Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к белкам и полипептидам, содержащим полипептид из слюнных желез Ixodes ricinus, и их применению для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, связанных с активацией нейтрофилов.
Предшествующий уровень техники
Гемостаз - жизненно важная функция организма, которая останавливает кровотечение и защищает целостность кровообращения на молекулярном и макроскопическом уровнях. Гемостаз включает каскад свертывания крови, который традиционное делят на два ферментативных каскада превращений, инициируемых либо содержащимися в крови компонентами сосудистой системы (внутренний путь), либо воздействием на кровь поврежденной стенки сосуда (внешний путь).
Внутренний путь и контактную фазу (также называемую калликреин-кининовой системой плазмы) инициируют белки контактной фазы, включая зимогены фактор XII (FXII), фактор XI (FXI) и прекалликреин (ПК; (pKK или PK)), и также кофактор высокомолекулярный кининоген (ВМК; (HK)). При связывании фактора XII с отрицательно заряженными поверхностями происходит автоактивация этого фактора с образованием активированного фактора XII (FXIIa или αFXIIa) посредством изменения конформации. Затем фактор αFXIIa осуществляет превращение РК в активированный плазменный калликреин (КК; (KK или PKa)). После образования в небольшом количестве КК он катализирует превращение связанного с поверхностью фактора XII в фактор αFXIIa, приводя к формированию сильной положительной обратной связи в системе. Во время этого процесса активация фактора XII приводит к последовательности протеолитических реакций, в результате которых образуется серия различных активных ферментов (XIa, IXa, VIIIa, Ха), которые, в конечном счете, осуществляют активацию протромбина, превращающегося в тромбин, и образование фибрина.
Внешний путь свертывания крови, или путь тканевого фактора (ТФ; (TF)) состоит из нескольких сериновых протеаз, кальция и компонентов клеточной мембраны. Внешний путь свертывания крови активируется под воздействием ТФ, также называемого тромбоцитарным тканевым фактором, фактором III, тромбопластином, или CD142, который экспрессируется в субэндотелиальном слое. Таким образом, внешний путь свертывания крови активируется при связывании ТФ, образующегося в клетках субэндотелия при воздействии на них фактора VII плазмы. Образующийся комплекс инициирует каскад свертывания крови, превращает фактор X в фактор Ха, что, в конечном счете, приводит к образованию фибрина. Тромбоциты и фибрин являются принципиально важными элементами гемостатической пробки, которая закупоривает поврежденное место в сосуде. Предположительно в условиях in vivo внешний путь является первичным активатором протеазным каскадом свертывания крови. После этого тромб увеличивается в объеме за счет рекрутинга дополнительных тромбоцитов и амплификации каскада свертывания крови.
Более того, в патологических условиях, таких как стимулирующее воздействие воспаления, экспрессия ТФ происходит в моноцитах, нейтрофилах, эндотелиальных клетках и тромбоцитах, что приводит к повышению уровня циркулирующих ТФ-позитивных микрочастиц. Таким образом, во внешнем пути свертывания крови, помимо факторов свертывания крови, задействованы также и клетки. Важно, что тромбоцитам, обеспечивающим создание тромбогенной поверхности, принадлежит критическая роль в амплификации каскада свертывания крови.
Проведенные в последние десятилетие исследования подтверждают представление о значимом вкладе нейтрофилов в процесс тромбообразования. Вклад этих клеток в процесс тромбоза продемонстрирован ослаблением тромботических проявлений в моделях животных с тромбозом, у которых снижено содержание нейтрофилов.
Нейтрофилы могут способствовать патологическому венозному и артериальному тромбозу посредством высвобождения нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ; (NET)). Высвобождение НВЛ является важным фактором тромбогенеза при патологических состояниях, таких как сепсис, тромбоз глубоких вен и злокачественные новообразование. Дополнительно предполагается, что НВЛ обеспечивают каркас для отложения фибрина и захвата и последующей активации тромбоцитов. Кроме того, в образовании тромба участвуют микрочастицы, связанные своим происхождением с клетками крови, в том числе, образующиеся из нейтрофилов. Данные нескольких исследований тоже подтверждают образование ТФ нейтрофилами в условиях in vivo и ex vivo (Kambas et al., 2012).
Продемонстрирована активная роль нейтрофилов в развитии in vivo экспериментального тромбоза и обусловленных воспалением тромботических заболеваний. Вклад нейтрофилов в активацию внешнего каскада свертывания крови заключается в разложении ИПТФ (TFPI) через высвобождение эластазы (ИПТФ - основной ингибитор пути ТФ) (Massberg et al., 2010). Кроме того, продемонстрировано, что связывание нейтрофилов с поврежденным эндотелием является первой стадией в последовательности событий, которые приводят к образованию тромба в модели индуцированного лазерным излучением повреждения эндотелия. Критическая роль нейтрофилов подтверждается наблюдением, согласно которому эти клетки являются основным источником ТФ, который требовался для образования тромба. Показано, что ингибирование связывания нейтрофилов со стенкой сосуда снижает количество присутствующего ТФ и уменьшает уровень образования фибрина и накопления тромбоцитов (Darbousset et al., 2012; Darbousset et al., 2014). Кроме того, в этой модели дефицит фактора XII не ослабляет образование тромба (Darbousset et al., 2012). Таким образом, нейтрофилы имеют важное значение для активации внешней системы свертывания крови, и НВЛ могут обеспечивать каркас для отложения фибрина и захвата и последующей активации тромбоцитов.
В течение последних пятидесяти лет в лечении антикоагулянтами применялись преимущественно, два класса препаратов: гепарины и антивитамины К. Гепарины ускоряют ингибирующее воздействие антитромбина на некоторые активированные факторы свертывания крови (конкретно, на тромбин и факторы IXa и Ха) посредством непрямого ингибирования этих факторов и активны лишь при парентеральном введении. Антивитамины К препятствуют заключительному этапу синтеза четырех факторов свертывания крови (протромбина и факторов VII, IX и X). Препараты, принадлежащие к этим двум классам, ингибируют внешний путь свертывания крови. Однако эти препараты характеризуются узким терапевтическим окном, требующим проведения пристального мониторинга пациентов. В действительности, при применении этих препаратов необходимо тщательное лабораторное тестирование, чтобы гарантировать достаточную антитромботическую эффективность и при этом не допустить риска кровоизлияния.
Таким образом, существует настоятельная потребность в новых антикоагулянтах, не вызывающих геморрагических побочных эффектов.
Ранее заявитель продемонстрировал, что полипептиды, выделенные из слюнных желез клеща I. ricinus, Ir-CPI (ингибиторы контактной фазы Ixodes ricinus), оказывают специфичное направленное воздействие на факторы свертывания крови XIa и XIIa (ЕР 1892297 и ЕР 2123670; Decrem et al., 2009). Таким образом, было установлено, что полипептиды из слюнных желез Ixodes ricinus являются специфичными ингибиторами внутреннего пути свертывания крови. В действительности, согласно имеющимся сообщениям, в условиях in vitro Ir-CPI увеличивает активированное частичное тромбопластиновое время (аЧТВ), демонстрируя взаимодействие с внутренним путем, но не влияет на протромбиновое время (ПТВ), тромбиновое время (ТВ) и время разбавленного яда гадюки Рассела (ВРРЯГР), три тест-системы, в которых инициируется свертывание крови активаторами внешнего или общего пути. Более того, в отличие от сильного дозозависимого снижения образования тромбина, вызванного эллаговой кислотой (активатором внутреннего пути), Ir-CPI совершенно неактивен в тесте тромбинообразования, в котором тромбинообразование индуцируют низкие концентрации ТФ (5 пМ) (активатора внешнего пути). Небольшое ингибирование тромбинообразования в присутствии 5 пМ тканевого фактора объясняется тем, что при низких концентрациях ТФ тромбин может активировать фактор XI внутреннего пути, чтобы создать петлю обратной связи, в которой задействованы тромбин, факторы XI(а), IX(а), Х(а) и (про)тромбин, что поддерживает внешний путь (Keularts, Zivelin et al. 2001).
В качестве потенциального механизма действия было показано, что молекула Ir-CPI ингибирует активацию фактора XI и РК фактором XIIa и активацию фактора XII фактором XIa, но абсолютно не активна в отношении других мишеней в составе путей свертывания крови, особенно тромбина и фактора Ха, которые являются мишенями для современных парентеральных и и/или пероральных антикоагулянтов и антитромботических препаратов. Представленные ранее результаты были получены в анализах in vitro, в которых были задействованы только факторы путей свертывания крови, и поэтому не могли указывать на активность в отношении клеток, задействованных во внешнем пути свертывания крови.
Ввиду такого специфичного воздействия на внутренний путь свертывания крови, ожидается, что Ir-CPI будет иметь более широкое терапевтическое окно применительно к риску кровотечения, которое является основным побочным эффектом современных парентеральных антикоагулянтов. В действительности, заявитель продемонстрировал, что соединение Ir-CPI в фармакологической терапевтической активной дозе не усиливает кровотечение в экспериментальной модели грызунов (Decrem, Rath et al., 2009).
Заявитель неожиданно обнаружил, что в экспериментальной мышиной модели вызванного лазерным излучением повреждения артериол, которая, как сообщалось, строго зависима от ТФ и независима от FXII, полипептиды из слюнных желез Ixodes ricinus ингибируют рекрутинг полиморфоядерных нейтрофилов (ПМЯН) и тромбоцитов на повроежденных участках (Darbousset et al., 2012). Кроме того, заявитель обнаружил также, что в условиях in vitro полипептиды из слюнных желез Ixodes ricinus ингибируют активацию ПМЯН и образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (называемое также нетозом). Не желая быть связанным какой-либо теорией, заявитель, таким образом, заключает, что Ir-CPI ингибирует рекрутинг и активацию нейтрофилов на пораженном участке, и, таким образом, имеет важное значение для рекрутинга и активации клеток, задействованных при активации внешнего пути свертывания крови.
Таким образом, полипептиды из слюнных желез Ixodes ricinus полезны для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, связанных с активацией внешнего пути свертывания крови, таких как, например, тромбоз, и для лечения и/или предотвращения воспалительных заболеваний с тромботической тенденцией и тромбовоспаления.
Открытие этих новых особенностей механизма действия полипептидов Ir-CPI говорит о том, что эти оригинальные соединения способны не только ингибировать внутренний путь, но также воздействовать на свертывание крови и/или тромботический процесс с участием ТФ, однако реализуя совершенно другой механизм действия, по сравнению с ингибиторами тромбина и/или факторов Ха.
Таким образом, настоящее изобретение относится к белкам-антикоагулянтам, содержащим полипептид из слюнных желез Ixodes ricinus, и их применению для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, связанных с активацией нейтрофилов и/или нетозом.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к белку или полипептиду, содержащему полипептид с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 для применения с целью ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (нетоза).
В одном варианте осуществления изобретения ингибирование рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза лечит и/или предотвращает заболевание или состояние, связанное с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом.
В одном варианте осуществления изобретения указанное заболевание или состояние, связанное с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом, выбирают из группы, в которую входят венозный тромбоз, артериальный тромбоз, тромбовоспаление и сердечно-сосудистые заболевания. В одном варианте осуществления изобретения указанным заболеванием или состоянием, связанным с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом, является тромбовоспаление.
В одном варианте осуществления изобретения указанное тромбовоспаление выбирают из группы, в которую входят атеросклероз, разрыв атеросклеротической бляшки, вызванное медицинским изделием тромбовоспаление, тромбоз, вызванный процедурами катетеризации и/или позиционирования стента, тромбоз, вызванный экстракорпоральным кровообращением, образование тромба после травм головного мозга, ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда, рак-ассоциированный тромбоз, ассоциированный с метастазированием тромбоз, ассоциированный с инсультом тромбоз, болезнь Бехчета (ББ), васкулиты, ассоциированные с антителами к цитоплазме нейтрофилов (ANCA-ассоциированные васкулиты), артериит Такаясу, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, антифосфолипидный синдром, периодическая болезнь, облитерирующий тромбангиит (ОТА), сепсис, воспалительные заболевания кишечника, гепарин-индуцированная тромбоцитопения, иммунотромбоз, тромбоз, ассоциированный с преэклампсией, тромботические осложнения при трансплантации клеток и клеточных кластеров и при трансплантации цельных органов или лоскутов, венозная тромбоэмболия, аневризмы, и синдром ишемии-реперфузии скелетной мускулатуры.
В одном варианте осуществления изобретения указанным тромбовоспалением является тромбоз, вызванный процедурами катетеризации и/или позиционирования стента в месте локального стеноза сосуда. В другом варианте осуществления изобретения указанным тромбовоспалением является тромбовоспаление, вызванное медицинским изделием, контактирующим с кровью. В другом варианте осуществления изобретения указанным тромбовоспалением является тромбоз и/или свертывание крови, ассоциированное с экстракорпоральным кровообращением.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, в состав которой входит белок или полипептид, содержащий полипептид с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество для применения при ингибировании рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза, и/или для лечения и/или предотвращения заболевания или состояния, связанного с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией и/ нейтрофилов и/или нетозом.
Изобретение относится также к лекарственному препарату, в состав которого входит белок или полипептид, содержащий полипептид с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для применения при ингибировании рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза, и/или для лечения и/или предотвращения заболевания или состояния, связанного с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом.
Другой целью настоящего изобретения является медицинское изделие, покрытое изолированным полипептидом с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для применения при ингибировании рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза, и/или для лечения и/или предотвращения заболевания или состояния, связанного с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом.
Еще одной целью настоящего изобретения является набор, в состав которого входит белок или полипептид, содержащий изолированный полипептид с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для применения при ингибировании рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза, и/или для лечения и/или предотвращения заболевания или состояния, связанного с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией и нейтрофилов и/или нетозом.
Настоящее изобретение дополнительно относится к белку или полипептиду, содержащему полипептид с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для применения с целью ингибирования внешнего пути свертывания крови у нуждающегося в таком ингибировании субъекта, где ингибирование внешнего пути свертывания крови включает ингибирование рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или образования внеклеточных нейтрофильных ловушек (нетоза).
Настоящее изобретение относится также к способу ингибирования внешнего пути свертывания крови у нуждающегося в таком ингибировании субъекта, где указанный способ заключается в введении субъекту белка или полипептида, содержащего изолированный полипептид с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления изобретения такое ингибирование внешнего пути свертывания крови лечит и/или предотвращает заболевание или состояние, ассоциированное с активацией внешнего пути свертывания крови. В одном варианте осуществления изобретения указанное ингибирование внешнего пути свертывания крови лечит и/или предотвращает тромбоз, ассоциированный с активацией внешнего пути свертывания крови. В одном варианте осуществления изобретения указанное ингибирование внешнего пути свертывания крови лечит и/или предотвращает венозный тромбоз. В одном варианте осуществления изобретения указанное ингибирование внешнего пути свертывания крови лечит и/или предотвращает артериальный тромбоз. В одном варианте осуществления изобретения указанное ингибирование внешнего пути свертывания крови лечит и/или предотвращает рак-ассоциированный тромбоз. В одном варианте осуществления изобретения указанное ингибирование внешнего пути свертывания крови лечит и/или предотвращает ассоциированный с инсультом тромбоз. В одном варианте осуществления изобретения указанное ингибирование внешнего пути свертывания крови лечит и/или предотвращает воспалительные заболевания с тромботической тенденцией. В одном варианте осуществления изобретения указанное ингибирование внешнего пути свертывания крови лечит и/или предотвращает тромбовоспаление.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, в состав которой входит белок или полипептид, содержащий полипептид с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество для применения с целью ингибирования внешнего пути свертывания крови у нуждающегося в таком ингибировании субъекта, согласно вышеописанному.
Настоящее изобретение относится также к лекарственному препарату, в состав которого входит белок или полипептид содержащий полипептид с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для применения с целью ингибирования внешнего пути свертывания крови у нуждающегося в таком ингибировании субъекта, согласно вышеописанному.
Настоящее изобретение относится также к набору, в состав которого входит белок или полипептид, содержащий полипептид с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для применения с целью ингибирования внешнего пути свертывания крови у нуждающегося в таком ингибировании субъекта, согласно вышеописанному.
Настоящее изобретение относится также к медицинскому изделию, покрытому изолированным полипептидом с последовательностью, по меньшей мере, на 75% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, для применения с целью ингибирования внешнего пути свертывания крови у нуждающегося в таком ингибировании субъекта, согласно вышеописанному.
Определения
В настоящем изобретении перечисленные ниже термины имеют следующие значения:
Термин «около», «приблизительно» перед числовым значением означает плюс или минус 10% от указанного значения.
Термин «аминокислотная замена» относится к замене в полипептиде одной аминокислоты на другую амнокислоту. В одном варианте осуществления изобретения аминокислоту замещают другой аминокислотой, имеющей сходные структурные и/или химические свойства, например, выполняют консервативную замену аминокислот. «Консервативная замена аминокислот», может быть выполнена на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы задействованных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Неконсервативная замена подразумевает замену члена одного из этих классов на члена другого класса. Например, аминокислотные замены могут привести также к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую отличающиеся структурные и/или химические свойства, например, при замене аминокислоты, принадлежащей к одной группе (например, группе полярных аминокислот), на аминокислоту, принадлежащую к другой группе (например, основных аминокислот). Аминокислотные замены могут быть выполнены при использовании генетических или химических методов, хорошо известных специалисту. Генетические методы могут включать сайт-направленный мутагенез, ПЦР, синтез гена и т.п. Предполагается, что могут быть использованы также методы изменения боковой цепи аминокислоты, не являющиеся генно-инженерными методами, такие как химическая модификация.
