СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ ATRAGENE SPECIOSA WEINM. (КНЯЖИК СИБИРСКИЙ) Российский патент 2011 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в фармакологической промышленности при получении тритерпеновых сапонинов и флавоноидов из клеточной культуры растения in vitro. Эти соединения входят в состав биологически активных веществ княжика сибирского и обладают адаптогенной и ноотропной активностью.

Известны способы получения и культивирования клеток лекарственных растений: женьшеня настоящего (Panax ginseng С.А.Меу) - продуцента гинзенозидов (патенты РФ №1824114, 2010857, 2038378, 2067819); марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) - продуцента антрахинонов (патент РФ №2141525); Lithospermum erythrorhizon Sieb. et Zucc. - продуцента шиконина, Cnidium monniery (L.) Cuss. (Selinum monnieri L.) - продуцента препарата с рибонуклеазной активностью (патент РФ №2031940), в которых используются различные питательные среды.

Известные способы и питательные среды не могут быть использованы для регуляции содержания веществ с адаптогенной и ноотропной активностью.

Известно, что на продукционный процесс в культуре клеток in vitro могут воздействовать факторы внешней среды. Так, в культурах in vitro чайного растения под действием света увеличивается биосинтез полифенолов. В культуре клеток Scopolia parviflora свет, напротив, подавляет образование алкалоидов. Более 20 флавонов и флавоноловых гликозидов образуется в культурах клеток петрушки после освещения ее непрерывным люминесцентным светом «холодный белый» [1]. Выявлено действие света и темноты на рост и морфогенез 5-ти штаммов тканевых культур женьшеня (Panax ginseng), а также на образование и распределение у них специфичных тритерпеноидных сапонинов, женьшенозидов. Для каждого из 5-ти штаммов определены ростовые параметры [2]. Установлено, что свет оказывает положительное действие на образование женьшенозидов в хлорофиллсодержащих тканях. Наибольшее количество женьшенозидов в темноте образуется в бесхлорофилльных тканях, выращенных из корней женьшеня. В работах других авторов также отмечается влияние света и регуляторов роста на продукционный процесс растений в контролируемых условиях искусственной экосистемы [13, 14]. Накопление биологически активных веществ связано с возникновением в тканях специализированных клеток.

При культивировании клеточных культур продукционный процесс может быть оптимизирован добавлением физиологически активных соединений - регуляторов роста и элиситоров, в частности гормонов. В последние годы среди регуляторов большое внимание уделяется эпибрассинолидам - классу фитогормонов с широким спектром биологической активности [3]. Существует сравнительно немного данных о действии эпибрассинолида на культуры тканей растений, причем описываемые эффекты противоречивы [4-6]. Исследования по влиянию эпибрассинолида на динамику роста Nicotiana tabacum L. показали изменение размера клеток и содержания в них нуклеиновых кислот. Значительное усиление каллусогенеза наблюдалось при добавлении эпибрассинолида в концентрации 10^-5 М [7]. Индукция каллусогенеза происходит даже при незначительном введении эпибрассинолида (10^-9 М) до 21 суток [8].

В работе Hayashi Hiroaki и др. показано усиление биосинтеза олеаноловой кислоты - агликона соответствующего тритерпенового сапонина в культуре клеток Glycyrrhiza glabra под действием гормона-элиситора жасмоновой кислоты в количестве 10-100 мМ [9].

Способ регуляции содержания биологически активных веществ, наиболее близкий к заявленному изобретению, изложен в работе «Влияние интенсивности и качества спектральных характеристик света на рост и биосинтез фенилэтанольных гликозидов каллуса Cistanche deserticola», выполненной в Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences (J.Ouyang et al. / Plant Science №165, 2003. P.657-661). Способ касается выращивания каллусной культуры Cistanche deserticola - продуцента фенилэтанольных гликозидов медицинского назначения - в условиях освещения светом различного частотного диапазона при субкультивировании, что увеличивает выход целевого продукта. Способ принят за прототип.

