KLK5-ИНГИБИРУЮЩИЙ ПЕПТИД Российский патент 2024 года по МПК C07K16/00 C07K14/81 C07K19/00 C12N15/12 C12N15/63 G01N33/15 G01N33/53 A61K45/00 A61K48/00 A61K35/12 A61K47/65 A61P35/00 A61P25/00 A61P17/00 A61P17/06 

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к пептиду; к полинуклеотиду; к вектору; к клетке; к способу получения пептида; у пептиду, полученному таким способом; к конъюгату, содержащему пептид; к композиции, содержащей пептид или конъюгат; к фармацевтической композиции, к фармацевтической композиции для лечения или профилактики различных заболеваний; к применению пептида или конъюгата для лечения или профилактики различных заболеваний; к способу лечения различных заболеваний, включающему стадию введения пептида или конъюгата; к композиции для диагностики или выявления различных заболеваний, содержащей пептид или конъюгат, и т.п.

Предпосылки создания изобретения

[0001] Калликреин 5 (KLK5) представляет собой сериновую трипсиноподобную протеазу (группы PA, семейства S1), которую также называют триптическим ферментом рогового слоя эпидермиса (SCTE). Калликреин 7 (KLK7) представляет собой химотрипсиноподобную протеазу (группы PA, семейства S1) и также называется химотриптическим ферментом рогового слоя эпидермиса (SCCE). Кроме того, калликреин 14 (KLK14) представляет собой трипсиноподобную протеазу (группы PA, семейства S1). KLK5, KLK7 и KLK14 принадлежат к семейству тканевых калликреинов, состоящему из 15 типов в высокой степени консервативных трипсино- или химотрипсиноподобных сериновых протеаз. KLK5 экспрессируется в клетках, а затем превращается в активный KLK5 посредством аутоактивации, тогда как KLK7 и KLK14 экспрессируются как неактивные препроферменты и превращаются в активные формы посредством расщепления их препропоследовательностей протеазами, представленными KLK5 (Непатентный документ 1). Экспрессия KLK5 наблюдалась в коже, и сообщалось, что она разлагает факторы, ассоциированные с адгезией клеток, такие как десмоглеин и десмоколлин (Непатентный документ 2). KLK5, KLK7 и KLK14 играют важную роль в шелушении кожи, а также участвуют в активации рецептора 2, активируемого протеиназой (PAR-2) (Непатентный документ 3). Активация PAR-2 индуцирует цитокины и хемокины и усиливает иммунитет, воспалительные реакции и т.п.

[0003] Синдром Нетертона является одним из синдромов ихтиоза с тяжелым воспалением кожи, шелушением, ломкими волосами и аллергическими симптомами, такими как астма и аллергический дерматит, наследуемыми по аутосомно-рецессивному типу, и является редким заболеванием (OMIM256500) (Непатентный документ 4). Поскольку эксфолиативный дерматит развивается с момента рождения, то обезвоживание, инфекция или т.п. могут быть вызваны значительным повреждением барьерной функции кожи и могут сопровождаться задержкой развития. Хотя полные эпидемиологические данные пока отсутствуют, однако, известно, что в этих случаях наблюдается высокая послеродовая смертность. Синдром Нетертона развивается из-за потери функции ингибитора сериновой протеазы (LEKTI) в результате мутации гена (SPINK5), кодирующего LEKTI, экспрессируемый в эпителиальных клетках кожи. LEKTI состоит из 15 Kazal-подобных доменов-ингибиторов. У пациентов с синдромом Нетертона, в SPINK5 было обнаружено множество сайтов мутации в последовательностях, кодирующих каждый домен, а симптомы и тяжесть заболевания изменяются в зависимости от сайтов мутаций (Непатентные документы 4 и 5).

[0004] У мышей с дефицитом SPINK5 (Spink5^-/-) наблюдаются кожные симптомы, подобные синдрому Нетертона, а в эпителии кожи наблюдается высокая протеазная активность KLK5 и KLK7 (Непатентный документ 1). Хотя мыши с дефицитом SPINK5 погибают в течение нескольких часов после рождения, однако, имеются сообщения о снижении неонатальной смертности у мышей (Spink5^-/-Klk5^-/-), полученных путем скрещивания KLK5-дефицитных мышей с SPINK5-дефицитными мышами (Непатентный документ 6). Кроме того, у Spink5^-/-Klk5^-/--мышей наблюдалось исчезновение серьезных дефектов кожного барьера, структурных дефектов эпителия, воспаления кожи и т.п., наблюдаемых у Spink5^-/--мышей. Аналогичным образом, у мышей с мутацией SPINK5 Spink5^A135X/A135X, наблюдаемой у пациентов с синдромом Нетертона, имелись кожные симптомы, подобные синдрому Нетертона, и смерть наступала в течение 12 часов после рождения, тогда у мышей Klk5^-/-Spink5^A135X/A135X, полученных путем скрещивания с KLK5-дефицитными мышами, наблюдалось улучшение функции кожного барьера и снижение тяжести кожных симптомов (Непатентный документ 7). Кроме того, аномальные кожные симптомы отсутствовали у мышей, скрещиваемых с KLK7-дефицитными мышами (Klk5^-/-Klk7^-/-Spink5^A135X/A135X). Сообщалось, что у мышей, трансгенных по KLK5, также наблюдались кожные симптомы, подобные синдрому Нетертона (Непатентный документ 8). Высокая протеазная активность ферментов, таких как трипсин и химотрипсин, наблюдалась в роговом слое эпидермиса пациентов с синдромом Нетертона и у мышей с моделью синдрома Нетертона, и было высказано предположение, что семейство калликреинов, расположенных ниже, таких как KLK7 и KLK14, помимо KLK5, ассоциируется с протеазной активностью в роговом слое эпидермиса. Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод, что синдром Нетертона вызывается мутацией гена SPINK5 и развивается с аномально повышенной протеазной активностью KLK5, KLK7 или KLK14 в роговице. В настоящее время не существует основного терапевтического средства, а применяется лишь симптоматическое лечение, такое как использование увлажнителей.

[0005] Также предполагается, что KLK5 ассоциируется с розацеей, которая представляет собой хроническое воспалительное заболевание кожи лица. Сообщалось, что у пациентов с розацеей наблюдались повышенные уровни экспрессии KLK5, а поэтому им необходимо вводить антимикробный пептид кателицидин. Хотя точная этиология этого заболевания неизвестна, однако, считается, что повышенный уровень экспрессии KLK5 вызывает разложение кателицидина, что тем самым приводит к продуцированию пептида, вызывающего розацею (Непатентный документ 9).

[0006] Имеется несколько сообщений о том, что полиморфизм SPINK5 ассоциируется с тяжестью атопического дерматита (Непатентные документы 10-14). Сообщалось, что в коже пациентов с атопическим дерматитом, имеющих гены SPINK5, кодирующие LEKTI, где аминокислотный остаток 420 представляет собой лизин в обоих аллелях, экспрессия десмоглеина 1 снижается на уровне белка, а активность протеаз, включая KLK5 и KLK7, увеличивается по сравнению со случаем, когда глутаминовая кислота кодируется в обоих аллелях (Непатентный документ 15). Считается, что активация этих протеаз облегчает проникновение аллергенов из-за снижения барьерной функции кожи и создает условия, при которых легко возникает воспалительная реакция.

[0007] SPINK2 (ингибитор сериновой протеазы Kazal-типа 2) состоит из Kazal-подобного домена с тремя дисульфидными связями и функционирует как ингибитор трипсина/акрозина (Непатентный документ 16), но взаимосвязь SPINK2 и его мутантов с такими заболеваниями, как синдром Нетертона, розацея и атопический дерматит, пока не выяснена.

Список цитируемых документов

[0008] Непатентные документы:

Непатентный документ 1: Ovaere P, et al., опубликованный в 2009, Trends Biochem Sci., Vol. 34, No. 9: pp. 453-463

Непатентный документ 2: Descargues P, et al., опубликованный в 2005, Nat Genet., Vol. 37, No. 1: pp. 56-65

Непатентный документ 3: Rattenholl A, et al., опубликованный в 2008, Drug News Perspect., Vol. 21, No. 7: pp. 369-381

Непатентный документ 4: Hovnanian A., опубликованный в 2013, Cell Tissue Res., Vol. 351, No. 2: pp. 289-300

Непатентный документ 5: Sarri CA, et al., опубликованный в 2017, Mol Diagn Ther., Vol. 21, No. 2: pp. 137-152

Непатентный документ 6: Furio L, et al., опубликованный в 2015, PLoS Genet., Vol. 11, No. 9: e1005389

Непатентный документ 7: Kasparek P, et al., опубликованный в 2017, PLoS Genet., Vol. 13, No. 1: e1006566

Non Patent Literature 8: Furio L, et al., опубликованный в 2014, J Exp Med., Vol. 211, No. 3: pp. 499-513

Непатентный документ 9: Yamasaki K, et al., опубликованный в 2007, Nat Med., Vol. 13, No. 8: pp. 975-980

Непатентный документ 10: Nishio Y, et al., опубликованный в 2003, Genes Immun., Vol. 4, No. 7: pp. 515-517

Непатентный документ 11: Kusunoki T, et al., опубликованный в 2005, J Allergy Clin Immunol., Vol. 4, No. 7: pp. 515-517

Непатентный документ 12: Lan CC, et al., опубликованный в 2011, Exp Dermatol., Vol. 20, No. 12: pp. 975-979

Непатентный документ 13: Kato A, et al., опубликованный в 2003, Br J Dermatol., Vol. 148, No. 4: pp. 665-669

Непатентный документ 14: Zhao LP, et al., опубликованный в 2012, J Eur Acad Dermatol Venereol., Vol. 26, No. 5: pp. 572-577

Непатентный документ 15: Fortugno P, et al., опубликованный в 2012, Hum Mol Genet., Vol. 21, No. 19: pp. 4187-4200

Непатентный документ 16: Chen T, et al., опубликованный в 2009, Proteins., Vol. 77, No. 1: pp. 209-219.

Сущность изобретения

Техническая проблема

[0009] Целью настоящего изобретения является получение нового пептида, ингибирующего KLK5; конъюгата, содержащего пептид; фармацевтической композиции, содержащей пептид или конъюгат, и т.п.

Решение проблемы

[0010] Настоящее изобретение включает:

(1) Мутантный пептид SPINK2, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61 (фигура 69) и ингибирует протеазную активность активного человеческого KLK5;

(2) Пептид согласно (1), где указанный пептид ингибирует протеазную активность человеческого KLK7 или человеческого KLK14;

(3) Пептид согласно (1), где указанный пептид селективно ингибирует человеческий KLK5 и необязательно человеческий KLK7 или KLK14;

(4) Пептид согласно любому из (1)-(3), где Xaa16 (X₁) представляет собой Ala, Asp, Gly, Gln, Leu, Ser или Thr;

(5) Пептид согласно любому из (1)-(4), где Xaa17 (X₂) представляет собой Arg, Glu, Asn, Gln или Ser;

(6) Пептид согласно любому из (1)-(5), где Xaa18 (X₃) представляет собой Asp, Gln, Ile, Thr, Trp или Tyr;

(7) Пептид согласно любому из (1)-(6), где Xaa19 (X₄) представляет собой Arg, Gly, Met, Gln или Thr;

(8) Пептид согласно любому из (1)-(7), где Xaa20 (X₅) представляет собой Asp, Glu, Leu, Lys, Thr или Tyr;

(9) Пептид согласно любому из (1)-(8), где Xaa21 (X₆) представляет собой Glu, Gly, His, Leu, Ser, Gln или Tyr;

(10) Пептид согласно любому из (1)-(9), где Xaa22 (X₇) представляет собой Asp, Gly, Gln, Ser или Tyr;

(11) Пептид согласно любому из (1)-(10), где Xaa24 (X₈) представляет собой Ala, Asp, Glu, Gly, Asn, Ser или Thr;

(12) Пептид согласно любому из (1)-(11), где Xaa25 (X₉) представляет собой Arg или Lys;

(13) Пептид согласно любому из (1)-(12), где Xaa26 (X₁₀) представляет собой Asp, Glu, Gln, Ser или Val;

(14) Пептид согласно любому из (1)-(13), где Xaa27 (X₁₁) представляет собой Phe или Tyr;

(15) Пептид согласно любому из (1)-(14), где Xaa28 (X₁₂) представляет собой Asp или Glu;

(16) Пептид согласно любому из (1)-(15), где пептид содержит аминокислоты в положениях 1-63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NN: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 (фигуры 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28);

(17) Пептид согласно любому из (1)-(3), где Xaa16 (X₁) представляет собой Gly, Met или Tyr;

(18) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17), где Xaa17 (X₂) представляет собой Glu, Gln или Thr;

(19) Пептид согласно любому из (1)-(3), (17) и (18), где Xaa18 (X₃) представляет собой His, Met или Tyr;

(20) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(19), где Xaa19 (X₄) представляет собой Ala, Arg, Lys или Gln;

(21) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(20), где Xaa20 (X₅) представляет собой Gly, Arg или Ser;

(22) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(21), где Xaa21 (X₆) представляет собой Arg, Lys, Gln или Ser;

(23) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(22), где Xaa22 (X₇) представляет собой Gly;

(24) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(23), где Xaa24 (X₈) представляет собой His, Thr или Tyr;

(25) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(24), где Xaa25 (X₉) представляет собой His или Tyr;

(26) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(25), где Xaa26 (X₁₀) представляет собой Asp, Glu или His;

(27) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(26), где Xaa27 (X₁₁) представляет собой Tyr;

(28) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(27), где Xaa28 (X₁₂) представляет собой Asp или Glu;

(29) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (17)-(28), где пептид содержит аминокислоты в положениях 1-63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NN: 22, 24, 26 и 28 (фигуры 30, 32, 34, и 36);

(30) Пептид согласно любому из (1)-(3), где Xaa16 (X₁) представляет собой Gly, Ser или Tyr;

(31) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30), где Xaa17 (X2) представляет собой Asp или Gln;

(32) Пептид согласно любому из (1)-(3), (30), и (31), где Xaa18 (X₃) представляет собой Thr или Val;

(33) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(32), где Xaa19 (X₄) представляет собой Thr или Val;

(34) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(33), где Xaa20 (X₅) представляет собой Glu или Thr;

(35) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(34), где Xaa21 (X₆) представляет собой His или Thr;

(36) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(35), где Xaa22 (X₇) представляет собой Tyr;

(37) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(36), где Xaa24 (X₈) представляет собой Asn или Ser;

(38) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(37), где Xaa25 (X₉) представляет собой Arg;

(39) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(38), где Xaa26 (X₁₀) представляет собой Asp или Glu;

(40) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(39), где Xaa27 (X₁₁) представляет собой Tyr;

(41) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(40), где Xaa28 (X₁₂) представляет собой Asp;

(42) Пептид согласно любому из (1)-(3) и (30)-(41), где пептид содержит аминокислоты в положениях с 1 по 63 в аминокислотной последовательности, указанной в любой из SEQ ID NN: 30 и 32 (фигуры 38 и 40);

(43) Пептид согласно любому из (1)-(42), где пептид имеет три дисульфидные связи и трехмерную структуру, характеризующуюся включением петлевой структуры, α-спирали и β-складки;

(44) Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность пептида согласно любому из (1)-(43);

(45) Вектор, содержащий полинуклеотид согласно (44);

(46) Клетка, которая содержит полинуклеотид согласно (44) или вектор согласно (45) или продуцирует пептид согласно любому из (1)-(43);

(47) Способ получения мутантного пептида SPINK2, включающий нижеследующие стадии (i) и (ii): (i) культивирование клетки согласно (46); и (ii) сбор мутантного пептида SPINK2 из культуры;

(48) Способ получения пептида согласно любому из (1)-(43), включающий стадию получения пептида путем химического синтеза или трансляции in vitro;

(49) мутантный пептид SPINK2, полученный способом согласно (47) или (48);

(50) Конъюгат, содержащий пептид согласно любому из (1)-(43) и (49), где пептид связан с одним и, необязательно, более чем с одним фрагментом;

(51) Конъюгат по п. (50), где один или более необязательных фрагментов включают второй пептид, который не является мутантом SPINK2;

(52) Конъюгат согласно (51), где второй пептид расположен на аминоконцевой стороне мутанта SPINK2;

(53) Конъюгат согласно (51), где второй пептид расположен на карбокси-концевой стороне мутанта SPINK2;

(54) Конъюгат согласно любому из (51)-(53), где второй пептид представляет собой антитело или его фрагмент и содержит одну или более областей Fc;

(55) Конъюгат согласно (54), где одна или каждая область Fc представляет собой область Fc человеческого иммуноглобулина или его фрагмента;

(56) Конъюгат согласно (54) или (55), где одна или каждая область Fc представляет собой область Fc IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и/или IgE или их фрагмента;

(57) Конъюгат согласно любому из (54)-(56), где одна или каждая область Fc представляет собой область Fc человеческого IgG1 или его фрагмента;

(58) Конъюгат по п. (57), где одна или каждая область Fc IgG1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 87 (фигура 95);

(59) Конъюгат согласно любому из (54)-(57), где одна или каждая область Fc представляет собой область Fc дикого типа или мутантную область Fc;

(60) Конъюгат согласно любому из (51)-(59), где конъюгат содержит от одной до нескольких аспарагиновых кислот и/или глутаминовых кислот, добавленных к его амино-концу;

(61) Конъюгат согласно любому из (50)-(60), где конъюгат содержит аминокислотную последовательность, описанную в (i) или (ii) ниже: (i) аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 и 96 (Фигуры 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 и 106); или (ii) аминокислотную последовательность конъюгата, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, описанной выше в (i), и ингибирует протеазную активность KLK5;

(62) Конъюгат согласно любому из (51)-(61), где мутант SPINK2 и второй пептид связаны друг с другом посредством линкера;

(63) Конъюгат по п. (62), где линкер представляет собой третий пептид, который не является мутантом SPINK2 или вторым пептидом;

(64) Способ получения конъюгата согласно любому из (50)-(63), включающий описанные ниже стадии (i) и (ii): (i) культивирование клетки, включающей полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность конъюгата, или вектор, в который встроен полинуклеотид; и (ii) сбор конъюгата мутантного пептида SPINK2 или пептидного фрагмента, содержащегося в конъюгате, из культуры;

(65) Способ получения конъюгата мутантного пептида SPINK2 согласно любому из (50)-(63), включающий стадию получения конъюгата или пептидного фрагмента, содержащегося в конъюгате, путем химического синтеза или трансляции in vitro;

(66) Конъюгат мутантного пептида SPINK2, полученный способом согласно (64) или (65);

(67) Антитело или его связывающий фрагмент, который связывается с пептидом согласно любому из (1)-(43) и (49);

(68) Композицию, содержащую пептид согласно любому из (1)-(43) и (49); полинуклеотид согласно (44); вектор согласно (45), клетку согласно (46); конъюгат согласно любому из (50)-(63) и (66); и/или антитело или его связывающий фрагмент согласно (67);

(69) Фармацевтическую композицию, содержащую пептид согласно любому из (1)-(43) и (49), полинуклеотид согласно (44), вектор согласно (45), клетку согласно (46), и/или конъюгат согласно любому из (50)-(63) и (66);

(70) Фармацевтическую композицию согласно (69) для лечения или профилактики заболевания, ассоциированного с KLK5;

(71) Фармацевтическую композицию согласно (70), где заболевание, ассоциированное с KLK5, представляет собой синдром Нетертона, атопический дерматит, розацею, УФ-индуцированное повреждение кожи, псориаз, астму, повреждение спинного мозга, рак или эзофагит Барретта;

(72) Фармацевтическую композицию согласно любому из (69)-(71) для использования в комбинации с дополнительным фармацевтическим продуктом;

(73) Композицию для тестирования или диагностики, содержащую пептид согласно любому из (1)-(43) и (49), полинуклеотид согласно (44), вектор согласно (45), клетку согласно (46), конъюгат согласно любому из (50)-(63) и (66), и/или антитело или его связывающий фрагмент согласно (67);

(74) Способ согласно любому из (47), (48), (64) и (65), включающий стадию проведения аффинной очистки с использованием антитела или его связывающего фрагмента согласно (67);

(75) Способ идентификации мутантного пептида SPINK2, ингибирующего KLK5, включающий нижеследующие стадии (i)-(iii): (i) инкубирование протеазы KLK5 и субстрата в присутствии и в отсутствии тестируемого мутантного пептида SPINK2; (ii) определение протеазной активности KLK5 в присутствии и в отсутствии тестируемого мутантного пептида SPINK2; и (iii) определение пептида как позитивного, если протеазная активность KLK5 в присутствии пептида ниже, чем протеазная активность KLK5 в отсутствии пептида;

(76) Способ идентификации KLK5-ингибирующего соединения, включающий описанные ниже стадии (i)-(iii), с использованием пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 и 32 (фигуры 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 и 40), или конъюгата, содержащего пептид в качестве эталонного соединения: (i) инкубирования протеазы KLK5 и субстрата в присутствии и в отсутствии тестируемого соединения; (ii) оценки протеазной активности KLK5 в присутствии и в отсутствии тестируемого соединения; и (iii) определения тестируемого соединения как позитивного, если протеазная активность KLK5 в присутствии тестируемого соединения ниже, чем протеазная активность KLK5 в отсутствии тестируемого соединения;

(77) Способ идентификации KLK5-ингибирующего соединения, включающий описанные ниже стадии (i)-(iii): (i) оценки активности ингибирования протеазы KLK5 с использованием тестируемого соединения; (ii) оценки активности ингибирования протеазы KLK5 с использованием эталонного соединения, которое представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 и 32 (Фигуры 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 и 40), или конъюгат, содержащий этот пептид; и (iii) оценки тестируемого соединения как позитивного, если активность ингибирования протеазы KLK5 под действием тестируемого соединения эквивалентна или выше, чем активность ингибирования протеазы KLK5 под действием эталонного соединения;

(78) Способ оценки активности протеазы KLK5, включающий описанные ниже стадии (i) и (ii), с использованием пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 и 32 (фигуры 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 и 40) или конъюгата, содержащего пептид в качестве эталонного соединения: (i) инкубирования протеазы KLK5 с субстратом и, необязательно, с другим компонентом; и (ii) измерения количества субстрата и/или количества продукта после стадии (i);

(79) KLK5-ингибирующий мутантный пептид SPINK2 или конъюгат мутантного пептида SPINK2, имеющий константу диссоциации (K_D) 1 × 10^-9 М или менее, измеренную с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса путем иммобилизации пептида или конъюгата и добавления к нему KLK5;

(80) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34 (фигура 42);

(81) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36 (фигура 44);

(82) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38 (Фигура 46);

(83) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40 (Фигура 48);

(84) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42 (фигура 50);

(85) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 44 (фигура 52);

(86) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46 (фигура 54);

(87) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48 (Фигура 56);

(88) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50 (фигура 58);

(89) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52 (фигура 60);

(90) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54 (фигура 62);

(91) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56 (Фигура 64);

(92) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58 (Фигура 66);

(93) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60 (фигура 68); и

(94) Конъюгат, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 96 (Фигура 106).

Предпочтительноые эффекты изобретения

[0011] Пептид, полученный в соответствии с настоящим изобретением; конъюгат, содержащий этот пептид, и фармацевтическая композиция, содержащая указанный пептид или конъюгат, обладают KLK5-ингибирующей активностью и являются подходящими для лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с KLK5 (которые будут описаны ниже).

Краткое описание чертежей

[0012] [Фигура 1] Фигура 1 включает изображения для выявления сходства аминокислотных последовательностей человеческих KLK5, KLK7 и KLK14.

[Фигура 2] Фигура 2 включает графики, иллюстрирующие KLK5-ингибирующую активность (50% ингибирующую концентрацию: IC₅₀) каждого пептида, ингибирующего KLK5, по скорости разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки KLK5-ингибирующей активности использовали KLK5 с конечной концентрацией 10 нМ и Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 3A] Фигура 3A включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования бычьего трипсина использовали трипсин (Pierce, 20233) в конечной концентрации 5 нМ и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческого трипсина использовали трипсин (Sigma-Aldrich Co. LLC, T6424) в конечной концентрации 1 нМ и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования бычьего α-химотрипсина использовали химотрипсин (Worthington Biochemical Corporation, LS001434) в конечной концентрации 10 нМ и пептидный субстрат Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 3B] Фигура 3B включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого ингибирующего пептида с протеазами по разложению пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого химотрипсина использовали химотрипсин (Sigma-Aldrich Co. LLC, C8946) в конечной концентрации 10 нМ и пептидный субстрат Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v) в конечной концентрации 10 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческой триптазы использовали триптазу (Sigma-Aldrich Co. LLC, T7063) в конечной концентрации 1 нМ и пептидный субстрат Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3107-v) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческой химазы использовали химазу (Sigma-Aldrich Co. LLC, C8118) в конечной концентрации 100 нМ и пептидный субстрат Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 3C] Фигура 3C включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого плазмина использовали плазмин (Sigma-Aldrich Co. LLC, P1867) в конечной концентрации 50 нМ и пептидный субстрат Boc-Val-Leu-Lys-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3104-v) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческого тромбина использовали тромбин (Sigma-Aldrich Co. LLC, T6884) в конечной концентрации 1 нМ и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования эластазы человеческих нейтрофилов использовали эластазу нейтрофилов (Enzo Life Sciences, BML-SE284) в конечной концентрации 0,00001 ед./мкл и пептидный субстрат Suc (OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3153-v) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 3D]. Фигура 3D включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческой матриптазы использовали матриптазу (R&D Systems, Inc., 3946-SE) в конечной концентрации 1 нМ и пептидный субстрат Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES014) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческого белка C использовали белок C (Sigma-Aldrich Co. LLC, P2200) в конечной концентрации 100 нМ и пептидный субстрат Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3112-v) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческого tPA использовали tPA (Sigma-Aldrich Co. LLC, T0831) в конечной концентрации 10 нМ и пептидный субстрат Pyr-Gly-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3145-v) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 3E] Фигура 3E включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого uPA использовали uPA (Sigma-Aldrich Co. LLC, U0633) в конечной концентрации 2 нМ и пептидный субстрат Pyr-Gly-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3145-v) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования калликреина в человеческой плазме использовали калликреин плазмы (R&D Systems, Inc., 2497-SE) в конечной концентрации 0,125 мкг/мл и пептидный субстрат Z-Phe-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3095-v) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 3F] Фигура 3F включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK1 использовали hKLK1 (R&D Systems, Inc., 2337-SE) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл и пептидный субстрат Pro-Phe-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3096-v) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK2 использовали hKLK2 (R&D Systems, Inc., 4104-SE) в конечной концентрации 2 мкг/мл и пептидный субстрат Pro-Phe-Arg-MCA (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3096-v) в конечной концентрации 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK4 использовали hKLK4 (R&D Systems, Inc., 1719-SE) в конечной концентрации 1 мкг/мл и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 3G] Фигура 3G включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK7 использовали hKLK7 в конечной концентрации 1 мкг/мл и пептидный субстрат Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH2 (R&D Systems, Inc., ES002) в конечной концентрации 20 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK8 использовали hKLK8 (UniProt: O60259, полученный авторами изобретения) в конечной концентрации 5 нМ и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации была 100 мкМ. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK12 использовали hKLK12 (R&D Systems, Inc., 3095-SE) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 3H] Фигура 3H включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK13 использовали hKLK13 (R&D Systems, Inc., 2625-SE) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ и флуоресцентный сигнал с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK14 использовали hKLK14 в конечной концентрации 0,2 мкг/мл и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 4] Фигура 4 представляет собой вид, изображающий комплекс KLK5/пептид, ингибирующий KLK5, полученный с помощью рентгеноструктурного анализа. Ингибирующий пептид K51034 связан с областью, содержащей активный центр KLK5.

[Фигура 5] Фигура 5 включает графики, иллюстрирующие KLK5-ингибирующую активность (IC₅₀) каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования KLK5 использовали KLK5 в конечной концентрации 10 нМ и Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 6A] Фигура 6A включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активностей ингибирования бычьего трипсина, человеческого трипсина и бычьего α-химотрипсина использовали те же условия, которые описаны на фигуре 3A.

[Фигура 6B] Фигура 6B включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого химотрипсина, человеческой триптазы и человеческой химазы использовали те же условия, которые описаны на фигуре 3B.

[Фигура 6C] Фигура 6C включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого плазмина, человеческого тромбина и эластазы человеческих нейтрофилов использовали те же условия, которые описаны на фигуре 3C.

[Фигура 6D] Фигура 6D включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческой матриптазы, человеческого белка С и человеческого tPA использовали те же условия, которые описаны на фигуре 3D.

[Фигура 6E] Фигура 6E включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого uPA и калликреина человеческой плазмы использовали те же условия, которые описаны на фигуре 3E.

[Фигура 6F] Фигура 6F включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK1, человеческого KLK2 и человеческого KLK4 использовали те же условия, которые описаны на фигуре 3F.

[Фигура 6G] Фигура 6G включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK7, человеческого KLK8 и человеческого KLK12 использовали те же условия, которые описаны на фигуре 3G.

[Фигура 6H] Фигура 6H включает графики для оценки перекрестной реактивности каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида с протеазами по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования человеческого KLK13 и человеческого KLK14 использовали те же условия, которые описаны на фигуре 3H.

[Фигура 7] Фигура 7 представляет собой график, иллюстрирующие группу, которой вводили Fc-гибрид KLK5-ингибирующего пептида, который подавляет трансэпидермальную потерю воды (TEWL) у мышей с моделью Crusty2. При гетеромутации (+/-) SPINK5, воспаление кожи не развивалось, но при гомомутации (+/+) SPINK5 развивалось сильное кожное воспаление, которое приводило к увеличению TEWL. Введение Fc-гибрида пептидла мышам Crusty2 с гомомутацией (+/+) SPINK5 приводило к ослаблению дерматита и к снижению TEWL. Число мышей Crusty2 (+/-) составляло 9, а число мышей Crusty2 (+/+) составляло 12 в каждой группе, которой вводили PBS, и в группе, которой вводили D1-K50055-Fc. Величины ошибок на этой фигуре представляют собой стандартные ошибки.

[Фигура 8] На Фигуре 8 представлены изображения для сравнения идентичностей последовательностей в человеческом SPINK2, D8 и D9 человеческого SPINK5 и человеческого SPINK9. Известно, что D8 и D9 человеческого SPINK5 и человеческого SPINK9 обладают активностью ингибирования человеческого KLK5, и очевидно, что идентичность аминокислотной последовательности с человеческим SPINK2, для которого отсутствует информация об активности ингибирования человеческого KLK5, во всех случаях является небольшой.

[Фигура 9] На фигуре 9 представлена аминокислотная последовательность человеческого SPINK2 (SEQ ID NO: 1).

[Фигура 10] На фигуре 10 представлена аминокислотная последовательность человеческого KLK5 (SEQ ID NO: 2).

[Фигура 11] На фигуре 11 представлена аминокислотная последовательность человеческого KLK7 (SEQ ID NO: 3).

[Фигура 12] На фигуре 12 представлена аминокислотная последовательность человеческого KLK14 (SEQ ID NO: 4).

[Фигура 13] На фигуре 13 представлена нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50032 (SEQ ID NO: 5).

[Фигура 14] На фигуре 14 представлена аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50032 (SEQ ID NO: 6).

[Фигура 15] На фигуре 15 представлена нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50055 (SEQ ID NO: 7).

[Фигура 16] На фигуре 16 представлена аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50055 (SEQ ID NO: 8).

[Фигура 17] На фигуре 17 представлена нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51072 (SEQ ID NO: 9).

[Фигура 18] На фигуре 18 представлена аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51072 (SEQ ID NO: 10).

[Фигура 19] На фигуре 19 представлена нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50016 (SEQ ID NO: 11).

[Фигура 20] На фигуре 20 представлена аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50016 (SEQ ID NO: 12).

[Фигура 21] На фигуре 21 представлена нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51034 (SEQ ID NO: 13).

[Фигура 22] На фигуре 22 представлена аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51034 (SEQ ID NO: 14).

[Фигура 23] На фигуре 23 представлена нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50062 (SEQ ID NO: 15).

[Фигура 24] На фигуре 24 представлена аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50062 (SEQ ID NO: 16).

[Фигура 25] На фигуре 25 представлена нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51090 (SEQ ID NO: 17).

[Фигура 26] На фигуре 26 представлена аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51090 (SEQ ID NO: 18).

[Фигура 27] На фигуре 27 представлена нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50098 (SEQ ID NO: 19).

[Фигура 28] На фигуре 28 представлена аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50098 (SEQ ID NO: 20).

[Фигура 29] На фигуре 29 представлена нуклеотидная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51028 (SEQ ID NO: 21).

[Фигура 30] На фигуре 30 представлена аминокислотная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51028 (SEQ ID NO: 22).

[Фигура 31] На фигуре 31 представлена нуклеотидная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51005 (SEQ ID NO: 23).

[Фигура 32] На фигуре 32 представлена аминокислотная последовательность ингибирующего пептида KLK5/KLK7 K51005 (SEQ ID NO: 24).

[Фигура 33] На фигуре 33 представлена нуклеотидная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K50031 (SEQ ID NO: 25).

