применении протеолитических фермента бромелайн в течение 8 часов.

Пример 2. Экспериментальный метод, вариант 1

Раствор изолята сывороточного белка пропускается через катодную камеру электролизера, t (р-ра) = 21,5°С, со скоростью потока 5 л/мин, плотность тока в катодной камере 600mA/см², окислительно-восстановительный потенциал =-980 мВ, РН=8,5. При этом методе степень гидролиза сывороточных белков составляет не более 35% при применении протеолитических фермента бромелайн в течение 8 часов.

Пример 3. Экспериментальный метод, вариант 2

Раствор изолята сывороточного белка пропускается через катодную камеру аппарата для электрохимического гидролиза (ЭХГ), t (р-ра) = 35,5°С, со скоростью потока 5 л/мин, плотность тока в катодной камере 600 mA/см², окислительно-восстановительный потенциал =-980 мВ, РН=8,5. При этом методе степень гидролиза сывороточных белков составляет не более 53% при применении протеолитических фермента бромелайн в течение 8 часов.

Таблица 1 (степень гидролиза)

Степень гидролиза, % Продолжительность гидролиза, ч 4 часа 8 часов Бромелайн, PH=8,5, t=50,0°С 19,51±0,9 30,92±1,7 Бромелайн, ЭХГ плотность тока 600 mA/см², t=21,5°С 20,77±0,8 34,19±0,9 Бромелайн, ЭХГ плотность тока 600 mA/см², t=35,5°С 36,44±0,5 52,22±0,6

Согласно приведенным в Табл. 2 результатам можно сделать вывод о том, что гибридный метод практически полностью гидролизует β-лактоглобулиновую фракцию, остальные белковые компоненты фракций сывороточных белков подвергаются биохимической трансформации. В большей степени биоизменениям подверглась фракция α-лактальбумин и иммуноглобулинов, массовая доля азота за период ферментации снизилась в 4,5 раза, снижение массовой доли азота фракции сывороточного альбумина почти в 3,0 раза, а массовая доля азота фракции протеозо-пептонов снизилась почти в 2 раза. Установленная закономерность связана с отщеплением от фракций сывороточных белков аминокислотных остатков и пептидов с различной молекулярной массой.

Таблица 2 (фракционный состав)

Образец Массовая доля азота во фракциях, % Общее содержание β-лактоглобул ин α-лактальбумин Сывороточный альбумин иммуноглобулины протеозопептоны До ферментации 8,75±0,51 4,16±0,13 1,66±0,08 0,54±0,02 1,38±0,08 1,01±0,05 Бромелайн, PH=8,5, t=50,0°С 2,79±0,13 1,53±0,04 0,29±0,06 0,31±0,01 0,84±0,05 0,69±0,01 Бромелайн, ЭХГ плотность тока 600 mA/см², t=21,5°С 1,82±0,12 0,55±0,02 0,25±0,06 0,23±0,02 0,51±0,05 0,72±0,05 Бромелайн, ЭХГ плотность тока 600 mA/см², t=35,5°С 1,62±0,12 0,49±0,02 0,18±0,03 0,13±0,02 0,30±0,05 0,52±0,05

В Табл. 3 приведены данные фракционного состава концентрата сывороточных белков до и после ферментативного гидролиза, полученных при применении различных ферментных препаратов.

Таблица 3 Фракционный состав концентрата сывороточных белков до и после ферментативного и гибридного гидролиза (n=5)

Наименование фракции Массовая доля азота во фракциях, % До гидролиза Бромелайн, PH=8,5, t=50,0°С Бромелайн, ЭХГ плотность тока 600 mA/см², t=21,5°С Бромелайн, ЭХГ плотность тока 600 mA/см², t=35,5°С β-лактоглобулин (β-Лг) 4,16±0,13 1,44±0,02 1,39±0,08 1,32±0,05 α-Лактальбумин (α-Ла) 1,66±0,08 0,57±0,03 0,55±0,02 0,52±0,02 Сывороточный альбумин сыворотки (СА) 0,54±0,02 0,18±0,01 0,18±0,18 0,17±0,06 Иммуноглобулины, в т.ч. 1,38±0,08 0,48±0,02 0,46±0,02 0,44±0,02 иммуноглобулин G1 (Ig G1) 0,58±0,05 0,20±0,01 0,19±0,01 0,18±0,008 иммуноглобулин G2 (Ig G2) 0,27±0,01 0,09±0,003 0,09±0,01 0,08±0,005 иммуноглобулин A (Ig A) 0,29±0,01 0,10±0,006 0,09±0,01 0,09±0,003 иммуноглобулин М (Ig M) 0,24±0,01 0,08±0,003 0,08±0,01 0,07±0,003 протеозо-пептоны 1,01±0,05 0,35±0,01 0,34±0,01 0,31±0,02 ВСЕГО: 8,75±0,51 3,033±0,15 2,93±0,14 2,77±0,13

В процессе ферментативного гидролиза сывороточных белков бромелайном массовая доля β-лактоглобулина, α-лактальбумина, сывороточного альбумина и иммуноглобулинов сократилась в 3,0 раза. Также изменению подверглись протеозо-пептоны - в процессе гидролиза термолизином они сократились в 2,9 раза.

