Лекарственное средство для лечения рака, комбинированное лекарственное средство, композиция лекарственного средства, иммунореактивная клетка, носитель для доставки нуклеиновых кислот и продукт Российский патент 2025 года по МПК A61K35/15 A61K35/17 A61K38/16 A61K38/19 A61K38/20 A61K39/395 A61K45/00 C07K14/47 C07K14/725 C07K14/54 C07K16/28 C07K19/00 C12N15/12 C12N5/09 C12N15/24 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее раскрытие относится к лекарственному средству для применения в лечении рака, к комбинированному лекарственному средству, фармацевтической композиции, иммунореактивной клетке, носителю для доставки нуклеиновых кислот и продукту.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак также называется «злокачественным новообразованием», и его лечение является важной целью в медицинской науке. До настоящего времени проводили лечение с использованием радиации или химиотерапевтического противоракового лекарственного средства, но его эффективность значительно варьирует в зависимости от типов раковых заболеваний, и против всех раковых заболеваний не получают высокую эффективность.

Недавно была разработана терапия на основе Т-клеток с CAR (химерный рецептор антигена), в которой используют Т-клетки с CAR, полученные модифицированием Т-клеток таким образом, чтобы обеспечивать продукцию Т-клетками специального белка, именуемого «химерным рецептором антигена (CAR)», с использованием методики медицинской генетики. Например, было показано то, что терапия на основе Т-клеток с CAR является эффективной против рецидивирующего или трудно поддающегося лечению СD×19-позитивного В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (B-ALL) и рецидивирующей или трудно поддающейся лечению СВ19-позитивной диффузной В-клеточной крупноклеточной лимфомы (DLBCL). В международной публикации (WO) № 2017/159736 описано то, что обеспечивается экспрессия интерлейкина-7 (IL-7) и лиганда 19 хемокина (с мотивом С-С) (CCL19) в иммунокомпетентных клетках, экспрессирующих молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, таких как Т-клетки с CAR, посредством этого усиливая их противоопухолевую активность. В международной публикации (WO) № 2019/073973 описаны усиленные Т-клетки или В-клетки, которые содержат носитель для доставки нуклеиновых кислот, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и которые имеют функцию памяти у субъекта, которому осуществляется введение, и индуктор, который индуцирует функцию памяти Т-клеток или В-клеток у субъекта, которому осуществляется введение.

При лечении рака часто совместно используют многочисленные противораковые лекарственные средства с целью усиления противораковых эффектов и для облегчения побочных эффектов посредством снижения дозы. Например, в публикации японского патента национальной фазы (JP-A) № 2018-538339 описана композиция и способ лечения заболевания, ассоциированного с экспрессией мезотелина, включающие введение клеток, которые экспрессируют специфичный в отношении мезотелина CAR в комбинации с антителом против PD-L1 (лиганд рецептора программируемой клеточной гибели 1), с целью улучшения эффективности лечения, в котором используются Т-клетки с CAR.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблема, подлежащая лечению посредством изобретения

Комбинированное применение противораковых лекарственных средств в некоторых случаях дает синергический эффект, но в других случаях взаимно ингибирует их эффекты, в зависимости от комбинации. Следовательно, осуществляется поиск полезной комбинации для комбинированного применения.

При рассмотрении вышеупомянутых обстоятельств настоящее раскрытие нацелено на предложение лекарственного средства для применения в лечении рака, комбинированного лекарственного средства, фармацевтической композиции, иммунореактивной клетки, носителя для доставки нуклеиновых кислот и продукта, с которым получают высокий противораковый эффект.

Способы решения проблемы

Настоящее раскрытие включает следующий аспект.

Комбинированное лекарственное средство для применения в лечении рака у субъекта, включающее:

(а) иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7 (IL-7), лиганд 19 хемокина (с мотивом С-С) (CCL19) и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген; и

(б) ингибитор иммуносупрессии.

Настоящее раскрытие также включает следующий аспект.

Комбинированное лекарственное средство для применения в лечении рака у субъекта, включающее:

(а) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителя для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген; и

б) ингибитор иммуносупрессии.

Настоящее раскрытие также включает следующий аспект.

Иммунореактивная клетка, экспрессирующая интерлейкин-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

Полезный эффект по изобретению

Согласно настоящему раскрытию предложены лекарственное средство для применения в лечении рака, комбинированное лекарственное средство, фармацевтическая композиция, иммунореактивная клетка, носитель для доставки нуклеиновых кислот и продукт, с которым получают сильный противораковый эффект.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1А показана карта вектора pMSGV, который включает eGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок), но не включает ни IL-7, ни CCL19, и который описывается в Примерах (ниже также называется «вектор eGFP-Conv.»; вектор, получаемый удалением области, кодирующей IL-7, и области, кодирующей CCL19, из вектора pMSGV, содержащего фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP (SEQ ID NO: 10)).

На Фиг. 1Б показана карта вектора pMSGV, который включает фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP (SEQ ID NO: 10), и который описывается в Примерах (далее также называется «экспрессионный вектор 7×19»).

Фиг. 2 представляет собой диаграмму рассеивания, показывающую результаты измерения уровня экспрессии eGFP и уровня экспрессии CD8 посредством проточной цитометрии в каждой из: Т-клеток TCR, в которые не был введен вектор (в частности, мышиные Т-клетки, которые были получены из клеток селезенки, и которые экспрессируют TCR, специфичный в отношении антигена P1A опухоли Р815, и в которые не был введен вектор); ниже именуемые «клетки P1A-TCRT без введенного вектора». Мышиные Т-клетки, экспрессирующие Р1А-специфичный TCR, будут совокупно называться «клетки P1A-TCRT», независимо от того, был ли введен вектор или нет); клетки P1A-TCRT, в которые был введен вектор eGFP-Conv. (ниже также именуемые «клетки P1A-TCRT, экспрессирующие eGFP»); и клетки P1A-TCRT, в которые был введен экспрессионный вектор 7×19 (ниже также именуемые «клетки Р1А-7×19 TCRT, экспрессирующие eGFP»).

Фиг. 3А представляет собой график, показывающий результаты измерения уровня экспрессии IL-7 посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) в каждой из: клетках P1A-TCRT без введения вектора, клетках P1A-TCRT, экспрессирующих eGFP, и клетках Р1А-7×19 TCRT, экспрессирующих eGFP.

Фиг. 3Б представляет собой график, показывающий результаты измерения уровня экспрессии CCL19 посредством ELISA в каждой из следующих: клетки Р1А-TCRT без введения вектора, клетки P1A-TCRT, экспрессирующие eGFP, и клетки Р1А-7×19 TCRT, экспрессирующие eGFP.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и жизнеспособностью в случае подкожного инъецирования мастоцитомных клеток (Р815) мышам DBA/2, облучения мышей DBA/2 радиацией и затем введения клеток P1A-TCRT без введения вектора, клеток P1A-TCRT, экспрессирующих eGFP, и/или моноклонального антитела против PD-1 (рецептор программируемой клеточной гибели 1) мышам DBA/2 в Примере.

Фиг. 5А представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае подкожного инъецирования мастоцитомных клеток (Р815) мышам DBA/2, облучения мышей DBA/2 радиацией и затем без проведения обработки в Примере.

Фиг. 5Б представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае подкожного инъецирования мастоцитомных клеток (Р815) мышам DBA/2, облучения мышей DBA/2 радиацией и затем введения моноклонального антитела против PD-1 мышам DBA/2 в Примере.

Фиг. 5В представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае подкожного инъецирования мастоцитомных клеток (Р815) мышам DBA/2, облучения мышей DBA/2 радиацией и затем введения клеток P1A-TCRT, экспрессирующих eGFP, мышам DBA/2 в Примере.

Фиг. 5Г представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае подкожного инъецирования мастоцитомных клеток (Р815) мышам DBA/2, облучения мышей DBA/2 радиацией и затем введения клеток P1A-TCRT, экспрессирующих eGFP, и моноклонального антитела против PD-1 мышам DBA/2 в Примере.

Фиг. 5Д представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае подкожного инъецирования мастоцитомных клеток (Р815) мышам DBA/2, облучения мышей DBA/2 радиацией и затем введения мышам DBA/2 клеток Р1А-7х19 TCRT, экспрессирующих eGFP, в Примере.

Фиг. 5Е представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае подкожного инъецирования мастоцитомных клеток (Р815) мышам DBA/2, облучения мышей DBA/2 радиацией и затем введения клеток Р1А-7×19 TCRT, экспрессирующих eGFP, и моноклонального антитела против PD-1 мышам DBA/2 в Примере.

Фиг. 6А представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и жизнеспособностью в случае подкожного инъецирования мастоцитомных клеток (Р815) мышам DBA/2, облучения мышей DBA/2 радиацией и затем введения/не введения мышам DBA/2 клеток Р1А-7×9 TCRT, в которых был нокаутирован (разрушен) ген PD-1 или ген ROSA26, и введения/не введения мышам DBA/2 моноклонального антитела против PD-1 в Примерах.

Фиг. 6Б представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае невведения ни клеток P1A-TCRT, ни моноклонального антитела против PD-1 в эксперименте Фиг. 6 А.

Фиг. 6В представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае введения клеток Р1А-7×19 TCRT, экспрессирующих eGFP, в которых был нокаутирован ген ROSA26, в эксперименте Фиг. 6А.

Фиг. 6Г представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае введения клеток Р1А-7×19 TCRT, экспрессирующих eGFP, в которых был нокаутирован ген PD-1, в эксперименте Фиг. 6А.

Фиг. 6Д представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае введения клеток Р1А-7×19 TCRT, экспрессирующих eGFP, в которых был нокаутирован ген PD-1, и моноклонального антитела против PD-1 в эксперименте Фиг. 6А.

Фиг. 7 представляет собой график, определяющий, на основе измерения проточной цитометрией уровня экспрессии CD8 и уровня экспрессии eGFP, присутствуют ли в клетках селезенки клетки P1A-TCRT, экспрессирующие eGFP, или клетки Р1А-7×19 TCRT, экспрессирующих eGFP, которые экспрессируют и eGFP, и CD8, после полной регрессии опухоли после введения клеткок P1A-TCRT, экспрессирующих eGFP, или клеток Р1А-7×19 TCRT, экспрессирующих eGFP, мышам DBA/2, которых инокулировали раковыми клетками, в Примерах.

Фиг. 8А представляет собой график, показывающий долю Т-клеток, которые не экспрессируют CD8, но экспрессируют eGFP, и долю Т-клеток, которые экспрессируют и CD8, и eGFP, в клетках селезенки, полученных в эксперименте Фиг. 7.

Фиг. 8Б представляет собой график, показывающий число Т-клеток, которые не экспрессируют CD8, но экспрессируют eGFP, и число Т-клеток, которые экспрессируют и CD8, и eGFP, в клетках селезенки, полученных в эксперименте Фиг. 7.

Фиг. 8В представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и числом Т-клеток, экспрессирующих и CD8, и eGFP, в случае дальнейшего сокультивирования клеток селезенки, полученных в эксперименте Фиг. 7, с опухолевыми клетками Р815.

Фиг. 8Г представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и концентрацией IFN-γ (интерферон-гамма) в кондиционированной среде в случае дальнейшего сокультивирования клеток селезенки, полученных в эксперименте Фиг. 7, с опухолевыми клетками Р815.

Фиг. 9 представляет собой график, показывающий связь между минувшими сутками и объемом опухоли в случае повторного инокулирования опухолевыми клетками Р815 после полной регрессии опухоли в эксперименте Фиг. 5Е и в случае инокулирования опухолевых клеток Р815 наивным мышам DBA/2.

Фиг. 10А представляет собой график, показывающий связь между течением времени и жизнеспособностью в случае инокулирования опухолевых клеток Р815 (опухолевые клетки P815-hCD20), экспрессирующих человеческий CD20 (hCD20), мышам DBA/2 и затем внутрибрюшинного введения циклофосфамида, и затем дальнейшего осуществления/не осуществления внутривенной инъекции Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20, или Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, или моноклонального антитела против PD-1.

Фиг. 10Б представляет собой график, показывающий связь между течением времени и объемом опухоли в случае не проведения ни введения CAR-T, ни введения антитела в эксперименте Фиг. 10А.

Фиг. 10В представляет собой график, показывающий связь между течением времени и объемом опухоли в случае не проведения введения CAR-T, но введения моноклонального антитела против PD-1 в эксперименте Фиг. 10А.

Фиг. ЮГ представляет собой график, показывающий связь между течением времени и объемом опухоли в случае введения Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20, и введения антитела против PD-1 в эксперименте Фиг. 10А.

Фиг. 10Д представляет собой график, показывающий связь между течением времени и объемом опухоли в случае введения Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, и введения контрольного IgG в эксперименте Фиг. ЮА.

Фиг. 10Е представляет собой график, показывающий связь между течением времени и объемом опухоли в случае введения Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, и введения моноклонального антитела против PD-1 в эксперименте Фиг. ЮА.

На Фиг. ПА показаны диаграммы рассеивания, показывающие результаты анализа состава инфильтрующих опухоль лимфоцитов (TIL) на основе экспрессий c-kit, CD11C, CD3, eGFP, CD4 и CD8 в случае инокулирования опухолевых клеток Р815 мышам DBA/2 и внутривенного инъецирования клеток P1A-TCRT, экспрессирующих eGFP, или клеток Р1А-×19 TCRT, экспрессирующих eGFP, в сутки 7.

Фиг. 11Б представляет собой график, показывающий число клеток каждого типа иммунных клеток, полученных в эксперименте Фиг. ПА.

Фиг. 12 представляет собой концептуальную диаграмму, иллюстрирующую вектор, кодирующий CAR и scFv против мышиного PD-1, и вектор, кодирующий CAR, IL-7, CCL19 и scFv против мышиного PD-1, которые используются в Примерах.

На Фиг. 13 показаны графики, демонстрирующие прямое рассеивание и боковое рассеивание, полученные проточной цитометрией Т-клеток, которые не подвергались трансдукции, и Т-клеток, трансдуцированных разными конструкциями, содержащими CAR, которые используются в Примерах, и графики, демонстрирующие долю клеток, экспрессирующих CAR, измеренную с использованием белка L-bio и sav-apc.

На Фиг. 14 показаны графики, демонстрирующие результаты измерения посредством ELISA концентраций IL-7 и CCL19 в кондиционированной среде Т-клеток, которые не подвергались трансдукции, и в кондиционированной среде Т-клеток, трансдуцированных разными конструкциями, содержащими CAR, которые используются в Примерах.

На Фиг. 15 показаны графики, демонстрирующие результаты измерения посредством ELISA концентрации антитела против PD-1 в кондиционированной среде Т-клеток, которые не подвергались трансдукции, и в кондиционированной среде Т-клеток, трансдуцированных разными конструкциями, содержащими CAR, которые используются в Примерах.

На Фиг. 16 показан график, демонстрирующий связь между минувшими сутками и жизнеспособностью в случае подкожного инъецирования опухолевых клеток Р815, экспрессирующих человеческий CD20, у мышей DBA/2, внутрибрюшинного введения циклофосфамида и затем введения Т-клеток, которые не подвергались трансдукции, и Т-клеток, трансдуцированных разными конструкциями, содержащими CAR, в Примерах, и таблица, показывающая значения Ρ среди экспериментальных групп согласно логранговому критерию.

На Фиг. 17 показаны графики, демонстрирующие связь между минувшими сутками и объемом опухоли в соответствующих экспериментальных группах в эксперименте на Фиг. 16.

СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Содержание настоящего раскрытия будет подробно описано ниже. Далее объяснения составных элементов могут быть сделаны на основе репрезентативных воплощений настоящего раскрытия. Однако настоящее раскрытие не ограничивается такими воплощениями.

Для числовых интервалов, описанных в настоящем раскрытии ступенчато, значение верхней границы или значение нижней границы одного числового интервала может быть заменено значением верхней границы или значением нижней границы другого числового интервала в ступенчатом описании. Значение верхней границы или значение нижней границы любого числового интервала, описанного в настоящем раскрытии, также может быть заменено значением, описанным в Примерах.

В случае, в котором в композиции присутствуют многие вещества, соответствующие интересующему компоненту, количество компонента в композиции, описанной в настоящем раскрытии, означает общее количество многочисленных веществ, присутствующих в данной композиции, если не определяется иное.

В настоящем раскрытии термины «% по массе» или «весовые %» используются синонимично, и термины «части по массе» и «весовые части» используются синонимично.

В настоящем раскрытии два или более чем два типичных аспекта могут быть объединены друг с другом, при условии, что не возникает противоречия.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложено комбинированное лекарственное средство для применения в лечении рака у субъекта (далее также именуемое «комбинированное лекарственное средство А согласно настоящему раскрытию»), которое включает: (а) иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7 (IL-7), CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген; и (б) иммуносупрессивный ингибитор.

Авторы настоящего изобретения провели исследование относительно комбинированных противораковых лекарственных средств, которые являются полезными в способе лечения рака, и обнаружили то, что можно получать замечательно высокий терапевтический эффект против рака с использованием комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию. В частности, в комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию используется иммунореактивная клетка, экспрессирующая IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген (далее также именуемая «иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию»). Авторы настоящего изобретения впервые обнаружили то, что получается замечательно высокий синергический эффект посредством совместного введения иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию и ингибитора иммуносупрессии.

Молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и которая присутствует на клеточной поверхности иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию, специфично связывается с раковым антигеном, экспрессируемым на раковой клетке. В результате данного связывания происходит одно или более чем одно событие, выбранное из связывания иммунореактивной клетки с раковой клеткой, запускания внутриклеточной трансдукции сигнала или тому подобного, с началом атаки против данной раковой клетки у страдающего от рака человека (далее именуемого «человеком, страдающим от рака»). В настоящем раскрытии термин «распознавать» используется взаимозаменяемо с термином «связываться».

Поскольку раковые клетки имеют иммуносупрессивный механизм, который подавляет действие иммунореактивных клеток по атаке против данных раковых клеток или по высылке инструкции для атаки данных раковых клеток, подавляется атака против раковых клеток иммунной системой самого человека, страдающего от рака. Понятно, что ингибитор иммуносупрессии, который является одним компонентом комбинированного лекарственного средства А по настоящему раскрытию, ингибирует иммуносупрессивный механизм, обеспечиваемый раковыми клетками, облегчая, посредством этого, для иммунной системы человека, страдающего от рака, атаку раковых клеток.

Кроме того, поскольку иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию также экспрессирует IL-7 и CCL19, вокруг раковых клеток накапливается не только иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию, но также эндогенные иммунореактивные клетки человека, страдающего от рака, в результате чего обеспечивается более эффективная атака против раковых клеток.

Понятно, что посредством включения иммунореактивной клетки, экспрессирущей IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и ингибитора иммуносупрессии комбинированное лекарственное средство А согласно настоящему раскрытию посредством этого оказывает замечательно улучшенный противораковый терапевтический эффект. Данный синергический эффект является таким превосходным, что его нельзя было бы прогнозировать из индивидуальных эффектов соответствующих факторов.

Например, даже в случае лечения рака, который сложно лечить иммунореактивной клеткой, экспрессирующей интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает один раковый антиген, или одним ингибитором иммуносупрессии, такой рак можно лечить комбинированным лекарственным средством А согласно настоящему раскрытию. На этот момент указывают экспериментальные результаты, касающиеся иммунореактивной клетки С согласно настоящему раскрытию, которые будут описаны позднее. Кроме того, такой высокий терапевтический эффект делает возможным получение терапевтического эффекта даже с пониженной дозой, что делает возможным получение терапевтического эффекта даже в случае, при котором нельзя собрать количество иммунореактивных клеток, традиционно требующееся для применения аутологических клеток. Данные эффекты не ожидаются от одиночного введения иммунореактивной клетки, экспрессирующей интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, или от одного введения ингибитора иммуносупрессии.

Молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген

Молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, в настоящем раскрытии представляет собой молекулу, которая специфично связывается с раковым антигеном, и может представлять собой любую молекулу из полипептида, нуклеиновой кислоты, такой как аптамер, или другой молекулы, при условии, что данная молекула специфично связывается с раковым антигеном. Здесь «раковый антиген» означает вещество, такое как белок или гликолипид, которое демонстрирует более высокую экспрессию в раковых клетках, чем в нормальных клетках, или которое специфично экспрессируется в раковых клетках. Примеры ракового антигена включают ассоциированные с опухолью антигены, раково-тестикулярные антигены, ассоциированные с ангиогенезом антигены и эпитопные пептиды раковых неоантигенов, возникающие из-за генетических мутаций.

Конкретные примеры раковых антигенов, которые специфично распознаются молекулами клеточной поверхности, включают такие белки, как WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-Al, M AGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A10, глипикан-3, KIF20A, сурвивин, AFP, gp100, MUC1, DLL3, PRSS21, нектин 4, F АР, интегрин β7, CT-83(KK-LC-1), KRAS (включающий мутанты, т.е. mKRAS), Epha2, PRAME, HA-1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, МЕЗОТЕЛИН, NKG2D и P1A, и гликолипиды, такие как GD2 и GM2. Другие примеры включают CD20, EGFR (такой как EGFRvIII), варианты EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, ROR1, c-Met, HER2, CEA, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD74, CD123, CD133, CD171, CD 180, MUC16, CS1(CD319), IL-13Ra2, BCMA, LewisY, цепь к IgG, фолатный рецептор α, PSCA, EpCAM, CAIX, CDS, CD49L CD56, CD138, IGF IR, антиген клетки, инфицированной цитомегаловирусом (CMV), EGP-2, EGP-40, ERB-B2, ERB-B3, ERB-В4, FBP, фетальный рецептор ацетилхолина, GD3, HER-2, hTERT, К-легкую цепь, LeY, молекулу клеточной адгезии L1, лиганд NKG2D, 5Т4 и TAG-72, но не ограничиваются ими. Данная молекула клеточной поверхности может включать одну или более чем одну из данных молекул клеточной поверхности. Организм происхождения данных антигенов может представлять собой тот же самый организм, что и организм, подлежащий лечению комбинированным лекарственным средством А согласно настоящему раскрытию, и данный организм представляет собой, например, человека.

Примеры молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, включают рецепторы клеточной поверхности, искусственные рецепторы и факторы адгезии, которые специфично распознают раковый антиген. Молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, может представлять собой молекулу клеточной поверхности, которая осуществляет только функцию связывания с раковым антигеном и, посредством этого, расположение иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию поблизости от раковой клетки, или может представлять собой молекулу клеточной поверхности, которая также имеет функцию запуска внутриклеточной трансдукции сигнала, который активирует иммунный ответ иммунореактивной клетки таким образом, чтобы дополнительно усиливать терапевтический эффект против рака. Молекулой клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, может быть антитело или фрагмент антитела, который специфично распознает раковый антиген. Данное антитело или фрагмент антитела не ограничивается IgM, IgD, IgG, IgA, IgE или тому подобными и может представлять собой низкомолекулярное антитело, такое как Fab или scFv.

Молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой, например, молекулу, которая дает клетке способность специфично распознавать рак при экспрессии данной молекулы на поверхности клетки, как, например, рецептор Т-клетки (TCR), который специфично распознает раковый антиген, или химерный рецептор антигена (CAR), который специфично распознает раковый антиген. Можно сказать, что TCR представляет собой пример рецептора клеточной поверхности, CAR представляет собой пример искусственного рецептора, и антитело (включая низкомолекулярное антитело, такое как Fab, Fab', F(ab')2 или scFv) представляет собой пример фактора адгезии. Естественно, фактор адгезии может представлять собой, в качестве альтернативы, молекулу, отличную от антитела, такую как цепь сахара или аптамер, поскольку данная молекула специфично распознает раковый антиген. Данные молекулы клеточной поверхности специфично распознают раковый антиген, обеспечивая, посредством этого, то, что иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию локализуется вокруг раковой клетки.

TCR представляет собой молекулу рецептора антигена, экспрессируемую на клеточной мембране Т-клетки. TCR присутствует в виде гетеродимера, состоящего из цепи альфа и цепи бета или цепи гамма и цепи дельта, и известно, что TCR активирует Т-клетку при распознавании молекулы антигена, связанной с главным комплексом гистосовместимости (МНС). TCR может представлять собой либо гетеродимер, состоящий из цепи альфа и цепи бета (альфа-бета TCR), либо гетеродимер, состоящий из цепи гамма и цепи дельта (гамма-дельта TCR), поскольку TCR специфично распознает раковый антиген.

TCR может представлять собой эндогенный TCR или экзогенный TCR (рекомбинантный TCR). Примеры источника Т-клетки, которая экспрессирует эндогенный TCR, или Т-клетки, в которую был генетически введен экзогенный TCR, включают инфильтрующий опухоль лимфоцит (TIL), регионарный лимфатический узел опухоли, лимфоцит периферической крови, лимфоцит в плевральной жидкости и лимфоцит в асцитической жидкости, но не ограничивается ими.

Примеры способов разделения Т-клеток, которые экспрессируют TCR, имеющий данное свойство связывания антигена, включают: центрифугирование в градиенте плотности; розеткообразование; связывание с частицей для изменения плотности клетки; магнитное разделение с использованием магнитных шариков, покрытых антителом; аффинную хроматографию (например, аффинную хроматографию с использованием негативного отбора); цитотоксический агент (примеры которых включают комплементы и цитотоксины, но не ограничиваются ими), связанный с моноклональным антителом или используемый в комбинации с моноклональным антителом; пэннинг с использованием антитела, связанного с твердой матрицей, такой как планшет или наконечник; элютриацию; селективную пролиферацию из-за антигенных стимулов; и разделение с использованием комплекса МНС и антигена.

Также разработали трансгенных животных, таких как трансгенные мыши, которые были модифицированы для экспрессии конкретного TCR.

CAR представляет собой искусственный химерный белок, получаемый слиянием одноцепочечного антитела, которое распознает антиген клеточной поверхности раковой клетки, и области сигнализации, которая индуцирует активацию Т-клетки. CAR может включать, например, область одноцепочечного антитела, которая распознает антиген клеточной поверхности раковой клетки, область, пронизывающую клеточную мембрану, и область сигнализации, которая индуцирует активацию Т-клетки. Когда молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, в комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию представляет собой CAR, можно получить эквивалентный или более высокий эффект даже в случае, при котором иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию, введенная в качестве компонента комбинированного лекарственного средства А, присутствует в количестве, которое меньше, чем количество Т-клеток с CAR (обычно по меньшей мере 1 × 10⁶ клеток), введенных в традиционных способах, при которых Т-клетки с CAR используются одни.

Одноцепочечное антитело (scFv) в CAR представляет собой, например, олигопептид или полипептид, который включает вариабельную область легкой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, происходящие из антигенсвязывающего сайта моноклонального антитела, и в котором присутствует линкерный пептид между вариабельной областью легкой цепи и вариабельной областью тяжелой цепи.

Одноцепочечное антитело, которое распознает интересующий раковый антиген, может быть получено с использованием известных способов. Например, лимфоидная ткань может быть отобрана после инокулирования антигена в мышь или тому подобное, из нее может быть получена библиотека генов антител, последовательность оснований, кодирующая антитело, которое распознает раковый антиген, может быть получена посредством прямого клонирования антитела, и одноцепочечное антитело может быть разработано на основе последовательности оснований. В качестве альтернативы, могут быть получены гибридомы с использованием отобранной лимфоидной ткани, может быть идентифицирована гибридома, кодирующая антитело, которое распознает раковый антиген, с получением моноклонального антитела, и одноцепочечное антитело может быть разработано на основе информации по последовательности данного моноклонального антитела. В качестве альтернативы, библиотека одноцепочечных антител может быть получена на основе, например, библиотеки наивных антител, полученной из В-клеток нормального человека, или библиотеки антител, полученной из В-клеток человека, страдающего от рака, имеющего антисыворотку, демонстрирующую высокую нейтрализующую активность против ракового антигена, данная библиотека одноцепочечных антител может подвергаться фаговому дисплею, и из нее может быть отобрано одноцепочечное антитело, которое распознает раковый антиген.

Активирующая сигнализацию область иммунореактивной клетки представляет собой область, способную к трансдуцированию сигнала в клетку при распознавании одноцепочечным антителом антигена клеточной поверхности раковой клетки. Активирующая сигнализацию область иммунореактивной клетки может включать по меньшей мере один или два, или более чем два полипептида, выбранных из полипептидов внутриклеточных областей CD28, 4-1ВВ (CD137), GITR, CD27, ОХ40, HVEM, CD3 и цепи γ, ассоциированной с рецептором Fe, и может включать полипептиды трех видов внутриклеточных областей CD28, 4-1ВВ и CD3ζ.

Полипептиды соответствующих внутриклеточных областей могут быть связаны через олигопептидный линкер, состоящий из 2-10 аминокислот, или через полипептидный линкер. Последовательность данного линкера представляет собой, например, последовательность глицин-сериновых повторов.

Активация иммунореактивной клетки означает инициацию иммунного ответа на основе внутриклеточной трансдукции сигнала или индукцию изменения экспрессии белка. Например, каскад трансдукции сигнала формируется при сборке цепей CD3 в ответ на связывание лиганда и ингибирующего мотива иммунорецептора на основе тирозина (ITAM). Далее связывание эндогенного TCR или экзогенного CAR с антигеном может индуцировать образование иммунологического синапса, который включает сборку многих молекул поблизости от рецепторов (например, CD4 или CD8, CD3γ/δ/ε/ζ, или тому подобных), участвующих в связывании. Из-за сборки ассоциированных с мембраной молекул сигнализации мотив ITAM, содержащийся в цепи CD3, фосфорилируется. Данное фосфорилирование, в свою очередь, инициирует путь активации иммунореактивной клетки и может в конечном счете активировать транскрипционные факторы, такие как NF-κΒ и АР-1. Данные транскрипционные факторы, например, запускают массовую экспрессию генов Т-клетки с инициацией иммунного ответа, опосредованного Т-клеткой, увеличивая, посредством этого, продукцию IL-2 для пролиферации главных регуляторных Т-клеток и экспрессии их белков.

Примеры области CAR, пронизывающей клеточную мембрану, включают полипептид области, пронизывающей клеточную мембрану, происходящий из любого из CD8, α-цепи или β-цепи рецептора Т-клетки, CD28, CD3s, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 или GITR. Область, пронизывающая клеточную мембрану, может представлять собой, например, полипептид пронизывающей клеточную мембрану области человеческого CD8. Область, пронизывающая клеточную мембрану, фиксирует CAR в клеточной мембране Т-клетки.

Область, пронизывающая клеточную мембрану, может включать шарнирную область, имеющую длину от 1 до 100 аминокислот, более конкретно, от 10 до 70 аминокислот, и она образуется свободно выбранным олигопептидом или полипептидом. Шарнирная область представляет собой, например, шарнирную область человеческого CD8.

