СОЕДИНЕНИЯ БЕНЗОКСАЗИНОНА В КАЧЕСТВЕ ДВОЙНЫХ ИНГИБИТОРОВ KLK5/7 Российский патент 2024 года по МПК C07D498/04 A61K31/536 A61P17/00 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

В данной заявке заявлен приоритет по предварительной заявке США № 62/909 006, поданной 01 октября 2019 г., которая полностью включена в настоящий документ для всех целей.

Заявление о правах на изобретения, сделанные в ходе федерально поддерживаемого исследования

Не применимо

Ссылка на «перечень последовательностей», таблицу или приложение с компьютерной программой, представленные на компакт-диске

Не применимо

Предпосылки изобретения

Генодерматозы – это генетические заболевания, которые проявляются как кожные заболевания. Эти болезни обычно обнаруживаются при рождении или сразу после него. Тип заболевания зависит от того, как затронуты гены, но результирующие состояния могут быть серьезными, редкими и существенно влиять на жизнь пациента, приводя к инвалидности, короткой продолжительности жизни и развитию других хронических и онкологических заболеваний. Существует около 400 различных видов генодерматозов, заболеваемость которыми может варьироваться от 1 на 6000 человек до 1 на 500 000 человек. Бремя болезни может быть тяжелым для пациента и его семьи, так как они потенциально имеют доступ лишь к очень ограниченному набору дорогих лекарств, помогающих в лечении этой болезни. Генодерматозы можно разделить на заболевания, связанные с одним геном (моногенные), когда кожные заболевания вызываются аномалией в одном гене, и полигенные заболевания, при которых мутации (дефекты) нескольких генов влияют на тип заболевания, от которого страдает пациент. Моногенные нарушения включают острый перемежающийся порфирин, буллезный эпидермолиз, ихтиоз, болезнь Фабри, ангидротическую эктодермальную дисплазию и недержание пигмента. Генетические заболевания с ихтиозом включают синдром Нетертона.

Синдром Нетертона (NS) — редкий аутосомно-рецессивный генодерматоз, характеризующийся врожденной ихтиозиформной эритродермией, атопическим диатезом и характерной аномалией волосяного стержня, известной как trichorrhexis invaginata. Синдром Нетертона — одно из самых тяжелых нарушений ороговения. Младенцы обычно имеют при рождении генерализованную шелушащуюся эритродермию и имеют высокий риск опасных для жизни осложнений, таких как гипернатриемическая дегидратация, задержка развития и сепсис. У детей старшего возраста может возникать широкий спектр аллергических проявлений, в том числе тяжелый атопический дерматит, астма, сенная лихорадка и заметно повышенный уровень иммуноглобулина Е в сыворотке. У детей старшего возраста и взрослых шелушение может иметь характерный круговой рисунок (ichthyosis linearis circumflexa). Но у младенцев и детей младшего возраста кожа чаще бывает красной и покрыта чешуйками, без характерного кругового паттерна. Стержни волос хрупкие и легко ломаются из-за trichorrhexis invaginata или «бамбуковых волос», что приводит к коротким редким волосам. Еще одной характеристикой синдрома Нетертона является предрасположенность к аллергии, астме и экземе. Взрослые и дети с синдромом Нетертона также предрасположены к кожным вирусным инфекциям, вызываемым герпесом и вирусом папилломы человека, в дополнение к бактериальным кожным и системным инфекциям. Заболеваемость синдромом Нетертона оценивается в 1/200000 рождений, а распространенность оценивается в 1-9/1000000. Тем не менее, региональные исследования показывают, что распространенность может быть выше из-за диагностических проблем в младенчестве и раннем детстве, включая совпадение признаков с атопическим дерматитом и другими рецессивными ихтиозами. В настоящее время не существует специфической терапии для NS, а есть только паллиативное лечение кожных инфекций, уменьшение зуда и боли.

NS вызывается мутациями укорачивания с потерей функции ингибитора сериновой протеазы типа Kazal-5 (SPINK5), гена, который кодирует LEKTI (лимфоэпителиальный ингибитор типа Kazal). Потеря функции LEKTI приводит к беспрепятственной активности протеаз и чрезмерному гидролизу эпидермальных структурных и барьерных белков.

LETKI представляет собой ингибитор, специфичный к представителям семейства калликреиновых (KLK) сериновых протеаз (KLK5, KLK7 и KLK14) (Chavanas et al., Nat Genet 2000, 25: 141-142). KLK5 характеризуется как расположенный выше по пути (upstream) инициатор KLK7. В соответствии с актуальной на данный момент гипотезой, про-KLK синтезируются и активируются в зернистом слое, а активные ферменты KLK быстро образуют комплексы с LEKTI, предотвращая тем самым преждевременную деградацию десмосом на границе роговой/гранулезный слой (Borgono et al., J Biol Chem 2007, 282:3640-3652; Deraison et al., Mol Biol Cell 2007, 18:3607-3619; Ovaere et al., Trends Biochem Sci 2009, 34:453-463). Комплексы KLK-LEKTI диффундируют во внешний роговой слой, где кислая микросреда рогового слоя вызывает высвобождение активных KLK из LEKTI. Впоследствии активные KLK расщепляют корнеодесмосомальные белки в самых поверхностных слоях рогового слоя. Это обеспечивает точно сбалансированную регуляцию процесса десквамации (Ovaere et al., Trends Biochem Sci 2009, 34:453-463).

Мыши Spink5-/- воспроизводят болезнь NS (Descargues et al., Nat Genet 2005, 37:56-65; Hewett et al., Hum Mol Genet 2005, 14:335-346; Yang et al., Genes Dev 2004, 18:2354- 2358). Ключевым открытием является то, что, аналогично тому, что наблюдалось у объектов с NS, эпидермис мышей Spink5-/- демонстрирует некомпенсированную активность протеаз KLK5 и KLK7 (Descargues et al., Nat Genet 2005, 37:56-65).

И наоборот, делеция KLK5 спасает от неонатальной смертности у новорожденных мышей Spink5-/- и устраняет кожные признаки NS, включая дефект кожного барьера, нарушение структуры эпидермиса и воспаление кожи (Furio et al., PLoS Genet 2015, Sep; 11(9): e1005389). Примечательно, что потеря KLK5 приводит к снижению эпидермальной протеолитической активности, особенно KLK7 и KLK14. Впоследствии он восстанавливает структурную целостность десмосом и корнеодесмосом и нормальную эпидермальную дифференцировку, а также нормализует экспрессию IL-1β, IL-17A и TSLP (тимусный стромальный лимфопоэтин).

В дополнение к животным моделям генерируют органотипические 3D-культуры с нормальными кератиноцитами человека, трансфицированными малой интерферирующей РНК (siRNA), нацеленной на SPINK5, и коллагеновыми гелями, населенными фибробластами, и в этих культуральных моделях наблюдаются дефекты эпидермиса (Wang et al., Exp Dermatol 2014, Jul;23(7):524-6). Сайленсинг генов KLK5 или KLK7 заметно улучшает эпидермальную архитектуру, нарушенную снижением экспрессии SPINK5. В совокупности эти исследования подтверждают важную роль KLK5 и его выше (upstream) и ниже (downstream) расположенных регуляторов при NS.

KLK7 экспрессируется кератиноцитами в зернистом слое и секретируется во внеклеточное пространство рогового слоя (т.е. самого наружного слоя кожи) в виде зимогена, впоследствии активируемого KLK5. После активации KLK7 играет центральную роль в процессе шелушения кожи. Протеолитические действия KLK7 необходимы для процесса десквамации и контролируемой регенерации кожи. Жесткий баланс между образованием новых корнеоцитов и шелушением необходим для поддержания гомеостаза кожи. Напротив, дисбаланс между этими двумя процессами приводит к нарушению функции кожи и, в конечном счете, к дерматологическим заболеваниям, таким как синдром Нетертона. В нормальных условиях этот баланс поддерживается за счет экспрессии эндогенных белковых ингибиторов (LEKTI) KLK7, противодействующих его протеолитической активности. При кожных заболеваниях сверхэкспрессия и/или повышенная активность KLK7 приводят к чрезмерной десквамации. Участие KLK7 в развитии кожных заболеваний дополнительно подтверждается генетической ассоциацией как на животных моделях, так и на людях. Было показано, что у трансгенных мышей со сверхэкспрессией KLK7 человека развиваются особенности кожи, сходные с таковыми у пациентов с хроническим атопическим дерматитом, которые имеют некоторые общие черты с пациентами с синдромом Нетертона.

Принимая во внимание роль KLK5 и KLK7 в регуляции процесса десквамации, а также полученные результаты полного фенотипического спасения в мышиной модели комбинированного нокаута Spink5-/-/Klk5-/-/Klk7-/- (Kasparek et al., PLoS Genet 2017, Jan; 13(1): e1006566), для лечения генодерматозов, например синдрома Нетертона, необходимы мощные и селективные двойные ингибиторы KLK5/KLK7, модулирующие протеолитическую активность этих протеаз.

Краткое описание сути изобретения

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается соединение, представленное формулой (I):

… (I),

или его фармацевтически приемлемый комплекс; где R представляет собой H или представитель, выбранный из группы, состоящей из R¹ и –C(O)R^1a, где R¹ представляет собой C_1-12 алкил, и R^1a представляет собой H или C_1-12 алкил.

Во втором аспекте в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, включающая соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс и фармацевтически приемлемый носитель.

В третьем аспекте в настоящем изобретении предлагается способ лечения кожного заболевания, связанного с протеолитической активностью одной или нескольких протеаз KLK, у объекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение объекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса, или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс.

В четвертом аспекте в настоящем изобретении предлагается анализ in vitro для определения протеолитической активности одной или нескольких протеаз KLK в коже. Способ включает 1) приготовление кожного экстракта; 2) воздействие на субстрат и соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемы комплекс этим кожным экстрактом; и 3) определение скорости протеолитического расщепления субстрата.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показана схема получения Соединения 1.001.

Фиг. 2 показана схема получения соединения 1.002.

Фиг. 3 показана схема получения промежуточного соединения 100, которое используется для получения соединений 1.001 и 1.002.

Фиг. 4A-4D — показаны скорости протеолитического расщепления селективного субстрата KLK5 в анализе кожного экстракта соединениями 1.001, 1.002 или известным соединением 14. Фиг. 4А — контроль; фиг. 4В — соединение 14; фиг. 4C — соединение 1.001; и фиг. 4D — соединение 1.002. NSK относится к свежеприготовленному экстракту кожи; и OSK относится к экстракту кожи после замораживания-оттаивания.

Подробное описание изобретения

I. Общее

В настоящем изобретении предлагаются соединения формулы (I) и фармацевтические композиции, включающие соединения формулы (I), для лечения кожного заболевания, связанного с протеолитической активностью одной или нескольких протеаз KLK. В частности, фармацевтические композиции могут представлять собой составы для местного применения, включающие соединения формулы (I), предназначенные для местного применения при лечении генодерматозов. Настоящее изобретение также относится к способам лечения кожного заболевания, связанного с протеолитической активностью одной или нескольких протеаз KLK, путем введения соединений формулы (I) или их фармацевтических композиций. В частности, соединения формулы (I) или их фармацевтические композиции можно вводить местно. В частности, кожное заболевание представляет собой генодерматоз, такой как синдром Нетертона.

II. Определения

Аббревиатуры, используемые в данном документе, имеют свое обычное значение в области химии и биологии.

«Алкил» относится к прямому или разветвленному, насыщенному алифатическому радикалу, имеющему указанное число атомов углерода (т.е. C_1-12 означает от одного до двенадцати атомов углерода). Алкил может включать любое количество атомов углерода, такое как C_1-2, C_1-3, C_1-4, C_1-5, C_1-6, C_1-7, C_1-8, C_1-9, C_1-10, C_1-11, C_1-12, C_2-3, C_2-4, C_2-5, C_2-6, C_2-7, C_2-8, C_2-9, C_2-10, C_2-11, C_2-12, C_3-4, C_3-5, C_3-6, C_3-7, C_3-8, C_3-9, C_3-10, C_3-11, C_3-12, C_4-5, C_4-6, C_5-6, C_5-7, C_5-8, C_5-9, C_5-10, C_5-11, C_5-12, C_6-7, C_6-8, C_6-9, C_6-10, C_6-11, C_6-12, C_7-8, C_7-9, C_7-10, C_7-11, C_7-12, C_8-9, C_8-10, C_8-11, C_8-12, C_9-10, C_9-11, C_9-12, C_10-11, C_10-12, и C_11-12. Например, C_1-12 алкил включает, без ограничения указанным, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, вторбутил, третбутил, н-пентил, изопентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил, н-додецил и т.д. Алкил также может относиться к алкильным группам, имеющим до 20 атомов углерода, таким как, без ограничения указанным, тридецил, тетрадецил, пентадецил, гексадецил, гептадецил и октадецил и т.д.

«Фармацевтически приемлемый комплекс», используемый в данном документе, относится к комплексу, включающему соединение формулы (I) и по меньшей мере один комплексообразующий агент. Термин «фармацевтически приемлемый» и т.п. означает одобренное регулирующим агентством федеральных или региональных органов государственного управления или перечисленное в Фармакопее США или в других общепризнанных фармакопеях для применения на животных, а конкретнее на людях. Комплексообразующие агенты имеют функцию образования комплексной структуры с соединением формулы (I) посредством нековалентных вторичных взаимодействий. Вторичные взаимодействия могут формироваться посредством электростатических взаимодействий, таких как ионные взаимодействия, Н-связь, диполь-дипольные взаимодействия, дипольно-индуцированные дипольные взаимодействия, лондоновские дисперсионные силы, π-π-взаимодействия и гидрофобные взаимодействия. Фармацевтически приемлемый комплекс соединения формулы (I) включает его фармацевтически приемлемую соль и/или сольват.

«Сольват» относится к соединению, представленному в настоящем документе, или его соли, которое дополнительно включает стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя, связанного нековалентными межмолекулярными силами. Если растворителем является вода, сольват представляет собой гидрат.

«Гидрат» относится к соединению, которое находится в комплексе с молекулой воды. Соединения по настоящему изобретению могут образовывать комплексы с ½ молекулы воды или с 1-10 молекулами воды.

«Пептид-п-нитроанилид» или «пептид-pNA» в данном контексте относится к пептидному субстрату, имеющему от 4 до 6 аминокислот, соединенных пептидными связями, и п-нитроанилидную группу на С-конце. Примеры субстратов пептид-pNA по настоящему изобретению включают Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA и Lys-His-Leu-Tyr-pNA.

«Композиция», используемая в данном документе, включает продукт, содержащий указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любой продукт, который прямо или косвенно является результатом комбинации указанных ингредиентов в указанных количествах. Под «фармацевтически приемлемым» подразумевается, что носитель, разбавитель или эксципиент должны быть совместимы с другими ингредиентами состава и не оказывать вредного воздействия на реципиента.

«Фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент» относится к веществу, которое способствует введению активного агента и абсорбции объектом. Фармацевтические эксципиенты, применимые в настоящем изобретении, включают, без ограничения указанным, связующие вещества, наполнители, разрыхлители, смазывающие вещества, покрытия, подсластители, ароматизаторы и красители. Фармацевтические эксципиенты, используемые в настоящем изобретении для чрескожной/местной доставки, включают, без ограничения указанным, усилители, солюбилизаторы, антиоксиданты, пластификаторы, загустители, полимеры и адгезивы, чувствительные к давлению. Специалисту в данной области будет понятно, что в настоящем изобретении можно использовать и другие фармацевтические эксципиенты.

«IC₅₀» относится к количеству, концентрации или дозировке конкретного тестируемого соединения, которая обеспечивает 50% ингибирование максимального ответа в анализе, который измеряет такой ответ.

«Ингибирование», «ингибирует» и «ингибитор» относятся к соединению, которое препятствует, или к способу препятствования конкретному действию или функции.

«Введение» относится к местному применению, например, в виде лосьона, спрея, мази, крема, геля, пасты или пластыря.

«Местный» означает нанесение подходящего соединения (например, активного агента) или композиции, содержащей соединение (например, активный агент), на кожу для лечения заболеваний или состояний, например генодерматозов. В некоторых воплощениях «местный» означает нанесение подходящего соединения (например, активного агента) или композиции, содержащей соединение (например, активный агент), на кожу с адекватным проникновением в эпидермис или дерму для лечения генодерматоза. В некоторых воплощениях местного применения соединение или композиция проникают в эпидермис или дерму без значительного системного воздействия и без намерения лечить или предотвращать заболевание другой системы органов. В некоторых воплощениях местного применения соединение или композиция доставляется трансдермально через кожу для системного распределения. Примеры включают трансдермальные пластыри, используемые для доставки лекарственных средств.

«Лечить», «проводить лечение» и «лечение» относятся к любым показателям успеха в лечении или облегчении травмы, патологии или состояния, включая любые объективные или субъективные параметры, такие как уменьшение; ремиссия; уменьшение симптомов или улучшение переносимости травмы, патологии или состояния пациентом; замедление темпов вырождения или упадка; сделать конечную точку ухудшения менее изнурительной; улучшение физического или психического самочувствия пациента. Лечение или облегчение симптомов может быть основано на объективных или субъективных параметрах; включая результаты медицинского осмотра, нейропсихиатрического обследования и/или психиатрической оценки.