Основными недостатками способа-прототипа являются продолжительное в течение 30 суток с фотопериодом 16 часов использование монохроматического (435 nm) спектрального освещения и низкий выход биологически активных веществ и биомассы клеток, что не позволяет получать в достаточном количестве культуру, содержащую ноотропно-активные вещества. Кроме того, использование дорогостоящих источников монохроматического света удорожает целевой продукт.

Интерес к введению княжика сибирского в асептическую культуру in vitro вызван возможностью получения биологически активных веществ, в том числе тритерпеновых сапонинов и флавоноидов, перспективой создания на их основе ноотропного и адаптогенного фитопрепарата. Княжик сибирский Atragene speciosa Weinm. (сем. Ranunculaceae) - многолетнее растение, произрастающее в таежных лесах Сибири. Надземная биомасса княжика сибирского используется в народной медицине для лечения сердечно-сосудистых, гинекологических и опухолевых заболеваний как кардиотоническое, противоревматическое, диуретическое, ранозаживляющее, болеутоляющее и общеукрепляющее средство. В ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН и в СибГМУ в дикорастущем княжике сибирском обнаружены фенолоспирты, флавоноиды, антрахиноны, кумарины, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, алкалоиды, тритерпеновые сапонины, полисахариды, каротиноиды и органические кислоты. Исследования экстракта княжика сибирского показали, что он обладает выраженным антистрессорным и противоневротическим действием, не уступая по своей активности диазепаму, но без его побочных проявлений. Установлено, что экстракт княжика сибирского оказывает ноотропное и противоязвенное действие, обладает противосудорожными, транквилизирующими, стресс-протективными свойствами [10]. Фракции, полученные из экстракта, проявляют выраженный ноотропный и противоишемический эффекты [11].

Поскольку Atragene speciosa Weinm. имеет разреженный ареал произрастания, имеются трудности сбора лекарственного сырья в достаточном количестве. Жизненная форма княжика сибирского - лиана, поэтому интродукция этого растения невозможна.

В Томском государственном университете на кафедре физиологии растений и биотехнологии была впервые получена каллусная культура растительных клеток княжика сибирского in vitro в качестве продуцента физиологически активных веществ. В отличие от способа-прототипа, пригодного для культуры Cistanche deserticola, биомасса культуры Atragene speciosa Weinm. интенсивнее накапливается при освещении белым светом.

Задача изобретения - регулировать накопление как суммарной биомассы клеток клеточной культуры Atragene speciosa Weinm., так и тритерпеновых сапонинов и флавоноидов, в них содержащихся.

Для решения поставленной задачи прирост биомассы и выход БАВ стимулируют действием белого света и гормонов. Разработан способ, включающий посадку инокулюма на питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) с регулируемым содержанием 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, 6-бензиламинопурина и мезоинозита, культивирование ведут на белом свету интенсивностью (2-4)×10³ лк с фотопериодом 12-14 час, сбор биомассы с целью выделения биологически активных веществ осуществляют через 25 суток. Кроме того, эффективность культивирования повышена путем добавления в питательную среду фитогормона 24-эпибрассинолида, что неочевидно, и найден оптимальный диапазон его концентраций.

Для культивирования Atragene speciosa Weinm. in vitro используют модифицированные питательные среды Мурасиге-Скуга: агаризованную для каллусной культуры или с исключением агара и CaCl₂ для суспензионной культуры (таблица 1).

Таблица 1 Состав модифицированной среды МС для каллусогенеза Atragene speciosa Weinm. Компоненты Концентрация, мг/л Неорганические компоненты: KNO₃ 1900 KH₂PO₄ 170 NH₄NO₃ 1650 MgSO₄×7H₂O 370 CaCl₂×2H₂O 440 FeSO₄×7H₂O 37,3 Na₂EDTA×2H₂O 27,8 KI 0,83 Н₃ВО₃ 6,2 MnSO₄×4H₂O 22,3 CoCl₂×6H₂O 0,025 CuSO₄×5H₂O 0,025 ZnSO₄×7H₂O 8,6 Na₂MoO₄×2H₂O 0,25 Органические компоненты: сахароза 30000 агар-агар 6500-7500 Витамины: тиамин-HCl 0,5-1,5 пиридоксин-HCl 0,4-0,6 никотиновая кислота-HCl 0,4-0,6 Гормоны: 2,4-дихлорфеноксиуксусная к-та 0,6-1,2 6-бензиламинопурин 0,4-0,6 вода дистиллированная до 1 л

Признаки, общие с прототипом: получают продукт с ноотропной активностью, процесс реализуют in vitro, используют освещение светом, выращивание каллуса стимулируют фитогормоном.