[Фигура 34] На фигуре 34 представлена аминокислотная последовательность ингибирующего пептида KLK5/KLK7 K50031 (SEQ ID NO: 26).

[Фигура 35] На фигуре 35 представлена нуклеотидная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51057 (SEQ ID NO: 27).

[Фигура 36] На фигуре 36 представлена аминокислотная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51057 (SEQ ID NO: 28).

[Фигура 37] На фигуре 37 представлена нуклеотидная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида K51069 (SEQ ID NO: 29).

[Фигура 38] На фигуре 38 представлена аминокислотная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида K51069 (SEQ ID NO: 30).

[Фигура 39] На фигуре 39 представлена нуклеотидная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида K50015 (SEQ ID NO: 31).

[Фигура 40] На фигуре 40 представлена аминокислотная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида K50015 (SEQ ID NO: 32).

[Фигура 41] На фигуре 41 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50032dN-Fc (SEQ ID NO: 33).

[Фигура 42] На фигуре 42 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50032dN-Fc (SEQ ID NO: 34).

[Фигура 43] На фигуре 43 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50055-Fc (SEQ ID NO: 35).

[Фигура 44] На фигуре 44 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50055-Fc (SEQ ID NO: 36).

[Фигура 45] На фигуре 45 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51072-Fc (SEQ ID NO: 37).

[Фигура 46] На фигуре 46 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51072-Fc (SEQ ID NO: 38).

[Фигура 47] На фигуре 47 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50016dN-Fc (SEQ ID NO: 39).

[Фигура 48] На фигуре 48 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50016dN-Fc (SEQ ID NO: 40).

[Фигура 49] На фигуре 49 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51034-Fc (SEQ ID NO: 41).

[Фигура 50] На фигуре 50 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51034-Fc (SEQ ID NO: 42).

[Фигура 51] На фигуре 51 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50062-Fc (SEQ ID NO: 43).

[Фигура 52] На фигуре 52 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50062-Fc (SEQ ID NO: 44).

[Фигура 53] На фигуре 53 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51090-Fc (SEQ ID NO: 45).

[Фигура 54] На фигуре 54 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51090-Fc (SEQ ID NO: 46).

[Фигура 55] На фигуре 55 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50098dN-Fc (SEQ ID NO: 47).

[Фигура 56] На фигуре 56 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50098dN-Fc (SEQ ID NO: 48).

[Фигура 57] На фигуре 57 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51028-Fc (SEQ ID NO: 49).

[Фигура 58] На фигуре 58 представлена аминокислотная последовательность ингибирующего KLK5/KLK7 пептида, слитого с Fc, D3-K51028-Fc (SEQ ID NO: 50).

[Фигура 59] На фигуре 59 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51005-Fc (SEQ ID NO: 51).

[Фигура 60] На фигуре 60 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51005-Fc (SEQ ID NO: 52).

[Фигура 61] На фигуре 61 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K50031-Fc (SEQ ID NO: 53).

[Фигура 62] На фигуре 62 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K50031-Fc (SEQ ID NO: 54).

[Фигура 63] На фигуре 63 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51057-Fc (SEQ ID NO: 55).

[Фигура 64] На фигуре 64 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51057-Fc (SEQ ID NO: 56).

[Фигура 65] На фигуре 65 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK14-ингибирующего пептида D3-K51069dN-Fc (SEQ ID NO: 57).

[Фигура 66] На фигуре 66 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK14-ингибирующего пептида D3-K51069dN-Fc (SEQ ID NO: 58).

[Фигура 67] На фигуре 67 представлена нуклеотидная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида D3-K50015-Fc (SEQ ID NO: 59).

[Фигура 68] На фигуре 68 представлена аминокислотная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида D3-K50015-Fc (SEQ ID NO: 60).

[Фигура 69] На фигуре 69 представлена формула мутантного пептида SPINK2 (SEQ ID NO: 61).

[Фигура 70] На фигуре 70 представлена нуклеотидная последовательность праймера 1 (SEQ ID NO: 62).

[Фигура 71] На фигуре 71 представлена нуклеотидная последовательность праймера 2 (SEQ ID NO: 63).

[Фигура 72] На фигуре 72 представлена нуклеотидная последовательность праймера 3 (SEQ ID NO: 64).

[Фигура 73] На фигуре 73 представлена нуклеотидная последовательность праймера 4 (SEQ ID NO: 65).

[Фигура 74] На фигуре 74 представлена нуклеотидная последовательность праймера 5 (SEQ ID NO: 66).

[Фигура 75] На фигуре 75 представлена нуклеотидная последовательность праймера 6 (SEQ ID NO: 67).

[Фигура 76] На фигуре 76 представлена нуклеотидная последовательность праймера 7 (SEQ ID NO: 68).

[Фигура 77] На фигуре 77 представлена нуклеотидная последовательность праймера 8 (SEQ ID NO: 69).

[Фигура 78] На фигуре 78 представлена нуклеотидная последовательность праймера 9 (SEQ ID NO: 70).

[Фигура 79] На фигуре 79 представлена нуклеотидная последовательность праймера 10 (SEQ ID NO: 71).

[Фигура 80] На фигуре 80 представлена нуклеотидная последовательность праймера 11 (SEQ ID NO: 72).

[Фигура 81] На фигуре 81 представлена нуклеотидная последовательность праймера 12 (SEQ ID NO: 73).

[Фигура 82] На фигуре 82 представлена нуклеотидная последовательность праймера 13 (SEQ ID NO: 74).

[Фигура 83] На фигуре 83 представлена нуклеотидная последовательность праймера 14 (SEQ ID NO: 75).

[Фигура 84] На фигуре 84 представлена нуклеотидная последовательность праймера 15 (SEQ ID NO: 76).

[Фигура 85] На фигуре 85 представлен пептидный субстрат KLK7 (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 77).

[Фигура 86] На фигуре 86 представлен пептидный субстрат бычьего α-химотрипсина (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 78).

[Фигура 87] На фигуре 87 представлен пептидный субстрат эластазы нейтрофилов (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 79).

[Фигура 88] На фигуре 88 представлен пептидный субстрат человеческого белка С (аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 80).

[Фигура 89] На фигуре 89 представлена нуклеотидная последовательность праймера 16 (SEQ ID NO: 81).

[Фигура 90] На фигуре 90 представлена нуклеотидная последовательность праймера 17 (SEQ ID NO: 82).

[Фигура 91] На фигуре 91 представлена нуклеотидная последовательность праймера 18 (SEQ ID NO: 83).

[Фигура 92] На фигуре 92 представлена нуклеотидная последовательность праймера 19 (SEQ ID NO: 84).

[Фигура 93] На фигуре 93 представлена нуклеотидная последовательность праймера 20 (SEQ ID NO: 85).

[Фигура 94] На фигуре 94 представлена нуклеотидная последовательность праймера 21 (SEQ ID NO: 86).

[Фигура 95] На фигуре 95 представлена аминокислотная последовательность Fc человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 87).

[Фигура 96] На фигуре 96 представлена аминокислотная последовательность D8 человеческого SPINK5 (SEQ ID NO: 88).

[Фигура 97] На фигуре 97 представлена аминокислотная последовательность D9 человеческого SPINK5 (SEQ ID NO: 89).

[Фигура 98] На фигуре 98 представлена аминокислотная последовательность человеческого SPINK9 (SEQ ID NO: 90).

[Фигура 99] На фигуре 99 представлена аминокислотная последовательность мышиного KLK5 (SEQ ID NO: 91).

[Фигура 100] На фигуре 100 представлена аминокислотная последовательность мышиного KLK7 (SEQ ID NO: 92).

[Фигура 101] На фигуре 101 представлена аминокислотная последовательность мышиного KLK14 (SEQ ID NO: 93).

[Фигура 102] На фигуре 102 представлены графики для оценки KLK5-ингибирующей активности каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида (n=3, среднее ± ср. кв. ош.) по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя для вычисления констант ингибирования K_i. Для оценки KLK5-ингибирующей активности использовали KLK5 в конечной концентрации 10 нМ и Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 103A] На фигуре 103A представлены диаграммы для оценки KLK5-ингибирующей активности каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида по степени разложения человеческого десмоглеина 1 в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования KLK5 использовали KLK5 в конечной концентрации 1 мкМ и рекомбинантный Fc-химерный белок человеческого десмоглеина-1 (R&D Systems, Inc., 944-DM-100) в конечной концентрации 1 мкМ. Анализ проводили с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием антитела против десмоглеина 1 (аминокислоты 471-499) (LSBio, LS-C167542) и ПХ-связанного F(ab')₂-фрагмента ослиного антитела против кроличьих IgG (GE healthcare, NA9340V).

[Фигура 103B] На фигуре 103B представлены диаграммы для оценки KLK5-ингибирующей активности каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида по степени разложения человеческого десмоколлина в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования KLK5 использовали KLK5 в конечной концентрации 0,2 мкМ и рекомбинантный белок человеческого десмоколлина-1 с С-концевой меткой His (R&D Systems, Inc., 4955-DC-050) в конечной концентрации 2 мкМ. Анализ проводили с помощью Вестерн-блот-анализ с использованием ПХ-конъюгата с пятью His-метками (QIAGEN, 34460).

[Фигура 104] На фигуре 104 представлена нуклеотидная последовательность праймера 22 (SEQ ID NO: 94).

[Фигура 105] На фигуре 105 представлена нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc (SEQ ID NO: 95).

[Фигура 106] На фигуре 106 представлена аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc (SEQ ID NO: 96).

[Фигура 107A] На фигуре 107A представлен график, показывающий KLK5-ингибирующую активность (IC₅₀) Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Для оценки активности ингибирования KLK5 использовали KLK5 в конечной концентрации 10 нМ и Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) в конечной концентрации 100 мкМ.

[Фигура 107B] На фигуре 107B представлен график для оценки перекрестной реактивности Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc с KLK7 по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Были использованы такие же условия, как и на фигуре 3G.

[Фигура 107C] На фигуре 107B представлен график для оценки перекрестной реактивности Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc с KLK14 по степени разложения пептидного субстрата в качестве показателя. Были использованы такие же условия, как и на фигуре 3H.

[0013] Описание вариантов осуществления изобретения

1. Определения

В настоящем изобретении, термин «ген» означает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность белка, или ее комплементарную цепь. Термин «ген» включает комплекс цепи ДНК и цепи РНК с одной цепью, двумя цепями или тремя или более цепями, а также смесь рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов на одной цепи, и двух- или трехцепочечных молекул нуклеиновой кислоты или молекул нуклеиновой кислоты с большим числом цепей, содержащих указанные цепи.

[0014] В настоящем изобретении, термины «ген», «полинуклеотид» и «молекулы нуклеиновой кислоты» являются синонимами, и не ограничиваются числом рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотидов, нуклеотидов, нуклеозидов и т.п., которые являются их составными единицами. Так, например, ДНК, РНК, мРНК, кДНК, кРНК, зонд, олигонуклеотид, праймер и т.п. также входят в объем этих терминов. «Молекулы нуклеиновой кислоты» могут сокращенно называться «нуклеиновыми кислотами».

[0015] В настоящем изобретении, термины «полипептид», «пептид» и «белок» имеют одно и то же значение.

[0016] В настоящем изобретении, пептид, который распознает молекулу-мишень X или связывается с молекулой-мишенью X (далее такое распознавание или связывание будет в совокупности означать «активность связывания с X»), может называться «пептидом, связывающимся с X». Кроме того, пептид, который распознает молекулу-мишень X или связывается с молекулой-мишенью X и ингибирует или подавляет одну или более активностей или функций молекулы-мишени X (далее, ингибирующее или подавляющее действие будет в совокупности называться «X-ингибирующей активностью») можно называться «пептидом, ингибирующим X».

[0017] В настоящем изобретении, «SPINK2» означает ингибитор сериновой протеазы Kazal-типа 2, который представляет собой белок в 7 кДа, состоящий из Kazal-подобного домена, имеющего три дисульфидные связи. SPINK2 предпочтительно выделяют у человека. В настоящем изобретении, человеческий SPINK2 (SEQ ID NO: 1, фигура 9) будет обозначаться просто как «SPINK2», если это не оговорено особо.

[0018] В настоящем изобретении, «KLK5» представляет собой белок, состоящий из N-концевого пропептида и активного домена протеазы и обладающий активностью трипсиноподобной и химотрипсиноподобной протеазы, а также имеющий добавленные сахарные цепи N-типа в трех сайтах. KLK5 предпочтительно происходит от человека. В настоящем изобретении, человеческий KLK5 (SEQ ID NO: 2, фигура 10) может называться просто «KLK5», если это не оговорено особо.

[0019] В настоящем изобретении, «KLK7» представляет собой белок, состоящий из N-концевого пропептида и трипсиноподобного домена, обладающего протеазной активностью, а также имеющий добавленную сахарную цепь N-типа. KLK7 предпочтительно происходит от человека. В настоящем изобретении, человеческий KLK7 (SEQ ID NO: 3, фигура 11) может называться просто «KLK7», если это не оговорено особо.

[0020] В настоящем изобретении «KLK14» также называется нейропсином и представляет собой белок, состоящий из N-концевого пропептида и трипсиноподобного домена, обладающего протеазной активностью, а также имеющий добавленную сахарную цепь N-типа. KLK14 предпочтительно происходит от человека. В настоящем изобретении, человеческий KLK14 (SEQ ID NO: 4, фигура 12) может называться просто «KLK14», если это не оговорено особо.

[0021] В настоящем изобретении, «предшественник KLK5» означает про-KLK5, который состоит из пропептида и домена, обладающего протеазной активностью. «Активный KLK5» означает активный KLK5, который состоит из домена, обладающего протеазной активностью. Активный KLK5 предпочтительно происходит от человека.

[0022] В настоящем изобретении, «предшественник KLK7» означает про-KLK7, который состоит из пропептида и домена, обладающего протеазной активностью. «Активный KLK7» означает активный KLK7, который состоит из домена, обладающего протеазной активностью. Активный KLK7 предпочтительно происходит от человека.

[0023] В настоящем изобретении, «предшественник KLK14» означает про-KLK14, который состоит из пропептида и домена, обладающего протеазной активностью. «Активный KLK14» означает активный KLK14, который состоит из домена, обладающего протеазной активностью. Активный KLK14 предпочтительно происходит от человека.

[0024] В настоящем изобретении, термины «пептид, ингибирующий KLK5», «пептид, ингибирующий KLK5/KLK7» или «пептид, ингибирующий KLK5/KLK14» означают пептид, который ингибирует или подавляет одну или более активностей или функций KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, соответственно.

[0025] В объем терминов «пептид, ингибирующий KLK5», «пептид, ингибирующий KLK5/7» и «пептид, ингибирующий KLK5/KLK14» входят фрагменты такого пептида и конъюгаты, полученные посредством присоединения или связывания других фрагментов с пептидом или с его фрагментами, которые сохраняют KLK5-ингибирующую (связывающую) активность, KLK5/KLK7-ингибирующую (связывающую) активность или KLK5/KLK14-ингибиторную (связывающую) активность, соответственно. То есть, «пептид, ингибирующий KLK5», «пептид, ингибирующий KLK5/KLK7» или «пептид, ингибирующий KLK5/KLK14» включают фрагменты, продукты присоединения и модифицированные формы (такие как конъюгаты) такого пептида, которые сохраняют KLK5-ингибирующую (связывающую) активность и KLK7-ингибирующую (связывающую) активность или KLK5-ингибирующую (связывающую) активность и KLK14-ингибиторную (связывающую) активность, соответственно.

[0026] В настоящем изобретении, «сайты», с которыми связывается пептид, то есть «сайты», распознаваемые пептидом, означают последовательные или прерывающиеся частичные аминокислотные последовательности или частичные структуры более высокого порядка на молекулах-мишенях, с которыми этот пептид связывается или которые он распознает. В настоящем изобретении, такие сайты могут называться эпитопами или сайтами связывания на молекулах-мишенях.

[0027] В настоящем изобретении, «клетки» включают различные клетки, полученные от животных, субкультивированные клетки, первичные культивируемые клетки, клеточные линии, рекомбинантные клетки, дрожжи и микроорганизмы.

[0028] В настоящем изобретении, «мутант SPINK2» означает пептид, содержащий аминокислотную последовательность, образованную путем замены одной или более аминокислот аминокислотами, отличающимися от аминокислот дикого типа; делеции одной или более аминокислот дикого типа; или инсерции одной или более аминокислот, которые не обнаруживаются в пептиде дикого типа (которые далее будут называться общим термином «мутация») в аминокислотной последовательности SPINK2 дикого типа. «Мутанты SPINK2», которые обладают KLK5-ингибирующей активностью, KLK5-ингибирующей активностью и KLK7-ингибирующей активностью (KLK5/KLK7-ингибирующей активностью) или KLK5-ингибирующей активностью и KLK14-ингибирующей активностью (KLK5/KLK14-ингибирующей активностью), включены в KLK5-ингибирующие пептиды, KLK5/KLK7-ингибирующие пептиды или KLK5/KLK14-ингибирующие пептиды. В настоящем изобретении, «инсерция» может быть включена в объем термина «добавление».

[0029] В настоящем изобретении, слово «несколько» в словосочетании «один или более» означает от трех до десяти.

[0030] В настоящем изобретении, термин «гибридизация в жестких условиях» означает гибридизацию в растворе, содержащем 5 × SSC, а затем промывку в водном растворе, содержащем 2 × SSC-0,1% ДСН при 65°С в течение 20 минут, в водном растворе, содержащем 0,5 × SSC-0,1% ДСН при 65°С в течение 20 минут, и в водном растворе, содержащем 0,2 × SSC-0,1% ДСН при 65°С в течение 20 минут, или гибридизацию в условиях, эквивалентных указанным выше условиям. SSC означает водный раствор 150 мМ NaCl-15 мМ цитрата натрия, а «n × SSC» означает SSC в n-кратной концентрации.

[0031] В настоящем изобретении, термины «специфический» и «специфичность» имеют такое же значение, как и термины «селективный» и «селективность», соответственно, и являются синонимами. Так, например, KLK5-специфический ингибирующий пептид имеет такое же значение, как и KLK5-селективный ингибирующий пептид, а KLK5- и KLK7-специфический ингибирующий пептид имеет такое же значение, как и KLK5- и KLK7-селективный ингибирующий пептид, соответственно.

[0032] 2. Пептид

2-1. Аминокислоты

Термин «аминокислота» означает органическое соединение, содержащее аминогруппу и карбоксильную группу, и предпочтительно, означает α-аминокислоту, содержащуюся в качестве составной единицы в белке, а более предпочтительно, в природном белке. В настоящем изобретении, более подходящие примеры аминокислот включают Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val, и термин «аминокислота» означает любую из всех этих 20 аминокислот, если это не оговорено особо. Все эти 20 аминокислот могут называться «природными аминокислотами». Пептид, ингибирующий KLK5, пептид, ингибирующий KLK5/KLK7 или пептид, ингибирующий KLK5/KLK14, согласно изобретению, предпочтительно содержит природную аминокислоту.

[0033] В настоящем изобретении, «аминокислотные остатки» могут сокращенно называться «аминокислотами».

[0034] Кроме того, в настоящем изобретении, аминокислота может представлять собой L-аминокислоту, D-аминокислоту или их смесь (DL-аминокислоту), но обычно означает L-аминокислоту, если это не оговорено особо.

[0035] Природные аминокислоты можно разделить, например, на следующие группы исходя из свойств их общих боковых цепей:

(1) группу гидрофобных аминокислот: Met, Ala, Val, Leu и Ile;

(2) группу нейтральных гидрофильных аминокислот: Cys, Ser, Thr, Asn и Gln;

(3) группу кислотных аминокислот: Asp и Glu;

(4) группу основных аминокислот: His, Lys и Arg;

(5) группу аминокислот, влияющих на ориентацию основной цепи: Gly и Pro; и

(6) группу ароматических аминокислот: Trp, Tyr и Phe.

Однако классификация природных аминокислот не ограничивается этими группами.

[0036] В настоящем изобретении, природные аминокислоты могут подвергаться консервативной аминокислотной замене.

[0037] Термин «консервативная аминокислотная замена» означает замену функционально эквивалентной или аналогичной аминокислотой. Консервативная аминокислотная замена в пептиде приводит к статическому изменению аминокислотной последовательности пептида. Так, например, одна или более аминокислот, имеющих одинаковую полярность, обладают эквивалентно функциональным действием, что приводит к статическому изменению аминокислотной последовательности пептида. В целом, замена в пределах этих групп может рассматриваться как консервативная по структуре и функциям. Однако, как будет очевидно специалистам в данной области, роль, которую играет конкретный аминокислотный остаток, может быть определена в контексте трехмерной структуры молекул, содержащих эту аминокислоту. Так, например, цистеиновый остаток может принимать менее полярную окисленную (дисульфидную) форму по сравнению с восстановленной (тиоловой) формой. Длинный алифатический фрагмент боковой цепи аргинина может образовывать структурно и функционально важный элемент. Кроме того, боковая цепь, содержащая ароматическое кольцо (такое как триптофан, тирозин и фенилаланин), может способствовать ион-ароматическим взаимодействиям или взаимодействиям катион-пи. В этом случае, даже если аминокислоты, имеющие такие боковые цепи, заменены аминокислотами, принадлежащими к кислотной или неполярной группе, то они могут быть структурно и функционально консервативными. Остатки, такие как пролин, глицин и цистеин (в дисульфидной форме) могут оказывать непосредственное влияние на трехмерную структуру основной цепи и часто не могут быть заменены без изменения структуры.

[0038] Консервативная аминокислотная замена включает специфические замены (L. Lehninger, Biochemistry, 2^nd edition, pp73-75, Worth Publisher, New York (1975)) и типичные замены, основанные на сходстве боковых цепей, как показано ниже:

(1) Группа неполярных аминокислот: аланин (который далее будет обозначаться как «Ala» или просто «A»), валин (который далее будет обозначаться как «Val» или просто «V»), лейцин (который далее будет называться «Leu» или просто «L»), изолейцин (который далее будет называться «Ile» или просто «I»), пролин (который далее будет называться «Pro» или просто «P»), фенилаланин («Phe» или просто «F»), триптофан (который далее будет называться «Trp» или просто «W») и метионин (который далее будет именоваться «Met» или просто «М»);

(2) Группа незаряженных полярных аминокислот: глицин (который далее будет называться «Gly» или просто «G»), серин (который далее будет называться «Ser» или просто «S»), треонин (который далее будет называться «Thr» или просто «T»), цистеин (который далее будет называться «Cys» или просто «C»), тирозин (который далее будет называться «Tyr» или просто «Y»), аспарагин (который далее будет называться «Asn» или просто «N») и глутамин (который далее будет называться «Gln» или просто «Q»);

(3) Группа кислотных аминокислот: аспарагиновая кислота (которая далее будет называться «Asp» или просто «D») и глутаминовая кислота (которая далее будет называться «Glu» или просто «E»); и

(4) Группа основных аминокислот: лизин (который далее будет называться «Lys» или просто «K»), аргинин (который далее будет называться «Arg» или просто «R») и гистидин (который далее будут называться «Его» или просто «Н»).

В настоящем изобретении, аминокислота может быть аминокислотой, отличающейся от природной аминокислоты. Их примеры могут включать аминокислоты, содержащиеся в природных пептидах или белках, такие как селеноцистеин, N-формилметионин, пирролидин, пироглутаминовая кислота, цистин, гидроксипролин, гидроксилизин, тироксин, O-фосфосерин, десмозин, β-аланин, саркозин, орнитин, креатин, γ-аминомасляная кислота, опин, теанин, триколоминовая кислота, каиновая кислота, домоевая кислота и акромелиновая кислота, и другие аминокислоты, не встречающиеся в природе, такие как N-концевые защищенные аминокислоты, включая норлейцин, Ас-аминокислоту, Boc- аминокислоту, Fmoc-аминокислоту, Trt-аминокислоту и Z-аминокислоту; С-концевые защищенные аминокислоты, включая трет-бутиловый эфир, бензиловый эфир, циклогексиловый эфир и флуорениловый эфир аминокислоты, диамин, ω-аминокислоту, β-аминокислоту, γ-аминокислоту, Tic-производные аминокислот и аминофосфоновую кислоту. Однако эти аминокислоты не имеют конкретных ограничений, и в настоящем изобретении, для удобства описания, аминокислоты, отличающиеся от вышеупомянутых 20 «природных аминокислот», будут называться общим термином «неприродные аминокислоты».

[0039] 2-2. Пептид, ингибирующий KLK5, Пептид, ингибирующий KLK5/KLK7 и Пептид, ингибирующий KLK5/KLK14.

Пептид согласно изобретению обладает KLK5-ингибирующей активностью, KLK5/KLK7-ингибирующей активностью или KLK5/KLK14-ингибирующей активностью.

[0040] KLK5, KLK7 и KLK14, на которые нацелен пептид, ингибирующий KLK5; пептид, ингибирующий KLK5/KLK7; и пептид, ингибирующий KLK5/KLK14 согласно изобретению, предпочтительно получают от позвоночных животных, более предпочтительно от млекопитающих, а еще более предпочтительно от приматов, и оптимально от человека. KLK5, KLK7 и KLK14 могут быть очищены из тканей или клеток или получены способами, известными специалистам в данной области, например, способами получения белков, такими как рекомбинация генов, трансляция in vitro и синтез пептидов. Сигнальная последовательность, Fc-область иммуноглобулина, метка, маркер и т.п. могут быть связаны с KLK5, KLK7 и KLK14. KLK5-ингибирующая активность, KLK5/KLK7-ингибирующая активность и KLK5/KLK14-ингибирующая активность могут быть оценены с использованием протеазных активностей KLK5, KLK5 и KLK7, а также KLK5 и KLK14 в качестве показателей. Так, например, если KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 или их функциональный фрагмент присутствуют вместе с субстратом и с KLK5-ингибирующим пептидом, KLK5/KLK7-ингибирующим пептидом или KLK5/KLK14-ингибирующим пептидом согласно изобретению или их кандидатами, то ингибирование KLK5, ингибирование KLK5/KLK7 или ингибирование KLK5/KLK14 происходит в том случае, если протеазная активность KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 составляет 70% или менее, 50% или менее, 30% или менее, 20% или менее, 10% или менее, 5% или менее, 1% или менее или 0% по сравнению с такой активностью в присутствии контроля или в отсутствие ингибитора или его кандидата. Ингибирующая активность составляет 30% или более, 50% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, 99% или более или 100%, соответственно. KLK5-ингибирующая активность, KLK5/KLK7-ингибирующая активность и KLK5/KLK14-ингибирующая активность могут варьироваться в зависимости от условий реакции, типа субстрата, концентрации и т.п. Условия реакции могут быть проиллюстрированы как описано в примерах, но они не ограничиваются этими примерами. Ферментативная активность может быть оценена путем добавления пептидного субстрата или белкового субстрата к KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 в определенной концентрации, с последующим проведением реакции в течение определенного периода времени, а затем детектированием флуоресценции пептидного субстрата или белкового субстрата с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, Вестерн-блот-анализа, жидкостной хроматографии и т.п. В качестве буфера может быть использован забуференный фосфатом физиологический раствор (который далее будет называться «PBS»), трис-буфер (50 мМ Трис, pH от 7 до 8,5, например, pH 7,5) и т.п., а также могут быть добавлены соли, такие как NaCl (от 0 до 200 мМ, например, 200 мМ) CaCl₂ (от 0 до 10 мМ, например, 2 мМ), ZnCl₂ и Brij-35. Однако, эти буферы не имеют конкретных ограничений.

[0041] KLK5-ингибирующая активность, KLK5/KLK7-ингибирующая активность и KLK5/KLK14-ингибирующая активность могут быть представлены константой ингибирования K_i. Протеазную активность оценивают путем добавления пептидного субстрата к ферменту в определенной концентрации с последующим проведением реакции в течение определенного периода времени, а затем детектированием флуоресценции пептидного субстрата. Исходя из протеазной активности при каждой концентрации субстрата, максимальную скорость реакции V_max и константу Михаэлиса K_m вычисляют по уравнению Михаэлиса-Ментена (Michaelis L, et al. (2011) Biochemistry., Vol. 50, No. 39, pp. 8264-8269). Кроме того, константу ингибирования K_i вычисляют исходя из протеазной активности при добавлении каждого ингибитора к ферменту в определенной концентрации по уравнению Моррисона (Morrison JF. (1969) Biochim Biophys Acta., Vol. 185, No. 2, pp. 269-286). Примеры программного обеспечения, используемого для таких вычисления, могут включать GraphPad Prism (GraphPad Software Inc).

[0042] Субстрат протеазы KLK5, KLK7 и KLK5 или KLK5 и KLK14 не имеет конкретных ограничений и может представлять собой эндогенный субстрат, экзогенный субстрат, синтетический субстрат или т.п. Примеры человеческого эндогенного субстрата KLK5 могут включать низкомолекулярный кининоген или каллистатин, коллаген, десмоглеин, десмоколлин и кателицидин. Примеры человеческого эндогенного субстрата KLK7 могут включать Pro-KLK3, фибронектин и коллаген. Примеры человеческого эндогенного субстрата KLK14 могут включать tPA, фибронектин и коллаген. Желатин, полученный путем термоденатурации коллагена, также может быть использован в качестве субстрата. Синтетический субстрат не имеет конкретных ограничений, и его примеры могут включать PFR-AMC и Boc-VPR-AMC. В настоящем изобретении, KLK5-ингибирующая активность (IC₅₀ или K_i) KLK5-ингибирующего пептида, KLK5-ингибирующая активность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида и KLK5-ингибирующая активность и KLK14-ингибирующая активность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида составляет 1 мкМ или менее, предпочтительно 300 нМ или менее, более предпочтительно 100 нМ или менее, еще более предпочтительно 30 нМ, а еще более предпочтительно 10 нМ или менее, каждая. KLK7-ингибирующая активность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида составляет предпочтительно 1000 нМ или менее, более предпочтительно 300 нМ или менее, еще более предпочтительно 100 нМ, а еще более предпочтительно 30 нМ или менее. Кроме того, классификация KLK14-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида может быть проведена по относительной степени KLK5-ингибирующей активности и KLK7-ингибирующей активности или KLK14-ингибирующей активности (каждая из которых представлена как IC₅₀ или K_i). Пептиды предпочтительно подразделяются на три группы: (i) группу с KLK5-ингибирующей активностью, которая менее, чем в 0,5 раза превышает KLK7-ингибирующую активность или KLK14-ингибирующую активность; (ii) группу с KLK5-ингибирующей активностью, которая более, чем в 0,5 раза и менее, чем в 2 раза превышает KLK7-ингибирующую активность или KLK14-ингибирующую активность; и (iii) группу с KLK5-ингибирующей активностью, которая в 2 раза или более превышает KLK7-ингибирующую активность или KLK5/KLK7-ингибирующую активность, и нужные пептиды могут быть выбраны из этих групп в соответствии с целями их применения, например, для лечения.

[0043] Кроме того, KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид согласно изобретению предпочтительно не ингибируют или не подавляют протеазные активности, отличающиеся от активностей KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, соответственно, или степень ингибирования или подавления активности других протеаз предпочтительно является относительно слабой. Другими словами, ингибирующая протеазу активность KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида согласно изобретению предпочтительно имеет высокую специфичность к KLK5, к KLK5/KLK7 или к KLK5/KLK14. Пептид согласно изобретению предпочтительно не ингибирует или не подавляет активность протеаз, таких как KLK1, KLK2, KLK3, KLK4, KLK6, KLK8, KLK9-KLK13, KLK15, химотрипсин, триптаза, химаза, плазмин, тромбин, эластаза, матриптаза, белок C, тканевый активатор плазминогена (tPA), урокиназный активатор плазминогена (uPA) и калликреин плазмы, либо степень их ингибирования или подавления является относительно низкой. Такой предпочтительный пептид согласно изобретению не дает побочных эффектов, вызываемых ингибированием или подавлением активности других протеаз, и является подходящим для его использования в качестве терапевтического или профилактического средства для лечения заболеваний, ассоциированных с KLK5 (которые будут описаны ниже). Кроме того, KLK5-специфический ингибирующий пептид согласно изобретению предпочтительно не ингибирует или не подавляет протеазную активность KLK7 и KLK14, или степень их ингибирования или подавления является относительно низкой; KLK5/KLK7-специфический ингибирующий пептид согласно изобретению предпочтительно не ингибирует или не подавляет протеазную активность KLK14, или степень ее ингибирования или подавления является относительно низкой; и KLK5/KLK14-ингибирующий пептид согласно изобретению предпочтительно не ингибирует или не подавляет протеазную активность KLK7, или степень ее ингибирования или подавления является относительно низкой.

[0044] Ингибиторы, которые имеют низкую специфичность к KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 и ингибируют протеазную активность других KLK, помимо KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, то есть, неселективные ингибиторы, могут вызывать побочные эффекты при их введении человеку (Coussens, LM, et al., Science, Vol. 295, No. 5564, pp. 2387-2392 (2002); Bissett, D, et al., J.Clin.Oncol., Vol. 23, № 4, стр. 842-849 (2005)). Кроме того, ингибиторы, обладающие высокой специфичностью к KLK5, KLK5/KLK7 или KLK5/KLK14, то есть, KLK5-специфические ингибирующие пептиды, KLK5/KLK7-специфические ингибирующие пептиды или KLK5/KLK14-специфические ингибирующие пептиды, могут не давать таких побочных эффектов, как описано выше, а поэтому они являются подходящими для их использования в целях лечения и профилактики заболеваний, ассоциированных с KLK5 (которые будут описаны ниже).