«Пациент» или «объект» относится к живому организму, страдающему или склонному к заболеванию или состоянию, которое можно лечить путем введения фармацевтической композиции, как предусмотрено в настоящем документе. Неограничивающие примеры включают людей, других млекопитающих, крупный рогатый скот, крыс, мышей, собак, обезьян, коз, овец, коров, оленей и других животных, не относящихся к млекопитающим. В некоторых воплощениях пациент представляет собой человека.

«Терапевтически эффективное количество» относится к количеству соединения или фармацевтической композиции, пригодному для лечения или облегчения течения идентифицированного заболевания или состояния или для проявления обнаруживаемого терапевтического или ингибирующего действия. Точные количества будут зависеть от цели лечения и могут быть установлены специалистом в данной области с использованием известных методов (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 13, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

Термины в единственном числе (в тексте на английском языке предваряемые артиклями «a», «an» или «a(n)»), когда они используются в отношении группы заместителей или «группы заместителей» в данном документе, означают по меньшей мере один. Например, когда соединение замещено алкилом или арилом, соединение необязательно замещено по меньшей мере одним таким алкилом и/или по меньшей мере одним таким арилом, где каждый алкил и/или арил необязательно могут отличаться. В другом примере, когда соединение замещено группой-заместителем, это соединение замещено по меньшей мере одной такой группой-заместителем, где каждая группа-заместитель необязательно может отличаться.

III. Соединения

В одном аспекте в настоящем изобретении предлагается соединение, представленное формулой (I):

… (I),

или его фармацевтически приемлемый комплекс; где R представляет собой H или представитель, выбранный из группы, состоящей из R¹ и –C(O)R^1a, где R¹ представляет собой C_1-12 алкил, и R^1a представляет собой H или C_1-12 алкил.

Метилсульфонильная (-SO₂CH₃) группа в формуле (I) может находиться в орто-, мета- или пара-положении относительно фрагмента 7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-он. В некоторых воплощениях группа -SO₂CH₃ находится в орто-положении относительно фрагмента 7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2 -d][1,3]оксазин-4-он.

Группа –CH₂OR в формуле (I) может находиться в орто-, мета- или пара-положении относительно фрагмента 7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-она. В некоторых воплощениях группа –CH₂OR находится в мета-положении относительно фрагмента 7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-она. В некоторых воплощениях группа –CH₂OR находится в пара-положении относительно фрагмента 7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2 -d][1,3]оксазин-4-она.

В некоторых воплощениях соединение представлено формулой (Ia):

… (Ia),

где R имеет значение, определенное и описанное для формулы (I).

В некоторых воплощениях формулы (Ia) группа -CH₂OR может находиться в орто-, мета- или пара-положении по отношению к группе -SO₂CH₃. В некоторых воплощениях группа -CH₂OR находится в мета-положении по отношению к группе -SO₂CH₃. В некоторых воплощениях группа -CH₂OR находится в пара-положении по отношению к группе -SO₂CH₃.

В некоторых воплощениях соединение представлено формулой (Ib):

… (Ib),

где R имеет значение, определенное и описанное для формулы (I).

В некоторых воплощениях соединение представлено формулой (Ic):

… (Ic),

где R имеет значение, определенное и описанное для формулы (I).

Что касается любой из формул (I), (Ia), (Ib) и (Ic), в некоторых воплощениях R представляет собой H.

В некоторых воплощениях соединение представлено формулой:

.

В некоторых воплощениях соединение представлено формулой:

.

Что касается любой из формул (I), (Ia), (Ib) и (Ic), в некоторых воплощениях R является представителем группы, состоящей из R¹ и –C(O)R^1a, где R¹ представляет собой C_1-12 алкил, и R^1a представляет собой H или C_1-12 алкил.

В некоторых воплощениях любой из формул (I), (Ia), (Ib) и (Ic) R представляет собой C_1-12 алкил. В некоторых воплощениях R представляет собой метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, вторбутил, третбутил, н-пентил, изопентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н- децил, н-ундецил или н-додецил. В некоторых воплощениях R представляет собой C_1-6 алкил. В некоторых воплощениях R представляет собой метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, вторбутил, третбутил, н-пентил, изопентил или н-гексил. В некоторых воплощениях R представляет собой метил или этил. В некоторых выбранных воплощениях R представляет собой метил.

В некоторых воплощениях любой из формул (I), (Ia), (Ib) и (Ic) R представляет собой –C(O)R^1a, где R^1a представляет собой H или C_1-12 алкил. В некоторых воплощениях R^1a представляет собой H. В некоторых воплощениях R^1a представляет собой C_1-12 алкил. В некоторых воплощениях R^1a представляет собой метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, вторбутил, третбутил, н-пентил, изопентил, н-гексил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н- децил, н-ундецил или н-додецил. В некоторых воплощениях R^1a представляет собой C_1-6 алкил. В некоторых воплощениях R^1a представляет собой метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, вторбутил, третбутил, н-пентил, изопентил или н-гексил. В некоторых воплощениях R^1a представляет собой метил или этил. В некоторых выбранных воплощениях R^1a представляет собой метил. В некоторых воплощениях R представляет собой ацетил.

В некоторых воплощениях соединение представлено формулой:

.

В некоторых воплощениях соединение представлено формулой:

.

Примеры соединений формулы (I) перечислены в таблице 1.

Таблица 1. Соединения формулы (I)

№ Структура № Структура 1.001 1.002

Соединения в других формах

Соединения по настоящему изобретению могут образовываться в виде комплексов по меньшей мере с одним комплексообразующим агентом. Комплексообразующие агенты имеют функцию образования комплексной структуры с соединением формулы (I) посредством нековалентных вторичных взаимодействий. Вторичные взаимодействия могут формироваться посредством электростатических взаимодействий, таких как ионные взаимодействия, Н-связь, диполь-дипольные взаимодействия, дипольно-индуцированные дипольные взаимодействия, лондоновские дисперсионные силы, π-π-взаимодействия и гидрофобные взаимодействия. Фармацевтически приемлемый комплекс соединения формулы (I) включает его фармацевтически приемлемую соль и/или сольват. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый комплекс соединения формулы (I) представляет собой его фармацевтически приемлемую соль и/или сольват. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый комплекс соединения формулы (I) представляет собой его фармацевтически приемлемую соль. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый комплекс соединения формулы (I) представляет собой его фармацевтически приемлемый сольват.

Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в несольватированных формах, а также в сольватированных формах, включая гидрированные формы. Как правило, сольватированные формы эквивалентны несольватированным формам и входят в объем настоящего изобретения. Некоторые соединения настоящего изобретения могут существовать во множестве кристаллических или аморфных форм. В общем, все физические формы являются эквивалентными для предполагаемого применения в настоящем изобретении и входят к объем настоящего изобретения.

Если не указано иное, соединения по настоящему изобретению могут также содержать неприродные соотношения атомных изотопов в том, что касается одного или нескольких атомов, составляющих такие соединения. Например, соединения по настоящему изобретению могут быть помечены радиоактивными или стабильными изотопами, такими как, например, дейтерий (²Н), тритий (³Н), йод-125 (¹²⁵I), фтор-18 (¹⁸F), азот-15 (¹⁵N), кислород-17 (¹⁷O), кислород-18 (¹⁸O), углерод-13 (¹³C) или углерод-14 (¹⁴C). Все изотопные варианты соединений по настоящему изобретению, независимо от того, радиоактивны они или нет, входят в объем настоящего изобретения.

В настоящем изобретении предлагаются соединения, которые находятся в форме пролекарства. Пролекарствами соединений, описанных в данном документе, являются те соединения, которые легко подвергаются химическим изменениям в физиологических условиях с высвобождением соединений по настоящему изобретению. Кроме того, пролекарства могут быть преобразованы в соединения по настоящему изобретению химическими или биохимическими способами в условиях ex vivo. Например, пролекарства могут быть медленно преобразованы в соединения настоящего изобретения, когда их помещают в резервуар трансдермального пластыря с подходящим ферментом или химическим агентом.

IV. Композиция

Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция включает соединение формулы (Ia) или его фармацевтически приемлемый комплекс и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция включает соединение формулы (Ib) или его фармацевтически приемлемый комплекс и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция включает соединение формулы (Ic) или его фармацевтически приемлемый комплекс и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтически приемлемый комплекс соединения любой из формул (I), (Ia), (Ib) и (Ic) определен и описан в данном документе. Фармацевтически приемлемый комплекс соединения любой из формул (I), (Ia), (Ib) и (Ic) может включать его фармацевтически приемлемую соль и/или сольват.

В некоторых воплощениях соединение любой из формул (I), (Ia), (Ib) и (Ic) имеет формулу:

,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

В некоторых воплощениях соединение любой из формул (I), (Ia), (Ib) и (Ic) имеет формулу:

,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

Соединения, представленные в настоящем документе, могут быть включены в состав фармацевтических композиций с использованием способов, доступных в данной области техники, и способов, раскрытых в настоящем документе. Любое из раскрытых в данном документе соединений может находиться в виде соответствующей фармацевтической композиции и может быть введено подходящим способом введения.

Введение соединения, описанного в настоящем документе, объекту может быть местным или несистемным, например местным, внутрикожным или внутриочаговым. В некоторых воплощениях соединение можно вводить путем местного введения. В некоторых воплощениях соединение можно вводить внутрикожно. В некоторых воплощениях соединение можно вводить внутриочаговым введением, например внутриочаговой инъекцией.

Способы, представленные в настоящем документе, включают введение фармацевтических композиций, содержащих по меньшей мере одно соединение, описанное в настоящем документе, включая соединение формулы (I), если это целесообразно, в форме соли или в комплексной форме, используемое либо отдельно, либо в форме комбинации с одним или более совместимыми и фармацевтически приемлемыми носителями, такими как разбавители или адъюванты, или с другим агентом для лечения генодерматоза, если объект в этом нуждается.

В некоторых воплощениях второй агент может быть составлен или упакован с соединением, представленным в настоящем документе. Само собой разумеется, что второй агент будет составлен с соединением, представленным в настоящем документе, только в том случае, если, по мнению специалистов в данной области, такой совместный состав не должен влиять на активность любого агента или способ введения. В некоторых воплощениях соединение, представленное в настоящем документе, и второй агент включаются в отдельные составы. Они могут быть упакованы вместе или упакованы по отдельности для удобства специалиста в данной области техники.

В клинической практике активные агенты, предлагаемые в настоящем документе, могут вводиться любым обычным способом, в частности, местно, внутрикожно, внутри очага поражения, перорально, парентерально, ректально или путем ингаляции (например, в форме аэрозолей). В некоторых воплощениях соединение, представленное в настоящем документе, вводят местно, внутрикожно или внутри очага поражения. В некоторых воплощениях соединение, представленное в настоящем документе, вводят местно. В некоторых воплощениях соединение, представленное в настоящем документе, вводят внутрикожно. В некоторых воплощениях соединение, представленное в настоящем документе, вводят внутри очага поражения.

В качестве твердых композиций для перорального введения можно использовать таблетки, пилюли, твердые желатиновые капсулы, порошки или гранулы. В этих композициях активный продукт смешивают с одним или несколькими инертными разбавителями или адъювантами, такими как сахароза, лактоза или крахмал.

Эти композиции могут содержать вещества, отличные от разбавителей, например смазку, такую как стеарат магния, или покрытие, предназначенное для контролируемого высвобождения.

В качестве жидких композиций для перорального введения можно использовать растворы, которые являются фармацевтически приемлемыми, суспензии, эмульсии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, такие как вода или жидкий парафин. Эти композиции могут также содержать вещества, отличные от разбавителей, в некоторых воплощениях смачивающие, подслащивающие или ароматизирующие продукты.

Можно использовать композиции для местного применения в виде лосьонов, настоек, кремов, эмульсий, гелей или мазей. В этих композициях активный продукт смешивают с одним или несколькими инертными наполнителями, включая воду, ацетон, этанол, этиленгликоль, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, бутан-1,3-диол, изопропилмиристат, изопропилпальмитат, минеральное масло и их смеси.

Композиции для парентерального, внутриочагового или внутрикожного введения могут представлять собой эмульсии или стерильные растворы. В качестве растворителя или носителя можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, в частности оливковое масло, или органические сложные эфиры для инъекций, в некоторых воплощениях этилолеат. Эти композиции также могут содержать адъюванты, в частности смачивающие, изотонизирующие, эмульгирующие, диспергирующие и стабилизирующие агенты. Стерилизацию можно проводить несколькими способами, в некоторых вариантах с использованием бактериологического фильтра, облучением или нагреванием. Они также могут быть приготовлены в виде стерильных твердых композиций, которые можно растворять во время использования в стерильной воде или любой другой стерильной среде для инъекций.

Композиции для ректального введения представляют собой суппозитории или ректальные капсулы, которые содержат в дополнение к активному началу эксципиенты, такие как масло какао, полусинтетические глицериды или полиэтиленгликоли.

Композиции также могут быть аэрозолями. Для применения в форме жидких аэрозолей композиции могут представлять собой стабильные стерильные растворы или твердые композиции, растворенные во время применения в апирогенной стерильной воде, физиологическом растворе или любом другом фармацевтически приемлемом носителе. Для применения в форме сухих аэрозолей, предназначенных для непосредственного вдыхания, активное начало тонко делят и смешивают с водорастворимым твердым разбавителем или носителем, в некоторых воплощениях декстраном, маннитом или лактозой.

В некоторых воплощениях композиция, представленная в настоящем документе, представляет собой фармацевтическую композицию или единичную стандартную лекарственную форму. Фармацевтические композиции и единичные лекарственные формы, представленные в настоящем документе, содержат профилактически или терапевтически эффективное количество одного или нескольких профилактических или терапевтических средств (например, соединения, представленного в настоящем документе, или другого профилактического или терапевтического средства), и обычно один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательные вещества. В одном конкретном воплощении и в этом контексте термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или зарегистрированный в Фармакопее США или в других общепризнанных фармакопеях для применения на животных, а конкретнее на людях. Термин «носитель» включает разбавитель, адъювант (например, адъювант Фрейнда (полный и неполный)), эксципиент или несущую среду, с которыми вводят терапевтическое средство. Такие физиологические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода или масла, включая масла нефтяного, животного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода может использоваться в качестве носителя при внутривенном введении фармацевтической композиции. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, особенно для инъецируемых растворов. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press; 22-е издание (15-е сентября, 2012).

Типичные фармацевтические композиции и лекарственные формы содержат один или несколько эксципиентов. Подходящие вспомогательные вещества хорошо известны специалистам в области фармацевтики, и в некоторых воплощениях подходящие вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и т.п. Подходит ли конкретное вспомогательное вещество для включения в фармацевтическую композицию или лекарственную форму, зависит от множества факторов, хорошо известных в данной области, включая, без ограничения указанным, способ введения лекарственной формы объекту и конкретные активные ингредиенты в лекарственной форме. Композиция или единичная лекарственная форма, при желании, может также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих агентов или буферных агентов.

Композиции, не содержащие лактозу, представленные в настоящем документе, могут содержать эксципиенты, которые хорошо известны в данной области и перечислены, в определенных воплощениях, в Фармакопее США (USP 36–NF 31 S2). Как правило, безлактозные композиции содержат активный ингредиент, связующее/наполнитель и смазывающее вещество в фармацевтически совместимых и фармацевтически приемлемых количествах. Типичные безлактозные лекарственные формы содержат активный ингредиент, микрокристаллическую целлюлозу, предварительно желатинизированный крахмал и стеарат магния.

Кроме того, в данном документе охвачены безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие активные ингредиенты, поскольку вода может способствовать разложению некоторых соединений. Например, добавление воды (например, 5%) широко распространено в фармацевтике как средство имитации длительного хранения для определения таких характеристик, как срок годности или стабильность составов в зависимости от времени. См., например, Jens T. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, New York, 1995, pp. 379 80. По сути, вода и тепло ускоряют разложение некоторых соединений. Таким образом, влияние воды на состав может иметь большое значение, поскольку влага и/или влажность часто встречаются во время производства, обработки, упаковки, хранения, перевозки и применения составов.

Предложенные в данном документе безводные фармацевтические композиции и лекарственные формы могут быть приготовлены с использованием безводных ингредиентов или ингредиентов с низким содержанием влаги и в условиях с низким содержанием влаги или низкой влажностью. Фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие лактозу и по меньшей мере один активный ингредиент, содержащий первичный или вторичный амин, могут быть безводными, если ожидается существенный контакт с влагой и/или влажностью во время производства, упаковки и/или хранения.

Безводную фармацевтическую композицию следует готовить и хранить таким образом, чтобы сохранялась ее безводная природа. Соответственно, безводные композиции могут быть упакованы с использованием материалов, которые известны, как предотвращающие воздействие воды, так что они могут быть включены в подходящие фармакологические наборы. В некоторых воплощениях подходящая упаковка включает, без ограничения указанным, герметично запечатанную фольгу, пластики, контейнеры с разовой дозой (например, флаконы), блистерные упаковки и контурные упаковки.

