ШТАММЫ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ MICROSPORUM CANIS И TRICHOPHYTON MENTAGROPHYTES, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ КОНТРОЛЯ РОСТОВЫХ СВОЙСТВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД Российский патент 2021 года по МПК C12N1/14 C12R1/645 

Изобретение относится к области ветеринарной и медицинской микологии, а также к клинической микробиологии, и может быть использовано лаборантом или врачом исследователем, для оценки ростовых свойств питательной среды.

Дерматофитозы животных - чаще всего хроническое, контагиозное заболевание поверхности кожи, вызываемое патогенными грибами-дерматофитами рода Microsporum spp.и Trichophyton spp. Примерно 20% от всех дерматологических заболеваний, приходится на дерматофитозы. Инфекция распространена повсеместно, особенно часто встречается в областях с влажным и теплым климатом [Савинов, В.А. Распространенность дерматофитозов у мелких домашних животных / В.А. Савинов // Успехи медицинской микологии. 2018. Т. 19. С. 373-375].

Существует более 40 видов возбудителей дерматофитозов, однако основными и наиболее часто встречаемыми возбудителями среди мелких домашних животных являются Microsporum earns и Trichophyton mentagrophytes [Савинов, В.А. Экспресс-диагностика дерматофитозов животных / В.А. Савинов, Р.С.Овчинников, А.В. Капустин, А.А. Гайнуллина // Аграрная наука. 2019. №10. С. 20-24].

Диагностика дерматофитозов подразумевает несколько этапов, на основании которых устанавливается окончательный диагноз. Существует первичная диагностика с помощью люминесцентной лампы с фильтром Вуда, которая выявляет метаболиты М. canis на поверхности волоса. Исследование основано на люминесценции продуктов жизнедеятельности, которые имеют изумрудное свечение под лучами лампы. Другим методом диагностики является прямое микроскопирование пораженного волоса. Шерсть исследуют на наличие гиф и артроспор, расположенных на корне волоса. Оба метода имеют достаточно низкую эффективность по ряду причин, однако зачастую ограничиваются только одним из выше названных методов. Золотым стандартом диагностики дерматофитозов является посев пораженных волос на питательные среды для выделения чистой культуры и идентификации возбудителя. Данный метод отличается длительностью определения, однако позволяет установить возбудителя до вида. Для точности идентификации необходимо иметь контрольные штаммы, которые будут обладать всеми типичными свойствами возбудителей [Овчинников, Р.С.Микологический скрининг домашних животных - важный способ профилактики дерматофитозов человека / Р.С. Овчинников, П.П. Ершов, А.В. Капустин, В.А. Савинов, А.Г. Гайнуллина // Успехи медицинской микологии. 2019. Т. 20. С. 712-716].

Уровень техники

В настоящее время для диагностики дерматофитозов используются следующие питательные среды: агар Сабуро с хлорамфениколом и циклогексимидом (http://www.himedialabs.ru/m664-m286), агар «Миобио» (http://www.himedialabs.ru/m475), агар Сабуро с глюкозой и хлорамфениколом (http://www.himedialabs.ru/ml067-m063), основа агара Киммига для грибов (http://www.himedialabs.ru/ml232), основа агара для дерматофитов - DTM Agar (http://www.himedialabs.ru/ml88), сердечно-мозговой агар СС (http://www.himedialabs.ru/m209), основа агара Литтмана (http://www.himedialabs.ru/m373-m663), агар Улриха для выделения патогенных грибов (http://www.himedialabs.ru/arap-улриха-для-выделения-патогенных-грибов_т246), среды для дифференциации трихофитонов (http://www.himedialabs.ru/m531-m532-m533-m534-m535-m536-ml52), микологический агар (http://www.himedialabs.ru/m094-m264-m095-m265), и т.д.