[0045] Пептид, ингибирующий KLK5; пептид, ингибирующий KLK5/KLK7; или пептид, ингибирующий KLK5/KLK14 согласно изобретению, может участвовать в конкурентном связывании субстрата протеазы с KLK5, KLK5 и/или KLK7 или KLK5 и/или KLK14.

[0046] Как описано выше, KLK5, KLK7 и KLK14, на которые нацелен пептид согласно изобретению, происходят от позвоночных животных, предпочтительно млекопитающих, более предпочтительно от приматов, а еще более предпочтительно от человека, но могут происходить от животных, не являющихся человеком, например, от грызунов, таких как крысы и мыши, и от приматов, таких как собакоподобные обезьяны, обыкновенные игрунки и макак-резусы. Пептиды с активностью, ингибирующей KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 животного, не являющегося человеком, могут быть использованы, например, для диагностики, тестирования, лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с KLK5, у животных, не являющихся человеком. Кроме того, если такие пептиды также ингибируют человеческие KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, то могут быть проведены фармакологические тесты и фармакокинетические тесты с использованием таких животных, не являющихся человеком, в качестве моделей данной патологии, а также тесты на безопасность и тесты на токсичность с использованием здоровых животных и т.п. в преклинических исследованиях и при разработке пептидов как терапевтических или профилактических средств для лечения заболеваний, ассоциированных с KLK5 (которые будут описаны ниже).

[0047] Кроме того, KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид и KLK5/KLK14-ингибирующий пептид согласно изобретению имеют такие преимущества, как низкая молекулярная масса, сравнительно легкое получение (которое будет описано ниже), превосходные физические свойства, такие как стабильность при хранении и термостабильность, а также широкий диапазон выбора путей введения, способа введения, рецептуры и т.п. при их использовании в качестве фармацевтических композиций (которые будут описаны ниже) по сравнению с другими биополимерами, такими как антитела, используемые в этой области в качестве фармацевтических и диагностических средств. Кроме того, время полужизни в крови при их использовании в качестве фармацевтической композиции можно регулировать в сторону увеличения с применением известного метода, такого как добавление биополимеров и полимеров, для увеличения молекулярной массы пептида согласно изобретению. Пептид, ингибирующий KLK5, пептид, ингибирующий KLK5/KLK7, и пептид, ингибирующий KLK5/KLK14 согласно изобретению, имеют молекулярную массу менее 10000, предпочтительно менее 8000, более предпочтительно приблизительно от 7000 до 7200. Кроме того, фрагменты вариабельной петли, состоящие из Cys15-Cys31 в SEQ ID NO: 61 (фигура 69), или фрагменты, состоящие из Cys15-Cys63 (далее называемые «фрагментами, содержащими шесть остатков Cys»), обладающие KLK5-ингибирующей активностью, KLK5/KLK7-ингибирующей активностью или KLK5/KLK14-ингибирующей активностью, также входят в состав KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида согласно изобретению, соответственно. Фрагменты вариабельной петли имеют молекулярную массу менее 2500, предпочтительно приблизительно от 1800 до 2000, а фрагменты, содержащие шесть Cys, имеют молекулярную массу менее 6000, а предпочтительно приблизительно от 5300 до 5500.

[0048] Пептид, ингибирующий KLK5, пептид, ингибирующий KLK5/KLK7 или пептид, ингибирующий KLK5/KLK14 согласно изобретению представляет собой мутант SPINK2 (который далее может сокращенно называться «мутантом SPINK2»), в котором остов SPINK2 по меньшей мере частично сохраняется, и который предпочтительно распознает неполный пептид, частичную структуру более высокого порядка и т.п. KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 или связывается с ними (далее такое распознавание или связывание будет называться общим термином «активность связывания с мишенью»).

[0049] В настоящем изобретении, связывание мутанта SPINK2 с KLK5, KLK7 или KLK14 может быть оценено или определено методами, известными специалистам в данной области, такими как ELISA, анализ с помощью поверхностного плазмонного резонанса (далее называемый «ППР»), биослойная интерферометрия (далее называемая «BLI»), изотермическая титрационная калориметрия (далее называемая «ITC»), проточная цитометрия и иммунопреципитация.

[0050] Примерами ELISA являются способ детектирования пептида, ингибирующего KLK5; пептида, ингибирующего KLK5/KLK7; или пептида, ингибирующего KLK5/KLK14, которые распознают и связываются с KLK5, KLK5/KLK7 или KLK5/KLK14, иммобилизованными на планшете. Для иммобилизации KLK5, KLK5/KLK7 или KLK5/KLK14 могут быть использованы антитела для твердой фазы, которые распознают KLK5, KLK5/KLK7 или KLK5/KLK14, или метка, связанная с KLK5, KLK5/KLK7 или KLK5/KLK14, кроме биотина-стрептавидина. Для обнаружения KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида, могут быть использованы меченые антитела, которые распознают KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид, или метка, связанная с KLK5-ингибирующим пептидом, KLK5/KLK7-ингибирующим пептидом или KLK5/KLK14-ингибирующим пептидом, кроме меченого стрептавидина. Методы, которые могут быть применены для проведения биохимического анализа, такого как анализ с использованием ПХ, щелочной фосфатазы и ФИТЦ, кроме биотина, могут быть проведены для мечения. Для детектирования с помощью ферментной метки могут быть использованы хромогенные субстраты, такие как TMB (3,3', 5,5'-тетраметилбензидин), BCIP (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат), p-NPP (п-нитрофенилфосфат), OPD (о-фенилендиамин), ABTS (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) и хемилюминесцентный субстрат для проведения ELISA-анализа Pico SuperSignal (Thermo Fisher Scientific), флуоресцентные субстраты, такие как флуорогенный пероксидазный субстрат QuantaBlu® (Thermo Fisher) и хемилюминесцентные субстраты. Для измерения детектирующих сигналов могут быть использованы абсорбционные планшет-ридеры, флуоресцентные планшет-ридеры, люминесцентные планшет-ридеры, жидкостные сцинтилляционные счетчики RI и т.п.

[0051] Метод измерения с помощью ППР-анализа может представлять собой любой из таких методов, как: метод иммобилизации мутантного пептида SPINK2 на сенсорном чипе и добавления молекулы-мишени, такой как KLK5, для оценки связывания между ними; и метод иммобилизации молекулы-мишени, такой как KLK5, на сенсорном чипе и добавления мутантного пептида SPINK2 для оценки связывания между ними. Первый метод является предпочтительным. Для иммобилизации мутанта SPINK2, содержащегося в пептиде согласно изобретению или в его конъюгате, может быть применен прямой метод или метод захвата. Последний метод является предпочтительным. В прямом методе для прямой иммобилизации может быть использована гидрофобность мутанта SPINK2, аминогрупп и карбоксильных групп SPINK2 и т.п. В методе захвата, для иммобилизации, могут быть использованы антитела, которые распознают конъюгат, или метка, связанная с конъюгатом, белком A, G-белком или т.п., кроме биотина-стрептавидина. Молекулу-мишень, такую как KLK5, разведенную аналитическим буфером, добавляют к сенсорному чипу, на котором иммобилизован мутант SPINK2, и ППР-сигнал наблюдают в течение определенного периода времени для построения сенсорограмм связывания. Затем, добавляют аналитический буфер, не содержащий молекул-мишеней, таких как KLK5, и наблюдают ППР-сигнал в течение определенного периода времени для построения сенсорограмм диссоциации. Аффинность связывания анализируют по построенным сенсорограммам для вычисления константы диссоциации K_D. Устройства, используемые для анализа с помощью ППР, могут включать BIAcore (R) (GE healthcare), ProteOn (R) (BioRad), SPR-Navi (R) (BioNavisOy), Spreeta (R) (Texas Instruments), SPRi-PlexII (R) (HORIBA, Ltd.) и Autolab SPR (R) (Metrohm). Устройства, используемые для BLI, могут включать Octet (R) (Pall).

[0052] Примером иммунопреципитации является способ детектирования KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, распознаваемых KLK5-ингибирующим пептидом, KLK5/KLK7-ингибирующим пептидом или KLK5/KLK14-ингибирующим пептидом, и связанных с этими пептидами, иммобилизованными на сферах. Что касается сфер, то могут быть использованы магнитные сферы, агарозные сферы и т.п. Для иммобилизации KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида могут быть использованы антитела, которые распознают такой пептид, или метка, связанная с пептидом, белком A, G-белком или т.п., кроме биотина-стрептавидина. Сферы разделяют с помощью магнита, центрифугирования и т.п., и KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, осажденные вместе со сферами, детектируют с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ или Вестерн-блот-анализа. Для детектирования KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 могут быть использованы меченые антитела, которые распознают метку, связанную с KLK5, KLK7 или KLK14 или KLK5, KLK7 или KLK14 и т.п., кроме меченого стрептавидина. Методы, которые могут быть применены для проведения биохимического анализа, такого как анализ с использованием ПХ, щелочной фосфатазы и ФИТЦ, кроме биотина, могут быть также применены и для мечения. Для детектирования с использованием ферментной метки может быть использован тот же субстрат, который был использован в ELISA. Для измерения детектирующих сигналов могут быть использованы ChemiDoc® (BioRad), LuminoGraph (ATTO) и т.п.

[0053] В настоящем изобретении, «специфическое распознавание», то есть «специфическое связывание» означает связывание, которое не является неспецифической адсорбцией. Примеры критериев для определения наличия или отсутствия специфического связывания, могут включать ЕС₅₀ активности связывания в ELISA. Примеры других критериев могут включать константу диссоциации (далее называемую «K_D»). В настоящем изобретении, значение K_D KLK5-ингибирующего пептида для KLK5, значение K_D KLK5/KLK7-ингибирующего пептида для KLK5 и KLK7, или значение K_D KLK5/KLK14-ингибирующего пептида для KLK5 и KLK14, составляют 1 × 10^-5 M или менее, 5 × 10^-6 M или менее, 2 × 10^-6 M или менее, или 1 × 10^-6 M или менее; более предпочтительно, 5 × 10^-7 M или менее, 2 × 10^-7 M или менее или 1 × 10^-7 M или менее, более предпочтительно, 5 × 10^-8 M или менее, 2 × 10^-8 M или менее, или 1 × 10^-8 M или менее, еще более предпочтительно 5 × 10^-9 M или менее, 2 × 10^-9 M или менее, или 1 × 10^-9 M или менее. Примеры других критериев могут включать результаты анализа иммунопреципитации. В случае иммобилизации KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида на сферах, что является предпочтительным в настоящем изобретении, с последующим добавлением к ним KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 и разделением сфер для детектирования KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, осажденных вместе со сферами, осуществляют детектирование сигналов KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14.

[0054] Мутант SPINK2 в качестве KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида согласно изобретению может обладать активностью ингибирования протеазы, активностью связывания с мишенью, и другими свойствами, функциями и особенностями, описанными выше, в то время как его полноразмерная аминокислотная последовательность имеет последовательность, в высокой степени идентичную аминокислотной последовательности человеческого SPINK2 дикого типа. Мутант SPINK2 согласно изобретению имеет последовательность, которая на 60% или более, на 70% или более, на 75% или более, на 80% или более, на 85% или более, на 90% или более, на 95% или более, на 98% или более или на 99% или более идентична аминокислотной последовательности человеческого SPINK2 (SEQ ID NO: 1, фигура 9).

[0055] Термин «идентичность» означает свойство, которое указывает на степень сходства или взаимосвязи между двумя последовательностями. Идентичность (%) аминокислотной последовательности вычисляют путем деления количества идентичных аминокислот или аминокислотных остатков на общее количество аминокислот или аминокислотных остатков и умножения полученного результата на 100.

[0056] Термин «пробел» означает пробел в выравнивании между двумя или более последовательностями, возникающий в результате делеции и/или добавления по меньшей мере одной из последовательностей.

[0057] Идентичность двух аминокислотных последовательностей, которые имеют полностью идентичные аминокислотные последовательности, составляет 100%, но если одну их аминокислотных последовательностей сравнивают с другой, и если одна или более аминокислот или аминокислотных остатков являются замененными, делетированными или добавленными, то идентичность между ними составляет менее 100%. Примеры алгоритмов или программ для определения идентичности двух последовательностей с учетом пробелов могут включать методы, известные специалистам в данной области и проводимые с использованием стандартных параметров, и такими алгоритмами являются BLAST (Altschul, et al. Nucleic Acids Res., Vol. 25, стр. 3389-3402, 1997), BLAST2 (Altschul и др., J. Mol. Biol., Vol. 215, стр. 403-410, 1990) и алгоритм Смита-Уотермана (Smith, et al., J. Mol. Biol., Vol. 147, pp. 195-197, 1981).

[0058] В настоящем изобретении, термин «мутированный» означает, что один или более нуклеотидов, нуклеотидных остатков, аминокислот или аминокислотных остатков были заменены, делетированы или встроены в нуклеотидную последовательность или в аминокислотную последовательность по сравнению с природной молекулой нуклеиновой кислоты или пептидом. Аминокислотная последовательность мутанта SPINK2 согласно изобретению имеет одну или более мутировавших аминокислот или аминокислотных остатков по сравнению с аминокислотной последовательностью человеческого SPINK2.

[0059] В одном из аспектов настоящего изобретения, аминокислотная последовательность мутанта SPINK2 может иметь: одну, две, три, четыре, пять, шесть или семь аминокислот Ser16- Gly22, замененных другими аминокислотами или аминокислотными остатками; одну, две, три, четыре или пять аминокислот Pro24-Asn28, замененных другими аминокислотами или аминокислотными остатками; и одну, две, три, четыре, пять или шесть из Cys15, Cys23, Cys31, Cys42, Cys45 и Cys63, замененных другими аминокислотами для удаления природных дисульфидных связей или для создания неприродных дисульфидных связей, хотя предпочтительно, чтобы Cys были такими же, как Cys дикого типа, для сохранения природных дисульфидных связей в аминокислотной последовательности человеческого SPINK2 (SEQ ID NO: 1, фигура 9). В некоторых предпочтительных KLK5-ингибирующих пептидах, KLK5/KLK7-ингибирующих пептидах, или KLK5/KLK14-ингибирующих пептидах мутанта SPINK2 согласно изобретению, Cys сохраняют в тех же 6 сайтах, как и в природном пептиде, для сохранения дисульфидных связей. В некоторых более предпочтительных аспектах таких пептидов, каждый из Cys15-Cys45, Cys23-Cys42 и Cys31-Cys63 образует дисульфидную связь.

[0060] Если аминокислотная последовательность такого мутанта SPINK2 содержится в KLK5-ингибирующем пептиде, KLK5/KLK7-ингибирующем пептиде или KLK5/KLK14-ингибирующем пептиде, то трехмерная структура, образованная петлевой структурой, состоящей из Ser16-Val30, содержащейся в аминокислотной последовательности SPINK2 дикого типа; β-складка, состоящая из β-цепи (1), состоящей из Cys31 и Gly32; и β-цепи (2), состоящей из Ile57-Arg59, и α-спираль, состоящая из Glu41-Gly51, или петлевая структура, β-складка и α-спираль, которые подобны или по меньшей мере частично соответствуют указанным выше структурам (их положениям), предпочтительно сохраняются в той степени, в которой может быть достигнута KLK5-ингибирующая активность, KLK5/KLK7-ингибирующая активность, или KLK5/KLK14-ингибирующая активность.

[0061] Аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида в соответствии с некоторыми аспектами мутанта SPINK2 согласно изобретению будет описана ниже. Как описано выше, в настоящем изобретении, «аминокислотные остатки» могут быть просто указаны как «аминокислоты».

[0062] В аминокислотной последовательности (в формуле), представленной в SEQ ID NO: 61 (фигура 69), X₁-X₁₂ не имеют конкретных ограничений при условии, что они будут представлять собой любую аминокислоту, которая будет давать мутант, ингибирующий KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14. Далее будут описаны подходящие аминокислоты X₁-X₁₂, но аминокислоты могут включать такие же аминокислоты, как и в аминокислотной последовательности природного типа, то есть, человеческого SPINK2 дикого типа.

[0063] В аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61 (фигура 69), содержащейся в KLK5-ингибирующем пептиде, желательно, чтобы: Xaa16 (X₁) представлял собой Ala, Asp, Gly, Gln, Leu, Ser или Thr; Xaa17 (X₂) представлял собой Arg, Glu, Asn, Gln или Ser; Xaa18 (X₃) представлял собой Asp, Gln, Ile, Thr, Trp или Tyr; Xaa19 (X₄) представлял собой Arg, Gly, Met, Gln или Thr; Xaa20 (X₅) представлял собой Asp, Glu, Leu, Lys, Thr или Tyr; Xaa21 (X₆) представлял собой Glu, Gly, His, Leu, Ser, Gln или Tyr; Xaa22 (X₇) представлял собой Asp, Gly, Gln, Ser или Tyr; Xaa24 (X₈) представлял собой Ala, Asp, Glu, Gly, Asn, Ser или Thr; Xaa25 (X₉) представлял собой Arg или Lys; Xaa26 (X₁₀) представлял собой Asp, Glu, Gln, Ser или Val; Xaa27 (X₁₁)-Phe или Tyr; и Xaa28 (X₁₂) представлял собой Asp или Glu.

[0064] В аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61 (фигура 69), содержащейся в KLK5/KLK7-ингибирующем пептиде, желательно, чтобы: Xaa16 (X₁) представлял собой Gly, Met или Tyr; Xaa17 (X₂) представлял собой Glu, Gln или Thr; Xaa18 (X₃) представлял собой His, Met или Tyr; Xaa19 (X₄) представлял собой Ala, Arg, Lys или Gln; Xaa20 (X₅) представлял собой Gly, Arg или Ser; Xaa21 (X₆) представлял собой Arg, Lys, Gln или Ser; Xaa22 (X₇) представлял собой Gly; Xaa24 (X₈) представлял собой His, Thr или Tyr; Xaa25 (X₉) представлял собой His или Tyr; Xaa26 (X₁₀) представлял собой Asp, Glu или His; Xaa27 (X₁₁) быть Tyr; и Xaa28 (X₁₂) представлял собой Asp или Glu.

[0065] В аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61 (фигура 69), содержащейся в KLK5/KLK14-ингибирующем пептиде, желательно, чтобы: Xaa16 (X₁) представлял собой Gly, Ser или Tyr; Xaa17 (X₂) представлял собой Asp или Gln; Xaa18 (X₃) представлял собой Thr или Val; Xaa19 (X₄) представлял собой Thr или Val; Xaa20 (X₅) представлял собой Glu или Thr; Xaa21 (X₆) His или Thr; Xaa22 (X₇) представлял собой Tyr; Xaa24 (X₈) представлял собой Asn или Ser; Xaa25 (X₉) представлял собой Arg; Xaa26 (X₁₀) представлял собой Asp или Glu; Xaa27 (X₁₁) представлял собой Tyr; а Xaa28 (X₁₂) представлял собой Asp.

[0066] Xaa16-22 и Xaa24-28 (от X₁ до X₁₂) дикого типа представляют собой Ser, Gln, Tyr, Arg, Leu, Pro, Gly, Pro, Arg, His, Phe и Asn, соответственно.

[0067] В настоящем изобретении, от одной до нескольких или более, а предпочтительно от 1 до 5 аминокислот могут быть дополнительно добавлены к N-концевой стороне первой аминокислоты. Примерами такого добавления аминокислот могут быть предпочтительно добавление от 1 до 5 Asp и/или Glu (могут быть включены оба Asp и Glu), а более предпочтительно добавление от 1 до 5 Asp или добавление от 1 до 5 Glu.

[0068] В настоящем изобретении, пептид, который образован в результате замены, инсерции и/или делеции одной или более аминокислот в добавленном фрагменте N-концевого и/или C-концевого продукта присоединения мутантного пептида SPINK2 (который далее будет называться «родительским пептидом»), и который частично или полностью сохраняет активность мутантного пептида SPINK2, может называться «производным родительского пептида» или «производным исходного пептида». Такое «производное» также входит в объем термина «пептид» согласно изобретению.

[0069] Аминокислотная последовательность мутанта SPINK2, входящая в объем KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида согласно изобретению, может содержать природные аминокислоты или мутированные аминокислоты или аминокислотные последовательности во фрагментах, не являющихся X₁-X₁₂, то есть в положениях от Pro2 до Cys15, Cys23 и от Pro29 до Cys63 в аминокислотной последовательности человеческого SPINK2 дикого типа (SEQ ID NO: 1, фигура 9). Так, например, мутант SPINK2 может быть мутирован в одном или более положениях при условии, что мутации не будут полностью предотвращать или блокировать KLK5-ингибирующую активность, KLK5/KLK7-ингибирующую активность или KLK5/KLK14-ингибирующую активность или укладку. Такие мутации могут быть достигнуты с применением стандартных методов, известных специалистам в данной области. Примерами типичных мутаций в аминокислотной последовательности могут быть замена, делеция или инсерция одной или более аминокислот, а примером замены может быть консервативная замена. В результате консервативной замены, аминокислотный остаток заменяется другим аминокислотным остатком, имеющим аналогичные химические свойства не только по объему, но и по полярности. Примеры консервативных замен описаны в настоящей заявке. Между тем фрагменты, отличающиеся от X₁-X₁₂, могут допускать неконсервативную замену одной или более аминокислот при условии, что такие замены не будут полностью предотвращать или блокировать KLK5-ингибирующую активность, KLK5/KLK7-ингибирующую активность или KLK5/KLK14-ингибирующую активность или укладку.

[0070] В аминокислотной последовательности мутанта SPINK2, служащего в качестве KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида согласно изобретению, X₁-X₁₂ предпочтительно представляют собой, соответственно, аминокислоты X₁-X₁₂ в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 (фигуры 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28), SEQ ID NO: 22, 24, 26 и 28 (фигуры 30, 32, 34 и 36) и SEQ ID NO: 30 и 32 (фигуры 38 и 40), а фрагменты, отличающиеся от X₁-X₁₂, могут иметь аминокислоты или аминокислотные последовательности, которые не будут полностью предотвращать или блокировать KLK5-ингибирующую активность, KLK5/KLK7-ингибирующую активность или KLK5/KLK14-ингибирующую активность или укладку.

[0071] Кроме того, примеры аминокислотной последовательности мутанта SPINK2, служащего в качестве KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида согласно изобретению могут включать любую из аминокислотных последовательностей (a1)-(a4), (b1)-(b4) или (c1)-(c4), указанных ниже:

(a1) аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот в положениях 1-63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 (Фигуры 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28);

(a2) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, описанную в (a1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5-ингибирующей активностью;

(а3) аминокислотную последовательность, образованную посредством замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, 1 до 3, 1 или 2 или 1 аминокислоты в аминокислотной последовательности, описанной в (a1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5-ингибирующей активностью; и

(а4) аминокислотную последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична аминокислотной последовательности, описанной в (a1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5-ингибирующей активностью,

(b1) аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот в положениях 1-63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 22, 24, 26 и 28 (Фигуры 30, 32, 34 и 36);

(b2) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, описанную в (b1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью;

(b3) аминокислотную последовательность, образованную посредством замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, 1 до 3, 1 или 2 или 1 аминокислоты в аминокислотной последовательности, описанной в (b1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью; и

(b4) аминокислотную последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична аминокислотной последовательности, описанной в (b1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью; или

(c1) аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот в положениях 1-63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 30 и 32 (Фигуры 38 и 40);

(с2) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, описанную в (с1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью;

(с3) аминокислотную последовательность, образованную посредством замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, 1 до 3, 1 или 2 или 1 аминокислоты в аминокислотной последовательности, описанной в (с1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью; и

(с4) аминокислотную последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична аминокислотной последовательности, описанной в (с1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью.

[0072] Аминокислоты в положениях 64 и 65 в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 и 32 (Фигуры 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 и 40) не являются аминокислотами, соответствующими аминокислотам в человеческом SPINK2 дикого типа (SEQ ID NO: 1, фигура 9: состоит из 63 аминокислот), но, в аспекте настоящего изобретения, их добавляют для экспрессии пептида согласно изобретению.

[0073] В пептид настоящего изобретения могут быть введены мутации в целях улучшения стабильности укладки, термостабильности, стабильности при хранении, увеличения времени полужизни в крови, растворимости в воде, биологической активности, фармакологической активности, устранения побочных эффектов и т.п. Так, например, новые реакционноспособные группы, такие как Cys, могут быть введены путем мутации для конъюгирования с другими веществами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), гидроксиэтилированный крахмал (HES), биотин, пептиды или белки.

[0074] В настоящем изобретении, KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид могут быть присоединены или добавлены к другим фрагментам, и такие конъюгаты называются «конъюгатами KLK5-ингибирующего пептида», «конъюгатами KLK5/KLK7-ингибирующего пептида» или «конъюгатами KLK5/KLK14-ингибирующего пептида», соответственно. В настоящем изобретении, термин «конъюгаты» означает молекулы, образованные другими группами, связывающимися с пептидом согласно изобретению или с его фрагментом. «Конъюгаты» или «конъюгирование» включают фрагменты, присоединенные к N-концу и/или C-концу или связанные с N-концом и/или C-концом пептида согласно изобретению посредством химического вещества, такого как перекрестносшивающий агент или посредством активного вещества или т.п., которые являются подходящими для связывания фрагментов с боковой цепью аминокислоты, с применением метода химического синтеза или метода генной инженерии или т.п. Пример таких «фрагментов», которые увеличивают время полужизни в крови, может включать молекулы полиалкиленгликоля, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), гидроксиэтилированный крахмал (HES), молекулы жирных кислот, такие как пальмитиновая кислота, Fc-область иммуноглобулина (например, Fc-область человеческого иммуноглобулина IgG1: ее аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 87, фигура 95), домен CH3 иммуноглобулина, домен CH4 иммуноглобулина, альбумин или его фрагмент, пептиды, связывающиеся с альбумином, белки, связывающиеся с альбумином, такие как стрептококковый G-белок и трансферрин. Что касается других «фрагментов», то пептид согласно изобретению может быть присоединен к таким «фрагментам» посредством линкера, такого как пептидный линкер.

[0075] В одном из аспектов настоящего изобретения, такой конъюгат представляет собой гибрид мутантного пептида SPINK2 согласно изобретению с Fc-областью антитела или его фрагмента. Примеры источника антитела могут включать человека и животных, не являющихся человеком, включая грызунов, таких как мыши, крысы и кролики; других млекопитающих, таких как коровы, свиньи, собаки, собакоподобные обезьяны, игрунки и макак-резусы, и птиц, таких как куры, однако, предпочтительными антителами являются антитела, взятые у человека. Примеры антител могут включать IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и IgE, а предпочтительно IgG1. Более предпочтительно, конъюгат представляет собой гибрид пептида согласно изобретению с Fc-областью человеческого IgG1 или его фрагмента. Хотя гибрид пептида согласно изобретению с Fc-областью антитела или его фрагмента может называться «Fc-гибридом» или «конъюгатом», однако, все они имеют одно и то же значение.

[0076] Примеры Fc-области человеческого IgG1 могут включать область, содержащую аминокислотную последовательность или состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 87 (фигура 95), однако, они не имеет конкретных ограничений. Fc-область антитела может быть областью дикого типа или мутантного типа.

[0077] Кроме того, KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид согласно изобретению могут быть конъюгированы с другим лекарственным средством для обеспечения или усиления фармакологической активности. Способы и аспекты, известные специалистам в области получения конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), относящейся к области антител, могут составлять некоторые аспекты настоящего изобретения путем замены антитела пептидом согласно изобретению.

[0078] KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид согласно изобретению, могут дополнительно содержать один или более фрагментов, обладающих аффинностью связывания, ингибирующнй активностью, антагонистической активностью и агонистической активностью по отношению к молекулам-мишеням, отличающимся от KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, соответственно, или они могут быть конъюгированы с такими фрагментами. Примеры таких «фрагментов» могут включать антитела или их фрагменты, а также белки, имеющие остов, не являющийся антителом, такие как мутант SPINK2 или его фрагменты. Способы и аспекты, известные специалистам в области получения мультиспецифических антител и биспецифических антител, относящейся к области антител, могут составлять некоторые аспекты конъюгата согласно изобретению путем замены по меньшей мере одного из двух или более «антител», содержащихся в этом конъюгате, пептидом согласно изобретению.

[0079] Пептид, ингибирующий KLK5, пептид, ингибирующий KLK5/KLK7 или пептид, ингибирующий KLK5/KLK14 согласно изобретению или его предшественник могут содержать сигнальную последовательность. Сигнальная последовательность, которая присутствует у N-конца полипептида или его предшественника или добавлена к нему, является подходящей для доставки полипептида в конкретный компартмент клетки, такой как периплазма в случае Escherichia coli и эндоплазматический ретикулум в случае эукариотических клеток. Многие сигнальные последовательности известны специалистам в данной области и могут быть выбраны в зависимости от клеток-хозяев. Примеры сигнальной последовательности для секреции нужного пептида в периплазму Escherichia coli могут включать OmpA. Вариант, содержащий такую сигнальную последовательность, может быть также включен в конъюгат согласно изобретению в качестве аспекта изобретения.

[0080] Кроме того, пептид может быть очищен с помощью аффинной хроматографии путем предварительного присоединения метки к пептиду, ингибирующему KLK5, пептиду, ингибирующему KLK5/KLK7 или пептиду, ингибирующему KLK5/KLK14 согласно изобретению.

[0081] Пептид согласно изобретению, например, может содержать биотин, метку Strep (R), метку Strep II (R), олигогистидины, такие как His6, полигистидины, домены иммуноглобулина, белки, связывающиеся с мальтозой, глутатион-S-трансферазы (GST), кальмодулин-связывающие пептиды (CBP), гаптены, такие как дигоксигенин и динитрофенол, эпитопные метки, такие как FLAG®, метка myc, метка HA и т.п. (которые далее будут называться общим термином «аффинные метки») у С-конца. Продукты присоединения метки могут быть также включены в конъюгат согласно изобретению в качестве некоторых аспектов. Конъюгат согласно изобретению в целом может быть пептидом (полипептидом).

[0082] KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид согласно изобретению могут содержать фрагменты для мечения и могут быть специфически конъюгированы с фрагментами для мечения, такими как ферментные метки, радиоактивные метки, цветные метки, флуоресцентные метки, хромогенные метки, люминесцентные метки, гаптены, дигоксигенин, биотин, комплексы металлов, металлы и коллоидное золото. Аспект, включающий фрагменты для мечения, может быть также включен в конъюгат согласно изобретению в качестве некоторых аспектов.

[0083] Примерами аминокислотной последовательности конъюгата KLK5-ингибирующего пептида, конъюгата KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или конъюгата KLK5/KLK14-ингибирующего пептида согласно изобретению могут быть любые из аминокислотных последовательностей (a1)-(a4), (b1)-(b4) или (c1)-(c4) представленные ниже:

(a1) аминокислотная последовательность, представленная в любой из SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 и 96 (Фигуры 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 и 106);

(a2) аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, описанную в (a1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5-ингибирующей активностью;

(а3) аминокислотная последовательность, образованная посредством замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, 1 до 3, 1 или 2 или 1 аминокислоты в аминокислотной последовательности, описанной в (a1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5-ингибирующей активностью; и

(а4) аминокислотная последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична аминокислотной последовательности, описанной в (a1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5-ингибирующей активностью,

(b1) аминокислотная последовательность, представленная в любой из SEQ ID NO: 50, 52, 54 и 56 (фигуры 58, 60, 62 и 64);

(b2) аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, описанную в (b1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью;

(b3) аминокислотная последовательность, образованная посредством замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, 1 до 3, 1 или 2 или 1 аминокислоты в аминокислотной последовательности, описанной в (b1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью; и

(b4) аминокислотная последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична аминокислотной последовательности, описанной в (b1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью; или

(c1) аминокислотная последовательность, представленная в любой из SEQ ID NO: 58 и 60 (Фигуры 66 и 68);

(с2) аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, описанную в (с1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью;

(с3) аминокислотная последовательность, образованная посредством замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, 1 до 3, 1 или 2 или 1 аминокислоты в аминокислотной последовательности, описанной в (с1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью; и

(с4) аминокислотная последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична аминокислотной последовательности, описанной в (с1) и содержащейся в пептиде, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью.

[0084] Пептид, ингибирующий KLK5, пептид, ингибирующий KLK5/KLK7 или пептид, ингибирующий KLK5/KLK14 согласно изобретению (его аминокислотная последовательность), могут содержать как природные аминокислоты, так и неприродные аминокислоты. Природные аминокислоты могут включать L-аминокислоты и D-аминокислоты.