Кроме того, предложены фармацевтические композиции и лекарственные формы, содержащие одно или несколько соединений, снижающих скорость разложения активного ингредиента. Такие соединения, которые упоминаются в данном документе как «стабилизаторы», включают, без ограничения указанным, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, рН-буферы или солевые буферы.

Фармацевтические композиции и единичные лекарственные формы могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п. Состав для перорального применения может включать стандартные носители, такие как фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д. Такие композиции и лекарственные формы будут содержать профилактически или терапевтически эффективное количество профилактического или терапевтического средства в некоторых воплощениях в очищенной форме вместе с подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения объекту. Состав должен соответствовать способу введения. В некоторых воплощениях фармацевтические композиции или разовые лекарственные формы являются стерильными и находятся в подходящей форме для введения объекту, в некоторых воплощениях животному, такому как млекопитающее, в некоторых воплощениях человеку.

Фармацевтическая композиция составлена таким образом, чтобы быть совместимой с ее предполагаемым путем введения. В некоторых воплощениях способы введения включают, без ограничения указанным, парентеральное, например внутривенное, внутрикожное, подкожное, внутримышечное, подкожное, пероральное, трансбуккальное, подъязычное, ингаляционное, интраназальное, чрескожное, местное, чрезслизистое, внутриопухолевое, интрасиновиальное и ректальное введение. В некоторых воплощениях способ введения представляет собой внутрикожное, местное или внутриочаговое введение. В некоторых воплощениях способ введения представляет собой несистемное введение. В конкретном воплощении композицию составляют в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного, подкожного, внутримышечного, перорального, интраназального или местного введения людям. В одном воплощении фармацевтическую композицию составляют в соответствии с обычными процедурами для подкожного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения являются растворами в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция может также включать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции.

В некоторых воплощениях лекарственные формы включают, без ограничения указанным: таблетки; капсулы; капсулы, такие как мягкие эластичные желатиновые капсулы; облатки; лепешки; пастилки; дисперсии; суппозитории; мази; горячие компрессы (припарки); пасты; порошки; повязки; кремы; пластыри; растворы; патчи; аэрозоли (например, назальные спреи или ингаляторы); гели; жидкие лекарственные формы, подходящие для перорального введения или введения через слизистую оболочку объекта, включая суспензии (например, водные или неводные жидкие суспензии, эмульсии масло-в-воде или жидкие эмульсии вода-в-масле), растворы и эликсиры; жидкие лекарственные формы, подходящие для парентерального введения объекту; и стерильные твердые вещества (например, кристаллические или аморфные твердые вещества), которые можно восстановить для получения жидких лекарственных форм, подходящих для парентерального введения объекту.

Состав, форма и тип лекарственных форм, представленных в настоящем документе, обычно варьируются в зависимости от их применения. В некоторых воплощениях лекарственная форма, используемая при начальном лечении генодерматоза, может содержать большее количество одного или нескольких активных ингредиентов, которые она содержит, чем лекарственная форма, используемая при поддерживающем лечении того же расстройства или заболевания. Точно так же, лекарственная форма для парентерального введения может содержать меньшие количества одного или нескольких активных ингредиентов, чем пероральная лекарственная форма, используемая для лечения того же заболевания или расстройства. Эти и другие способы, которыми конкретные лекарственные формы, охватываемые настоящим документом, будут отличаться друг от друга, будут очевидны специалистам в данной области. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press; 22-е издание (15 сентября, 2012).

Как правило, ингредиенты композиций поставляются либо по отдельности, либо смешиваются друг с другом в стандартной лекарственной форме, в некоторых воплощениях в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Если композиция вводится инфузией, то она может распределяться инфузионной бутылкой содержащей стерильную фармацевтического качества воду или солевой раствор. Когда композицию вводят путем инъекции, может обеспечиваться ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора таким образом, что ингредиенты могут быть смешаны перед введением.

Типичные лекарственные формы включают соединение, представленное в настоящем документе, или его фармацевтически приемлемый комплекс, сольват или гидрат, находящиеся в диапазоне от около 0,1 мг до около 1000 мг в день, принимаемые в виде разовой дозы один раз в день утром или в виде разделенные дозы в течение дня, принимаемые во время еды. Конкретные лекарственные формы могут содержать около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 2,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 100, 200, 250, 500 или 1000 мг активного соединения.

Пероральные лекарственные формы

Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных лекарственных форм, таких как, без ограничения указанным, таблетки (например, жевательные таблетки), каплеты, капсулы и жидкости (например, ароматизированные сиропы). Такие лекарственные формы содержат заданные количества активных ингредиентов и могут быть приготовлены способами фармации, хорошо известными специалистам в данной области. См. в целом Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press; 22-е издание (15 сентября, 2012).

В некоторых воплощениях пероральные лекарственные формы являются твердыми и готовятся при безводных заболеваниях или нарушениях с использованием безводных ингредиентов, как подробно описано в данном документе. Однако объем представленных в данном документе композиций выходит за рамки безводных твердых лекарственных форм для перорального применения. Таким образом, в данном документе описаны дополнительные формы.

Типичные лекарственные формы для перорального применения готовят путем смешивания активного ингредиента(ов) в однородной смеси по меньшей мере с одним эксципиентом в соответствии с общепринятыми методами составления фармацевтических композиций. Вспомогательные вещества могут принимать самые разнообразные формы в зависимости от формы состава, желательного для введения. В некоторых воплощениях вспомогательные вещества, подходящие для использования в пероральных жидких или аэрозольных дозированных формах, включают, без ограничения указанным, воду, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты и красители. В некоторых воплощениях вспомогательные вещества, подходящие для применения в твердых пероральных лекарственных формах (например, порошках, таблетках, капсулах и каплетах), включают, без ограничения указанным, крахмалы, сахара, микрокристаллическую целлюлозу, разбавители, гранулирующие агенты, смазывающие вещества, связующие вещества, и разрыхлители.

Из-за простоты введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные пероральные стандартные лекарственные формы, и в этом случае используются твердые эксципиенты. При желании таблетки могут быть покрыты стандартными водными или неводными способами. Такие лекарственные формы могут быть приготовлены любым из способов, известных в фармацевтике. Как правило, фармацевтические композиции и лекарственные формы готовят путем однородного и тщательного смешивания активных ингредиентов с жидкими носителями, тонкоизмельченными твердыми носителями или с обоими, а затем при необходимости придают продукту желаемую форму.

В некоторых воплощениях таблетка может быть получена прессованием или формованием. Прессованные таблетки могут быть приготовлены путем прессования в подходящей машине активных ингредиентов в сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанных с эксципиентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены путем формования в подходящей машине смеси порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем.

В некоторых воплощениях вспомогательные вещества, которые можно использовать в лекарственных формах для перорального применения, включают, без ограничения указанным, связующие вещества, наполнители, разрыхлители и смазывающие вещества. Связующие, подходящие для применения в фармацевтических композициях и лекарственных формах, включают, без ограничения указанным, кукурузный крахмал, картофельный крахмал или другие крахмалы, желатин, натуральные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, альгинат натрия, альгиновую кислоту, другие альгинаты, порошкообразный трагакант, гуаровая камедь, целлюлозу и ее производные (например, этилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, кальцийкарбоксиметилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу), поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, прежелатинизированный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу (например, № 2208, 2906, 2910), микрокристаллическую целлюлозу и их смеси.

В некоторых воплощениях наполнители, подходящие для применения в фармацевтических композициях и лекарственных формах, раскрытых в настоящем документе, включают, без ограничения указанным, тальк, карбонат кальция (например, гранулы или порошок), микрокристаллическую целлюлозу, порошкообразную целлюлозу, декстраты, каолин, маннит, кремниевую кислоту, сорбит, крахмал, предварительно желатинизированный крахмал и их смеси. Связующее вещество или наполнитель в фармацевтических композициях обычно присутствует в количестве от около 50 до около 99 мас.% фармацевтической композиции или лекарственной формы.

В некоторых воплощениях подходящие формы микрокристаллической целлюлозы включают, без ограничения указанным, материалы, продаваемые как AVICEL PH 101, AVICEL PH 103, AVICEL RC 581, AVICEL PH 105 (доступные у FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Маркус Хук, Пенсильвания) и их смеси. Специфическое связующее представляет собой смесь микрокристаллической целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы натрия, продаваемую как AVICEL RC 581. Подходящие безводные эксципиенты или наполнители или добавки с низким содержанием влаги включают AVICEL PH 103™ и Starch 1500 LM.

Разрыхлители используются в композициях для получения таблеток, которые распадаются при воздействии водной среды. Таблетки, содержащие слишком много разрыхлителя, могут распадаться при хранении, тогда как таблетки, содержащие слишком мало, могут не распадаться с желаемой скоростью или в желаемых условиях. Таким образом, для образования твердых лекарственных форм для перорального применения следует использовать достаточное количество разрыхлителя, которое не является ни слишком большим, ни слишком маленьким, чтобы неблагоприятным образом не изменить характеристики высвобождения активных ингредиентов. Количество используемого разрыхлителя варьируется в зависимости от типа состава и легко определяется специалистами в данной области. Типичные фармацевтические композиции содержат от около 0,5 до около 15 мас.% разрыхлителя, в частности, от около 1 до около 5 мас.% разрыхлителя.

Разрыхлители, которые можно использовать в фармацевтических композициях и лекарственных формах, включают, без ограничения указанным, агар, альгиновую кислоту, карбонат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, кроскармеллозу натрия, кросповидон, полакрилин калия, гликолят крахмала натрия, картофельный или тапиоковый крахмал, прежелатинизированный крахмал, прочие крахмалы, глины, прочие альгины, прочие целлюлозы, камеди и их смеси.

Смазывающие вещества, которые можно использовать в фармацевтических композициях и лекарственных формах, включают, без ограничения указанным, стеарат кальция, стеарат магния, минеральное масло, легкое минеральное масло, глицерин, сорбит, маннит, полиэтиленгликоль, другие гликоли, стеариновую кислоту, лаурилсульфат натрия, тальк, гидрогенизированное растительное масло (например, арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло), стеарат цинка, этилолеат, этиллауреат, агар и их смеси. Дополнительные смазывающие вещества включают, в некоторых воплощениях, силикагель SYLOID (AEROSIL 200, производства W.R. Grace Co. Балтимор, Мэриленд), коагулированный аэрозоль синтетического диоксида кремния (продаваемый компанией Degussa Co. Плано, Техас), CAB O SIL (продукт пирогенного диоксида кремния, продаваемый Cabot Co. Бостон, Массачусетс) и их смеси. Если смазывающие вещества вообще используются, их обычно используют в количестве менее чем около 1 мас.% фармацевтических композиций или дозированных форм, в которые они включены.

Лекарственные формы с отсроченным высвобождением

Активные ингредиенты, такие как соединения, предложенные в настоящем документе, можно вводить с помощью средств с контролируемым высвобождением или средств доставки, которые хорошо известны специалистам в данной области. В некоторых воплощениях, без ограничения указанным, описанных в пат. США №: 3 845 770; 3 916 899; 3 536 809; 3 598 123; 4 008 719; 5 674 533; 5 059 595; 5 591 767; 5 120 548; 5 073 543; 5 639 476; 5 354 556; 5 639 480; 5 733 566; 5 739 108; 5 891 474; 5 922 356; 5 972 891; 5 980 945; 5 993 855; 6 045 830; 6 087 324; 6 113 943; 6 197 350; 6 248 363; 6 264 970; 6 267 981; 6 376 461; 6 419 961; 6 589 548; 6 613 358; 6 699 500; каждый из которых полностью включен в настоящий документ ссылкой. Такие лекарственные формы можно использовать для обеспечения медленного или контролируемого высвобождения одного или нескольких активных ингредиентов с использованием, в некоторых воплощениях, гидропропилметилцеллюлозы, других полимерных матриц, гелей, проницаемых мембран, осмотических систем, многослойных покрытий, микрочастиц, липосом, микросфер или их комбинации для обеспечения желаемого профиля высвобождения в различных пропорциях. Подходящие составы с контролируемым высвобождением, известные специалистам в данной области, в том числе описанные в настоящем документе, могут быть легко выбраны для применения с активными ингредиентами, представленными в настоящем документе. Таким образом, в данном документе охвачены единичные стандартные лекарственные формы, подходящие для перорального введения, такие как, без ограничения указанным, таблетки, капсулы, желатиновые капсулы и капсуловидные таблетки, адаптированные для контролируемого высвобождения.

Все фармацевтические продукты с контролируемым высвобождением имеют общую цель улучшения лекарственной терапии по сравнению с их неконтролируемыми аналогами. В идеале, использование оптимально разработанного состава с контролируемым высвобождением в медицинском лечении характеризуется использованием минимума лекарственного вещества для лечения или контроля заболевания или расстройства за минимальное время. Преимущества составов с контролируемым высвобождением включают пролонгированную активность лекарственного средства, уменьшенную частоту дозирования и повышенное соблюдение пациентом режима лечения. Кроме того, лекарственные формы с контролируемым высвобождением могут использоваться для воздействия на время начала действия или другие характеристики, такие как уровни лекарственного средства в крови, и, таким образом, могут влиять на возникновение побочных (например, неблагоприятных) эффектов.

Большинство составов с контролируемым высвобождением предназначены для первоначального высвобождения количества лекарственного средства (активного ингредиента), которое быстро вызывает желаемый терапевтический эффект, и постепенного и непрерывного высвобождения других количеств лекарственного средства для поддержания этого уровня терапевтического или профилактического эффекта в течение длительного периода времени. Чтобы поддерживать этот постоянный уровень лекарственного средства в организме, лекарство должно высвобождаться из лекарственной формы со скоростью, которая заменит количество метаболизируемого и выводимого из организма лекарственного средства. Контролируемое высвобождение активного ингредиента может стимулироваться различными заболеваниями или нарушениями, включая, без ограничения указанным, рН, температуру, ферменты, воду или другие физиологические заболевания, нарушения или соединения.

В некоторых воплощениях лекарственное средство можно вводить с помощью внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. В некоторых воплощениях может использоваться насос (см. Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). В другом воплощении могут использоваться полимерные материалы. В еще одном воплощении система с контролируемым высвобождением может быть помещена объекту в подходящее место, определенное практикующим врачом, т.е. таким образом, требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждаются в обзоре Langer (Science 249:1527-1533 (1990)). Активный ингредиент может быть диспергирован в твердой внутренней матрице, например полиметилметакрилат, полибутилметакрилат, пластифицированный или непластифицированный поливинилхлорид, пластифицированный нейлон, пластифицированный полиэтилентерефталат, натуральный каучук, полиизопрен, полиизобутилен, полибутадиен, полиэтилен, сополимеры этилена и винилацетата, силиконовые каучуки, полидиметилсилоксаны, сополимеры карбоната кремния, гидрофильные полимеры, такие как гидрогели сложных эфиров акриловой и метакриловой кислоты, коллаген, сшитый поливиниловый спирт и сшитый частично гидролизованный поливинилацетат, окруженный внешней полимерной мембраной, например, полиэтилен, полипропилен, сополимеры этилена/пропилена, сополимеры этилена/этилакрилата, сополимеры этилена/винилацетата, силиконовые каучуки, полидиметилсилоксаны, неопреновый каучук, хлорированный полиэтилен, поливинилхлорид, сополимеры винилхлорида с винилацетатом, винилиденхлоридом, этиленом и пропиленом, иономер полиэтилентерефталата, бутилкаучук, эпихлоргидриновые каучуки, сополимер этилена/винилового спирта, терполимер этилена/винилацетата/винилового спирта и сополимер этилена/винилоксиэтанола, нерастворимый в жидкостях организма. Затем активный ингредиент диффундирует через внешнюю полимерную мембрану на стадии контроля скорости высвобождения. Процентное содержание активного ингредиента в таких парентеральных композициях сильно зависит от их конкретной природы, а также от потребностей объекта.

Парентеральные лекарственные формы

В некоторых воплощениях в настоящем документе представлены лекарственные формы для парентерального введения. В некоторых воплощениях парентеральные лекарственные формы можно вводить объектам различными путями, включая, помимо прочего, подкожный, внутривенный (включая болюсную инъекцию), внутримышечный и внутриартериальный. В некоторых воплощениях парентеральные лекарственные формы можно вводить объектам различными путями, включая, помимо прочего, местный, внутрикожный или внутриочаговый. Поскольку их введение обычно обходит естественную защиту объекта от загрязняющих веществ, парентеральные лекарственные формы обычно стерильны или могут быть стерилизованы перед введением объекту. В некоторых воплощениях парентеральные лекарственные формы включают, без ограничения указанным, растворы, готовые для инъекций, сухие продукты, готовые для растворения или суспендирования в фармацевтически приемлемом носителе для инъекций, суспензии, готовые для инъекций, и эмульсии.