Термин «идентичность» относится к мере идентичности нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей. В целом, последовательности выравнивают таким образом, чтобы получить соответствие самого высокого порядка. «Идентичность» как таковая имеет признанное в данной области техники значение, и может быть рассчитана при использовании опубликованных методик. См., например: Computational Molecular Biology (Вычислительные методы в молекулярной биологии), Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Биовычисления: Информатика и геномные проекты), Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis Of Sequence Data (Компьютерный анализ последовательностей), Part I, Griffin, A.M., и Griffin, H.G., eds, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis In Molecular Biology (Анализ последовательностей в молекулярной биологии), von Heijne, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer (Праймер для анализа последовательности), Gribskov, М. и Devereux, J., eds, M Stockton Press, New York, 1991. Поскольку существует ряд методов для измерения степени идентичности двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, термин «идентичность» хорошо известен специалистам в данной области техники (Carillo и Lipton, SIAM J Applied Math, 1998, 48:1073). Методы, часто используемые для определения сходства или идентичности двух последовательностей, включают, не ограничиваясь перечисленным, методы, изложенные в Руководстве по огромным компьютерам (Guide to Huge Computers), Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994; и Carillo и Lipton, SIAM J Applied Math, 1998, 48:1073. Методы определения идентичности и сходства кодифицированы в компьютерных программах. Предпочтительные методы, основанные на компьютерных программах, для определения идентичности и сходства двух последовательностей, включают, не ограничиваясь перечисленным, пакет программ GCG (Devereux et al., J Molec Biol, 1990, 215:403). Наиболее предпочтительной программой, использованной для определения степеней идентичности, являлась программа GAP, которая применялась в описанных ниже Примерах.
В качестве иллюстрации, под полинуклеотидом с последовательностью, по меньшей мере, на 95% «идентичной» референтной нуклеотидной последовательности, подразумевают нуклеотидную последовательность полинуклеотида, идентичную референтной последовательности, за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать в среднем до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов референтной нуклеотидной последовательности. Другими словами, чтобы получить полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, по крайней мере, на 75% идентичной референтной нуклеотидной последовательности, до 5% нуклеотидов в референтной последовательности могут быть удалены или заменены на ругой нуклеотид, или в референтную последовательность может быть вставлены нуклеотиды в количестве до 5% от общего числа нуклеотидов в референтной последовательности. Эти мутации в референтной последовательности могут происходить в конечных позициях у 5'-конца или 3'-конца референтной нуклеотидной последовательности или в любом месте между конечными позициями, они могут быть рассеяны либо по отдельности между нуклеотидами в референтной последовательности, или находиться в одной или нескольких непрерывных группах нуклеотидов в референтной последовательности.
Термин «пептидный линкер», также называемый «спейсерным пептидом, относится к пептиду, используемому для того, чтобы связать между собой 2 пептида или полипептида. В одном варианте осуществления изобретения пептидный линкер по настоящему изобретению содержит от 3 до 50 аминокислот. Пептидные линкеры известны из уровня техники или описаны в настоящем документе.
Термин «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» относится к вспомогательному веществу, которое не вызывает нежелательной, аллергической или другой непредусмотренной реакции при введении животному, предпочтительно, человеку. Этот термин включает также самые разнообразные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотоуические и замедляющие всасывание агенты и т.п. Термин «фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество» относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу или вспомогательному ингредиенту лекарственной формы любого типа. Препараты, предназначенные для введения людям, должны соответствовать стандартам стерильности, апирогенности, общей безопасности и чистоты, в соответствии с требованиями Департамента FDA по стандартам биопрепаратов.
Термин «полинуклеотид» относится к любому полирибонуклеотиду или полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК. «Полинуклеотиды» включают, без ограничения, одно- и двуцепочечные ДНК, ДНК, представляющую собой смесь одноцепочечных и двуцепочечных областей, одно- и двуцепочечную РНК и РНК, представляющую собой смесь одноцепочечных и двуцепочечных областей, гибридные молекулы, содержание ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными, но в более типичном случае, двуцепочечными или представлять собой смесь одноцепочечных и двуцепочечных областей. Дополнительно термин «полинуклеотид» относится к трехцепочечным областям, содержащим РНК или ДНК или и РНК, и ДНК. Термин «полинуклеотид» включает также ДНК или РНК, содержащие одно или несколко модифицированных оснований, и ДНК или РНК с остовом, модифицированным для стабильности или по другим причинам. «Модифицированные» основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, например, инозин. В отношении ДНК и РНК применялись самые разные модификации; таким образом, термин «полинуклеотид» охватывает химически, энзиматически или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, встречающихся в природе, и также химические формы ДНК и РНК, характерные для вирусов и клеток. Термин «полинуклеотид» включает также относительно короткие полинуклеотиды, которые часто называют олигонуклеотидами.
Термин «полипептид» относится к любому пептиду или белку, содержащему две или более аминокислот, соединенных между собой пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е., к пептидным изостерам. Термин «полипептид» относится к коротким цепям, обычно называемым пептидами, олигопептидами или олигомерами, и к более длинным цепям, обычно называемым белками. Помимо 20 аминокислот, кодируемых генами, полипептиды могут содержать и другие аминокислоты.
Термин «белок» относится к последовательности, содержащей более 100 аминокислот и/или мультимерному соединению. Белки по настоящему изобретению не ограничены определенной длиной продукта. Термин «полипептид» или «белок» не относится к или исключает постэкспрессионные модификации белка, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п., и также и также другие модификации, известные из уровня техники, как природные, так и не встречающиеся в природе. Такие модификации хорошо описаны в основных документах и в более подробных монографиях, и также в обширной научной литературе. Модификации могут происходить на любом участке полипептида или белка, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и также аминоконец или карбоксильный конец молекулы. Должно быть понятно, что модификация одного и того же типа может присутствовать в разных участках определенного полипептида или белка и быть выраженной в одинаковой или разной степени. Кроме того, в определенном полипептиде или белке могут содержаться модификации многих типов. Полипептиды или белки могут быть разветвленными в результате убиквитинирования, и они могут быть цикличными, с разветвлениями или без разветвлений. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды или белки могут образовываться в результате естественных посттрансляционных процессов, или могут быть получены методами синтеза. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединпение фосфатидилинозитола, образование поперечных связей, циклизацию, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование ГФИ-якоря, гидроксилирование, иодинирование, метилирование, меристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, фенилирование, рацеизацию, селенирование, сульфатирование, опосредованное транспортной РНК добавление аминов аминокислот к белкам, такое как аргинилирование и убиквитинирование. См., например, публикации "Proteins-structure и molecular properties (Белки - структура и молекулярные свойства)", 2nd Ed., Т.Е. Creighton, W.Н. Freeman и Comany, New York, 1993; Wolt, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives и Prospects" (Посттрансляционые модификации белков: Перспективы и концепции), Posttranslational covalent modification of proteins (Посттрансляционная ковалентная модификация белков), В.С. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, pgs. 1-12; Seifter et al., "Analysis for protein modifications и nonprotein cofactors (Анализ модификаций белков и небелковые кофакторы)", Meth Enzymol, 1990, 182:626-646; Rattan et al, "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications и Aging (Синтез белка: Посттрансляционные модификации и старение)", Ann NY Acad Sci, 1992, 663:48-62. Белок может представлять собой полную белковую молекулу или часть ее последовательности.
«Изолированный белок или полипептид» - это белок или полипептид, идентифицированный и выделенный и/или извлеченный из компонента собственной природной среды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения изолированный белок или полипептид будут очищены
(1) до степени чистоты более 80, 85, 90, 95 весовых % белка или полипептида при определении методом Лоури, и наиболее предпочтительно, более 96, 97, 98 или 99 весовых %,
(2) до степени, достаточной для получения не менее 15 остатков, содержащихся в N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, посредством использования секвенатора с вращающимся стаканом, или
(3) до однородного состояния посредством электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси синим или, предпочтительно, с окрашиванием серебром.
Изолированный белок или полипептид включает белок in situ в рекомбинантных клетках, после того по меньшей мере один компонент природной среды белка или полипептида будет отсутствовать. Однако, как правило, изолированный белок или полипептид будет получен с использованием, по меньшей мере, одной стадии очистки.
Термин «слитый белок» относится к молекуле, содержащей два или более белка или их фрагмента, индивидуальные пептидные остовы которых соединяет ковалентная связь, в наиболее предпочтительном случае слитый белок получают посредством генетической экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки. У образующих слитый белок полипептидов, как С-конец одного полипептида соединяется с N-концом второго полипептида, хотя С-конец одного полипептида может соединяться с С-концом второго полипептида, N-конец одного полипептида может соединяться с N-концом второго полипептида, или N-конец может соединяться с С-концом. Полипептиды слитых белков могут быть слитыми в любом порядке
Термин «слитый» относится к компонентам, которые соединены пептидными связями, непосредственно или через один или несколько пептидных линкеров.
Термин «нативный Ir-CPI" относится к природному полипептиду Ir-CPI, но не к «модифицированному Ir-CPI», который был получен посредством модификации природного Ir-CPI, например, для изменения одного или нескольких свойств природного полипептида, например, стабильности. Модифицированный полипептид Ir-CPI, может, например, содержать модификации аминокислотной последовательности, например, замены, делеции или инсерции аминокислот.
- Термин «субъект» относится к млекопитающему, предпочтительно, к человеку. В одном варианте осуществления изобретения субъект - мужчина. В другом варианте осуществления изобретения субъект - женщина. В одном варианте осуществления изобретения субъект может быть «пациентом», т.е. теплокровным животным, более предпочтительно, человеком, который ожидает получения или получает медицинскую помощь, или являлся/является/будет являться объектом при проведении медицинской процедуры, такой как медицинская процедура в соответствии со способами по настоящему изобретению, или находится под наблюдением в связи с развитием заболевания или состояния. В одном варианте осуществления изобретения субъект взрослый (например, субъект, достигший 18 лет). В другом варианте осуществления изобретения субъект ребенок (например, субъект моложе 18 лет).
Термин «терапевтически эффективное количество» означает уровень или количество агента, который предназначен для того, чтобы не вызывая значимых отрицательных или нежелательных побочных эффектов у мишени, (1) задержать развитие или предотвратить заболевание или состояние, ассоциированное с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или активацией внешнего пути свертывания крови; (2) замедлить или остановить прогрессирование, обострение или ухудшение одного или нескольких симптомов заболевания или состояния, ассоциированного с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или активацией внешнего пути свертывания крови; (3) обеспечить улучшение симптомов заболевания или состояния ассоциированного с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или активацией внешнего пути свертывания крови; (4) снизить тяжесть или частоту заболевания или состояния ассоциированного с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или активацией внешнего пути свертывания крови; или (5) предотвратить заболевание или состояние, ассоциированное с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или активацией внешнего пути свертывания крови. В одном варианте осуществления изобретения терапевтически эффективное количество вводят до начала заболевания или состояния, ассоциированного с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или активацией внешнего пути свертывания крови для профилактического или превентивного воздействия.
Термин «лечение» или «облегчение» относятся к терапевтическому лечению и профилактическим или превентивным мерам, цель которых предотвратить или замедлить (уменьшить) целевое состояние или нарушение, ассоциированное с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или с внешним путем свертывания крови. Нуждающиеся в лечении включают индивидуумов, у которых уже имеется заболевание или состояние, ассоциированное с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или с внешним путем свертывания крови, и также предрасположенных к заболеванию или состоянию, ассоциированному с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или с внешним путем свертывания крови, и индивидуумов, у которых надо предотвратить заболевание или состояние, ассоциированное с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или с внешним путем свертывания крови. Субъект или млекопитающее успешно «пролечены» по поводу инфекции, если после получения в терапевтическом количестве белка или полипептида по настоящему изобретению в соответствии со способами по настоящему изобретению у пациента отмечено наблюдаемое и/или измеримое уменьшение или отсутствие одного из следующих: уменьшение численности патогенных клеток; уменьшение процента патогенных клеток относительно общей численности клеток; и/или некоторое облегчение одного или нескольких симптомов заболевания или состояния, ассоциированного с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или внешним путем свертывания крови; сниженная заболеваемость и смертность; и улучшение качества жизни. Вышеперечисленные параметры для оценки успешного лечения и улучшения состояния или заболевания, ассоциированного с рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов или с внешним путем свертывания крови, могут быть легко измерены с помощью известных врачу стандартных процедур.
Термин «вариант» относится к полинуклеотиду или полипептиду, который отличается от референтного полинуклеотида или полипептида, соответственно, но сохраняет их принципиальные свойства. У типичного варианта полинуклеотида в нуклеотидной последовательности имеются отличия от последовательности другого, референтного полинуклеотида. Изменения нуклеотидной последовательности варианта могут приводить либо не приводить к изменениям аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого референтным полинуклеотидом. Как обсуждается ниже, изменения нуклеотидов могут приводить к заменам, добавлениям, делециям, слияниям и укорочениям полипептида, кодируемого референтной последовательностью. Аминокислотная последовательность типичного варианта полипептида отличается от аминокислотной последовательности другого - референтного полипептида. Как правило, различия незначительны, и последовательности референтного полипептида и варианта, в целом, очень сходны и во многих областях идентичны. Аминокислотные последовательности варианта и референтного полипептида могут различаться одной или несколькими заменами (предпочтительно, консервативными), добавлениями, делециями в любом сочетании. Замещенный или встроенный аминокислотный остаток может быть как закодированным, так и не закодированным в генетическом коде. Вариант полинуклеотида или полипептида может быть природным, как в случае аллельного варианта, или же вариант может быть не известен в качестве природного. Не встречающиеся в природе варианты полинуклеотидов и полипептидов могут быть получены с использованием методов мутагенеза или посредством прямого синтеза. Варианты должны сохранять одну или несколько активностей референтного полипептида.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к белку или полипептиду, содержащему полипептид из слюнных желез Ixodes ricinus, или фрагмент или вариант такого полипептида, и его применению для ингибирования внешнего пути свертывания крови и, тем самым, для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, связанных с внешним путем свертывания крови, в частности лечения и/или предотвращения тромба, ассоциированного с активацией внешнего пути свертывания крови.
В одном варианте осуществления изобретение относится к белку или полипептиду, содержащему полипептид из слюнных желез Ixodes ricinus, или фрагмент, или вариант такого полипептида, и его применению для ингибирования клеточной части внешнего пути свертывания крови. В одном варианте осуществления изобретения термины "клеточная часть внешнего пути свертывания крови" означает рекрутинг тромбоцитов, активацию нейтрофилов, и/или рекрутинг нейтрофилов, и/или образование НВЛ. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения ингибирование клеточной части внешнего пути свертывания крови состоит из ингибирования рекрутинга тромбоцитов, активации нейтрофилов, и/или рекрутинга нейтрофилов, и/или образования НВЛ.
В одном варианте осуществления изобретения ингибирование клеточной части внешнего пути свертывания крови включает ингибирование рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретение относится к применению белка или полипептида, содержащего полипептид из слюнных желез Ixodes ricinus, или фрагмент, или вариант такого полипептида, и его применению для ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза. Изобретение относится также белку или полипептиду по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, ассоциированных с рекрутингом тромбоцитов, активацией нейтрофилов, рекрутиногом нейтрофилов и/или нетозом.
В одном варианте осуществления изобретения ингибирование внешнего пути свертывания крови, в частности, ингибирование клеточной части внешнего пути свертывания крови, состоит из ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза.
В одном варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, содержащего полипептид из слюнных желез Ixodes ricinus, или фрагмент или вариант такого полипептида для ингибирования внешнего пути свертывания крови, предпочтительно, клеточной части внешнего пути свертывания крови, или для ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза.
В одном варианте осуществления изобретения ингибирование внешнего пути свертывания крови, в частности, ингибирование клеточной части внешнего пути свертывания крови, не включает ингибирование тканевых факторов, специфичных для внешнего пути свертывания крови, таких как Тканевый фактор. В одном варианте осуществления изобретения ингибирование внешнего пути свертывания крови, в частности, ингибирование клеточной части внешнего пути свертывания крови, не включает ингибирования факторов свертывания крови, специфичных для внешнего пути свертывания крови.
В одном варианте осуществления изобретения белком или полипептидом по настоящему изобретению является изолированный белок или полипептид.
В одном варианте осуществления изобретения полипептидом из слюнных желез Ixodes ricinus по настоящему изобретению является Ir-CPI (ингибитор контактной фазы Ixodes ricinus). В настоящем документе Ir-CPI может быть также обозначен IrCPI.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, полипептид Ir-CPI по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательно, состоящую из или содержащую последовательность SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления изобретения полипептид Ir-CPI по настоящему изобретению закодирован кДНК, соответствующей аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность полипептида Ir-CPI по настоящему изобретению является, по меньшей мере, на 75% идентичной последовательности SEQ ID NO: 1, предпочтительно, идентичной, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.