[0085] KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид согласно изобретению, могут существовать в виде мономера, димера, тримера или олигомера более высокого порядка или мультимера. Димер, тример или олигомер более высокого порядка и мультимер могут представлять собой либо гомомер, состоящий из мономеров одного типа, либо гетеромер, состоящий из мономеров двух или более различных типов. Мономер может быстро диффундировать и, например, легко проникать в ткани. Димер, олигомер и мультимер могут иметь превосходные свойства, такие как высокая локальная аффинность или активность связывания с молекулами-мишенями, низкая скорость диссоциации или высокая активность ингибирования KLK5, активность ингибирования KLK5/KLK7 или активность ингибирования KLK5/KLK14. Помимо спонтанной димеризации, олигомеризации и мультимеризации, нацеленная димеризация, олигомеризация и мультимеризация также могут быть достигнуты путем введения домена jun-fos, лейциновой молнии или т.п. в пептид согласно изобретению.

[0086] KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид, или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид согласно изобретению в форме мономера, димера, тримера или олигомера более высокого порядка или мультимера могут связываться с одной или более молекулами-мишенями или ингибировать активность молекул-мишеней.

[0087] Примеры формы KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида согласно изобретению могут включать выделенные формы (такие как лиофилизованные препараты и растворы), вышеупомянутые конъюгаты и формы, связанные с другими молекулами (такие как иммобилизованные формы, формы, ассоциированные с чужеродными молекулами, и формы, связанные с молекулами-мишенями), однако, эти примеры не имеет конкретных ограничений, и может быть выбрана, но необязательно, форма, подходящая для экспрессии, очистки, применения, хранения или т.п..

[0088] 3. Идентификация KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида и KLK5/KLK14-ингибирующего пептида.

KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид, могут быть идентифицированы способами, известными специалистам в данной области, с использованием аминокислотной последовательности SPINK2 или аминокислотной последовательности KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида, или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида согласно изобретению (например, аминокислотных последовательностей согласно (a1), (b1) или (c1), описанным выше), нуклеотидной последовательности, кодирующей такую аминокислотную последовательность, молекул нуклеиновой кислоты, содержащих такую нуклеотидную последовательность, и т.п. в качестве исходных материалов. В качестве подходящего примера, такая идентификация может быть проведена из библиотеки человеческих мутантов SPINK2 исходя из KLK5-ингибирующей активности, KLK5/KLK7-ингибирующей активности или KLK5/KLK14-ингибирующей активности, соответственно, в качестве показателя, и активности связывания с KLK5, KLK5/KLK7 или KLK5/KLK14 могут быть объединены для их соответствующего применения в качестве показателя.

[0089] Так, например, молекулы нуклеиновой кислоты, служащие исходным материалом, могут быть подвергнуты мутагенезу и введены соответствующему бактериальному или эукариотическому хозяину с применением технологии рекомбинантных ДНК. Библиотека мутантов SPINK2 известна как метод идентификации связывающей молекулы или ингибитора молекулы-мишени. Так, например, описание, приведенное в публикации Международной заявки No. WO 2014/024914, также включено в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки. После того, как нуклеотидная последовательность, подвергнутая мутагенезу, экспрессировалась в соответствующем хозяине, клон, образованный посредством связывания мутанта SPINK2, обладающего нужными свойствами, активностью, функциями и т.п., вместе с его генетическим признаком, может быть сконцентрирован и/или выбран из библиотеки, для его идентификации. Для концентрирования и/или отбора клона могут быть применены методы, известные специалистам в данной области, такие как метод бактериального представления (Francisco, JA, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 90, pp. 10444-10448), метод дрожжевого представления (Boder, E.T., et al. (1997) Nat. Biotechnol., Vol. 15, pp. 553-557), метод представления на клетках млекопитающих (Ho M, et al. (2009) Methods Mol Biol., Vol. 525, pp. 337-352), метод фагового представления (Smith, G.P. (1985) Science., Vol. 228, pp. 1315-1317), метод рибосомного представления (Mattheakis LC, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 91, No. 19, pp. 9022-9029), метод нуклеиновокислотного представления (Nemoto N, et al. (1997) FEBS Lett., Vol. 414, No. 2, pp. 405-408), такой как представление мРНК и метод скрининга колоний (Pini, A. et al. (2002) Comb. Chem. High Throughput Screen., т. 5, рр. 503-510). Затем определяют нуклеотидную последовательность мутанта SPINK2, содержащуюся в отобранном и идентифицированном таким образом клоне. Таким образом, аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидной последовательностью, может быть определена как аминокислотная последовательность мутанта SPINK2, то есть, KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида, или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида, содержащегося в клоне.

[0090] Мутант SPINK2 согласно изобретению может быть получен, например, путем мутагенеза природного SPINK2. «Мутагенез» означает замену или делецию одной или более аминокислот, присутствующих в некоторых положениях аминокислотной последовательности, другими аминокислотами, или инсерцию аминокислот, которые не присутствуют в аминокислотной последовательности. Такая делеция или инсерция может изменять длину последовательности. В мутанте SPINK2 согласно изобретению, мутагенез может предпочтительно происходить в одном или более положениях X₁-X₁₂ в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 61 (фигура 69).

[0091] Однако, в объем термина «мутант» также входят мутанты, которые имеют те же аминокислоты, которые присутствуют в определенных положениях в природной аминокислотной последовательности, то есть, природная аминокислотная последовательность сохраняется в одном или более положениях X₁ - X₁₂ после такого подходящего мутагенеза, при условии, что по меньшей мере одна аминокислота будет полностью мутирована. Аналогичным образом, в этом аспекте настоящего изобретения, в объем термина «мутант» также входят мутанты, которые имеют те же аминокислоты, которые присутствуют в определенных положениях в природной аминокислотной последовательности, то есть, природная аминокислотная последовательность сохраняется в одном или более положениях во фрагменах, отличающихся от X₁-X₁₂, после индуцирования такой мутации в этих положениях, при условии, что по меньшей мере одна аминокислота будет полностью мутирована.

[0092] Термин «неспецифический мутагенез» означает, что одну или более различных аминокислот вводят в определенные положения последовательности посредством мутагенеза с определенной вероятностью, но не все вероятности введения аминокислот могут быть одинаковыми. Кроме того, в настоящем изобретении, включение природной аминокислоты (в качестве одной из аминокислот) в положениях по меньшей мере двух различных аминокислот не может быть предотвращено, и такой случай также входит в объем термина «неспецифический мутагенез».

[0093] Что касается метода неспецифического мутагенеза в определенных положениях, то могут быть применены стандартные методы, известные специалистам в данной области. Так, например, мутации могут быть индуцированы в определенных положениях последовательности посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции) с использованием смеси синтетических олигонуклеотидов, содержащих вырожденный нуклеотидный состав. Так, например, использование кодона NNK или NNS (N=аденин, гуанин, цитозин или тимин; K=гуанин или тимин; S=аденин или цитозин) индуцирует мутацию для введения стоп-кодона в дополнение ко всем 20 природным аминокислотам, тогда как использование кодона VVS (V=аденин, гуанин или цитозин) исключает возможность введения Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr и Val и индуцирует мутацию с введением других 12 природных аминокислот. Кроме того, использование кодона NMS (M=аденин или цитозин) исключает возможность введения Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp и Val и индуцирует мутацию с введением, например, других 11 природных аминокислот. Специальные кодоны, искусственные кодоны или т.п. могут быть использованы для индуцирования мутации с введением неприродных аминокислот.

[0094] Сайт-специфический мутагенез также может быть осуществлен исходя из структурной информации, содержащей структуру мишени более высокого порядка и/или пептида против этой мишени или пептида дикого типа, от которого происходит этот пептид. В настоящем изобретении, сайт-специфическая мутация может быть введена исходя из структурной информации, содержащей информацию более высокого порядка о KLK5-, KLK7- или KLK14-мишени, и/или о мутанте SPINK2, SPINK2 дикого типа или их комплексе, в отношении его связывания с KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14. Могут иметь место случаи, когда на основе результатов анализа может быть обнаружена корреляция между KLK5-ингибирующей активностью, KLK5/KLK7-ингибирующей активностью или KLK5/KLK14-ингибирующей активностью и структурной информацией, полученной, например, путем идентификации мутанта SPINK2, обладающего KLK5-ингибирующей активностью, KLK5/KLK7-ингибирующей активностью или KLK5/KLK14-ингибирующей активностью, с последующим получением кристаллов KLK5, KLK7 или KLK14 и комплекса мутантов SPINK2 для проведения рентгеноструктурного анализа и определения эпитопа на молекуле KLK5, KLK7 или KLK14, с которой связывается мутант SPINK2, и паратопа на мутанте SPINK2, соответствующий эпитопу. На основе корреляции структура-активность, замену конкретными аминокислотами в определенных положениях, или инсерцию, или делецию аминокислот в определенных положениях и т.п. осуществляют таким образом, чтобы можно было подтвердить KLK5-ингибирующую активность, KLK5/KLK7-ингибирующую активность или KLK5/KLK14-ингибирующую активность.

[0095] Кроме того, мутации могут быть индуцированы, например, с использованием нуклеотидной составной единицы, которая изменяет специфичность пар оснований, такой как инозин.

[0096] Кроме того, мутации могут быть индуцированы в произвольных положениях, например, посредством ПЦР с вероятностью ошибки с использованием ДНК-полимеразы с высокой вероятностью ошибки без функции корректирующего считывания, такой как ДНК-полимераза Taq, или посредством химического мутагенеза и т.п.

[0097] KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид может быть сконцентрирован и/или выбран из подходящих библиотек, таких как фаговая библиотека и библиотека колоний, известных специалистам в данной области, с применением соответствующего метода скрининга с использованием бактериального представления, дрожжевого представления, представления на клетках млекопитающих, фагового представления, рибосомного представления, нуклеиновокислотного представления, скрининга колоний или т.п. С использованием векторов и методов, известных специалистам в данной области, которые являются подходящими для соответствующих библиотек, таких как фагмида для фаговой библиотеки и космида для скрининга колоний в этих библиотеках, может быть осуществлено конструирование библиотек. Векторы могут представлять собой вирусы, инфицирующие прокариотические или эукариотические клетки, или вирусные векторы. Такие рекомбинантные векторы могут быть получены способами, известными специалистам в данной области, такими как генная инженерия.

[0098] Бактериальное представление представляет собой, например, метод присоединения нужного белка к части липопротеина внешней мембраны (Lpp) Escherichia coli и белка внешней мембраны OmpA для презентации нужного белка на поверхности Escherichia coli. Группу ДНК, полученную посредством неспецифического мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность белка, вводят в векторы, подходящие для бактериального представления, в целях трансформации бактериальных клеток с помощью векторов. Таким образом, библиотека, презентирующая неспецифически мутагенизированную белковую группу, может быть получена на поверхности трансформированных бактериальных клеток (Francisco, JA, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 90, pp. 10444-10448).

[0099] Дрожжевое представление представляет собой метод присоединения нужного белка к белку, такому как α-агглютинин, на внешней оболочке поверхности дрожжевой клетки, для его презентации на поверхности дрожжей. α-Агглютинин содержит C-концевую гидрофобную область, которая, как считается, является сигналом прикрепления гликозилфосфатидилинозитного якоря (GPI), сигнальной последовательностью, активным доменом, доменом клеточной стенки и т.п., и нужный белок может быть презентирован на поверхности дрожжевой клетки путем их трансформации. Группу ДНК, полученную посредством неспецифического мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность белка, вводят в векторы, подходящие для дрожжевого представления в целях трансформации дрожжевых клеток с помощью векторов. Таким образом, библиотека, презентирующая неспецифически мутагенизированную белковую группу, может быть получена на поверхности трансформированных дрожжевых клеток (Ueda, M. & Tanaka, A., Biotechnol. Adv., Vol. 18, pp. from 121, published in 2000; Ueda, M. & Tanaka, A., J. Biosci. Bioeng., Vol. 90, pp. from 125, published in 2000).

[0100] Представление на клетках животных означает, например, метод присоединения нужного белка к трансмембранной области мембранного белка, типичным примером которого является рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), для презентации нужного белка на поверхности клетки млекопитающего, такой как HEK293 и клетки яичника китайского хомячка (CHO). Группу ДНК, полученную посредством неспецифического мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность белка, вводят в векторы, подходящие для представления на клетках животных, для трансфекции клеток животных этими векторами. Таким образом, библиотека, презентирующая неспецифически мутагенизированную белковую группу, может быть получена на поверхности трансфецированных клеток животных (Ho M., et al. (2009) Methods Mol Biol., Vol. 525, pp. 337-352).

[0101] Нужная библиотека, презентированная на клетках, таких как клетки дрожжей, бактерий и животных, может быть инкубирована в присутствии молекул-мишеней или подвергнута контактированию с молекулами-мишенями. Так, например, после инкубирования клетки, содержащей библиотеку и KLK5, KLK7 или KLK14, модифицированных биотином или т.п., в течение определенного времени, добавляют носитель, такой как магнитные сферы, после чего, клетку отделяют от носителя, а затем носитель промывают для удаления неспецифических адсорбатов и связывающих агентов. Таким образом, может быть собрана группа клеток, презентирующих пептид, связанный с носителем (или KLK5, KLK7 или KLK14, связанные с носителем), набор пептидов или набор концентрированных пептидов. Аналогичным образом, группа клеток, презентирующих пептид, связанный с носителем (или KLK5, KLK7 или KLK14, связанные с носителем), или KLK5, KLK7 или KLK14, набор пептидов или набор концентрированных пептидов, может быть собрана путем магнитного разделения клеток (MACS) после добавления магнитных сфер или проведения FACS после окрашивания клеток с использованием анти-KLK5 антитела, анти-KLK7 антитела или анти-KLK14 антитела. Неспецифические сайты адсорбата и/или сайты связывания могут быть подвергнуты, например, блокирующей обработке, и может быть проведена стадия блокирования, если это необходимо. Затем собирают полученный таким образом вектор, экспрессирующий пептид, набор пептидов или набор концентрированных пептидов, и определяют нуклеотидную последовательность полинуклеотида, встроенного в вектор, так, чтобы можно было определить аминокислотную последовательность, кодируемую этой нуклеотидной последовательностью. Кроме того, набор пептидов, связывающихся с молекулами-мишенями, может быть более концентрированным посредством повторного введения вектора в клетку-хозяина и повторения вышеупомянутой процедуры в виде цикла, проводимого один или более раз.

[0102] В случае фагового представления, фагмида представляет собой, например, бактериальную плазмиду, содержащую второй ориджин репликации, происходящий от одноцепочечного бактериофага и отличающйся от ориджина репликации плазмиды. Клетка, содержащая фагмиду, может реплицировать фагмиду посредством одноцепочечной репликации в результате суперинфицирования M13 или аналогичным хелперным бактериофагом. То есть, одноцепочечная фагмидная ДНК упакована в инфекционные частицы, покрытые белком оболочки бактериофага. Таким образом, фагмидная ДНК может быть образована в инфицированных бактериях в виде клонированной двухцепочечной плазмидной ДНК, а фагмида может быть образована в виде бактериофаг-подобных частиц из супернатанта культуры суперинфицированной клетки. Сами частицы могут быть преобразованы как плазмиды путем инъекции бактериофаг-подобных частиц в бактерии, имеющие F-ворсинки, для инфицирования бактерий такой ДНК.

[0103] Гибридный ген, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность тестируемого пептида, и ген белка оболочки бактериофага, встраивают в фагмиду для инфицирования бактерий, и такие клетки культивируют. Таким образом, пептид может быть экспрессирован или презентирован (то есть представлен) на бактериях или на фагоподобных частицах, либо он может быть получен в виде гибридного белка с белком оболочки в фаговых частицах или в супернатанте культуры бактерий.

[0104] Так, например, пептид может быть получен в супернатанте культуры Escherichia coli в виде гибридного белка, содержащего пептид и белок оболочки, путем встраивания гибридного гена, содержащего полинуклеотид и ген белка оболочки бактериофага gpIII, в фагмиду для суперинфицирования Escherichia coli под действием M13 или аналогичного хелперного фага.

[0105] В случае использования различных циклических или нециклических векторов, таких как вирусный вектор, вместо фагмиды, пептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью полинуклеотида, встроенного в такой вектор, может быть экспрессирован или презентирован на клетке, в которую вводят этот вектор, или на вирусоподобных частицах, либо он может быть получен в супернатанте культуры клетки в соответствии с методами, известными специалистам в данной области.

[0106] Библиотека, экспрессирующая полученный таким образом пептид, может быть инкубирована в присутствии молекул-мишеней, либо она может быть подвергнута контактированию с молекулами-мишенями. Так, например, носитель, на котором иммобилизованы KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14, инкубируют в течение определенного периода времени вместе с подвижной фазой, содержащей библиотеку, а затем подвижную фазу отделяют от носителя, после чего носитель промывают для удаления неспецифических адсорбатов и связывающих агентов. Таким образом, пептид, связанный с носителем (или с KLK5, KLK5 и/или KLK7, или с KLK5 и/или KLK14, связанными с носителем), набор пептидов или набор концентрированных пептидов могут быть собраны путем элюирования. Элюирование может быть осуществлено неселективно при относительно высокой ионной силе, при низком pH и в умеренных условиях денатурации в присутствии хаотропных солей и т.п., либо оно может быть осуществлено селективно путем добавления растворимых молекул-мишеней, таких как KLK5, KLK7 и KLK14, антитела, которые связываются с молекулами-мишенями, природные лиганды, субстраты и т.п., для того, чтобы смесь конкурировала за связывание с иммобилизованными молекулами-мишенями. Неспецифические сайты адсорбата и/или сайты связывания могут быть подвергнуты, например, блокирующей обработке, и если это необходимо, может быть включена стадия блокирования.

[0107] Вектор, экспрессирующий пептид, набор пептидов или набор концентрированных пептидов, полученных таким образом, собирают и определяют нуклеотидную последовательность полинуклеотида, встроенного в вектор, так, чтобы можно было определить аминокислотную последовательность, кодируемую этой нуклеотидной последовательностью. Кроме того, набор пептидов, связывающихся с молекулами-мишенями, может быть более концентрированным посредством повторного введения вектора в клетку-хозяина и повторения вышеупомянутой процедуры в виде цикла, проводимого один или более раз.

[0108] Рибосомное представление означает метод синтеза нужного белка и соответствующей ему мРНК, и молекулы, связанной с рибосомой в тест-пробирке, например, с использованием мРНК, кодирующей нужный белок, не содержащий кодона терминации, и с использованием бесклеточной системы синтеза белка. Библиотека, презентирующая неспецифически мутагенизированную белковую группу на рибосомах, может быть получена с использованием группы мРНК, продуцируемой посредством неспецифического мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность белка, и с использованием бесклеточной системы синтеза белка (Mattheakis LC, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 91, No. 19, pp. 9022-9029).

[0109] Нуклеиновокислотное представление также называется мРНК-представлением и означает метод синтеза нужного белка, мРНК, кодирующей белок, и молекулы, связанной с рибосомой, например, с использованием линкера, такого как пуромицин, который имеет структуру, аналогичную 3'-концу тирозил-тРНК. Поскольку в этом методе вместо живых клеток используется бесклеточная система синтеза белка, то этот синтез может быть проведен в тест-пробирке. Библиотека, презентирующая неспецифически мутагенизированную белковую группу на рибосомах, может быть получена с использованием группы мРНК, продуцируемой посредством неспецифического мутагенеза нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность белка, линкера, такого как пуромицин, и с использованием бесклеточной системы синтеза белка (Nemoto N et al., (1997) FEBS Lett., Vol. 414, No. 2, pp. 405-408).

[0110] Библиотека, полученная с использованием системы бесклеточного синтеза, такой как рибосомное представление или нуклеиновокислотное представление, и экспрессирующая пептид, может быть инкубирована в присутствии молекул-мишеней, либо она может быть подвергнута контактированию с молекулами-мишенями. Так, например, носитель, на котором иммобилизованы KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14, инкубируют в течение определенного периода времени вместе с подвижной фазой, содержащей библиотеку, а затем подвижную фазу отделяют от носителя, после чего носитель промывают для удаления неспецифических адсорбатов и связывающих агентов. Таким образом, пептид, связанный с носителем (или с KLK5, KLK5 и/или KLK7, или с KLK5 и/или KLK14, связанными с носителем), набор пептидов или набор концентрированных пептидов могут быть собраны путем элюирования. Элюирование может быть осуществлено неселективно при относительно высокой ионной силе, при низком pH и в умеренных условиях денатурации в присутствии хаотропных солей и т.п., либо оно может быть осуществлено селективно путем добавления растворимых молекул-мишеней, таких как KLK5, KLK7 и KLK14, антитела, которые связываются с молекулами-мишенями, природные лиганды, субстраты и т.п., для того, чтобы смесь конкурировала за связывание с иммобилизованными молекулами-мишенями. Неспецифические сайты адсорбата и/или сайты связывания могут быть подвергнуты, например, блокирующей обработке, и если это необходимо может быть включена стадия блокирования.

[0111] Нуклеиновые кислоты, экспрессирующие пептид, набор пептидов или набор концентрированных пептидов, полученных таким образом, собирают и определяют нуклеотидную последовательность после обратной транскрипции в кДНК в случае мРНК, так, чтобы можно было определить аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью. Кроме того, набор пептидов, связывающихся с молекулами-мишенями, может быть более концентрированным посредством транскрипции мРНК из полученных таким образом нуклеиновых кислот и повторения вышеупомянутой процедуры в виде цикла, проводимого один или более раз.

[0112] Пептид или набор пептидов могут быть эффективно очищены путем предварительного конъюгирования аффинной метки с пептидом, набором пептидов или набором концентрированных пептидов. Так, например, пептид может быть предварительно элюирован путем конъюгирования субстрата протеазы в качестве метки с набром пептидов с последующим его отщеплением под действием протеазной активности.

[0113] Исходя из полученной информации о последовательности и функциях или т.п. пептида, дальнейшие мутации индуцируют в полученном клоне или в полученной библиотеке, так, чтобы из библиотеки, в которую была введена такая мутация, можно было получить пептид с улучшенными функциями (например, с KLK5-ингибирующей активностью, KLK5/KLK7-ингибирующей активностью или KLK5/KLK14-ингибирующей активностью), с улучшенными физическими свойствами (такими как термостабильность и стабильность при хранении), с улучшенной фармакокинетикой (такой как распределение и время полужизни в крови) и т.п.

[0114] KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид могут быть идентифицированы путем определения того факта, обладает ли полученный пептид KLK5-ингибирующей активностью, KLK5/KLK7-ингибирующей активностью или KLK5/KLK14-ингибирующей активностью, соответственно.

[0115] Кроме того, KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид могут предпочтительно сохранять трехмерную структуру, образованную петлевой структурой, состоящей из Ser16-Val30, содержащейся в аминокислотной последовательности SPINK2 дикого типа; β-складку, состоящую из β-цепи (1), состоящей из Cys31 и Gly32, и β-цепи (2), состоящей из Ile57-Arg59; и α-спираль, состоящую из Glu41-Gly51, или петлевую структуру, β-складку и α-спираль, которые подобны или по меньшей мере частично соответствуют указанным выше структурам (их положениям), в той степени, в которой может быть достигнута KLK5-ингибирующая активность, KLK5/KLK7-ингибирующая активность, или KLK5/KLK14-ингибирующая активность. Также могут быть идентифицированы более подходящий KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид с использованием такой трехмерной структуры (всей структуры или частичной структуры) как часть показателя.

[0116] Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации KLK5-ингибирующего пептида, KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или KLK5/KLK14-ингибирующего пептида с использованием библиотеки мутантных SPINK2, и примеры такого способа могут включать способ, описанный выше в (75). Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации KLK5-ингибирующего соединения, KLK5/KLK7-ингибирующего соединения, или KLK5/KLK14-ингибирующего соединения, с использованием библиотек различных соединений. В таком способе, пептид согласно изобретению или его конъюгат могут быть использованы в качестве эталонного соединения, контроля или т.п., и такой способ проиллюстрирован выше в (76). В этом способе, тестируемое соединение может быть определено как позитивное, если активность соединения в отношении ингибирования фермента эквивалентна или превышает активность эталонного соединения или контроля в отношении ингибирования ферментов, тогда как соединение может быть определено как негативное, если активность ингибирования фермента является более низкой. Способ, включающий такое сравнение, проиллюстрирован выше в (77). При этом пептид согласно изобретению или его конъюгат могут быть использованы в качестве эталонного соединения, контроля или т.п. в любом анализе, включающем стадию оценки протеазной активности KLK5 и, необязательно, KLK7 или KLK14, и такой способ анализа также включен в настоящее изобретение. Такой анализ не имеет конкретных ограничений и может быть таким, как он был проиллюстрирован выше в (78). Подходящие примеры таких анализов могут включать метод диагностики, метод тестирования, метод детектирования и метод идентификации индивидуума, которому должна быть введена фармацевтическая композиция согласно изобретению (все это будет описано ниже).

[0117] 4. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептид согласно изобретению или его конъюгат; вектор, содержащий эти молекулы; клетка, содержащая эти молекулы; и способ получения рекомбинантного пептида или конъюгата.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в KLK5-ингибирующем пептиде, KLK5/KLK7-ингибирующем пептиде или KLK5/KLK14-ингибирующем пептиде (которые далее будут называться «молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими KLK5-ингибирующий пептид», «молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими KLK5/KLK7-ингибирующий пептид», или «молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими KLK5/KLK14-ингибирующий пептид»), к рекомбинантному вектору с таким встроенным геном, к клетке со встроенным в нее геном или введенным вектором (которая далее будет называться «клеткой, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5-ингибирующий пептид», «клеткой, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5/KLK7-ингибирующий пептид» или «клеткой, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5/KLK14-ингибирующий пептид»), к клетке, которая продуцирует KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид (которая далее будет называться «клеткой, продуцирующей KLK5-ингибирующий пептид», «клеткой, продуцирующей KLK5/KLK7-ингибирующий пептид», или «клеткой, продуцирующей KLK5/KLK14-ингибирующий пептид»).

[0118] Подходящие примеры молекул нуклеиновых кислот, кодирующих KLK5-ингибирующий пептид, молекул нуклеиновых кислот, кодирующих KLK5/KLK7-ингибирующий пептид, или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих KLK5/KLK14-ингибирующий пептид согласно изобретению, могут включать молекулы, содержащие нуклеотидную последовательность, описанную в любой из нижеуказанных (a1)-(a4), (b1)-(b4) или (c1)-(c4) (которые далее будут называться «нуклеотидной последовательности KLK5-ингибирующего пептида», «нуклеотидной последовательности KLK5/KLK7-ингибирующего пептида», или «нуклеотидной последовательности KLK5/KLK14-ингибирующего пептида», соответственно), состоящих из нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотидную последовательность KLK5-ингибирующего пептида, нуклеотидную последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида, или нуклеотидную последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида, или состоящих из нуклеотидной последовательности KLK5-ингибирующего пептида, нуклеотидной последовательности KLK5/KLK7-ингибирующего пептида, или нуклеотидной последовательности KLK5/KLK14-ингибирующего пептида:

(a1) нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1-189 в нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот в положениях 1-63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 (Фигуры 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 и 28) или нуклеотидную последовательность, описанную в любой из SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19 (фигуры 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 и 27);

(a2) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной в (a1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5-ингибирующей активностью;

(а3) нуклеотидную последовательность, которая образована в результате замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2 или 1 нуклеотида или нуклеотидного остатка в нуклеотидной последовательности, описанной в (a1), и которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5-ингибирующей активностью; и

(а4) нуклеотидную последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична нуклеотидной последовательности, описанной в (a1) и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5-ингибирующей активностью:

(b1) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот в положениях 1-63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 22, 24, 26 и 28 (Фигуры 14, 30, 32, 34 и 36) или нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1-189 в нуклеотидной последовательности, описанной в любой из SEQ ID NO: 21, 23, 25 и 27 (Фигуры 29, 31, 33 и 35);

(b2) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной в (b1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью;

(b3) нуклеотидную последовательность, которая образована в результате замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2 или 1 нуклеотида или нуклеотидного остатка в нуклеотидной последовательности, описанной в (b1), и которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью; и

(b4) нуклеотидную последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична нуклеотидной последовательности, описанной в (b1) и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью:

(c1) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот в положениях 1-63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 30 и 32 (Фигуры 38 и 40) или нуклеотидную последовательность, состоящую из нуклеотидов 1-189 в нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 29 или 31 (Фигуры 37 или 39);

(с2) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной в (с1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью;

(с3) нуклеотидную последовательность, которая образована в результате замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2 или 1 нуклеотида или нуклеотидного остатка в нуклеотидной последовательности, описанной в (с1), и которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью; и

(с4) нуклеотидную последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична нуклеотидной последовательности, описанной в (с1) и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью.

[0119] Мутантный пептид SPINK2 состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, описанной в любой из вышеуказанных (a1) - (a4), (b1) - (b4), или (c1)-(c4), или содержит аминокислотую последовательность, которая ингибирует протеазную активность KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, и предпочтительно, специфически ингибирует их протеазную активность.

[0120] Нуклеотиды 190-195 в SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 и 31 (Фигуры 13, 15, 17, 19, 21, 23 , 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37 и 39) не являются нуклеотидами, соответствующими нуклеотидам в нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий SPINK2 дикого типа (SEQ ID NO: 1, фигура 9: состоит из 63 аминокислот), но их добавляют для экспрессии пептида согласно изобретению в соответствии с аспектом изобретения.

[0121] Однако, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид, не ограничиваются молекулами, описанными в (a1)-(a4), (b1)-(b4) или (c1)-(c4), и молекулы нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в мутанте SPINK2, обладающем KLK5-ингибирующей активностью, KLK5/KLK7-ингибирующей активностью или KLK5/KLK14-ингибирующей активностью и, предпочтительно, имеющем аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61 (фигура 69), входят в объем термина «молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид».

[0122] Кроме того, настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в конъюгате KLK5-ингибирующего пептида, в конъюгате KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или в конъюгате KLK5/KLK14-ингибирующего пептида (которые далее будут называться «молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими KLK5-ингибирующий конъюгат», «молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими KLK5/KLK7-ингибирующий конъюгат», или «молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими KLK5/KLK14-ингибирующий конъюгат», соответственно), к рекомбинантному вектору с таким встроенным геном, к клетке со встроенным в нее геном или введенным вектором (которая далее будет называться «клеткой, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5-ингибирующий конъюгат», «клеткой, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5/KLK7-ингибирующий конъюгат» или «клеткой, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5/KLK14-ингибирующий конъюгат»), и к клетке, которая продуцирует конъюгат KLK5-ингибирующего пептида, конъюгат KLK5/KLK7-ингибирующего пептида или конъюгат KLK5/KLK14-ингибирующего пептида (которая далее будет называться «клеткой, продуцирующей KLK5-ингибирующий конъюгат», «клеткой, продуцирующей KLK5/KLK7-ингибирующий конъюгат», или «клеткой, продуцирующей KLK5/KLK14-ингибирующий конъюгат», соответственно).

[0123] Подходящие примеры молекул нуклеиновых кислот, кодирующих KLK5-ингибирующий конъюгат, молекул нуклеиновых кислот, кодирующих KLK5/KLK7-ингибирующий конъюгат, или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих KLK5/KLK14-ингибирующий конъюгат согласно изобретению, могут включать, соответственно, молекулы, содержащие нуклеотидную последовательность, описанную в любой из нижеуказанных (a1)-(a4), (b1)-(b4) или (c1)-(c4) (которые далее будут называться «нуклеотидной последовательностью KLK5-ингибирующего конъюгата», «нуклеотидной последовательности KLK5/KLK7-ингибирующего конъюгата», или «нуклеотидной последовательностью KLK5/KLK14-ингибирующего конъюгата», соответственно), состоящих из нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотидную последовательность KLK5-ингибирующего конъюгата, нуклеотидную последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего конъюгата, или нуклеотидную последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего конъюгата, или состоящих из нуклеотидной последовательности KLK5-ингибирующего конъюгата, нуклеотидной последовательности KLK5/KLK7-ингибирующего конъюгата, или нуклеотидной последовательности KLK5/KLK14-ингибирующего конъюгата:

(a1) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 и 96 (Фигуры 42, 44, 46, 48, 50 , 52, 54, 56 и 106), или нуклеотидную последовательность, описанную в любой из SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 и 95 (Фигуры 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 и 105);

(a2) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной в (a1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде или конъюгате, обладающем KLK5-ингибирующей активностью;

(а3) нуклеотидную последовательность, которая образована в результате замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2 или 1 нуклеотида или нуклеотидного остатка в нуклеотидной последовательности, описанной в (a1), и которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде или конъюгате, обладающем KLK5-ингибирующей активностью; и

(а4) нуклеотидную последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична нуклеотидной последовательности, описанной в (a1) и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде или конъюгате, обладающем KLK5-ингибирующей активностью:

(b1) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 50, 52, 54 и 56 (фигуры 58, 60, 62 и 64), или нуклеотидную последовательность, описанную в любой из SEQ ID NO: 49, 51, 53 и 55 (Фигуры 57, 59, 61 и 63);

(b2) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной в (b1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде или конъюгате, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью;

(b3) нуклеотидную последовательность, которая образована в результате замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2 или 1 нуклеотида или нуклеотидного остатка в нуклеотидной последовательности, описанной в (b1), и которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде или конъюгате, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью; и

(b4) нуклеотидную последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична нуклеотидной последовательности, описанной в (b1) и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде или конъюгате, обладающем KLK5/KLK7-ингибирующей активностью:

(c1) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 58 и 60 (фигуры 66 и 68), или нуклеотидную последовательность, описанную в любой из SEQ ID NO: 57 или 59 (Фигуры 66 или 67);

(с2) нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной в (с1), в жестких условиях и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде или конъюгате, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью;

(с3) нуклеотидную последовательность, которая образована в результате замены, делеции, добавления и/или инсерции от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2 или 1 нуклеотида или нуклеотидного остатка в нуклеотидной последовательности, описанной в (с1), и которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде или конъюгате, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью; и

(с4) нуклеотидную последовательность, которая на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентична нуклеотидной последовательности, описанной в (с1) и кодирует аминокислотную последовательность, содержащуюся в пептиде или конъюгате, обладающем KLK5/KLK14-ингибирующей активностью:

[0124] Мутантный пептид SPINK2 состоит из аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, описанной в любой из вышеуказанных (a1)-(a4), (b1)-(b4), или (c1)-(c4), или содержит аминокислотую последовательность, которая ингибирует протеазную активность KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14, а предпочтительно, специфически ингибирует их протеазную активность.