Подходящие носители, которые можно использовать для получения парентеральных лекарственных форм, хорошо известны специалистам в данной области. В некоторых воплощениях подходящие носители включают, без ограничения указанным: вода для инъекций USP; водные носители, такие как, помимо прочего, раствор для инъекций хлорида натрия, раствор Рингера для инъекций, раствор декстрозы для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций и раствор Рингера для инъекций с лактатом; смешиваемые с водой носители, такие как, без ограничения указанным, этиловый спирт, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль; и неводные носители, такие как, без ограничения указанным, кукурузное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, кунжутное масло, этилолеат, изопропилмиристат и бензилбензоат.

Соединения, повышающие растворимость одного или нескольких активных ингредиентов, раскрытых в настоящем описании, также могут быть включены в лекарственные формы для парентерального введения.

Трансдермальные, местные и чрезслизистые лекарственные формы

Также предусмотрены трансдермальные, местные и чрезслизистые лекарственные формы. Чрескожные, местные и чрезслизистые лекарственные формы включают, без ограничения указанным, офтальмологические растворы, спреи, аэрозоли, кремы, лосьоны, мази, гели, растворы, эмульсии, суспензии или другие формы, известные специалисту в данной области. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press; 22-е издание (15 сентября, 2012); и введение в Pharmaceutical Dosage Forms, 4th ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985). Лекарственные формы, подходящие для обработки тканей слизистой оболочки полости рта, могут быть приготовлены в виде жидкостей для полоскания рта или пероральных гелей. Кроме того, трансдермальные лекарственные формы включают пластыри «резервуарного типа» или «матричного типа», которые можно наносить на кожу и носить в течение определенного периода времени для обеспечения проникновения желаемого количества активных ингредиентов.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к фармацевтически приемлемому материалу, композиции или носителю, такому как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующим в переноске или транспортировке любой рассматриваемой композиции или ее компонента. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в том смысле, что он совместим с рассматриваемой композицией и ее компонентами и не вреден для пациента. Подходящие носители (например, эксципиенты и разбавители) и другие материалы, которые можно использовать для получения лекарственных форм для чрескожного, местного применения и слизистых оболочек, охватываемых настоящим документом, хорошо известны специалистам в области фармацевтики и зависят от конкретной ткани, к которой будут применены данный фармацевтический состав или лекарственная форма. Принимая во внимание этот факт, типичные носители включают, без ограничения указанным, воду, ацетон, этанол, этиленгликоль, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, бутан-1,3-диол, изопропилмиристат, изопропилпальмитат, минеральное масло и их смеси для образования лосьонов, настоек, кремов, эмульсий, гелей или мазей, которые нетоксичны и фармацевтически приемлемы. В некоторых воплощениях материалы, которые могут служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлоза и ее производные, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) эксципиенты, такие как масло какао и воск для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновая кислота; (16) апирогенная вода; (17) изотонический раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) фосфатно-буферные растворы; и (21) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических составах. При желании в фармацевтические композиции и лекарственные формы также могут быть добавлены увлажнители или хумектанты. Примеры таких дополнительных ингредиентов хорошо известны в данной области. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy; Pharmaceutical Press; 22-е издание (15 сентября, 2012).

В зависимости от конкретной ткани, подлежащей лечению, дополнительные компоненты могут быть использованы до, в сочетании или после лечения предоставленными активными ингредиентами. В некоторых воплощениях можно использовать усилители проникновения для облегчения доставки активных ингредиентов в ткань. Подходящие усилители проникновения включают, без ограничения указанным: ацетон; различные спирты, такие как этанол, олеил и тетрагидрофурил; алкилсульфоксиды, такие как диметилсульфоксид; диметилацетамид; диметилформамид; полиэтиленгликоль; пирролидоны, такие как поливинилпирролидон; сорта Kollidon (повидон, поливидон); мочевину; и различные водорастворимые или нерастворимые сложные эфиры сахаров, такие как Tween 80 (полисорбат 80) и Span 60 (сорбитанмоностеарат).

рН фармацевтической композиции или лекарственной формы или ткани, на которую наносят фармацевтическую композицию или лекарственную форму, также можно регулировать для улучшения доставки одного или нескольких активных ингредиентов. Точно так же можно регулировать полярность растворителя-носителя, его ионную силу или тоничность для улучшения доставки. Соединения, такие как стеараты, также могут быть добавлены к фармацевтическим композициям или лекарственным формам для преимущественного изменения гидрофильности или липофильности одного или нескольких активных ингредиентов с целью улучшения доставки. В этом отношении стеараты могут служить липидным носителем для состава, в качестве эмульгирующего агента или поверхностно-активного вещества, а также агента, усиливающего доставку или усиливающего проникновение. Различные комплексы, соли, гидраты или сольваты активных ингредиентов могут быть использованы для дополнительной корректировки свойств полученной композиции.

Дозировка и единичные лекарственные формы

В терапии человека врач определяет дозировку, которую он считает наиболее подходящей, в соответствии с профилактической или лечебной обработкой, а также в соответствии с возрастом, массой тела, стадией расстройства или заболевания и другими факторами, характерными для объекта, подлежащего лечению. В некоторых воплощениях дозы составляют от около 1 до около 1000 мг в день для взрослого, или от около 5 до около 250 мг в день, или от около 10 до 50 мг в день для взрослого. В некоторых воплощениях дозы составляют от около 5 до около 400 мг в день или от 25 до 200 мг в день на взрослого. В некоторых воплощениях также предполагаются дозы от около 50 до около 500 мг в день.

В дополнительных аспектах предусмотрены способы лечения заболевания или расстройства, при которых объект в этом нуждается, и/или генодерматоза у объекта путем введения объекту, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества соединения, представленного в настоящем документе, или их фармацевтически приемлемый комплекс. Количество соединения или композиции, которое будет терапевтически или профилактически эффективным при лечении расстройства или одного или нескольких его симптомов, будет варьироваться в зависимости от природы и тяжести заболевания или состояния и пути введения активного ингредиента. Частота и дозировка также будут варьироваться в зависимости от факторов, специфичных для каждого объекта, в зависимости от вводимой конкретной терапии (например, терапевтических или профилактических агентов), тяжести расстройства, заболевания или состояния, пути введения, а также возраста, массы тела, реакции и анамнеза перенесённых заболеваний объекта. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-реакция, полученных в тест-системах in vitro или на животных моделях.

В некоторых воплощениях примерные дозы композиции включают количество активного соединения в миллиграммах или микрограммах на килограмм массы объекта или образца (например, от около 10 микрограммов на килограмм до около 50 миллиграммов на килограмм, от около 100 микрограммов на килограмм до около 25 миллиграммов на килограмм или от около 100 микрограммов на килограмм до около 10 миллиграммов на килограмм). Для композиций, представленных в настоящем документе, в некоторых воплощениях доза, вводимая объекту, составляет от 0,140 мг/кг до 3 мг/кг массы тела объекта в расчете на массу активного соединения. В некоторых воплощениях доза, вводимая объекту, составляет от 0,20 мг/кг до 2,00 мг/кг, от 0,30 мг/кг до 1,50 мг/кг, от 1 мг/кг до 100 мг/кг, от 5 мг/кг до 50 мг/кг, от 10 мг/кг до 50 мг/кг, от 20 мг/кг до 50 мг/кг, от 15 мг/кг до 40 мг/кг, от 15 мг/кг до 35 мг/кг, от 15 мг/кг и 30 мг/кг, от 25 мг/кг до 35 мг/кг, от 10 мг/кг до 30 мг/кг, от 10 мг/кг до 20 мг/кг, около 5 мг/кг, около 10 мг/кг, около 15 мг/кг, около 20 мг/кг, около 25 мг/кг, около 30 мг/кг, около 35 мг/кг, около 40 мг/кг, около 45 мг/кг или около 50 мг/кг массы тела объекта.

В некоторых воплощениях рекомендуемый диапазон суточных доз композиции, представленной в настоящем документе, для заболеваний или нарушений, описанных в настоящем документе, находится в диапазоне от около 0,1 мг до около 1000 мг в день, вводимых в виде разовой дозы один раз в день или в виде разделенных доз в течение дня. В некоторых воплощениях суточную дозу вводят два раза в день в равных дозах. В некоторых воплощениях диапазон суточной дозы должен составлять от около 10 до около 200 мг в день, в других воплощениях от около 10 до около 150 мг в день, в дополнительных воплощениях от около 25 до около 100 мг в день. В некоторых случаях может оказаться необходимым использовать дозировки активного ингредиента за пределами раскрытых в данном документе диапазонов, как будет очевидно специалистам в данной области техники. Кроме того, следует отметить, что клиницист или лечащий врач будут знать, как и когда прерывать, корректировать или прекращать терапию в зависимости от реакции объекта.

Различные терапевтически эффективные количества могут быть применимы для различных заболеваний и состояний, как будет легко известно специалистам в данной области техники. Точно так же количества, достаточные для предотвращения, контроля, лечения или облегчения таких нарушений, но недостаточные для того, чтобы вызвать или достаточные для того, чтобы уменьшить побочные эффекты, связанные с композицией, представленной в настоящем документе, также охватываются описанными в данном документе количествами доз и схемами частоты дозирования. Кроме того, когда объекту вводят несколько доз композиции, представленной в настоящем документе, не обязательно, чтобы все дозы были одинаковыми. В некоторых воплощениях доза, вводимая объекту, может быть увеличена для улучшения профилактического или терапевтического эффекта композиции или может быть уменьшена для уменьшения одного или нескольких побочных эффектов, которые испытывает конкретный объект.

В некоторых воплощениях доза композиции, представленной в настоящем документе, в пересчете на массу активного соединения, вводимого для предотвращения, лечения, контроля или облегчения расстройства или одного или нескольких его симптомов у объекта, составляет 0,1 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 10 мг/кг или 15 мг/кг или более массы тела объекта. В другом воплощении доза композиции или композиция, представленная в настоящем документе, вводимая для предотвращения, лечения, контроля или облегчения расстройства или одного или нескольких его симптомов у объекта, представляет собой стандартную дозу от 0,1 мг до 200 мг, от 0,1 мг до 100 мг, от 0,1 мг до 50 мг, от 0,1 мг до 25 мг, от 0,1 мг до 20 мг, от 0,1 мг до 15 мг, от 0,1 мг до 10 мг, от 0,1 мг до 7,5 мг, от 0,1 мг до 5 мг, от 0,1 до 2,5 мг, от 0,25 мг до 20 мг, от 0,25 до 15 мг, от 0,25 до 12 мг, от 0,25 до 10 мг, от 0,25 мг до 7,5 мг, от 0,25 мг до 5 мг, от 0,5 мг до 2,5 мг, от 1 мг до 20 мг, от 1 мг до 15 мг, от 1 мг до 12 мг, от 1 мг до 10 мг, от 1 мг до 7,5 мг, от 1 мг до 5 мг или от 1 мг до 2,5 мг.

В некоторых воплощениях лечение или профилактику можно начинать с одной или нескольких насыщающих доз соединения или композиции, представленных в настоящем документе, за которыми следует одна или несколько поддерживающих доз. В таких воплощениях нагрузочная доза может составлять, например, от около 60 до около 400 мг в день или от около 100 до около 200 мг в день в течение от одного дня до пяти недель. За нагрузочной дозой может следовать одна или несколько поддерживающих доз. В некоторых воплощениях каждая поддерживающая доза независимо составляет около от около 10 мг до около 200 мг в сутки, от около 25 мг до около 150 мг в сутки или от около 25 до около 80 мг в сутки. Поддерживающие дозы можно вводить ежедневно и в виде разовых доз или в виде разделенных доз.

В некоторых воплощениях доза соединения или композиции, представленных в настоящем документе, может быть введена для достижения равновесной концентрации активного ингредиента в крови или сыворотке объекта. Стационарная концентрация может быть определена путем измерения в соответствии с методами, доступными специалистам в данной области, или может быть основана на физических характеристиках объекта, таких как рост, масса и возраст. В некоторых воплощениях вводят достаточное количество соединения или композиции, представленных в настоящем документе, для достижения равновесной концентрации в крови или сыворотке объекта от около 300 до около 4000 нг/мл, от около 400 до около 1600 нг/мл. от около 600 до около 1200 нг/мл. В некоторых воплощениях местно вводят достаточное количество соединения или композиции, представленных в настоящем документе, для достижения равновесной концентрации в крови или сыворотке объекта от около 0,01 до около 300 нг/мл, от около 0,01 до около 100 нг/мл. мл, от около 0,01 до около 10 нг/мл, от около 0,01 до около 1 нг/мл, от около 0,01 до около 0,1 нг/мл или от около 0,01 до около 0,05 нг/мл. В некоторых воплощениях нагрузочные дозы можно вводить для достижения равновесных концентраций в крови или сыворотке от около 1200 до около 8000 нг/мл или от около 2000 до около 4000 нг/мл в течение от одного до пяти дней. В некоторых воплощениях нагрузочные дозы можно вводить местно для достижения равновесных концентраций в крови или сыворотке от около 0,05 до около 1200 нг/мл, от около 0,05 до около 100 нг/мл, от около 0,05 до около 10 нг/мл, от около 0,05 до около 1 нг/мл, от около 0,05 до около 0,5 нг/мл или от около 0,05 до около 0,1 нг/мл в течение от одного до пяти дней. В некоторых воплощениях поддерживающие дозы можно вводить для достижения равновесной концентрации в крови или сыворотке объекта от около 300 до около 4000 нг/мл, от около 400 до около 1600 нг/мл или от около 600 до около 1200 нг/мл. В некоторых воплощениях поддерживающие дозы можно вводить местно для достижения равновесной концентрации в крови или сыворотке объекта от около 0,01 до около 300 нг/мл, от около 0,01 до около 100 нг/мл, от около 0,01 до около 10 нг/мл, от около 0,01 до около 1 нг/мл, от около 0,01 до около 0,1 нг/мл или от около 0,01 до около 0,05 нг/мл.

В некоторых воплощениях введение одной и той же композиции может быть повторено, и введения могут быть разделены по меньшей мере на 1 день, 2 дня, 3 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 30 дней, 45 дней, 2 месяца, 75 дней, 3 месяца или 6 месяцев. В других воплощениях введение одного и того же профилактического или терапевтического средства может быть повторено, и введение может быть разделено по меньшей мере на 1 день, 2 дня, 3 дня, 5 дней, 10 дней, 15 дней, 30 дней, 45 дней, 2 месяца, 75 дней, 3 месяца или 6 месяцев.

В некоторых аспектах в настоящем документе предусмотрены стандартные дозы, содержащие соединение или его фармацевтически приемлемый комплекс в форме, подходящей для введения. Такие формы подробно описаны в данном документе. В некоторых воплощениях стандартная доза включает от 1 до 1000 мг, от 5 до 250 мг или от 10 до 50 мг активного ингредиента. В конкретных воплощениях стандартные дозы содержат около 1, 5, 10, 25, 50, 100, 125, 250, 500 или 1000 мг активного ингредиента. Такие стандартные дозы могут быть приготовлены в соответствии с методами, известными специалистам в данной области.

Дозировка может варьироваться в диапазоне, зависящем от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения терапевтически эффективная доза может быть первоначально оценена из анализов клеточных культур. Доза может быть составлена на животных моделях для достижения уровня в коже с поражением, например синдромом Нетертона или кожным заболеванием, опосредованным протеазами KLK), который включает IC₅₀ (т.е. концентрацию тестируемого соединения, которая достигает половины от максимального подавления симптомов), как определено в клеточной культуре. Такая информация может быть использована для более точного определения полезных доз для человека. Кроме того, уровни в плазме могут быть измерены, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы определить системное воздействие.

Следует также понимать, что конкретная дозировка и схема лечения для любого конкретного пациента будут зависеть от множества факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, размер поражения, количество поражений, общее состояние здоровья, пол, диета, время введения, комбинация лекарственных средств, мнение лечащего врача и тяжесть конкретного обрабатываемого заболевания. Количество соединения формулы (I), описанного в данном документе, в композиции будет также зависеть от конкретного соединения формулы (I) в композиции.

В некоторых воплощениях местная доза составляет около 0,01 мкг/см², около 0,05 мкг/см², около 0,1 мкг/см², около 0,15 мкг/см², около 0,2 мкг/см², около 0,3 мкг/см², около 0,4 мкг/см², около 0,5 мкг/см², около 0,6 мкг/см², около 0,7 мкг/см², около 0,8 мкг/см² или около 0,9 мкг/см²; или находится в пределах около 0,01-0,03 мкг/см², около 0,03-0,05 мкг/см², около 0,05-0,1 мкг/см², около 0,1-0,3 мкг/см², около 0,3-0,5 мкг/см², около 0,5-0,8 мкг/см², около 0,8-1,0 мкг/см², около 1-10 мкг/см², около 10-20 мкг/см², около 20-30 мкг/см², около 30-40 мкг/см², около 40-50 мкг/см², около 50-60 мкг/см², около 60-70 мкг/см², около 70-80 мкг/см², около 80-90 мкг/см², около 90-100 мкг/см², около 100-125 мкг/см², около 125- 150 мкг/см², около 150-175 мкг/см², около 175-200 мкг/см², около 200-250 мкг/см², около 250-300 мкг/см², около 300-350 мкг/см², около 350-400 мкг/см², около 400-450 мкг/см², около 450-500 мкг/см², около 500-550 мкг/см², около 550-600 мкг/см², около 600-650 мкг/см², около 650-700 мкг/см², около 700-750 мкг/см², около 750-800 мкг/см², около 800-850 мкг/см², около 850-900 мкг/см², около 900-950 мкг/см² или около 950-1000 мкг/см².