В одном варианте осуществления изобретения фрагменты полипептида Ir-CPI тоже включены в настоящее изобретение. В настоящем документе термин «фрагмент» означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, такую же, как у части аминокислотной последовательности вышеупомянутого полипептида Ir-CPI, но не полную. Как и полипептид Ir-CPI, его фрагменты могут быть обособленными или входить в состав более крупного полипептида, в котором они могут образовывать часть или область, наиболее предпочтительно, одну непрерывную область. Типичные примеры фрагментов полипептида по настоящему изобретению включают, например, фрагменты, начинающиеся приблизительно от аминокислоты под номером 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100 и 101 до конца полипептида. В этом контексте «приблизительно» включает конкретные перечисленные диапазоны, увеличенные или уменьшенные на несколько, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислоту относительно каждого крайнего значения или обоих крайних значений.
Предпочтительные фрагменты включают не ограничиваясь перечисленным, укороченные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность полипептида Ir-CPI, кроме делеции из непрерывной серии остатков, которая включает N-конец последовательности, или непрерывной серии остатков, которая включает С-конец и/или трансмембранную область, или делеции из двух непрерывных серий остатков, одна из которых включает N-конец, и вторая включает С-конец. Также предпочтительными являются фрагменты, характеризующиеся структурными и функциональными признаками, например, фрагменты, содержащие альфа-спираль и образующие альфа-спираль области, бета-слой и образующие бета-слой области, изгибы и обазующие изгибы области, петлю и образующие спираль области, гидрофильные области, гидрофобные области, альфа-амфипатичные области, бета-амфипатичные области, гибкие области, образующие поверхность области, субстрат-связывающую область и области с высоким антигенным индексом. Другими предпочтительными фрагментами являются биологически активные фрагменты. К биологически активным относят фрагменты, которыми опосредована активность полипептида Ir-CPI, включая фрагменты, имеющие сходную активность, или улучшенную активность, или сниженную нежелательную активность.
В одном варианте осуществления изобретения все эти фрагменты полипептида частично сохраняют биологическую активность полипептида Ir-CPI.
В одном варианте осуществления в настоящее изобретение включены также варианты полипептида Ir-CPI. Предпочтительными являются варианты, которые отличаются от полипептида Ir-CPI консервативными заменами аминокислот, т.е. варианты с заменой остатка на другой остаток с похожими характеристиками. Типичными заменами такого рода являются замены между собой остатков Ala, Val, остатков Leu и Ile; остатков Ser и Thr; кислых остатков Asp и Glu; остатков Asn и Gln; и основных остатков Lys и Arg; или ароматических остатков Phe и Tyr. В частности, предпочтительными являются варианты с заменой, делецией или добавлением нескольких, 5-10, 1-5 или 1-2 аминокислот в любом сочетании. Наиболее предпочтителными являются природные аллельные варианты полипептида Ir-CPI, присутствующие в слюнных железах Ixodes ricinus.
В одном варианте осуществления изобретения полипептид Ir-CPI по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, содержащую мутацию, которая приводит к замене аспарагина на глутамин в положении, соответствующем положению 54 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, с целью предотвратить N-гликозилирование. В одном варианте осуществления изобретения полипептид Ir-CPI по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 2.
В одном варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность полипептида Ir-CPI по настоящему изобретению является, по меньшей мере, на 75% идентичной последовательности SEQ ID NO: 2, предпочтительно, идентичной, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.
В одном варианте осуществления изобретения полипептид Ir-CPI по настоящему изобретению может быть получен любым подходящим образом. Примеры пептидов, полученные любым подходящим образом, включают, не ограничиваясь перечисленным, изолированные природные полипептиды; полипептиды, полученные методом рекомбинантных ДНК; полипептиды, полученные в результате синтеза, или полипептиды, полученные при сочетании этих методов. Способы получения таких полипептидов вполне понятны специалисту.
В одном варианте осуществления изобретения белком по настоящему изобретению является слитый белок, содержащий Ir-CPI.
В настоящем документе термин «слитый белок» относится к слиянию описанного выше полипептида Ir-CPI с, по меньшей мере, одним другим полипептидом.
В одном варианте осуществления изобретения полипептид Ir-CPI соединен, по меньшей мере, с одним другим полипептидом таким образом, чтобы получить один белок, сохраняющий биологическую активность Ir-CPI.
В одном варианте осуществления изобретения полипептиды в составе слитого белка соединены С-концом с N-концом. В другом варианте осуществления изобретения компоненты слитого белка соединены С-концом с С-концом. В другом варианте осуществления изобретения компоненты слитого белка соединены N-концом с N-концом. В другом варианте осуществления изобретения компоненты слитого белка соединены N-концом с С-концом.
В одном варианте осуществления изобретения полипептиды слитого белка могут быть слиты в любом порядке.
В одном варианте осуществления изобретения полипептиды образуют одну непрерывную полипептидную цепь.
В одном варианте осуществления изобретения слитый белок по настоящему изобретению дополнительно содержит, по меньшей мере, один пептидный линкер. В одном варианте осуществления изобретения полипептиды слитого белка по настоящему изобретению соединяются друг с другом через один или несколько пептидных линкеров.
В одном варианте осуществления изобретения термин «слитые белки-Ir-CPI» или «слитые белки» в равной степени относится к слитым белкам без добавленной линкерной последовательности и с добавленной линкерной последовательностью.
В одном варианте осуществления изобретения линкерный пептид обеспечивает большее физическое разобщение двух компонентов и за счет этого максимизирует доступность полипептида из слюнных желез Ixodes ricinus. Линкерный пептид может состоять из аминокислот, придающих ему гибкость или жесткость.
В одном варианте осуществления изобретения пептидный линкер по настоящему изобретению содержит от 1 до 60 аминокислот, предпочтительно, от 2 до 50 аминокислот, более предпочтительно, от 4 до 40 аминокислот. В одном варианте осуществления изобретения пептидный линкер по настоящему изобретению содержит от 5 до 50 аминокислот, от 10 до 50 аминокислот, от 15 до 50 аминокислот, или от 20 до 50 аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения пептидный линкер по настоящему изобретению содержит от 6 до 20 аминокислот, от 8 до 20 аминокислот, или от 10 до 20 аминокислот. В другом варианте осуществления изобретения пептидный линкер по настоящему изобретению содержит от 2 до 10 аминокислот, от 5 до 20 аминокислот, от 10 до 30 аминокислот, или от 15 до 40 аминокислот.
В одном варианте осуществления изобретения пептидный линкер по настоящему изобретению не является расщепляемым линкером в условиях in vivo. В одном варианте осуществления изобретения пептидный линкер по настоящему изобретению является расщепляемым линкером в условиях in vivo.
Слитые белки по настоящему изобретению могут быть получены, например, посредством твердофазного синтеза пептидов {например, методом твердофазного синтеза по Меррифилду) или методом рекомбинантных ДНК. Для получения методом рекомбинантных ДНК выделяют один или несколько полинуклеотидов, кодирующих слитый белок (фрагмент), например, описанный выше, и вставляют его в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такой полинуклеотид может быть легко изолирован и секвенирован при использовании стандартных методик.
Для создания экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательности слитого белка (фрагмента) наряду с соответствующими сигналами, регулирующими транскрипцию/трансляцию, могут быть использованы методы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Эти методы включают применяемые in vitro технологии рекомбинантных ДНК, методы синтеза и применяемую in vivo рекомбинацию/генетическую рекомбинацию. См., например, технологии, описанные в публикации Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); и Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Экспрессионный вектор может быть частью плазмиды, вируса или может быть фрагментом нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор включает экспрессионную кассету, в которой клонируют полинуклеотид, кодирующий слитый белок (фрагмент) (т.е., кодирующую область), при функциональной ассоциации с промотором и/или другими элементами, регулирующими транскрипцию или трансляцию. В настоящем документе, «кодирующая область» - это часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя «стоп-кодоны» (TAG, TGA или ТАА) не транслируются в аминокислоту, их можно рассматривать, как часть кодирующей области при ее наличии, но фланкирующие последовательности, например, промоторы, участки связывания рибосомы, терминаторы транскрипции, интроны, 5'- и 3'-нетранслируемые области и т.п. не являются частью кодирующей области. В одном полинуклеотидном конструкте могут присутствовать две или более кодирующие области, например, на одном векторе или в отдельных полинуклеотидных конструктах, например, на отдельных (разных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область, или может содержать две и более кодирующие области, например, вектор по настоящему изобретению может кодировать один или более полипептидов, которые пост- или котрансляционно посредством протеолиза разделяются в конечные белки. Кроме того, вектор, полинуклеотид, или нуклеиновая кислота по настоящему изобретению могут кодировать гетерологичные кодирующие области, которые могут оставаться неслитыми или быть слиты в полинуклеотид, кодирующий слитый белок (фрагмент) по настоящему изобретению, либо его вариант или производное. Гетерологичные кодирующие области включают, не ограничиваясь перечисленным, специализированные элементы, или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. Функциональная ассоциация имеет место, когда область, кодирующая продукт гена, например, полипептид, ассоциирована с одним или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы поместить экспрессию продукта гена под влиянием или контролем регуляторной последовательности(ей). Два фрагмента ДНК (таких как область, кодирующая полипептид, и ассоциированный с ней промотор) являются «функционально ассоциированными», если индукция функции промотора приводит к транскрипции иРНК, кодирующей желаемой продукт гена, и если природа связи между двумя фрагментами ДНК не нарушает способность последовательностей, регулирующих экспрессию, направлять экспрессию продукта гена, и не нарушает способность матрицы ДНК быть транскрибированной. Так, промоторная область будет функционально ассоциированной с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор был способен осуществлять транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотор может быть клеточно-специфичным промотором, который направляет существенную транскрипцию ДНК только в предопределенных клетках. Другие элементы, регулирующие транскрипцию помимо промотора, например, энхансоры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально ассоциированными с полинуклеотидом, чтобы направлять клеточно-специфичную транскрипцию. В настоящем документе раскрыты подходящие промоторы и другие области регуляции транскрипции. Специалистам в данной области техники известны разнообразные области регуляции транскрипции. Они включают, не ограничиваясь перечисленным, области регуляции транскрипции, которые функционируют в клетках позвоночных животных, в том числе, промоторные и энхансорные сегменты цитомегаловирусов (например, немедленно-ранний промотор во взаимодействии с интроном А), обезьяньего вируса 40 (например, ранний промотор) и ретровирусов (такой как, например, вирус саркомы Рауса). Другие области регуляции транскрипции включают области, полученные из генов позвоночных животных, таких как гены актина, белка теплового шока, гормона роста крупного рогатого скота и а-глобина кролик, и также другие последовательности, способные регулировать экспрессию гена в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие области регуляции транскрипции включают тканеспецифичные промоторы и энхансоры, и также индуцируемые промоторы (например, тетрациклин-индуцируемые промоторы). Аналогично, специалистам в данной области техники известны разнообразные элементы, регулирующие трансляцию. Такие элементы включают, в частности, участки связывания рибосомы, инициаторные и терминирующие кодоны и элементы, полученные из вирусных систем (в частности, участок внутреннего связывания рибосомы, IRES, также называемый последовательностью CITE). Экспрессионная кассета может также включать другие признаки, такие как точка начала репликации и/или элементы интеграции в хромосому, такие как длинные концевые повторы (LTR) ретровирусов или инвертированные концевые повторы (ITR) аденоассоциированных вирусов.
Слитые белки, полученные в соответствии с описанием в настоящем документе, могут быть очищены при использовании методов, известных из уровня техники, например, высокоэффективной жидкостной хроматографии, ионобменной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии, гель-фильтрации и т.п. Фактические условия, используемые для очистки конкретного белка, будут зависеть, частично, от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и очевидны для специалистов в данной области. Для очистки методом аффинной хроматографии может быть использовано антитело, лиганд, рецептор или антиген, с которым связывается слитый белок. Чистота слитого белка может быть определена любым из разнообразных хорошо известных аналитических методов, включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и т.п.
Изобретение относится также к полинуклеотиду или нуклеиновой кислоте, кодирующим белок или полипептид, содержащий полипептид Ir-CPI, его фрагмент или вариант, согласно вышеописанному, и его применению для ингибирования внешнего пути свертывания крови, предпочтительно, для ингибирования клеточной части внешнего пути свертывания крови, или для ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза, и тем самым для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, ассоциированных с внешним путем свертывания крови или рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом.
Согласно одному варианту осуществления изобретения, полинуклеотид или нуклеиновая кислота по настоящему изобретению имеют нуклеотидную последовательность, содержащую или состоящую из последовательности SEQ ID NO: 3 или последовательности, по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 3.
В одном варианте осуществления изобретения полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.
В одном варианте осуществления изобретения полинуклеотиды, кодирующие слитые белки по настоящему изобретению, могут экспрессироваться, как один полинуклеотид, который кодирует полный слитый белок, или как несколько (например, два или более) совместно экспрессирующихся полинуклеотидов. Полипептиды, кодируемые совместно экспрессирующимися полинуклеотидами, могут соединяться посредством, например, дисульфидных связей или другими способами, с образованием функционального слитого белка.
В одном варианте осуществления изобретения полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляют собой ДНК. В другом варианте осуществления изобретения полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляют собой РНК, например, в форме информационной РНК (иРНК). РНК по настоящему изобретению может одноцепочечной или двуцепочечной.
Другой целью настоящего изобретения является вектор, содержащий один или более полинуклеотидов, кодирующих белок или полипептид по настоящему изобретению, и его применение для ингибирования внешнего пути свертывания крови, предпочтительно, для ингибирования клеточной части внешнего пути свертывания крови, или для ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза, и тем самым, для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, ассоциированных с внешним путем свертывания крови или рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом. в предпочтительном варианте осуществления изобретения вектором по настоящему изобретению является экспрессионный вектор.
Изобретение относится также к композиции, содержащей описанные выше белок или полипептид, полинуклеотид или нуклеиновую кислоту.
Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей белок или полипептид, полинуклеотид или нуклеиновую кислоту, или вектор по настоящему изобретению, и по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые могут быть использованы в таких композициях, включают, не ограничиваясь перечисленным, ионообменные материалы, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси неполных глицеридов, образованных насыщенными жирными кислотами растительного происхождения, воду, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, гидрофосфат динатрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу натрия), полиэтиленгликоль, полиакрилаты, воска, блок-сополимеры, образованные полиэтиленом и полиоксипропиленом, полиэтиленгилколь и ланолин.
Другой целью настоящего изобретения является лекарственный препарат, в состав которого входит белок или полипептид, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, вектор, композиция, или фармацевтическая композиция, согласно вышеописанному.
В одном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция или лекарственный препарат по настоящему изобретению содержит описанный выше белок или полипептид, полинуклеотид или нуклеиновую кислоту, или вектор в терапевтически эффективном количестве.
Еще одной целью настоящего изобретения является медицинское изделие с покрытием из описанного выше белка или полипептида.
Далее, еще одной целью настоящего изобретения является применение описанного выше белка или полипептида для покрытия медицинского изделия. Еще одной целью настоящего изобретения является вышеописанный белок или полипептид для покрытия медицинского изделия.
Соответственно, настоящее изобретение относится также к медицинскому изделию с покрытием из вышеописанного белка или полипептида.
Примеры медицинских изделий, которые могут быть покрыты белком или полипептидом по настоящему изобретению включают, не ограничиваясь перечисленным, коронарный стент, искусственное сердце, искусственный сердечный клапан, центральный венозный катетер, систему для кардиоплегии, расширители, туннельные изделия, канюли для стент-графтов, катетеры, системы экстракорпорального кровообращения, включая, в частности, системы экстракорпоральной мембранной оксигенации, системы (авто)трансфузии, артериальные фильтры, системы для гемодиализа, системы для плазмафереза; медицинское изделие, используемое для сбора крови вне тела; и/или принадлежности для любого из указанных изделий, включая, в частности, трубки, канюли, центрифужный насос, клапан, порт и/или дивертор, артериальные стенты для применения при стенозе и аневризме, и устройства для поддержки левого желудочка.
Изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для ингибирования внешнего пути свертывания крови, предпочтительно, для ингибирования клеточной части внешнего пути свертывания крови, более предпочтительно, для лечения тромботических заболеваний, ассоциированных с внешним путем свертывания крови.
Как описано выше, в одном варианте осуществления изобретения ингибирование внешнего пути свертывания крови, в частности ингибирование клеточной части внешнего пути свертывания крови, включает ингибирование рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза.
Заявитель неожиданно обнаружил, что полипептид Ir-CPI согласно изобретению ингибирует рекрутинг тромбоцитов, рекрутинг нейтрофилов, активацию нейтрофилов и нетоз, тем самым подавляя тромбоз, ассоциированный с внешним путем свертывания крови.