Признаки, отличающие изобретение от прототипа: культивирование ведут на белом свету интенсивностью (2-4)×10³ лк с фотопериодом 12-14 час, концентрацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты выбирают из диапазона 0,6-1,2 мг/л, концентрацию 6-бензиламинопурина - из диапазона 0,2-0,6 мг/л, концентрацию мезоинозита - из диапазона 100-125 мг/л.

Способ по изобретению позволяет сократить фотопериод до 14 часов, причем продолжительность культивации сокращается до 25 суток, что достаточно для увеличения выхода биологически активных веществ из каллуса княжика сибирского.

Экспериментально показано, что культивирование каллусной культуры княжика сибирского на монохроматическом красном свету, в отличие от прототипа, приводит к угнетению ростовых показателей до 62% от контроля. В каллусе 25-26-го субкультивирований, выращенном на белом свету, обнаружено десять фракций высокополярных тритерпеновых сапонинов, в темноте - восемь, а на красном свету - только пять фракций тритерпеновых сапонинов.

Повреждающий эффект красного света наблюдался в работах, где выявлена контрастная реакция различных видов растений на красный свет по сравнению с белым светом. Этот факт отмечен и при работе с культурой клеток руты при переходе на фотогетеротрофное питание [15].

Прирост сырой биомассы оценивали по общепринятому показателю - ростовому индексу, определяя средние значения начальной и конечной биомассы. Сухую массу определяли, высушивая клетки при температуре 55-60°С до воздушно-сухого состояния, после чего определяли выход экстракта биологически активных веществ. При определении содержания биологически активных веществ использовали методы тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии. Максимальный прирост каллуса происходит при культивировании на модифицированной питательной среде МС на белом свету интенсивностью 3000 лк с фотопериодом 14 час в течение 25 суток.

Пример 1. Для выращивания каллусной культуры Atragene speciosa Weinm. используют вышеописанную агаризованную среду (таблица 1) при концентрации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 0,6-1,2 мг/л и концентрации 6-бензиламинопурина 0,2-0,6 мг/л, придерживаясь массового соотношения дихлорфеноксиуксусная к-та: бензиламинопурин = 2,0-2.2:1. Культивирование ведут в колбах Эрленмейера (100 мл и 250 мл). Для регуляции содержания тритерпеновых гликозидов используют белый свет интенсивностью (2-4)×10³ лк с фотопериодом 14 час (люминесцентные лампы Philips TL-D 36W/54-765). Через 25 суток получают требуемый объем биомассы каллусной культуры Atragene speciosa Weinm. Использование света с интенсивностью ниже указанного предела малоэффективно. Дальнейшее увеличение интенсивности освещения нецелесообразно, так как вызывает накопление фотосинтетических пигментов, что приводит к дополнительным затратам при препаративном извлечении из растительных экстрактов целевых биологически активных веществ. Исследования образцов клеточной культуры княжика сибирского, выращенной при заявленных параметрах процесса, показали отсутствие сопутствующих веществ и примесей, в том числе пигментов, в количествах, препятствующих идентификации и выделению БАВ.

В работах других авторов с культурой клеток солодки голой также отмечено влияние света на накопление хлорофилла, особенно у каллусной культуры, растущей на среде с малым количеством сахарозы. Так, при увеличении интенсивности света до 6×10³ лк накапливается почти в 2 раза больше хлорофилла. Увеличение интенсивности света до 15×10³ лк с одновременным уменьшением содержания сахарозы в питательной среде приводит к 4-кратному возрастанию хлорофилла [13].