Спейсерная область, состоящая из свободно выбранного олигопептида или полипептида, может быть предоставлена между одноцепочечным антителом, которое распознает антиген клеточной поверхности раковой клетки, и областью, пронизывающей клеточную мембрану, или между областью, пронизывающей клеточную мембрану, и активирующей сигнализацию областью иммунореактивной клетки. Длина данной спейсерной области составляет, например, от 1 до 100 аминокислот, более конкретно, от 10 до 50 аминокислот. Примером спейсерной области является последовательность глицин-сериновых повторов.

Аминокислотная последовательность молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой, например, аминокислотную последовательность от млекопитающего животного и может представлять собой аминокислотную последовательность от человека с точки зрения уменьшения отторжения при введении человеку. Данную аминокислотную последовательность можно получать по желанию посредством поиска в известных публикациях или базах данных, таких как NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). Молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, может представлять собой человеческий TCR или CAR, в котором область одноцепочечного антитела гуманизирована.

Молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, может представлять собой молекулу клеточной поверхности, которая опосредованно распознает раковый антиген, при условии, что данное распознавание ракового антигена является специфичным. Например, в случае, при котором молекула, такая как антитело, которое специфично распознает раковый антиген, вводится субъекту одновременно или параллельно с введением иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию, причем иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию может специфично распознавать раковый антиген опосредованно посредством распознавания такой молекулы, как антитело, или посредством распознавания маркера, присоединенного в качестве метки молекулы, такой как антитело. В данных случаях в примере, в котором иммунореактивная клетка А распознает антитело, данная молекула клеточной поверхности представляет собой, например, CD 16, и маркер, присоединенный в качестве метки к молекуле, такой как антитело, представляет собой, например, FITC (флуоресцеинизотиоцианат).

IL-7

IL-7 представляет собой цитокин примерно 25 кДа, продуцируемый клеткой стромы, происходящей из костного мозга, или вилочковой железой в качестве структуры происхождения. IL-7 вызывает испускание сигнала, который стимулирует, через рецептор IL-7, дифференциацию от гематопоэтических стволовых клеток до лимфоидных клеток-предшественников с образованием Т-клеток, В-клеток и NK-клеток (природные киллеры). Аминокислотная последовательность IL-7 представляет собой, например, аминокислотную последовательность от млекопитающего животного и может представлять собой аминокислотную последовательность от человека с точки зрения уменьшения отторжения. Данную аминокислотную последовательность можно получать по желанию посредством поиска в известных публикациях или базах данных, таких как NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

CCL19

Лиганд 19 хемокина (с мотивом С-С) (CCL19) представляет собой цитокин, принадлежащий к семейству хемокинов СС, и он демонстрирует высокую экспрессию в вилочковой железе и лимфатических узлах. Аминокислотная последовательность CCL19 представляет собой, например, аминокислотную последовательность от млекопитающего животного и может представлять собой аминокислотную последовательность из человека с точки зрения уменьшения отторжения. Данную аминокислотную последовательность можно получать по желанию посредством поиска в известных публикациях или базах данных, таких как NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

Иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию

Термин «иммунореактивные клетки» относится к клеткам, участвующим в иммунных ответах. Примеры иммунореактивных клеток включают лимфоцитарные клетки, такие как Т-клетки, природные клетки-киллеры (NK-клетки) и В-клетки, антигенпрезентирующие клетки, такие как моноциты, макрофаги и дендритные клетки, и гранулоциты, такие как нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки. Примеры Т-клеток включают альфа-бета Т-клетки, гамма-дельта Т-клетки, Т-клетки CD8⁺, Т-клетки CD4⁺, инфильтрующие опухоль Т-клетки, Т-клетки памяти, наивные Т-клетки и Т-клетки-природные киллеры (NKT).

Иммунореактивные клетки могут быть получены посредством выделения и очистки из жидкости органзма, такой как кровь или аспират костного мозга, или от иммунных клеток, которые инфильтрируют в ткань, такую как селезенка, вилочковая железа или лимфатические узлы, или от иммунных клеток, которые инфильтрируют в раковую ткань, такую как первичная опухоль, метастатическая опухоль или раковые асциты. Также можно использовать иммунореактивные клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, таких как клетки iPS (индуцированные стволовые клетки) или клетки ES (эмбриональные стволовые клетки), или из соматических стволовых клеток, таких как гематопоэтичекие стволовые клетки.

Иммунореактивная клетка может представлять собой Т-клетку, происходящую из млекопитающего животного, такого как человек, собака, кошка, свинья или мышь, и может представлять собой Т-клетку, происходящую из человека.

Иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию экспрессирует IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген. Здесь выражение «экспрессирует IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген» относится к ситуации, при которой IL-7, CCL19 и молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, продуцируются данной иммунореактивной клеткой таким образом, что по меньшей мере некоторые из молекул клеточной поверхности, которые специфично распознают раковый антиген, располагаются на поверхности клетки (поверхности клетки на наружной стороне клетки), и таким образом, что IL-7 и CCL19 секретируются наружу клетки.

Иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию может быть получена посредством введения гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, гена, кодирующего IL-7, и гена, кодирующего CCL19, например, в иммунореактивную клетку, отобранную из живого организма, или иммунореактивную клетку, индуцированную из плюрипотентной стволовой клетки, такой как клетка iPS или клетка ES, или индуцированную из соматической стволовой клетки, такой как гематопоэтическая стволовая клетка. Иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию, в качестве альтернативы, может быть получена отбором иммунореактивной клетки, которая по своей природе экспрессирует молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген (например, TCR, который специфично распознает раковый антиген), из живого организма и введением гена, кодирующего IL-7, и гена, кодирующего CCL19. В настоящем раскрытии выражение «ген, кодирующий XX» и выражение «нуклеиновая кислота, кодирующая XX» используются взаимозаменяемо. В данном случае нуклеиновая кислота может быть одноцепочечной или двухцепочечной и может представлять собой ДНК или РНК. Данная нуклеиновая кислота предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.

В случае введения гена в иммунореактивную клетку, отобранную из живого организма, отторжение может быть минимизировано отбором иммунореактивной клетки человека, страдающего от рака, подлежащего лечению комбинированным лекарственным средством А согласно настоящему раскрытию (т.е. аутологичной иммунореактивной клетки). Однако не исключается применение аллогенной иммунореактивной клетки. Другими словами, иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию может быть или может не быть иммунореактивной клеткой, происходящей от самого субъекта.

Каждый из гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, гена, кодирующего IL-7, и гена, кодирующего CCL19, может присутствовать в геноме иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию или может сохраняться в векторе, который присутствует вне генома. Например, для каждого гена может допускаться присутствие в геноме с точки зрения стабильности сохранения гена. Ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, могут присутствовать в геноме сосредоточенно или могут присутствовать рассредоточенно (отдельно друг от друга). В случае, при котором молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой гетеродимер, такой как TCR, образованный из αβ-димера или γδ-димера, или гетеромультимер, гены, кодирующие соответствующие молекулы, составляющие гетеродимер или гетеромультимер, могут присутствовать в геноме сосредоточенно или могут присутствовать рассредоточенно (отдельно друг от друга).

В одном воплощении ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, являются экзогенными, и оба гена интегрируются в геном иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию, или ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, совместно закодированы в одном векторе или раздельно закодированы во многих векторах, присутствующих в иммунореактивной клетке А согласно настоящему раскрытию. Присутствуют ли или нет соответстующие гены в клетке можно легко подтвердить с использованием известной методики, такой как ПЦР. В настоящем раскрытии термин «экзогенный» означает то, что ген или нуклеиновая кислота не является геном или нуклеиновой кислотой, которая по своей природе присутствует в клетке, но является геном или нуклеиновой кислотой, которая была введена извне.

В том, что касается TCR, были описаны такие TCR, как MARTI-специфичный TCR (Cancer Res.54, 5265-5268 (1994)), MAGE-А3-специфичный TCR (Anticancer Res., 20, 1793-1799 (2000)), gp100-специфичный TCR (J. Immunol. 170, 2186-2194 (2003)), NY-ESO-1-специфичный TCR (J. Immunol, 174, 4415-4423 (2005)), WTl-специфичный TCR (Blood, 106, 470-476 (2005)), MAGE-Al-специфичный TCR (Int. Immunol, 8, 1463-1466 (1996)), PlA-специфичный TCR (Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. Cytotoxic Τ lymphocytes to an unmutated tumor antigen PI A: normal development but restrained effector function. J. Exp. Med. 189:811.), MAGE-A10-специфичный TCR, AFP-специфичный TCR, CT-83-специфичный TCR, KRAS (включая мутант, т.е. mKRАS)-специфичный TCR, МАGЕ-А4-специфичный TCR, Ерhа2-специфичный TCR, ВСМА-специфичный TCR, 5Т4-специфичный TCR, PRAME-специфичный TCR и НА-1-специфичный TCR, и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие данные TCR, также описываются в соответствующих документах. Когда молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой TCR, последовательность оснований гена, кодирующего TCR, может иметь идентичность последовательности, например, 80% или более, более конкретно 85% или более, более конкретно 90% или более, более конкретно 95% или более, и более конкретно 98% или более по отношению к основной последовательности, кодирующей TCR, описанной в приведенных выше документах, до тех пор, пока данная основная последовательность способна к распознаванию молекулы антигена-мишени и к активации Т-клеток. В настоящем раскрытии идентичность последовательности аминокислотных последовательностей и идентичность последовательности последовательностей оснований может оцениваться, например, с использованием программы BLAST (зарегистрированный торговый знак, Национальная библиотека медицины) с параметрами по умолчанию.

В качестве альтернативы, последовательность оснований гена, кодирующего TCR, может представлять собой последовательность оснований, которая содержит последовательности оснований, кодирующие CDR (область, определяющая комплементарность), в последовательности оснований, кодирующей TCR, описанной в приведенных выше документах, и из которых последовательность оснований в областях, отличных от последовательностей оснований, кодирующей CDR, имеет идентичность последовательности 60% или более, более конкретно, 70% или более, более конкретно 80% или более, более конкретно 90% или более, или более конкретно 95% или более по отношению к последовательности оснований соответствующей области в последовательности оснований, кодирующей TCR, описанной в приведенных выше документах.

Естественно, последовательность оснований TCR изменяется со специфичностью в отношении антигена TCR. Т-клетка, экспрессирующая TCR, который связывается с интересующим антигеном, может быть выделена, и может быть проанализирована последовательность оснований данного TCR. Например, последовательность оснований гена, кодирующего TCR, который специфично распознает специфический антиген, может быть получена посредством проведения анализа последовательностей оснований, кодирующих альфа цепь и бета цепь в качестве субъединиц TCR цитотоксической Т-клетки (CTL), индуцированной специфическим антигеном, с использованием способов, известных в данной области (международная публикация (WO) № 2007/032255 и Morgan et al., J. Immunol, 111, 3288 (2003)). Для анализа последовательности оснований TCR анализ можно проводить после амплификации последовательностей оснований, кодирующих соответствующие цепи, с использованием способа ПЦР (полимеразная цепная реакция). Праймер ПЦР может представлять собой, например, 5'R-праймep в качестве праймера 5'-конца (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3': SEQ ID NO: 1) и праймер 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3': SEQ ID NO: 2) в качестве праймера 3'-конца, который является специфичным в отношении области С α-цепи TCR, праймер 3-TRb-Cl (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3': SEQ ID NO: 3), специфичный в отношении области Cl β-цепи TCR, или праймер 3-TRbeta-C2 (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3': SEQ ID NO: 4), специфичный в отношении области С2 β-цепи TCR. Однако праймер ПЦР не ограничивается ими. Антигенспецифичный TCR может связываться с высокой силой связывания с клеткой-мишенью, презентирующей антиген (например, пептид). Посредством подходящего отбора вида иммунореактивной клетки может быть опосредовано эффективное умерщвление клетки-мишени, презентирующей пептид антигена.

Последовательность оснований, кодирующая CAR, конкретно не ограничивается, при условии, что данная последовательность оснований кодирует полипептид, создающий конфигурацию CAR. Последовательность оснований, кодирующая CAR, включает последовательности оснований, кодирующие полипептиды одноцепочечного антитела, которое распознает антиген клеточной поверхности раковой клетки, области, пронизывающей клеточную мембрану, и области сигнализации, которая индуцирует активацию Т-клетки.

Информацию по последовательностям оснований, кодирующих полипептиды одноцепочечного антитела против антигена клеточной поверхности раковой клетки, области, пронизывающей клеточную мембрану, и области сигнализации, активирующей иммунореактивную клетку, в CAR при желании можно получить посредством поиска в известных публикациях или базах данных, таких как NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

Например, информацию по последовательностям оснований, кодирующих полипептиды областей, пронизывающих клеточную мембрану, CD28, 4-1ВВ, и в области сигнализации, активирующей иммунореактивную клетку, можно получать, при желании, посредством поиска в базе данных, такой как NCBI. В качестве примера для человеческого CD28 может быть приведена последовательность оснований, зарегистрированная номером Genbank NM_006139.2 (дата обновления 10 мая 2014 г.), в качестве примера для человеческого 4-1ВВ может быть приведена последовательность оснований, зарегистрированная номером Genbank NM_001561.5 (дата обновления 16 марта 2014 г.), и в качестве примера для человеческого CD3ζ может быть приведена последовательность оснований, зарегистрированная номером Genbank NM_000734.3 (дата обновления 12 августа 2014 г.).

Информацию по последовательности оснований, кодирующей полипептид области, пронизывающей клеточную мембрану, человеческого CD8 при желании можно получить посредством поиска в базе данных, такой как NCBI, примеры которой включают последовательность оснований, зарегистрированную под номером Genbank NM_001768.6 (дата обновления 10 мая 2014 г.).

Кроме того, информацию по последовательности оснований, кодирующей полипептид одноцепочечного антитела, также можно получить на основе аминокислотной последовательности, которую получают продуцированием моноклонального антитела, которое распознает антиген поверхности клетки-мишени, и определением аминокислотной последовательности данного моноклонального антитела с использованием известного способа, такого как способ Эдмана. Примеры способа, используемого для получения моноклональных антител, включают способ продукции с использованием гибридомы, способ продукции, включающий трансформирование хозяина экспрессионным вектором, который содержит ген антитела, с использованием методики генной инженерии, и способ получения, включающий иммунизацию трансгенного животного желательным антигеном.

Информация по последовательности оснований, кодирующей IL-7, и последовательности оснований, кодирующей CCL19, может быть получена, по желанию, посредством поиска известных публикаций или в базе данных, такой как NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

Последовательность оснований, кодирующая IL-7, может быть выбрана, сообразно ситуации, с использованием типа иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию. Последовательность оснований, кодирующая IL-7, может представлять собой последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность человеческого IL-7 (SEQ ID NO: 5), или последовательность оснований, имеющую идентичность последовательности, например, 80% или более, более конкретно 85% или более, более конкретно 90% или более, более конкретно 95% или более и более конкретно 98% или более по отношению к последовательности оснований SEQ ID NO: 5, при условии, что оказывается эффект IL-7 в показателях стимуляции скорости пролиферации клеток.

Последовательность оснований, кодирующая CCL19, может быть отобрана, сообразно ситуации, согласно типу иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию. Последовательность оснований, кодирующая CCL19, может представлять собой последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность человеческого CCL19 (SEQ ID NO: 6), или последовательность оснований, имеющую идентичность последовательности, например, 80% или более, более конкретно 85% или более, более конкретно 90% или более, более конкретно 95% или более и более конкретно 98% или более по отношению к последовательности оснований SEQ ID NO: 6, при условии, что проявляется эффект активности CCL19 на миграцию Т-клеток.