Производителем, для контроля ростовых свойств приведенных средств предлагается использовать следующие штаммы дерматофитов: Trichophyton mentagrophytes АТСС 9533; Trichophyton rubrum АТСС 28191; Trichophyton equinum АТСС 22443; Trichophyton verrucosum АТСС 36058; Microsporum audouinii ATCC 9079; Trichophyton megninii ATCC 12106; Trichophyton tonsurans ATCC 10220. Согласно приведенным данным, для контроля приведенных коммерческих сред, предназначенных для диагностики дерматофитозов, нет ни одного конкретно предложенного и изученного штамма Microsporum canis. Данный нюанс может негативно повлиять на качество проводимой диагностики, и к постановке ложных результатов. Кроме того, все приведенные культуры мицелиальных грибов расположены в иностранной коллекции, что в свою очередь подрывает принципы импортозамещения на территории РФ, так как делает все отечественные лаборатории и испытательные центры зависимыми от зарубежных поставщиков.

Известен «Штамм гриба Microsporum canis, используемый для контроля иммуногенности вакцин против дерматофитозов животных» [патент RU 2074252 А опубл. 1995.09.27], а также «Штамм гриба Trichophyton mentagrophytes, используемый для контроля иммуногенной активности вакцин против трихофитии животных» [патент RU 2013444 С1 опубл. 1994.05.30], а также «Штамм гриба Trichophyton mentagrophytes, используемый для изготовления вакцины против трихофитии животных» [патент RU 2013445 С1 опубл. 1994.05.30]. Поскольку приведенные штаммы предназначены для контроля иммуногенности или производства вакцин, то они обладают высокой вирулентностью, что не подходит для контрольных культур используемых при контроле питательных сред, так как тест-культуры должны быть не вирулентными или слабовирулентными.

Технической проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является необходимость повышение стабильности и достоверности лабораторно-диагностических исследований на дерматофитозы за счет использования контрольных тест-культур Microsporum canis и Trichophyton mentagrophytes с известными свойствами, проводимых с использованием рутинных методов диагностики, необходимость расширения арсенала штаммов, предназначенных для контроля ростовых свойств питательных сред.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом изобретения является повышение стабильности и достоверности результатов лабораторной диагностики дерматофизозов животных и человека, а также сроков диагностирования дерматофитозов животных, расширение арсенала штаммов, предназначенных для контроля ростовых свойств питательных сред.

Для контроля ростовых свойств питательных сред, предназначенных для диагностики дерматофитозов, вызванных мицелиальными грибами видов Microsporum canis и Trichophyton mentagrophytes предлагаются хорошо изученные и охарактеризованные штаммы Microsporum canis «FL 79-18 Viev» депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером F-81, а также Trichophyton mentagrophytes «CN 38-18 Viev» депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером F-82. Приведенные штаммы являются слабопатогенными для лабораторных животных и обладают типичными для вида культуральными свойствами.

Благодаря использованию предлагаемого изобретения лаборант или врач исследователь, может оценивать ростовые свойства используемой питательной среды, тем самым подтверждать пригодность ее к использованию, повышая достоверность получаемых результатов.

Осуществление изобретения

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Пример №1. Авторский штамм микроорганизма Microsporum canis «FL 79-18 Viev»

1. Вид микроорганизма: Анаморфа: Microsporum canis (Bodin) Bodin Телеоморфа: Arthroderma otae (Hasegawa & Usui) McGinnis Штамм FL 79-18 Viev является анаморфой

2. Штамм депонирован во Всероссийская государственная коллекция патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН 13 декабря 2019 года под номером F-81.

3. Основание для депонирования: контрольный штамм для оценки ростовых свойств питательной среды.

4. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов -возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» грибные агенты рода Microsporum относятся к четвертой группе опасности, является зоопатогенным.

5. Способ получения штамма (когда, где и кем получен): штамм выделен от естественного хозяина при микологическом исследовании клинического материала от кошки с признаками дерматофитоза (г. Москва), в октябре 2018 г., в лаборатории микологии и антибиотиков им. А.Х. Саркисова ФНЦ ВИЭВ РАН, авторами штамма.