В действительности, заявитель показал, что полипептид Ir-CPI проявил неожиданные защитные свойства в экспериментальной животной модели вызванных лазерным излучением повреждений артериол мышцы, поднимающей яичко, про которую известно, что внешний путь свертывания крови является ключевым фактором, приводящим к тромботическому событию (Darbousset et al., 2012). В этой модели Ir-CPI ингибирует не только образование фибрина, но также рекрутинг тромбоцитов на пораженном участке. Полипептид Ir-CPI был активен также при нанесении повреждений лазерным излучением мышам с опухолями в модели, зависимой, в основном, от Тканевого фактора, экспрессируемого микрочастицами из раковых клеток (Thomas et al., 2009). Поскольку нейтрофилы играют ключевую роль в активации пути, зависимого от Тканевого фактора, в модели повреждений, вызванных лазерным излучением (Darbousset et al., 2012), затем проводилось сравнение присутствия и активации нейтрофилов в присутствии и в отсутствие Ir-CPI. Заявитель наблюдал, что in vivo Ir-CPI значимо подавлял количество скапливающихся нейтрофилов и активность эластазы нейтрофилов на поврежденном участке. Заявитель показал также, что in vitro Ir-CPI значимо подавлял активацию нейтрофилов, примированных TNFα (ФНОα; фактором некроза опухоли альфа), или инкубированных в присутствии аденозинтрифосфата (АТФ), как это наблюдали посредством детекции экспрессии CD11b, CD11b в условиях активации или Ly6G на поверхности нейтрофилов. После активации нейтрофилы могли образовывать «нейтрофильные внеклеточные ловушки» (НВЛ) - структуры, представленные филаментами хроматина, покрытыми гистонами, протеазами и зернистыми и цитозольными белками. Данные исследований указывают на то, что НВЛ способствует тромбозу, стимулируя отложения фибрина и агрегацию тромбоцитов. Заявитель наблюдал, как в условиях in vitro Ir-CPI тоже значимо снижал уровень образования НВЛ (т.е., уровень нетоза) в нейтрофилах, которые были примированы ФНОα и активированы PAF (ФАТ; фактором активации тромбоцитов). Вклад нейтрофилов в возникновение тромботических событий был продемонстрирован в разнообразных эксперимента. Причастность автофагии к высвобождению НВЛ и доставке Тканевого фактора в НВЛ, и связь между НВЛ и тромбозом указывают на критическое значение нейтрофилов для взаимодействия между воспалительными и тромботическими путями (Demers et al., 2012; Leal et al., 2017; Mauracher et al., 2018). Вклад нейтрофилов в тромбоз может быть продемонстрирован ослаблением тромботических проявлений в животных моделях тромбоза при истощении нейтрофилов (von 
et al., 2012). Экспрессия образующегося в нейтрофилах и/или приобретенного нейтрофилами ТФ указывает на участие этих клеток в патогенезе тромботических событий, характеризующих несколько воспалительных нарушений. Так, Ir-CPI ингибирует тромбообразование после активации внешнего пути свертывания крови не посредством ингибирования факторов свертывания крови, специфичных для этого пути, таких как Тканевый фактор, а посредством ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или образования НВЛ.
Таким образом, заявитель неожиданно обнаружил, что полипептид Ir-CPI может быть использован по терапевтическим показаниям с целью предотвращения и/или лечения тромботических событий во время заболеваний и состояний, при которых тромбоз и/или свертывание крови зависит от рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или образования НВЛ. Заявитель продемонстрировал также, что Ir-CPI может быть использован по терапевтическим показаниям, направленным на предотвращение и/или лечение тромботических событий у пациентов с заболеваниями и состояниями, ассоциированными с активацией внешнего пути свертывания крови.
Изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, ассоциированных с рекрутингом тромбоцитов, активацией нейтрофилов, рекрутингом нейтрофилов и/или образованием НВЛ, у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
В одном варианте осуществления изобретения лечение и/или предотвращение заболеваний и состояний, ассоциированных с рекрутингом тромбоцитов, активацией нейтрофилов, рекрутингом нейтрофилов и/или образованием НВЛ, у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта, заключается в лечении и/или предотвращении заболеваний и состояний, ассоциированных с активацией внешнего пути свертывания крови.
Изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, ассоциированных с активацией внешнего пути свертывания крови у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта, предпочтительно, тромбоза, ассоциированного с внешним путем свертывания крови.
В одном варианте осуществления изобретения заболевания и состояния, ассоциированные с активацией внешнего пути свертывания крови, выбирают из группы, состоящей из или включающей тромбоз (включая венозный и артериальный тромбозы), воспалительные заболевания с тромботической тенденцией, тромбовоспаление (включая тромбовоспаление, вызванное медицинским изделием), заболевания и состояния, ассоциированные с кардиологическими хирургическими вмешательствами, сердечно-сосудистые заболевания, рак и метастазирование.
Заболевания и состояния, ассоциированные с активацией внешнего пути свертывания крови, включают воспалительные заболевания с тромботической тенденцией. В настоящем документе термин "воспалительные заболевания с тромботической тенденцией" можно заменить на «тромботические осложнения при воспалительных заболеваниях».
В одном варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения тромбоз ассоциированное с активацией внешнего пути свертывания крови у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
В одном варианте осуществления изобретения тромбоз, ассоциированный с активацией внешнего пути свертывания крови, выбирают из группы, состоящей из или включающей венозный тромбоз, рак-ассоциированный тромбоз и ассоциированный с инсультом тромбоз. В одном варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием для лечения и/или предотвращения венозного тромбоза. В другом варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения рак-ассоциированного тромбоза. В другом варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения ассоциированного с инсультом тромбоза.
Так, один вариант осуществления изобретения относится к применению белка, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, а фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения воспалительных заболеваний с тромботической тенденцией у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
В одном варианте осуществления изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения тромбоза, ассоциированного с воспалительным заболеванием, или тромбовоспаления у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
В одном варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения воспалительного заболевания с тромботической тенденцией или тромбовоспаления, которое выбирают из группы, состоящей из или включающей рак-ассоциированный тромбоз, ассоциированный с метастазированием тромбоз, ассоциированный с инсультом тромбоз, болезнь Бехчета (ББ), васкулиты, ассоциированные с антителами к цитоплазме нейтрофилов ANCA-ассоциированные васкулиты, артериит Такаясу, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, антифосфолипидный синдром, периодическую болезнь, облитерирующий тромбангиит (ОТА), сепсис, воспалительные заболевания кишечника, атеросклероз и разрыв атеросклеротической бляшки, ишемическую болезнь сердца, острый инфаркт миокарда, образование тромба после травм головного мозга, тромбовоспаление, вызванное медицинским изделием, контактирующим с кровью, тромбоз, вызванный процедурами катетеризации и/или позиционирования стента в месте локального стеноза сосуда, тромбоз, вызванный экстракорпоральным кровообращением, гепарин-индуцированную тромбоцитопению (ГИТ), иммунотромбоз, тромбоз, ассоциированный с преэклампсией, тромботические осложнения при трансплантации клеток и клеточных кластеров и при трансплантации целых органов или лоскутов, венозную тромбоэмболию, аневризмы, и синдром ишемии-реперфузии скелетной мускулатуры.
В одном варианте осуществления изобретения указанное тромбовоспаление выбирают из группы, состоящей из или включающей тромбоз, вызванный процедурами катетеризации и/или позицирования стента в месте локального стеноза сосуда, атеросклероз, разрыв атеросклеротической бляшки, ишемическую болезнь сердца, вызванное медицинским изделием тромбовоспаление. В одном варианте осуществления изобретения вызванное медицинским изделием тромбовоспаление включает тромбовоспаление, вызванное медицинским изделием, контактирующим с кровью. В другом варианте осуществления изобретения указанное тромбовоспаление выбирают из группы, состоящей из или включающей рак-ассоциированный тромбоз, ассоциированный с метастазированием тромбоз, и ассоциированный с инсультом тромбоз.
Заболевания и состояния, ассоциированные с активацией внешнего пути свертывания крови, включают тромбовоспаление, вызванное медицинским изделием, контактирующим с кровью. В одном варианте осуществления изобретения тромбовоспаления, вызванные медицинским изделием, контактирующим с кровью, включают, не ограничиваясь перечисленным, воспаления, вызванные процедурами катетеризации (такими как, например, чрескожная транслюминальная ангиопластика) и/или позицирования стента в месте локального стеноза сосуда, с учетом риска разрыва атеросклеротической бляшки и последующего риска повторного тромбоза и тромбоза катетера после таких вмешательств; и экстракорпоральным кровообращением.
В одном варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения вызванного медицинским изделием тромбовоспаления у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
Так, в одном варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения тромбоза, вызванного процедурами катетеризации (такими как, например, чрескожная транслюминальная ангиопластика) и/или позиционирования стента в месте локального стеноза сосуда; и/или экстракорпоральным кровообращением у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
Заболевания и состояния, ассоциированные с активацией внешнего пути свертывания крови, включают тромбоз и/или свертывание крови, ассоциироавные с экстракорпоральным кровообращением, которое проводится в контексте кардиологического хирургического вмешательства (например, операции аортокоронарного шунтирования (АКШ), операции на открытом сердце).
Так, в одном варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения тромбоза и/или свертывания крови, ассоциированного с экстракорпоральным кровообращением, которое проводится в контексте кардиологического хирургического вмешательства нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
Заболевания и состояния, ассоциированные с активацией внешнего пути свертывания крови, включают рак, и, в частности, рак-ассоциированный тромбоз.
В действительности, микрочастицы, содержащие Тканевый фактор, и нетоз(?), задействованы также в тромбогенезе, ассоциированном с раком (Thomas et al., 2009; Demers et al., 2012; Mauracher et al., 2018).
Так, в одном варианте осуществления изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения рака и/или метастазирования у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
В одном варианте осуществления изобретения рак и/или метастазирование ассоциированы с внешним путем свертывания крови. В одном варианте осуществления изобретения рак и/или метастазирование ассоциированы с тромбозом. В одном из частных случаев осуществления изобретения рак и метастазирование ассоциированы с тромбозом, ассоциированным с внешним путем свертывания крови.
В одном варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения рак-ассоциированного тромбоза и/или ассоциированного с метастазированием тромбоза у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
В одном варианте осуществления изобретения изобретение относится к применению белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению для лечения и/или предотвращения ассоциированного с инсультом тромбоза у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта.
Настоящее изобретение относится также к способу ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза у нуждающегося в таком ингибировании субъекта; способ заключается в введении указанному субъекту в терапевтически эффективном количестве белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения и/или предотвращения заболевания или состояния, ассоциированного с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом, у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта; способ заключается в введении указанному субъекту в терапевтически эффективном количестве белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления изобретения способ по настоящему изобретению предназначен для лечения и/или предотвращения заболевания и состояния, ассоциированного с активацией внешнего пути свертывания крови, которое выбирают из группы, состоящей из или включающей венозный тромбоз, артериальный тромбоз, тромбовоспаление, сердечно-сосудистые заболевания, рак и метастазирование.
Настоящее изобретение относится также к способу ингибирования внешнего пути свертывания крови, предпочтительно, клеточной части внешнего пути, или для ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза у нуждающегося в таком ингибировании субъекта; способ заключается в введении указанному субъекту в терапевтически эффективном количестве белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения и/или предотвращения заболевания или состояния, ассоциированного с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта; способ заключается в введении указанному субъекту в терапевтически эффективном количестве белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения и/или предотвращения заболевания или состояния, ассоциированного с внешним путем свертывания крови у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта; способ заключается в введении указанному субъекту в терапевтически эффективном количестве белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления изобретения способ по настоящему изобретению предназначен для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, ассоциированных с активацией внешнего пути свертывания крови, или с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом, которое выбирают из группы, состоящей из или включающей тромбоз, воспалительные заболевания с тромботической тенденцией, тромбовоспаление, вызванное медицинским изделием, заболевания и состояния, ассоциированные с кардиологическими хирургическими вмешательствами, и рак и метастазирование.
Другой целью настоящего изобретения является способ лечения и/или предотвращения воспалительных заболеваний с тромботической тенденцией или тромбовоспалением, в частности, тромбоза, ассоциированного с воспалительным заболеванием, или воспалительного заболевания, ассоциированного с тромбозом, у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта; такой способ заключается в введении указанному субъекту в терапевтически эффективном количестве белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления изобретения способ по настоящему изобретению предназначен для лечения и/или предотвращения заболевания или состояния, которое выбирают из группы, состоящей из или включающей тромбоз, ассоцированный с воспалительным заболеванием, воспалительное заболевание, ассоцированное с тромбозом, рак-ассоциированный тромбоз, ассоциированный с метастазированием тромбоз, ассоциированный с инсультом тромбоз, Болезнь Бехчета (ББ), васкулиты, ассоциированные с антителами к цитоплазме нейтрофилов (ANCA-ассоциированные васкулиты), артериит Такаясу, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, антифосфолипидный синдром, периодическая болезнь, облитерирующий тромбангиит (ОТА), сепсис, воспалительные заболевания кишечника, атеросклероз и разрыв атеросклеротической бляшки, ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда, образование тромба после травм головного мозга, тромбовоспаление, вызванное медицинским изделием, контактирующим с кровью, тромбоз, вызванный процедурами катетеризации и/или позиционирования стента в месте локального стеноза сосуда, тромбоз, вызванный экстракорпоральным кровообращением, гепарин-индуцированная тромбоцитопения (ГИТ), иммунотромбоз, тромбоз, ассоциированный с преэклампсией, тромботические осложнения при трансплантации клеток и клеточных кластеров и при трансплантации целых органов или лоскутов, венозная тромбоэмболия, аневризмы, и синдром ишемии-реперфузии скелетной мускулатуры.
Другой целью настоящего изобретения является способ лечения и/или предотвращения тромбоза при всех процедурах катетеризации (таких как, например, чрескожная транслюминальная ангиопластика) и/или позиционирования стента в месте локального стеноза сосуда у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта, способ заключается в введении указанному субъекту в терапевтически эффективном количестве белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению.
Другой целью настоящего изобретения является способ лечения и/или предотвращения тромбоза и/или свертывания крови, ассоциированного с экстракорпоральным кровообращением, которое проводится в контексте кардиологического хирургического вмешательства у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта, способ заключается в введении указанному субъекту в терапевтически эффективном количестве белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению.
Другой целью настоящего изобретения является способ лечения и/или предотвращения рака и/или метастазирования, в частности, рак-ассоциированного тромбоза у нуждающегося в таком лечении и/или предотвращении субъекта; способ заключается в введении указанному субъекту в терапевтически эффективном количестве белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием по настоящему изобретению.
В одном варианте осуществления изобретения субъект подвержен образованию тромбов, в частности тромба, ассоциированного с внешним путем свертывания крови. В одном варианте осуществления изобретения субъект относится к группе риска развития тромба, в частности, тромба, ассоциированного с внешним путем свертывания крови. В другом варианте осуществления изобретения у субъекта имеется или имелся тромб, в частности, тромб, ассоциированный с внешним путем свертывания крови.
Примеры рисков развития тромба, в частности, тромба, ассоциированного с внешним путем свертывания крови, включают, не ограничиваясь перечисленным, наличие воспалительных заболеваний с тромботической тенденцией, наличие атеросклеротических повреждений, требующих проведения вмешательства, направленного на облегчение локального кровотока на уровне стеноза сосуда, осуществление экстракорпорального кровообращения, проведение операции аортокоронарного шунтирования (АКШ) с использованием аппарата искусственного кровообращения, и наличие рака.
В действительности, экстракорпоральное кровообращение может способствовать тромбинообразованию посредством активации внешнего пути через воздействие на кровь воздуха и ТФ в ране и затем рециркуляции этой крови при дренировании в связи с кардиотомией, применяемом для уменьшения кровопотери.
В одном варианте осуществления изобретения субъект подвержен развитию рака и/или метастазированию. В одном варианте осуществления изобретения субъект относится к группе риска развития рака и/или метастазирования. В одном варианте осуществления изобретения субъект болен в настоящее врмя или перенес рак и/или метастазирование.
В одном варианте осуществления изобретения субъект недавно перенес хирургическое вмешательство. В одном варианте осуществления изобретения «недавно» означает, что после вмешательства прошло не более 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 или более дней. В одном варианте осуществления изобретения «недавно» означает, что после вмешательства прошло не более 2 часов, 4 часов, 6 часов, 12 часов, 18 чсов или 24 часов.
В другом варианте осуществления изобретения у субъекта запланировано проведение хирургического вмешательства. В одном варианте осуществления изобретения «запланировано проведение» означает в течение 2 часов, 4 часов, 6 часов, 12 часов, 18 часов или 24 часов. В другом варианте осуществления изобретения термин «запланировано проведение» означает в течение 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 или более дней.
В одном варианте осуществления изобретения субъекту ранее не проводилось лечение по поводу тромба. В другом варианте осуществления изобретения субъект ранее получал одно, два или более видов лечения по поводу тромба.
В настоящем документе термин «лечение» охватывает профилактическое и терапевтическое лечение.
В одном варианте осуществления изобретения субъект по настоящему изобретению находится в пожилом возрасте. В настоящем документе термин «пожилой» означает, что возраст субъекта составляет, по меньшей мере, 50 лет, по меньшей мере, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90 лет.
В одном варианте осуществления изобретения субъект является мужчиной. В другом варианте осуществления изобретения the субъект является женщиной.
