Лечение резистентного бактериального кератита с помощью квантовых точек Российский патент 2024 года по МПК A61K31/496 A61K31/7036 A61K33/04 A61K33/24 A61K33/30 A61K33/42 A61P27/02 A61P31/00 

Группа изобретений в целом относится к лечению инфекционных заболеваний. Более конкретно заявляемая группа изобретений относится к офтальмологии и может быть использована в лечении резистентного бактериального кератита.

Инфекционный кератит характеризуется воспалением роговицы и может быть вызван бактериями, грибами, вирусами или паразитами. Несмотря на наличие современных методов лечения, кератиты разной этиологии приводят к формированию грубых помутнений роговицы, сопровождающихся рефракционными нарушениями и снижающих остроту и качество зрения пациентов.

Стандартом лечения бактериального кератита является эмперически назначаемая местная антибактериальная терапия, которую начинают незамедлительно после установления диагноза. Существует два доступных варианта лечения: монотерапия фторхинолонами (Ципрофлоксацин 0,3%, офлоксацин 0,3% и левофлоксацин 1,5%) или комбинированная антибактериальная терапия (цефазолин 5% и тобрамицин или гентамицин 1,4%).

Частота закапывания зависит от тяжести бактериального кератита, но для большинства пациентов обычно начинают капать каждые 30 минут в течение 24 часов. Нагрузочная доза в виде капли каждые 5 мин в течение первых 30 мин после начала лечения может быть использована при тяжелых язвах. Частота закапывания снижается в зависимости от клинического ответа.

Местное противомикробное лечение широкого спектра действия является в настоящее время основой лечения бактериального кератита, хотя его эффективность подвергается сомнению в связи с появлением устойчивости к противомикробным препаратам, включая множественную лекарственную устойчивость в некоторых частях мира.

В случае возникновения резистентного острого бактериального кератита глаз пациента может быть обречен на гибель.

В этих случаях особый интерес представляет терапия воспалительных заболеваний с использованием квантовых точек.

Квантовые точки представляют собой полупроводниковые нанокристаллы размером несколько нанометров (нм) с контролируемыми оптическими и электронными свойствами, за счет изменения их размера, морфологии и покрытия. Диаметр ядра, количество оболочек (одна, две, три) на поверхности квантовой точки, характер пассивации (покрытие на границе раздела ядра и оболочки для устранения электронных ловушек, как правило за счет материала с большей шириной энергии запрещенной зоны), функционализации (специфического покрытия для связывания с биологически активными молекулами, белками, пептидами, нуклеиновыми кислотами - так называемое биоконъюгирование), позволяют использовать их в различных областях науки и техники.

Путем изменения состава, формы и размера фотовозбужденного носителя заряда, в качестве которого выступает квантовая точка и модуляции положения зоны проводимости и валентной зоны, можно осуществить избирательное возмущение окислительно-восстановительного гомеостаза в клеточной среде (микробной клетке), тем самым создав субстрат для так называемой «световой терапии».

Одним из направлений в борьбе с мультирезистентной микрофлорой, является использование комбинации антиинфекционных агентов и фотоактивированных квантовых точек для увеличения потенциала активности используемых химиотерапевтических агентов. Таким образом, квантовые точки способны выступать в качестве нарушителя электронно-транспортной цепи бактериальной или грибковой клетки. Механизм действия квантовых точек выглядит следующим образом: фотосенсибилизированная (чрезвычайно реакционно активная) источником света определенной длины волны квантовая точка имеет на своей поверхности не спаренные электроны, которые выступают в качестве донора для молекулярного кислорода, трансформируя его в супероксидный радикал, который в свою очередь обладает высокоспецифичным узконаправленным действием на внутриклеточные кластеры железа и серы, разрушая нормальную внутриклеточную окислительно-восстановительную среду, необходимую для нормального функционирования патогенного микроорганизма.

Учитывая эти факты, разработку возможности применения квантовых точек в офтальмологии необходимо рассматривать как одно из чрезвычайно перспективных направлений в борьбе с бактериальной, в частности, стафилококковой инфекцией роговицы.

Таким образом, проблема, на решение которой направлена заявляемая группа изобретений - разработка лекарственного средства и способа лечения, позволяющих достичь полного излечения резистентного бактериального кератита.

Техническим результатом заявляемой группы изобретений является расширение арсенала средств для борьбы с резистентным бактериальным кератитом, полное излечение резистентного бактериального кератита.