6. Где и кем идентифицирована культура: в лаборатории микологии и антибиотиков им. А.Х. Саркисова ФНЦ ВИЭВ РАН, авторами штамма.

7. Методы идентификации: штамм идентифицирован на основании изученных морфологических и физиологических свойств в соответствии с микологическими определителями клинически значимых грибов.

8. Культуральные особенности: культура штамма растет на твердых питательных средах: среда Сабуро, сусло-агар.

9. Морфологические особенности:

А. Макроморфологические признаки: колонии на среде Сабуро бежевато-белые, плоские, бархатисто-шерстистые, в центре пуговчатое возвышение. Растущий край ровный, реснитчатый. Реверс охряно-желтый. Воздушный мицелий развит умеренно, белого цвета. Диаметр колонии на 10-ые сутки роста 50-55 мм. Пигмент и экссудат не образует.По мере старения культуры реверс приобретает более темную окраску.

Б. Микроморфологические признаки: мицелий ровный, ветвящийся, септированный, бесцветный, ширина гиф 1-2 мкм. Макроконидии многочисленные, многоклеточные, веретеновидные с клювовидным кончиком, имеют от 4 до 8 септ. Микроконидии немногочисленные, овальные, грушевидные, размером 1-3×1,5-5 мкм, располагаются непосредственно на недифференцированных гифах.

В. Дополнительные признаки (наличие хламидоспор, артроспор, склероциев и т.д.) не выявлены.

Культурально-морфологические признаки штамма являются типичными для вида Microsporum canis.

10. Молекулярно-генетические характеристики штамма: у штамма проведено секвенирование участков внутреннего транскрибируемого спейсера гена рибосомальной РНК (ITS) и гена Р-тубулина. Филогенетический BL AST-анализ подтвердил принадлежность штамма к виду Microsporum canis.

11. Условия культивирования: культура штамма выращивается на агаре Сабуро или сусло - агаре (рН 6,2-6,8) при температуре от 26-28°С. Срок инкубирования 7-14 сут.

12. Условия хранения: культуры штамма хранятся в лиофилизированном состоянии под вакуумом в ампулах, при температуре от 4 до 6°С или в пробирках на агаре Сабуро под ватно-марлевыми пробками при температуре от 4 до 6°С. Периодичность пересевов из пробирок один раз в 6 месяцев, из ампул - один раз в 5 лет.

Пример №2. Авторский штамм микроорганизма Trichophyton mentagrophytes «CN 38-18 Viev»

1. Вид микроорганизма:

Анаморфа: Trichophyton mentagrophytes (Robin) Blanchard Телеоморфа: Arthroderma benhamiae (Ajello et Cheng) Graser et de Hoog Штамм CN 38-18 Viev является анаморфой.

2. Штамм депонирован во Всероссийская государственная коллекция патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН 13 декабря 2019 года под номером F-82.

3. Основание для депонирования: контрольный штамм для оценки ростовых свойств питательной среды.

4. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами I1I-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» грибные агенты рода Trichophyton относятся к четвертой группе опасности, является зоопатогенным.

5. Способ получения штамма (когда, где и кем получен): штамм выделен от естественного хозяина при микологическом исследовании клинического материала от собаки с признаками дерматофитоза (Московская обл.), в июне 2018 г., в лаборатории микологии и антибиотиков им. А.Х. Саркисова ФНЦ ВИЭВ РАН, авторами штамма.

6. Где и кем идентифицирована культура: в лаборатории микологии и антибиотиков им. А.Х. Саркисова ФНЦ ВИЭВ РАН, авторами штамма.

7. Методы идентификации: штамм идентифицирован на основании изученных морфологических и физиологических свойств в соответствии с микологическими определителями клинически значимых грибов.

8. Культуральные особенности: культура штамма растет на твердых питательных средах: среда Сабуро, сусло-агар.