При гидролизе бромелайном с ЭХГ плотностью тока 600 mA/см², t=21,5°С наблюдаются схожие значения изменений фракций белков: остаточное количество β-лактоглобулина, α-лактальбумина, сывороточного альбумина и иммуноглобулинов уменьшилось в 3,2 раза.

В случае гидролиза сывороточных белков бромелайном с ЭХГ плотность тока 600 mA/см², t=35,5°С массовая доля вышеуказанных фракций уменьшилась в 2,9 раза.

Увеличение концентрации аминного азота в гидролизате, и, соответственно, степени гидролиза хорошо коррелирует с изменением других параметров, например, его молекулярно-массового состава. В связи с чем были проведены исследования молекулярно-массового распределения белковых фракций, образующихся под действием протеолитических ферментов. Анализ белкового и пептидного профиля представлен на фигуре.

Анализ представленных результатов электрофоретического разделения позволяет сделать вывод о том, что в ходе ферментативного гидролиза сывороточных белков происходит перераспределение фракций, при этом соотношение отдельных фракций зависит от вида используемого ферментного препарата (Табл. 4).

Таблица 4 Молекулярно-массовое распределение белков и пептидов в результате ферментативного гидролиза (n=5)

Молекулярная масса, кДа Массовая доля фракций, % Бромелайн, PH=8,5, t=50,0°С Бромелайн, ЭХГ плотность тока 600mA/см², t=21,5°С Бромелайн, ЭХГ плотность тока 600mA/см², t=35,5°С Более 50 12,53±0,6 10,77±0,53 10,21±0,3 50-30 23,9±0,7 13,26±0,66 13,42±0,7 29-11 18,0±0,4 9,97±0,49 10,7±0,6 10-5 21,0±1,5 21,12±1,05 29,15±0,46 Менее 5 24,12±1,7 33,88±0,7 34,5±0,73

Данные, представленные в Табл. 4, показывают, что гидролизаты, подвергаемые электрофорезу, представляет собой смесь соединений белковой природы, молекулярная масса которых находится в пределах от 5 до 50 кДа.

На фигуре представлена электрофореграмма гидролизатов сывороточных белков:

1 - маркер молекулярных масс;

2 - ГСБ при использовании Бромелайн, PH=8,5, t=50,0°С;

3 - ГСБ при использовании Бромелайн с ЭХГ плотность тока 600 mA/см², t=21,5°С;

4 - ГСБ при использовании Бромелайн с ЭХГ плотность тока 600 mA/см², t=35,5°С.

Гидролитическое расщепление белков начинается через небольшой промежуток после внесения ферментных препаратов, поэтому уже после 10-15 минут гидролиза часть белковых веществ переходит частично в растворимое состояние, и на электрофореграмме (фигура) наблюдается изменение фракционного состава.

Большая часть фракций приходится на белки с низкой молекулярной массой - 10-5 кДа составило 21-29%, менее 5 кДа составило 33-35%. Суммарно 55-65%. При гидролизе в течение 8 ч массовая доля фракций с молекулярным весом более 50 кДа заметно сокращается, и изменения составляют от 10,21 до 12,46% (в зависимости от метода).

Изобретение относится к области переработки молочной сыворотки. Раскрыт способ получения низкомолекулярных гидролизных пептидов из молочной сыворотки, характеризующийся тем, что пропускают раствор изолята сывороточного белка с протеолитическим ферментом Бромелайн в течение 8 часов через катодную камеру аппарата для электрохимического гидролиза при температуре 35,5°С, со скоростью потока 5 л/мин, плотностью тока в катодной камере 600 mA/см², окислительно-восстановительным потенциалом -980 мВ и pН 8,5. Изобретение позволяет получить низкомолекулярные гидролизные пептиды из молочной сыворотки. 1 ил., 4 табл., 3 пр.

Способ получения низкомолекулярных гидролизных пептидов из молочной сыворотки, заключающийся в пропускании раствора изолята сывороточного белка с протеолитическим ферментом Бромелайн в течение 8 часов через катодную камеру аппарата для электрохимического гидролиза при температуре 35,5°С, со скоростью потока 5 л/мин, плотностью тока в катодной камере 600 mA/см², окислительно-восстановительным потенциалом -980 мВ и pН 8,5.