Следует понимать, что решение о общей суточной дозе белка по настоящему изобретению, полинуклеотида, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата будет принимать лечащий врач на основании тщательной медицинской оценки. Конкретный уровень терапевтически эффективной дозы для каждого конкретного пациента будет зависеть от самых разнообразных факторов, в том числе, от нарушения, по поводу котрого проводится лечение, и тяжесть нарушения; активности применяемого агента; конкретной используемой композиции, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и рациона питания пациента; времени введения; способа введения; и скорости выведения конкретного используемого агента; продолжительности лечения; лекарственных средств, используемых в комбинации или одновременно с конкретным используемым агентом; и подобных факторов, хорошо известных в медицине. Например, специалисты в данной области начинают лечение препаратом с доз, более низких по сравнению с требуемыми для достижения желаемого терапевтического эффекта, и постепенно повышают дозировку до достижения желаемого эффекта. Однако, суточная дозировка препаратов может варьировать в широких пределах от приблизительно 10 до приблизительно 10000 мг в сутки для взрослого пациента, предпочтительно, от приблизительно 100 мг до приблизительно 5000 мг, более предпочтительно, от приблизительно 200 мг до приблизительно 2000 мг в сутки для взрослого пациента. Предпочтительно композиции содержат 10, 50, 100, 250, 500, 1000 и 2000 мг действующего вещества для симптоматической коррекции дозировки для пациента, которому проводится лечение. Лекарственный препарат, как правило, содержит от приблизительно 10 до приблизительно 10000 мг действующего вещества, предпочтительно, 5 до приблизительно 5000, более предпочтительно, от приблизительно 10 до приблизительно 2000 мг действующего вещества. Эффективное количество поступающего лекарства на уровне дозировки обычно составляет от 0.01 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела в сутки, предпочтительно, от приблизительно 0.05 мг/кг до 40 мг/кг массы тела в сутки, более предпочтительно, от приблизительно 0.1 мг/кг до 20 мг/кг массы тела в сутки, более предпочтительно, от приблизительно 0.2 мг/кг до 1 мг/кг массы тела в сутки.
Для применения посредством введения субъекту композиция композиция, фармацевтическая композиция, лекарственный препарат по настоящему изобретению будут приготовлены для введения субъекту. Композиция, фармацевтическая композиция, лекарственный препарат по настоящему изобретению могут вводиться перорально, парентерально, наружно, в форме ингалируемого спрея, ректально, назально, буккально, вагинально или через имплантированный резервуар. В настоящем документе термин «введение» включает подкожные, внутривенные, наружные, внутримышечные, внутриглазные, внутрисуставные, внутрисиновиальные, внутригрудинные, интратекальные, внутрипеченочные, внутриочаговые и внутричерепные способы введения в форме инъекций и инфузий.
В одном варианте осуществления изобретения композиция, фармацевтическая композиция, лекарственный препарат по настоящему изобретению имеет форму, адаптированную для наружного применения.
Примеры форм, адаптированных для наружного введения, включают, в частности, жидкие, пастообразные и твердые композиции и более конкретно, водные растворы, капли, глазные капли, офтальмологические растворы, дисперсии, спреи, микрокапсулы, микро- или наночастицы, полимерный пластырь или пластырь с контролируемым высвобождением.
В одном варианте осуществления изобретения композиция, фармацевтическая композиция или лекарственный препарат по настоящему изобретению содержит один или более фармацевтически приемлемых носителей для создания рецептуры, адаптированной для наружного применения.
В одном варианте осуществления изобретения композиция, фармацевтическая композиция, или лекарственный препарат по настоящему изобретению имеет форму, адаптированную для инъекций, например, внутриглазной, внутримышечной, подкожной, внутрикожной, чрескожной или внутривенной инъекции или инфузий.
Примеры форм, адаптированных для инъекций, включают, в частности, растворы, например, стерильные водные растворы дисперсии, эмульсии, суспензии, твердые формы, пригодные для использования для приготовления растворов или суспензий посредством добавления жидкости перед использованием, такие как, например, порошок, липосомальные формы и т.п.
Стерильные инъекционные формы композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата по данному изобретению могут представлять собой водную или маслянистую суспензию. Эти суспензии могут быть приготовлены в соответствии с методиками, известными специалисту в данной области техники, при использовании подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъекционный препарат может также иметь форму стерильного инъекционного раствора или суспензии в нетоксичном, приемлемом для парентерального введении разбавителе или растворителе. В число приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, входят вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Дополнительно в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно используют стерильные нелетучие масла. С этой целью можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Для приготовления инъекционных форм могут быть использованы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и глицериды-производные этой кислоты, и также натуральные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в своих полиоксиэтилированных версиях. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать в качестве разбавителя или дисперсанта жирный спирт, такой как карбоксиметилцеллюлоза, или сходные диспергирующие агенты, которые широко применяются в составе фармацевтически приемлемымх лекарственных форм, включающих эмульсии и суспензии. Также в целях приготовления препарата могут быть использованы другие часто применяемые поверхностно-активные вещества, такие как Твины, Спаны и другие эмульгаторы или усилители биодоступности, которые часто применяются в производстве фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм.
В частном случае осуществления изобретения композиция, фармацевтическая композиция или лекарственный препарат по настоящему изобретению имеют форму, адаптированную для внутриглазного введения.
В одном варианте осуществления изобретения композицию, фармацевтическую композицию или лекарственный препарат по настоящему изобретению вводят нуждающемуся в них субъекту, по меньшей мере, один раз в сутки. Например, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственный препарат по настоящему изобретению может вводиться один раз в сутки, два раза в сутки или три раза в сутки. В предпочтительном варианте осуществления изобретения композицию, фармацевтическую композицию или лекарственный препарат по настоящему изобретению вводят нуждающемуся в них субъекту один раз в сутки.
В другом варианте осуществления изобретения композицию, фармацевтическую композицию или лекарственный препарат по настоящему изобретению вводят нуждающемуся в них субъекту, по меньшей мере, один раз в неделю. Например, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственный препарат по настоящему изобретению могут вводиться один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю или до семи раз в неделю.
В другом варианте осуществления изобретения композицию, фармацевтическую композицию или лекарственный препарат по настоящему изобретению вводят нуждающемуся в них субъекту один раз в месяц, два раза в месяц, каждые два месяца, каждые два или три месяца, два раза в год или один раз в год.
В одном варианте осуществления изобретения композицию, фармацевтическую композицию или лекарственный препарат по настоящему изобретению вводят нуждающемуся в них субъекту вводят нуждающемуся в них субъекту предварительно до воздействия с риском развития тромба. В одном варианте осуществления изобретения термин «предварительно до» означает, по меньшей мере, за неделю до воздействия. В другом варианте осуществления изобретения термин «предварительно до» означает пять дней, четыре дня, три дня, два дня или один день до воздействия. В другом варианте осуществления изобретения термин «предварительно до» означает 24 часа, 18 часов, 15 часов, 12 часов, 6 часов, 4 часа, 2 часа или 1 час до воздействия. В другом варианте осуществления изобретения термин «предварительно до» означает менее одного часа до воздействия, например, за 45 минут, 30 минут, 15 минут, 10 минут, 5 минут до воздействия или в момент воздействия. В качестве иллюстрации, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственный препарат по настоящему изобретению могут вводиться субъекту за 24 часа, 12 часов, 6 часов или 1 час до продолжительной й поездки или в начале продолжительной поездки.
В другом варианте осуществления изобретения композицию, фармацевтическую композицию или лекарственный препарат по настоящему изобретению вводят нуждающемуся в них субъекту после воздействия с риском развития тромба. В одном варианте осуществления изобретения термин «после» означает через 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, или 45 минут после воздействия. В другом варианте осуществления изобретения термин «после» означает через 1 час, 2, 4, 6, 12, 15, 18 или 14 часов после воздействия. В другом варианте осуществления изобретения термин «после» означает через 1 день, 2, 3, 4 или пять дней после воздействия. В другом варианте осуществления изобретения термин «после» означает через неделю или более после воздействия. В качестве иллюстрации, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственный препарат по настоящему изобретению могут вводиться субъекту сразу после продолжительной поездки, через 1 час, 2 часа, 6 часов или 12 часов после продолжительной поездки.
В одном варианте осуществления медицинское изделие с белковым покрытием по настоящему изобретению разрабатывают для введения субъекту. Медицинское изделие с белковым покрытием по настоящему изобретению может быть введено парентерально или наружно, или может быть имплантировано.
В одном варианте осуществления изобретения медицинское изделие с белковым покрытием по настоящему изобретению имплантируют в сердечную систему или систему кровообращения.
Настоящее изобретение относится также к набору, в состав которого входит белок или полипептид, полинуклеотид или нуклеиновая кислота, вектор, композиция, фармацевтическая композиция или лекарственный препарат, либо медицинское изделие с покрытием согласно изобретению.
В одном варианте осуществления изобретения набор по настоящему изобретению дополнительно включает устройство для введения белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием нуждающемуся в них субъекту.
В одном варианте осуществления изобретения набор по настоящему изобретению дополнительно включает инструкции по введению указанному субъекту белка или полипептида, полинуклеотида или нуклеиновой кислоты, вектора, композиции, фармацевтической композиции, лекарственного препарата или медицинского изделия с покрытием.
В одном варианте осуществления изобретения набор по настоящему изобретению применяется для ингибирования внешнего пути свертывания крови, в частности, клеточной части внешнего пути свертывания крови, или для ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза. В одном варианте осуществления изобретения набор по настоящему изобретению применяется для лечения и/или предотвращения заболеваний и состояний, ассоциированных с активацией внешнего пути свертывания крови. В одном варианте осуществления изобретения набор по настоящему изобретению применяется для лечения и/или предотвращения тромбоза, ассоциированного с внешним путем свертывания крови, предпочтительно, рак-ассоциированного тромбоза. В одном варианте осуществления изобретения набор по настоящему изобретению применяется для предотвращения образования и/или роста тромба или тромбоза, ассоциированного с внешним путем свертывания крови. В одном варианте осуществления изобретения набор по настоящему изобретению применяется для лечения и/или предотвращения рака и/или метастазирования.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 - Серия графиков, показывающих детекцию in vivo тромбоцитов (А) и фибрина (В) после индукции тромбообразования у мышей посредством повреждения сосудистой стенки. Для детекции фибрина и тромбоцитов использовали антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488, и антитело к GPIb, меченое DyLight649, соответственно. Представлена медиана интегрированной по времени флуоресценции (для короткого периода времени) для 53 (контрольная группа) и 54 (Ir-CPI) тромбов, образовавшихся у 5 мышей из каждой группы, усл. ед.: условные единицы.
Фигура 2 - Серия типичных изображений, полученных методом флуоресцентной микроскопии in vivo через 30, 60, 120 и 180 секунд после повреждения лазерным излучением стенки сосуда, вызвавшим образование тромба у мышей, обработанных NaCl (контроль) или Ir-CPI. Для детекции фибрина и тромбоцитов использовали антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488, и антитело к GPIb, меченое DyLight649, соответственно. Зоны, окруженные штриховой линией, отражают скопление тромбоцитов, и зоны, окруженные точечной линией, отражают скопление фибрина. Отрезок соответствует 10 мкМ.
Фигура 3 - График, показывающий детекцию in vivo фибрина в течение 90 минут после образования у мыши тромба, вызванного повреждением стенки сосуда. Для детекции фибрина использовали антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488. Представлена медиана интегрированной по времени флуоресценции (для длительного периода времени) для 53 (контрольная группа) и 50 (Ir-CPI) тромбов, образовавшихся у 9 (n=9) мышей из каждой группы), усл. ед.: условные единицы.
Фигура 4 - График, показывающий детекцию in vivo фибрина в течение 90 минут после образования у мыши тромба, вызванного повреждением стенки сосуда. Для детекции фибрина использовали антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488. Представлены медиана и межквартильный размах для тромбов у контрольных мышей (n=53 тромба) и мышей, обработанных Ir-CPI (n=50 тромбов), образовавшихся у 9 мышей (n=9 мышей в группе), усл. ед.: условные единицы.
Фигура 5 - Серия типичных изображений, полученных методом флуоресцентной микроскопии in vivo через 30, 60, 120 и 180 секунд после повреждения лазерным излучением стенки сосуда, вызвавшим образование тромба у мышей, обработанных NaCl (контроль) или Ir-CPI. Для детекции ПМЯН использовали меченое фикоэритрином антитело к Ly6G. Зоны, окруженные штриховой линией, отражают скопление ПМЯН. Отрезок соответствует 10 мкМ.
Фигура 6 - Серия графиков, показывающих детекцию in vivo ПМЯН после повреждения лазерным излучением стенки сосуда, вызвавшего образование тромба у мышей. Для оценки скопления ПМЯН использовали меченые фикоэритрином антитело к Ly6G. Представлена медиана интегрированной по времени флуоресценции (А) и соответствующие значения площади под кривой (В) для 26 (контрольная группа) или 27 (Ir-CPI) тромбов, образовавшихся у 8 мышей (n=4 мыши в каждой групппе). усл. ед.: условные единицы. При статистическом анализе использовали критерий Манна-Уитни (***р<0.001).
Фигура 7 - График, показывающий детекцию in vivo активности эластазы нейтрофилов после образования тромба, вызванного повреждением стенки сосуда. Для оценки активности эластазы нейтрофилов в качестве флуоресцентно меченого субстрата эластазы использовали фрагмент конъюгата DQ-эластин, меченного BODIPY-FL. Представлена медиана интегрированной по времени флуоресценции для 31 (контрольная группа) и 23 (Ir-CPI) тромбов, образовавшихся у 7 мышей (n=3 для контрольных мышей и n=4 для мышей, обработанных Ir-CPI). усл. ед.: условные единицы.
Фигура 8 - График, показывающий объем опухоли после имплантации мышам клеток, принадлежащих к мышиной линии Panc02. До эксперимента с лазерным изучением, вызывавшим повреждение сосудистой стенки, была выполнена оценка объема опухоли у мышей с эктопическими опухолями поджелудочной железы, индуцированными клетками Panc02. Черным цветом показаны мыши, которым проводилась контрольная обработка, т.е., NaCl (n=5), и серым цветом показаны мыши, которым проводилась обработка препаратом Ir-CPI (n=4). Показаны средние объемы опухоли ± СОС.
Фигура 9 - Серия графиков, показывающих in vivo детекцию тромбоцитов и образование фибрина после образования тромба, вызванного повреждением сосудистой стенки. Для детекции фибрина и тромбоцитов использовали антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488, и антитело к GPIb, меченое DyLight649. Представлена площадь под интегрированной по времени флуоресценцией тромбоцитов (А) или фибрина (В), рассчитанная для 41 тромба (обработка NaCl мышей дикого типа (ДТ), т.е. мышей без рака; n=3 мыши) или 40 (NaCl, с раком; n=6 mice) тромбов у мышей без тромбов. При статистическом анализе использовали критерий Манна-Уитни s (*р<0.05).
Фигура 10 - Серия графиков, показывающих in vivo детекцию фибрина (А) и тромбоцитов (В) после образования тромба, индуцированного повреждением сосудистой стенки у мышей с опухолями, которым вводили исследуемый препарат в дозе 20,5 мг/кг (болюс) + 3.7 мг/кг/ч (инфузия) (т.е. в высокой дозе). Для детекции фибрина и тромбоцитов использовали антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488, и антитело к GPIb, меченое DyLight649, соответственно. Представлена медиана интегрированной по времени флуоресценции (для длительного периода времени) для 44 тромбов (у получавших NaCl мышей без рака, что соответствует введению NaCl мышам без рака), для 34 тромбов (у получавших NaCl мышей с раком, что соответствует введению NaCl мышам с опухолями) и 39 тромбов (у получавших Ir-CPI мышей с раком, что соответствует введению Ir-CPI мышам с опухолями) у 14 мышей (n=5 для обработанных NaCl мышей без рака, n=5 для обработанных NaCl мышей с раком, и n=4 для обработанных Ir-CPI мышей с раком). Отрезок соответствует 10 мкМ.
Фигура 11 - График, показывающий детекцию in vivo интегрированной интенсивности флуоресценции тромбоцитов (площадь под кривой), отражающей данные 44 тромбов (у мышей без рака, обработанных NaCl), 34 тромбов (у мышей с раком, обработанных NaCl) и 39 тромбов (у мышей с раком, обработанных Ir-CPI), развившихся у 14 мышей, которых обрабатывали Ir-CPI в высокой дозе (n=5 для мышей без рака, обработанных NaCl; и n=4 для мышей с раком, обработанных Ir-CPI. Для детекции тромбоцитов использовали антитело к GPIb, меченое DyLight649. При статистическом анализе использовали критерий Манна-Уитни (*р<0.05; ***р<0.001).