В иммунореактивной клетке А согласно настоящему раскрытию ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, который специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, организованы так, чтобы подвергаться контролю посредством подходящего промотора.

Иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию может дополнитено экспрессировать один или более чем один фактор, регулирующий иммунную функцию, такой как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-23, IL-27, IP-10, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL4L1, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CX3CL1, XCL1, XCL2, CCL3L1, CCL3L3, CCL4L1, CCL4L2, Flt3L, интерферон-гамма, MIP-1 альфа, GM-CSF, M-CSF, TGF-бета, или TNF-альфа, помимо IL-7, CCL19 и молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

Примеры способов разделения иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию включают следующие: центрифугирование в градиенте плотности; повторное отстаивание; связывание с частицей для изменения плотности клеток; магнитное разделение с использованием магнитных шариков, покрытых антителом; аффинная хроматография (например, аффинная хроматография с использованием отрицательного отбора); цитотоксическое средство (примеры которого включают комплементы и цитотоксины, но не ограничиваюся ими), связанное с моноклональным антителом или используемое в комбинации с моноклональным антителом; пэннинг с использованием антитела, связанного с твердой матрицей, такой как планшет или наконечник; элютриация; селективная пролиферация из-за антигенного стимула; и разделение с использованием комплекса МНС (главный комплекс гистосовместимости), но не ограничиваюся ими.

Когда иммунореактивная клетка по своей природе экспрессирует молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, например, когда Т-клетка экспрессирует TCR (Т-клеточный рецептор), который специфично распознает данный раковый антиген, подлежащий выделению, нет необходимости вводить ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, извне. Однако, в общем, один или более чем один ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, или ген, кодирующий CCL19, вводятся извне.

Нуклеиновая кислота, включающая ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, включающая ген, кодирующий IL-7, и нуклеиновая кислота, включающая ген, кодирующий CCL19, которые подлежат введению в иммунореактивную клетку, могут быть получены на основе информации по последовательностям оснований, кодирующих соответствующие молекулы, с использованием известных методик, таких как способ химического синтеза или способ амплификации с использованием ПЦР. Кодоны в кодирующей области могут быть модифицированы таким образом, чтобы оптимизировать экспрессию гена в иммунореактивной клетке, в которую подлежит введению нуклеиновая кислота, включающая данный ген.

Гены, подлежащие введению, могут быть введены в состоянии, в котором данные гены сохраняются на, соответственно, разных векторах, или в состоянии, в котором два или более чем два гена сохраняются на том же самом векторе. Например, в случае введения в иммунореактивную клетку гена, кодирующего IL-7, и гена, кодирующего CCL19, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, могут быть введены с использованием отдельных векторов, или оба гена могут быть введены, сохраняясь на том же самом векторе.

Когда ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, подлежат введению в иммунореактивную клетку,

(1) введение может осуществляться в состоянии, при котором ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, сохраняются на, соответственно, отдельных векторах; или

(2) введение может осуществляться в состоянии, при котором ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и ген, кодирующий IL-7, сохраняются на том же самом векторе, и при котором ген, кодирующий CCL19, сохраняется на отдельном векторе; или

(3) введение может осуществляться в состоянии, при котором ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и ген, кодирующий CCL19, сохраняются на том же самом векторе, и при котором ген, кодирующий IL-7, сохраняется на отдельном векторе; или

(4) введение может осуществляться в состоянии, при котором ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, сохраняются на том же самом векторе, и при котором ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, сохраняется на отдельном векторе; или

(5) введение может осуществляться в состоянии, при котором ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, сохраняются на том же самом векторе.

Введение может осуществляться в состоянии, при котором два или более чем два гена сохраняются на том же самом векторе, принимая во внимание эффективность введения. В данном случае два или более чем два гена будут присутствовать в иммунореактивной клетке сосредоточенно.

Например, можно использовать следующий вектор или группу векторов: (а) вектор, содержащий ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19;

(6) группа векторов, состоящая из следующего вектора (6-1) и вектора (6-2):

(6-1) вектор, содержащий ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген,

(6-2) вектор, содержащий ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19;

(в) группа векторов, состоящая из следующего вектора (в-1) и вектора (в-2): (в-1) вектор, содержащий ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности,

которая специфично распознает раковый антиген, и ген, кодирующий IL-7, (в-2) вектор, содержащий ген, кодирующий CCL19;

(г) группа векторов, состоящая из следующего вектора (г-1) и вектора (г-2): (г-1) вектор, содержащий ген, кодирующий IL-7;

(г-2) вектор, содержащий ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и ген, кодирующий CCL19,

(д) группа векторов, состоящая из следующего вектора (д-1), вектора (д-2) и вектора (д-3):

(д-1) вектор, содержащий ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген,

(д-2) вектор, содержащий ген, кодирующий IL-7, (д-3) вектор, содержащий ген, кодирующий CCL19.

Такая группа векторов может быть сконструирована таким образом, что данные гены содержатся избыточно. Например, можно сконструировать группу векторов, состоящую из вышеописанных (в-1) и (г-2). В данном случае оба вектора включают ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген; гены, кодирующие молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, содержащиеся в обоих векторах, могут быть либо одинаковыми, либо отличными друг от друга.

В любой из вышеописанных векторов или в вектор, отличный от вышеописанных векторов, может быть дополнительно включен ген или гены, кодирующие один или более чем один другой фактор, регулирующий иммунную функцию, такой как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-23, IL-27, IP-10, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL4L1, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CX3CL1, XCL1, XCL2, CCL3L1, CCL3L3, CCL4L1, CCL4L2, Flt3L, интерферон-гамма, MIP-1 альфа, GM-CSF, M-CSF, TGF-бета или TNF-альфа, и он может быть введен в иммунореактивную клетку.

Способ, используемый для введения вектора, сохраняющего ген, в иммунореактивную клетку конкретно не ограничивается, и его примеры включают известные способы, такие как способ инфекции вирусом, транспозоновый способ, способ с фосфататом кальция, способ липофекции, способ микроинъекции и способ электропорации. Способ, включающий введение с использованием способа инфекции вирусом, который способен вводить чужеродный ген в геном, может обеспечивать стабильность сохранения гена.

Примером способа инфекции вирусом является способ, включающий трансфицирование упаковывающей клетки, такой как клетка GP2-293 (изготовленная Takara Bio Inc.), клетка Plat-GP (изготовленная Cosmo Bio Co., Ltd.), клетка PG13 (ATCC CRL-10686) или клетка РА317 (ATCC CRL-9078), вектором и упаковывающей плазмидой с получением рекомбинантного вируса и инфицирование иммунореактивной клетки рекомбинантным вирусом. Это может проводиться с использованием имеющегося в продаже набора, такого как упаковывающий набор Eco для ретровируса (изготовленный Takara Bio Inc.). Применение ретровирусной экспрессионной системы MSCV или подобной обеспечивает введение в геном чужеродного гена.

Введение в геном гена, кодирующего IL-7, гена, кодирующего CCL19, и, если необходимо, гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, также может осуществляться с использованием известной методики редактирования генов. Примеры известных методик редактирования генов включают методику с использованием эндонуклеазы, такой как нуклеаза с цинковыми пальцами, TALEN (эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции) или система CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками)-Саs. Интеграцию в геном гена, кодирующего другой чужеродный белок, который возможно вводят, можно осуществлять с использованием таких способов.

В случае интегрирования любого из этих генов в геном иммунореактивной клетки ген может быть интегрирован вместе с расположенным выше промотором для регулирования данного гена в некодирующую область или тому подобное генома функциональным образом (т.е. иметь способность к экспрессии под контролем промотора) или может быть интегрирован без промотора ниже промотора, который уже присутствует в геноме, функциональным образом. Примеры промотора, который уже присутствует в геноме, включают промотор TCRα или TCRβ.

Когда два или более чем два гена, кодирующих молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, ген, кодирующий CCL19, или возможно введенный ген, кодирующий дополнительный чужеродный белок, присутствуют рядом друг с другом, данные два или более чем два гена могут экспрессироваться под контролем, оказываемым общим промотором. В случае, при котором гены экспрессируются под контролем, оказываемым общим промотором, транскрипция и/или трансляция могут быть разделены пептидом 2А, пептидом IRES или тому подобными для обеспечения экспрессии индивидуальных полипептидов.

В случае, при котором вектор, несущий два или более чем два гена, кодирующих молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, или ген, кодирующий CCL19, вводится в иммунореактивную клетку, порядок выравнивания двух или более чем двух генов в данном векторе конкретно не ограничивается. Например, в векторе (а), содержащем ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, порядок выравнивания данных генов не ограничивается. В частности, относительно порядка от расположенного выше (5'-концевая сторона) до расположенного ниже (3'-концевая сторона) данный порядок может представлять собой любое из следующего:

порядок, при котором ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, располагаются в данном порядке;

порядок, при котором ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий CCL19, и ген, кодирующий IL-7, располагаются в данном порядке;

порядок, при котором ген, кодирующий IL-7, ген, кодирующий CCL19, и ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, организованы в данном порядке;

порядок, при котором ген, кодирующий IL-7, ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и ген, кодирующий CCL19, организованы в данном порядке;

порядок, при котором ген, кодирующий CCL19, ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и ген, кодирующий IL-7, организованы в данном порядке; или

порядок, при котором ген, кодирующий CCL19, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, организованы в данном порядке.

В векторе (6-2), содержащем ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, порядок выравнивания гена, кодирующего IL-7, и гена, кодирующего CCL19, конкретно не ограничивается, и ген, кодирующий CCL19, может располагаться либо выше, либо ниже гена, кодирующего IL-7.

В векторе (в-1), содержащем ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и ген, кодирующий IL-7, порядок выравнивания гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и гена, кодирующего IL-7, конкретно не ограничивается, и ген, кодирующий IL-7, может располагаться либо выше, либо ниже гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

В векторе (г-2), содержащем ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и ген, кодирующий CCL19, порядок выравнивания гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и гена, кодирующего CCL19, конкретно не ограничивается, и ген, кодирующий CCL19, может располагаться либо выше, либо ниже гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

Ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, и ген, кодирующий CCL19, могут транскрибироваться из-за действия, соответственно, разных промоторов или могут транскрибироваться из-за действия одного промотора с использованием участка внутренней посадки рибосомы (1RES) или саморасщепляемого пептида 2А.

В случае, при котором многие гены транскрибируются из-за действия одного промотора, последовательность оснований, простирающаяся между соответствующими генами, может включать свободно выбранную последовательность оснований, при условии, что возможна экспрессия индивидуальных генов. Последовательность оснований, простирающаяся между соответствующими генами, может включать последовательность оснований, кодирующую саморасщепляемый пептид (пептид 2А), или последовательность оснований, кодирующую 1RES, или может включать последовательность оснований, кодирующую пептид 2А. Эффективная экспрессия соответствующих генов обеспечивается посредством связывания многих генов с такой последовательностью оснований. Межгенная последовательность оснований, которая может включать последовательность оснований, кодирующую саморасщепляемый пептид (пептид 2А) или IRES, может представлять собой последовательность оснований, простирающуюся между геном, кодирующим IL-7, и геном, кодирующим CCL19, или последовательность оснований, простирающуюся между геном, кодирующим молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и геном, кодирующим IL-7, или последовательность оснований, простирающуюся между геном, кодирующим молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и геном, кодирующим CCL19, или последовательность оснований, простирающуюся между геном, кодирующим альфа-цепь, и геном, кодирующим бета-цепь, в альфа-бета TCR, или последовательность оснований, простирающуюся между геном, кодирующим гамма-цепь, и геном, кодирующим дельта-цепь, в гамма-дельта TCR. То есть, каждая из данных межгенных областей может включать последовательность оснований, кодирующую саморасщепляемый пептид (пептид 2А) или IRES, если это желательно.

Пептид 2А представляет собой саморасщепляемый пептид из вируса. В случае аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 7, данный пептид имеет такую характеристику, что связь между G и Ρ (в положении, которое находится на расстоянии одного основания от С-конца) в данной аминокислотной последовательности расщепляется в эндоплазматическом ретикулуме (Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther. 5(5):627-638 (2005)). Таким образом, нуклеиновые кислоты, расположенные до и после пептида 2А, будут независимо экспрессироваться в клетке.

Пептид 2А может представлять собой пептид 2А из пикорнавируса, ротавируса, вируса насекомых, вируса ящура или вируса трипаносомы, или пептид 2А (F2A) из пикорнавируса, указанный в SEQ ID NO: 8.

Вектор, используемый для введения гена в иммунореактивную клетку, может быть линейным или кольцевым и может представлять собой невирусный вектор, такой как плазмида, вирусный вектор или транспозоновый вектор. Вектор, используемый для введения гена в иммунореактивную клетку, может включать одну или более чем одну регуляторную последовательность, такую как промотор или терминатор, или последовательность селективного маркера, такую как ген лекарственной устойчивости или репортерный ген. При экспрессии гена может использоваться промотор, содержащийся в векторе даже после введения гена в иммунореактивную клетку. Например, посредством размещения функциональным образом одного или более чем одного гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, гена, кодирующего IL-7, или гена, кодирующего CCL19, ниже последовательности промотора в векторе данные гены могут эффективно транскрибироваться.

Примеры данного промотора включают промоторы от вирусов, такие как промотор LTR ретровируса, ранний промотор SV40, промотор цитомегаловируса и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса, и промоторы от млекопитающих, такие как промотор фосфоглицераткиназы (PGK), промотор Xist, промотор β-актина, промотор РНК-полимер азы II и промотор гена фактора элонгации полипептидной цепи. Также можно использовать отвечающий на тетрациклин промотор, индуцируемый тетрациклином, промотор Mxl, индуцируемый интерфероном или тому подобные. Посредством применения промотора, который индуцируется конкретным веществом, можно регулировать экспрессия гена, подвергающегося транскрипционной регуляции данным промотором (например, одного или более чем одного гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, гена, кодирующего IL-7, или гена, кодирующего CCL19) согласно ходу лечения рака.

Примеры вирусного вектора включают ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор и вектор на основе аденосателлитного вируса. Примеры ретровирусного вектора включают вектор pMSGV (Tamada К. et al., Clin. Cancer Res. 18:6436-6445 (2002)) и вектор pMSCV (изготовленный Takara Bio Inc.). Применение ретровирусного вектора обеспечивает стабильную экспрессию введенного гена в течение длительного времени, так как введенный ген интегрируется в геном клетки-хозяина.

Экспрессию молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, IL-7 и CCL19 в иммунореактивной клетке можно определять, например, проточной цитометрией, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) или вестерн-блоттингом. Введение генов, кодирующих данные молекулы, можно подтвержать проверкой продуктов экспрессии, как описано выше, или посредством применения, например, норзерн-блоттинга, саузерн-блоттинга или ПЦР (полимеразная цепная реакция), такого как ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией). Когда вектор, используемый для введения гена, включает маркерный ген, введение данного гена можно подтверждать посредством проверки экспрессии маркерного гена, вставленного в экспрессионный вектор.

Иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию может дополнительно экспрессировать суицидный ген, такой как ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-TK) или индуцибельной каспазы 9, таким образом, чтобы обеспечивать индукцию апоптоза. Гены данных ферментов могут быть введены в иммунореактивную клетку (например, в геном иммунореактивной клетки) согласно такому способу, как способы, описанные выше. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая суицидный ген, может быть включена в вектор, вмещающий по меньшей мере один ген, кодирующий молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, ген, кодирующий IL-7, или ген, кодирующий CCL19, или в отдельный вектор из вышеупомянутого вектора, и введена в иммунореактивную клетку.