[0125] Однако, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5-ингибирующий пептид, KLK5/KLK7-ингибирующий пептид или KLK5/KLK14-ингибирующий пептид, не ограничиваются молекулами, описанными в (a1)-(a4), (b1)-(b4) или (c1)-(c4), и молекулы нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в конъюгате, содержащем аминокислотную последовательность, присутствующую в мутанте SPINK2, обладающем KLK5-ингибирующей активностью, KLK5/KLK7-ингибирующей активностью или KLK5/KLK14-ингибирующей активностью и, предпочтительно, имеющем аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61 (фигура 69), входят в объем термина «молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5-ингибирующий конъюгат, «молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5/KLK7-ингибирующий конъюгат или «молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5/KLK14-ингибирующий конъюгат».

[0126] Для получения нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, могут быть использованы один или более кодонов, соответствующих определенным аминокислотам. Следовательно, последовательность оснований, кодирующая одну аминокислотную последовательность пептида, может иметь множество вариантов. При выборе таких кодонов, эти кодоны могут быть соответствующим образом выбраны так, чтобы они соответствии кодонам для экспрессии в клетке-хозяине, в которую должен быть введен полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность или вектор, содержащий эту последовательность, или чтобы частота или доля используемого множества кодонов могли быть соответствующим образом скорректированы. Так, например, в случае использования Escherichia coli в качестве клетки-хозяина, нуклеотидная последовательность может быть сконструирована с использованием кодонов, которые часто встречаются в Escherichia coli.

[0127] Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептид согласно изобретению или его конъюгат, могут быть функционально связаны с одной или более регуляторными последовательностями. Термин «Функционально связанный» относится к связанным молекулам нуклеиновой кислоты, которые могут экспрессироваться, или к нуклеотидной последовательности, содержащейся в молекулах, которые могут экспрессироваться. Такая регуляторная последовательность содержит элементы последовательности, включая информацию о регуляции транскрипции и/или регуляции трансляции. Регуляторная последовательность варьируется в зависимости от вида, но обычно, она содержит промотор и 5'-некодирующую последовательность, участвующую в инициации транскрипции и трансляции, такую как прокариотический -35/-10-бокс, последовательность Шайна-Дальгарно, эукариотический ТАТА-бокс, последовательность СААТ и 5'-кэпирующая последовательность. Такая последовательность может включать энхансерный элемент и/или репрессорный элемент и транслируемую сигнальную последовательность, лидерную последовательность и т.п. для доставки природного или зрелого пептида в конкретный компартмент внутри или вне клетки-хозяина. Кроме того, такая регуляторная последовательность может включать 3'-некодирующую последовательность, и эта последовательность может включать элементы, участвующие в терминации транскрипции, полиаденилировании и т.п. Однако, если последовательность, относящаяся к терминации транскрипции, недостаточно функционирует в конкретной клетке-хозяине, то такая последовательность может быть заменена последовательностью, подходящей для данной клетки.

[0128] Примеры промоторной последовательности могут включать промотор tet, промотор lacUV5 и промотор Т7 для прокариотических клеток, а также промотор SV40 и промотор CMV для эукариотических клеток.

[0129] Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептид согласно изобретению или его конъюгат, могут быть выделены или они могут содержаться в векторе или в других носителях для клонирования (которые далее будут называться просто «вектором», таким как плазмида, фагмида, фаг, бакуловирус и космида) или в хромосоме, и такие формы не имеет конкретных ограничений. Вектор может содержать последовательность репликации и регуляторную последовательность, которые являются подходящими для экспрессии в используемых клетках-хозяевах, и селективный маркер, который определяет фенотип, позволяющий проводить отбор клеток, в которые были введены молекулы нуклеиновой кислоты путем трансформации или т.п., помимо регуляторной последовательности.

[0130] Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептид согласно изобретению или его конъюгат, и вектор, содержащий нуклеотидную последовательность пептида согласно изобретению или его конъюгат, могут быть введены методами, известными специалистам в данной области, такими как трансформация, в клетку-хозяина, способную экспрессировать пептид, конъюгат или нуклеотидную последовательность. Клетка-хозяин с введенными в нее молекулами нуклеиновой кислоты или вектором может быть культивирована в условиях, подходящих для экспрессии пептида или нуклеотидной последовательности. Клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической. Примеры прокариотической клетки могут включать Escherichia coli и Bacillus subtilis, а примеры эукариотической клетки могут включать дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, клетки насекомых, такие как SF9 и High5, и клетки животных, такие как клетки HeLa, клетки CHO, клетки COS и NS0. Экспрессируемый пептид согласно изобретению может быть подвергнут нужной посттрансляционной модификации с использованием эукариотической клетки или т.п. в качестве клетки-хозяина. Примеры посттрансляционной модификации могут включать добавление функциональных групп, таких как сахарные цепи, добавление пептидов или белков, изменение химических свойств аминокислот и т.п. Кроме того, нужные модификации могут быть искусственно введены в пептид согласно изобретению или в его конъюгат. Такие модифицированные пептиды или конъюгаты также входят в объем термина «пептид» или «конъюгат» согласно изобретению.

[0131] Настоящее изобретение также относится к способу получения пептида или конъюгата. Этот способ включает стадию 1 культивирования клетки, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5-ингибирующий пептид (или KLK5-ингибирующий конъюгат), или клетки, продуцирующей KLK5-ингибирующий пептид (или KLK5-ингибирующий конъюгат), клетки, содержащей молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5/KLK7-ингибирующий пептид (или KLK5/KLK7-ингибирующий конъюгат), или клетки, продуцирующей KLK5/KLK7-ингибирующий пептид (или KLK5/KLK7-ингибирующий конъюгат), или клетка, содержащая молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие KLK5/KLK14-ингибирующий пептид (или KLK5/KLK14-ингибирующий конъюгат), или клетки, продуцирующей KLK5/KLK14-ингибирующий пептид (или KLK5/KLK14-ингибирующий конъюгат), и/или стадию 2 сбора мутанта SPINK2 из культуры, полученной на стадии 1. Процедуры, известные специалистам в данной области, такие как фракционирование, хроматография и очистка, могут быть проведены в стадии 2. Так, например, может быть проведена очистка с помощью аффинной хроматографии с использованием антитела согласно изобретению или его связывающего фрагмента, которые будут описаны ниже.

[0132] В некоторых аспектах изобретения, пептид или пептид, включенный в конъюгат, имеет внутримолекулярные дисульфидные связи. Может оказаться предпочтительной доставка пептида, имеющего внутримолекулярные дисульфидные связи, в компартмент клетки, имеющий окислительно-восстановительную среду, с использованием сигнальной последовательности или т.п. Окислительная среда может обеспечиваться периплазмой грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, внеклеточной средой грамположительных бактерий и просветом эндоплазматического ретикулума эукариотических клеток или т.п., и в такой среде может инициироваться образование структурных дисульфидных связей. Кроме того, также может быть получен пептид, имеющий внутримолекулярные дисульфидные связи в цитоплазме клетки-хозяина, такой как Escherichia coli. В таком случае, пептид может быть непосредственно получен в растворимой и складчатой форме, либо он может быть собран в форме телец включения, а затем восстановлен in vitro. Кроме того, может быть также выбрана клетка-хозяин, имеющая окислительную внутриклеточную среду, с получением пептида, имеющего внутримолекулярные дисульфидные связи в ее цитоплазме. При этом, если пептид не имеет внутримолекулярной дисульфидной связи, то такой пептид может быть продуцирован в компартменте клетки, имеющем окислительно-восстановительную среду, например, в цитоплазме грамотрицательных бактерий.

[0133] Пептид согласно изобретению или его конъюгат (содержащийся в нем пептидный фрагмент) может быть получен другими способами, известными специалистам в данной области, такими как метод твердофазного пептидного синтеза, описанный Merrifield и др., и химического синтеза, примером которого может служить метод органического химического синтеза пептидов с использованием трет-бутоксикарбонила (Boc), 9-флуоренилметоксикарбонила (Fmoc) или т.п. и трансляция in vitro.

[0134] В некоторых своих аспектах, настоящее изобретение относится к антителу, связывающемуся с пептидом согласно изобретению или с пептидом, содержащимся в конъюгате, и к его связывающему фрагменту. Антитело может представлять собой поликлональное антитело или моноклональное антитело, и такое моноклональное антитело не имеет конкретных ограничений при условии, что оно будет представлять собой иммуноглобулин или его производное. Связывающий фрагмент антитела не имеет конкретных ограничений, при условии, что он будет обладать антигенсвязывающей активностью, то есть, активностью связывания с пептидом. Эти антитела также включают обе или одну из тяжелых цепей и легких цепей или их фрагментов, не содержащих константные области или Fc-области, и конъюгаты с другими белками или веществами для мечения. Такое антитело и его связывающий фрагмент могут быть получены способами, известными специалистам в данной области, и могут быть использованы для очистки пептида с помощью аффинной хроматографии, для детектирования пептида в клинических испытаниях, для диагностики или для других применений, относящихся к фармацевтической композиции, содержащей пептид или к его использованию, для иммунологического анализа и т.п. Антитело согласно изобретению или его связывающий фрагмент могут быть очищены с помощью аффинной хроматографии с использованием пептида согласно изобретению, с которым связывается антитело или его фрагмент.

[0135] 5. Фармацевтическая композиция.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид согласно изобретению или его конъюгат.

[0136] Фармацевтическая композиция, содержащая пептид согласно изобретению или его конъюгат, может быть использована для лечения и/или профилактики различных заболеваний, которые индуцируются или обостряются под действием KLK5 (которые далее будут называться «заболеваниями, ассоциированными с KLK5» или «KLK5-ассоциированными заболеваниями»), и в которых подавление такого индуцирования или обострения, выздоровление, устранение или ослабление симптомов, предотвращение вторичных заболеваний и т.п. возможно благодаря ингибированию или подавлению экспрессии или функций KLK5. Примерами заболеваний, ассоциированными с KLK5, могут быть синдром Нетертона (Furio, L., et al. (2015) PLoS. Genet., Vol. 11, p. E1005389), атопический дерматит (Fortugno, P., et al. (2012) Hum. Mol. Genet., Vol. 21, pp. 4187-4200), розацея (Yamasaki, K., et al. (2007) Nat. Med., Vol. 13, pp. 975-980), УФ-индуцированное повреждение кожи (Nin, M., et al. (2009) J. Dermatol. Sci., Vol. 54, pp. 17-24), псориаз (Komatsu, N., et al. (2007) Br. J. Dermatol., Vol. 156, pp. 875-883), астма (Grunberg, M., et al. (2018) Eur. J. Immunol., Vol. 48, pp. 1592-1594), повреждение спинного мозга (Radulovic , M., et al. (2013) J. Neuropathol. Exp. Neurol., Vol. 72, pp. 1072-1089), рак (такой как рак матки, уротелиальный рак мочевого пузыря, рак прямой и ободочной кишки, плоскоклеточная карцинома полости рта, рак молочной железы, рак головы и шеи, меланома, рак предстательной железы и глиома) (Emami, N., et al. (2007) Mol. Oncol., Vol. 1, pp. 269-287) и эзофагит Барретта (Gene Expression Omnibus, номер доступа GSE13083), но эти примерны не имеет конкретных ограничений.

[0137] Считается, что KLK5 является главным фактором, ответственным за развитие кожных симптомов, подобных синдрому Нетертона. KLK5 представляет собой аутоактивированную протеазу, которая также участвует в активации KLK7 и KLK14. При этом, в роговом слое эпидермиса пациентов с синдромом Нетертона и у мышей с моделью синдрома Нетертона наблюдаются высокие уровни протеазной активности, такой как трипсиновая и химотрипсиновая активность, и предполагается, что калликреины, принадлежащие к определенному семейству и действующие по нижеследующему пути реакции, такие как KLK7 и KLK14, помимо KLK5, ассоциируются с протеазной активностью в роговом слое эпидермиса. Предполагается, что могут встречаться случаи, в которых кожные симптомы, подобные синдрому Нетертона, могут более сильно подавляться путем ингибирования KLK7 или KLK14 помимо KLK5. 70 или более примеров мутаций в SPINK5, вызывающих синдром Нетертона, перечислены в базе данных мутаций генов человека (HGMD) и, как сообщалось, они ассоциируются с тяжестью синдрома Нетертона. Мутации в экзонах 1-9 SPINK5 ассоциируются с более тяжелыми патологиями синдрома Нетертона. Возможность использования фармацевтической композиции, содержащей пептид согласно изобретению или его конъюгат, для лечения или профилактики синдрома Нетертона, можно определить путем исследования мутаций в SPINK5.

[0138] Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать терапевтически или профилактически эффективное количество пептида или конъюгата и фармацевтически приемлемые разбавители, носители, солюбилизаторы, эмульгаторы, консерванты и/или вспомогательные агенты.

[0139] Термин «терапевтически или профилактически эффективное количество» означает количество, которое оказывает терапевтическое или профилактическое действие при лечении конкретного заболевания в зависимости от формы введения или способа введения, и имеет такое же значение, как и «фармакологически эффективное количество».

[0140] Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать вещества для изменения, поддержания или сохранения pH, осмотического давления, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, стерильности или стабильности, растворимости, замедленного высвобождения, абсорбционной способности, проницаемости, лекарственной формы, ионной силы, свойств, формы и т.п. композиции или пептида, конъюгата или т.п., содержащихся в композиции (которые далее будут называться «фармацевтическими средствами»). Фармацевтические средства не имеет конкретных ограничений, при условии, что они будут представлять собой фармакологически приемлемыми средства. Так, например, фармацевтические средства предпочтительно не обладают токсичностью или имеют низкую токсичность.

[0141] Примерами фармацевтических средств могут быть, но не ограничиваются ими, аминокислоты, такие как глицин, аланин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; антибактериальные средства; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, сульфат натрия или бисульфит натрия; буферы, такие как фосфатный, цитратный или боратный буферы, раствор бикарбоната натрия или трис-соляной кислоты (трис-HCl); наполнители, такие как маннит и глицин; хелатообразующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); комплексообразующие агенты такие как кофеин, поливинилпирролидин, β-циклодекстрин или гидроксипропил-β-циклодекстрин; вещества, придающие объем, такие как глюкоза, манноза или декстрин, моносахариды, дисахариды, другие углеводы, такие как глюкоза, манноза или декстрин; красители; ароматизаторы; разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидин; консерванты, такие как низкомолекулярные полипептиды, солеобразующие противоионы, хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимерзсал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода; растворители, такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль (ПЭГ); спирты ряда сахаров, такие как маннит или сорбит; суспендирующие агенты, полисорбаты, такие как сложный эфир сорбитана, полисорбат 20 или полисорбат 80; поверхностно-активные вещества, такие как тритон, трометамин, лецитин или холестерин; агенты, повышающие стабильность, такие как сахароза или сорбит; агенты, повышающие эластичность, такие как хлорид натрия, хлорид калия, маннит или сорбит; агенты для переноса; разбавители; наполнители, и/или фармацевтические вспомогательные агенты.

[0142] Количество этих добавляемых фармацевтических средства в 0,001-1000 раз, предпочтительно в 0,01-100 раз, а более предпочтительно в 0,1-10 раз превышает массу пептида согласно изобретению или пептида, содержащегося в конъюгате.

[0143] Фармацевтическая композиция согласно изобретению также включает липосому, содержащую пептид согласно изобретению или его конъюгат, и фармацевтическую композицию, содержащую модифицированную форму, образованную посредством связывания пептида с липосомой.

[0144] Наполнители или носители не имеет конкретных ограничений, при условии, что они будут представлять собой жидкие или твердые вещества, обычно используемые для перорального или парентерального введения, такие как вода для инъекций, физиологический раствор, искусственные спинномозговые жидкости и другие препараты. Примеры физиологического раствора могут включать нейтральный физиологический раствор и физиологический раствор, содержащий сывороточный альбумин.

[0145] Примеры буферов могут включать трис-буфер, скорректированный для доведения конечного pH фармацевтической композиции до 7,0-8,5; ацетатный буфер, скорректированный для доведения конечного pH до 4,0-5,5; цитратный буфер, скорректированный для доведения конечного pH до 5,0-8,0; и гистидиновый буфер, скорректированный для доведения конечного pH до 5,0-8,0.

[0146] Фармацевтическая композиция согласно изобретению представляет собой твердое вещество, жидкость, суспензию или т.п.. Другой пример фармацевтической композиции согласно изобретению может включать лиофилизованный препарат. Лиофилизованный препарат может быть получен с использованием наполнителя, такого как сахароза.

[0147] Способ введения фармацевтической композиции согласно изобретению может представлять собой любой из способов, таких как введение глазных капель, энтеральное введение, местное введение и парентеральное введение. Примеры такого введения могут включать закапывание глазных капель в конъюнктиву, введение в стекловидное тело, внутривенное введение, внутриартериальное введение, внутримышечное введение, интрадермальное введение, подкожное введение, внутрибрюшинное введение, трансдермальное введение, внутрикостное введение и внутрисуставное введение.

[0148] Состав фармацевтической композиции может быть определен в зависимости от способа введения, ингибирующей активности пептида согласно изобретению или пептида, содержащегося в конъюгате с KLK5, KLK5 и KLK7, или KLK5 и KLK14, аффинности связывания или т.п. Чем выше ингибирующая активность (чем меньше значение IC₅₀ или значение K_i) или выше аффинность (меньше значение K_D) по отношению к мишени ингибирующего пептида согласно изобретению, тем выше будет эффективность при более низкой дозе.

[0149] Доза пептида согласно изобретению или его конъюгата не имеет конкретных ограничений, при условии, что она будет представлять собой фармакологически эффективное количество, и эта доза может быть соответствующим образом определена в зависимости от вида индивидуума, типа заболевания, симптома, пола, возраста, хронического заболевания, ингибирующей активности пептида по отношению к мишени, аффинности связывания и других факторов, но, обычно, пептид согласно изобретению или его конъюгат вводят в дозе от 0,01 до 1000 мг/кг, а предпочтительно от 0,1 до 100 мг/кг, один, два или более раз в день в течение периода времени от 1 до 180 дней.

[0150] Примерами формы фармацевтической композиции могут быть инъекции (включая лиофилизованные препараты и капли), суппозитории, препараты для трансназального поглощения, препараты для трансдермального поглощения, препараты для подъязычного введения, капсулы, таблетки, мази, гранулы, аэрозоли, драже, порошки, суспензии, эмульсии, глазные капли и композиции биологических имплантатов.

[0151] Фармацевтическая композиция, содержащая пептид согласно изобретению или его конъюгат в качестве активного ингредиента, может быть введена одновременно с другими лекарственными средствами или отдельно. Так, например, фармацевтическая композиция, содержащая пептид согласно изобретению или его конъюгат в качестве активного ингредиента, может быть введена после введения других лекарственных средств, другие лекарственные средства могут быть введены после введения фармацевтической композиции, или фармацевтическая композиция может быть введена одновременно с введением других лекарственных средств. В случае одновременного введения, пептид согласно изобретению или его конъюгат и другие лекарственные средства могут содержаться либо в одном препарате, либо в отдельных препаратах (в нескольких препаратах).

[0152] Могут быть введены или назначены для приема одно, два, три или более таких других лекарственных средств. В целом, считается, что фармацевтическая композиция согласно изобретению «вводится в комбинации с другими лекарственными средствами» или «применяется в комбинации с другими лекарственными средствами». Фармацевтическая композиция согласно изобретению, содержащая другие лекарственные средства в дополнение к пептиду согласно изобретению или его конъюгату, или используемая в комбинации с другими видами терапии, также включена в настоящее изобретение как аспект «комбинированного применения других лекарственных средств» или «комбинации с другими лекарственными средствами».

[0153] Примерами лекарственных средств для лечения синдрома Нетертона могут быть увлажнители, стероидные препараты и антибактериальные средства. Примерами лекарственных средств для лечения атопического дерматита могут быть стероидные препараты, ингибиторы кальцинейрина, ингибиторы PDE4, иммунодепрессанты, ингибиторы IL-4/IL-13 и фототерапия. Примерами лекарственных средств для лечения розацеи могут быть доксициклин, миноциклин, азелаиновая кислота и бримонидин. Примерами лекарственных средств для лечения псориаза могут быть ингибиторы TNFα, ингибиторы IL-12/23, ингибиторы IL-17, ингибиторы PDE4, антиметаболиты, ингибиторы кальцинейрина, сложный эфир фумаровой кислоты, ретиноидные препараты, стероидные препараты, аналоги витамина D3 и фототерапия. Примерами лекарственных средств для лечения астмы могут быть стероидные препараты и агонисты β2. Примерами лекарственных средств для лечения рака, такого как рак матки, уротелиальный рак мочевого пузыря, рак прямой и ободочной кишки, плоскоклеточная карцинома ротовой полости, рак молочной железы, рак головы и шеи, меланома, рак предстательной железы и глиома, могут быть различные противораковые средства.

[0154] Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики заболеваний, ассоциированных с KLK5, к способу, включающему стадию введения пептида согласно изобретению или его конъюгата, к применению пептида согласно изобретению или его конъюгата в целях приготовления фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболеваний и к применению пептида или конъюгата для лечения и профилактики заболеваний. Настоящее изобретение также включает набор для лечения или профилактики, содержащий пептид или конъюгат.

[0155] Кроме того, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность пептида согласно изобретению или его конъюгата, вектор, содержащий полинуклеотид, клетку, содержащую полинуклеотид или вектор, или клетку, экспрессирующую пептид согласно изобретению или его конъюгат. Так, например, полинуклеотид и вектор могут быть применены для генотерапии заболеваний, ассоциированных с KLK5, а клетки могут быть применены для клеточной терапии заболеваний, ассоциированных с KLK5, соответственно, с применением известных методов. Кроме того, клетки для клеточной терапии могут быть получены, например, путем введения полинуклеотида или вектора в аутологичные клетки или аллогенные клетки (клетки того же типа). Полинуклеотид и вектор включены в настоящее изобретение также в качестве композиций для приготовления клеточных терапевтических средств. Однако, аспекты, относящиеся к фармацевтической композиции, содержащей полинуклеотид, вектор, клетку или т.п. согласно изобретению, не ограничивается вариантами, приведенными выше.

[0156] Животное-модель может быть использовано в качестве средства для оценки терапевтического эффекта пептида или его конъюгата, содержащегося в фармацевтической композиции согласно изобретению в качестве активного ингредиента согласно изобретению, при лечении заболеваний, ассоциированных с KLK5. Примерами модели синдрома Нетертона, имеющей мутацию в гене SPINK5, который является геном, вызывающим синдром Нетертона, могут быть мыши с дефицитом гена SPINK5 (Descargues, P., et al. (2004) Nat. Genet., Vol. 37, pp. 56-65), мыши с условным нокаутом гена SPINK5 (Petrova, E., et al. (2019) oral presentation in the 8th International Symposium on Kallikreins and Kallikrein-Related Peptidases: Abstract Book, p. 28), и мыши Crusty2 (База данных Mutagenetix), но эти примеры не имеет конкретных ограничений.

[0157] 6. Диагностическая композиция

Настоящее изобретение относится к композиции для тестирования или диагностики, содержащей пептид согласно изобретению или его конъюгат (далее, эта композиция будет называться общим термином «диагностическая композиция»).

[0158] Диагностическая композиция согласно изобретению является подходящей для тестирования или диагностики заболеваний, ассоциированных с KLK5, с экспрессией KLK5, с экспрессией KLK7, с экспрессией KLK14 или т.п. В настоящем изобретении, примерами тестирования или диагностики являются определение или оценка риска заболеваемости; определение заболеваемости; оценка степени прогрессирования или обострения заболевания; оценка или определение эффекта терапевтического лечения фармацевтической композицией, содержащей пептид согласно изобретению или его конъюгат; оценка или определение эффекта лечения, отличающегося от лечения лекарственными средствами; оценка риска рецидива и обнаружение рецидива. Однако, эти примеры не имеет конкретных ограничений при условии, что они будут проведены в целях анализа или диагностики.

[0159] Диагностическая композиция согласно изобретению является подходящей для идентификации индивидуума, которому необходимо вводить пептид согласно изобретению или его конъюгат, композицию, содержащую этот пептид или конъюгат, или фармацевтическую композицию, содержащую этот пептид или конъюгат.

[0160] Такая диагностическая композиция может содержать pH-забуферивающие агенты, осморегуляторы, соли, стабилизаторы, консерванты, проявители, сенсибилизаторы, ингибиторы агрегации и т.п.

[0161] Настоящее изобретение также относится к способу тестирования или диагностики заболеваний, ассоциированных с KLK5, к применению пептида согласно изобретению в целях получения диагностической композиции для диагностики заболеваний и к применению пептида согласно изобретению для тестирования или диагностики заболеваний. Настоящее изобретение также включает набор для тестирования или диагностики, содержащий пептид согласно изобретению.

[0162] Что касается метода тестирования или диагностики с использованием пептида согласно изобретению, то желательным является сэндвич-ELISA, но могут быть применены и другие методы детектирования, такие как обычный ELISA или RIA, ELISPOT (иммуноферметный спот-анализ), дот-блоттинг, метод Охтерлони, CIE (иммуноэлектрофорез с контрастным окрашиванием), CLIA (хемилюминесцентный иммуноанализ) и FCM (проточная цитометрия). Для детектирования используют антитела или их связывающие фрагменты, или антитела или их фрагменты, меченные пептидом согласно изобретению или его конъюгатом. Для мечения могут быть применены методы, которые могут быть подходящими для проведения биохимического анализа, такие как мечение флуорофорами, такими как ПХ, щелочная фосфатаза и ФИТЦ, радиоизотопами и т.п., а также биотином. Для детектирования с помощью ферментной метки, помимо хромогенных субстратов, таких как TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), BCIP (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат), p-NPP (п-нитрофенилфосфат), OPD (о-фенилендиамин), ABTS (3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) и хемилюминесцентный субстрат для проведения ELISA-анализа Pico SuperSignal (Thermo Fisher Scientific), и флуоресцентные субстраты, такие как флуорогенный пероксидазный субстрат QuantaBlu® (Thermo Fisher Scientific), могут быть использованы хемилюминесцентные субстраты. Этому анализу могут быть подвергнуты образцы, взятые у человека или у животных, не являющихся человеком, а также искусственно обработанные образцы, такие как рекомбинантные белки. Примерами тест-образцов, полученных от отдельных организмов, могут быть, помимо прочих, кровь, синовиальные жидкости, асциты, лимфа, спинномозговая жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна, мокрота, супернатанты гомогената тканей и срезы тканей.

[0163] Набор для сэндвич-ELISA для тестирования или диагностики, содержащий пептид согласно изобретению, может включать реагенты для окрашивания, буферы для разведения, белки для твердофазного синтеза, белки для детектирования, промывочные растворы и т.п., а также стандартные растворы белков, которые содержат пептид согласно изобретению или его конъюгат. В качестве метода определения количества белка, связанного с антигеном, могут быть применены метод абсорбции, метод с использованием флуоресценции, метод с использованием люминесценции, метод RI (радиоизотопный) или т.п., а для оценки предпочтительно используют планшет-ридер для определения степени абсорбции, планшет-ридер для определения флуоресценции, планшет-ридер для определения люминесценции, жидкостный сцинтилляционный счетчик RI или т.п.

[0164] Кроме того, тестирование или диагностика могут быть осуществлены с применением методов иммунопреципитации.

[0165] Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу детектирования или оценки уровня KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 в тест-образце. Диагностическая композиция согласно изобретению может быть использована для проведения такого метода детектирования или оценки. KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 в тест-образце могут быть детектированы посредством контактирования пептида согласно изобретению или его конъюгата с тест-образцом (стадия 1) с последующей оценкой количества KLK5, KLK5 и KLK7. или KLK5 и KLK14, связанных с пептидом или конъюгатом (стадия 2). Примеры стадии 1 могут включать иммобилизацию Fc-области иммуноглобулина, конъюгированного с пептидом согласно изобретению, на магнитных сферах посредством G-белка и добавления к нему тест-образца, а примеры стадии 2 могут включать разделение магнитных сфер и анализ растворимых белков, осажденных вместе со сферами с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ или Вестерн-блот-анализа для детектирования KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14. Такому анализу могут быть подвергнуты искусственно обработанные образцы, такие как рекомбинантные белки, а также образцы, взятые у человека или у животного, не являющегося человеком. Примерами тест-образцов, полученных от отдельных организмов, могут быть, помимо прочих, кровь, синовиальные жидкости, асциты, лимфа, спинномозговая жидкость, бронхоальвеолярный лаваж, слюна, мокрота, супернатанты гомогената тканей и срезы тканей.

[0166] Детектирование KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 может быть осуществлено не только in vitro, но также in vivo. В случае диагностической визуализации может быть использован пептид согласно изобретению или его конъюгат, меченный фармацевтически приемлемым радионуклидом или люминесцентным веществом. Примеры стадии 1 могут включать введение меченого пептида или его конъюгата испытуемому индивидууму, а примеры стадии 2 могут включать получение изображения с применением метода диагностической визуализации, такого как ПЭТ/КТ, и определение или тестирование на наличие KLK5, KLK5. и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14.

[0167] Пептид или его конъюгат, содержащийся в диагностической композиции согласно изобретению, связываются с KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14 и предпочтительно имеют KLK5, KLK5 и KLK7- или KLK5 и KLK14-специфическую активность связывания.

[0168] В настоящее изобретение также входит способ идентификации индивидуума, которому должна быть введена фармацевтическая композиция согласно изобретению. В таком способе идентификации определяют уровень KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14 в образце, взятом у индивидуума, и индивидуум может быть определен как положительный, если KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14 были обнаружены в образце, или KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14 были обнаружены в количестве, превышающем количество обнаруженных KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14, обнаруженных в другом образце, взятом у здорового индивидуума. В этом способе может быть использована диагностическая композиция согласно изобретению.

[0169] Кроме того, в подходящем аспекте способа идентификации, индивидуум страдает заболеваниями, ассоциированными с KLK5, или находится в группе риска развития таких заболеваний.

[0170] Кроме того, в одном из аспектов изобретения, фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть введена индивидууму, который определен как положительный в способе идентификации.

[0171] 7. Метод разделения KLK5, KLK5 и KLK7 или KLK5 и KLK14.

Пептид согласно изобретению или его конъюгат предпочтительно обладают связывающей активностью, специфичной к KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14. В соответствии с этим, KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14 могут быть специфически выделены из образца, в котором KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14 смешаны с другими KLK, с использованием пептида согласно изобретению или его конъюгата. Высвобождение KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14 из пептида или конъюгата может быть осуществлено неселективно, например, при относительно высокой ионной силе, низком pH, в умеренных условиях денатурации, в присутствие хаотропных солей и т.п., но предпочтительно, оно может быть осуществлено в пределах протеазной активности, при которых эта активность KLK5, KLK5 и/или KLK7, или KLK5 и/или KLK14 не является аттенюированной.

Примеры

[0172] В следующих примерах, некоторые аспекты настоящего изобретения будут описаны более конкретно. Однако, настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

[0173] В нижеследующих примерах, процедуры, относящиеся к генной инженерии, были осуществлены в соответствии со способами, описанными в руководстве «Молекулярное клонирование» (в руководстве Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, опубликованном в 1982 г. или опубликованном в 1989 г.) и в соответствии с другими способами, описанными в экспериментальных руководствах, используемых специалистами в данной области, или в соответствии со инструкциями по применению коммерчески доступных продуктов в случаях, когда использовались коммерчески доступные реагенты или наборы, если это не оговорено особо.

[0174] Пример 1. Получение пептида, ингибирующего KLK5.

(1-1) Конструирование вектора для экспрессии KLK5-ингибирующего пептида

С использованием нуклеотидной последовательности каждого ингибирующего пептида (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 или 31) и нуклеотидной последовательности SPINK2 в качестве матриц были амплифицированы фрагменты ингибирующего пептида с помощью ПЦР ((при 94°С в течение 15 секунд, при 60°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 20 секунд) × 30 циклов) с использованием нижеследующих праймеров и KOD-plus-(TOYOBO).