В заявляемой группе изобретений предлагается эффективный подход к лечению резистентного бактериального кератита, вызванного стафилококком, а также синегнойной палочкой, основанный на новых результатах, полученных путем добавления квантовых точек к известным антиинфекционным агентам, что ведет к полному излечению резистентного бактериального кератита.

Соответственно в первом варианте заявляемой группы изобретений Лекарственное средство для лечения резистентного бактериального кератита в виде глазных капель, содержащее антиинфекционный агент, согласно изобретения содержит квантовые точки, выбранные из CdTe/Cd и InP/ZnSe/ZnS, при этом антиинфекционный агент выбран из левофлоксацина и тобрамицина, причем средство получено путем добавления 1 мл 2,5%-ного коллоидного раствора квантовых точек CdTe/Cd или InP/ZnSe/ZnS к 4 мл 0,5%- ного раствора левофлоксацина или 0,3%-ного раствора тобрамицина.

Квантовые точки CdTe/Cd используют с длиной волны флуоресценции 710 нм. Квантовые точки InP/ZnSe/ZnS используют с длиной волны флуоресценции 650 нм.

Во втором варианте заявляемой группы изобретений предлагается способ лечения резистентного бактериального кератита, включающий применение эпибульбарно в виде глазных капель лекарственного средства, содержащего квантовые точки, выбранные из CdTe/Cd и InP/ZnSe/ZnS, при этом антиинфекционный агент выбран из левофлоксацина и тобрамицина, причем средство получено путем добавления 1 мл 2,5%-ного коллоидного раствора квантовых точек CdTe/Cd или InP/ZnSe/ZnS к 4 мл 0,5%- ного раствора левофлоксацина или 0,3%-ного раствора тобрамицина.

Применение эпибульбарно в виде глазных капель лекарственного средства осуществляют по 0,05 мл 4-8 р/день в течение 7-14 дней.

Квантовые точки CdTe/Cd используют с длиной волны флуоресценции 710 нм. Квантовые точки InP/ZnSe/ZnS используют с длиной волны флуоресценции 650 нм.

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг.1 показаны технические характеристики квантовых точек CdTe/Cd 710.

На фиг.2 показан спектр поглощения квантовых точек CdTe/Cd 710.

На фиг.3 показан спектр флуоресценции CdTe/Cd 710.

На фиг.4 показаны технические характеристики квантовых точек InP/ZnSe/ZnS 650.

На фиг.5 показан спектр поглощения квантовых точек InP/ZnSe/ZnS 650.

На фиг.6 показан спектр флуоресценции InP/ZnSe/ZnS 650.

Пример 1 (синтез квантовых точек).

Спектральные и физико-химические требования, предъявляемые к квантовым точкам, для последующего использования в офтальмологии были следующими:

- широкий спектр поглощения световых волн от 350 до 750 нм, для возможности их активации любым источником освещения, в том числе в видимой области спектра;

- узкий спектр флуоресценции, в диапазоне от 550 до 650 нм, для минимизации токсического повреждения интраокулярных структур после активации;

- полная растворимость в воде, для минимизации не запланированных физических взаимодействий, после интраокулярной имплантации;

- квантовый выход не более 15%, как отношение количества испускаемых и поглощаемых фотонов, для минимизации нежелательных оптических эффектов - разрушение фоторецепторов;

- cвойства поверхности: меркаптопропионовая кислота, бифункциональная молекула, содержащая как карбоновую кислоту, так и тиоловые группы, что позволяет минимизировать самоадгезию квантовых точек;

- функионализация: карбоксильная группа -СООН, позволяющая формировать химически активные соединения при взаимодействии с активными молекулами;

- ионные взаимодействия: противоион тетраметиламмоний, используется как поверхностно-активное вещество при синтезе ферромагнитных жидкостей, чтобы препятствовать слипанию её частиц.

Используемые реактивы: октадецен (Fluka, 90%), селен (Merck, 99%), теллур (Aldrich, 99,8%), олеиламин (90 %, Sigma), метанол (HPLC), триоктилфосфин (Sigma, 90%), ацетат цинка (Sigma, 99%), трис-(диэтиламино)фосфин (Aldrich, 97%), 3-меркаптопропионовая кислота (Enamine, 95%). Остальные реагенты были химически чистые.

Спектры поглощения образцов измеряли на спектрофотометре UV-Vis-NIR Cary 5000 (с шагом 1 нм). Спектры фотолюминесценции измеряли на спектрофлуориметре HORIBA Fluorolog-3.

Синтез ядер CdTe проводили в соответствии с методикой [1]. Формирование насыщенной кадмием поверхности (CdTe/Cd) проводили прогреванием 5% масс. дисперсии CdTe в 0.2М олеате кадмия в октадецене при 180С в среде аргона. За прохождением реакции следили по спектрам флуоресценции до достижения стабильного положения (710нм) основного пика. Время реакции составило 20 мин.