После субкультивирования по примеру 1 определяли количество фракций тритерпеновых сапонинов методом тонкослойной хроматографии. В клетках каллуса, выращенных на белом свету, накапливаются десять фракций высокополярных тритерпеновых сапонинов с rf 0.02; 0.04; 0.07; 0.09; 0.11; 0.14; 0.16; 0.18; 0.22; 0.24, тогда как в темноте накапливаются только восемь фракций. Затем определяли выход экстрактивных веществ: 1 г клеток, высушенных в термостате при температуре 65°С, помещали в 10 мл метанола и экстрагировали 1 час на водяной бане при температуре 60-65°С. Экстракт отфильтровывали и выпаривали в течение суток.

Пример 2. Выращивают каллусную культуру Atragene speciosa Weinm. при условиях примера 1, но в питательную среду добавляют мезоинозит в возрастающих концентрациях, что активирует рост биомассы каллусной культуры княжика сибирского. Усиление ростовых и синтетических процессов происходит до определенных пределов. Максимальный прирост каллуса дает выращивание на белом свету при концентрации мезоинозита 100-125 мг/л (таблица 2).

Таблица 2 Влияние белого света и мезоинозита на индекс роста каллусной культуры Atragene speciosa Weinm. (среднее значение ±m) Вариант Концентрация мезоинозита (мг/л), индекс роста контроль 50 75 100 125 150 темнота 2,74±0,2 2,54±0,5* 3,08±0,2* 3,95±0,4* 3,53±0,5* 2,10±0,2* белый свет 2,35±0,3 2,67±0,6* 3,48±0,3* 4,05±0,2* 3,83±0,3* 3,51±0,4* Примечания: * - различия достоверны с контролем при р<0,05, контроль - отсутствие мезоинозита в питательной среде

Под действием перечисленных выше признаков, используемых для решения поставленной задачи, выход целевого продукта увеличивается не только за счет большей биомассы, но и за счет увеличения процентного содержания БАВ. В частности, выход экстракта, полученный из 1 г сухого веса клеток, выращенных на белом свету, составил 0,25 г, в то время как из выращенных в темноте только 0,10 г.

Пример 3. Для оптимизации условий выращивания и максимизации образования биологически активных веществ в клеточной культуре Atragene speciosa Weinm. в модифицированную питательную среду МС по примеру 1 или по примеру 2 дополнительно вводят экзогенный гормональный регулятор 24-эпибрассинолид в концентрациях 10^-12-10^-6 M. Максимальное содержание флавоноидов получено при добавлении 24-эпибрассинолида в концентрации 10^-6 М и составило 5,15%, тогда как в контроле (без 24-эпибрассинолида) их содержание составляет 1,19%.

В клетках каллусной культуры, выращенных по примеру 3, определяли содержание флавоноидов, для чего использовали спектрофотометрический метод. Количество флавоноидов в каллусной культуре, культивируемой при облучении белым светом на среде МС с добавкой 24-эпибрассинолида в концентрации 10^-6 М, составляет более 5%. Дальнейшее увеличение концентрации вплоть до 10^-3 М дает обратный эффект. При добавлении 24-эпибрассинолида в концентрации ниже нижнего предела 10^-12 М эффект не наблюдается.

Содержание флавоноидов в культуре клеток, выращенной по изобретению, сопоставимо с их количеством в листьях интактного растения (6,09%), что позволяет говорить об эффективности заявленного способа регуляции содержания тритерпеновых гликозидов в клеточной культуре Atragene speciosa Weinm. и перспективности его применения в промышленных масштабах.

Использованные источники

1. McCue Kent F., Conn Eric E. Induction of shikimic acid pathway enzymes by light in suspension cultured cells of parsley (Petroselinum crispum) // Plant Physiol. 1990. 94, №2. P.507-510.

2. Odnevall A., Björk L. Effects of light on growth, morphogenesis and ginsenoside formation in tissue cultures of Panax ginseng // Biochem. und Physiol. Pflantz. 1989. 185, №3-4. P.253-259.

3. Khripach V.A., Zhabiunskii V.N. Groot Ae de Brassinosteroids: a new class of Plant Hormones. San Diego. Academic Press. 1999. 456 p.

4. Ikekawa N., Zhao Y.I. Application of 24-Epibrassinolide in Agriculture // J. Am. Chem. Soc. Meeting Abstracts. 1991. Vol.474. P.292.