В некоторых воплощениях местная доза составляет около 0,5-1,0 мг/см², 1,0-1,5 мг/см², 1,5-2,0 мг/см², 2,5-2,5 мг/см², 3,0-3,5 мг/см², 3,5-5,0 мг/см², 5,0-7,5 мг/см², 7,5-10 мг/см², 1-10 мг/см², около 10-20 мг/см², около 20-30 мг/см², около 30-40 мг/см², около 40- 50 мг/см², около 50-60 мг/см², около 60-70 мг/см², около 70-80 мг/см², около 80-90 мг/см², около 90-100 мг/см², около 100-125 мг/см², около 125-150 мг/см², около 150-175 мг/см², около 175-200 мг/см², около 200-250 мг/см², около 250-300 мг/см², около 300-350 мг/см², около 350-400 мг/см², около 400-450 мг/см², около 450-500 мг/см², около 500-550 мг/см², около 550-600 мг/см², около 600-650 мг/см², около 650-700 мг/см², около 700-750 мг/см², около 750-800 мг/см², около 800-850 мг/см², около 850-900 мг/см², около 900-950 мг/см² или около 950 -1000 мг/см².

V. Способы

В третьем аспекте в настоящем документе предложен способ лечения кожного заболевания, связанного с протеолитической активностью одной или нескольких протеаз KLK, если объект в этом нуждается. Способ включает введение объекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса, или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс.

В некоторых воплощениях соединение формулы (I) имеет формулу:

,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

В некоторых воплощениях соединение формулы (I) имеет формулу:

,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

Фармацевтически приемлемый комплекс соединения формулы (I) определен и описан в данном документе. Фармацевтически приемлемый комплекс соединения формулы (I) может включать его фармацевтически приемлемую соль и/или сольват.

В некоторых воплощениях кожное заболевание представляет собой генодерматоз. В некоторых воплощениях генодерматоз представляет собой синдром Нетертона.

В некоторых воплощениях объект имеет мутации укорачивания с потерей функции ингибитора сериновой протеазы Типа Kazal-5 (SPINK5). В некоторых воплощениях у объекта наблюдается потеря функции LEKTI (лимфоэпителиальный ингибитор типа Kazal). В некоторых воплощениях у объекта наблюдается сверхэкспрессия одной или нескольких калликреиновых (KLK) сериновых протеаз. В некоторых воплощениях у объекта наблюдается сверхэкспрессия одной или нескольких протеаз KLK5, KLK7 и KLK14. В некоторых воплощениях у объекта наблюдается сверхэкспрессия протеазы KLK5. В некоторых воплощениях у объекта наблюдается сверхэкспрессия протеазы KLK7. В некоторых воплощениях у объекта наблюдается сверхэкспрессия протеазы KLK14. В некоторых воплощениях у объекта наблюдается сверхэкспрессия протеаз KLK5 и KLK7. В некоторых воплощениях у объекта наблюдается сверхэкспрессия протеаз KLK5, KLK7 и KLK14. В некоторых воплощениях у объекта наблюдается повышенная протеолитическая активность одной или нескольких калликреиновых (KLK) сериновых протеаз. В некоторых воплощениях объект имеет повышенную протеолитическую активность одной или нескольких протеаз KLK5, KLK7 и KLK14. В некоторых воплощениях объект имеет повышенную протеолитическую активность протеазы KLK5. В некоторых воплощениях объект имеет повышенную протеолитическую активность протеазы KLK7. В некоторых воплощениях объект имеет повышенную протеолитическую активность протеазы KLK14. В некоторых воплощениях у объекта наблюдается повышенная протеолитическая активность протеаз KLK5 и KLK7. В некоторых воплощениях у объекта наблюдается повышенная протеолитическая активность протеаз KLK5, KLK7 и KLK14.

В некоторых воплощениях в настоящем документе предложен способ лечения синдрома Нетертона, когда объект в этом нуждается. Способ включает введение объекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса, или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс.

В некоторых воплощениях в настоящем документе предложен способ лечения генодерматоза, когда объект нуждается в этом, и генодерматоз опосредуется одной или несколькими протеазами KLK. Способ включает введение объекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса, или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс. В некоторых воплощениях генодерматоз опосредован протеазой KLK5, протеазой KLK7, протеазой KLK14 или их комбинациями. В некоторых воплощениях генодерматоз опосредуется протеазой KLK5. В некоторых воплощениях генодерматоз опосредован протеазой KLK7. В некоторых воплощениях генодерматоз опосредуется протеазой KLK14. В некоторых воплощениях генодерматоз опосредован протеазами KLK5 и KLK7. В некоторых воплощениях генодерматоз опосредуется протеазами KLK5, KLK7 и KLK14. В некоторых воплощениях генодерматоз представляет собой синдром Нетертона.

В некоторых воплощениях в настоящем документе предложен способ лечения генодерматоза у объекта путем ингибирования протеолитической активности одной или нескольких протеаз KLK. Способ включает введение объекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса, или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность одной или нескольких протеаз KLK. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK5, протеазы KLK7, протеазы KLK14 или их комбинаций. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK5. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK7. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK14. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеаз KLK5 и KLK7. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеаз KLK5, KLK7 и KLK14. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой ингибитор KLK5. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой ингибитор KLK7. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой ингибитор KLK14. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой двойной ингибитор KLK5/KLK7. В некоторых воплощениях генодерматоз представляет собой синдром Нетертона.

В некоторых воплощениях в настоящем документе предложен способ лечения синдрома Нетертона у объекта путем ингибирования протеолитической активности одной или нескольких протеаз KLK. Способ включает введение объекту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса, или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность одной или нескольких протеаз KLK. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK5, протеазы KLK7, протеазы KLK14 или их комбинаций. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK5. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK7. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK14. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеаз KLK5 и KLK7. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеаз KLK5, KLK7 и KLK14. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой ингибитор KLK5. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой ингибитор KLK7. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой ингибитор KLK14. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой двойной ингибитор KLK5/KLK7.

Соединения по настоящему изобретению полезны для защиты кожи путем ингибирования протеолитической активности одной или нескольких протеаз KLK и стимуляции развития здоровой кожи. Таким образом, в дополнительном аспекте в настоящем документе предложен способ лечения кожного заболевания, когда объект нуждается в этом, и кожное заболевание опосредовано одной или несколькими протеазами KLK. Способ включает введение объекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса, или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс. В некоторых воплощениях кожное заболевание опосредовано протеазой KLK5, протеазой KLK7, протеазой KLK14 или их комбинациями. В некоторых воплощениях кожное заболевание опосредовано протеазой KLK5. В некоторых воплощениях кожное заболевание опосредовано протеазой KLK7. В некоторых воплощениях кожное заболевание опосредовано протеазой KLK14. В некоторых воплощениях кожное заболевание опосредовано протеазами KLK5 и KLK7. В некоторых воплощениях кожное заболевание опосредовано протеазами KLK5, KLK7 и KLK14. В некоторых воплощениях кожное заболевание представляет собой KLK-опосредованное заболевание, выбранное из группы, состоящей из синдрома Нетертона, синдрома шелушения кожи, розовых угрей, псориаза, экземы и атопического дерматита. В некоторых воплощениях KLK-опосредованное заболевание представляет собой синдром Нетертона.

В некоторых воплощениях в настоящем документе предложен способ лечения кожного заболевания у объекта путем ингибирования протеолитической активности одной или нескольких протеаз KLK. Способ включает введение объекту эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса, или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемый комплекс. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность одной или нескольких протеаз KLK. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK5, протеазы KLK7, протеазы KLK14 или их комбинаций. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK5. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK7. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеазы KLK14. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеаз KLK5 и KLK7. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) ингибирует протеолитическую активность протеаз KLK5, KLK7 и KLK14. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой ингибитор KLK5. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой ингибитор KLK7. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой ингибитор KLK14. В некоторых воплощениях соединение формулы (I) представляет собой двойной ингибитор KLK5/KLK7. В некоторых воплощениях кожное заболевание выбрано из группы, состоящей из синдрома Нетертона, синдрома шелушения кожи, розовых угрей, псориаза, экземы и атопического дерматита. В некоторых воплощениях кожное заболевание представляет собой синдром Нетертона.

Соединение формулы (I) или фармацевтическую композицию, включающую соединение формулы (I) по изобретению, можно использовать как для профилактического, так и для терапевтического лечения кожного заболевания или патологии или другого нежелательного состояния кожи у объекта. Например, композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для предотвращения раздражения кожи, предотвращения сыпи, ускорения заживления кожной ткани после возникновения сыпи или раздражения (т.е. формирования слоев эпидермиса и/или дермы кожи), предотвращения и/или замедления атрофии кожи, предотвращения и/или замедления появления сосудистых звездочек и/или красных пятен на коже, предотвращения и/или замедления шелушения кожи, предотвращения и/или облегчения кожного зуда, регулирования текстуры кожи (например, уменьшения шелушения, шероховатости, припухлости и болезненности) и улучшения цвета кожи (например, уменьшения покраснения).

Профилактическое или терапевтическое лечение генодерматоза или кожного заболевания у объекта может осуществляться путем применения соединения формулы (I) или его фармацевтической композиции в виде кожного лосьона, крема, геля, пены, мази, пасты, эмульсии, спрея, кондиционера, тоника, пластыря и т.п., которые предпочтительно предназначены для оставления на коже. После нанесения композиции на кожу ее можно оставить на коже на срок по меньшей мере около 15 минут, или по меньшей мере около 30 минут, или по меньшей мерее около 1 час, или по меньшей мере нескольких часов, например, по меньшей мере около 2 часов, 3 часов, 6 часов, 12 часов или 24 часов.

Соединения по настоящему изобретению также применимы для регулирования десквамации in vitro путем ингибирования протеазной активности одной или нескольких протеаз KLK в процедурах культивирования клеток/тканей. Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу дезагрегации клеток или ткани in vitro, способу, включающему стадии воздействия на клетки или ткани протеазой KLK (например, KLK5, KLK7 и/или KLK14) с последующим воздействием соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса по настоящему изобретению.

Следует понимать, что этот способ в целом применим к процедурам культивирования клеток, где этот способ можно использовать для диссоциации и отделения клеток для пассажа. Кроме того, этот способ можно использовать при культивировании искусственной кожи, где происходит селективное расщепление белков межклеточной адгезии протеазой KLK (например, KLK5, KLK7 и/или KLK14) в сочетании с регулированием такого расщепления соединением формула (I), ее фармацевтически приемлемый комплекс, приводит к тому, что клетки/ткани лучше подходят для последующего терапевтического применения.

В другом аспекте в настоящем документе предложен анализ in vitro для определения протеолитической активности одной или нескольких протеаз KLK в коже. Способ включает 1) приготовление кожного экстракта; 2) воздействие на субстрат и соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемого комплекса кожным экстрактом; и 3) определение скорости протеолитического расщепления субстрата. В некоторых воплощениях субстрат представляет собой пептид-п-нитроанилид (также называемый пептид-pNA). В некоторых воплощениях субстрат представляет собой дипептид-pNA, трипептид-pNA, тетрапептид-pNA, пентапептид-pNA или гексапептид-pNA. В некоторых воплощениях субстрат представляет собой тетрапептид-pNA. В некоторых воплощениях субстрат представляет собой Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA или Lys-His-Leu-Tyr-pNA. В некоторых воплощениях субстрат представляет собой Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA. В некоторых воплощениях субстрат представляет собой Lys-His-Leu-Tyr-pNA. Экстракт кожи может представлять собой экстракт кожи человека или экстракт кожи животного (например, мыши). В некоторых воплощениях экстракт кожи представляет собой экстракт кожи человека.

VI. Примеры

Общие синтетические способы

Используемые в данном документе символы и условные обозначения, используемые в этих процессах, схемах и примерах, независимо от того, определено ли отдельно конкретное сокращение, согласуются с теми, которые используются в современной научной литературе, например, в American Chemical Society или Journal of Biological Chemistry. В частности, без ограничения указанным, в примерах и по всему описанию могут быть использованы следующие сокращения: экв. (эквивалент); г (граммы); мг (миллиграммы); мл (миллилитров); мкл (микролитр); мМ (миллимолярный); мкМ (микромолярный); Гц (Герц); МГц (мегагерц); ммоль (миллимоли); час или часы (часы); мин (минуты); RT (комнатная температура); MS (масс-спектрометрия); ESI (ионизация электрораспылением); ТСХ (тонкослойная хроматография); ВЭЖХ (жидкостная хроматография высокого давления); THF (тетрагидрофуран); CDCl₃ (дейтерированный хлороформ); AcOH (уксусная кислота); DCM (дихлорметан); DMW (деминерализованная вода); DME (диметоксиэтан); DMF (N,N-диметилформамид); DMSO (диметилсульфоксид); DMSO-d6 (дейтерированный диметилсульфоксид); EtOAc (этилацетат); и MeOH (метанол).

Для всех следующих примеров можно использовать стандартные способы обработки и очистки, известные специалистам в данной области. Если не указано иное, все температуры выражены в °C (градусы Цельсия). Все реакции проводят при комнатной температуре, если не указано иное. Синтетические методологии, проиллюстрированные в настоящем документе, предназначены для иллюстрации применимой химии посредством использования конкретных примеров и не определяют объем изобретения.

Пример 1. 2-(4-(Гидроксиметил)-2-(метилсульфонил)фенил)-7,8-дигидро-4Н-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2 -d][1,3]оксазин-4-он (соединение 1.001)

Синтез соединения 1.001 показан на фиг. 1. Синтез промежуточного соединения 100 проиллюстрирован на фиг. 3.

Стадия 1: 4-бром-2-меркаптобензойная кислота (промежуточное соединение 102).

Смесь конц. HCl (280,0 мл) и ледяной воды (280,0 мл) медленно добавляли к перемешиваемому раствору 2-амино-4-бромбензойной кислоты (101) (200,0 г, 926,0 ммоль, 1,0 экв.), NaOH (37,0 г, 926,0 ммоль, 1,0 экв.) и нитрит натрия (63,90 г, 926,0 ммоль, 1,0 экв.) в DMW (4,0 л) с такой скоростью, чтобы температура реакции поддерживалась на уровне 3-6°С. После добавления реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 30 мин, а затем нейтрализовали ацетатом калия (454,0 г, 4,63 моль, 5,0 экв.). Этот раствор добавляли к предварительно нагретому раствору O-этилксантана калия (445,0 г, 2,78 моль, 3,0 экв.) в DMW (4,0 л) до 90°C. Реакционную смесь перемешивали при 90°С в течение 30 мин, охлаждали до 0°С и подкисляли конц. HCl (600,0 мл). Реакционную смесь подщелачивали 20% NaOH (1750 мл) и нагревали до 85°C в течение 2 часов. К этой смеси небольшими порциями добавляли NaHSO₃ (96,30 г, 926,0 ммоль, 1,0 экв.) и реакционную смесь нагревали до 85°С в течение 10 мин. Реакционную смесь фильтровали, охлаждали до 0°С и подкисляли конц. HCl (600,0 мл). Осажденное твердое вещество собирали фильтрованием, промывали DMW (500 мл), а затем н-гексаном и сушили на воздухе с получением промежуточного соединения 102 (216,0 г, 100,0%) в виде твердого вещества светло-серого цвета. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 7,88 м.д. (д, J = 1,9 Гц, 1H), 7,81 м.д. (т, J = 7,4 Гц, 1H), 7,38 м.д. (дд, J = 8,4, 2,0 Гц, 1H). MS (ESI): m/z 232,8 (M-1).

Стадия 2: Метил-4-бром-2-(метилтио)бензоат (промежуточное соединение 103)

Карбонат калия (896,0 г, 6,49 моль, 7,0 экв.) и метилиодид (231,0 мл, 3,71 моль, 4,0 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору 4-бром-2-меркаптобензойной кислоты (102) (216,0 г, 927,0 экв.). моль, 1,0 экв.) в DMF (3,24 л) при RT. Реакционную смесь нагревали до 80°С и перемешивали при 80°С в течение 20 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (10% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Добавляли DMW (2,5 л) и продукт экстрагировали этилацетатом (2×2,5 л). Объединенный экстракт EtOAc промывали DMW (2×2,5 л), рассолом (2,5 л), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и фильтрат концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 103 (180 г, 74,40%) в виде коричневого масла. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 7,83 м.д. (д, J = 8,3 Гц, 1H), 7,51-7,39 м.д. (м, 2H), 3,83 м.д. (с, 3H), 2,46 м.д. (с, 3H).