Суицидный ген означает ген, имеющий такую функцию, что, при экспрессии гена, данный ген непосредственно или вторично индуцирует вещество, имеющее цитотоксическую активность, и вызывает гибель клетки, которая экспрессировала данный суицидный ген. При обеспечении включения нуклеиновой кислоты, кодирующей суицидный ген, в иммунореактивную клетку агент, который активирует функцию данного суицидного гена, может вводиться согласно ходу лечения рака (например, вводиться при исчезновении опухоли), и количество иммунореактивных клеток А согласно настоящему раскрытию, которые присутствуют в живом организме, может быть уменьшено, или они могут быть устранены.

Примеры суицидного гена включают ген, кодирующий тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-TK) или индуцибельную каспазу 9, описанные в следующих документах, и агент, который активирует функцию данного суицидного гена, представляет собой, например, ганцикловир для HSV-TK или АР1903, который представляет собой соединение, индуцирующее димеризацию (химическая индукция димеризации (CID)) в отношении индуцибельной каспазы 9 (см. Cooper L. J, et. al., Cytotherapy, 2006; 8(2): 105-17, Jensen M. С. et. al., Biol Blood Marrow Transplant, 2010 Sep; 16(9): 1245-56, Jones B. S. Front Pharmacol. 2014 Nov 27; 5: 254., Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel) 2015 May 8; 8(2): 230-49, Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015 Aug 25; 6: 174).

Ингибитор иммуносупрессии

Термин «ингибитор иммуносупрессии» относится к веществу, которое отменяет или уменьшает подавление активации иммунореактивных клеток. Подавление активации иммунореактивных клеток происходит, например, из-за следующего: подавление ассоциации цитотоксической Т-клетки или хелперной Т-клетки с дендритной клеткой, вызванное связыванием регуляторной Т-клетки (Treg) с дендритной клеткой; подавление активации цитотоксической Т-клетки, хелперной Т-клетки или тому подобного, вызванное секрецией подавляющего цитокина, такого как TGF-p (трансформирующий фактор-бета) или IL-10 (интерлейкин-10), или такого цитотоксического вещества, как перфорин или гранзим, из Treg; или подавление активации цитотоксических Т-клеток, вызванное иммунологической контрольной точкой, осуществляемое, например, взаимодействием между PD-1 и PD-L1 или взаимодействием между CTLA-4 (антиген-4 цитотоксических Т-лимфоцитов) и CD80/CD86. Ингибитор иммуносупрессии представляет собой вещество, которое отменяет подавление активации иммунореактивных клеток, таких как клетки, описанные выше, и посредством этого обеспечивает активацию иммунореактивной клетки.

Примеры ингибитора иммуносупрессии включают ингибитор иммунологической контрольной точки, молекулярное таргетное лекарственное средство, которое ингибирует инфильтрацию, выживание или функцию иммуносупрессивной клетки, такой как Treg или клетка-супрессор, происходящая из миелоида (MDSC), ингибитор CCR4, ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), ингибитор простагландина Е2 [PGE2] и цитотоксическое противораковое средство.

Ингибитор иммуносупрессии может представлять собой антитело, при условии, что данное антитело имеет вышеописанную функцию, и может представлять собой, например, моноклональное антитело IgG или фрагмент антитела.

Ингибитор иммунологической контрольной точки типично представляет собой вещество, которое отменяет или ослабляет иммуносупрессивный механизм, который работает через молекулу иммунологической контрольной точки, которая экспрессируется на поверхности Т-клетки. Ингибитор иммунологической контрольной точки может уменьшать реакцию подавления иммунного ответа, например, посредством связывания с молекулой иммунологической контрольной точки (например, PD-1, CTLA-4, BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), TIM-3 (Т-клеточный белок, содержащий иммуноглобулин- и муцин-домены - 3), TIGIT или LAG-3) или с лигандом молекулы иммунологической контрольной точки (например, PD-L1, PD-L2, CD80/CD86 или Siglec-15 (Ig-подобный лектин, связывающий сиаловую кислоту - 15)), с ингибированием инициации трансдукции сигнала от молекулы иммунологической контрольной точки, запущенной данным лигандом.

Молекулярное таргетное лекарственное средство, которое ингибирует инфильтрацию, выживание или функцию иммуносупрессивной клетки, такой как Treg или MDSC, может ослаблять иммуносупрессию в раковом микроокружении, например, посредством ингибирования тирозинкиназы и, посредством этого, уменьшая уровень Treg, инфильтруемых в раковую ткань.

Ингибитор CCR4 может ослаблять иммуносупрессию в раковом микроокружении посредством ингибирования функции рецептора хемокина CCR4 в показателях связывания друг с другом Treg.

Ингибитор IDO может уменьшать индуцированную кинуренином активацию Treg посредством ингибирования ферментативной активности IDO или ингибирования экспрессии IDO и, посредством этого, уменьшая продукцию кинуренина.

Ингибитор PGE2 может ослаблять иммуносупрессию в раковом микроокружении посредством подавления увеличения иммуносупрессивного действия Treg, вызванного связыванием PGE2 с рецептором ЕР4 простагландина, присутствующим на поверхности Treg.

Цитотоксическое противораковое средство может уменьшать подавление иммунного ответа посредством уменьшения числа иммуносупрессивных клеток, таких как Treg.

Примеры ингибитора иммунологической контрольной точки включают ингибитор PD-1, ингибитор PD-L1, ингибитор CTLA-4, ингибитор CD47, ингибитор SIRPa, ингибитор BTLA, ингибитор TIM-3, ингибитор TIGIT, ингибитор LAG-3, ингибитор Siglec-15 и ингибитор галектина-9. Примеры молекулярного таргетного средства, которое ингибирует инфильтрацию, выживание или функцию иммуносупрессивной клетки, такой как Treg или MDSC, включают сорафениб и сунитиниб. Примеры ингибитора CCR4 включают антитело против CCR4 (например, могамулизумаб). Примеры ингибитора IDO включают эпакадостат. Примеры ингибитора простагландина Е2 [PGE2] включают аспирин. Примеры цитотоксического противоракового средства включают циклофосфамид и гемцитабин.

Ингибитор иммуносупрессии может включать по меньшей мере один ингибитор, выбранный из группы, состоящей из ингибитора PD-1, ингибитора PD-L1, ингибитора PD-L2, ингибитора CTLA-4, ингибитора BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), ингибитора TIM-3 (иммуноглобулин и домен 3 муцина Т-клетки), ингибитора TIGIT (иммунорецептор Т-клетки с доменами Ig и IТIМ (иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив)), ингибитора LAG-3 (ген-3 активатора лимфоцитов) и ингибитора Siglec-15.

Ингибитор иммуносупрессии в комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию может представлять собой ингибитор иммунологической контрольной точки, более конкретно ингибитор PD-1 или ингибитор PD-L1 и еще более конкретно антитело против PD-1 или антитело против PD-L1. Примеры антитела против PD-1 включают ниволумаб, пембролизумаб, торипалимаб, цемиплимаб-rwlc и синтилима. Примеры антитела против PD-L1 включают атезолизумаб, дурвалумаб и авелумаб. Примеры антитела против CTLA-4 включают ипилимумаб. Дополнительные примеры включают антитело к CD47 и антитело к SIRPα.

В комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию допустимо, что экспрессия IL-7 и CCL19, помимо молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, осуществляется посредством действия иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию, а дополнительное включение ингибитора иммуносупрессии не только оказывает эффект подавления рака из-за молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, но также дает эффект в отношении уменьшения иммуносупрессии в раковом микроокружении на основе комбинации IL-7, CCL19 и ингибитора иммуносупрессии, и, дополнительно, в отношении индукции эндогенных цитотоксических Т-клеток и тому подобного поблизости от раковых клеток и активации эндогенных цитотоксических Т-клеток и тому подобного. По этой причине комбинированное лекарственное средство А согласно настоящему раскрытию дает улучшенный терапевтический эффект против рака, который не может быть получен в случае введения одной иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию без введения ингибитора иммуносупрессии или в случае совместного введения ингибитора иммуносупрессии и иммунореактивной клетки, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, но не экспрессирует IL-7 или CCL19.

Терапевтический эффект против рака можно оценивать, например, посредством уменьшения числа опухолевых клеток, уменьшения размера опухоли, исчезновения опухоли или уменьшения опухолевой нагрузки у субъекта, который, например, представляет собой млекопитающее животное, такое как человек.

Поскольку ингибитор иммуносупрессии, в общем, активирует действие иммунореактивных клеток в иммуносупрессивном микроокружении вокруг раковой опухоли, данный ингибитор иммуносупрессии улучшает активность атаки раковых клеток эндогенными иммунореактивными клетками, а также иммунореактивной клеткой А согласно настоящему раскрытию. Следовательно, когда ингибитор иммуносупрессии представляет собой, например, ингибитор иммунологической контрольной точки, нацеленный на специфическую молекулу, для иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию не обязательно экспрессировать молекулу-мишень на ее клеточной поверхности; иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию может экспрессировать или может не экспрессировать молекулу-мишень.

В настоящем раскрытии термин «антитело» относится не только к молекуле полного антитела, но также может относиться к фрагменту молекулы антитела, которая сохраняет способность к связыванию с антигеном. Такой фрагмент антитела также известен в данной области и обычно используется in vitro, а также in vivo. Следовательно, термин «антитело» в том виде, как он здесь используется, относится к понятию, которое охватывает не только полную молекулу иммуноглобулина, но также F(ab')2 и Fab, которые представляют собой известные функциональные фрагменты антител. В настоящем раскрытии объем понятия «антитело» охватывает полное природное антитело, биспецифичное антитело, химерное антитело, Fab, Fab', одноцепочечное антитело (scFv), слитый полипептид и нетрадиционное антитело.

В настоящем раскрытии одноцепочечное антитело (scFv) представляет собой слитый белок вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) иммуноглобулина, которые ковалентно связаны с образованием гетеродимера VH::VL. Тяжелая цепь (VH) и легкая цепь (VL) связаны непосредственно, или N-конец VH и С-конец VL связаны через пептидный линкер, или С-конец VH и N-конец VL связаны через пептидный линкер. Длина данного пептидного линкера составляет, например, 10 аминокислот, 15 аминокислот, 20 аминокислот или 25 аминокислот. Данный пептидный линкер обычно обогащен глицином, что способствует гибкости, и серином или треонином, что способствует растворимости. Даже если удаляется константная область и включается пептидный линкер, белок scFv все еще имеет специфичность связывания антигена, которую имел исходный иммуноглобулин. Как описано в Huston et al., (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988), scFv может экспрессироваться от нуклеиновой кислоты, которая включает последовательность, кодирующую VH, и последовательность, кодирующую VL. По отношению к scFv также можно дать ссылку патентов США № 5091513, 5132405 и 4956778, и публикаций патентных заявок США № 2005/0196754 и 2005/0196754.

Антитело для применения в качестве ингибитора иммунологической контрольной точки может представлять собой моноклональное антитело IgG, фрагмент Fab, scFv или другое антитело, или фрагмент антитела, при условии, что данное антитело или фрагмент антитела имеет требующееся антигенсвязывающее свойство. scFv, например, может быть получен способом, включающим получение клона мышиной гибридомы и затем превращения полного IgG (или IgM) до scFv, способом, включающим получение scFv иммунизированного фагового дисплея и затем осуществление скрининга библиотеки с использованием антигена, или способом, включающим прямое получение scFv посредством скрининга готовой библиотеки фагового дисплея scFv с использованием антигена.

Антитело, полученное от животного (например, мыши), отличного от человека, может индуцировать иммунный ответ при введении человеку. При рассмотрении этого такое антитело можно использовать после модификации до химерного антитела, полученного заменой гена невариабельной части антитела геном человеческого антитела посредством рекомбинации, или до гуманизированного антитела, полученного заменой части, отличной от областей, определяющих комплементарность (CDR) геном человеческого антитела посредством реомбинации. Кроме того, полностью гуманизированное антитело может быть получено с использованием фагового дисплея или генетически модифицированной мыши, которая продуцирует человеческое антитело, а не создания мыши или тому подобных, продуцирующих антитело.

Вводимая композиция

В комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию вводимая композиция, которая включает иммунореактивную клетку А согласно настоящему раскрытию (ниже также именуемая «первая вводимая композиция»), может дополнительно включать фармацевтически приемлемую добавку, и примеры данной добавки включают физиологический раствор, буферизованный физиологический раствор, среду культуры клеток, декстрозу, воду для инъекции, глицерин, этанол и их комбинации, стабилизатор, солюбилизатор, поверхностно-активное вещество, буферизующий агент, консервант, изотоничный агент, наполнитель и смазку.

В комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию вводимая композиция, которая включает ингибитор иммуносупрессии (ниже также именуемая «вторая вводимая композиция»), может дополнительно включать фармацевтически приемлемую добавку, и примеры данной добавки включают физиологический раствор, буферизованный физиологический раствор, среду культуры клеток, декстрозу, воду для инъекции, глицерин, этанол и их комбинации, стабилизатор, солюбилизатор, поверхностно-активное вещество, буферизующий агент, консервант, изотоничный агент, наполнитель и смазку.

Вторая вводимая композиция может представлять собой такую же композицию, что и первая вводимая композиция, причем в данном случае одна вводимая композиция включает и иммунореактивную клетку А согласно настоящему раскрытию, и ингибитор иммуносупрессии.

Когда вторая вводимая композиция представляет собой композицию, которая является отдельной от первой вводимой композиции, первая вводимая композиция и вторая вводимая композиция могут вводиться совместно или могут вводиться в разное время (разные моменты времени), как описано выше. Другими словами, иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию и ингибитор иммуносупрессии могут вводиться совместно или могут вводиться раздельно в разное время.

Количество иммунореактивных клеток А согласно настоящему раскрытию, содержащихся в первой вводимой композиции, можно корректировать, сообразно обстоятельствам, согласно, например, типу, положению или тяжести рака, или возрасту, массе тела или состоянию субъекта, подлежащего лечению. Количество иммунореактивных клеток А согласно настоящему раскрытию, содержащихся в первой вводимой композиции, например, составляет от 1×10⁴ до 1×10^й клеток, более конкретно - от 1×10⁵ до 1×10¹⁰ клеток и еще более конкретно - от 1×10⁶ до 1×10⁹ клеток на одно введение. Кроме того, количество иммунореактивных клеток А согласно настоящему раскрытию может быть малым, как, например, меньше, чем 1х10^б клеток, например, от 1×10⁵ до 5×10⁵ клеток и более конкретно от 1,5×10⁵ до 4×10⁵ клеток на одно введение.

Как описано выше, рак, который трудно лечить в случае применения одних иммунореактивных клеток А согласно настоящему раскрытию или в случае применения одного ингибитора иммуносупрессии, можно лечить с использованием комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию. Следовательно, количество иммунореактивных клеток А согласно настоящему раскрытию, содержащихся в первой вводимой композиции, может быть таким малым количеством, при котором одиночное применение такого же количества (такого числа клеток) иммунореактивных клеток А согласно настоящему раскрытию не оказывало бы противоракового эффекта. Нижняя граница количества данных иммунореактивных клеток А конкретно не ограничивается, при условии, что данное количество иммунореактивных клеток А способно оказывать противораковый эффект на основе синергического эффекта с ингибитором иммуносупрессии.

Первая вводимая композиция может вводиться с частотой четыре раза в сутки, три раза в сутки, дважды в сутки, один раз в сутки, один раз в двое суток, один раз в каждые третьи сутки, один раз в каждые четвертые сутки, один раз в каждые пятые сутки, один раз в каждые шестые сутки, один раз в неделю, один раз в каждые восьмые сутки, один раз в каждые девятые сутки, один раз в каждые десятые сутки, дважды в неделю, один раз в месяц или дважды в месяц. Кроме того, число введений может составлять, например, всего от 1 до 10, в частности, всего 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Также допустимо введение больше, чем 10 раз.