Праймер 1: 5'-AAAAGGATCCCTGGACAAACGTGGCCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3' (SEQ ID NO: 62, фигура 70)

Праймер 2: 5'-AAAACTCGAGTTAGCCGCCGCACGGACCATTGCGAATAA-3' (SEQ ID NO: 63, фигура 71)

Амплифицированные фрагменты подвергали электрофорезу в агарозном геле, а затем вырезали нужные фрагменты ДНК для получения ДНК с использованием набора для экстракции из геля QIAquick (QIAGEN). Полученные фрагменты ДНК и pET 32a (Novagen) обрабатывали рестриктирующими ферментами BamHI (NEB) и XhoI (NEB) при 37°C в течение 1 часа или более, и после электрофореза в агарозном геле, нужные фрагменты ДНК вырезали, а затем очищали с использованием набора для ПЦР-очистки QIAquick (QIAGEN). С использованием системы быстрого лигирования ДНК LigaFast (Promega), каждый очищенный фрагмент подвергали взаимодействию при комнатной температуре в течение 10 минут для проведения реакции лигирования. Раствор для лигирования добавляли к JM109 Escherichia coli (TOYOBO), оставляли на льду на 30 минут, а затем подвергали термообработке при 42°С в течение 45 секунд, после чего оставляли на льду на 5 минут, высевали на планшет 2YT, содержащий 0,1 мг/мл ампициллина, и подвергали статическому культивированию при 37°C в течение ночи для трансформации Escherichia coli. На следующий день, трансформированную Escherichia coli инокулировали в бульонную среду Terrific (Invitrogen), содержащую 0,1 мг/мл ампициллина, и культивировали при 37°C в течение ночи. После этого, плазмидную ДНК собирали с использованием набора QIAprep 96 Turbo Miniprep (Qiagen) (который далее будет называться «набором для обработки минипрепаратов»), и проводили анализ последовательности для конструирования вектора, экспрессирующего пептид, ингибирующий pET 32a_Kex2_KLK5.

[0175] (1-2) Получение KLK5-ингибирующего пептида

Escherichia coli Origami B (DE3) (Novagen) трансформировали вектором, сконструированным как описано в (1-1), и культивировали при 37°C с использованием среды 2YT, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина. После этого добавляли IPTG (в конечной концентрации 1 мМ) с последующим культивированием при 16°С в течение ночи. На следующий день после сбора клеток путем центрифугирования (3000× g, 20 минут и 4°C), лизат был получен с использованием смеси BugBuster Master Mix (Novagen), и гибрид белка-мишени и His-метки очищали с использованием смолы, обладающей аффинностью к металлу TALON (Clontech). После этого, тиоредоксиновую метку отщепляли от нужного белка с использованием Kex2 (Saccharomyces cerevisiae: номер доступа CAA96143) и очищали с использованием TALON. Далее проводили гель-фильтрационную хроматографию (на Superdex75 10/300 GL) или обращенно-фазовую хроматографию (YMC-Pack ODS-AM) для получения 14 видов пептидов, ингибирующих KLK5. Аминокислотные последовательности производных представлены в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, и 32 (Фигуры 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 и 40).

[0176] Пример 2. Получение KLK5, KLK7 и KLK14.

(2-1) Конструирование векторов для экспрессии человеческого KLK5, человеческого KLK7 и человеческого KLK14.

Праймеры и условия проведения ПЦР, используемые для клонирования человеческого про-KLK5, человеческого про-KLK7 и человеческого про-KLK14 представлены ниже. Фрагмент А амплифицировали с помощью ПЦР ((при 94°С в течение 15 секунд, при 60°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 10 секунд) с использованием нижеследующих праймеров и KOD-plus-(TOYOBO).

Праймер 3: 5'-GGCGATTATAAAGATGACGATGATAAACACCATCACCACCATC-3’ (SEQ ID NO: 64, фигура 72).

Праймер 4: 5'-GTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGTTTATCATCGTCAT-3’ (SEQ ID NO: 65, фигура 73).

Затем, с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих человеческий про-KLK5 (Uniprot: Q9Y337), человеческий про-KLK7 (Uniprot: P49862) и человеческий про-KLK14 (Uniprot: Q9P0G3), соответственно, в качестве матриц, фрагменты амплифицировали с помощью ПЦР ((при 94°С) в течение 15 секунд, при 60°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 60 секунд) × 30 циклов) с использованием нижеследующих праймеров и KOD-plus-(TOYOBO).

[0177] Праймер для амплификации человеческого pro-KLK5

Праймер 5: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGCCACAGCTAGACCCCCT-3' (SEQ ID NO: 66, фигура 74)

Праймер 6: 5'-CGTCATCTTTATAATCGCCGCTGTTGGCCTGGATGGTTTCCTG-3' (SEQ ID NO: 67, фигура 75)

[0178] Праймер для амплификации человеческого pro-KLK7

Праймер 7: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGCCAGATCTCTGCTGCTGCCC-3' (SEQ ID NO: 68, фигура 76)

Праймер 8: 5'-CGTCATCTTTATAATCGCCCCGGTGTTTCTTCATGGTGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 69, фигура 77)

[0179] Праймер для амплификации человеческого pro-KLK14:

Праймер 9: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGTTCCTCCTCCTCACCGCCCTC-3' (SEQ ID NO: 70, фигура 78).

Праймер 10: 5'-CGTCATCTTTATAATCGCCCTTGTCGCGCATGGTCTCCTCGAT-3' (SEQ ID NO: 71, фигура 79)

[0180] Нужные фрагменты ДНК амплифицировали посредством перекрывающейся ПЦР с использованием фрагментов, амплифицированных выше, и фрагмента А, нижеследующих праймеров и KOD-plus-(TOYOBO):

Праймер 5 (SEQ ID NO: 66, фигура 74) или праймер 7 (SEQ ID NO: 68, фигура 76) или праймер 9 (SEQ ID NO: 70, фигура 78) и

Праймер 11: 5'-AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGT-3' (SEQ ID NO: 72, фигура 80).

[0181] Затем, с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих мышиный pro-KLK7 (Uniprot: Q91VE3) или мышиный pro-KLK14 (Uniprot: Q8CGR5), соответственно, в качестве матриц, фрагменты амплифицировали с помощью ПЦР ((при 94°С в течение 15 секунд, при 60°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 60 секунд) × 30 циклов) с использованием нижеследующих праймеров и KOD-plus-(TOYOBO).

[0182] Праймер для амплификации мышиного pro-KLK7

Праймер 12: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGGGAGTGTGGCTGCTGAGCCTG-3' (SEQ ID NO: 73, фигура 81).

Праймер 13: 5'-AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGCCGGTGGGTCTTCATGGTTTCCATG-3'(SEQ ID NO: 74, фигура 82)

[0183] Праймер для амплификации мышиного pro-KLK14

Праймер 14: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGTTTCTGCTGCTGATCATCCTG-3'(SEQ ID NO: 75, фиг. 83)

Праймер 15: 5'-AAAAGTTTAAACTCAATGATGGTGGTGATGGTGGTTGCTCTGCATGGTCCGCTGAA-3'(SEQ ID NO: 76, фигура 84).

[0184] Векторы для экспрессии в клетках млекопитающих pCMA_pro-hKLK5, pCMA_pro-hKLK7, pCMA_pro-hKLK14, pCMA_pro-mKLK7 и pCMA_pro-mKLK14 с меткой His, присоединенной к С-концу и кодируемой каждым геном, были сконструированы путем клонирования фрагментов ДНК с использованием амплифицированных таким образом нужных фрагментов ДНК и рестриктирующих ферментов XbaI (NEB) и PmeI (NEB). Эту процедуру проводили методом, описанным в (1-1).

[0185] (2-2) Экспрессия и очистка человеческого KLK5, человеческого про-KLK7, человеческого про-KLK14, мышиного про-KLK7 и мышиного про-KLK14.

Каждый экспрессионный вектор, сконструированный, как описано в (2-1), трансфицировали в клетки Expi293F (Thermo Fisher Scientific) с использованием PEI MAX 40000 (Polysciences), и супернатант культуры собирали через 3 дня после культивирования клеток. Нужный гибридный белок с меткой His собирали из супернатанта культуры с использованием HisTrap Excel (GE healthcare), и буфер заменяли на PBS с использованием Amicon Ultra NMWL 10000 (Merck KGaA Millipore) для очистки KLK5, человеческого pro-KLK7, человеческого pro-KLK14, мышиного pro-KLK7 и мышиного pro-KLK14, соответственно.

[0186] (2-3) Получение человеческого KLK5, человеческого KLK7, человеческого KLK14, мышиного KLK5, мышиного KLK7 и мышиного KLK14.

К 200 мкг/мл pro-KLK7 или 14, полученного с использованием буфера для активации KLK (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂, 0,05% (масс./масс.) Brij-35, pH 7,5), добавляли равное количество 20 мкг/мл термолизина с последующим проведением реакции взаимодействия в течение определенного периода времени при 37°C. После этого, к нему добавляли равное количество 100 мМ EDTA для получения активированного человеческого KLK7, активированного человеческого KLK14, активированного мышиного KLK7 и активированного мышиного KLK14.

[0187] Кроме того, 200 мкг/мл мышиного KLK5 (R&D Systems, Inc., 7236-SE) и 2 мкг/мл человеческого KLK5, полученных с использованием буфера для активации (50 мМ Трис-HCl, 0,005% (мас./Мас.) Brij-35), pH 8,0), смешивали в равных количествах, а затем проводили реакцию взаимодействия при 37°C в течение 24 часов для получения активированного мышиного KLK5.

[0188] Пример 3. Оценка пептида, ингибирующего KLK5.

(3-1) Оценка ингибирующей активности KLK5-ингибирующего пептида для человеческого/мышиного KLK5, человеческого/мышиного KLK7 и человеческого/мышиного KLK14.

Пептидный субстрат растворяли в ДМСО до 10 мМ и разводили аналитическим буфером (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 8,0) для последующего использования. Затем смешивали 25 мкл каждого человеческого/мышиного KLK5, человеческого/мышиного KLK7 и человеческого/мышиного KLK14 и ингибирующего пептида, разведенного аналитическим буфером, после чего проводили реакцию взаимодействия при 37°C в течение 20 минут. После этого добавляли 50 мкл субстрата, разведенного аналитическим буфером, и измеряли сигнал флуоресценции с помощью Enspire (PerkinElmer). Комбинации используемого фермента и субстрата представлены ниже. Каждый ингибирующий пептид имел конечную концентрацию от 0,098 до 1000 нМ, а для проведения реакции и измерения использовали черный планшет PROTEOSAVE® SS96F (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).

[0189] Оценка активности ингибирования человеческого KLK5: hKLK5 в конечной концентрации 10 нМ, пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc.) в конечной концентрации 100 мкМ и флуоресцентный сигнал с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0190] Оценка активности ингибирования человеческого KLK7: hKLK7 в конечной концентрации 1 мкг/мл, пептидный субстрат Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH₂ (R&D Systems, Inc., фигура 85, и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 77) в конечной концентрации 20 мкМ, и сигнал флуоресценции с возбуждением на 320 нм/излучением на 405 нм.

[0191] Оценка активности ингибирования человеческого KLK14: hKLK14 в конечной концентрации 0,2 мкг/мл, пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ (R&D Systems, Inc.), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0192] Оценка активности ингибирования мышиного KLK5: мышиный KLK5 в конечной концентрации 0,25 мкг/мл, пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ (R&D Systems, Inc.) и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0193] Оценка активности ингибирования мышиного KLK7: мышиный KLK7 в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, пептидный субстрат Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH₂ в конечной концентрации 7 мкМ (R&D Systems, Inc., Фигура 85, и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 77), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 320 нм/излучением на 405 нм.

[0194] Оценка активности ингибирования мышиного KLK14: мышиный KLK14 в конечной концентрации 0,1 мкг/мл, пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ (R&D Systems, Inc.), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0195] В результате вычисления степени разложения пептидного субстрата каждым ингибирующим пептидом в каждой концентрации и вычисления 50% ингибирующей концентрации (IC₅₀) с использованием GraphPad Prism (версия 5.0; GraphPad Software Inc.), где степень разложения ингибирующим пептидом в концентрации 0 нМ, была принята за 100%, было обнаружено, что все ингибирующие пептиды подавляли ферментативную активность человеческого KLK5 при низких концентрациях (Таблица 1, фигура 2). Некоторые из ингибирующих пептидов подавляли ферментативную активность человеческого KLK7 или человеческого KLK14 при низких концентрациях, а некоторые из ингибирующих пептидов проявляли слабую ингибирующую активность против этих протеаз (Таблица 1). Ингибирующие пептиды также проявляли аналогичную активность против мышиных KLK5, KLK7 или KLK14 (Таблица 2). Среднее значение для трех независимых экспериментов использовали для вычисления величины IC₅₀.

[0196] [Таблица 1]. Активность каждого KLK5-ингибирующего пептида в отношении человеческого KLK5, человеческого KLK7 или человеческого KLK14

ID IC₅₀(нМ) для hKLK5 IC₅₀(нМ) для hKLK7 IC₅₀(нМ)для hKLK14 K51028 6,1±0,5 249±25 >1000 K50032 7,1±0,4 >1000 >1000 K50055 6,7±0,2 >1000 >1000 K51069 6,8±0,4 >1000 72±23 K51072 7,0±0,2 >1000 434±18 K50015 6,8±0,3 >1000 17±1 K50016 6,9±1,1 >1000 >1000 K51034 6,4±0,3 >1000 >1000 K50062 7,5±0,7 >1000 499±27 K51090 4,5±0,3 >1000 >1000 K50098 8,3±0,9 >1000 268±31 K51005 5,8±2,1 17±0,2 >1000 K50031 5,4±0,1 13±0,3 >1000 K51057 12±1 24±0,7 >1000

[0197] [Таблица 2]. Активность каждого KLK5-ингибирующего пептида в отношении мышиного KLK5, мышиного KLK7 или мышиного KLK14

ID IC₅₀(нМ) для mKLK5 IC₅₀(нМ) для mKLK7 IC₅₀(нМ) для mKLK14 K51028 <0,5 77 >1000 K50032 127 >1000 >1000 K50055 <0,5 >1000 >1000 K51069 <0,5 181 40 K51072 2 512 >1000 K50015 <0,5 248 108 K50016 15 >1000 >1000 K51034 54 >1000 >1000 K50062 10 >1000 >1000 K51090 2 658 >1000 K50098 14 >1000 547 K51005 48 23 214 K50031 40 4 244 K51057 149 27 437

[0198] (3-2) Оценка перекрестной реактивности пептида, ингибирующего KLK5

Специфичность для других протеаз оценивали по разложению пептидного субстрата в качестве показателя. Как и в методе, описанном в (3-1), смешивали 25 мкл каждой протеазы и образца, разведенного аналитическим буфером (до конечной концентрации образца 1 мкМ), после чего проводили реакцию взаимодействия при 37°C в течение 20 минут. Затем добавляли 50 мкл субстрата, разведенного аналитическим буфером, и измеряли сигнал флуоресценции с помощью Enspire (PerkinElmer). Аналитический буфер (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, pH 8,0) использовали для оценки протеазной активности, а для проведения реакции взаимодействия и измерения использовали черный планшет PROTEOSAVE® SS96F (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). Комбинации протеазы и субстрата, используемых для оценки специфичности, представлены ниже.

[0199] Оценка активности ингибирования бычьего трипсина: трипсин (Pierce; 20233) в конечной концентрации 5 нМ и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ (R&D Systems, Inc., ES011), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм

[0200] Оценка активности ингибирования человеческого трипсина: трипсин в конечной концентрации 1 нМ (Sigma-Aldrich Co. LLC, T6424) и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ (R&D Systems, Inc., ES011), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0201] Оценка активности ингибирования бычьего α-химотрипсина: химотрипсин в конечной концентрации 10 нМ (Worthington Biochemical Corporation; LS001434) и пептидный субстрат Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v, фиг. 86, и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 78), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0202] Оценка активности ингибирования человеческого химотрипсина: химотрипсин в конечной концентрации 10 нМ (Sigma-Aldrich Co. LLC, C8946), пептидный субстрат Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA в конечной концентрации 10 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v, фигура 86, и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 78), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0203] Оценка активности ингибирования человеческой триптазы: триптаза в конечной концентрации 1 нМ (Sigma-Aldrich Co. LLC, T7063) и пептидный субстрат Boc-Phe-Ser-Arg-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3107-v), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0204] Оценка активности ингибирования человеческой химазы: химаза в конечной концентрации 100 нМ (Sigma-Aldrich Co. LLC, C8118) и пептидный субстрат Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3120-v, фигура 86, и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 78), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0205] Оценка активности ингибирования человеческого плазмина: плазмин в конечной концентрации 50 нМ (Sigma-Aldrich Co. LLC, P1867) и пептидный субстрат Boc-Val-Leu-Lys-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3104-v), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0206] Оценка активности ингибирования человеческого тромбина: тромбин в конечной концентрации 1 нМ (Sigma-Aldrich Co. LLC, T6884) и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ (R&D Systems, Inc., ES011), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0207] Оценка активности ингибирования эластазы человеческых нейтрофилов: эластаза нейтрофилов в конечной концентрации 0,00001 ед./мкл (Enzo Life Sciences) и пептидный субстрат Suc (OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3153-v, фигура 87, и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 79), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0208] Оценка активности ингибирования человеческой матриптазы: матриптаза в конечной концентрации 1 нМ (R&D Systems, Inc., 3946-SE) и пептидный субстрат Boc-Gln-Ala-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ (R&D Systems, Inc., ES014), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0209] Оценка активности ингибирования человеческого белка C: белок C в конечной концентрации 100 нМ (Sigma-Aldrich Co. LLC, P2200) и пептидный субстрат Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3112-v, фигура 88, и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 80) и сигнал флуоресценции с возбуждением при 380 нм/излучением при 460 нм.

[0210] Оценка активности ингибирования человеческого tPA: tPA в конечной концентрации 10 нМ (Sigma-Aldrich Co. LLC, T0831) и пептидный субстрат Pyr-Gly-Arg-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3145-v), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0211] Оценка активности ингибирования человеческого uPA: uPA в конечной концентрации 2 нМ (Sigma-Aldrich Co. LLC, U0633) и пептидный субстрат Pyr-Gly-Arg-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3145-v), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0212] Оценка активности ингибирования калликреина человеческой плазмы: калликреин плазмы в конечной концентрации 0,125 мкг/мл (R&D Systems, Inc., 2497-SE) и пептидный субстрат Z-Phe-Arg-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3095-v), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0213] Оценка активности ингибирования человеческого KLK1: KLK1 в конечной концентрации 0,1 мкг/мл (R&D Systems, Inc., 2337-SE) и пептидный субстрат Pro-Phe-Arg-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3096-v), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0214] Оценка активности ингибирования человеческого KLK2: KLK2 в конечной концентрации 2 мкг/мл (R&D Systems, Inc., 4104-SE) и пептидный субстрат Pro-Phe-Arg-MCA в конечной концентрации 100 мкМ (PEPTIDE INSTITUTE, INC., 3096-v), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0215] Оценка активности ингибирования человеческого KLK4: KLK4 в конечной концентрации 1 мкг/мл (R&D Systems, Inc., 1719-SE) и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ. (R&D Systems, Inc., ES011), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0216] Оценка активности ингибирования человеческого KLK7: KLK7 в конечной концентрации 1 мкг/мл, пептидный субстрат Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH₂ в конечной концентрации 20 мкМ (R&D Systems, Inc., Фигура 85, и аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 77), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 320 нм/излучением на 405 нм.

[0217] Оценка активности ингибирования человеческого KLK8: KLK8 в конечной концентрации 5 нМ (UniProt: O60259, полученный авторами) и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ (R&D Systems, Inc., ES011), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0218] Оценка активности ингибирования человеческого KLK12: KLK12 в конечной концентрации 0,1 мкг/мл (R&D Systems, Inc., 3095-SE) и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ. (R&D Systems, Inc., ES011), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0219] Оценка активности ингибирования человеческого KLK13: KLK13 в конечной концентрации 0,5 мкг/мл (R&D Systems, Inc., 2625-SE) и пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ. (R&D Systems, Inc., ES011), и сигнал флуоресценции с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0220] Оценка активности ингибирования человеческого KLK14: hKLK14 в конечной концентрации 0,2 мкг/мл, пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC в конечной концентрации 100 мкМ (R&D Systems, Inc.) и флуоресценция сигнал с возбуждением на 380 нм/излучением на 460 нм.

[0221] Аналогичным образом, как описано в (3-1), перекрестную реактивность каждого KLK5-ингибирующего пептида с протеазами, отличающимися от KLK5, оценивали по разложению пептидного субстрата в качестве показателя. Некоторые из ингибирующих пептидов обнаруживали слабую перекрестную реактивность с химотрипсином в конечной концентрации ингибирующего пептида 1 мкМ (где значение IC₅₀ составляет менее 1 мкМ), но большинство ингибирующих пептидов не обладали ингибирующей активностью по отношению к каким-либо протеазам кроме KLKn (n=1, 2, 4, 5, 7, 8, 12 или 14) (фигура 3). При этом некоторые из ингибирующих пептидов обладали ингибирующей активность по отношению к KLK4 или KLK12 в конечной концентрации ингибирующего пептида 1 мкМ (где значение IC₅₀ было менее, чем 1 мкМ), но многие из ингибирующих пептидов не обладали активностью ингибирования протеазы KLKn, за исключением KLK5, KLK7 и KLK14, и, таким образом, было обнаружено, что ингибирующие пептиды обладают высокой специфичностью.

[0222] (3-3) Оценка активности связывания KLK5 с KLK5-ингибирующим пептидом

Для оценки аффинности связывания пептидов, ингибирующих KLK5, был проведен анализ методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIAcore T200 (GE healthcare). Комплементарную цепь ДНК конъюгата стрептавидина захватывали посредством гибридизации на сенсорном чипе CAP (GE healthcare), на котором была иммобилизована одноцепочечная ДНК. Затем KLK5, биотинилированный с использованием EZ-связанного NHS-PEG4-биотина (Thermo Fisher Scientific), захватывали при скорости потока 10 мкл/мин для иммобилизации приблизительно 10 RU. После этого, KLK5-ингибирующий пептид, подвергнутый 2-кратному серийному разведению HBS-EP (от 0,625 до 10 нМ), добавляли в качестве аналита при скорости потока 30 мкл/мин. С использованием компьютерной программы BIAcore T200 Evaluation (версия 2.0), k_on и k_off вычисляли путем анализа посредством кинетики одного цикла с помощью простой одиночной Лангмюровской модели связывания. Константу диссоциации K_D вычисляли как отношение k_off/k_on. Кроме того, несколько KLK5-ингибирующих пептидов оценивали путем регенерации сенсорного чипа CAP с использованием буфера для регенерации, включенного в набор для захвата биотина (GE healthcare), и многократного захвата биотинилированного KLK5.

[0223] Все 14 видов оцененных KLK5-ингибирующих пептидов, имели значения K_D ниже 1 нМ, что указывает на то, что их связывающая активность была очень высокой (Таблица 3A).

[0224] [Таблица 3A]. KLK5-связывающая активность каждого KLK5-ингибирующего пептида

ID K_on(1/M∙с) K_off(1/с) K_D(M) K51028 1,5×10⁶ 2,0×10^-5 1,4×10^-11 K50032 2,0×10⁶ 2,7×10^-4 1,3×10^-10 K50055 9,8×10⁵ 1,8×10^-5 1,9×10^-11 K51069 9,4×10⁵ 1,0×10^-6 1,0×10^-12 K51072 8,4×10⁵ 2,2×10^-5 2,6×10^-11 K50015 9,4×10⁵ 1,0×10^-6 1,1×10^-12 K50016 7,0×10⁶ 2,9×10^-4 4,2×10^-11 K51034 5,2×10⁵ 3,5×10^-5 6,8×10^-11 K50062 1,2×10⁶ 2,9×10^-6 2,5×10^-12 K51090 2,1×10⁶ 5,7×10^-5 2,7×10^-11 K50098 1,0×10⁶ 1,8×10^-5 1,8×10^-11 K51005 3,5×10⁶ 1,2×10^-3 3,4×10^-10 K50031 8,2×10⁵ 5,0×10^-5 6,1×10^-11 K51057 6,0×10⁶ 1,5×10^-3 2,6×10^-10

[0225] (3-4) Оценка KLK5-связывающей активности Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида

Для оценки аффинности связывания Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида, полученного, как описано в (5-2) и описанного ниже, анализ методом поверхностного плазмонного резонанса был проведен с использованием BIAcore T200 (GE healthcare).

[0226] Fc-гибрид KLK5-ингибирующего пептида захватывали при скорости потока 20 мкл/мин на сенсорном чипе CM5 (GE healthcare), на котором было иммобилизовано антитело против человеческого IgG (Fc) для иммобилизации приблизительно от 30 до 50 RU. После этого добавляли KLK5, подвергнутый 2-кратному серийному разведению HBS-EP (от 0,625 до 10 нМ) в качестве аналита при скорости потока 30 мкл/мин. С использованием компьютерной программы BIAcore T200 Evaluation (версия 2.0), k_on и k_off вычисляли путем анализа посредством кинетики одного цикла с помощью простой одиночной Лангмюровской модели связывания. Константу диссоциации K_D вычисляли как отношение k_off/k_on. Кроме того, активность связывания KLK5 с множеством Fc-гибридов KLK5-ингибирующего пептида оценивали путем регенерации сенсорного чипа СМ5, на котором было иммобилизовано антитело против человеческого IgG (Fc) с использованием буфера для регенерации, включенного в набор для захвата человеческого антитела (GE healthcare), и многократного захвата Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида.

[0227] Все 14 видов оцененных Fc-гибридов KLK5-ингибирующего пептида имели величины K_D ниже 1 нМ, что указывает на то, что их связывающая активность была очень высокой (Таблица 3B).

[0228] [Таблица 3B] KLK5-связывающая активность каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида

ID K_on(1/M∙с) K_off(1/с) K_D(M) D3-K51028-Fc 5,39×10⁵ 1,81×10^-6 3,35×10^-12 D3-K50032dN-Fc 1,08×10⁶ 5,69×10^-6 5,25×10^-12 D3-K50055-Fc 5,49×10⁵ 2,32×10^-6 4,22×10^-12 D3-K51069dN-Fc 7,14×10⁵ 2,81×10^-6 3,93×10^-12 D3-K51072-Fc 2,25×10⁵ 1,68×10^-6 7,48×10^-12 D3-K50015-Fc 1,04×10⁶ 3,52×10^-6 3,38×10^-12 D3-K50016dN-Fc 7,18×10⁵ 5,60×10^-6 7,81×10^-12 D3-K51034-Fc 2,83×10⁵ 2,93×10^-6 1,03×10^-11 D3-K50062-Fc 5,66×10⁵ 6,52×10^-6 1,15×10^-11 D3-K51090-Fc 7,00×10⁵ 7,86×10^-6 1,12×10^-11 D3-K50098dN-Fc 9,22×10⁵ <1,62×10^-6 <1,76×10^-12 D3-K51005-Fc 1,47×10⁵ 1,96×10^-5 1,33×10^-10 D3-K50031-Fc 8,81×10⁴ <1,00×10^-6 <1,14×10^-11 D3-K51057-Fc 8,69×10⁴ 1,79×10^-5 2,06×10^-10

[0229] Пример 4. Анализ KLK5-ингибирующего пептида с помощью рентгеноструктурного анализа.

(4-1) Получение комплекса KLK5/KLK5-ингибирующего пептида

В соответствии со способами, описанными в (1-2) и (2-2), были получены KLK5-ингибирующий пептид K51034 и KLK5, имеющие аминокислотные последовательности, представленные номерами SEQ ID. После смешивания двух компонентов в условиях 50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl и pH 8,0, комплекс выделяли и очищали гель-фильтрационной хроматографией (Superdex 200 10/300 GL).

[0230] (4-2) Рентгеноструктурный анализ.

Раствор комплекса, полученный, как описано в (4-1), концентрировали до 12 мг/мл, а затем смешивали с раствором в резервуаре (0,2 M гексагидратом хлорида магния, 20% ПЭГ3350) в соотношении 1:1 и кристаллизовали методом диффузного выпаривания. Полученный монокристалл кубической формы погружали в раствор в резервуаре, содержащий 20% глицерин, а затем замораживали в жидком азоте. Замороженные кристаллы облучали рентгеновскими лучами в криопотоке с получением дифракционного изображения (Hypixel 6000HE/MicroMax007). Данные масштабирования с максимальным разрешением 1,7 Å получали с помощью анализа с использованием CrysAlisPro. Фазу определяли методом молекулярного замещения с использованием только KLK5 (PDB ID: 2PSX) и только SPINK2 (PDB ID: 2JXD) в качестве матриц. После уточнения структуры были определены кристаллы комплекса KLK5/пептида K51034 с разрешением 1,8 Å. В элементарной ячейке содержалось по одной молекуле каждого KLK5 и SPINK2. Для молекулы SPINK2 была построена неполная молекулярная модель, содержащая сайт взаимодействия с KLK5, на основе информации о последовательности и наблюдаемой электронной плотности. Было подтверждено, что KLK5-ингибирующий пептид K51034 был связан с областью, содержащей активный центр фермента KLK5 (Фигура 4).

[0231] Пример 5. Получение Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида.

(5-1) Конструирование вектора, экспрессирующего Fc-гибрид KLK5-ингибирующего пептида.

С использованием нуклеотидной последовательности каждого ингибирующего пептида (SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 или 31) в качестве матрицы были амплифицированы фрагменты ингибирующего пептида с помощью ПЦР ((при 94°С в течение 15 секунд, при 60°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 20 секунд) × 30 циклов) с использованием нижеследующих праймеров и KOD-plus-(TOYOBO).

Праймер 16: 5'-AGATGGGTGTTGTCTGATGACGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3’ (SEQ ID NO: 81, фигура 89).

Праймер 17: 5'-GCAGGGGCCATTCCGGAT-3’ (SEQ ID NO: 82, фигура 90).

[0232] Фрагмент B амплифицировали с помощью ПЦР ((при 94°С в течение 15 секунд, при 60°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 10 секунд) × 30 циклов) с использованием нижеследующих праймеров и KOD-plus-(TOYOBO).

Праймер 18: 5'-AAAATCTAGAGCCGCCACCATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCT-3’ (SEQ ID NO: 83, фигура 91).

Праймер 19: 5'-AGACAACACCCATCTAGGAGCGGCCACCAGCAGCAGAAAGAACC-3’ (SEQ ID NO: 84, фигура 92).

[0233] С использованием Fc-области человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 87) в качестве матрицы, фрагмент C, содержащий Fc-область человеческого IgG1, амплифицировали с помощью ПЦР ((при 94°С в течение 15 секунд, при 60°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 30 секунд) × 30 циклов) с использованием нижеследующих праймеров и KOD-plus-(TOYOBO).

Праймер 20: 5'-ATCCGGAATGGCCCCTGCGAACCCAAGAGCTGCGAC-3’ (SEQ ID NO: 85, фигура 93)

Праймер 21: 5'-AAAAGTTTAAACTCATTTGCCGGGGCTCAG-3’ (SEQ ID NO: 86, фигура 94)

[0234] Нужные фрагменты ДНК амплифицировали с помощью перекрывающейся ПЦР с использованием фрагментов ингибирующего пептида, амплифицированных выше, фрагмента B, фрагмента C, праймера 18, праймера 21 и KOD-plus-(TOYOBO).

[0235] Кроме того, экспрессионный вектор клеток млекопитающих, содержащий Fc-гибрид pCMA_KLK5-ингибирующего пептида, был сконструирован путем клонирования с использованием рестриктирующих ферментов XbaI (NEB) и PmeI (NEB). Эту процедуру проводили по методике, описанной в (1-1).

[0236] (5-2) Получение Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида

Экспрессионный вектор, сконструированный, как описано в (5-1), трансфицировали в клетки Expi293F (Thermo Fisher Scientific), с использованием PEI MAX 40000 (Polysciences), и супернатант культуры собирали после 6-дневного культивирования клеток. Нужный Fc-гибрид собирали из супернатанта культуры с использованием MabSelect SuRe (GE healthcare), и буфер заменяли на PBS с использованием Amicon Ultra NMWL 10000 (Merck KGaA Millipore) с получением Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида. Из каждого клона, имеющего последовательность гликозилирования в KLK5-ингибирующем пептиде, последовательность гликозилирования удаляли путем замены одного остатка, и добавляли «dN» в качестве идентификатора, указывающего на дегликозилированную форму. Модификация последовательности гликозилирования вообще не влияет на активность, такую как KLK5-ингибирующая активность или перекрестная реактивность.

[0237] (5-3) Конструирование вектора D1-K50055-Fc, экспрессирующего Fc-гибрид KLK5-ингибирующего пептида

С использованием нуклеотидной последовательности KLK5-ингибирующего пептида K50055 (SEQ ID NO: 7) в качестве матрицы, фрагменты ингибирующего пептида амплифицировали с помощью ПЦР ((при 94°С в течение 15 секунд, при 60°С в течение 30 секунд и при 68°С в течение 20 секунд) × 30 циклов) с использованием нижеследующих праймеров и KOD-plus-(TOYOBO).