5. Verpoorte R., Cosmo F. Di, Misava M. Plant Cell Culture Secondary Metabolism. Eds. Boca Raton. New York, London, and Tokio: The CRS Press. 1996. Chapter 9. 660 p.

6. Roddick I.G., Rintrberg A.L., Ikekawa N. Developmental Effects of 24-Epibrassinolide in Excised Roots of Tomato Grown in vitro // Physiol. Plant. 1993. Vol.87. P.453-458.

7. Roddick I.G., Rintrberg A.L., Ikekawa N. Developmental Effects of 24-Epibrassinolide in Excised Roots of Tomato Grown In Vitro // Physiol. Plant. - 1993. - V.87. - P.453-458.

8. Ikekawa N., Zhao Y.I. Application of 24-Epibrassinolide in Agriculture // J. Am. Chem. Soc. Meeting Abstracts. - 1991. - V.474. - P.292.

9. Hayashi Hiroaki, Huang Pengyu, Inoue Kenichiro. Up-regulation of Soyasaponin Biosynthesis by Methyl Jasmonate in Cultured Cells of Glycyrrhiza glabra // Plant Cell Physiol. 2003. V.44(4). P.404-411.

10. Краснов Е.А., Шилова И.В., Суслов Н.И. Исследования по разработке оригинального ноотропного фитопрепарата // Химия природных соединений. - 1981. - №6. - с.806.

11. Шилова И.В., Краснов Е.А., Андреева Т.И., Карначук Р.А., Суслов Н.И. Исследование химического состава надземных частей Atragene sibirica L. и ее культуры ткани // Материалы Всеросс. совещ., посвящ. 120-летию Томского государственного университета «Физиология и биотехнология растений». - Томск: Изд-во ТГУ. - 1998. - С.79-81.

12. Murashige, Т. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

13. Уразалиев К.Р., Сванбаев Е.С. Фотогетеротрофный рост и фотосинтез в каллусной культуре солодки голой // Известия Академии наук Казахской ССР. - Сер. биологическая. - Наука. - Вып.4 (154) (июль-август). - 1989. - С.23-30.

14. Юшкова Е.В., Скуратова Е.В., Величко Н.А. Особенности роста каллусных тканей Catharanthus roseus L. в зависимости от способа культивирования // Биотехнология. - 1998. - №6. - С.42-47.

15. Карпилов Ю.С., Опарина Л.А., Кузнецова Л.Г. Изменение фотосинтетического аппарата при переходе культуры ткани руты от фотогетеротрофного питания к автотрофному // Физиология и биохимия культурных растений. - Киев: Наук. Думка. - 1977. - Т.9. - Вып.1 (46) (январь-февраль). - С.93-99.

Изобретение может быть использовано в фармакологической промышленности для получения тритерпеновых сапонинов и флавоноидов. Клетки растения Atragene speciosa Weinm. (княжик сибирский) культивируют на среде МС при освещении белым светом интенсивностью (2-4)×10³ лк с фотопериодом 12-14 час при концентрации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 0,6-1,2 мг/л, 6-бензиламинопурина 0,2-0,6 мг/л, мезоинозита 100-125 мг/л. Введение дополнительно в питательную среду фитогормона 24-эпибрассинолида увеличивает процентное содержание целевого продукта в клетках. Способ позволяет получать требуемый объем биомассы каллусной культуры с повышенным содержанием тритерпеновых сапонинов и флавоноидов, близким к содержанию таковых в листьях интактного растения. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения биологически активных веществ в клеточной культуре Atragene speciosa Weinm. (княжик сибирский), включающий культивирование на модифицированной питательной среде МС, сбор биомассы и выделение биологически активных тритерпеновых сапонинов и флавоноидов, отличающийся тем, что культивирование ведут при освещении белым светом интенсивностью (2-4)×10³ лк с фотопериодом 12-14 ч при концентрации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в диапазоне 0,6-1,2 мг/л, 6-бензиламинопурина в диапазоне 0,2-0,6 мг/л, мезоинозита в диапазоне 100-125 мг/л.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при культивировании дополнительно вводят в питательную среду 24-эпибрассинолид в количестве 10^-12-10^-6 М.