Количество ингибитора иммуносупрессии, содержащегося во второй вводимой композиции, можно корректировать, сообразно обстоятельствам, согласно, например, типу, положению или тяжести рака, или возрасту, массе тела или состоянию субъекта, подлежащего лечению. Доза ингибитора иммуносупрессии, например, составляет от 0,1 до 500 мг/кг, более конкретно от 0,5 до 250 мг/кг и более конкретно от 1 до 100 мг/кг на одно введение.

Вторая вводимая композиция может вводиться с частотой четыре раза в сутки, три раза в сутки, дважды в сутки, один раз в сутки, один раз в каждые двое суток, один раз в каждые третьи сутки, один раз в каждые четвертые сутки, один раз в каждые пятые сутки, один раз в каждые шестые сутки, один раз в неделю, один раз в каждые восьмые сутки, один раз в каждые девятые сутки, один раз в каждые десятые сутки, дважды в неделю, один раз в месяц или дважды в месяц. Кроме того, число введений может составлять, например, всего от 1 до 30, в частности, всего 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или от 11 до 30. Также допустимо введение больше, чем 30 раз.

Связь между расписанием введения первой вводимой композиции и расписанием введения второй вводимой композиции конкретно не ограничивается. Сперва может начинаться введение первой вводимой композиции, или сперва может начинаться введение второй вводимой композиции, или введение первой вводимой композиции и введение второй вводимой композиции может начинаться в то же самое время. Нет конкретного ограничения по связи между числом или частотой введений соответствующих вводимых композиций.

Первая вводимая композиция и вторая вводимая композиция может представлять собой ту же самую композицию, причем в данном случае предложена фармацевтичская композиция, которая включает и иммунореактивную клетку А по настоящему раскрытию, и ингибитор иммуносупрессии (комбинированное лекарственное средство). Когда первая вводимая композиция и вторая вводимая композиция в комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию представляют собой разные композиции, первая вводимая композиция и вторая вводимая композиция могут вводиться в то же самое время или могут вводиться в разное время (т.е. с интервалом). С точки зрения эффективного получения синергического эффекта иммунореактивной клетки А по настоящему раскрытию и ингибитора иммуносупрессии интервал между расписанием введения первой вводимой композиции и расписанием введения второй вводимой композиции (интервал между расписанием введения одной из вводимых композиций и расписанием введения другой вводимой композиции, причем данное расписание является ближайшим по времени к вышеизложенному расписанию) может составлять 3 месяца или менее, 2 месяца или менее, 1 месяц или менее или 2 недели или менее. Данный интервал может составлять 1 неделю или менее, или 3 суток или менее. Поскольку иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию поддерживается в живом организме в течение длительного времени, как продемонстрировано в Примерах, описанных позднее, данный интервал не должен быть слишком коротким.

В комбинированном лекарственном средстве А по настоящему раскрытию иммунореактивная клетка А согласно настоящему раскрытию и ингибитор иммуносупрессии могут вводиться в независимые моменты времени (например, в разное время), как описано выше. Кроме того, подразумевается то, что в настоящем раскрытии значение термина «совместное введение» и термина «комбинированное применение» охватывает случай, при котором многие агенты включаются в ту же самую композицию и вводятся, случай, при котором многие агенты включаются в отдельные композиции, но вводятся в то же самое время, и случай, при котором многие агенты включаются в отдельные композиции и вводятся в разное время.

Как описано выше, комбинированное лекарственное средство А согласно настоящему раскрытию оказывает неожиданно улучшенный терапевтический эффект против рака из-за синергического эффекта, оказываемого комбинацией факторов: секретируемые IL-7 и CCL19, иммунореактивная клетка, экспрессирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и ингибитор иммуносупрессии.

Первая вводимая композиция может вводиться субъекту, нуждающемуся в лечении рака, с использованием способа, известного специалистам в данной области, и может вводиться, например, посредством перорального введения, местной инфузии или инъекции (включая инфузию катетером), системной инфузии или инъекции, внутривенной инфузии или инъекции, или парентерального введения (например, чрескожного введения или введения через слизистую, более конкретно, назального, глазного, подъязычного или посредством суппозитория, посредством пластыря или тому подобного). Первая вводимая композиция может быть приготовлена в форме (раствор, суспензионная жидкость или эмульсионная жидкость), допускающей инфузию или инъекцию единичной дозы с точки зрения удобства в обращении. Более конкретные примеры способов введения включают внутривенную инъекцию, внутриопухолевую инъекцию, внутрикожную инъекцию, подкожную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутриартериальную инъекцию, интрамедуллярную инъекцию, внутрисердечную инъекцию, внутрисуставную инъекцию, инъекцию в синовиальную жидкость, внутричерепную инъекцию, подоболочечную инъекцию и субарахноидальную инъекцию (инъекцию в спинномозговую жидкость).

Вторая вводимая композиция может вводиться субъекту, нуждающемуся в лечении рака, с использованием способа, известного специалистам в данной области, и может вводиться, например, посредством местной инфузии или инъекции (включая инфузию катетером), системной инфузии или инъекции, внутривенной инфузии или инъекции, или парентерального введения (например, чрескожного введения или введения через слизистую, более конкретно, назального, глазного, подъязычного или посредством суппозитория, посредство пластыря или тому подобного). Вторая вводимая композиция может быть приготовлена в форме (раствор, суспензионная жидкость или эмульсионная жидкость), допускающей инфузию или инъекцию единичной дозы с точки зрения удобства в обращении. Более конкретные примеры способов введения включают внутривенную инъекцию, внутриопухолевую инъекцию, внутрикожную инъекцию, подкожную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутриартериальную инъекцию, интрамедуллярную инъекцию, внутрисердечную инъекцию, внутрисуставную инъекцию, инъекцию в синовиальную жидкость, внутричерепную инъекцию, подоболочечную инъекцию и субарахноидальную инъекцию (инъекцию в спинномозговую жидкость).

После получения в качестве отправной точки иммунореактивной клетки или ее клетки-предшественника от пациента, который является субъектом лечения, и введения в нее требующихся генов для превращения данной клетки в иммунореактивную клетку А согласно настоящему раскрытию, иммунореактивную клетку А согласно настоящему раскрытию можно вводить тому же самому пациенту (аутологичное введение) или другому пациенту (аллогенное введение). В качестве альтернативы, иммунореактивную клетку или ее клетку-предшественника в качестве отправной точки можно получать из плюрипотентной стволовой клетки, такой как клетка iPS (индуцированная стволовая клетка) или клетка ES (эмбриональная стволовая клетка), или соматической стволовой клетки, такой как гематопоэтическая стволовая клетка.

Первая вводимая композиция и вторая вводимая композиция может вводиться в виде стерильного жидкого препарата, который может быть буферизован до предписанного рН, такого как изотоничный водный раствор, суспензионная жидкость, эмульсионная жидкость, дисперсионная жидкость или вязкая композиция. Данный жидкий препарат может представлять собой жидкий препарат для инъекции. Данный жидкий препарат может находиться в виде вязкой композиции, имеющей вязкость в пределах подходящего интервала вязкости таким образом, чтобы увеличивать продолжительность контакта с точно определенной тканью. Данный жидкий препарат может включать растворитель или диспегирующую среду, выбранную, например, из воды, физиологического раствора, фосфатно-солевого буферного раствора, полиола (например, глицерин, пропиленгликоль или жидкий полиэтиленгликоль) или их комбинации.

Данный жидкий препарат может быть получен посредством добавления иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию и/или ингибитора иммуносупрессии в подходящее количество подходящего растворителя, совместно с разными количествами других компонентов. Данный жидкий препарат может включать подходящий носитель, разбавитель или эксципиент. Данный жидкий препарат может быть лиофилизированным. Данный жидкий препарат может дополнительно включать разные вспомогательные агенты, в зависимости от желательного пути введения, и примеры данных вспомогательных агентов включают увлажнители, диспергенты или эмульгаторы (например, метилцеллюлозу), буферизующие агенты, гелеобразующие агенты или усилители вязкости, консерванты, корригенты и красители. В том, что касается компонентов, которые могут быть включены в данный жидкий препарат, можно привести в качестве ссылки "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17-ое издание (1985).

Данный жидкий препарат может дополнительно включать разные добавки, которые увеличивают стабильность и стерильность данного жидкого препарата, примеры которых включают антимикробные консерванты, антиоксиданты, хелаторы и буферы. Можно использовать разные антибактериальные средства и противогрибковые средства, такие как парабены, хлорбутанол, фенол и сорбиновая кислота, для предупреждения действия микроорганизмов. Носители, разбавители и добавки для применения в жидком препарате должны иметь совместимость с иммунореактивной клеткой А по настоящему раскрытию и/или ингибитором иммуносупрессии, содержащимся в данном жидком препарате.

Данный жидкий препарат может быть изотоничным с кровью. Изотоничность может достигаться посредством обеспечения включения в жидкий препарат хлорида натрия или другого фармацевтически приемлемого регулирующего осмотичность вещества (например, декстроза, борная кислота, тартрат натрия, пропиленгликоль или другое неорганическое или органическое растворенное вещество).

Комбинированное лекарственное средство А по настоящему раскрытию может дополнительно включать другое противораковое средство, помимо иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию и ингибитора иммуносупрессии. Примеры других противораковых средств включают алкилирующие агенты, такие как бендамустин, ифосфамид и дакарбазин, антиметаболиты, такие как пентостатин, флударабин, кладрибин, метотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин и эноцитабин, молекулярные таргентные лекарственные средства, такие как ритуксимаб, цетуксимаб и трастузумаб, ингибиторы киназы, такие как иматиниб, гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, дасатиниб, сунитиниб и траметиниб, ингибиторы протеасомы, такие как бортезомиб, ингибиторы кальциневрина, такие как циклоспорин и такролимус, противораковые антибиотики, такие как идарубицин, доксорубицин и митомицин С, растительные алкалоиды, такие как иринотекан и этопозид, лекарственные средства, содержащие платину, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин, средства гормональной терапии, такие как тамоксифен и бикалутамид, и средства иммунного контроля, такие как интерферон. Другое противораковое средство может включать по меньшей мере одно из алкилирующего средства и антиметаболита.

Лечение рака с использованием комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию

В случае применения комбинированного лекарственного средства А по настоящему раскрытию в лечении рака субъект, подлежащий лечению, может представлять собой, например, любое млекопитающее животное. Субъект, подлежащий лечению, представляет собой, например, животное-примата и более конкретно может представлять собой человека. Субъект, подлежащий лечению, в качестве альтернативы, может представлять собой домашнее животное или сельскохозяйственное животное, примеры которых включают собаку, кошку, свинью, крупный рогатый скот, лошадь, овцу и козу.

Раковое заболевание, подлежащее лечению, может представлять собой либо солидное раковое заболевание, либо рак крови, и их примеры включают такие раковые заболевания, как аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома, аденоплоскоклеточная карцинома, недифференцированная карцинома, крупноклеточная карцинома, мелкоклеточная карцинома, рак кожи, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак вагины, рак шейки матки, рак матки, рак печени, рак почки, рак поджелудочной железы, рак селезенки, рак легкого, рак трахеи, бронхиальная карцинома, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, рак желудка, рак пищевода, рак желчного пузыря, рак яичка и рак яичника; раковые заболевания костной ткани, ткани хряща, жировой ткани, мышечной ткани, сосудистой ткани и гематопоэтической ткани; саркомы, такие как хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная саркома сосудистого эндотелия, злокачественная шваннома, остеосаркома и саркома мягкой ткани; бластомы, такие как гепатобластома, медуллобластома, нефробластома, нейробластома, панкреатобластома, плевролегочная бластома и ретинобластома; герминома; лимфома и лейкоз.

Поскольку комбинированное лекарственное средство А по настоящему раскрытию способно уменьшать иммуносупрессию в раковом микроокружении, рак, подлежащий лечению, не ограничивается раком клеток крови, и комбинированное лекарственное средство А также оказывает терапевтический эффект против солидного рака. Следовательно, комбинированное лекарственное средство А имеет высокую эффективность даже против солидного рака, который трудно лечить традиционными способами.

В ситуации, при которой подозревают присутствие раковых клеток у субъекта, комбинированное лекарственное средство А по настоящему раскрытию можно вводить субъекту профилактически перед тем, как делается доказательный диагноз рака. В настоящем раскрытии такой способ применения также включается в идею применения в лечении рака.

Способ лечения рака у субъекта

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен способ лечения рака у субъекта (ниже также именуемый «способ лечения рака А согласно настоящему раскрытию»), который включает введение в комбинации следующего:

(а) иммунореактивная клетка, экспрессирующая IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и

(б) ингибитор иммуносупрессии.

Иммунореактивная клетка в способе лечения рака А согласно настоящему раскрытию представляет собой иммунореактивную клетку А согласно настоящему раскрытию, и вышеописанное объяснение относительно иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к подробной конфигурации и примерам иммунореактивной клетки в способе лечения рака А согласно настоящему раскрытию. Также описанное выше объяснение относительно ингибитора иммуносупрессии в комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к подробной конфигурации и примерам ингибитора иммуносупрессии в способе лечения рака А согласно настоящему раскрытию.

Кроме того, объяснение относительно комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к особенностям способа лечения в способе лечения рака А согласно настоящему раскрытию, таким как субъект, тип рака, доза и схема введения. Например, (а) иммунореактивная клетка и (б) ингибитор иммуносупрессии могут вводиться в то же самое время или вводиться в разное время. Каждый из (а) иммунореактивной клетки и ингибитора иммуносупрессии (б) может вводиться в терапевтически эффективном количестве.

Из-за синергического эффекта, оказываемого комбинацией факторов ингибитора иммуносупрессии и иммунореактивной клетки, экспрессирующей IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, способ лечения рака А согласно настоящему раскрытию дает неожиданно улучшенный терапевтический эффект против рака.

Кроме того, согласно настоящему раскрытию предложено применение (а) иммунореактивной клетки, экспрессирующей IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и (б) ингибитора иммуносупрессии в изготовлении лекарственного средства для лечения рака. Также в данном применении объяснение относительно комбинированного лекарственного средства А по настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к особенностям иммунореактивной клетки, ингибитора иммуносупрессии, вводимым композициям, лечению рака и тому подобному.

Кроме того, предложено лекарственное средство для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии согласно настоящему раскрытию в лечении рака у субъекта, причем данное лекарственное средство включает иммунореактивную клетку, экспрессирующую IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген. Данное лекарственное средство, включающее иммунореактивную клетку А согласно настоящему раскрытию дает синергический эффект и обеспечивает неожиданно улучшенный терапевтический эффект против рака при применении в комбинации с ингибитором иммуносупрессии. Вышеописанное объяснение относительно комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к особеностям иммунореактивной клетки, ингибитора иммуносупрессии, вводимым композициям, лечения рака и тому подобному. Кроме того, предложена иммунореактивная клетка для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии при лечении рака у субъекта, экспрессирующая IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

Согласно настоящему раскрытию также предложено лекарственное средство, включающее ингибитор иммуносупрессии, для комбинированного применения с иммунореактивной клеткой, экспрессирующей IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, в лечении рака у субъекта. Данное лекарственное средство, включающее ингибитор иммуносупрессии, дает синергический эффект и обеспечивает неожиданно улучшенный терапевтический эффект против рака при применении в комбинации с иммунореактивной клеткой А согласно настоящему раскрытию. Вышеописанное объяснение относительно комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к особенностям иммунореактивной клетки, ингибитора иммуносупрессии, вводимых композиций, лечения рака и тому подобного. Также предложен ингибитор иммуносупрессии для комбинированного применения с иммунореактивной клеткой, экспрессирующей IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, при лечении рака у субъекта.