Синтез InP/ZnSe/ZnS проводили в соответствии с методикой [2].

Солюбилизацию в водную фазу проводили с использованием 3- меркаптопропионовой кислоты. Модификацию и очистку образцов проводили по методике [3].

Полученные растворы экспортировались как бактериологически чистые.

По техническим характеристикам были синтезированы:

1. Квантовые точки CdTe/Cd 710, которые поставлялись в форме дисперсного раствора, десяти процентной концентрации в объеме 100 мл. Растворитель - вода (коллоидный раствор). На наружной поверхности покрыты меркаптопропионовой кислотой, функционализированы карбоксильной группой. В качестве противоиона - тетраметиламмоний. Квантовый выход составляет 7%. Длина волны флуоресценции - 710нм.

2. Квантовые точки InP/ZnSe/ZnS 650, которые поставлялись в форме дисперсного раствора, десяти процентной концентрации в объеме 100 мл. Растворитель - вода (коллоидный раствор). На наружной поверхности покрыты меркаптопропионовой кислотой, функционализированы карбоксильной группой. В качестве противоиона - тетраметиламмоний. Квантовый выход составляет 13%. Длина волны флуоресценции - 650 нм.

Пример 2 (Оценка токсичности синтезированных квантовых точек)

Для оценки токсичности синтезированных квантовых точек производилось их местное введение в конъюнктивальную полость лабораторным кроликам породы Шиншилла, мужского пола, весом 3,5 килограмма. Кролики получали эпибульбарно инстилляции в конъюнктивальный мешок 0,05 мл 2,5% раствор квантовых точек CdTe/Cd 710 или InP/ZnSe/ZnS 650. Оценка токсического повреждения зрительного анализатора осуществлялась с помощью клинического наблюдения через 7 суток после местного применения, а также проведения осмотра состояния роговицы и фоторегистрации с помощью фотощелевой лампы. Растворы квантовых точек CdTe/Cd 710 и InP/ZnSe/ZnS 650 в концентрации 2,5% не вызывали клинических изменений со стороны зрительного анализатора.

Пример 3 (Создание лекарственных средств на основе квантовых точек и антиинфекционных агентов, используемых в лечении резистентного бактериального кератита).

Для получения лекарственных средств были использованы: раствор левофлоксацина 0,5% или раствор Тобрамицина 0,3% объемом 4 мл для эпибульбарного применения, в который добавили 2,5% раствор квантовых точек CdTe/Cd MPA 710 или InP/ZnSe/ZnS 650 объемом 1 мл. На завершающем этапе выполнялось механическое перемешивание полученной суспензии на лабораторном шейкере.

Были получены следующие лекарственные средства:

1. CdTe/Cd 710 2,5% + Левофлоксацин 0,5% общим объемом 5 мл.

2. CdTe/Cd 710 2,5% + Тобрамицин 0,3% общим объемом 5 мл.

3. InP/ZnSe/ZnS 650 2,5% + Левофлоксацин 0,5% общим объемом 5 мл.

4. InP/ZnSe/ZnS 650 2,5% + Тобрамицин 0,3% общим объемом 5 мл.

Пример 4 (Оценка активности полученных лекарственных средств)

Особенности фотолюминесценции полученных лекарственных средств исследовались в НОЦ «Наноматериалы и нанотехнологии» Уральского федерального университета (г. Екатеринбург) на флуоресцентном спектрометре Perkin Elmer LS55. Спектры возбуждения и свечения измерялись со скоростью сканирования 60 нм/мин при ширине щелей возбуждающего и регистрирующего монохроматоров 5 нм. Изменений спектральных характеристик (спектра поглощения и спектра флуоресценции) выявлено не было, что говорит о активности бикомплекса.

Для изучения конформационной структуры лекарственных средств, наличия возможных конгломератов использовалась атомно-силовая микроскопия (АСМ). Образцы исследовались методом АСМ на приборе «Интегра» в резонансном режиме с использованием зондов NSG03. Конгломератов между квантовыми точками и антиинфекционными агентами выявлено не было.

Пример 5 (Моделирование резистентного бактериального кератита)

В клиническую модель резистентных к Левофлоксацину возбудителей острого кератита вошли дикие штаммы S. Aureus. В клиническую модель резистентных к Тобрамицину возбудителей острого кератита вошел дикий штамм Pseudomonas aeruginosa.