9. Морфологические особенности:

A. Макроморфологические признаки: колонии на среде Сабуро белые, выпуклые, бархатисто-пушистые, в центре кратерообразное углубление. Растущий край ровный, реснитчатый. Реверс охряно-коричневый. Воздушный мицелий развит хорошо, белого цвета. Диаметр колонии на 10-ые сутки роста 60-65 мм. Пигмент и экссудат не образует. По мере старения культуры рельеф становится более плоским.

Б. Микроморфологические признаки: мицелий изогнутый, септированный, ветвящийся, бесцветный. Микроконидии многочисленные, овальные или булавовидные, располагаются непосредственно на гифах, одиночно или гроздьями. Макроконидии единичные, встречаются редко, сигаровидной формы.

B. Дополнительные признаки (наличие хламидоспор, артроспор, склероциев и т.д.) не выявлены.

Культурально-морфологические признаки штамма являются типичными для вида Trichophyton mentagrophytes.

10. Молекулярно-генетические характеристики штамма: у штамма проведено секвенирование участков внутреннего транскрибируемого спейсера гена рибосомальной РНК (ITS) и гена (3-тубулина. Филогенетический BLAST-анализ подтвердил принадлежность штамма к виду Trichophyton mentagrophytes.

11. Условия культивирования: культура штамма выращивается на агаре Сабуро или сусло - агаре (рН 6,2-6,8) при температуре от 26-28°С. Срок инкубирования 7-14 сут.

12. Условия хранения: хранятся в лиофилизированном состоянии под вакуумом в ампулах, при температуре от 4 до 6°С или в пробирках на Сабуро агар под ватно-марлевыми пробками при температуре от 4 до 6°С. Периодичность пересевов из пробирок один раз в 6 месяцев, из ампул - один раз в 5 лет.

Пример №3. Способ подготовки культур из лиофилизированного состояния для использования в качестве тест-объектов

В ампулу или флакон с лиофилизированной культурой штамма вносят 0,3-1,0 мл стерильного физраствора или жидкой среды Сабуро, перемешивают до полного растворения. Полученную смесь рассевают на 2-3 чашки с твердой питательной средой типа агара Сабуро или сусло-агара по 0,2 мл на каждую чашку Петри, делая уколы в трех различных местах в виде треугольника. Посевы культивируют при температуре 28°С в течение 7-14 суток. Параллельно проводят посев на контрольные среды: МПА, МПБ, МППБ для исключения контаминации материала посторонней микрофлорой.

Пример №4. Способ подготовки культур из нативного состояния для использования в качестве тест-объектов

Используя микологический крючок или иглу, с поверхности нативной культуры отбирают образец, пытаясь захватить воздушный мицелий. Затем отобранный материал переносится на чистую твердую питательную среду Сабуро или сусло-агар и высевается уколами в трех точках чашки Петри в виде треугольника.

Культура способна сохранять свою жизнеспособность более месяца.

Пример №5. Пример роста культур на среде Сабуро

На питательной среде Сабуро М. canis растет достаточно быстро - на 7 сутки диаметр колонии достигает 30 мм при условии инкубации 28°С. Морфология шерстистая, пушистая, рост радиальный, колонии распростертые, бело-серого или желтоватого цвета. Реверс охряно-желтого цвета. К 5-7 суткам образуются складки. Край колонии реснитчатый.

Tr. mentagrophytes на среде Сабуро характеризуется интенсивным ростом - на 7 сутки диаметр достигает 30-35 мм при 28°С. Колонии пушистые, круглые, выпуклые, белого, кремового или желтовато-коричневого цвета. Край колонии ровный. Реверс от охряного до красно-коричневого, иногда желтый.

Пример №6. Пример роста культур на среде Сабуро с хлорамфениколом и циклогексимидом

На питательной среде Сабуро М. canis растет достаточно быстро - на 7 сутки диаметр колонии достигает 30 мм при условии инкубации 28°С. Морфология шерстистая, пушистая, рост радиальный, колонии распростертые, бело-серого или желтоватого цвета.