Стадия 3: Метил-4-бром-2-(метилсульфонил)бензоат (промежуточное соединение 104)

Раствор оксона (1,17 кг, 3,79 моль, 5,50 экв.) в DMW (4,50 л) добавляли к перемешиваемому раствору метил-4-бром-2-(метилтио)бензоата (103) (180,0 г, 589 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (3,60 л) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение 16 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (50% EtOAc в н-гексане). Около 40% растворителя удаляли перегонкой, затем к реакционной смеси добавляли охлажденную DMW (4,50 л) и перемешивали в течение 15 минут. Осажденное твердое вещество собирали фильтрованием с получением влажного продукта 104. Влажный продукт сушили в вакуумной печи при температуре ниже 50°С, получая высушенное промежуточное соединение 104 (200 г, 99,0%) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 8,19–8,02 м.д. (м, 2H), 7,73 м.д. (д, J = 8,1 Гц, 1H), 3,87 м.д. (с, 3H), 3,42 м.д. (с, 3H). МС (ESI): m/z 311,5 (М+18).

Стадия 4: 4-бром-2-(метилсульфонил)бензойная кислота (промежуточное соединение 105)

Раствор NaOH (192,0 г, 4,80 моль, 7,0 экв.) в воде (2,01 л) добавляли к перемешиваемому раствору метил-4-бром-2-(метилсульфонил)бензоата (104) (201,0 г, 0,68 моль, 1,0 л). экв.) в метаноле (2,01 л). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3,0 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (20% МеОН в DCM). Растворитель удаляли при пониженном давлении. К остатку добавляли ледяную DMW (1,5 л) и добавляли 5 н. HCl для доведения pH до ~5. Осажденное твердое вещество собирали фильтрованием, промывали охлажденной водой (1000 мл), сушили с получением промежуточного соединения 105 (155,0 г, 81,0%) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): 8,09 м.д. (д, J = 2,0 Гц, 1H), 8,04 м.д. (дд, J = 8,2, 2,0 Гц, 1H), 7,70 м.д. (д, J = 8,2 Гц, 1H), 3,44 м.д. (с, 3H). МС (ESI): m/z 278,8 (М-1).

Стадия 5: 4-бром-2-(метилсульфонил)бензоилхлорид (промежуточное соединение 106)

Тионилхлорид (68,4 мл, 940,0 ммоль, 2,50 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору 4-бром-2-(метилсульфонил)бензойной кислоты (105) (105,0 г, 376,0 ммоль, 1,0 экв.) в THF (1,05 л) с последующим добавлением DMF (1,37 мл, 18,80 ммоль, 0,05 экв.) при RT. Реакционную смесь нагревали до 80°С и перемешивали в течение 2 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (50% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Растворитель удаляли в вакууме с получением промежуточного соединения 106 (112,0 г). Неочищенный материал промежуточного соединения 106 использовали непосредственно на стадии 6.

Стадия 6: 7-(4-бром-2-(метилсульфонил)бензамидо)-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновая кислота (промежуточное соединение 107)

Триэтиламин (103,0 мл, 753,0 ммоль, 2,0 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору 7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновой кислоты (100) (60,20 г, 309,0 г). ммоль, 0,82 экв.) в THF (1,68 л) при 0°C, затем добавляли раствор 4-бром-2-(метилсульфонил)бензоилхлорида (106) (60,20 г, 309 ммоль, 1,0 экв.) в THF ( 1,68 л) при 0°С. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 10 минут, а затем при RT в течение 2,5 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (10% МеОН в DCM). Добавляли 1 н. HCl для доведения pH до 7. Около 70% THF удаляли перегонкой, а оставшийся остаток растирали с диэтиловым эфиром (250 мл) для осаждения твердого продукта. Твердое вещество собирали фильтрованием, промывали диэтиловым эфиром (50 мл) и сушили с получением промежуточного соединения 107 (120,0 г, 69,90%) в виде твердого вещества светло-коричневого цвета.

Промежуточное соединение 100, 7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновую кислоту, синтезировали на стадиях А-Е, как описано в данном документе.

Стадия A: Метил-3,4-дигидроксибензоат (промежуточное соединение 100B).

Серную кислоту (138,0 мл, 2,60 моль, 2,0 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору 3,4-дигидроксибензойной кислоты (100А) (200,0 г, 1,30 моль, 1,0 экв.) в метаноле (2,0 л). Реакционную смесь перемешивали при 80°С в течение 15 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (50% EtOAc в н-гексане). Растворитель удаляли перегонкой в вакууме, затем добавляли DMW (1500 мл) и продукт экстрагировали этилацетатом (3×1,5 л). Объединенный органический экстракт промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (2000 мл) и соляным раствором (1500 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 100В (198,0 г, 90,70%) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 9,78 м.д. (с, 1H), 9,37 м.д. (с, 1H), 7,36 – 7,23 м.д. (м, 2H), 6,81 м.д. (д, J = 8,2 Гц, 1H), 3,76 м.д. (с, 3H).

Стадия B: Метил-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилат (промежуточное соединение 100C).

Карбонат калия (405 г, 2,93 моль, 2,50 экв.) и 1,2-дибромэтан (152,0 мл, 1,76 моль, 1,50 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору метил-3,4-дигидроксибензоат (100В) (197,0 г, 1,17 моль, 1,0 экв.) в DMF (2,96 л). Реакционную смесь нагревали при 90°С и перемешивали в течение 25 часов. За ходом реакции следят с помощью ТСХ (анализ ТСХ 60% этилацетата в н-гептане). Реакционную смесь охлаждали до RT, затем добавляли DMW (7,50 л), затем экстрагировали EtOAc (2×3,50 л). Объединенный органический экстракт промывали DMW (2×3,5 л) и соляным раствором (3,5 л), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 100C (214,0 г, 94,10%) в виде светло-коричневого масла. ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,63 – 7,51 м.д. (м, 2H), 6,89 м.д. (д, J = 9,0 Гц, 1H), 4,35 – 4,24 м.д. (м, 4H), 3,88 м.д. (с, 3H) .

Стадия C: Метил-7-нитро-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилат (промежуточное соединение 100D)

Конц. HNO₃ (832,0 мл, 14,50 моль, 17,0 экв.) медленно добавляли к перемешиваемому раствору метил-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилата (100°C) (214,0 г, 1,10 моль, 1,0 экв.) в уксусной кислоте (832,0 мл, 14,50 моль, 13,2 экв.) при температуре ниже 20°C. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, контролируя ход реакции с помощью ТСХ (элюент: 60% этилацетат в н-гептане). Реакционную смесь выливали в ледяную воду (5,0 л) при интенсивном перемешивании. Осажденное твердое вещество собирали фильтрованием, промывали DMW (1100 мл) и сушили с получением промежуточного соединения 100D (261 г, 99,0%) в виде светло-желтого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 7,65 м.д. (с, 1H), 7,30 м.д. (с, 1H), 4,47 – 4,34 м.д. (м, 1H), 4,39 м.д. (с, 4H), 3,80 м.д. (с, 3H).

Стадия D: Метил-7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилат (промежуточное соединение 100E)

Смесь метил-7-нитро-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилата (100D) (260 г, 1,09 моль, 1,0 экв.), железной пыли (217,0 г, 2,72 моль, 2,5 экв., размер ячеек сита 300-400) в этаноле (1,69 л, 6,50 об. экв.), воды (585 мл) и уксусной кислоты (1,69 л) нагревали до 80°С и перемешивали при этой температуре в течение 45 мин. За ходом реакции следили с помощью ТСХ (элюент: 60% этилацетат в н-гептане). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через слой целита и слой промывали этилацетатом (500 мл). К фильтрату добавляли воду (5,0 л) и перемешивали. Водный слой отделяли и повторно экстрагировали этилацетатом (3×2,0 л). Объединенный органический экстракт промывали насыщ. бикарбонатом натрия (3×3,0 л) и соляной раствор (5,0 л), затем сушат над сульфатом натрия и фильтруют. Фильтрат концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 100Е (226 г, 99,40%) в виде твердого вещества светло-коричневого цвета. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 7,14 м.д. (с, 1H), 6,27 м.д. (с, 2H), 6,24 м.д. (с, 1H), 4,28 – 4,19 м.д. (м, 2H), 4,16 – 4,06 м.д. (м, 2H), 3,73 м.д. (с, 3H).

Стадия E: 7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновая кислота (промежуточное соединение 100).

К перемешиваемому раствору метил-7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилата (100E) (225,0 г, 1,08 моль, 1,0 экв.) в THF (1,58 мл) добавляли раствор NaOH (237,0 г, 5,92 моль, 5,50 экв.) в воде (1,58 мл), реакционную смесь нагревали до 80°C и перемешивали в течение 15 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (10% МеОН в DCM), чтобы гарантировать завершение реакции. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и выпаривали THF при пониженном давлении. Затем к остатку добавляли охлажденную DMW (1500 мл) и рН доводили до ~ 6,0 с помощью 5 н. HCl. Осажденное твердое вещество собирали фильтрованием, промывали DMW (300 мл) и сушили с получением промежуточного соединения 100 (152,50 г, 72,5%) в виде светло-желтого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 8,17 м.д. (с, 2H), 7,13 м.д. (с, 1H), 6,20 м.д. (с, 1H), 4,27 – 4,17 м.д. (м, 2H), 4,17 – 4,02 м.д. (м, 2Н).

Стадия 7: Синтез 2-(4-бром-2-(метилсульфонил)фенил)-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-она (промежуточное соединение 108)

Раствор 7-(4-бром-2-(метилсульфонил)бензамидо)-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновой кислоты (107) (120,0 г, 263,0 ммоль, 1,0 экв.) в уксусном ангидриде (960 мл) нагревали до 140°C и перемешивали в течение 1,5 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (50% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Около 70% растворителя удаляли вакуумной перегонкой. Оставшийся остаток охлаждали до комнатной температуры, затем добавляли DMW (1000 мл) и смесь перемешивали в течение 40 мин. Осажденное твердое вещество собирали фильтрованием, промывали DMW (1000 мл) и сушили до промежуточного соединения 108 (85,4 г, 74,1%) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 8,29 – 8,12 м.д. (м, 2H), 7,91 м.д. (д, J = 8,2 Гц, 1H), 7,59 м.д. (с, 1H), 7,26 м.д. (с, 1H), 4,55-4,32 м.д. (м, 4H), 3,57 м.д. (с, 3H). МС (ESI): m/z 439,6 (М+1).

Стадия 8: Синтез 2-(2-(метилсульфонил)-4-винилфенил)-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-он (промежуточное соединение 109)

Раствор 2-(4-бром-2-(метилсульфонил)фенил)-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d ][1,3]оксазин-4-она (108) (84,0 г, 192,0 ммоль, 1,0 экв.) в 1,4-диоксане (1,68 л) дегазировали три раза, применяя чередование вакуума и пополнения азотом для удаления кислорода. Бикарбонат натрия (56,40 г, 671,0 ммоль, 3,5 экв.), винилтрифторборат калия (64,20 г, 479,0 ммоль, 2,5 экв.), три(о-толил)-фосфин (14,60 г, 47,90 ммоль, 0,25 экв.) и Pd (OAc)2 (1,51 г, 6,71 ммоль, 0,035 экв.) добавляли в атмосфере азота и реакционную колбу дегазировали еще два раза, чередуя вакуум и пополнение азотом. Реакционную смесь нагревали при 70°С и перемешивали в течение 3,5 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (40% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, гасили 1 н. раствором HCl (1000 мл) и фильтровали через фильтр Hiflo. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и к остатку добавляли DMW (2,5 л). Продукт экстрагировали этилацетатом (3×2 л) и объединенный экстракт EtOAc промывали соляным раствором (2,5 л), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт перемешивали в диэтиловом эфире (150 мл) и фильтровали с получением промежуточного соединения 109 (72,0 г, 97,50%) в виде светло-желтого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 8,19–8,10 м.д. (м, 1H), 8,06–8,00 м.д. (м, 1H), 7,93 м.д. (дд, J = 7,9, 3,5 Гц, 1H), 7,58 м.д. ( с, 1H), 7,24 м.д. (с, 1H), 6,96 м.д. (дд, J = 17,7, 11,0 Гц, 1H), 6,10 м.д. (т, J = 17,7 Гц, 1H), 5,56 м.д. (д, J = 11,0 Гц), 1H), 4,55–4,26 м.д. (м, 4H), 3,56–3,46 м.д. (м, 3H).

Стадия 9: Синтез 3-(метилсульфонил)-4-(4-оксо-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-2-ил)бензальдегида (промежуточное соединение 110)

Рутений на углероде (10%) (5,66 г, 5,60 ммоль, 0,03 экв.) добавляли к раствору 2-(2-(метилсульфонил)-4-винилфенил)-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-она (109) (72,0 г, 187,0 ммоль, 1,0 экв.) в ацетонитриле (1,44 л), EtOAc (1,44 л) и DMW (1,08 л) при комнатной температуре. Метапериодат натрия (130,0 г, 607,0 ммоль, 3,25 экв.) добавляли при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 3,0 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (50% EtOAc в н-гексане). Реакционную смесь фильтровали через слой целита. Твердое вещество промывали этилацетатом (4×1,5 л). Фильтрат промывали водой (3,0 л) и водный слой повторно экстрагировали этилацетатом (800 мл). Объединенный органический экстракт промывали соляным раствором (2,0 л), сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали в вакууме с получением сырого продукта 110 (65,0, 95,30%) в виде коричневого твердого вещества. Неочищенный материал промежуточного продукта 110 использовали непосредственно на следующей стадии 10.

Стадия 10: Синтез 2-(4-(гидроксиметил)-2-(метилсульфонил)фенил)-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-она (соединение 1.001)

Боргидрид натрия (8,0 г, 1,0 экв.) медленно добавляли к перемешиваемому раствору 3-(метилсульфонил)-4-(4-оксо-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-2-ил)бензальдегида (110) (82,0 г, 212,0 ммоль, 1,0 экв.) в THF (1,23 мл) и этаноле (1,23 л) при 0°С в течение 1,0 ч. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 2 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (70% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Реакционную смесь гасили насыщенным раствором хлорида аммония (100 мл) и продукт экстрагировали этилацетатом (3×1500 мл). Объединенный органический экстракт промывали соляным раствором (500 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (размер 230-400 меш) с использованием градиентного растворителя (20-40% [(10% MeOH в EtOAc)] в н-гексане) с получением соединения 1.001 (15,50 г, 18,80 %) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 8,08 м.д. (д, J = 1,5 Гц, 1H), 7,91 м.д. (д, J = 7,9 Гц, 1H), 7,83 м.д. (дд, J = 7,9, 1,6 Гц, 1H), 7,58 м.д. (с, 1H), 7,24 м.д. (с, 1H), 5,64 м.д. (т, J = 5,7 Гц, 1H), 4,70 м.д. (д, J = 5,7 Гц, 2H), 4,47 – 4,35 м.д. (м, 4Н), 3,50 м.д. (с, 3H).

Пример 2: 2-(5-(Гидроксиметил)-2-(метилсульфонил)фенил)-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2] -d][1,3]оксазин-4-он (соединение 1.002)

Синтез соединения 1.002 показан на фиг. 2. Синтез промежуточного соединения 100 проиллюстрирован на фиг. 3.

Стадия 1: 5-бром-2-меркаптобензойная кислота (промежуточное соединение 202)

Смесь концентрированной HCl (28,0 мл) и охлажденной воды (34 мл) добавляли по каплям к перемешиваемому раствору 2-амино-5-бромбензойной кислоты (201) (20,0 г, 92,6 ммоль, 1,0 экв.), NaOH (3,70 г, 92,6 ммоль, 1,0 экв.) и нитрита натрия (6,39 г, 92,6 ммоль, 1,0 экв.) в DMW (400,0 мл), поддерживая внутреннюю температуру 3-6°C. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин и затем нейтрализовали ацетатом калия (30,0 г, 306,0 ммоль, 3,3 экв.). Этот раствор добавляли к раствору O-этилксантогената калия (44,6 г, 278,0 ммоль, 3,0 экв.) в DMW (223 мл), предварительно нагретому до 90°C. Смесь перемешивали при той же температуре в течение 30 мин, охлаждали до 0°С и подкисляли конц. HCl (100 мл). Реакционную смесь подщелачивали 10% NaOH (200 мл) и нагревали до 85°C в течение 2 часов. К этой смеси порциями добавляли NaHSO3 (9,81 г, 92,6 ммоль) и смесь нагревали до 85°С в течение 10 мин. Смесь фильтровали, охлаждали до 0°С и подкисляли конц. HCl (100 мл). Осадок собирали фильтрованием и промывали водой, а затем н-гексаном с получением промежуточного соединения 202 (20,2 г, 93,6%) в виде бледно-коричневого твердого вещества. МС (ESI): m/z 230,8 (М-1).