Ход оперативного вмешательства:

Кролики были разделены на две группы в зависимости от используемого возбудителя. На правых глазах животных под операционным микроскопом с соблюдением всех правил асептики инициировался бактериальный кератит, путем центральной скарификации эпителия роговицы с нанесением радиальных разрезов до десцеметовой оболочки после тугого пеленания и предварительной эпибульбарной анестезии проксиметакаином гидрохлоридом 0,5%. Для дополнительной индукции иммунного ответа также выполнялось вскрытие лимбальной конъюнктивы на протяжении трех часовых меридианов в височном секторе.

В качестве индуктора воспаления была взята культура внутрибольничного штамма Золотистого стафиликокка. Предварительное исследование антибиотикочувствительности исследуемого штамма микроорганизма диско-диффузионным методом к антибактериальным препаратам показало отсутствие чувствительности к фторхинолонам, зона задержки роста (ЗЗР) не превышала 6 и 8 мм соответственно. Для приготовления суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма) использовали стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда и содержащий 1,5·108 КОЕ/мл S. Aureus или Pseudomonas aeruginosa в соответствием с разделением по группам. Контроль оптической плотности суспензии осуществляли спектрофотометрически (денситометрически). Инокулюм использовали в течение 1-3 мин после приготовления. Нож для основного разреза погружался в инокулюм с последующим введением в структуры роговицы.

На вторые сутки динамического наблюдения у всех лабораторных животных были выявлены клинические признаки бактериального кератита. Этот период явился стартовым для начала проведения антиинфекционной терапии по заявленному способу.

Пример 6. (Лечение резистентного бактериального кератита с использованием лекарственных средств: CdTe/Cd MPA 710+левофлоксацина, и InP/ZnSe/ZnS 650 +левофлоксацина).

Лабораторные животные, которым в структуры роговицы был введен госпитальный штамм S.Aureus были разделены на три группы, по 3 кролика в каждой. Кролики первой группы после манифестации клинической картины бактериального кератита получали инстилляции капель левофлоксацина 0,05 мл в конъюнктивальный мешок каждые два часа на протяжении семи дней. Кролики второй группы, придерживаясь аналогичной схемы лечения, получали инстилляции лекарственного средства из квантовых точек CdTe/Cd 710 2,5% и Левофлоксацин 0,5%. Кролики третьей группы, придерживаясь аналогичной схемы лечения, получали инстилляции лекарственного средства из квантовых точек InP/ZnSe/ZnS 650 2,5% и Левофлоксацин 0,5%. В качестве методов динамического наблюдения использовалась фоторегистрация переднего отрезка с окрашиванием флуоресцеином и оптическая когерентная томография переднего отрезка. На третьи сутки динамического наблюдения у лабораторных животных второй и третьей группы был выявлен значительный регресс клинических проявлений, который проявлялся в уменьшении площади и интенсивности инфильтрации роговицы в сравнении с первой группой лабораторных животных, получавших инстилляции только левофлоксацина.

Начиная с четвертых суток динамического наблюдения за лабораторными животными в группе кроликов второй и третьей группы был выявлен полный регресс клинической симптоматики со стоны роговицы - полная резолюция инфильтрата, с остаточной ограниченной «облаковидной запыленностью». В группе кроликов, получавших инстилляции чистого левофлоксацина, положительной динамики в отношении обратного развития симптомов выявлено не было. Для анатомической сохранности глазного яблока животные второй группы были переведены на схему лечения с использованием конъюгатов с квантовыми точками.

В данном клиническом эксперименте лекарственное средство CdTe/Cd MPA 710 +левофлоксацин и лекарственное средство InP/ZnSe/ZnS 650 + левофлоксацин продемонстрировали выраженную клиническую эффективность в отношении госпитального штамма S.Aureus.

Пример 7. (Лечение резистентного бактериального кератита с использованием лекарственных средств: InP/ZnSe/ZnS 650 + Тобрамицин 0,3%, CdTe/Cd MPA 710 + Тобрамицина 0,3%)

Лабораторные животные, которым в структуры роговицы был введен госпитальный штамм Pseudomonas aeruginosa были разделены на три группы, по 3 кролика в каждой. Кролики первой группы после манифестации клинической картины бактериального кератита получали инстилляции капель тобрамицина 0,05 мл в конъюнктивальный мешок каждые два часа на протяжении семи дней. Кролики второй группы, придерживаясь аналогичной схемы лечения, получали инстилляции лекарственного средства из квантовых точек CdTe/Cd 710 2,5% и Тобрамицин 0,3%. Кролики третьей группы, придерживаясь аналогичной схемы лечения, получали инстилляции лекарственного средства из квантовых точек InP/ZnSe/ZnS 650 2,5% и Тобрамицин 0,3%. В качестве методов динамического наблюдения использовалась фоторегистрация переднего отрезка с окрашиванием флуоресцеином и оптическая когерентная томография переднего отрезка.