Согласно настоящему раскрытию также предложено лекарственное средство, которое включает иммунореактивную клетку, экспрессирующую IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и которое содержится в контейнере, несущем указание с инструкцией для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии. Вышеописанное объяснение относительно комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к особенностям иммунореактивной клетки, ингибитора иммуносупрессии и тому подобного. Объяснение относительно вышеупомянутой первой вводимой композиции применяется в сложившихся условиях к особенностям конфигурации лекарственного средства. Контейнер, несущий указание с инструкцией для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии, может представлять собой такой контейнер, как флакон, мешок для внутривенной инъекции, мешок для консервации клеток или инфузионный мешок, к которому прикрепляются указания по применяемому способу, или такой контейнер, как пробирка Эппендорфа, к которой прикрепляются указания по применяемому способу. В таком контейнере содержится лекарственное средство, включающее иммунореактивную клетку А по настоящему раскрытию, например, в состоянии, описанном в приведенном выше описании относительно первой вводимой композиции. Указание инструкции для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии может быть присоединено к любой поверхности данного контейнера и может быть присоединено к наружной поверхности данного контейнера с учетом видимости. Также рассматривается конфигурация, при которой указание с инструкцией присоединяется к оболочке, такой как коробка, которая вмещает один или более чем один контейнер, вместо прикрепления к самому контейнеру. Кроме того, указание с инструкцией для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии не ограничивается указанием, в котором дается прямая инструкция по комбинированному применению с ингибитором иммуносупрессии, и может представлять собой любое указание, которое относится к возможности комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии.

Согласно настоящему раскрытию также предложен продукт, включающий (1) этикетку, описывающую инструкцию для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии, и (2) контейнер, содержащий лекарственное средство, включающее иммунореактивную клетку, экспрессирующую IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген. Вышеописанное объяснение относительно комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к особенностям иммунореактивной клетки, ингибитора иммуносупрессии и тому подобному. Объяснение относительно вышеупомянутой первой вводимой композиции применяется в сложившихся условиях к особенностям конфигурации лекарственного средства. Контейнер, содержащий иммунореактивную клетку А согласно настоящему раскрытию, может представлять собой такой контейнер, как флакон, мешок для внутривенной инъекции, мешок для консервации клеток или инфузионный мешок, к которому прикрепляется указание по применяемому способу, или такой контейнер, как пробирка Эппендорфа, к которой прикрепляется указание по применяемому способу. В таком контейнере содержится лекарственное средство, включающее иммунореактивную клетку А по настоящему раскрытию, например, в состоянии, описанном в приведенном выше описании относительно первой вводимой композиции. Инструкция для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии, приведенная на этикетке, не ограничивается прямой инструкцией для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии и может представлять собой любую инструкцию, которая относится к возможности комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии.

Как описано выше, согласно одному аспекту настоящего раскрытия неожиданно улучшенный терапевтический эффект против рака может быть получен из-за синергического эффекта, оказываемого комбинацией ингибитора иммуносупрессии и иммунореактивной клеткой, экспрессирующей IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

Воплощения согласно настоящему раскрытию включают следующие воплощения:

1. Комбинированное лекарственное средство для применения в лечении рака у субъекта, включающее:

(а) иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген; и

(б) ингибитор иммуносупрессии.

2. Комбинированное лекарственное средство по п. 1, в котором иммунореактивная клетка и ингибитор иммуносупрессии вводятся раздельно в разное время.

3. Комбинированное лекарственное средство по п. 1 или 2, где ген, кодирующий интерлейкин-7, и ген, кодирующий CCL19, являются экзогенными, и оба данных гена интегрированы в геном иммунореактивной клетки или кодируются совместно или раздельно в одном или более чем одном векторе, присутствующем в иммунореактивной клетке.

4. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-3, в котором молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой химерный рецептор антигена (CAR) или рецептор Т-клетки (TCR).

5. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-4, в котором ингибитор иммуносупрессии включает по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из ингибитора PD-1, ингибитора PD-L1, ингибитора PD-L2, ингибитора CTLA-4, ингибитора BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), ингибитора TIM-3 (Т-клеточный белок, содержащий иммуноглобулин- и муцин-домены 3), ингибитора TIGIT (иммунорецептор Т-клетки с доменами Ig и ITIM), ингибитора LAG-3 (ген-3 активатора лимфоцитов) и ингибитора Siglec-15.

6. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-5, в котором ингибитор иммуносупрессии представляет собой антитело.

7. Комбинированное лекарственное средство по п. 6, в котором антитело представляет собой моноклональное антитело IgG или фрагмент антитела.

8. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-7, где раковое заболевание представляет собой солидный рак.

9. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-8, где иммунореактивная клетка происходит от самого субъекта.

10. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-9, где иммунореактивная клетка выбрана из группы, состоящей из лимфоцитарных клеток, таких как Т-клетки, природные клетки-киллеры (NK-клетки) и В-клетки, антигенпрезентирующие клетки, такие как моноциты, макрофаги и дендритные клетки, и нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки.

11. Лекарственное средство для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии в лечении рака у субъекта, включающее иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

12. Лекарственное средство для комбинированного применения с иммунореактивной клеткой, экспрессирующей интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, в лечении рака у субъекта, причем данное лекарственное средство включает ингибитор иммуносупрессии.

13. Лекарственное средство по п. 11 или 12 для применения в способе, при котором ингибитор иммуносупрессии и иммунореактивная клетка вводятся раздельно в разное время.

14. Лекарственное средство, включающее иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, причем данное лекарственное средство содержится в контейнере, несущем указание с инструкцией по комбинированному применению с ингибитором иммуноупрессии.

15. Продукт, включающий:

этикетку, описывающую инструкцию по комбинированному применению с ингибитором иммуносупрессии, и

контейнер, содержащий лекарственное средство, включающее иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

16. Фармацевтическая композиция для применения в лечении рака у субъекта, включающая:

(а) иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген; и

(б) ингибитор иммуносупрессии.

17. Фармацевтическая композиция по п. 16, в которой молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой химерный рецептор антигена (CAR) или рецептор Т-клетки (TCR).

18. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение данному субъекту следующего (а) и (б) в комбинации:

(а) иммунореактивная клетка, экспрессирующая IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и

(б) ингибитор иммуносупрессии.

19. Применение (а) иммунореактивной клетки, экспрессирующей IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и (б) ингибитора иммуносупрессии в изготовлении лекарственного средства для лечения рака.

Другие аспекты согласно настоящему раскрытию описываются ниже.

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложено комбинированное лекарственное средство для применения в лечении рака у субъекта (ниже также именуемое «комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию»), которое включает:

(а) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19; и

(б) ингибитор иммуносупрессии.

Здесь особенности интерлейкина-7, CCL19, нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и ингибитора иммуносупрессии, такие как определения, примеры, аминокислотные последовательности, последовательности оснований и предпочтительные воплощения в комбинированном лекарственном средстве В, соответственно, являются такими же, как особенности интерлейкина-7, CCL19, нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и ингибитора иммуносупрессии, такие как определения, примеры, аминокислотные последовательности, последовательности оснований и предпочтительные воплощения в иммунореактивной клетке А согласно настоящему раскрытию и комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию.

В настоящем раскрытии выражение «совместно включают» означает то, что в случае, при котором имеются многие элементы (например, многие клетки, многие носители для доставки нуклеиновых кислот или одна или более чем одна клетка и один или более чем один носитель для доставки нуклеиновых кислот), вещество, описанное как вещество, подлежащее включению (например, нуклеиновая кислота, кодирующая точно определенный полипептид), включается в по меньшей мере один из многих элементов, и не обязательно, что все из многих элементов включают данное вещество.

Другими словами, фраза «совместно включают» также может быть выражена как «включают как целое». Объем значения выражения «совместно включают» охватывает случай, при котором все многие вещества, описанные как вещества, подлежащие включению, включаются в одну клетку или носитель для доставки нуклеиновых кислот, и данная конфигурация также является предпочтительной конфигурацией.

Следовательно, в случае, при котором комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию включает клетку I и клетку II, может быть принята конфигурация, при которой клетка I включает нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, но не включает нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и при которой клетка II включает нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, но не включает нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7. Аналогично, в случае, при котором комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию включает носитель для доставки нуклеиновых кислот I и носитель для доставки нуклеиновых кислот II, может быть принята конфигурация, при которой носитель для доставки нуклеиновых кислот I включает нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, но не включает нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и при которой носитель для доставки нуклеиновых кислот II включает нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, но не включает нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7.

В качестве альтернативы, комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию может включать одну клетку или носитель для доставки нуклеиновых кислот, которые включают и нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

Термин «их комбинация» в выражении «один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинация, которая совместно включает нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19» относится к комбинации, которая представляет собой комбинацию одного или более чем одного вида клеток и одного или более чем одного вида носителя для доставки нуклеиновых кислот, и в которой нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, включается в по меньшей мере один из одного или более чем одного вида клеток или одного или более чем одного вида носителя для доставки нуклеиновых кислот, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, включается в по меньшей мере один из одного или более чем одного вида клеток или одного или более чем одного вида носителя для доставки нуклеиновых кислот.

В настоящем раскрытии термин «полипептид» обычно относится к полимеру, в котором аминокислотные остатки соединяются посредством пептидных связей, и так называемый белок также включается в качестве примера полипептида. Число аминокислотных остатков в полипептиде может составлять 10 или более, 20 или более, 30 или более, 40 или более, 50 или более, 70 или более, или 100 или более. Верхняя граница числа аминокислотных остатков конкретно не ограничивается. Число аминокислотных остатков может составлять 10000 или менее, 5000 или менее, 2000 или менее, 1000 или менее, 500 или менее, 200 или менее, 100 или менее, 70 или менее, 50 или менее, 40 или менее, 30 или менее, или 20 или менее. Вышеописанные значения нижней границы и значения верхней границы могут быть свободно объединены с образованием интервалов, при условии, что не случается противоречия.

В комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию клетка конкретно не ограничивается, при условии, что данная клетка способна экспрессировать нуклеиновую кислоту, которая описывается как нуклеиновая кислота, подлежащая включению (например, нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19). Данная клетка предпочтительно представляет собой клетку, которая накапливается вокруг раковых клеток или инфильтрует в область вокруг раковых клеток, когда данная клетка была введена в организм. Когда две или более чем две нуклеиновые кислоты, которые описываются как нуклеиновые кислоты, подлежащие включению, присутствуют в клетке, каждая из данных нуклеиновых кислот может быть независимо включена в состоянии интеграции в геном или сохранения на плазмиде в клетке, или данные нуклеиновые кислоты могут быть связаны друг с другом и включены в состоянии интергации в геном или сохранения на плазмиде в клетке. Примеры данной клетки включают иммунореактивные клетки, клетки анаэробных микроорганизмов и мезенхимные стволовые клетки (MSC).

В комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию носитель для доставки нуклеиновых кислот конкретно не ограничивается, при условии, что он представляет собой носитель для доставки нуклеиновых кислот, способный доставлять нуклеиновую кислоту, которая описывается как нуклеиновая кислота, подлежащая включению (например, нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19) в клетку, с вызовом экспрессии данной нуклеиновой кислоты. Данная клетка предпочтительно представляет собой человеческую клетку, более предпочтительно клетку в человеческом организме и еще более предпочтительно представляет собой раковую клетку или иммунореактивную клетку в человеческом организме. Другими словами, носитель для доставки нуклеиновых кислот предпочтительно представляет собой носитель для доставки нуклеиновых кислот, который доставляет нуклеиновую кислоту в раковую клетку или иммунореактивную клетку, когда данный носитель для доставки нуклеиновых кислот был введен в организм.

Примеры носителя для доставки нуклеиновых кислот включают вирусы, липосомы и наночастицы. Носители для доставки нуклеиновых кислот, известные в данной области, можно использовать согласно обычным способам. Также возможно применять вирусный вектор в качестве носителя для доставки нуклеиновых кислот.

Когда две или более чем две нуклеиновые кислоты, которые описываются как нуклеиновые кислоты, подлежащие включению, присутствуют в носителе для доставки нуклеиновых кислот, каждая из данных нуклеиновых кислот может быть включена в носитель для доставки нуклеиновых кислот во взаимонезависимом состоянии или во взаимосвязанном состоянии.

Поскольку раковые клетки имеют иммуносупрессивный механизм, который подавляет действие иммунореактивных клеток по атаке раковых клеток и по высылке инструкций для атаки раковых клеток, подавляется атака против раковых клеток посредством собственной иммунной системы лица, страдающего от рака. Понятно, что ингибитор иммуносупрессии, который является одним компонентом комбинированного лекарственного средства В согласно настоящему раскрытию, облегчает атаку раковых клеток для иммунной системы лица, страдающего от рака, посредством подавления иммуносупрессивного механизма, оказываемого раковыми клетками.

Кроме того, понятно, что один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинация, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, экспрессирует IL-7 поблизости от раковой ткани или вызывает экспрессию клеткой (типично клеткой в организме) IL-7 поблизости от раковой ткани посредством доставки нуклеиновой кислоты и дополнительно экспрессирует CCL19 поблизости от раковой ткани или вызывает экспрессию клеткой (типично клеткой в организме) CCL19 поблизости от раковой ткани посредством доставки нуклеиновой кислоты, в результате чего эндогенные иммунореактивные клетки у лица, страдающего от рака, накапливаются вокруг раковых клеток, обеспечивая, посредством этого, более эффективную атаку против раковых клеток. С этой точки зрения клеткой, в отношении которой осуществляется доставка нуклеиновой кислоты, препочтительно является раковая клетка в организме.

Понятно то, что причиной, почему комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию оказывает значительно улучшенный терапевтический эффект против рака, является то, что комбинированное лекарственное средство В оказывает синергический эффект, оказываемый комбинацией факторов ингибитора иммуносупрессии и экспрессии IL-7 и CCL19 из-за включения ингибитора иммуносупрессии и одного или более чем одного вида клеток, одного или более чем одного вида носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинации, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Данный синергический эффект является превосходящим по степени, что нельзя прогнозировать из индивидуальных эффектов соответствующих факторов.

В одном воплощении один или более чем один вид клеток или один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот в комбинированном лекарственном средстве В доставляет нуклеиновые кислоты в клетку, такую как иммунореактивная клетка, отличная от раковых клеток. В данном воплощении один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинация в комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию может дополнительно включать нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген. В данном случае клетка или носитель для доставки нуклеиновой кислоты, который включает нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, может включать или может не включать нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и может включать или может не включать нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. То есть, когда один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинация в комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию дополнительно включает нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, для одного или более чем одного вида клеток, одного или более чем одного вида носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинации достаточно совместно включать (другими словами, включать в совокупности) нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

В случае, при котором один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинация в комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию вызывает дополнительную экспрессию клеткой, в которую была доставлена нуклеиновая кислота, терапевтический эффект против рака может быть дополнительно усилен. Например, в случае, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, включается в носитель для доставки нуклеиновой кислоты, данный носитель для доставки нуклеиновой кислоты может вводиться субъекту для введения нуклеиновой кислоты в Т-клетку в организме субъекта, вызывая, посредством этого, экспрессию молекулы клеточной поверхности на Т-клетке.