Стадия 2: Метил 5-бром-2-(метилтио)бензоат (промежуточное соединение 203)

Карбонат калия (83,0 г, 601 ммоль, 7,0 экв.) и этилиодид (21,4 мл, 343 ммоль, 4,0 экв.) добавляли при 0°C к перемешиваемому раствору 5-бром-2-меркаптобензойной кислоты (202) (20 г, 85,8 ммоль, 1 экв.) в DMF (600 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при 80°С в течение 4 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (10% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Добавляли DMW (500 мл) и продукт экстрагировали этилацетатом (3×500 мл). Объединенный экстракт EtOAc промывали рассолом (300 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и фильтрат концентрировали в вакууме, получая неочищенное соединение. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (размер 230-400 меш) и градиентном растворителе (0-5% EtOAc в н-гексане) с получением промежуточного соединения 203 (20 г, 89,3%) в виде не совсем белого твердого вещества.

Стадия 3: Метил-5-бром-2-(метилсульфонил)бензоат (промежуточное соединение 204)

Раствор оксона (40,8 г, 268 ммоль, 5,0 экв.) в DMW (280 мл) добавляли к перемешиваемому раствору метил-5-бром-2-(метилтио)бензоата (203) (14,0 г, 53,6 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (350 мл) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при 50°С в течение 16 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (70% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Продукт экстрагировали EtOAc (4×500 мл). Объединенный органический экстракт промывают рассолом (2×300 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (размер 230-400 меш) и градиентном растворителе (5-20% EtOAc в н-гексане) с получением промежуточного соединения 204 (13,2 г, 84,0%) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 8,08 – 7,98 м.д. (м, 2H), 7,93 м.д. (дд, J = 7,9, 0,9 Гц, 1H), 3,87 м.д. (с, 3H), 3,44 – 3,35 м.д. (м, 3Н). MS (ESI): m/z 292,8 (M-1).

Стадия 4: Метил-2-(метилсульфонил)-5-винилбензоат (промежуточное соединение 205)

Раствор метил-5-бром-2-(метилсульфонил)бензоата (204) (5,0 г, 17,1 ммоль, 1,0 экв.) в DME (100,0 мл, 20 об. экв.) трижды дегазировали с помощью чередующегося вакуума, а пополнение азотом дважды дегазировали с чередованием вакуума и азота. В атмосфере азота добавляли карбонат калия (4,71 г, 34,1 ммоль, 2,0 экв.), винилтрифторборат калия (4,57 г, 34,1 ммоль, 2,0 экв.) и Pd(PPh₃)₄ (591 мг, 512 мкмоль, 0,03 экв.), и реакционную колбу дополнительно два раза дегазировали с чередованием вакуума и заполнения азотом. Реакционную смесь нагревали при 80°С и перемешивали в течение 4 ч (N₂ удаляли при повышении температуры до 40-45°С). Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (70% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через фильтр Hyflo. К фильтрату добавляли DMW (300 мл) и продукт экстрагировали этилацетатом (2×100 мл). Объединенный органический экстракт промывали рассолом (2×100 мл), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (размер 230-400 меш), используя растворитель с градиентом (5-20% EtOAc в н-гексане) в качестве элюента, с получением промежуточного соединения 205 (3,36 г, 82,0%) в виде светло-желтой камеди.

Стадия 5: 2-(метилсульфонил)-5-винилбензойная кислота (промежуточное соединение 206).

К перемешиваемому раствору метил-2-(метилсульфонил)-5-винилбензоата (205) (3,36 г, 14,0 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (67,2 мл) добавляли раствор NaOH (3,92 г, 97,9 ммоль, 7,0 экв.) в воде (67,2 мл). Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение 2 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (70% EtOH в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, pH доводили до ~ 6 с помощью 3 н. HCl и водный слой экстрагировали этилацетатом (4×500 мл). Объединенный органический экстракт промывали соляным раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и фильтрат концентрировали в вакууме с получением желаемого промежуточного соединения 206 (1,48 г, 46,8%) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 7,93 м.д. (т, J = 7,6 Гц, 1H), 7,88 – 7,78 м.д. (м, 2H), 6,87 м.д. (дд, J = 17,7, 11,0 Гц, 1H), 6,13 м.д. (г, J = 17,6 Гц, 1Н), 5,53 м.д. (д, J = 10,9 Гц, 1Н), 3,37 м.д. (с, 3H). МС (ESI): m/z 224,95 (М-1).

Стадия 6: 2-(метилсульфонил)-5-винилбензоилхлорид (промежуточное соединение 207).

Оксалилхлорид (2,66 мл, 30,9 ммоль, 5,0 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору 2-(метилсульфонил)-5-винилбензойной кислоты (206) (1,4 г, 6,19 ммоль, 1,0 экв.) в DCM (70 мл) с последующим добавлением 2 капель DMF при RT. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 2 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (50% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Растворитель удаляли в вакууме с получением целевого продукта в виде промежуточного соединения 207 (540 мг, 83,2%). Сырой материал промежуточного продукта 207 использовался непосредственно на следующей стадии 7.

Стадия 7: 7-(2-(метилсульфонил)-5-винилбензамидо)-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновая кислота (промежуточное соединение 208)

Триэтиламин (1,93 мл, 13,8 ммоль, 3,0 экв.) и раствор 2-(метилсульфонил)-5-винилбензоилхлорида (207) (1,35 мг, 5,53 ммоль, 1,2 экв.) в THF (36 мл) добавляли к перемешиваемому раствору 7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновой кислоты (100) (900 мг, 4,61 ммоль, 1,0 экв.) в THF (36,0 мл) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при той же температуре в течение 10 минут, а затем при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (20% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Растворитель удаляли в вакууме. К остатку добавляли DMW и продукт экстрагировали EtOAc (9×200 мл). Объединенный экстракт EtOAc промывали рассолом (200 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме с получением промежуточного соединения 208 (1,6 г, 86,0%) в виде коричневого твердого вещества. MS(ESI): m/z 404,10 (M+1), m/z 401,90 (M-1).

Промежуточное соединение 100, 7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновую кислоту, синтезировали на стадиях А-Е, как описано в данном документе.

Стадия A: Метил-3,4-дигидроксибензоат (промежуточное соединение 100B).

К перемешиваемому раствору 3,4-дигидроксибензойной кислоты (100A) (97%, 10,0 г, 62,9 ммоль, 1,0 экв.) в MeOH (500 мл) добавляли серную кислоту (96%, 7,0 мл, 126,0 ммоль, 2,0 экв.) при RT. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. С помощью ТСХ проверяли завершение реакции. Растворитель удаляли в вакууме и затем добавляли воду (500 мл). Водный слой экстрагировали EtOAc (3 х 100 мл). Объединенные органические слои промывали насыщ. раствором NaHCO₃ (250 мл), рассолом (250 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме с получением желаемого промежуточного соединения 100B (8,72 г, 82,4%) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 9,81 м.д. (д, J = 131,1 Гц, 2H), 7,41 – 7,19 м.д. (м, 2H), 6,81 м.д. (д, J = 8,2 Гц, 1H), 3,77 м.д. (с, 3H).

Стадия B: Метил-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилат (промежуточное соединение 100C).

К перемешиваемому раствору метил-3,4-дигидроксибензоата (100B) (10,0 г, 59,5 ммоль, 1,0 экв.) в ацетоне (200,0 мл) добавляли карбонат калия (20,5 г, 149 ммоль, 2,50 экв.), а затем добавляли 1,2-дибромэтана (7,72 мл, 89,2 ммоль, 1,50 экв.) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение ночи. С помощью ТСХ проверяли завершение реакции. Растворитель удаляли в вакууме и затем добавляли воду. Водный слой нейтрализовали 1 н. HCl и затем экстрагировали EtOAc (2×250 мл). Объединенный органический экстракт промывали рассолом (500 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью combiflash с использованием этилацетата в н-гексане (от 0 до 10%) с получением желаемого промежуточного соединения 100C (9,0 г, 77,9%) в виде бесцветного масла. ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 7,54 – 7,42 м.д. (м, 2H), 6,85 – 6,75 м.д. (м, 1H), 4,27 – 4,14 м.д. (м, 4H), 3,79 м.д. (с, 3H).

Стадия C: Метил-7-нитро-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилат (промежуточное соединение 100D)

К перемешиваемому раствору метил-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилата 100C (9,0 г, 46,3 ммоль, 1,0 экв.) в уксусной кислоте (35,0 мл, 612 ммоль, 13,2 экв.) добавляли по каплям конц. HNO3 (47,0 мл, 788 ммоль, 17,0 экв.) при температуре ниже 20°C, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. С помощью ТСХ проверяли завершение реакции. Реакционную смесь выливали в ледяную воду при интенсивном перемешивании и водный слой экстрагировали EtOAc (3×500 мл). Объединенный органический экстракт промывали NaHCO3, соляным раствором, сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме с получением целевого продукта в виде промежуточного соединения 100D (9,7 г, 87,5%) в виде бледно-желтого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): δ 7,65 м.д. (с, 1H), 7,30 м.д. (с, 1H), 4,47 – 4,34 м.д. (м, 1H), 4,39 м.д. (с, 4H), 3,80 м.д. (с, 3H).

Стадия D: Метил-7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилат (промежуточное соединение 100E).

Смесь метил-7-нитро-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилата (100D) (25,0 г, 105,0 ммоль, 1,0 экв.), железа (20,4 г, 366,0 ммоль, 3,5 экв.), этанол (625 мл), воду (163 мл) и уксусную кислоту (500 мл) перемешивали при 70°С в течение 45 мин. ТСХ проверяли, чтобы убедиться в завершении реакции. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через фильтр Hiflo. Фильтрат разбавляли водой (1000 мл) и водный слой экстрагировали этилацетатом (3×700 мл). Объединенный органический экстракт промывали насыщ. бикарбонатом натрия (2×1000 мл), рассолом (1000 мл), сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали в вакууме с получением указанного в заголовке промежуточного соединения 100E (21,8 г, 99,7%) в виде коричневого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 7,14 м.д. (с, 1H), 6,25 м.д. (д, J = 7,6 Гц, 3H), 4,26 – 4,19 м.д. (м, 2H), 4,17 – 4,08 м.д. (м, 2H), 3,73 м.д. (с, 3H). МС (ESI): m/z 210,10 (М+1).

Стадия E: 7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновая кислота (промежуточное соединение 100)

К перемешиваемому раствору метил-7-амино-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоксилата (100E) (22,0 г, 105 ммоль, 1,0 экв.) в THF (440,0 мл) добавляли раствор NaOH (23,1 г, 578 ммоль, 5,5 экв.) в воде (440,0 мл) и реакционную смесь перемешивали при 80°C в течение 20 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (10% МеОН в DCM), чтобы гарантировать завершение реакции. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, рН доводили до 6 с помощью 3 н. HCl и водный слой экстрагировали этилацетатом (5×500 мл). Объединенные органические слои промывали соляным раствором, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали фильтрат в вакууме, получая твердый неочищенный продукт коричневого цвета. Неочищенный продукт очищали н-гексаном с получением целевого промежуточного соединения 100 (18,6 г, 90,6%) в виде коричневого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 8,27 м.д. (с, 2H), 7,13 м.д. (с, 1H), 6,20 м.д. (с, 1H), 4,27 – 4,19 м.д. (м, 2H), 4,18 – 4,08 м.д. (м, 2Н).

Стадия 8: 2-(2-(метилсульфонил)-5-винилфенил)-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-он (промежуточное соединение 209)

Раствор 7-(2-(метилсульфонил)-5-винилбензамидо)-2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-карбоновой кислоты (208) (1,60 мг, 3,97 ммоль, 1,0 экв.) в уксусном ангидриде (40 мл) перемешивали при 140°C в течение 1,5 часов. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (50% EtOH в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, затем добавляли DMW (100 мл). Продукт экстрагировали EtOAc (4×200 мл). Объединенный экстракт EtOAc промывали рассолом (2×200 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали под вакуумом, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (размер 230-400 меш) и градиентном растворителе (20-50% EtOAc в н-гексане) с получением промежуточного соединения 209 (700 мг, 45,8%) в виде твердого вещества желтого цвета. ¹H ЯМР (300 МГц, CDCl3): δ 8,15 м.д. (д, J = 8,2 Гц, 1H), 7,90 м.д. (д, J = 1,7 Гц, 1H), 7,77 – 7,68 м.д. (м, 2H), 7,16 м.д. (с, 1H), 6,82 м.д. (дд, J = 17,5, 10,9 Гц, 1H), 6,01 м.д. (д, J = 17,5 Гц, 1H), 5,57 м.д. (д, J = 10,9 Гц, 1H), 4,40 м.д. (дд, J = 11,8, 5,3 Гц, 5H), 3,52 м.д. (д, J = 3,0 Гц, 3H). MS(ESI): m/z 385,80 (M+1).

Стадия 9: 3-(метилсульфонил)-4-(4-оксо-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][ 1,3]оксазин-2-ил)бензальдегид (промежуточное соединение 210)

Рутений на углероде (10%) (50 мг, 0,049 ммоль, 0,03 экв.) добавляли к раствору 2-(2-(метилсульфонил)-5-винилфенил)-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-она (209) (0,630 г, 1,63 ммоль, 1,0 экв.) в ацетонитриле (12,6 мл), EtOAc (12,6 мл) и DMW (12,6 мл) при RT. Метапериодат натрия (1,05 г, 4,9 ммоль, 3,0 экв.) добавляли при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (70% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Реакционную смесь фильтровали через слой целита. Фильтрат разбавляли водой (100 мл) и водный слой экстрагировали этилацетатом (3×200 мл). Объединенный органический экстракт промывали насыщ. бикарбонатом натрия, рассолом, сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали в вакууме с получением неочищенного промежуточного соединения 210. Неочищенный продукт промежуточного соединения 210 использовали непосредственно на следующей стадии 10.

Стадия 10: 2-(4-(гидроксиметил)-2-(метилсульфонил)фенил)-7,8-дигидро-4H-[1,4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-4-он (соединение 1.002)

Боргидрид натрия (9,77 мг, 0,258 ммоль, 0,5 экв.) добавляли в течение 1 ч к перемешиваемому раствору 4-(метилсульфонил)-3-(4-оксо-7,8-дигидро-4H-[1, 4]диоксино[2',3':4,5]бензо[1,2-d][1,3]оксазин-2-ил)бензальдегида (210) (0,20 г, 0,52 ммоль, 1,0 экв.) в THF (10,0 мл) при -10°С. Реакционную смесь перемешивали при той же температуре 0°С в течение 30 мин. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ (70% EtOAc в н-гексане), чтобы гарантировать завершение реакции. Реакционную смесь гасили насыщенным раствором хлорида аммония (50 мл) и продукт экстрагировали этилацетатом (3×100 мл). Объединенный органический экстракт промывали соляным раствором (500 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме, получая неочищенный продукт. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (размер 230-400 меш) с использованием градиентного растворителя (20-40% [(10% MeOH в EtOAc)] в н-гексане) с получением соединения 1.002 (70 мг, 34,80 %) в виде не совсем белого твердого вещества. ¹H ЯМР (300 МГц, DMSO): δ 8,07 м.д. (д, J = 8,2 Гц, 1H), 7,88 м.д. (с, 1H), 7,79 м.д. (д, J = 8,5 Гц, 1H), 7,58 м.д. (с, 1H), 7,24 м.д. (с, 1H), 5,63 м.д. (т, J = 5,7 Гц, 1H), 4,69 м.д. (д, J = 5,6 Гц, 2H), 4,52 – 4,31 м.д. (м, 4H), 3,48 м.д. (с, 3H). MS(ESI): m/z 390,0 (M+1).

Пример 3. Анализы активности in vitro

Калликреиновые белки человека: Рекомбинантный человеческий KLK5, экспрессированный в HEK293, был получен от SpeedBio (Гейтерсберг, Мэриленд). Рекомбинантный профермент KLK-7 и рекомбинантный профермент KLK-14, оба экспрессированные в клетках мышиной миеломы, были получены от R&D Biosystems (Миннеаполис, Миннесота). Плазмин и тромбин были получены от Haematologic Technologies (Эссекс-Джанкшен, Вермонт). Трипсин и химотрипсин были куплены у Worthington Biochemical Corporation (Лейквуд, Нью-Джерси), а калликреин плазмы был из Prospec (Ист-Брунсвик, Нью-Джерси). Нейтрофильная эластаза была получена от Innovative Research (Пири Корт, Мичиган). Бычья рекомбинантная энтерокиназа, экспрессируемая в E. coli, была куплена у Sigma (Сент-Луис, Мичиган). Матриптаза, экспрессируемая в E.coli, была получена от Enzo Life Sciences (Фармингдейл, Нью-Йорк). В качестве контрольных ингибиторов мезилат нафамостата был получен от Sigma (Сент-Луис, Мичиган), а (2-(2-фторфенил)-5,6,7,8-тетрагидро-4Н-бензо[4,5]тиено[2,3-d][1,3]оксазин-4-он был получен от Interbioscreen (Москва, Россия).