Реверс охряно-желтого цвета. К 5-7 суткам образуются складки. Край колонии реснитчатый.

Tr. mentagrophytes на среде Сабуро характеризуется интенсивным ростом - на 7 сутки диаметр достигает 30-35 мм при 28°С. Колонии пушистые, круглые, выпуклые, белого, кремового или желтовато-коричневого цвета. Край колонии ровный. Реверс от охряного до красно-коричневого, иногда желтый.

Пример №7. Пример рост культур на среде Сабуро с глюкозой и хлорамфениколом На питательной среде Сабуро М. canis растет достаточно быстро - на 7 сутки диаметр колонии достигает 30 мм при условии инкубации 28°С. Морфология шерстистая, пушистая, рост радиальный, колонии распростертые, бело-серого или желтоватого цвета. Реверс охряно-желтого цвета. К 5-7 суткам образуются складки. Край колонии реснитчатый.

Tr. mentagrophytes на среде Сабуро характеризуется интенсивным ростом - на 7 сутки диаметр достигает 30-35 мм при 28°С. Колонии пушистые, круглые, выпуклые, белого, кремового или желтовато-коричневого цвета. Край колонии ровный. Реверс от охряного до красно-коричневого, иногда желтый.

Пример №8. Пример роста культур на среде ДТМ

На питательной среде ДТМ колония М. canis характеризуется умеренным ростом. На 7 сутки диаметр колонии достигает 20-25 мм при режиме инкубации 28°С. Колонии белого цвета, круглой формы, поверхность бархатистая. Морфология рыхлая, полупрозрачная. Редко образуются радиальные складки. Изменение цвета среды возникает на 4-5 сутки.

На питательной среде ДТМ колония Tr. mentagrophytes имеет умеренный рост. Колония белого цвета, круглая, поверхность бархатистая, немного выпуклая. Имеет ватообразную консистенцию. Изменение цвета происходит на 4-5 сутки.

Пример №9. Пример рост культур на среде ДТМ эксперт

На питательной среде ДТМ колония М. canis характеризуется умеренным ростом. На 7 сутки диаметр колонии достигает 20-25 мм при режиме инкубации 28°С. Колонии белого цвета, круглой формы, поверхность бархатистая. Морфология рыхлая, полупрозрачная. Редко образуются радиальные складки. Изменение цвета среды возникает на 3-5 сутки.

На питательной среде ДТМ колония Tr. mentagrophytes имеет умеренный рост. Колония белого цвета, круглая, поверхность бархатистая, немного выпуклая. Имеет ватообразную консистенцию. Изменение цвета происходит на 3-5 сутки.

Изобретение относится к области ветеринарной и медицинской микологии и может быть использовано для оценки ростовых свойств питательной среды. Для контроля ростовых свойств питательных сред, предназначенных для диагностики дерматофитозов, вызванных мицелиальными грибами видов Microsporum canis и Trichophyton mentagrophytes, предложены штамм Microsporum canis «FL 79-18 Viev», депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером F-81, а также штамм Trichophyton mentagrophytes «CN 38-18 Viev», депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером F-82. Штаммы являются слабопатогенными для лабораторных животных и обладают типичными для вида культуральными свойствами, позволяют оценивать ростовые свойства используемой питательной среды, тем самым подтверждать пригодность ее к использованию, повышая достоверность получаемых результатов. Преимуществом изобретения является повышение стабильности и достоверности результатов лабораторной диагностики дерматофитозов, а также сокращение сроков диагностирования дерматофитозов животных. 2 н.п. ф-лы, 9 пр.

1. Штамм мицелиального гриба Microsporum canis «FL 79-18 Viev» для контроля ростовых свойств питательных сред, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером F-81.

2. Штамм мицелиального гриба Trichophyton mentagrophytes «CN 38-18 Viev» для контроля ростовых свойств питательных сред, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером F-82.