Фигура 12 - - Серия графиков, показывающих in vivo детекцию фибрина (А) и тромбоцитов (В) после вызванного повреждением сосудистой стенки образования тромба у мышей с опухолями, которых обрабатывали препаратом Ir-CPI по схеме: 10.3 мг/кг (болюс) + 1.9 мг/кг/ч (инфузия) (т.е. в низкой дозе). Для детекции фибрина и тромбоцитов использовали антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488, и антитело к GPIb, меченое DyLight649, соответственно. Представлена медиана интегрированной по времени флуоресценции, рассчитанная для 41 тромба (у мышей без рака, обработанных NaCl, что соответствует введению NaCl мышам без рака), 40 тромбов (обработка NaCl мышей с раком, что соответствует введению NaCl мышам с опухолями), и 40 тромбов (у мышей с раком, обработанных Ir-CPI, соответствует введению Ir-CPI мышам с опухолью), возникшими у 14 мышей (n=3 для мышей без рака, получавших NaCl, n=6 для мышей с раком, получавших NaCl, n=5 в группе мышей с раком, получавших Ir-CPI). усл. ед.: условные единицы.
Фигура 13 - График, показывающий интегрированную интенсивность флуоресценции тромбоцитов (площадь под кривой) для 41 тромба (у мышей без рака, обработанных NaCl), 40 тромбов (у мышей с раком, обработанных NaCl) и 40 тромбов (у мышей с раком, обработанных Ir-CPI), которые развились у 14 мышей (n=3 для мышей без рака, обработанных NaCl, n=6 для мышей с раком, обработанных NaCl; и n=5 для мышей с раком, обработанных Ir-CPI). Мыши с раком, обработанные Ir-CPI, получали Ir-CPI в дозе 10.3 мг/кг (болюс) + 1.9 мг/кг/ч (инфузия) (т.е. низкую дозу Ir-CPI). Для детекции тромбоцитов использовали антитело к GPIb, меченое DyLight649. При статистическом анализе использовали критерий Манна-Уитни (*р<0.05; ***р<0.001).
Фигура 14 - График, показывающий время кровотечения (в секундах) у мышей дикого типа, обработанных NaCl (т.е. мышей без рака), мышей дикого типа, обработанных Ir-CPI, т.е. мышей без рака (высокая и низкая дозы) и мышей с раком, обработанных NaCl, мышей с раком, обработанных Ir-CPI (высокая и низкая доза). При статистическом анализе использовали односторонний метод ANOVA (***р<0.001). Во всех экспериментальные группы включали по 7 мышей, кроме группы мышей с диким генотипом, обработанных NaCl, которая включала 8 мышей.
Фигура 15 - График, на котором сравнивается нетоз, наблюдавшийся в разных экспериментальных условиях in vitro (необработанный контроль, примирование фактором некроза опухоли (ФНОα), с или без активации фактором активации тромбоцитов (ФАТ), и/или инкубация в присутствии Ir-CPI в соотетствии с показаниями). Процент нетоза (медиана) был рассчитан после анализа результатов иммунофлуоресцентного окрашивания и длины НВЛ (n=5 независимых экспериментов; для каждого исследования, были проанализированы 5 рандомных полей для каждого состояния). При проведении статистического анализа использовали критерий Вилкоксона (нз: статистически незначимо; *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001).
Фигура 16 - График, на котором сравнивается экспрессия CD11b на поверхности нейтрофилов в различных экспериментальных условиях (необработанный контроль; примирование ФНОα и/или инкубация в присутствии Ir-CPI, в зависимости от указаний). Представлены средние значения ± СОО (n=3, независимые эксперименты). При проведении статистического анализа использовали метод ANOVA и далее критерий множественного сравнения Тьюки (нз: статистически незначимо; *р<0.05).
Фигура 17 - График, на котором сравнивается экспрессия Ly6G (А), CD11b (В) и активированного CD11b (С) на поверхности нейтрофилов при разных экспериментальных условиях (контроль, активированный АТФ; нейтрофилы инкубировали с Ir-CPI [0.65 или 2 мкМ] и активировали в присутствии АТФ). Показаны следующие данные: среднее ± СКО (n=2 независимых эксперимента).
Примеры.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.
Пример 1: Модель активации внешнего пути свертывания крови
Материал
Исследуемое вещество
Полипептид Ir-CPI (м.в. 660 Да) был приобретен в компании Bachem (порошок, серия 1060411, степень чистоты: 98.4%) и хранился до использования при -80°С.
В эксперименте использовали свежеприготовленный раствор Ir-CPI с концентрацией 50 мг/мл (максимальная концентрация, которую можно достичь без проблем с растворимостью), полученный при растворении в 0,9% растворе NaCl.
В качестве контроля использовали 0,9% р-р NaCl.
Животные
В данном исследовании использовали самцов мыши (линия C57BL/6JRj), приобретенных в компании Janvier LABS (в возрасте 5-8 недель).
Методы
Введение препарата
Препарат Ir-CPI вводили внутривенно в форме болюса (20.5 мг/кг), после чего сразу же проводилась непрерывная инфузия со скоростью 3.7 мг/кг/ч (Табл. 1). Учитывая быстрое распределение и выведение полипептида Ir-CPI у мышей (t1/2α=14 мин и t1/2β=236 мин), для того чтобы поддерживать постоянную концентрацию Ir-CPI в крови было выбрано сочетание болюсного и инфузионного введения.
n = количество использованных мышей.
Прижизненная микроскопия микроциркуляции в мышце, поднимающей яичко
Прижизненная видеомикроскопия микроциркуляции в мышце, поднимающей яичко, проводилась, как описано ранее (Falati et al., 2002).
Мышей наркотизировали посредством внутрибрюшинной инъекции кетамина (в дозе 125 мг/кг), ксилазина (12.5 мг/кг) и атропина (0.25 мг/кг) и помещали на одеяло для грызунов с контролируемой температурой 37°С.
Для обеспечения дыхания в трахею вводили трахеальную трубку. В яремную вену вводили канюлю, предназначенную для введения через нее пентобарбитала. Каждые 20-30 минут в яремную вену вводили пентобарбитал (12 мг/кг), чтобы мыши находились под наркозом в течение всего эксперимента. Через эту же канюлю, установленную в яремную вену, вводили антитела и субстрат для ферментов, связанный с флуорохромом, чтобы отслеживать формирование тромба (детекция фибрина, и/или тромбоцитов, и/или нейтрофилов, и/или активности эластазы нейтрофилов). Во вторую контралатеральную яремную вену тоже вводили канюлю для введения носителя или исследуемого препарата (Ir-CPI или NaCl).
После разреза мошонки из нее выводили яичко и окружающую его мышцу, поднимающую яичко, и помещали их на подложку для прижизненной микроскопии. На протяжении всего эксперимента проводилась непрерывная перфузия мышцы, поднимающей яичко, аэрируемым (95% N2, 5% СО2) солевым раствором, забуференным бикарбонатом, который поддерживали при температуре 37°С.
Для получения данных о состоянии микрососудов использовали микроскоп Olympus AX61WI с водно-имммерсионным объективом с численной аппертурой 60×0.9. Система цифровой широкопольной флуоресцентной микроскопии была описана ранее (Falati et al., 2002). Цифровые изображения были получены с помощью камеры с зарядовой связью Cooke Sensicam CCD в формате 640×480.
Повреждения, вызываемые лазерным излучением
Для повреждения стенки сосудов использовали лазерную систему Micropoint Laser System (Photonics Instruments), сфокусированную через объектив микроскопа, парфокальный с фокусной плоскостью и направленный на стенку сосуда, как описано ранее (Dubois et al., 2006). Как правило, чтобы вызвать повреждение стенки сосуда требовались 1 или 2 импульса.
У каждой мыши были изучены многочисленные тромбы, новые тромбы образовывались выше ранее образовавшегося тромба, новый тромб формировали выше образовавшегося ранее тромба, чтобы не допустить вклада ранее образованных тромбов у изучаемого животного. Повреждения, вызываемые лазерным излучением, наносили через разное время после начала введения исследуемого препарата (от +5 мин до приблизительно 150 мин после введения болюсной дозы полипептида of Ir-CPI или NaCl (контроль)).
Для анализа изображений использовали программное обеспечение Slidebook 4.1 (Intelligent Imaging Innovations). Данные флуоресценции регистрировали в цифровой форме до 50 кадров в секунду и анализировали, как описано ранее (Falati et al., 2002). Для анализа тромбообразования определяли изменение медианы значений флуоресценции в течение времени не менее чем для 20 тромбов.
После завершения эксперимента мышей умерщвляли сверхдозой пентобарбитала (120 мг/кг).
Детекция фибрина, тромбоцитов, ПМЯН и активности эластазы нейтрофилов in vivo
Для in vivo детекции фибрина использовали антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488, приобретенное у Darbousset et al., 2014, которое вводили каждой мыши внутривенно в дозе 0.5 мкг/г.
Для vivo детекции тромбоцитов использовали меченое DyLight649 антитело к GPIb, приобретенное у Emfret, которое вводили каждой мыши внутривенно в дозе 0,5 мг/кг.
Для детекции ПМЯН in vivo использовали меченое фикоэритрином антитело к Ly6G.
Для детекции активности эластазы нейтрофилов in vivo использовали фрагмент конъюгата DQ-эластин, меченного BODIPY-FL, который приобретали в компании Life Technologies и вводили внутривенно в дозе 0.3 мкг/г массы тела мыши.
Получение образцов и подготовка плазмы
В конце эксперимента (приблизительно через 150 мин после введения болюса) из нижней полой вены получали кровь, которую вносили в пробирки, содержащие 0,109 М 3,2% цитрата натрия (цитрат/кровь, отношение объемов 1/9). Плазму (около 250 мкл) центрифугировали при температуре 18-22°С при 2500 g в течение 15 мин. Плазму повторно центрифугировали (18-22°С при 2500 g в течение 15 мин) и хранили в полипропиленовой пробирке при -80°С. Позднее образцы плазмы направляли в замороженном виде в сухом льде для определения концентраций циркулирующего полипептида Ir-CPI методом твердофазного ИФА (ELISA).
Количественное определение полипептида Ir-CPI в образцах плазмы
Количественное определение циркулирующего полипептида Ir-CPI в образцах плазмы методом твердофазного ИФА (ELISA) выполняла компания Eurofins, ADME Bioanalyses (Вержез, Франция). При проведении иммуноанализа сэндвич-методом использовали два антитела к Ir-CPI. Лунки микропланшетов для титрования (Nunc, ThermoFischer Scientific, США) покрывали суспензией иммобилизованного моноклонального антитела (Ir-CPI3) в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ; PBS) (Nunc, ThermoFischer Scientific, США) в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С PBS (Hyclone, США). Лунки блокировали 2% БСА 2% (Sigma-Aldrich, США) в ФСБ при комнатной температуре (КТ) в течение 1 ч и затем лунки промывали. В лунки вносили образцы и инкубировали планшеты в течение 2 ч при КТ. В лунки вносили биотинилированное детекторное антитело (L39-биотин), разведенное 1% БСА (Sigma-Aldrich, США) в ФСБ, и добавляли комплемент стрептамидин-пероксидаза хрена (REF), разведенный в 1% БСА в ФСБ. Для спектрофотометрической детекции при длине волны 450 нм использовали тетраметилбензидиновый (ТМБ) субстрат ТМВ SureBlue (KPL, REF) и 1Н H2SO4 (VWR, США)/
Обработка данных и статистический анализ
Представлены медиана и межквартильный размах, рассчитанные с учетом размера выборки (n). При статистическом сравнении данных, полученных в группах мышей, обработанных полипептидом Ir-CPI, и в контрольной группе, использовали критерий Манна-Уитни (***р<0.001).
Результаты
Цель настоящего исследования заключалась в том, чтобы оценить антитромботическую эффективность полипептида Ir-CPI в экспериметальной модели тромбоза у мыши, в которой тромбоз был вызван локальным повреждением артериолы мышцы, поднимающей яичко, лазерным лучом. Эта экспериментальная модель тромбоза предположительно задействована в активации внешнего пути свертывания крови, приводящего к опосредованному Тканевым фактором образованию тромбина (Dubois et al., 2007; Darbousset et al., 2012). В действительности, согласно опубликованным сообщениям, в такой модели у мышей с низким содержанием Тканевого фактора (ТФ) резко снижена кинетика образования тромбина и образования фибрина, тогда как отсутствие фактора свертывания крови XII (мыши FXII-/-) не оказывает никакого влияния (Darbousset et al., 2012). Таким образом, модель вызванного лазерным излучением повреждения стенки сосуда позволяет оценить ингибирующее воздействие полипептида Ir-CPI на тромбоз, который развивается при участии внешнего пути свертывания крови.
Мониторинг скопления тромбоцитов и фибрина после повреждения лазерным излучением у контрольных и обработанных Ir-CPI мышей (короткий период измерения)
Для мониторинга скопления тромбоцитов и образования фибрина на поврежденных стенках сосудов использовали следующие флуоресцентно меченные антител: меченое DyLight649 антитело к GPIb и антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488, соответственно.
У контрольных мышей тромбоциты быстро скапливались на поврежденном участке, максимальное скопление наблюдалось приблизительно в момент времени Т114 сек (медиана интегрированной флуоресценции тромбоцитов: 508541 усл. ед.), после чего скопление уменьшалось до конца периода измерения - Т228 сек (медиана интегрированной флуоресценции тромбоцитов: 209893 усл. ед.). Образование фибрина на поврежденном участке непрерывно возрастало до конца периода измерения, и медиана интегрированной флуоресценции фибрина в момент времени Т228 сек составила 16686 усл. ед. (Фиг. 1 и Фиг, 2).
У мышей, обработанных полипептидом Ir-CPI, кинетика скопления тромбоцитов отличалась от наблюдавшейся у контрольных мышей. Скопление тромбоцитов было резко снижено по сравнению с контрольными мышами. Максимальная измеренная медиана интегрированной флуоресценции тромбоцитов составила 121783 усл. ед. и наблюдалась при Т214 сек. При 228 сек (т.е., в конце периода измерения), медиана интегрированной флуоресценции тромбоцитов составила 101887 усл. ед. Кроме того, в первые 3,8 мин после повреждения лазерным излучением образование фибрина у мышей, обработанных Ir-CPI, по-видимому, было менее важным, чем у контрольных мышей. В момент времени Т228 сек максимальная медиана интегрированной флуоресценции фибрина составила 7539.7 усл. ед. (Фиг. 1 и Фиг. 2).
Измеренная средняя концентрация в плазме мышей, обработанных Ir-CPI, приблизительно через 150 мин после процедуры составила 6.48±1.02 мкг/мл (среднее ± СОС; n=5).
Кинетика образования фибрина после повреждения лазерным излучением у контрольных и обработанных Ir-CPI мышей (длительный период измерения)
Кинетику образования фибрина у обработанных Ir-CPI и контрольных мышей измеряли в течение 90 мин после повреждения стенки сосуда лазерным излучением. В каждой временной точке (0, 15, 30, 45, 75 и 90 мин), в которой проводились измерения, медиана интегрированной интенсивности флуоресценции фибрина у мышей, обработанных Ir-CPI, была ниже, чем у контрольных мышей (Фиг. 3 и Фиг. 4).
Влияние Ir-CPI на скопление нейтрофилов
Продемонстрировано, что после повреждения лазерным излучением первыми клетками, которые скапливаются у стенки сосуда, являются полиморфоядерные нейтрофилы (ПМЯН). Взаимодействие ПМЯН с активированными эндотелиальными клетками требуется для инициации образования тромба (Darbousset et al., 2012).
Для того чтобы определить, оказывает ли полипептид Ir-CPI влияние на скопление ПМЯН на поврежденном участке, был проведен мониторинг процесса скопления ПМЯН на поврежденной стенке сосуда при использовании антитела к Ly6G, флуоресцентно меченой фикоэритрином (Фиг. 5).
У контрольных мышей наблюдали быстрое скопление ПМЯН на поврежденном участке, достигавшее максимального уровня через Т 42 сек (медиана интегрированной флуоресценции тромбоцитов: 1.60×107 усл. ед.). В момент времени Т270 сек медиана интегрированной флуоресценции ПМЯН составила 1.10×107 усл. ед. (Фиг. 6).
У мышей, обработанных полипептидом Ir-CPI, кинетика скопления нейтрофилов отличалась от наблюдаемой у контрольных мышей. В действительности, в первые 4.5 мин после повреждения лазерным излучением скопление ПМЯН было резко снижено по сравнению с контрольными мышами. Максимальная измеренная медиана интегрированной флуоресценции тромбоцитов составила 3.02×106 усл. ед. при Т 261 сек. В момент времени Т270 сек (т.е., в конце периода измерения), медиана интегрированной флуоресценции ПМЯН составила 2.78×106 усл. ед. (Фиг. 6). Аналогичные результаты были получены при использовании флуоресцентно меченного субстрата эластазы в качестве маркера активности ПМЯН. У мышей, обработанных Ir-CPI, был резко снижен сигнал, соответствующий активности эластазы нейтрофилов, по сравнению с контрольными мышами (Фиг. 7).
Заключение
Эти результаты в совокупности демонстрируют, что полипептид Ir-CPI обладает неожиданной активностью в экспериментальной модели, в которой задействована активация внешнего пути свертывания крови. Эти результаты свидетельствуют о том, что Ir-CPI вызывает антитромботические эффекты, не всегда ассоциированные с известными мишенями (т.е. факторами свертывания крови XIa и XIIa). Неожиданным оказалось, что на поврежденном участке Ir-CPI ингибирует не только образование фибрина, но также скопление тромбоцитов и даже появление на более ранней стадии ПМЯН, которые, как известно, важны для активации внешней системы свертывания крови, поскольку являются основным источником ТФ, который требуется для образования тромба на участке, поврежденном лазерным излучением (Darbousset, Thomas et al. 2012).