Субстраты: S-2288 (D-Ile-Pro-Arg-pNA), CS-PSA (MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA), S-2266 (HD-Val-Leu-Arg-pNA) и S-2288 (HD-lle-Pro-Arg-pNA) были куплены у Diapharma (Уэст-Честер, Огайо). MeOSuccAla-Ala-Pro-Val-pNA был приобретен у Sigma (Сент-Луис, Мичиган). Субстраты растворяли в воде с концентрацией 10 мМ и в аликвотах замораживали при -20°С.

Активация KLK-7 и KLK-14: 150 мкл 8 мкМ раствора проферментов KLK-7 или KLK-14 в 50 мМ Трис, 10 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 0,05% (масс./об.) Brij-35, рН 7,5 смешивали со 150 мкл 10 мкг/мл бычьей энтерокиназы в том же буфере и инкубировали в течение 2 ч для KLK-7 и 1 ч для KLK-14 при 37°С. После периода инкубации активацию останавливали добавлением 6 мкл 0,5 М EDTA, рН 8,0.

Анализы: Все анализы проводили в 384-луночных полистироловых планшетах, покрытых в течение ночи 0,1% Tween 20 при 4°C. Затем планшеты дважды промывали 100 мкл воды и сушили. Для определения значений IC50 ингибиторы разбавляли серийными разведениями с интервалами 1:3 в чистом DMSO в 50 раз по сравнению с предполагаемыми конечными концентрациями в анализах. Обычно готовили восемь разведений ингибитора и один контроль с DMSO. Субстраты разбавляли водой в 2,2 раза по сравнению с конечной концентрацией в смеси для анализа. Лунки планшета заполняли 50 мкл фермента, разведенного в 2-кратном буфере для анализа (100 мМ трис, 200 мМ NaCl, 0,2% PEG, 0,01% Tween, 2 мМ EDTA, рН 8,0) в двукратной предполагаемой концентрации. Затем для начала реакции добавляли 5 мкл DMSO, 2,2 мкл ингибитора и 45 мкл субстрата. Анализы контролировали при 37°C в многолуночном планшетном ридере при длине волны 405 нм (Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния) в течение 1 часа. Ингибитор инструмента, нафамостат, использовали в качестве контроля для трипсина, тромбина, KLK-5 и KLK-14 при максимальной концентрации 10 мкМ и (2-(2-фторфенил)-5,6,7,8-тетрагидро-4H- бензо[4,5]тиено[2,3-d][1,3]оксазин-4-он для KLK-7 при 5 мкМ.

В таблице приведены условия анализа для отдельных ферментов.

Фермент Концентрация фермента (нM) Субстрат Концентрация субстрата
(мкM) KLK-7 20 CS-PSA 500 KLK-5 10 S-2288 500 KLK-14 5 S-2288 500 Калликреин плазмы 5 S-2266 200 трипсин 0.1 S-2288 500 химотрипсин 0.2 CS-PSA 500 плазмин 1 S-2288 500 тромбин 0,5 S-2288 200 матриптаза 0,015 Ед./мкл S-2288 200

Анализ данных: Кривые прогресса гидролиза субстрата анализировали с помощью линейной регрессии последних 20 минут реакции. Подгонка доза-реакция полученных скоростей (rate) к следующему уравнению дает IC50:

,

где 1) c: фоновая скорость при самой высокой концентрации ингибитора; 2) d: скорость контрольной реакции; 3) IC₅₀: IC₅₀ ингибитора; 4) x: концентрация ингибитора; и 5) b: уклон.

Пример 4. Протеазная активность в коже человека

Материалы: пептидные субстраты PS-01 (YRSR-pNA Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA) и PS-02 (Lys-His-Leu-Tyr-pNA) были синтезированы Zamboni Chemical Solutions (Монреаль, Канада). Образцы эпидермиса человека были получены от Biopredic (Сен-Грегуар, Франция). Набор для анализа белка BCA был приобретен в VWR.

Приготовление кожного экстракта. Эпидермис замораживали и лиофилизировали. Образец 15 мг лиофилизированного эпидермиса погружали в 1 мл высокосолевого буфера (100 мМ Трис, 5 мМ EDTA, 2 М KCl, рН 8), дважды замораживали на сухом льду и оттаивали. После инкубации в течение ночи при 4°C и добавления шести металлических шариков диаметром 2,4 мм образец гомогенизировали в гомогенизаторе Bertin Precellys (Аткинсон, Нью-Хэмпшир) три раза при 5000 Гц по 20 секунд каждый раз и охлаждали в промежутке в течение 30 секунд. После центрифугирования на максимальной скорости в настольной миницентрифуге определяли концентрацию белка в надосадочной жидкости анализом ВСА (~0,5 мг/мл).

Ингибирование протеазной активности в экстракте кожи: готовили исходные растворы 200, 66, 22 и 0 мкМ тестируемого соединения в DMSO. Исходные субстраты 1100 мкМ PS-01 и PS-02 готовили путем растворения в воде. Лунки 384-луночного планшета заполняли 50 мкл двукратного буфера для анализа (см. выше), а затем добавляли 45 мкл исходного субстрата и 5 мкл тестируемого соединения. Реакцию запускали добавлением 10 мкл кожного экстракта к субстрату PS-02 и 5 мкл к субстрату PS-01. Гидролиз субстрата контролировали в многолуночном планшетном ридере при 405 нм.

Пример 5. Результаты анализа тестируемых соединений

Соединения 1.001 и 1.002, а также известное соединение 14 тестировали в соответствии с протоколами анализа Примеров 3 и 4. Результаты испытаний приведены в таблице 2. Соединение 14 раскрыто в WO 2015/112081 и имеет формулу:

.

Таблица 2. Результаты анализа протестированных соединений

Конц. Соед. 14 Соед. 1.001 Соед. 1.002 Рекомбинантный фермент KLK5 (IC₅₀) 0,24 мкМ 0,21 мкМ 1,57 мкМ Рекомбинантный фермент KLK7 (IC₅₀) 0,13 мкМ 0,34 мкМ 0,22 мкМ Скорость в анализе кожи 0,14^* 0,004^* 0,009^* Константа скорости истощения субстрата 1 мкМ 0,1^* 0,02^* 0,06^* 3,3 мкМ 0,08^* 0,04^* 0,05^* Начальная скорость протеолитической активности 1 мкМ 0,13^* 0,04^* 0,1^* 3,3 мкМ 0,11^* 0,07^* 0,09^*

* Поглощение 405/мин.

Прогрессии расщепления хромогенным субстратом соединений 1.001, 1.002 и 14 тестировали в соответствии с анализом экстракта рогового слоя человека в Примере 4 с использованием предпочтительных хромогенных пептидных субстратов KLK5 и KLK7 (PS-01 и PS-02). Протеолитическое расщепление селективного субстрата KLK5 в экстракте кожи соединениями 1.001, 1.002 и 14 сравнивается и показано на фиг. 4А-4D. NSK относится к свежеприготовленному экстракту кожи; и OSK относится к экстракту из кожи после замораживания-оттаивания.

Как видно из фиг. 4A-4D (NSK), для соединения 1.001 скорость (наклон) начального линейного участка кривых оказывается ниже, чем для двух других соединений, что указывает на более высокое ингибирование расщепления субстрата. Наблюдаемая более низкая начальная скорость протеолитической активности для соединения 1.001 также согласуется с наблюдаемой более низкой точкой пересечения кривых. Как видно из фиг. 4A-4D (NSK), скорость расщепления субстрата экспоненциально замедляется по мере истощения субстрата. Более низкая экспоненциальная константа скорости для соединения 1.001 указывает на то, что соединение 1.001, по-видимому, обладает более сильным ингибированием протеолитической активности.

В отличие от результатов очищенного рекомбинантного KLK 5, основанных на трех параметрах (скорость, истощение субстрата и начальная скорость протеолитической активности), соединение 1.001 оказалось более сильным ингибитором протеолитической активности кожного экстракта по сравнению с известным соединением 14.

Пример 6. Хромогенный анализ

Получение лизата неонатальных эпидермальных кератиноцитов человека: Объединенные эпидермальные кератиноциты человека (HEK) были приобретены у Invitrogen (кат. № A13401). Клетки выращивали в коммерческой среде EpiLife (ThermoFisher, кат. № MEPI500CA) с добавлением коммерческой добавки S7 (ThermoFisher, кат. № SO0175) в отсутствие сыворотки. Культуру ткани проводили при 37°С во влажной камере с 5% углекислым газом. Состав буфера для лизиса HEK: 100 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1% тритон, 5 мМ EDTA, конечный рН 7,6. После двух пассажей клетки лизировали, используя буфер для лизиса НЕК без добавления ингибиторов протеазы и фосфатазы, и определяли концентрацию белка, используя анализ с бицинхониновой кислотой (BCA) (ThermoFisher, кат. № 23225).

Приготовление экстракта рогового слоя здорового человека-добровольца: Листы рогового слоя были приобретены у компании Biopredic (кат. № STR0020). Приготовление экстракта: лизат рогового слоя готовили с использованием набора Minute для экстракции общего белка для жировых тканей (InventBiotech, кат. № AT-022) после гомогенизации в соответствии с инструкциями производителя. Общую концентрацию белка определяли с помощью анализа BCA (ThermoFisher, кат. № 23225). Экстракты были мгновенно заморожены и хранились при температуре -80°С до применения.

Концентрация KLK5 в экстракте рогового слоя: Концентрацию KLK5 в экстракте рогового слоя определяли с помощью 1) ELISA от Abcam (кат. № ab131555); и 2) сравнение скорости гидролиза селективного хромогенного субстрата PS-01 (YRSR-pNA Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA) со скоростью известных концентраций очищенного KLK5 (Speed Bio). Далее концентрацию KLK5 в неизвестном образце определяли по скорости гидролиза селективного субстрата путем интерполяции из линейного графика скоростей известных образцов.

Расщепление макромолекулярных субстратов эндогенным и экзогенным калликреином 5: 10 мкг лизата HEK инкубировали с равным объемом экстракта рогового слоя или протеазы в буфере при 37°С в течение 1,5 ч. Реакции гасили кипячением в течение 5 мин при 100°C с загрузочным буфером в восстанавливающих условиях (50 мМ DTT). Белки разделяли электрофорезом на bis-tris гелях с градиентом акриламида 4-12%, который проводили в течение 22 минут при 200 В. После переноса белков на мембраны PVDF неспецифическое связывание блокировали с использованием блокирующего буфера Intercept (Licor) в течение одного часа при комнатной температуре. Сигналы на пятнах нормализовали с помощью GAPDH.

Условия для обнаружения конкретных белков приведены ниже:

Десмоглеин 1: антитело к десмоглеину sc-137164 (Santa Cruz Biochemicals) разводили 1/750 и инкубировали в течение 18 часов при 40°С. После промывания добавляли вторичное антитело против мышиных антител (Licor) после разбавления 1/20000 стокового раствора. Контроли в отсутствие KLK5 обрабатывали смесью ингибиторов протеазы/фосфатазы (Cell Signalling, #5872).

Десмоколлин 1: антитело против десмоколлина 1 (Abcam, 150382) разбавляли 1:1000. Вторичное антитело разбавляли 1:15000. После промывки добавляли вторичное антитело против антител кролика после разбавления 1:15000.

Филагрин: антифилагрин (LS-Bio, 1561) разбавляли 1:400. Вторичное антитело разбавляли 1:10000.

Результаты хромогенного анализа:

Протеазы: KLK5 (SpeedBioSystems); KLK7 (R&Dsystems) активировали энтерокиназой (2 часа, 37°С) перед анализом; трипсин (Sigma Aldrich); химотрипсин (Sigma Aldrich); Фактор Ха (Haematologic Technologies); Плазмин (Haematologic Technologies); KLK14 (R&Dsystems) активировали энтерокиназой (1 час, 37°С) перед анализом; Тромбин (Haematologic Technologies); нейтрофильная эластаза (Athens Research&Technology); и KLK1 (Prospec).

Соединение 408: продукт, полученный в результате гидролитического раскрытия 4-хиназолиноновой группы Соединения 1.001, представленный формулой:

.

Результаты анализа приведены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты хромогенного анализа соединения 1.001 и соединения 408.

Протеаза Субстрат Соед. 1.001 Соед. 408 название тестируемая
конц. название тестируемая
конц. Высшая
конц. IC₅₀ (мкМ) IC₅₀ KLK5 10 нМ S-2288 500 мкМ 10 мкМ 0,176 мкМ (n=2); 0,188 мкМ (n=2) Без
ингибирования KLK7 20 нМ CS-PSA 500 мкМ 20 мкМ 0,693 мкМ (n=2); 0,647 мкМ (n=2) Без
ингибирования Трипсин 0,1 нМ S-2288 500 мкМ 50 мкМ 1,664 мкМ (n=2); 1,363 мкМ n=2); 2,204 мкМ (n=2) Без
ингибирования Химотрипсин 0,2 нМ CS-PSA 500 мкМ 50 мкМ 0,249 мкМ (n=2); 0,317 мкМ (n=2) Без
ингибирования Фактор Xa 0,5 нМ S-2288 500 мкМ 20 мкМ 3,217 мкМ (n=2); 10,40 мкМ (n=2); 3,935 мкМ (n=2) Без
ингибирования Плазмин 1,0 нМ S-2288 500 мкМ 50 мкМ 3,357 мкМ (n=2); 4,196 мкМ (n=2) Без
ингибирования KLK14 5 нМ, 1 нМ S-2288 500 мкМ 50 мкМ 0,633 мкМ (5 нМ)^a; 0,442 мкМ (1 нМ)^b Без
ингибирования Тромбин 0,5 нМ S-2288 500 мкМ 100 мкМ >10 мкМ (n=2); >10 мкМ (n=2);
>10 мкМ (n=2) Без
ингибирования нейтрофилэластаза 0,5 нМ Субстрат эластазы 1 200 мкМ 100 мкМ >50 мкМ (n=2);
>50 мкМ (n=2) > 500 мкМ KLK1 10 нМ S-2266 200 мкМ 50 мкМ Без
ингиби-рования Без ингибирования

S-2288, S-2266 и CS-PSA были получены от Diapharma и растворены в воде в виде 10 мМ раствора; и

Субстрат 1 эластазы был от Sigma и растворен в воде в виде 0,8 мМ раствора.

а: IC₅₀ при концентрации 5 нМ KLK14; и b: IC₅₀ при концентрации 1 нМ KLK14.

Выводы: можно сделать вывод, что соединение 1.001 является ингибитором KLK5, KLK7 и химотрипсина. Напротив, соединение 408, в котором отсутствует фрагмент 4-хиназолинона (т.е. фармакофор соединения 1.001), не способно ингибировать протеазы.

Изобретение относится к соединению формулы (I), где R представляет собой водород, и его фармацевтической композиции для лечения кожного заболевания, связанного с протеолитической активностью одной или нескольких протеаз KLK. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл., 6 пр.

1. Соединение, представленное формулой (I)

(I),

или его фармацевтически приемлемый комплекс, где R представляет собой H.

2. Соединение по п. 1, представленное формулой (Ia)

(Ia),

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

3. Соединение по п. 1, представленное формулой (Ib)

(Ib),

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

4. Соединение по п. 1, представленное формулой (Ic)

(Ic),

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

5. Соединение по п. 1, представленное формулой

,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

6. Соединение по п. 1, представленное формулой

,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

7. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний кожи, связанных с протеолитической активностью одной или нескольких протеаз KLK, содержащая терапевтически эффективное количество соединения по любому из пп. 1-6 и фармацевтически приемлемый носитель.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанное соединение имеет формулу

,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

9. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанное соединение имеет формулу

,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

10. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 7-9, полученная для местного применения.

11. Способ лечения кожного заболевания, связанного с протеолитической активностью одной или нескольких протеаз KLK, у объекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному объекту эффективного количества соединения, имеющего формулу (I)

(I),

или его фармацевтически приемлемого комплекса, где R представляет собой H.

12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанное соединение имеет формулу (Ia)

(Ia),

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанное соединение имеет формулу, выбранную из группы, состоящей из:

и ,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

14. Способ по любому из пп. 11-13, отличающийся тем, что кожное заболевание представляет собой генодерматоз.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что генодерматоз представляет собой синдром Нетертона.

16. Способ по любому из пп. 11-15, отличающийся тем, что одна или несколько протеаз KLK представляют собой KLK5 и/или KLK7.

17. Способ по любому из пп. 11-16, отличающийся тем, что указанное соединение вводят местно.

18. Способ in vitro для определения протеолитической активности одной или нескольких протеаз KLK, включающий:

а) приготовление кожного экстракта;

b) экспонирование субстрата и соединения формулы (I)

(I)

или его фармацевтически приемлемого комплекса кожному экстракту; и

в) определение скорости протеолитического расщепления субстрата,

где субстрат представляет собой пептид-п-нитроанилид; и

R представляет собой H.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что субстрат представляет собой Tyr-Arg-Ser-Arg-pNA или Lys-His-Leu-Tyr-pNA.

20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанное соединение имеет формулу (Ia):

(Ia),

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

21. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанное соединение имеет формулу, выбранную из группы, состоящей из:

и ,

или его фармацевтически приемлемый комплекс.

22. Способ по п. 18, отличающийся тем, что экстракт кожи представляет собой экстракт кожи человека.