[0238] Праймер 22: 5'-AGATGGGTGTTGTCTGACGGCCCTCAGTTCGGCCTGTTC-3’ (SEQ ID NO: 94, фигура 104)

Праймер 17: 5'-GCAGGGGCCATTCCGGAT-3’(SEQ ID NO: 82, фигура 90)

[0239] Нужные фрагменты ДНК были амплифицированы с помощью перекрывающейся ПЦР с использованием фрагментов ингибирующего пептида, амплифицированных выше, и фрагмента B, фрагмента C, праймера 18 и праймера 21, которые были амплифицированы как описано в (5-1) и KOD-plus-(TOYOBO).

[0240] Кроме того, экспрессионный вектор клеток млекопитающих, содержащий Fc-гибрид pCMA_KLK5-ингибирующего пептида, был сконструирован путем клонирования с использованием рестриктирующих ферментов XbaI (NEB) и PmeI (NEB). Эту процедуру проводили по методике, описанной в (1-1).

[0241] (5-4) Получение Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc

Экспрессионный вектор, сконструированный, как описано в (5-3), трансфицировали в клетки Expi293F (Thermo Fisher Scientific) с использованием PEI MAX 40000 (Polysciences), и супернатант культуры собирали после 6-дневного культивирования клеток. Нужный Fc-гибрид собирали из супернатанта культуры с использованием MabSelect SuRe (GE healthcare), и буфер заменяли на PBS с использованием Amicon Ultra NMWL 10000 (Merck KGaA Millipore) с получением Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc.

[0242] Пример 6. Оценка Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида.

(6-1) Оценка Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида, обладающего активностью ингибирования человеческого/мышиного KLK5, человеческого/мышиного KLK7 и человеческого/мышиного KLK14

В соответствии со способом, описанным в Примере 3-1, оценивали ингибирующую активность каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида против человеческого/мышиного KLK5, человеческого/мышиного KLK7 и человеческого/мышиного KLK14. В результате вычисления степени разложения пептидного субстрата каждым Fc-гибридом ингибирующего пептида в каждой концентрации и вычисления 50% ингибирующей концентрации (IC₅₀) с использованием GraphPad Prism (версия 5.0; GraphPad Software Inc.), где степень разложения Fc-гибридом ингибирующего пептида в концентрации 0 нМ, была принята за 100%, было обнаружено, что все Fc-гибриды ингибирующего пептида подавляли ферментативную активность человеческого KLK5 при низких концентрациях (Таблица 1, фигура 5 и фигура 107). Некоторые из Fc-гибридов ингибирующого пептида подавляли ферментативную активность человеческого KLK7 или человеческого KLK14 при низких концентрациях, а некоторые Fc-гибридов ингибирующого пептида проявляли слабую ингибирующую активность против этих протеаз. Fc-гибриды ингибирующого пептида также проявляли аналогичную активность против мышиных KLK5, KLK7 или KLK14 (Таблица 5). Среднее значение для трех независимых экспериментов использовали для вычисления величины IC₅₀.

[0243] [Таблица 4]. Активность каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида против человеческого KLK5, человеческого KLK7 или человеческого KLK14

ID IC₅₀(нМ) для
hKLK5 IC₅₀(нМ) для
hKLK7 IC₅₀(нМ) для
hKLK14 D3-K51028-Fc 4,5±0,1 220±10 >1000 D3-K50032dN-Fc 3,9±0,3 >1000 >1000 D3-K50055-Fc 3,7±0,1 >1000 340±120 D3-K51069dN-Fc 4,5±0,4 >1000 42±11 D3-K51072-Fc 4,5±0,3 >1000 260±60 D3-K50015-Fc 3,1±0,2 >1000 4,5±1,3 D3-K50016dN-Fc 4,3±0,7 >1000 >1000 D3-K51034-Fc 5,7±0,8 >1000 960±320 D3-K50062-Fc 4,3±0,1 >1000 190±50 D3-K51090-Fc 4,6±0,5 >1000 350±30 D3-K50098dN-Fc 4,3±0,3 >1000 210±60 D3-K51005-Fc 8,6±1,4 28±3 >1000 D3-K50031-Fc 9,5±0,4 9,3±1,3 >1000 D3-K51057-Fc 12±1 18±1 >1000 D1-K50055-Fc 5,8±0,6 >1000 >1000

[0244] [Таблица 5]. Активность каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида против мышиного KLK5, мышиного KLK7 или мышиного KLK14

ID IC₅₀(нМ) для
mKLK5 IC₅₀(нМ) для mKLK7 IC₅₀(нМ) для mKLK14 D3-K51028-Fc 16 110 >1000 D3-K50032dN-Fc 26 >1000 >1000 D3-K50055-Fc 6,8 >1000 >1000 D3-K51069dN-Fc 6,8 410 24 D3-K51072-Fc 50 >1000 >1000 D3-K50015-Fc 4,4 340 48 D3-K50016dN-Fc 35 >1000 >1000 D3-K51034-Fc 39 >1000 >1000 D3-K50062-Fc 5,4 >1000 >1000 D3-K51090-Fc 5,1 730 510 D3-K50098dN-Fc 6,8 >1000 350 D3-K51005-Fc 330 37 240 D3-K50031-Fc 270 6,3 300 D3-K51057-Fc 600 24 380 D1-K50055-Fc 6,3 >1000 >1000

[0245] (6-2) Оценка перекрестной реактивности Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида

В соответствии с результатами, полученными как описано в (3-2), некоторые из Fc-гибридов ингибирующего пептида обладали слабой перекрестной реактивностью с бычьим трипсином, химотрипсином и плазмином в конечной концентрации ингибирующего пептида 1 мкМ (где значение IC₅₀ было менее чем 1 мкМ), но большинство ингибирующих пептидов не обладали ингибирующей активностью по отношению к какой-либо протеазе, кроме KLK (фигура 6). Некоторые из Fc-гибридов ингибирующего пептида обладали ингибирующей активностью по отношению к KLK4 или KLK12 в конечной концентрации 1 мкМ (где значение IC₅₀ было менее 1 мкМ), но многие из Fc-гибридов KLK5-ингибирующего пептида не обладали ингибирующей активностью по отношению к протеазам KLK, кроме KLK7 или KLK14. В соответствии с этим, было обнаружено, что Fc-гибриды ингибирующего пептида обладают такой же высокой специфичностью, как и ингибирующие пептиды.

[0246] (6-3) Оценка KLK5-ингибирующей активности Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида с использованием пептидного субстрата (вычисление константы ингибирования K_i)

Оценивали ингибирующую активность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида против человеческого KLK5 и вычисляли константу ингибирования K_i. Пептидный субстрат Boc-Val-Pro-Arg-AMC (R&D Systems, Inc., ES011) растворяли в ДМСО до 10 мМ и разводили аналитическим буфером (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 8,0) в конечной концентрации от 25 до 200 мкМ для дальнейшего использования. Затем смешивали 25 мкл человеческого KLK5 и 25 мкл Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида, разведенного аналитическим буфером, с последующей реакцией взаимодействия при 37°C в течение 20 минут. После этого добавляли 50 мкл субстрата, разведенного аналитическим буфером, и измеряли сигнал флуоресценции (возбуждение на 380 нм/излучение на 460 нм) с помощью Enspire. Человеческий KLK5 имел конечную концентрацию 10 нМ, Fc-гибрид KLK5-ингибирующего пептида имел конечную концентрацию от 0,5 до 25 нМ, а для проведения реакции и измерения использовали черный планшет PROTEOSAVE® SS96F (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.).

[0247] Была вычислена степень разложения пептидного субстрата под действием каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида в каждой концентрации и проведена оценка ингибирующей активности каждого Fc-гибрида ингибирующего пептида против человеческого KLK5, где степень разложения под действием Fc-гибрида ингибирующего пептида в концентрации 0 нМ была принята за 100% (фигура 102). С использованием GraphPad Prism (версии 5.0; GraphPad Software Inc.) была вычислена максимальная скорость реакции V_max и константа Михаэлиса K_m по уравнению Михаэлиса-Ментена при концентрации фермента 10 нМ. Кроме того, в результате вычисления константы ингибирования K_i при концентрации субстрата 100 мкМ с использованием GraphPad Prism по уравнению Моррисона было обнаружено, что все Fc-гибриды KLK5-ингибирующего пептида ингибировали ферментативную активность человеческого KLK5 при низких концентрациях (Таблица 6). Для вычисления величины K_i использовали среднее значение для трех независимых экспериментов.

[0248] [Таблица 6]. Константа ингибирования K_i человеческого KLK5 для каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида

ID K_i(пМ) D3-K50032dN-Fc 440±10 D3-K50055-Fc 190±60 D3-K51072-Fc 360±70 D3-K50016dN-Fc 360±40

[0249] (6-4) Оценка KLK5-ингибирующей активности Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида с использованием белкового субстрата.

С использованием человеческого десмоглеина 1 и человеческого десмоколлина 1 в качестве белковых субстратов оценивали KLK5-ингибирующую активность каждого Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида. Человеческий KLK5 и каждый Fc-гибрид KLK5-ингибирующего пептида (D3-K50032dN-Fc, D3-K50055-Fc, D3-K51072-Fc или D3-K50016dN-Fc), разведенного аналитическим буфером, смешивали и проводили реакцию взаимодействия при 37°C в течение 1 часа. Затем добавляли каждый белковый субстрат, разведенный аналитическим буфером, и проводили реакцию взаимодействия при 37°C в течение 4 часов. После этого добавляли буфер для образцов ДСН, содержащий восстановитель, и ферментативную реакцию прекращали путем обработки при 99°С в течение 5 минут. После этого оценивали степень разложения белкового субстрата с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (в восстанавливающих условиях) и Вестерн-блот-анализа. Комбинации субстрата и фермента, Fc-гибрида ингибирующего пептида и антитела для Вестерн-блот-анализа представлены ниже.

[0250] Оценка с использованием человеческого десмоглеина 1: hKLK5 в конечной концентрации 1 мкМ, Fc-гибрид ингибирующего пептида в конечной концентрации от 0,001 до 10 мкМ, рекомбинантный химерный Fc-белок человеческого десмоглеина-1 в конечной концентрации 1 мкМ (R&D Systems, Inc.), антитело против десмоглеина-1 (аминокислоты 471-499) (LSBio) и ПХ-конъюгированный F(ab')₂-фрагмент ослиного антитела против кроличьих IgG (GE healthcare).

[0251] Оценка с использованием человеческого десмоколлина 1: hKLK5 в конечной концентрации 0,2 мкМ, Fc-гибрид ингибирующего пептида в конечной концентрации от 0,0002 до 2 мкМ, рекомбинантный человеческий белок десмоколлина-1 с С-концевой His-меткой в конечной концентрации 2 мкМ (R&D Systems, Inc.) и ПХ-конъюгат с пятью His (QIAGEN).

[0252] Человеческий десмоглеин 1 и человеческий десмоколлин 1 не разлагались в отсутствии человеческого KLK5, но полностью разлагались в присутствии человеческого KLK5. В результате оценки человеческого KLK5, предварительно инкубированного с каждым Fc-гибридом KLK5-ингибирующего пептида, было обнаружено, что каждый из Fc-гибридов ингибирующего пептида ингибирует активность человеческого фермента KLK5 в отношении разложения человеческого десмоглеина 1 и человеческого десмоколлина 1. В условиях, при которых концентрация человеческого KLK5 и концентрация Fc-гибрида ингибирующего пептида были одинаковыми, разложение человеческого десмоглеина 1 и человеческого десмоколлина 1 полностью ингибировалось (фигура 103).

[0253] Пример 7. Влияние Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида на подавление увеличения трансэпидермальной потери воды (TEWL) у мышей с моделью синдрома Нетертона.

(7-1) Мыши с моделью синдрома Нетертона

Мыши Crusty2, имеющие мутацию в SPINK5, которая представляет собой ген, вызывающий синдром Нетертона, известны как мыши с моделью синдрома Нетертона, где у аллогенных мышей Crusty2 (+/+) обнаруживались кожные симптомы (база данных Mutagenetix).

[0254] (7-2) Влияние Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида на подавление увеличения TEWL у мышей с моделью синдрома Нетертона.

Мышей Crusty2 (+/-) и мышей Crusty2 (+/+) скрещивали путем искусственного осеменения, и Fc-гибрид KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc, полученный как описано в (5-4), оценивали с использованием полученного потомства (мышей Crusty2 (+/-) или мышей Crusty2 (+/+)). На днь 0 или день 1 после рождения, мышам подкожно вводили PBS или 100 мг/кг D1-K50055-Fc через день в течение 4 недель. И только при первом введении вводили 3-кратное количество D1-K50055-Fc в качестве загрузочной дозы. С использованием VAPO SCAN (AS-VT100RS, Asahi Techno Lab. Ltd.), TEWL на коже спинки или бедра мышей измеряли через 2 и 4 недели после введения (фигура 7). Количество мышей Crusty2 (+/-) составляло 9, а количество мышей Crusty2 (+/+) составляло 12 в каждой группе, получавшей PBS, и в группе, получавшей D1-K50055-Fc.

[0255] У мышей Crusty2 (+/+) наблюдалось статистически значимое увеличение TEWL по сравнению с мышами Crusty2 (+/-), и такое увеличение было более заметным у 4-недельных мышей по сравнению с 2-недельными мышами. Через 4 недели после введения наблюдалось статистически значимое снижение TEWL как в спинке, так и в более серьезно пораженных бедрах в группе, получавшей D1-K50055-Fc, по сравнению с группой, получавшей PBS. Исходя из всего вышесказанного можно сделать вывод, что у мышей наблюдалось увеличение TEWL, вызванное мутацией в SPINK5, а D1-K50055-Fc оказывал ингибирующее действие. Кроме того, было показано, что пептиды согласно изобретению и их конъюгаты, включая D1-K50055-Fc, являются эффективными для ослабления кожных симптомов синдрома Нетертона.

[0256] Промышленное применение

Пептид и конъюгат согласно изобретению и содержащая их фармацевтическая композиция могут быть использованы для лечения различных заболеваний.

[0257] Список последовательностей в свободном формате

SEQ ID NO: 1: Аминокислотная последовательность человеческого SPINK2 (фигура 9).

SEQ ID NO: 2: Аминокислотная последовательность человеческого KLK5 (фигура 10).

SEQ ID NO: 3: Аминокислотная последовательность человеческого KLK7 (фигура 11).

SEQ ID NO: 4: Аминокислотная последовательность человеческого KLK14 (фигура 12).

SEQ ID NO: 5: Нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50032 (фигура 13).

SEQ ID NO: 6: Аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50032 (фигура 14).

SEQ ID NO: 7: Нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50055 (фигура 15).

SEQ ID NO: 8: Аминокислотная последовательность ингибирующего KLK5 пептида K50055 (фигура 16).

SEQ ID NO: 9: Нуклеотидная последовательность ингибирующего KLK5 пептида K51072 (фигура 17).

SEQ ID NO: 10: Аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51072 (фигура 18).

SEQ ID NO: 11: Нуклеотидная последовательность ингибирующего KLK5 пептида K50016 (фигура 19).

SEQ ID NO: 12: Аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50016 (фигура 20).

SEQ ID NO: 13: нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51034 (фигура 21).

SEQ ID NO: 14: Аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51034 (фигура 22).

SEQ ID NO: 15: нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50062 (фигура 23).

SEQ ID NO: 16: Аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50062 (фигура 24).

SEQ ID NO: 17: Нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51090 (фигура 25).

SEQ ID NO: 18: Аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K51090 (фигура 26).

SEQ ID NO: 19: Нуклеотидная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50098 (фигура 27).

SEQ ID NO: 20: Аминокислотная последовательность KLK5-ингибирующего пептида K50098 (фигура 28).

SEQ ID NO: 21: Нуклеотидная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51028 (фигура 29).

SEQ ID NO: 22: Аминокислотная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51028 (фигура 30).

SEQ ID NO: 23: Нуклеотидная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51005 (фигура 31).

SEQ ID NO: 24: Аминокислотная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51005 (фигура 32).

SEQ ID NO: 25: Нуклеотидная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K50031 (фигура 33).

SEQ ID NO: 26: Аминокислотная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K50031 (фигура 34).

SEQ ID NO: 27: Нуклеотидная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51057 (фигура 35).

SEQ ID NO: 28: Аминокислотная последовательность KLK5/KLK7-ингибирующего пептида K51057 (фигура 36).

SEQ ID NO: 29: Нуклеотидная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида K51069 (фигура 37).

SEQ ID NO: 30: Аминокислотная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида K51069 (фигура 38).

SEQ ID NO: 31: Нуклеотидная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида K50015 (фигура 39).

SEQ ID NO: 32: Аминокислотная последовательность KLK5/KLK14-ингибирующего пептида K50015 (фигура 40).

SEQ ID NO: 33: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50032dN-Fc (фигура 41).

SEQ ID NO: 34: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50032dN-Fc (фигура 42).

SEQ ID NO: 35: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50055-Fc (фигура 43).

SEQ ID NO: 36: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50055-Fc (фигура 44).

SEQ ID NO: 37: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51072-Fc (фигура 45).

SEQ ID NO: 38: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51072-Fc (фигура 46).

SEQ ID NO: 39: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50016dN-Fc (фигура 47).

SEQ ID NO: 40: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50016dN-Fc (фигура 48).

SEQ ID NO: 41: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51034-Fc (фигура 49).

SEQ ID NO: 42: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51034-Fc (фигура 50).

SEQ ID NO: 43: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50062-Fc (фигура 51).

SEQ ID NO: 44: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50062-Fc (фигура 52).

SEQ ID NO: 45: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51090-Fc (фигура 53).

SEQ ID NO: 46: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K51090-Fc (фигура 54).

SEQ ID NO: 47: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50098dN-Fc (фигура 55).

SEQ ID NO: 48: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D3-K50098dN-Fc (фигура 56).

SEQ ID NO: 49: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51028-Fc (фигура 57).

SEQ ID NO: 50: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51028-Fc (фигура 58).

SEQ ID NO: 51: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51005-Fc (фигура 59).

SEQ ID NO: 52: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51005-Fc (фигура 60).

SEQ ID NO: 53: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K50031-Fc (фигура 61).

SEQ ID NO: 54: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K50031-Fc (фигура 62).

SEQ ID NO: 55: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51057-Fc (фигура 63).

SEQ ID NO: 56: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK7-ингибирующего пептида D3-K51057-Fc (фигура 64).

SEQ ID NO: 57: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK14-ингибирующего пептида D3-K51069dN-Fc (фигура 65).

SEQ ID NO: 58: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK14-ингибирующего пептида D3-K51069dN-Fc (фигура 66).

SEQ ID NO: 59: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK14-ингибирующего пептида D3-K50015-Fc (фигура 67).

SEQ ID NO: 60: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5/KLK14-ингибирующего пептида D3-K50015-Fc (фигура 68).

SEQ ID NO: 61: Формула мутантного пептида SPINK2 (фигура 69).

SEQ ID NO: 62: Нуклеотидная последовательность праймера 1 (фиг. 70).

SEQ ID NO: 63: Нуклеотидная последовательность праймера 2 (фиг.71).

SEQ ID NO: 64: Нуклеотидная последовательность праймера 3 (фигура 72).

SEQ ID NO: 65: Нуклеотидная последовательность праймера 4 (фигура 73).

SEQ ID NO: 66: Нуклеотидная последовательность праймера 5 (фиг. 74).

SEQ ID NO: 67: Нуклеотидная последовательность праймера 6 (фиг. 75).

SEQ ID NO: 68: Нуклеотидная последовательность праймера 7 (фигура 76).

SEQ ID NO: 69: Нуклеотидная последовательность праймера 8 (фигура 77).

SEQ ID NO: 70: Нуклеотидная последовательность праймера 9 (фигура 78).

SEQ ID NO: 71: Нуклеотидная последовательность праймера 10 (фигура 79).

SEQ ID NO: 72: Нуклеотидная последовательность праймера 11 (фигура 80).

SEQ ID NO: 73: Нуклеотидная последовательность праймера 12 (фигура 81).

SEQ ID NO: 74: Нуклеотидная последовательность праймера 13 (фигура 82).

SEQ ID NO: 75: Нуклеотидная последовательность праймера 14 (фигура 83).

SEQ ID NO: 76: Нуклеотидная последовательность праймера 15 (фигура 84).

SEQ ID NO: 77: Аминокислотная последовательность в пептидном субстрате KLK7 (фигура 85).

SEQ ID NO: 78: Аминокислотная последовательность в пептидном субстрате бычьего α-химотрипсина (фигура 86).

SEQ ID NO: 79: Аминокислотная последовательность в пептидном субстрате эластазы нейтрофилов (фигура 87).

SEQ ID NO: 80: Аминокислотная последовательность в пептидном субстрате человеческого белка C (фигура 88).

SEQ ID NO: 81: Нуклеотидная последовательность праймера 16 (фигура 89).

SEQ ID NO: 82: Нуклеотидная последовательность праймера 17 (фигура 90).

SEQ ID NO: 83: Нуклеотидная последовательность праймера 18 (фигура 91).

SEQ ID NO: 84: Нуклеотидная последовательность праймера 19 (фигура 92).

SEQ ID NO: 85: Нуклеотидная последовательность праймера 20 (фигура 93).

SEQ ID NO: 86: Нуклеотидная последовательность праймера 21 (фигура 94).

SEQ ID NO: 87: Аминокислотная последовательность Fc человеческого IgG1 (фигура 95).

SEQ ID NO: 88: Аминокислотная последовательность D8 человеческого SPINK5 (фигура 96).

SEQ ID NO: 89: Аминокислотная последовательность D9 человеческого SPINK5 (фигура 97).

SEQ ID NO: 90: Аминокислотная последовательность человеческого SPINK9 (фигура 98).

SEQ ID NO: 91: Аминокислотная последовательность мышиного KLK5 (фигура 99).

SEQ ID NO: 92: Аминокислотная последовательность мышиного KLK7 (фигура 100).

SEQ ID NO: 93: Аминокислотная последовательность мышиного KLK14 (фигура 101).

SEQ ID NO: 94: Нуклеотидная последовательность праймера 22 (фигура 104).

SEQ ID NO: 95: Нуклеотидная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc (фигура 105).

SEQ ID NO: 96: Аминокислотная последовательность Fc-гибрида KLK5-ингибирующего пептида D1-K50055-Fc (фигура 106).

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED

<120> KLK5-ИНГИБИРУЮЩИЙ ПЕПТИД

<130> FP1933

<150> JP2018-209729

<151> 2018-11-07

<160> 97

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg His Phe Asn Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys

50 55 60

<210> 2

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ile Ile Asn Gly Ser Asp Cys Asp Met His Thr Gln Pro Trp Gln Ala

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Arg Pro Asn Gln Leu Tyr Cys Gly Ala Val Leu Val

20 25 30

His Pro Gln Trp Leu Leu Thr Ala Ala His Cys Arg Lys Lys Val Phe

35 40 45

Arg Val Arg Leu Gly His Tyr Ser Leu Ser Pro Val Tyr Glu Ser Gly

50 55 60

Gln Gln Met Phe Gln Gly Val Lys Ser Ile Pro His Pro Gly Tyr Ser

65 70 75 80

His Pro Gly His Ser Asn Asp Leu Met Leu Ile Lys Leu Asn Arg Arg

85 90 95

Ile Arg Pro Thr Lys Asp Val Arg Pro Ile Asn Val Ser Ser His Cys

100 105 110

Pro Ser Ala Gly Thr Lys Cys Leu Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Lys

115 120 125

Ser Pro Gln Val His Phe Pro Lys Val Leu Gln Cys Leu Asn Ile Ser

130 135 140

Val Leu Ser Gln Lys Arg Cys Glu Asp Ala Tyr Pro Arg Gln Ile Asp

145 150 155 160

Asp Thr Met Phe Cys Ala Gly Asp Lys Ala Gly Arg Asp Ser Cys Gln

165 170 175

Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Ser Leu Gln Gly Leu

180 185 190

Val Ser Trp Gly Asp Tyr Pro Cys Ala Arg Pro Asn Arg Pro Gly Val

195 200 205

Tyr Thr Asn Leu Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Gln Glu Thr Ile Gln

210 215 220

Ala Asn Ser

225

<210> 3

<211> 224

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ile Ile Asp Gly Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser His Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Ala Leu Leu Ser Gly Asn Gln Leu His Cys Gly Gly Val Leu Val Asn

20 25 30

Glu Arg Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Met Asn Glu Tyr Thr

35 40 45

Val His Leu Gly Ser Asp Thr Leu Gly Asp Arg Arg Ala Gln Arg Ile

50 55 60

Lys Ala Ser Lys Ser Phe Arg His Pro Gly Tyr Ser Thr Gln Thr His

65 70 75 80

Val Asn Asp Leu Met Leu Val Lys Leu Asn Ser Gln Ala Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Met Val Lys Lys Val Arg Leu Pro Ser Arg Cys Glu Pro Pro Gly

100 105 110

Thr Thr Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr Ser Pro Asp Val

115 120 125

Thr Phe Pro Ser Asp Leu Met Cys Val Asp Val Lys Leu Ile Ser Pro

130 135 140

Gln Asp Cys Thr Lys Val Tyr Lys Asp Leu Leu Glu Asn Ser Met Leu

145 150 155 160

Cys Ala Gly Ile Pro Asp Ser Lys Lys Asn Ala Cys Asn Gly Asp Ser

165 170 175

Gly Gly Pro Leu Val Cys Arg Gly Thr Leu Gln Gly Leu Val Ser Trp

180 185 190

Gly Thr Phe Pro Cys Gly Gln Pro Asn Asp Pro Gly Val Tyr Thr Gln

195 200 205

Val Cys Lys Phe Thr Lys Trp Ile Asn Asp Thr Met Lys Lys His Arg

210 215 220

<210> 4

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ile Ile Gly Gly His Thr Cys Thr Arg Ser Ser Gln Pro Trp Gln Ala

1 5 10 15

Ala Leu Leu Ala Gly Pro Arg Arg Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ala Leu

20 25 30

Leu Ser Gly Gln Trp Val Ile Thr Ala Ala His Cys Gly Arg Pro Ile

35 40 45

Leu Gln Val Ala Leu Gly Lys His Asn Leu Arg Arg Trp Glu Ala Thr

50 55 60

Gln Gln Val Leu Arg Val Val Arg Gln Val Thr His Pro Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Ser Arg Thr His Asp Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Gln Gln Pro

85 90 95

Ala Arg Ile Gly Arg Ala Val Arg Pro Ile Glu Val Thr Gln Ala Cys

100 105 110

Ala Ser Pro Gly Thr Ser Cys Arg Val Ser Gly Trp Gly Thr Ile Ser

115 120 125

Ser Pro Ile Ala Arg Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Cys Val Asn Ile Asn

130 135 140

Ile Ser Pro Asp Glu Val Cys Gln Lys Ala Tyr Pro Arg Thr Ile Thr

145 150 155 160

Pro Gly Met Val Cys Ala Gly Val Pro Gln Gly Gly Lys Asp Ser Cys

165 170 175

Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Arg Gly Gln Leu Gln Gly

180 185 190

Leu Val Ser Trp Gly Met Glu Arg Cys Ala Leu Pro Gly Tyr Pro Gly

195 200 205

Val Tyr Thr Asn Leu Cys Lys Tyr Arg Ser Trp Ile Glu Glu Thr Met

210 215 220

Arg Asp Lys

225

<210> 5

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 5

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt ctg 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Leu

1 5 10 15

aac tgg act gac cat cag tgt gaa cgt gac tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Asn Trp Thr Asp His Gln Cys Glu Arg Asp Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 6

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Leu

1 5 10 15

Asn Trp Thr Asp His Gln Cys Glu Arg Asp Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 7

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 7

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt gct 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala

1 5 10 15

aac act atg aaa cag gac tgt act cgt gaa tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Asn Thr Met Lys Gln Asp Cys Thr Arg Glu Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 8

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ala

1 5 10 15

Asn Thr Met Lys Gln Asp Cys Thr Arg Glu Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 9

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 9

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt cag 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gln

1 5 10 15

gaa gac atg act gaa tac tgt gct cgt gac ttc gac ccg gtt tgt ggt 96

Glu Asp Met Thr Glu Tyr Cys Ala Arg Asp Phe Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 10

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gln

1 5 10 15

Glu Asp Met Thr Glu Tyr Cys Ala Arg Asp Phe Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 11

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 11

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt tct 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser

1 5 10 15

cag tgg cag tac tct tct tgt gac cgt gtt tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Gln Trp Gln Tyr Ser Ser Cys Asp Arg Val Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 12

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser

1 5 10 15

Gln Trp Gln Tyr Ser Ser Cys Asp Arg Val Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 13

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 13

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt ggt 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gly

1 5 10 15

cgt tac act act ggt ggt tgt aac aaa gaa tac gaa ccg gtt tgt ggt 96

Arg Tyr Thr Thr Gly Gly Cys Asn Lys Glu Tyr Glu Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 14

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gly

1 5 10 15

Arg Tyr Thr Thr Gly Gly Cys Asn Lys Glu Tyr Glu Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 15

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 15

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt cag 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gln

1 5 10 15

cag tac cgt gaa ctg ggt tgt ggt cgt cag tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Gln Tyr Arg Glu Leu Gly Cys Gly Arg Gln Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 16

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gln

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Glu Leu Gly Cys Gly Arg Gln Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 17

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 17

ggc ccg caa ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt gac 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Asp

1 5 10 15

gaa atc ggt aaa tac ggt tgt ggt cgt tct tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Glu Ile Gly Lys Tyr Gly Cys Gly Arg Ser Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 18

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Asp

1 5 10 15

Glu Ile Gly Lys Tyr Gly Cys Gly Arg Ser Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 19

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 19

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt act 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Thr

1 5 10 15

tct cag act ctg ggt tct tgt tct cgt gaa tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Ser Gln Thr Leu Gly Ser Cys Ser Arg Glu Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 20

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Thr

1 5 10 15

Ser Gln Thr Leu Gly Ser Cys Ser Arg Glu Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 21

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 21

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt tac 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Tyr

1 5 10 15

cag tac cgt tct aaa ggt tgt act cat gaa tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Gln Tyr Arg Ser Lys Gly Cys Thr His Glu Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 22

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Tyr

1 5 10 15

Gln Tyr Arg Ser Lys Gly Cys Thr His Glu Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 23

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 23

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt atg 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Met

1 5 10 15

cag cat gct cgt cag ggt tgt cat tac gac tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Gln His Ala Arg Gln Gly Cys His Tyr Asp Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 24

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Met

1 5 10 15

Gln His Ala Arg Gln Gly Cys His Tyr Asp Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 25

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 25

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt ggt 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gly

1 5 10 15

gaa tac aaa ggt cgt ggt tgt tac tac cat tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Glu Tyr Lys Gly Arg Gly Cys Tyr Tyr His Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 26

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gly

1 5 10 15

Glu Tyr Lys Gly Arg Gly Cys Tyr Tyr His Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 27

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 27

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt ggt 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gly

1 5 10 15

act atg cag ggt tct ggt tgt act tac cat tac gaa ccg gtt tgt ggt 96

Thr Met Gln Gly Ser Gly Cys Thr Tyr His Tyr Glu Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 28

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gly

1 5 10 15

Thr Met Gln Gly Ser Gly Cys Thr Tyr His Tyr Glu Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 29

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 29

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt tct 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser

1 5 10 15

cag gtt gtt gaa act tac tgt aac cgt gac tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Gln Val Val Glu Thr Tyr Cys Asn Arg Asp Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 30

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser

1 5 10 15

Gln Val Val Glu Thr Tyr Cys Asn Arg Asp Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 31

<211> 198

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(198)

<400> 31

ggc ccg cag ttt ggt ctg ttt agc aaa tat cgt acc ccg aat tgt tac 48

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Tyr

1 5 10 15

gac act act act cat tac tgt tct cgt gaa tac gac ccg gtt tgt ggt 96

Asp Thr Thr Thr His Tyr Cys Ser Arg Glu Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

agc gat atg agc acc tat gca aat gaa tgt acc ctg tgc atg aaa att 144

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

cgt gaa ggt ggc cat aat att aaa att att cgc aat ggt ccg tgc ggc 192

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

ggc taa 198

Gly

65

<210> 32

<211> 65

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 32

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Tyr

1 5 10 15

Asp Thr Thr Thr His Tyr Cys Ser Arg Glu Tyr Asp Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys Gly

50 55 60

Gly

65

<210> 33

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 33

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc ctg cag tgg act gac cat cag tgt gaa cgt gac tac gac cct 96

Asn Cys Leu Gln Trp Thr Asp His Gln Cys Glu Arg Asp Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 34

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Leu Gln Trp Thr Asp His Gln Cys Glu Arg Asp Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 35

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 35

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc gct aac act atg aaa cag gac tgt act cgt gaa tac gac cct 96

Asn Cys Ala Asn Thr Met Lys Gln Asp Cys Thr Arg Glu Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 36

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Ala Asn Thr Met Lys Gln Asp Cys Thr Arg Glu Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 37

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 37

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc cag gaa gac atg act gaa tac tgt gct cgt gac ttc gac cct 96

Asn Cys Gln Glu Asp Met Thr Glu Tyr Cys Ala Arg Asp Phe Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 38

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 38

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Gln Glu Asp Met Thr Glu Tyr Cys Ala Arg Asp Phe Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 39

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 39

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc ggc cag tgg cag tac tct tct tgt gac cgt gtt tac gac cct 96

Asn Cys Gly Gln Trp Gln Tyr Ser Ser Cys Asp Arg Val Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 40