Пример 2. Анализ in vitro агрегации тромбоцитов
Кровь здоровых доноров-людей, не получавших антитромбоцитарные препараты в течение 15 дней, предшествовавших сбору крови, собирали в пробирки с цитратом и центрифугировали в течение 13 мин при 200g. Собирали обогащенную тромбоцитами плазму и центрифугировали ее в течение 13 мин при 900g в буфере Тироде (138 мМ NaCl, 2.9 мМ KCl, 12 мМ NaHCO3, 5.5 мМ глюкозы, 1.8 мМ CaCl2 и 0.4 мМ MgCl2, рН 7.4), содержащем 0,2% БСА, апиразу 0,02 Ед./мл и 500 мМ простациклина. Отмытые тромбоциты ресуспендировали в растворе Тироде/0,2% БСА/апиразы/простациклина и центрифугировали при 900g в течение 13 мин. Тромбоциты ресуспендировали в растворе Тироде/0,2% БСА при концентрации 3.108 тромбоцитов/мл. Тромбоциты поддерживали в течение 30 мин при 37°С в растворе, содержащем 4 мкМ кальция и 5 мкМ магния. Затем тромбоциты инкубировали при 37°С при перемешивании в течение 5-10 минут в агрегометре APACT 4004 в присутствии АДФ (аденозиндифосфата), TRAP (пептида, активирующего тромбиновые рецепторы) и/или Ir-CPI.
Результаты
Влияние Ir-CPI на агрегацию тромбоцитов оценивали in vitro, используя изолированные отмытые тромбоциты человека (n=1).
Вначале отмытые тромбоциты инкубировали в присутствии АДФ (аденозиндифосфата), активатора тромбоцитов, не вызывающего агрегацию тромбоцитов, или TRAP (пептида, активирующего тромбиновые рецепторы), активатора агрегации тромбоцитов. Как и ожидалось, и как показано в Табл. 2, АДФ не вызывал агрегации тромбоцитов (максимальная агрегация: 6.9%), тогда как TRAP активировал агрегацию тромбоцитов (максимальная агрегация: 58.6-59.5%).
Добавление Ir-CPI к отмытым тромбоцитам не приводило к активации агрегации тромбоцитов (макс.Агрегация: 4.1%). Добавление Ir-CPI и TRAP к отмытым тромбоцитам не сопровождалось значимой модификацией агрегации тромбоцитов (макс.агрегация: 71.7%) по сравнению с условиями, являвшимися положительным контролем (TRAP отдельно: макс.агрегация: 58.6-59.5%). Сходный эффект, но с более длительным латентным периодом (231.2 сек) достигался в случае добавления TRAP к Ir-CPI (макс.агрегация: 73.5%) (Табл. 2).
Результаты Примера 1 показали, что Ir-CPI ингибирует скопление тромбоцитов in vivo. Однако Ir-CPI не ингибирует агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro теста на агрегацию тромбоцитов. Эти данные в совокупности свидетельствуют о том, что действие Ir-CPI может быть направлено, не на тромбоциты, а на другую мишень, задействованную в тромбообразовании.
Известно, что в модели вызванного лазерным излучением повреждения сосуда в течение нескольких секунд после появления поражения происходит предшествующая скоплению тромбоцитов адгезия полиморфоядерных нейтрофилов (ПМЯН) на поврежденных сосудах посредством связывания ПМЯН с активированным эндотелием. ПМЯН, связывающиеся со стенкой сосуда, являются основным источником переносимого кровью ТФ на ранней стадии образования тромба (Darbousset et al., 2012). Взаимодействие ПМЯН с эндотелиальными клетками является критическим этапом, предшествующим скоплению тромбоцитов с целью инициации тромбоза.
Результаты Примера 1 показывают, что полипептид Ir-CPI снижал рекрутинг ПМЯН к поврежденной стенке сосуда. Также на фоне обработки полипептидом Ir-CPI снижалась активность эластазы нейтрофилов. Однако такое снижение активности эластазы могло быть вызвано уменьшением численности нейтрофилов, рекрутированных на поврежденный участок.
Пример 3. Модель рак-ассоциированного тромбоза
Материал
Исследуемое вещество
Полипептид Ir-CPI (м.в.=7660 Да), приобретенный в компании Bachem (порошок, серия 1060411, степень чистоты: 98.4%) хранили до использования при -80°С.
В эксперименте использовали свежеприготовленный раствор Ir-CPI с концентрацией 50 мг/мл (максимальная концентрация, которую можно достичь без проблем с растворимостью), полученный при растворении в 0,9% растворе NaCl.
В качестве контроля использовали 0,9% NaCl.
Животные
В этом исследовании использовали 5-недельных самцов мыши (линия C57BL/6JRj), приобретенных в лаборатории Janvier LABS. Методы Введение
Полипептид Ir-CPI вводили, как описано выше (см. Пример 1) и кратко описано ниже в Табл. 3.
n=количество использованных мышей; ДТ (дикий тип), т.е. мыши без рака.
Индукция эктопической опухоли
Клетки Panc02 (клеточная лини аденокарциномы протоков поджелудочной железы мыши) выращивали до 80% конфлюэнтности в среде RPMI-1640 (Life Technologies) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки ФТС (РАА), пенициллина 1000 Е/мл (Life Technologies), стрептомицина в концентрации 100 мкг/мл (Life Technologies) и 0.1% фунгозина (Life Technologies) при температуре 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2. После достижения экспоненциальной фазы роста клетки 3-кратно отмывали ФСБ и на короткий период подвергали воздействию неферментативного буфера для диссоциации клеток (Life Technologies), чтобы отделить клетки друг от друга. Клетки осторожно трехкратно отмывали, ресуспендировали в ФСБ и разбавляли до желаемой концентрации.
Пятинедельным мышам линии C57BL/6 вводили суспензию опухолевых клеток, выполняя подкожную инъекцию в правый бок (106 клеток в 100 мкл ФСБ). Когда опухоль становилась пальпируемой (0.2 см), определяли ее размер в двух измерениях с помощью кронциркуля, и рассчитывали объем каждой опухоли по формуле объема эллипсоида: π/6× a(b)2, где а - больший диаметр, и b - меньший диаметр опухоли.
Прижизненная микроскопия микроциркуляции в мышце, поднимающей яичко
Прижизненная видеомикроскопия микроциркуляции в мышце, поднимающей яичко, проводилась, как описано ранее (Falati et al., 2002), и как описано выше (см. Пример 1).
Повреждения, вызываемые лазерным излучением
Для повреждения стенки сосудов использовали лазерную систему Micropoint Laser System (Photonics Instruments), как описано выше (см. Пример 1).
Мониторинг и детекцию скопления тромбоцитов и фибрина выполняли, как описано выше (см. Пример 1).
Оценка времени кровотечения при надрезе хвоста
Оценку времени кровотечения при надрезе хвоста в условия обработки NaCl или Ir-CPI (в высокой или низкой дозе) выполняли, как описано выше (Mezouar et al., 2015) у наркотизированных мышей дикого типа (т.е. без рака) или мышей с раковыми опухолями. Отрезали часть мышиного хвоста длиной 1-3 мм, хвост погружали в изотонический солевой раствор (37°С), и записывали время до полной остановки кровотечения. Мониторинг времени кровотечения продолжали не более 10 мин.
Обработка данных и статистический анализ
Для оценки объема опухоли данные выражали, как среднее ±СОС для соответствующего размера выборки (n). Для оценки влияния Ir-CPI на скопление тромбоцитов и образование фибрина у мышей с опухолями представляли медиану интегрированной по времени флуоресценции. При проведении статистического анализа использовали критерий Манна-Уитни, и при оценке времени кровотечения - односторонний анализ ANOVA и критерий множественного сравнения Тьюки.
Результаты
В этой же модели индукции тромбоза оценивали антитромботический эффект полипептида Ir-CPI у мышей с раком поджелудочной железы (эктопическая модель). В действительности, продемонстрировано, что в клетках рака поджелудочной железы образуются микрочастицы (МЧ), содержащее тканевый фактор (ТФ), который играет основную роль в тромбообразовании in vivo (Thomas et al., 2009; Mezouar et al., 2015). В этой модели были протестированы две дозы (высокая доза и низкая доза) полипептида Ir-CPI.
В другом эксперименте оценивали время до остановки кровотечения при надрезе хвоста в условиях обработки NaCl (контроль) или Ir-CPI (в низкой и высокой дозе) мышей дикого типа (без рака) и мышей с раковыми опухолями.
Эксперименты для оценки объема опухоли до повреждения лазерным излучением
В использованной в эксперименте мышиной модели рак индуцировали подкожной инъекцией клеток мышиного рака поджелудочной железы (Panc02). Мышей с раковыми опухолями рандомно делили на две группы (контроль и Ir-CPI). Через 22 дня после имплантации клеток Panc02 мышам из обеих групп выполняли инъекцию носителя (NaCl (контроль)) или исследуемого препарата (Ir-CPI) и наносили повреждение лазерным излучением, чтобы индуцировать тромб в капиллярах мышцы, поднимающей яичко. Как показано на Фиг. 8, в День 22 средние размеры опухоли в двух группах статистически значимо не различались (контроль: 372.6±45.3 мм3; n=5 и Ir-CPI: 365.0±52.1 мм3; n=4). Мышей из последней группы использовали в эксперименте с обработкой полипептидом Ir-CPI в высокой дозе. У мышей, распределенных для обработки полипептидом Ir-CPI в низкой дозе, средний объем опухоли тоже статистически значимо не отличался от объема опухоли в других группах (данные не показаны).
Мониторинг скопления тромбоцитов и фибрина после повреждения лазером
Мышей с опухолями распределяли в группу, предназначенную для обработки полипептидом Ir-CPI (Ir-CPI, рак), или в контрольную группу (NaCl, рак). Кроме того, мышей без опухолей обрабатывали NaCl (NaCl, без рака) и использовали в качестве отрицательного контроля. Всех мышей подвергали воздействию лазерного излучения, чтобы образовавшиеся повреждения артериол в мышце, поднимающей яичко, инициировали тромбоз. Мыши, которых обрабатывали полипептидом Ir-CPI, получали низкую или высокую дозу этого исследуемого препарата.
Для мониторинга скопления тромбоцитов и образования фибрина на поврежденных стенках сосудов использовали следующие флуоресцентно меченные антитела: меченое DyLight649 антитело к GPIb и антитело к фибрину, конъюгированное с красителем Alexa Fluor 488, соответственно.
У мышей с раком, обработанных NaCl наблюдали протромботическое состояние, на которое указывал высокий уровень скопления тромбоцитов и образовавшийся в большом количестве фибрин на поврежденных участках, по сравнению с мышами без рака, обработанными NaCl. В действительности интегрированная интенсивность флуоресценции метки, связанной с тромбоцитами и фибрином (площадь под кривой), у контрольных мышей с раком была значимо выше, чем у контрольных мышей ДТ (*р<0.05). У контрольных мышей с раком и контрольных мышей ДТ медиана интегрированной флуоресценции фибрина в момент времени T 278 сек составила 59172 усл. ед. и 23005 усл. ед., соответственно (Фиг. 9 и Фиг. 10).
У мышей с раком, обработанных полипептидом Ir-CPI в высокой и низкой дозе уровни скопления тромбоцитов и образования фибрина были значимо ниже, чем у мышей с раком, обработанных NaCl. Как показано на Фиг. 11, интегрированная по времени интенсивность флуоресценции меченых тромбоцитов (площадь под кривой) у мышей с раком, получивших высокую дозу Ir-CPI, была значимо ниже, чем у мышей без рака, получивших NaCl (*р<0.05) и мышей с раком, получивших NaCl (***р<0.001). Аналогичные результаты были получены в экспериментах с мышами, получившими низкую дозу Ir-CPI (Фиг. 12 и Фиг. 13).
Оценка времени кровотечения при надрезе хвоста
У мышей с развившимися опухолями время кровотечения при надрезе хвоста было значимо короче (***р<0.001) (например, у обработанных NaCl мышей, получивших раковые клетки Panc02, медиана времени кровотечения составила 75 сек) по сравнению с мышами без опухолей (например, медиана времени кровотечения у мышей дикого типа (т.е. без рака), обработанных NaCl составила 147 сек) (Фиг. 14). Обработка полипептидом Ir-CPI в высокой или низкой дозе не оказывала значимого влияния на время кровотечения при надрезе хвоста, измеренное у мышей без рака и мышей с раком, по сравнению с мышами, обработанными (Фиг. 14).
Заключение
Патогенез протромботического состояния при раке ассоциирован с развитием локального и системного гиперкоагуляционного/тромботического состояния, которое обеспечивает преимущественный рост опухолевых клеток. Продемонстрировано, что клетки рака поджелудочной железы образуют содержащие тканевый фактор (ТФ) микрочастицы (МЧ), которые играют ключевую роль в тромбообразовании in vivo (Thomas et al., 2009; Mezouar et al., 2015). У мышей с раком ПМЯН повышали предрасположенность к образованию нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) - паутинных структур, образованных экстернализованным хроматином и секретируемыми протеазами; этот процесс называется нетозом (Leal et al., 2017). Кроме того, показано, что внеклеточный хроматин, высвобождающийся при образовании НВЛ, является причиной рак-ассоциированного тромбоза (Demers et al., 2012; Mauracher et al., 2018).
Результаты, полученные в Примере 3, показывают, что в мышиной модели повреждений, вызванных лазерным излучением, Ir-CPI ингибирует протромботическое состояние, связанное с раком. В действительности, у мышей с эктопическими опухолями поджелудочной железы Ir-CPI уменьшает уровень скопления тромбоцитов и образования фибрина на участках, поврежденных лазерным излучением. Важно, что у мышей без рака и мышей с раком полипептид Ir-CPI не изменяет время кровотечения при надрезе хвоста, из чего следует, что Ir-CPI не нарушает гемостаз.
Пример 4. Анализ нетоза
Материал
Нейтрофилы были выделены из костного мозга бедренной кости мышей (C57BL/6), как описано ранее (Hu 2012), при использовании связанных с FR-1 магнитных микрогранул (набор микрогранул с антителами к Ly6G; anti-Ly6G Microbead Kit, Miltenyi Biotec).
Методы
In vitro анализ нетоза
Клетки собирали, центрифугировали и инкубировали в течение 30 минут с добавлением или без добавления ФНОα, содержащегося в концентрации 2 нг/мл в растворе Хэнкса (Gibco). Нейтрофилы наносили на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином, и инкубировали при 37°С в течение 1 ч в растворе Хэнкса. Затем нейтрофилы активировали в присутствии или отсутствии 25 мкМ фактора, активирующего тромбоциты (ФАТ±Ir-CPI (0.65 или 2 мкМ) в растворе Хэнкса (3 ч при 37°С). Для оценки образования ВНЛ использовали метод иммунофлуоресценции (флуоресцентный микроскоп Leica) после фиксирования нейтрофилов 4% ПФА (параформальдегидом) и флуоресцентного мечения цитруллинированных гистонов (антитело Н3) и ядер (Hoechst). Для обработки и анализа изображений использовали программное обеспечение FIJI.
Обработка данных и статистический анализ
Представлен выраженный в процентах нетоз (медиана), рассчитанная для 5 независимых экспериментов. При проведении статистического анализа использовали критерий Вилкоксона (нз: незначимо; *p<0.05; **p<0.01; ***р<0.001).
Результаты
После получения результатов, описанных в Примере 3, проводилась in vitro оценка влияния полипептида Ir-CPI на состояние активации ПМЯН посредством оценки образования НВЛ. В действительности, известно, что у мышей с раком ПМЯН повышают предрасположенность к образованию нейтрофильных кнеклеточных ловушек (НВЛ), являющихся причиной рак-ассоциированного тромбоза (Demers, Krause et al. 2012, Mauracher, Posch et al. 2018).
Влияние Ir-CPI на нетоз in vitro
Согласно имеющимся сообщениям, у мышей с раком ПМЯН повышают предрасположенность к образованию нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ), т.е. паутинных структур, образованных экстернализованным хроматином и секретируемыми протеазами; этот процесс называется нетозом (Leal et al., 2017). Кроме того, показано, что внеклеточный хроматин, высвобождающийся при образовании НВЛ, является причиной рак-ассоциированного тромбоза (Demers et al., 2012; Mauracher et al., 2018).
Для того чтобы оценить влияние Ir-CPI на нетоз, выполняли иммунофлуоресцентное окрашивание (Hoechst для мечения ДНК и H3Cit для мечения цитруллинированных гистонов) ПМЯН, выделенных из костного мозга бедренной кости мыши, с последующим изучением в различных условиях эксперимента in vitro (необработанный контроль, примирование фактором некроза опухоли α при наличии или в отсутствии активации фактором активации тромбоцитов, и/или инкубация в присутствии Ir-CPI) как показано на Фиг. 15.
