Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs753856 (С>G) гена HSPA6 молекулярно-генетическим методом исследования.
Уровень техники. HSPA6 представляет собой молекулярный шаперон, который участвует в широком спектре клеточных процессов, включая защиту протеома от стресса, сворачивание и транспорт вновь синтезированных полипептидов, активацию протеолиза неправильно свернутых белков, а также образование и диссоциацию белковых комплексов. Играет ключевую роль в системе контроля качества белков, обеспечивая правильное сворачивание белков, повторное сворачивание неправильно свернутых белков и контролируя направление белков для последующей деградации. Заболевания, связанные с HSPA6, включают гепатоцеллюлярную карциному. [https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=HSPA6&keywords=HSPA6].
Ген HSPA6 (Gene ID: 3310) локализован на хромосоме 1q23.3. Согласно SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] полиморфный вариант rs753856 HSPA6 является таргетным (то есть репрезентативным однонуклеотидным полиморфизмом в геномной области с высокой степенью неравновесия по сцеплению с группами других полиморфных локусов, составляющих гаплотип). SNP rs753856 (С>G), позиция chr1:161526344 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs753856] представляет собой миссенс-вариант. SNP rs753856 отличается высокой функциональной значимостью. Согласно биоинформатическому ресурсу GTEx Portal, данный генетический вариант влияет на экспрессию генов RPS23P10, FCRLA в различных органах и тканях посредством eQTL-эффектов [https://gtexportal.org/home/snp/rs753856]. Кроме того, обнаружено его влияние на модификации гистонов [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs753856], а также на связывание с транскрипционными факторами [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs753856 (С>G) гена HSPA6.
Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006–2016 //Nature protocols. – 2017. – Vol. 12. – №. 2. – P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.
За прототип выбран способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. – 2022. – Vol. 2. – №. 5. – P. 385-404]. Однако, данный метод характеризуется высокой стоимостью, поскольку требует приобретения наборов спектральных чипов и дорогостоящих реактивов для проведения генотипирования, характеризуется высокой стоимостью оборудования, требует наличия высококвалифицированного персонала, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.
Методов таргетного генотипирования полиморфизма rs753856 (С>G) гена HSPA6 с применением аллель-специфических флюоресцентных зондов до настоящего времени разработано не было.
Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма полиморфизма rs753856 (С>G) гена HSPA6, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.
Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs753856 (С>G), локализованного в позиции chr1:161526344 (GRCh38.p14) гена HSPA6 (Gene ID: 3310) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.
Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs753856 (С>G) гена HSPA6 осуществляют с использованием прямого праймера rs753856 5′-TGAGGATGAGGCCCAGAGG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs753856 5′-AGCCAGGCAAGGACTTCC-3′ (SEQ ID NO 2), rs753856-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM)CCTTAGGGACAAGATTCC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs753856-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX)CCTTAGGGAGAAGATTCC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs753856 гена HSPA6 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs753856-C/C показаны оранжевыми кругами, генотипы rs753856-C/G показаны зелеными треугольниками, генотипы rs753856-G/G показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.
Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:
1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [C/G] rs753856 HSPA6, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:
прямой общий праймер rs753856 5′-TGAGGATGAGGCCCAGAGG-3′ (SEQ ID NO 1),
обратный общий праймер rs753856 5′-AGCCAGGCAAGGACTTCC-3′ (SEQ ID NO 2).
Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена HSPA6 составляет 162 пары нуклеотидов
(TGAGGATGAGGCCCAGAGGGACAGAGTGGCTGCCAAAAACTCGCTGGAGGCCCAT
GTCTTCCATGTGAAAGGTTCTTTGCAAGAGGAAAGCCTTAGGGA[C/G]AAGATTCCC
GAAGAGGACAGGCGCAAAATGCAAGACAAGTGTCGGGAAGTCCTTGCCTGGCT).
2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. – New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.
На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:
rs753856-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)CCTTAGGGACAAGATTCC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs753856-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)CCTTAGGGAGAAGATTCC(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).
3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.
4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 58°C в течение 1 минуты].
5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs753856 160 человек (80%) индивидуумов оказались гомозиготами по аллелю C (генотип C/C), 36 человек (18%) являлись гетерозиготами (генотип C/G), 4 человека (2%) оказались гомозиготами по аллелю G (генотип G/G).
6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs753856 (С>G) гена HSPA6 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).
Осуществление изобретения.
Способ осуществляют следующим образом:
1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37˚C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.
2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.
3. Анализ полиморфизма rs753856 (С>G) гена HSPA6 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).
ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0.03 мM каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 58°C в течение 1 минуты].
4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs753856 (С>G) гена HSPA6 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю С, зонд с красителем ROX - аллелю G (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов – соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот С/С. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот С/G.
Резюме.
Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs753856 (С>G) гена HSPA6 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена HSPA6 , а также в научных целях.
--->
<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC "-
//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">
<ST26SequenceListing productionDate="2024-05-03" softwareVersion="2.3.0"
softwareName="WIPO Sequence" fileName="Способ генотипирования полиморфного
локуса rs753856 (С G) гена HSPA6 у человека методом ПЦР в режиме «реального
времени» с применением аллель- специфических флуоресцентных зондов.xml"
dtdVersion="V1_3">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText/>
<FilingDate/>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>2021</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный
медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской
Федерации,</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Kursk State Medical University</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ генотипирования полиморфного локуса
rs753856 (С>G) гена HSPA6 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени»
с применением аллель- специфических флуоресцентных зондов</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgaggatgaggcccagagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>agccaggcaaggacttcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccttagggacaagattcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccttagggagaagattcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан cпособ генотипирования полиморфного локуса rs753856 (С>G) гена HSPA6 у человека методом ПЦР в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs753856 (С>G), локализованного в позиции chr1:161526344 (GRCh38.p14) гена HSPA6 (Gene ID: 3310) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащих флуорофоры FAM и ROX. 1 ил.
Способ генотипирования полиморфного локуса rs753856 (С>G) гена HSPA6 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs753856 (С>G) гена HSPA6 осуществляют с использованием прямого праймера rs753856 5'-TGAGGATGAGGCCCAGAGG-3' (SEQ ID NO: 1), обратного праймера rs753856 5'-AGCCAGGCAAGGACTTCC-3' (SEQ ID NO: 2), rs753856-C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(FAM)CCTTAGGGACAAGATTCC(RTQ1)-3' (SEQ ID NO: 3), rs753856-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5'-(ROX)CCTTAGGGAGAAGATTCC(BHQ2)-3' (SEQ ID NO: 4).