Кролики первой группы, получавшие эпибульбарные инстилляции Тобрамицина демонстрировали полное отсутствие положительной клинической динамики за трехдневный период лечения. С целью анатомической сохранности глазного яблока с четвертого дня все животные были переведены на инстилляции комплекса InP/ZnSe/ZnS 650 + Тобрамицин.

Кролики второй и третьей группы, получавшие инстилляции лекарственного средства InP/ZnSe/ZnS 650 + Тобрамицин или CdTe/Cd MPA 710 + Тобрамицина демонстрировали положительную динамику в отношении обратного развития симптомов со второго дня терапии.

В данном клиническом эксперименте лекарственное средство CdTe/Cd MPA 710 +Тобрамицин и лекарственное средство InP/ZnSe/ZnS 650 + Тобрамицин продемонстрировали выраженную клиническую эффективность в отношении госпитального штамма Pseudomonas aeruginosa.

Список литературы:

[1]. Wang J., Long Y., Zhang Y., et. al. Preparation of Highly Luminescent CdTe/CdS Core/Shell Quantum Dots. Chem. Phys. Chem. 2009; 10: 680 - 685. DOI: https://doi.org/10.1002/cphc.200800672.

[2]. Jo J.H., Jo D.Y., Lee S.H. et al. InP-Based Quantum Dots Having an InP Core, Composition-Gradient ZnSeS Inner Shell, and ZnS Outer Shell with Sharp, Bright Emissivity, and Blue Absorptivity for Display Devices. ACS Applied Nano Materials. 2020; 3 (2): 1972-1980. DOI: https://doi.org/10.1021/acsanm.0c00008

[3]. Pong B.K., Trout B.L., LeeLangmuir J. Y. Modified Ligand-Exchange for Efficient Solubilization of CdSe/ZnS Quantum Dots in Water: A Procedure Guided by Computational Studies. 2008; 24(10): 5270-5276. DOI: 10.1021/la703431j

[4]. Lin A, Rhee MK, Akpek EK, et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern(R). Ophthalmology. 2019;126:P1-P55. doi:10.1016/j.ophtha.2018.10.018

Группа изобретений относится к области лечения инфекционных заболеваний, в частности к офтальмологии, и может быть использована в лечении резистентного бактериального кератита. Лекарственное средство для лечения резистентного бактериального кератита в виде глазных капель содержит квантовые точки, выбранные из CdTe/Cd и InP/ZnSe/ZnS, и антиинфекционный агент, выбранный из левофлоксацина и тобрамицина; причем средство получено путем добавления 1 мл 2,5%-ного коллоидного раствора квантовых точек CdTe/Cd или InP/ZnSe/ZnS к 4 мл 0,5%-ного раствора левофлоксацина или 0,3%-ного раствора тобрамицина. Способ лечения резистентного бактериального кератита включает применение эпибульбарно указанного выше лекарственного средства в виде глазных капель. Использование группы изобретений позволяет расширить арсенал средств для борьбы с резистентным бактериальным кератитом, полностью излечить резистентный бактериальный кератит. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 пр.

1. Лекарственное средство для лечения резистентного бактериального кератита в виде глазных капель, содержащее антиинфекционный агент, отличающееся тем, что содержит квантовые точки, выбранные из CdTe/Cd и InP/ZnSe/ZnS, при этом антиинфекционный агент выбран из левофлоксацина и тобрамицина, причем средство получено путем добавления 1 мл 2,5%-ного коллоидного раствора квантовых точек CdTe/Cd или InP/ZnSe/ZnS к 4 мл 0,5%-ного раствора левофлоксацина или 0,3%-ного раствора тобрамицина.

2. Лекарственное средство по п.1, отличающееся тем, что квантовые точки CdTe/Cd используют с длиной волны флуоресценции 710 нм.

3. Лекарственное средство по п.1, отличающееся тем, что квантовые точки InP/ZnSe/ZnS используют с длиной волны флуоресценции 650 нм.

4. Способ лечения резистентного бактериального кератита, включающий применение эпибульбарно в виде глазных капель лекарственного средства по п.1.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что применение эпибульбарно в виде глазных капель лекарственного средства по п.1 осуществляют по 0,05 мл 4-8 р/день в течение 7-14 дней.