В качестве положительного контроля образования НВЛ использовали примирование ПМЯН фактором некроза опухоли α и активацию этих клеток фактором активации тромбоцитов. Такие ПМЯН обеспечивали повышенный процент нетоза по сравнению с необработанными ПМЯН (***p<0.001), тем самым была выполнена валидация модели (Фиг. 15).
Как показано на Фиг. 15, в случае примирования ПМЯН фактором некроза опухоли α, активации их ФАП и инкубации в присутствии Ir-CPI (0.65 и 2 мкМ) выраженное в процентах образования НВЛ было значимо ниже, чем в случае инкубации ПМЯН в присутствии ФНО α и ФАП (*p<0.05 для Ir-CPI при концентрации 0.65 мкМ и ***p<0.001 для Ir-CPI в концентрации 2 мкМ).
Эти результаты демонстрируют, что уровень нетоза снижается, если активированные нейтрофилы инкубируют in vitro в присутствии Ir-CPI.
Пример 5. Влияние полипептида Ir-CPI на активацию нейтрофилов
Нейтрофилы были выделены из костного мозга бедренной кости мышей (C57BL/6), как описано ранее (Ни 2012), при использовании связанных с FR-1 магнитных микрогранул (набор микрогранул с антителами к Ly6G; anti-Ly6G Microbead Kit, Miltenyi Biotec). Для активации фактором некроза опухоли α клетки собирали, центрифугировали и инкубировали в течение 30 минут с добавлением или без добавления ФНОα, содержащегося в концентрации 2 нг/мл в растворе Хэнкса (Gibco). Затем нейтрофилы инкубировали в присутствии полипептида Ir-CPI (0.65 или 2 мкМ) в растворе Хэнкса (1 ч при 37°С). Для активации аденозинтрифосфатом клетки собирали, центрифугировали и инкубировали в присутствии 10 мкМ АТФ и Ir-CPI (0.65 или 2 мкМ) в растворе Хэнкса (1 ч при 37°С). После отмывания клеток выполняли оценку экспрессии CD11b, активированного CD11b или Ly6G методом проточной цитометрии (Beckman Coulter Gallios). При проведении анализов для идентификации и активации нейтрофилов использовали следующие антитела: IRR IgG1-FITC (нерелевантное антитело), антитело к CD45-APC, антитело к Ly6G-PE и антитело к CD11b-FITC и связанное с красителем Alexa Fluor 647 антитело к активированному CD11b-. Для анализа результатов использовали программное обеспечение Kaluza (Beckman Coulter).
Обработка данных и статистический анализ
Выраженная в процентах экспрессия маркеров активации представлена, как среднее ± СОС (n=3 независимых эксперимента по оценке ФНОα опосредованной активации, и n=2 независимых эксперимента по оценке АТФ-опосредованной активации). В экспериментах по оценке активации, вызванной ФНОα, статистический анализ включал использование одностороннего анализа ANOVA и далее критерия множественного сравнения Тьюки (нз: статистически незначимо; *р<0.05).
Результаты
После получения результатов, описанных в Примере 4, была выполнена оценка влияния Ir-CPI на состояние активации ПМЯН in vitro посредством оценки экспрессии маркеров активации нейтрофилов markers после инкубации с соединениями, способными активировать нейтрофилы, а именно, аденозинтрифосфатом (АТФ) и фактором некроза опухоли α (ФНОα).
Показано, что АТФ способствует активации нейтрофилов, приводящей к адгезии этих клеток на участках с поврежденным эндотелием вследствие воздействия лазерного излучения, и такая адгезия является необходимым этапом, приводящим к образованию фибрина и последующему тромбоцитозависимому образованию тромба (Darbousset, Delierneux et al. 2014). Кроме того, в данном примере был протестирован и другой активатор нейтрофилов - ФНОα (Futosi, Fodor et al. 2013).
Влияние Ir-CPI на активацию нейтрофилов после инкубации с ФНОα
Нейтрофилы, выделенные из костного мозга бедренной кости мыши, подвергали воздействию различных экспериментальных условий in vitro (необработанные нейтрофилы, являвшиеся контролем, либо примирование ФНОα, либо инкубация в присутствии Ir-CPI), чтобы оценить влияние Ir-CPI на статус активации нейтрофилов. Для оценки статуса активации был проведен анализ процента экспрессии CD11b на поверхности нейтрофилов (Фиг. 16).
Инкубация необработанных нейтрофилов в присутствии Ir-CPI (0.65 и 2 мкМ) не приводила к каким-либо изменениям экспрессии CD11b. В качестве положительного контроля активации нейтрофилов использовали ФНОα. Как показано на Фиг. 16, нейтрофилы, примированные ФНОα, демонстрировали повышенный уровень экспрессии CD11b по сравнению с необработанными нейтрофилами. Удивительным образом, нейтрофилы, примированные ФНОα и инкубированные в присутствии Ir-CPI (2 мкМ), продемонстрировали значимое снижение содержания CD11b, экспрессия которого происходит на клеточной поверхности нейтрофилов (*p<0.05).
Эти результаты демонстрируют, что Ir-CPI изменяет вызванную ФНОα активацию тромбоцитов посредством снижения экспрессии CD11b в условиях in vitro.
Влияние Ir-CPI на активацию нейтрофилов после инкубации с АТФ
Нейтрофилы, выделенные из костного мозга бедренной кости мыши, подвергали воздействию различных экспериментальных условий in vitro (необработанные нейтрофилы, являвшиеся контролем, либо инкубация в присутствии Ir-CPI, и в присутствии/отсутствии АТФ) в присутствии/отсутствии АТФ, чтобы оценить влияние Ir-CPI на статус активации нейтрофилов. Для оценки статуса активации был проведен анализ процента экспрессии CD11b, активированного CD11b и Ly6G на поверхности нейтрофилов (Фиг. 17).
Инкубация необработанных нейтрофилов в присутствии Ir-CPI (0.65 и 2 мкМ) не оказывала влияния на экспрессию CD11b (Фиг. 17 В). Тем не менее, Ir-CPI значимо снижал экспрессию активированных CD11b на поверхности нейтрофилов (Фигура 17С). Инкубация в присутствии Ir-CPI приводила также к снижению экспрессии Ly6G на поверхности нейтрофилов (Фиг. 17А).
Эти результаты демонстрируют, что in vitro Ir-CPI изменяет уровень АТФ-индуцированной активации нейтрофилов посредством сниженной экспрессии активированного CD11b.
Таким образом, Ir-CPI ингибирует образование тромба после активации внешнего пути свертывания крови не через ингибирование тканевых факторов, специфичных для данного пути, таких как Тканевый фактор, но через ингибирование рекрутинга и активации нейтрофилов и образования НВЛ. После повреждения эндотелия, вызванного лазерным излучением, эти события являются первыми шагами, приводящими к активации внешней системы свертывания крови и последующему образованию тромба.
Список литературы
Darbousset, R., et al. (2014). "Р2Х1 expressed on polymorphonuclear neutrophils и platelets is required for thrombosis in mice." (Для тромбоза у мышей требуется Р2Х1, экспрессируемый полиморфоядерными нейтрофилами и тромбоцитами) Blood. 124(16):2575-2585.
Darbousset, R., et al. (2012). "Tissue factor-positive neutrophils bind to injured endothelial wall и initiate thrombus formation." (Нейтрофилы, позитивные по тканевому фактору, связываются с поврежденной стенкой эндотелиальных клеток и инициируют тромбообразование) Blood. 120(10):2133-2143.
Decrem, Y., et al. (2009). "Ir-CPI, a coagulation contact phase inhibitor from the tick Ixodes ricinus, inhibits thrombus formation without impairing hemostasis." (Ir-CPI, ингибитор контактной фазы свертывания крови из клеща Ixodes Ricinus, ингибирует тромбообразование, не нарушая гемостаз) J Exp Med. 206(11):2381-2395.
Demers, M., et al. (2012). "Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute cancer-associated thrombosis." (Раковые опухоли являются предрасполагающим фактором для высвобождения нейтрофилами внеклеточных ловушек ДНК, которые способствуют развитию рак-ассоциированного тромбоза) Proc Natl Acad Sci USA. 109(32): 13076-13081.
Dubois, С., et al. (2007). "Thrombin-initiated platelet activation in vivo is vWF independent during thrombus formation in a laser injury model." (Инициированная тромбином активация тромбоцитов in vivo не зависит от vWF во время тромбообразования в модели повреждения лазерным излучением) J Clin Invest; 117(4):953-960.
Dubois, С., et al. (2006). "Glycoprotein VI-dependent и -independent pathways of thrombus formation in vivo." (Зависимые и не зависимые от гликопротеина VI пути тромбообразования in vivo) Blood. 107(10):3902-3906.
Falati, S., et al. (2002). "Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor и fibrin during arterial thrombus formation in the mouse." (Визуализация тромбоцитов, тканевого фактора и фибрина в реальном времени во время тромбообразования в артерии мыши) Nat Med. 8(10): 1175-1181.
Futosi, K., et al. (2013). "Neutrophil cell surface receptors и their intracellular signal transduction pathways." (Рецепторы клеточной поверхности нейтрофилов и опосредованные ими внутриклеточные пути передачи сигнала) Int Immunopharmacol. 17(3):638-650.
Hu, Y. (2012). "Isolation of human и mouse neutrophils ex vivo and in vitro." (Выделение нейтрофилов человека и мыши ex vivo и in vitro) Methods Mol Biol. 844:101-113.
Kambas, K., et al. (2012). "The emerging role of neutrophils in thrombosis - the journey of TF through NETs."(Роль нейтрофилов в развитии тромбоза -путешествие ТФ через НВЛ) Front Immunol. 3:385.
Keularts, I.M., et al. (2001). "The role of factor XI in thrombin generation induced by low concentrations of tissue factor." (Роль фактора XI в образовании тромбина, индуцируемом низкими концентрациями тканевого фактора) Thromb Haemost. 85(6): 1060-1065.
Leal, А.С., et al. (2017). "Tumor-Derived Exosomes Induce the Formation of Neutrophil Extracellular Traps: Implications For The Establishment of cancer associated thrombosis." (Образующиеся в опухоли экзосомы индуцируют образование нейтрофильных внеклеточных ловушек: значение для развития рак-ассоциированного тромбоза) Sci Rep.7(1):6438.
Massberg, S., et al. (2010). "Reciprocal coupling of coagulation и innate immunity via neutrophil serine proteases." (Взаимосвязь свертывания крови и врожденного иммунитета, осуществляемая при участии сериновых протеаз нейтрофилов) Nat Med. 16(8):887-896.
Mauracher, L.M., et al. (2018). "Citrullinated histone H3, a biomarker of neutrophil extracellular trap formation, predicts the risk of venous thromboembolism in cancer patients." (Цитруллинированный гистон Н3, являющийся биомаркером образования нейтрофильных внеклеточных ловушек, позволяет прогнозировать риск венозной тромбоэмболии у больных раком) J Thromb Haemost.
Mezouar, S., et al. (2015). "Inhibition of platelet activation prevents the P-selectin и integrin-dependent accumulation of cancer cell microparticles и reduces tumor growth и metastasis in vivo." (Ингибирование активации тромбоцитов препятствует зависимому от Р-селектина и интегрина накоплению образующихся в раковых клетках микрочастиц и снижает рост опухоли и метастазов in vivo) Int J Cancer. 136(2):462-475.
Thomas, G.M., et al. (2009). "Cancer cell-derived microparticles bearing P-selectin glycoprotein ligand 1 accelerate thrombus formation in vivo." (Образующиеся в раковых клетках микрочастицы, несущие лиганд 1 гликопротеина Р-селектина, ускоряют тромбообразование in vivo) J Exp Med. 206(9): 1913-1927.
von 
, M. L., et al. (2012). "Monocytes, neutrophils, и platelets cooperate to initiate и propagate venous thrombosis in mice in vivo." (Моноциты, нейтрофилы и тромбоциты совместно инициируют и поддерживают венозный тромбоз у мышей in vivo) J Exp Med. 209(4):819-835.
Перечень последовательностей
<110> БИОКСОД ( BIOXODES)
<120> Белок, фармацевтическая композиция, лекарственное средство, устройство, набор
<160> 3
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 67
<212> PRT
<213> Ixodes ricinus
<223> полипептид
<400> 1
Ala Asn His Lys Gly Arg Gly Arg Pro Ala Lys Cys Lys Leu Pro Pro
1 5 10 15
Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Arg Ile Pro Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg
20 25 30
Lys Thr Lys Thr Cys Lys Glu Phe Met Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn
35 40 45
Glu Asn Asn Phe Glu Asn Ile Thr Thr Cys Gln Glu Glu Cys Arg Ala
50 55 60
Lys Lys Val
65
<210> 2
<211> 67
<212> PRT
<213> Ixodes ricinus
<223> полипептид
<400> 2
Ala Asn His Lys Gly Arg Gly Arg Pro Ala Lys Cys Lys Leu Pro Pro
1 5 10 15
Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Arg Ile Pro Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg
20 25 30
Lys Thr Lys Thr Cys Lys Glu Phe Met Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn
35 40 45
Glu Asn Asn Phe Glu Gln Ile Thr Thr Cys Gln Glu Glu Cys Arg Ala
50 55 60
Lys Lys Val
65
<210> 3
<211> 201
<212> ДНК
<213> Ixodes ricinus
<400> 3
gccaaccaca aaggtagagg gcggcctgcg aagtgtaaac ttcctccgga cgacggacca 60
tgcagagcac gaattccgag ttactacttt gatagaaaaa ccaaaacgtg caaggagttt 120
atgtatggcg gatgcgaagg aaacgaaaac aattttgaaa acataactac gtgccaagag 180
gaatgcagag caaaaaaagt c 201
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой применение белка, который имеет последовательность по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 1, для ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или образования внеклеточных нейтрофильных ловушек (нетоза). Изобретение позволяет расширить ассортимент продуктов, используемых для ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или образования внеклеточных нейтрофильных ловушек. 10 з.п. ф-лы, 17 ил., 4 табл., 5 пр.
1. Применение белка, который имеет последовательность по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 1, для ингибирования рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или образования внеклеточных нейтрофильных ловушек (нетоза).
2. Применение белка по п. 1, где указанный белок или полипептид содержит полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
3. Применение белка по п. 1 или 2, где ингибирование рекрутинга тромбоцитов, рекрутинга нейтрофилов, активации нейтрофилов и/или нетоза лечит и/или предотвращает заболевание или состояние, связанное с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом.
4. Применение белка по п. 3, где указанное заболевание или состояние, связанное с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом, выбирают из группы, в которую входят венозный тромбоз, артериальный тромбоз, тромбовоспаление и сердечно-сосудистые заболевания.
5. Применение белка по любому из пп. 1-4, где указанным заболеванием или состоянием, связанным с рекрутингом тромбоцитов, рекрутингом нейтрофилов, активацией нейтрофилов и/или нетозом, является тромбовоспаление.
6. Применение белка по п. 5, где указанное тромбовоспаление выбирают из группы, в которую входят атеросклероз, разрыв атеросклеротической бляшки, вызванное медицинским изделием тромбовоспаление, тромбоз, вызванный процедурами катетеризации и/или позиционирования стента, тромбоз, вызванный экстракорпоральным кровообращением, образование тромба после травм головного мозга, ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда, рак-ассоциированный тромбоз, ассоциированный с метастазированием тромбоз, ассоциированный с инсультом тромбоз, Болезнь Бехчета (ББ), васкулиты, ассоциированные с антителами к цитоплазме нейтрофилов (ANCA-ассоциированные васкулиты), артериит Такаясу, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, антифосфолипидный синдром, периодическая болезнь, облитерирующий тромбангиит (ОТА), сепсис, воспалительные заболевания кишечника, гепарин-индуцированная тромбоцитопения, иммунотромбоз, тромбоз, ассоциированный с преэклампсией, тромботические осложнения при трансплантации клеток и клеточных кластеров и при трансплантации цельных органов или лоскутов, венозная тромбоэмболия, аневризмы к синдрому ишемии-реперфузии скелетной мускулатуры.
7. Применение белка по п. 6, где указанным тромбовоспалением является атеросклероз.
8. Применение белка по п. 6, где указанным тромбовоспалением является тромбоз, вызванный процедурами катетеризации и/или позиционирования стента.
9. Применение белка по п. 6, где указанным тромбовоспалением является тромбовоспаление, вызванное медицинским изделием, контактирующим с кровью.
10. Применение белка по п. 6, где указанным тромбовоспалением является разрыв атеросклеротической бляшки.
11. Применение белка по п. 6, где указанным тромбовоспалением является тромбоз, ассоциированный с экстракорпоральным кровообращением.
| Машина для штемпелевания писем и т.п. | 1939 |
|
SU55816A1 |
| DARBOUSSET ET AL: "Tissue factor-positive neutrophils bind to injured endothelial wall and initiate thrombus formation", BLOOD, vol | |||
| Кровля из глиняных обожженных плит с арматурой из проволочной сетки | 1921 |
|
SU120A1 |
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
| Токарный резец | 1924 |
|
SU2016A1 |
| Паровой котел, предназначенный для использования тепла, выделяющегося при гашении кокса | 1928 |
|
SU10134A1 |