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 40

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Gly Gln Trp Gln Tyr Ser Ser Cys Asp Arg Val Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 41

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 41

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc ggt cgt tac act act ggt ggt tgt aac aaa gaa tac gaa cct 96

Asn Cys Gly Arg Tyr Thr Thr Gly Gly Cys Asn Lys Glu Tyr Glu Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 42

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 42

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Gly Arg Tyr Thr Thr Gly Gly Cys Asn Lys Glu Tyr Glu Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 43

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 43

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc cag cag tac cgt gaa ctg ggt tgt ggt cgt cag tac gac cct 96

Asn Cys Gln Gln Tyr Arg Glu Leu Gly Cys Gly Arg Gln Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 44

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 44

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Gln Gln Tyr Arg Glu Leu Gly Cys Gly Arg Gln Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 45

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 45

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc gac gaa atc ggt aaa tac ggt tgt ggt cgt tct tac gac cct 96

Asn Cys Asp Glu Ile Gly Lys Tyr Gly Cys Gly Arg Ser Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 46

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 46

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Asp Glu Ile Gly Lys Tyr Gly Cys Gly Arg Ser Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 47

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 47

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc ggc tct cag act ctg ggt tct tgt tct cgt gaa tac gac cct 96

Asn Cys Gly Ser Gln Thr Leu Gly Ser Cys Ser Arg Glu Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 48

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Gly Ser Gln Thr Leu Gly Ser Cys Ser Arg Glu Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 49

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 49

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc tac cag tac aga agc aag ggc tgc acc cac gag tac gat cct 96

Asn Cys Tyr Gln Tyr Arg Ser Lys Gly Cys Thr His Glu Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 50

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 50

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Tyr Gln Tyr Arg Ser Lys Gly Cys Thr His Glu Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 51

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 51

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc atg cag cat gct cgt cag ggt tgt cat tac gac tac gac cct 96

Asn Cys Met Gln His Ala Arg Gln Gly Cys His Tyr Asp Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 52

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 52

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Met Gln His Ala Arg Gln Gly Cys His Tyr Asp Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 53

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 53

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc ggt gaa tac aaa ggt cgt ggt tgt tac tac cat tac gac cct 96

Asn Cys Gly Glu Tyr Lys Gly Arg Gly Cys Tyr Tyr His Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 54

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 54

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Gly Glu Tyr Lys Gly Arg Gly Cys Tyr Tyr His Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 55

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 55

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc ggt act atg cag ggt tct ggt tgt act tac cat tac gaa cct 96

Asn Cys Gly Thr Met Gln Gly Ser Gly Cys Thr Tyr His Tyr Glu Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 56

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 56

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Gly Thr Met Gln Gly Ser Gly Cys Thr Tyr His Tyr Glu Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 57

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 57

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc ggc cag gtt gtt gaa act tac tgt aac cgt gac tac gac cct 96

Asn Cys Gly Gln Val Val Glu Thr Tyr Cys Asn Arg Asp Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 58

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 58

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Gly Gln Val Val Glu Thr Tyr Cys Asn Arg Asp Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 59

<211> 897

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> связывающий агент

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(897)

<400> 59

gat gac gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct 48

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

aac tgc tac gac act act act cat tac tgt tct cgt gaa tac gac cct 96

Asn Cys Tyr Asp Thr Thr Thr His Tyr Cys Ser Arg Glu Tyr Asp Pro

20 25 30

gtg tgc ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc 144

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

atg aag atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc 192

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

ccc tgc gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt 240

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

cct gcc ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca 288

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc 336

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

gtg gtg gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg 384

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag 432

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg 480

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

cat cag gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 528

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

aag gcc ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc 576

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

cag ccc cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag 624

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

atg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac 672

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

ccc agc gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac 720

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc 768

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac 816

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 864

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

cag aag tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 897

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 60

<211> 298

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 60

Asp Asp Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro

1 5 10 15

Asn Cys Tyr Asp Thr Thr Thr His Tyr Cys Ser Arg Glu Tyr Asp Pro

20 25 30

Val Cys Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys

35 40 45

Met Lys Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly

50 55 60

Pro Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

65 70 75 80

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

85 90 95

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

100 105 110

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

115 120 125

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

130 135 140

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

145 150 155 160

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

165 170 175

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

180 185 190

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

195 200 205

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

225 230 235 240

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

245 250 255

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

260 265 270

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

275 280 285

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 61

<211> 63

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> формула

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (16)..(22)

<223> Xaa представляет собой любую аминокислоту

<220>

<221> ДОМЕН

<222> (24)..(28)

<223> Xaa представляет собой любую аминокислоту

<400> 61

Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Val Cys Gly

20 25 30

Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile

35 40 45

Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys

50 55 60

<210> 62

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 62

aaaaggatcc ctggacaaac gtggcccgca gtttggtctg tttag 45

<210> 63

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 63

aaaactcgag ttagccgccg cacggaccat tgcgaataa 39

<210> 64

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 64

ggcgattata aagatgacga tgataaacac catcaccacc atc 43

<210> 65

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 65

gtttaaactc aatgatggtg gtgatggtgt ttatcatcgt cat 43

<210> 66

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 66

aaaatctaga gccgccacca tggccacagc tagaccccct 40

<210> 67

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 67

cgtcatcttt ataatcgccg ctgttggcct ggatggtttc ctg 43

<210> 68

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 68

aaaatctaga gccgccacca tggccagatc tctgctgctg ccc 43

<210> 69

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 69

cgtcatcttt ataatcgccc cggtgtttct tcatggtgtc gtt 43

<210> 70

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 70

aaaatctaga gccgccacca tgttcctcct cctcaccgcc ctc 43

<210> 71

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 71

cgtcatcttt ataatcgccc ttgtcgcgca tggtctcctc gat 43

<210> 72

<211> 34

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 72

aaaagtttaa actcaatgat ggtggtgatg gtgt 34

<210> 73

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 73

aaaatctaga gccgccacca tgggagtgtg gctgctgagc ctg 43

<210> 74

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 74

aaaagtttaa actcaatgat ggtggtgatg gtgccggtgg gtcttcatgg tttccatg 58

<210> 75

<211> 43

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 75

aaaatctaga gccgccacca tgtttctgct gctgatcatc ctg 43

<210> 76

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 76

aaaagtttaa actcaatgat ggtggtgatg gtggttgctc tgcatggtcc gctgaa 56

<210> 77

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Субстрат

<220>

<221> ПЕПТИД

<222> (7)..(7)

<223> Xaa представляет собой Nva

<400> 77

Arg Pro Lys Pro Val Glu Xaa Trp Arg Lys

1 5 10

<210> 78

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Субстрат

<400> 78

Leu Leu Val Tyr

1

<210> 79

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Субстрат

<400> 79

Ala Ala Pro Val

1

<210> 80

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Субстрат

<400> 80

Leu Ser Thr Arg

1

<210> 81

<211> 45

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 81

agatgggtgt tgtctgatga cgacggccct cagttcggcc tgttc 45

<210> 82

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 82

gcaggggcca ttccggat 18

<210> 83

<211> 48

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 83

aaaatctaga gccgccacca tgaagcacct gtggttcttt ctgctgct 48

<210> 84

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 84

agacaacacc catctaggag cggccaccag cagcagaaag aacc 44

<210> 85

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 85

atccggaatg gcccctgcga acccaagagc tgcgac 36

<210> 86

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 86

aaaagtttaa actcatttgc cggggctcag 30

<210> 87

<211> 232

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 87

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 88

<211> 62

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88

Glu Ala Ala Lys Glu Ile Cys Ser Glu Phe Arg Asp Gln Val Arg Asn

1 5 10 15

Gly Thr Leu Ile Cys Thr Arg Glu His Asn Pro Val Arg Gly Pro Asp

20 25 30

Gly Lys Met His Gly Asn Lys Cys Ala Met Cys Ala Ser Val Phe Lys

35 40 45

Leu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asn Asp Lys Glu Glu Lys Gly

50 55 60

<210> 89

<211> 62

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 89

Glu Ala Val Gln Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg His Tyr Val Arg Asn

1 5 10 15

Gly Arg Leu Pro Cys Thr Arg Glu Asn Asp Pro Ile Glu Gly Leu Asp

20 25 30

Gly Lys Ile His Gly Asn Thr Cys Ser Met Cys Glu Ala Phe Phe Gln

35 40 45

Gln Glu Ala Lys Glu Lys Glu Arg Ala Glu Pro Arg Ala Lys

50 55 60

<210> 90

<211> 67

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90

Ile Glu Cys Ala Lys Gln Thr Lys Gln Met Val Asp Cys Ser His Tyr

1 5 10 15

Lys Lys Leu Pro Pro Gly Gln Gln Arg Phe Cys His His Met Tyr Asp

20 25 30

Pro Ile Cys Gly Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Lys Asn Asp Cys Phe Phe

35 40 45

Cys Ser Lys Val Lys Lys Thr Asp Gly Thr Leu Lys Phe Val His Phe

50 55 60

Gly Lys Cys

65

<210> 91

<211> 227

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 91

Arg Ile Val Asn Gly Ser Asp Cys Gln Lys Asp Ala Gln Pro Trp Gln

1 5 10 15

Gly Ala Leu Leu Leu Gly Pro Asn Lys Leu Tyr Cys Gly Ala Val Leu

20 25 30

Ile Ser Pro Gln Trp Leu Leu Thr Ala Ala His Cys Arg Lys Pro Val

35 40 45

Phe Arg Ile Arg Leu Gly His His Ser Met Ser Pro Val Tyr Glu Ser

50 55 60

Gly Gln Gln Met Phe Gln Gly Ile Lys Ser Ile Pro His Pro Gly Tyr

65 70 75 80

Ser His Pro Gly His Ser Asn Asp Leu Met Leu Ile Lys Met Asn Arg

85 90 95

Lys Ile Arg Asp Ser His Ser Val Lys Pro Val Glu Ile Ala Cys Asp

100 105 110

Cys Ala Thr Glu Gly Thr Arg Cys Met Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr

115 120 125

Ser Ser Ser His Asn Asn Phe Pro Lys Val Leu Gln Cys Leu Asn Ile

130 135 140

Thr Val Leu Ser Glu Glu Arg Cys Lys Asn Ser Tyr Pro Gly Gln Ile

145 150 155 160

Asp Lys Thr Met Phe Cys Ala Gly Asp Glu Glu Gly Arg Asp Ser Cys

165 170 175

Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn Gly Lys Leu Gln Gly

180 185 190

Leu Val Ser Trp Gly Asp Phe Pro Cys Ala Gln Arg Asn Arg Pro Gly

195 200 205

Val Tyr Thr Asn Leu Cys Glu Phe Val Lys Trp Ile Lys Asp Thr Met

210 215 220

Asn Ser Asn

225

<210> 92

<211> 225

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 92

Arg Ile Ile Asp Gly Tyr Lys Cys Lys Glu Gly Ser His Pro Trp Gln

1 5 10 15

Val Ala Leu Leu Lys Gly Asn Gln Leu His Cys Gly Gly Val Leu Val

20 25 30

Asp Lys Tyr Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Lys Met Gly Gln Tyr

35 40 45

Gln Val Gln Leu Gly Ser Asp Lys Ile Gly Asp Gln Ser Ala Gln Lys

50 55 60

Ile Lys Ala Thr Lys Ser Phe Arg His Pro Gly Tyr Ser Thr Lys Thr

65 70 75 80

His Val Asn Asp Ile Met Leu Val Arg Leu Asp Glu Pro Val Lys Met

85 90 95

Ser Ser Lys Val Glu Ala Val Gln Leu Pro Glu His Cys Glu Pro Pro

100 105 110

Gly Thr Ser Cys Thr Val Ser Gly Trp Gly Thr Thr Thr Ser Pro Asp

115 120 125

Val Thr Phe Pro Ser Asp Leu Met Cys Ser Asp Val Lys Leu Ile Ser

130 135 140

Ser Arg Glu Cys Lys Lys Val Tyr Lys Asp Leu Leu Gly Lys Thr Met

145 150 155 160

Leu Cys Ala Gly Ile Pro Asp Ser Lys Thr Asn Thr Cys Asn Gly Asp

165 170 175

Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Asp Thr Leu Gln Gly Leu Val Ser

180 185 190

Trp Gly Thr Tyr Pro Cys Gly Gln Pro Asn Asp Pro Gly Val Tyr Thr

195 200 205

Gln Val Cys Lys Tyr Lys Arg Trp Val Met Glu Thr Met Lys Thr His

210 215 220

Arg

225

<210> 93

<211> 227

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 93

Ile Ile Gly Gly Tyr Arg Cys Val Arg Asn Ser Gln Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Ala Leu Gln Ala Gly Pro Gly His Arg Phe Leu Cys Gly Gly Val Leu

20 25 30

Leu Ser Asp Gln Trp Val Ile Thr Ala Ala His Cys Ala Arg Pro Ile

35 40 45

Leu His Val Ala Leu Gly Lys His Asn Ile Arg Arg Trp Glu Ala Thr

50 55 60

Gln Gln Val Val Arg Val Ala Arg Gln Val Pro His Pro Gln Tyr Gln

65 70 75 80

Pro Gln Ala His Asp Asn Asp Leu Met Leu Leu Lys Leu Gln Lys Lys

85 90 95

Val Arg Leu Gly Arg Ala Val Lys Thr Ile Ser Val Ala Ser Ser Cys

100 105 110

Ala Ser Pro Gly Thr Pro Cys Arg Val Ser Gly Trp Gly Thr Ile Ala

115 120 125

Ser Pro Ile Ala Arg Tyr Pro Thr Ala Leu Gln Cys Val Asn Val Asn

130 135 140

Ile Met Ser Glu Gln Ala Cys His Arg Ala Tyr Pro Gly Ile Ile Thr

145 150 155 160

Ser Gly Met Val Cys Ala Gly Val Pro Glu Gly Gly Lys Asp Ser Cys

165 170 175

Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Gly Gly Gln Leu Gln Gly

180 185 190

Leu Val Ser Trp Gly Met Glu Arg Cys Ala Met Pro Gly Tyr Pro Gly

195 200 205

Val Tyr Ala Asn Leu Cys Asn Tyr His Ser Trp Ile Gln Arg Thr Met

210 215 220

Gln Ser Asn

225

<210> 94

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 94

agatgggtgt tgtctgacgg ccctcagttc ggcctgttc 39

<210> 95

<211> 891

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гибрид

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(891)

<400> 95

gac ggc cct cag ttc ggc ctg ttc agc aag tac aga acc cct aac tgc 48

Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys

1 5 10 15

gct aac act atg aaa cag gac tgt act cgt gaa tac gac cct gtg tgc 96

Ala Asn Thr Met Lys Gln Asp Cys Thr Arg Glu Tyr Asp Pro Val Cys

20 25 30

ggc agc gac atg agc acc tac gcc aat gag tgc acc ctg tgc atg aag 144

Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys

35 40 45

atc aga gaa ggc ggc cac aac atc aag atc atc cgg aat ggc ccc tgc 192

Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys

50 55 60

gaa ccc aag agc tgc gac aag acc cac acc tgt ccc cct tgt cct gcc 240

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

65 70 75 80

ccc gaa ctg ctg gga gga cct agc gtg ttc ctg ttc ccc cca aag ccc 288

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

85 90 95

aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gaa gtg acc tgc gtg gtg 336

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

100 105 110

gtg gat gtg tcc cac gag gac cct gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg 384

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

115 120 125

gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag 432

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

130 135 140

tac aac tcc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg aca gtg ctg cat cag 480

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

145 150 155 160

gac tgg ctg aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc 528

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

165 170 175

ctg cct gcc ccc atc gag aaa acc atc agc aag gcc aag ggc cag ccc 576

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

180 185 190

cgc gaa ccc cag gtg tac aca ctg ccc cct agc cgg gaa gag atg acc 624

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

195 200 205

aag aac cag gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aaa ggc ttc tac ccc agc 672

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

210 215 220

gac att gcc gtg gaa tgg gag agc aac ggc cag ccc gag aac aac tac 720

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

225 230 235 240

aag acc acc ccc cct gtg ctg gac agc gac ggc tca ttc ttc ctg tac 768

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

245 250 255

agc aag ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc 816

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

260 265 270

agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag 864

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

275 280 285

tcc ctg agc ctg agc ccc ggc aaa tga 891

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 96

<211> 296

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 96

Asp Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys

1 5 10 15

Ala Asn Thr Met Lys Gln Asp Cys Thr Arg Glu Tyr Asp Pro Val Cys

20 25 30

Gly Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys

35 40 45

Ile Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys

50 55 60

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

65 70 75 80

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

85 90 95

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

100 105 110

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

115 120 125

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

130 135 140

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

145 150 155 160

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

165 170 175

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

180 185 190

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

195 200 205

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

210 215 220

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

225 230 235 240

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

245 250 255

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

260 265 270

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

275 280 285

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295

<210> 97

<211> 62

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 97

Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser Gln

1 5 10 15

Tyr Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg His Phe Asn Pro Val Cys Gly Ser

20 25 30

Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile Arg

35 40 45

Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys

50 55 60

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены мутантный пептид SPINK2, который ингибирует протеазную активность активного человеческого KLK5, и где указанный пептид содержит определенные аминокислотные последовательности, полинуклеотид для получения мутантного пептида SPINK2, вектор для получения мутантного пептида SPINK2, клетка для получения мутантного пептида SPINK2, которая содержит полинуклеотид или вектор, способы получения мутантного пептида SPINK2, конъюгаты для ингибирования протеазной активности человеческого KLK5 и способы их получения, композиции и фармацевтические композиции для лечения и профилактики заболевания, ассоциированного с KLK5 и их применение, а также способы лечения или профилактики заболевания, ассоциированного с KLK5. Также описаны композиции для тестирования и для диагностики заболеваний, связанных с KLK5, экспрессией KLK5, экспрессией KLK7 и/или экспрессией KLK14, способ идентификации мутантного пептида SPINK2, ингибирующего KLK5, где указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61, способы идентификации KLK5-ингибирующего соединения, способ оценки активности протеазы KLK5, KLK5-ингибирующие мутантные пептиды SPINK2. Изобретение применяется для лечения заболевания у субъекта, ассоциированного с KLK5, в частности, где заболевание представляет собой синдром Нетертона, атопический дерматит, розацею, УФ-индуцированное повреждение кожи, псориаз, астму, повреждение спинного мозга, рак или эзофагит Барретта. 44 н. и 25 з.п. ф-лы, 7 табл., 107 ил., 7 пр.

1. Мутантный пептид SPINK2, который ингибирует протеазную активность активного человеческого KLK5, и где указанный пептид содержит:

(i) аминокислотную последовательность аминокислот в положениях с 4 по 66 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 34, 40 и 48;

(ii) аминокислотную последовательность аминокислот в положениях с 1 по 63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20;

(iii) аминокислотную последовательность аминокислот в положениях с 1 по 63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 22, 24, 26 и 28;

(iv) аминокислотную последовательность аминокислот в положениях с 4 по 66 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 58;

(v) аминокислотную последовательность аминокислот в положениях с 1 по 63 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 30 и 32;

(vi) аминокислотную последовательность, которая на 98% или более идентична аминокислотной последовательности любого из (i)-(v) выше; или

(vii) аминокислотную последовательность, которая на 96% или более идентична аминокислотной последовательности (ii) или (v) выше.

2. Пептид по п. 1, где указанный пептид ингибирует протеазную активность человеческого KLK7 или человеческого KLK14.

3. Пептид по п. 1, где указанный пептид селективно ингибирует человеческий KLK5 и необязательно человеческий KLK7 или KLK14.

4. Пептид по любому из пп. 1-3, где пептид имеет три дисульфидные связи и трехмерную структуру, характеризующуюся включением петлевой структуры, α-спирали и β-складки.

5. Полинуклеотид для получения мутантного пептида SPINK2, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность пептида по любому из пп. 1-4.

6. Вектор для получения мутантного пептида SPINK2, содержащий полинуклеотид по п. 5.

7. Клетка для получения мутантного пептида SPINK2, которая содержит полинуклеотид по п. 5 или вектор по п. 6.

8. Способ получения мутантного пептида SPINK2, включающий нижеследующие стадии (i) и (ii):

(i) культивирование клетки по п. 7; и

(ii) сбор мутантного пептида SPINK2 из культуры.

9. Способ получения пептида по любому из пп. 1-4, включающий стадию получения пептида путем химического синтеза или трансляции in vitro.

10. Мутантный пептид SPINK2 по п. 1, полученный способом по п. 8 или 9.

11. Конъюгат для ингибирования протеазной активности человеческого KLK5, содержащий пептид по любому из пп. 1-4 и 10, где пептид связан с одним и, необязательно, более чем с одним фрагментом, включающим второй пептид, который не является мутантом SPINK2.

12. Конъюгат по п. 11, где второй пептид представляет собой антитело или его фрагмент и содержит одну или более областей Fc.

13. Конъюгат по п. 12, где одна или каждая Fc-область представляет собой область Fc человеческого иммуноглобулина или его фрагмента.

14. Конъюгат по п. 12 или 13, где одна или каждая область Fc представляет собой Fc-область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD и/или IgE или их фрагмента.

15. Конъюгат по любому из пп. 12-14, где одна или каждая Fc-область представляет собой область Fc человеческого IgG1 или его фрагмента.

16. Конъюгат по п. 15, где одна или каждая Fc-область IgG1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 87.

17. Конъюгат по любому из пп. 12-15, где одна или каждая Fc-область представляет собой область Fc дикого типа или мутантную Fc-область.

18. Конъюгат по любому из пп. 11-17, где конъюгат содержит от одной до нескольких аспарагиновых кислот и/или глутаминовых кислот, добавленных к его амино-концу.

19. Конъюгат по любому из пп. 12-18, где мутант SPINK2 и второй пептид связаны друг с другом через линкер.

20. Конъюгат по п. 19, где линкер представляет собой третий пептид, который не является мутантом SPINK2 или вторым пептидом.

21. Конъюгат по любому из пп. 11-20, где второй пептид расположен на карбокси-концевой стороне мутанта SPINK2.

22. Конъюгат по любому из пп. 11-20, где второй пептид расположен на аминоконцевой стороне мутанта SPINK2.

23. Конъюгат по любому из пп. 11-20, где конъюгат содержит аминокислотную последовательность, описанную ниже в (i), (ii) или (iii):

(i) аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 и 96;

(ii) аминокислотную последовательность, содержащуюся в конъюгате, которая на 90% или более идентична аминокислотной последовательности, описанной выше в (i), и ингибирует протеазную активность KLK5; или

(iii) аминокислотную последовательность, образованную делецией одной аминокислоты в аминокислотной последовательности, описанной в (i) выше, и где конъюгат ингибирует протеазную активность KLK5.

24. Способ получения конъюгата по любому из пп. 11-23, включающий описанные ниже стадии (i) и (ii):

(i) культивирование клетки, включающей полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащуюся в конъюгате, или вектор, в который встроен полинуклеотид; и

(ii) сбор конъюгата мутантного пептида SPINK2 или пептидного фрагмента, содержащегося в конъюгате, из культуры.

25. Способ получения конъюгата мутантного пептида SPINK2 по любому из пп. 11-23, включающий стадию получения конъюгата или пептидного фрагмента, содержащегося в конъюгате, путем химического синтеза или трансляции in vitro.

26. Конъюгат мутантного пептида SPINK2 по п. 11, полученный способом по п. 24 или 25.

27. Конъюгат по любому из пп. 11-23 и 26, где одна или указанная одна аминокислота делетирована из фрагмента, содержащегося в конъюгате, и где конъюгат ингибирует протеазную активность активного человеческого KLK5.

28. Композиция для лечения заболевания, ассоциированного с KLK5, содержащая пептид по любому из пп. 1-4 и 10, полинуклеотид по п. 5, вектор по п. 6, клетку по п. 7 и/или конъюгат по любому из пп. 11-23, 26 и 27, и дополнительно содержащая по меньшей мере одно из разбавителя, носителя, солюбилизатора, эмульгатора, консерванта и/или вспомогательного агента.

29. Композиция для профилактики заболевания, ассоциированного с KLK5, содержащая пептид по любому из пп. 1-4 и 10, полинуклеотид по п. 5, вектор по п. 6, клетку по п. 7 и/или конъюгат по любому из пп. 11-23, 26 и 27 и дополнительно содержащая по меньшей мере одно из разбавителя, носителя, солюбилизатора, эмульгатора, консерванта и/или вспомогательного агента.

30. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, ассоциированного с KLK5, содержащая терапевтически или профилактически эффективное количество пептида по любому из пп. 1-4 и 10, полинуклеотида по п. 5, вектора по п. 6, клетки по п. 7 и/или конъюгата по любому из пп. 11-23, 26 и 27.

31. Фармацевтическая композиция для профилактики заболевания, ассоциированного с KLK5, содержащая терапевтически или профилактически эффективное количество пептида по любому из пп. 1-4 и 10, полинуклеотида по п. 5, вектора по п. 6, клетки по п. 7 и/или конъюгата по любому из пп. 11-23, 26 и 27.

32. Способ лечения или профилактики заболевания, ассоциированного с KLK5, включающий введение фармацевтической композиции по п. 30 или 31.

33. Применение фармацевтической композиции по п. 30 или 31 для лечения или профилактики заболевания, ассоциированного с KLK5.

34. Способ по п. 32 или применение по п. 33, где заболевание, ассоциированное с KLK5, представляет собой синдром Нетертона, атопический дерматит, розацею, УФ-индуцированное повреждение кожи, псориаз, астму, повреждение спинного мозга, рак или эзофагит Барретта.

35. Фармацевтическая композиция по п. 30 или 31, способ по п. 32 или 34 или применение по п. 33 или 34, где указанная фармацевтическая композиция предназначена для применения или вводится в комбинации с дополнительным фармацевтическим продуктом.

36. Композиция для тестирования заболеваний, связанных с KLK5, экспрессией KLK5, экспрессией KLK7 и/или экспрессией KLK14, содержащая пептид по любому из пп. 1-4 и 10, полинуклеотид по п. 5, вектор по п. 6, клетку по п. 7 и/или конъюгат по любому из пп. 11-23, 26 и 27, и дополнительно содержащая по меньшей мере одно из разбавителя, носителя, солюбилизатора, эмульгатора, консерванта и/или вспомогательного агента.

37. Композиция для диагностики заболеваний, связанных с KLK5, экспрессией KLK5, экспрессией KLK7 и/или экспрессией KLK14, содержащая пептид по любому из пп. 1-4 и 10, полинуклеотид по п. 5, вектор по п. 6, клетку по п. 7 и/или конъюгат по любому из пп. 11-23, 26 и 27, и дополнительно содержащая по меньшей мере одно из разбавителя, носителя, солюбилизатора, эмульгатора, консерванта и/или вспомогательного агента.

38. Способ по любому из пп. 8, 9, 24 и 25, включающий стадию проведения аффинной очистки с использованием антитела или его связывающего фрагмента, которые связываются с пептидом по любому из пп. 1-4 и 10.

39. Способ идентификации мутантного пептида SPINK2, ингибирующего KLK5, где указанный пептид содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61, где указанный способ включает нижеуказанные стадии (i)-(iii):

(i) инкубирование протеазы KLK5 и субстрата в присутствии и в отсутствие тестируемого мутантного пептида SPINK2;

(ii) определение протеазной активности KLK5 в присутствии и в отсутствие тестируемого мутантного пептида SPINK2; и

(iii) определение пептида как позитивного, если протеазная активность KLK5 в присутствии пептида ниже, чем протеазная активность KLK5 в отсутствие пептида.

40. Способ идентификации KLK5-ингибирующего соединения, включающий описанные ниже стадии (i)-(iii), с использованием пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 и 32, или в аминокислотах в положениях с 4 по 66 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 34, 40 и 48, или конъюгата, содержащего пептид в качестве эталонного соединения:

(i) инкубирования протеазы KLK5 и субстрата в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения;

(ii) оценки протеазной активности KLK5 в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения; и

(iii) определения тестируемого соединения как позитивного, если протеазная активность KLK5 в присутствии тестируемого соединения ниже, чем протеазная активность KLK5 в отсутствие тестируемого соединения.

41. Способ идентификации KLK5-ингибирующего соединения, включающий нижеуказанные стадии (i)-(iii):

(i) измерения активности ингибирования протеазы KLK5 с использованием тестируемого соединения;

(ii) измерения активности ингибирования протеазы KLK5 с использованием эталонного соединения, которое представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 и 32, или в аминокислотах в положениях с 4 по 66 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 34, 40 и 48, или конъюгат, содержащий этот пептид; и

(iii) оценки тестируемого соединения как позитивного, если активность ингибирования протеазы KLK5 под действием тестируемого соединения эквивалентна или выше, чем активность ингибирования протеазы KLK5 под действием эталонного соединения.

42. Способ измерения активности протеазы KLK5, включающий описанные ниже стадии (i) и (ii), с использованием пептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 и 32, или в аминокислотах в положениях с 4 по 66 в аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 34, 40 и 48, или конъюгата, содержащего пептид в качестве эталонного соединения:

(i) инкубирования протеазы KLK5 с субстратом и, необязательно, с другим компонентом; и

(ii) измерения количества субстрата и/или количества продукта после стадии (i).

43. KLK5-ингибирующий мутантный пептид SPINK2, где указанный пептид содержит аминокислотную последовательность по п. 1, и имеют константу диссоциации (K_D) 1 × 10^-9 М для KLK5 или менее, измеренную с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса путем иммобилизации пептида или конъюгата и добавления к нему KLK5.

44. KLK5-ингибирующий конъюгат мутантного пептида SPINK2, где указанный конъюгат содержит аминокислотную последовательность по п. 1, и имеет константу диссоциации (K_D) 1 × 10^-9 М для KLK5 или менее, измеренную с помощью анализа методом поверхностного плазмонного резонанса путем иммобилизации пептида или конъюгата и добавления к нему KLK5.

45. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активного человеческого KLK5, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

46. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активного человеческого KLK5, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 36, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

47. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активного человеческого KLK5, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 38, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

48. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активного человеческого KLK5, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

49. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активного человеческого KLK5, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

50. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активного человеческого KLK5, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 44, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

51. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активного человеческого KLK5, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 46, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

52. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активного человеческого KLK5, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

53. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активных человеческих KLK5 и KLK7, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 50, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

54. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активных человеческих KLK5 и KLK7, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

55. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активных человеческих KLK5 и KLK7, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 54, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

56. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активных человеческих KLK5 и KLK7, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 56, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

57. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активных человеческих KLK5 и KLK14, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

58. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активных человеческих KLK5 и KLK14, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 60, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

59. Конъюгат для ингибирования протеазной активности активного человеческого KLK5, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 96, который содержит мутантный пептид SPINK2, связанный с Fc-областью.

60. Конъюгат по любому из пп. 45-59, где одна аминокислота делетирована из аминокислотной последовательности конъюгата, предпочтительно, где указанная одна аминокислота делетирована из фрагмента, содержащегося в конъюгате, и где конъюгат ингибирует протеазную активность активного человеческого KLK5.

61. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, ассоциированного с KLK5, содержащая терапевтически или профилактически эффективное количество конъюгата по любому из пп.45-60, и дополнительно содержащая фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель, солюбилизатор, эмульгатор, консервант и/или вспомогательный агент.

62. Фармацевтическая композиция для предотвращения заболевания, ассоциированного с KLK5, содержащая терапевтически или профилактически эффективное количество конъюгата по любому из пп.45-60, и дополнительно содержащая фармацевтически приемлемые разбавитель, носитель, солюбилизатор, эмульгатор, консервант и/или вспомогательный агент.

63. Фармацевтическая композиция по п. 61 или 62, где заболевание, ассоциированное с KLK5, представляет собой синдром Нетертона, атопический дерматит, розацею, УФ-индуцированное повреждение кожи, псориаз, астму, повреждение спинного мозга, рак или эзофагит Барретта.

64. Композиция для диагностики заболеваний, связанных с KLK5, экспрессией KLK5, экспрессией KLK7 и/или экспрессией KLK14, содержащая конъюгат по любому из пп.45-60, и дополнительно содержащая разбавитель, носитель, солюбилизатор, эмульгатор, консервант и/или вспомогательный агент.

65. Композиция для тестирования заболеваний, связанных с KLK5, экспрессией KLK5, экспрессией KLK7 и/или экспрессией KLK14, содержащая конъюгат по любому из пп.45-62, и дополнительно содержащая разбавитель, носитель, солюбилизатор, эмульгатор, консервант и/или вспомогательный агент.

66. Способ лечения или профилактики KLK5-ассоциированного заболевания, включающий введение фармацевтической композиции по п. 61 или 62.

67. Применение фармацевтической композиции по п. 61 или 62 для лечения или профилактики KLK5-ассоциированного заболевания.

68. Применение по п. 67, где KLK5-ассоциированное заболевание представляет собой синдром Нетертона, атопический дерматит, розацею, УФ-индуцированное повреждение кожи, псориаз, астму, повреждение спинного мозга, рак или эзофагит Барретта.

69. Способ по п. 66 или применение по п. 67, где KLK5-ассоциированное заболевание представляет собой синдром Нетертона, атопический дерматит, розацею, УФ-индуцированное повреждение кожи, псориаз, астму, повреждение спинного мозга, рак или эзофагит Барретта.