В одном воплощении один или более чем один вид клеток или один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот в комбинированном лекарственном средстве В имеет на его поверхности молекулу, которая специфично распознает раковую клетку, для того, чтобы доставлять нуклеиновые кислоты в раковые клетки. Особенности молекулы, которая специфично распознает раковую клетку, такие как примеры и предпочтительные воплощения, являются такими же, как особенности, такие как примеры и предпочтительные воплощения молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковую клетку.

Когда один или более чем один вид клеток или один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот в комбинированном лекарственном средстве В представляют собой один или более чем один вид клеток, например, нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, может вводиться в клетку, и данная клетка может культивироваться перед введением комбинированного лекарственного средства В, при этом scFv или тому подобное, которое специфично распознает раковый антиген, может экспрессироваться на поверхности данной клетки.

Когда один или более чем один вид клеток или один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот в комбинированном лекарственном средстве В представляют собой один или более чем один вид вирусов, например, нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, может быть включена в геном вируса, и данный вирус может быть трансфицирован в подходящую клетку с вызовом продукции и пролиферации вируса, при этом scFv или тому подобное, которое специфично распознает раковый антиген, может экспрессироваться на поверхности клетки. Антитело, такое как scFv, может быть включено в оболочку или капсид вируса. Например, при использовании вируса герпеса, гликопротеин gD оболочки, который отвечает за инвазию вируса герпеса, может быть модифицирован таким образом, чтобы не иметь способности к связыванию с его исходным рецептором, и антитело, такое как scFv, которое специфично распознает раковый антиген, может быть вставлено в гликопротеин gD оболочки.

Кроме того, когда один или более чем один вид клеток или один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот в комбинированном лекарственном средстве В представляют собой один или более чем один вид липосом или наночастиц, молекула, которая специфично распознает раковую клетку, может быть заранее присоединена к липосомам или наночастицам с использованием известных способов или очевидных из них способов.

Особенности, такие как определения, примеры, аминокислотные последовательности, последовательности оснований и предпочтительные воплощения молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, являются, соответственно, такими же, как особенности, такие как определения, примеры, аминокислотные последовательности, последовательности оснований и предпочтительные воплощения молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, в иммунореактивной клетке А согласно настоящему раскрытию, и комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию.

Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, предпочтительно включается в иммунореактивную клетку. Другими словами, один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинация в комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию предпочтительно включают иммунореактивную клетку, включающую нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген. Иммунореактивная клетка может включать или может не включать нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и может включать или может не включать нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, предпочтительно представляет собой молекулу, которая придает клетке специфическую способность распознавать рак при экспрессии данной молекулы на поверхности клетки, и ее примеры включают рецептор Т-клетки (TCR), который специфично распознает раковый антиген, и химерный рецептор антигена (CAR), который специфично распознает раковый антиген.

При рассмотрении вышеописанного, в одном воплощении можно сказать, что комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию можно использовать в комбинации с лечением с использованием CAR-T или TCR-T.

В одном воплощении один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинация, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, могут включать иммунореактивную клетку, которая экспрессирует интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген. Ингибитор иммуносупрессии может представлять собой полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, экспрессируемый клеткой, и комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию может включать клетку, которая экспрессирует полипептид, ингибирующий иммуносупрессию. Примеры данной клетки включают описанные позднее клетки, которые описываются как примеры клетки в одном или более чем одном виде клеток, одном или более чем одном виде носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинации, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Конфигурация, в которой носитель для доставки нуклеиновых кислот, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, включается в комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию вместо ингибитора иммуносупрессии, также находится в пределах объема воплощений согласно настоящему раскрытию. Носитель для доставки нуклеиновых кислот может быть таким же носителем доставки нуклеиновых кислот или другим носителем доставки нуклеиновых кислот, что и носитель для доставки нуклеиновых кислот или носители доставки нуклеиновых кислот, которые включают другие нуклеиновые кислоты.

Соответственно, в одном воплощении настоящего раскрытия ингибитор иммуносупрессии представляет собой полипептид, и один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинация совместно дополнительно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, ингибирующий иммуносупрессию.

Когда комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию включает иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и клетку, экспрессирующую полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, данные клетки могут представлять собой такие же клетки, как и другие, или отличные друг от друга клетки. Когда иммунореактивная клетка, экспрессирующая интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и клетка, экспрессирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, представляют собой ту же самую иммунореактивную клетку, комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию включало бы один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и ингибитор иммуносупрессии, посредством включения данной иммунореактивной клетки. В комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию естественно допустимо то, что ингибитор иммуносупрессии включается в качестве компонента, независимо от одного или более чем одного вида клеток, одного или более чем одного вида носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинации, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Другими словами, ингибитор иммуносупрессии может быть включен в виде отдельно добавленного вещества в комбинированное лекарственное средство В согласно настоящем раскрытию, а не вещества, экспрессируемого одним или более чем одним видом клеток, одним или более чем одним видом носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинацией.

Как описано выше, клетки, носители доставки нуклеиновых кислот или их комбинация в комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию могут представлять собой по меньшей мере одну, выбранную из группы, состоящей из иммунореактивных клеток, вирусов, анаэробных микроорганизмов, липосом, мезенхимных стволовых клеток (MSC) и наночастиц, и также можно применять смесь двух или более, чем двух, выбранных из них.

Здесь иммунореактивная клетка конкретно не ограничена при условии, что она представляет собой клетку, которая участвует в иммунных ответах, и которая способна включать и экспрессировать нуклеиновую кислоту, подлежащую включению (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19). Доставленная нуклеиновая кислота может быть включена в геном иммунореактивной клетки или может сохраняться на векторе вне генома. Доставленная нуклеиновая кислота может быть включена в геном с точки зрения стабильности сохранения гена. Иммунореактивная клетка предпочтительно представляет собой иммунореактивную клетку, отобранную из живого организма, и ее примеры включают лимфоцитарные клетки, такие как Т-клетки, природные клетки-киллеры (NK-клетки) и В-клетки, антигенпрезентирующие клетки, такие как моноциты, макрофаги и дендритные клетки, и гранулоциты, такие как нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки. Их предпочтительные примеры включают Т-клетку, отобранную у млекопитающего животного, такого как человек, собака, кошка, свинья или мышь, и более предпочтительные примеры включают Т-клетку, отобранную у человека. В случае применения популяции клеток, включающей Т-клетки, которая отбирается из живого организма, данная популяция клеток может включать другие клетки, помимо Т-клеток, и может включать Т-клетки в пропорции 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, или 90% или более по отношению к общему числу клеток на основе числа клеток.

Иммунореактивные клетки, такие как Т-клетки, можно получать посредством отбора популяции клеток, которая включает иммунореактивные клетки, из жидкости организма, такой как кровь или аспират костного мозга, или из иммунных клеток, которые инфильтруют в ткань, такую как селезенка, вилочковая железа или лимфатические узлы, или из иммунных клеток, которые инфильтруют в раковую ткань, такую как первичная опухоль, метастатическая опухоль или раковый асцит. Отделенную популяцию клеток можно подвергать, если это необходимо, стадии выделения или стадии очистки согласно обычному способу с целью увеличения доли иммунореактивных клеток, таких как Т-клетки, включенные в популяцию клеток. Данная иммунореактивная клетка может представлять собой иммунореактивную клетку, полученную от ES клетки или iPS клетки. Примеры Т-клеток, которые являются примерами иммунореактивных клеток, включают альфа-бета Т-клетки, гамма-дельта Т-клетки, Т-клетки CD8⁺, Т-клетки CD4⁺, инфильтрующие опухоль Т-клетки, Т-клетки памяти, наивные Т-клетки и NKT-клетки. Индивид, от которого получают иммунореактивную клетку, и индивид, которому подлежит введению данное комбинированное лекарственное средство, могут быть тем же самым индивидом или разными индивидами, предпочтительно тем же самым индивидом. Например, когда субъект, которому осуществляется введение, представляет собой человека, иммунореактивная клетка может быть аутологичной клеткой, отобранной от самого пациента, которому осуществляется введение, или аллогенной клеткой, отобранной у другого лица. То есть, донор и реципиент могут быть одним и тем же или разными друг от друга, и предпочтительно являются одними и теми же.

Вирус в качестве носителя для доставки нуклеиновой кислоты предпочтительно представляет собой вирус, который способен инкапсулировать нуклеиновую кислоту, подлежащую доставке (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19), и которым могут быть инфицированы раковые клетки. Данный вирус более предпочтительно представляет собой онколитический вирус. Онколитический вирус означает вирус, который с трудом пролиферирует, когда им инфицированы нормальные клетки, но пролиферирует, когда им инфицированы раковые клетки, таким образом, имея способность умерщвлять раковые клетки (будучи цитотоксичным против раковых клеток). Обзор онколитических вирусов приводится в Molecular Therapy том 18, № 2 (февраль, 2010 г.) стр. 233-234. Данный онколитический вирус не является конкретно ограниченным, при условии, что он имеет способность умерщвлять раковые клетки посредством инфицирования раковых клеток, и его примеры включают онколитический вирус осповакцины, онколитический аденовирус, онколитический вирус простого герпеса, онколитический реовирус, онколитический вирус кори, онколитический вирус псевдочумы птиц, онколитический вирус коровьей оспы, онколитический вирус паротита и онколитический вирус Коксаки.

Пример онколитического вируса осповакцины включает вирусы осповакцины, описанные в Kim МК et al., Science TranslationalMedicine, 2013 May 15; 5(185): 185ra63, Heo J, et al., Nature Medicine, 2013 (3): 329-36. doi: 10.1038/nm. 3089. Epub 2013 Feb 10, и WO 2012/094386, но не ограничивается ими. Примеры онколитического аденовируса включают аденовирусы, описанные в Tedcastle A et al. Mol. Ther. 2016; 24: 796-804, Marino Ν, Illingworth S, Kodialbail Ρ, Patel A, Calderón H, Lear R, Fisher KD, Champion BR, Brown ACN. PLoSOne 2017; 12(5): e0177810, Freedman JD, et al. EMBO Mol. Med. 9: 1067-1087 (2017), Lang FF et al., Journal of Clinical Oncology (2018), James M. et al., The Journal of Oncology, 188(6): 2391-7, 2012 и японских патентах № 3867968 и 5574284, но не ограничиваются ими. Примеры онколитического вируса простого герпеса включают вирусы простого герпеса, описанные в Mazzacurati et al., Mol. Ther., 2015 Jan; 23(1): 99-107, Hirooka Y, et al., BMC Cancer 2018, 18, 596, Nakatake R, et al., Cancer Sci. 2018 Mar, 109(3); 600-610 и Andtbacka RHI, et al., J. Clin. Oncol. 2015; 33: 2780-2788, но не ограничиваются ими. Примеры онколитического реовируса включают реовирус, описанный в Mahalingam, et al., Cancers 2018, 10, 160, но не ограничиваются им. Примеры онколитического вируса псевдочумы птиц включают вирус псевдочумы птиц, описанный в Journal of Virology, 2016 Jun; 90(11): 5343-5352, но не ограничиваются им. Примеры онколитического вируса везикулярного стоматита включают вирус везикулярного стоматита, описанный в Muik A. et al., Cancer Res; 74(13); 3567-78, но не ограничиваются им. Некоторые онколитические вирусы имеют функцию экспрессии белка, придаваемую генетической модификацией. Полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, подлежащей доставке (например, нуклеиновой кислотой, кодирующей интерлейкин-7, и/или нуклеиновой кислотой, кодирующей CCL19), может экспрессироваться в виде белка, экспрессируемого на основе приданной функции экспрессии белка.

Аэробный микроорганизм в качестве клетки в «одном или более чем одном виде клеток, одном или более чем одном виде носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинации, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19» конкретно не ограничивается, при условии, что он представляет собой клетку аэробного микроорганизма, способную включать и экспрессировать нуклеиновую кислоту, подлежащую включению (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19). Данный анаэробный микроорганизм предпочтительно представляет собой анаэробную грамотрицательную бактерию, имеющую способность к накоплению в раковых клетках, и ее примеры включают бактерии Bifidobacterium, такие как Bifidobacterium bifidum, бактерии Lactobacillus и бактерии Listeria. Поскольку анаэробные микроорганизмы легче растут в среде с низким содержанием кислорода, известно, что анаэробные микроорганизмы имеют тенденцию к накоплению в раковых клетках. Данный анаэробный микроорганизм может включаться в клетку в организме субъекта, которому вводится комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию.

Липосома в качестве носителя для доставки нуклеиновых кислот конкретно не ограничивается, при условии, что она представляет собой липидную нанокапсулу, которая образуется из фосфолипидного бислоя и способна инкапсулировать нуклеиновую кислоту, подлежащую доставке (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19). Данная липосома может представлять собой имеющийся в продаже продукт или липосому, синтезированную с использованием известных способов. Данная липосома может быть модифицирована ПЭГ (полиэтиле нглико ль) или может иметь молекулу нацеливающего зонда, такую как лектин или белок (например, антитело), на ее поверхности для того, чтобы улучшать накопление в раковых клетках.

Мезенхимная стволовая клетка (MSC) в качестве клетки в «одном или более чем одном виде клеток, одном или более чем одном виде носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинации, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19» конкретно не ограничивается, при условии, что она представляет собой MSC, способную включать и экспрессировать нуклеиновую кислоту, подлежащую включению (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19). Данная MSC предпочтительно представляет собой MSC, которая накапливается в раковых клетках.

Наночастица в качестве носителя для доставки нуклеиновых кислот конкретно не ограничивается, при условии, что она является веществом в виде частиц нанометрового порядка, предпочтительно имеющих диаметр от 5 до 800 нм, то есть способных доставлять нуклеиновую кислоту, подлежащую доставке (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7 и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19) в раковую клетку. Примеры наночастицы включают металлические наночастицы, такие как золотые наночастицы и наночастицы из диоксида кремния. Такие наночастицы могут представлять собой имеющийся в продаже продукт или наночастицы, синтезируемые с использованием обычных способов. Данная наночастица может достигать раковой клетки из-за эффекта повышенной проницаемости и удерживания (EPR эффект). В зависимости от материала наночастицы, нуклеиновая кислота может быть включена в наночастицу посредством связывания с поверхностью наночастицы или будучи инкапсулированной в наночастицу.

В комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию каждая из нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, которые включаются в клетку или в носитель для доставки нуклеиновых кислот, и нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, которая возможно включается, является предпочтительно связанной функциональным образом с расположенным ниже промотором. Методика включения нуклеиновой кислоты в клетку или носитель для доставки нуклеиновых кислот может проводиться с использованием обычных способов. В случае введения нуклеиновой кислоты в клетку, введение может осуществляться с использованием, например, способа, выбранного из группы, состоящей из способа электропорации (см., например, Cytotechnology, 3, 133 (1990)), способа с фосфатом кальция (см., например, выложенную в открытый доступ японскую патентную заявку (JP-A) № Н2-227075), способа липофекции (см., например, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7413 (1987)), и способа инфекции вирусом. Способ инфекции вирусом может представлять собой способ, включающий получение рекомбинантного вируса посредством трансфицирования упаковывающей клетки, такой как клетка GP-2-293 (изготовленная Takara Bio Inc.), клетка Plat-GP (изготовленная Cosmo Bio Co., Ltd.), клетка PG13 (ATCC CRL-10686) или клетка РА317 (ATCC CRL-9078), вектором, включающим нуклеиновую кислоту, подлежащую введению, и упаковывающую плазмиду, и инфицирование Т-клетки данным рекомбинантным вирусом (см., например, международную публикацию (WO) № 2017/159736).

Нуклеиновая кислота, подлежащая введению, может быть интегрирована в геном клетки с использованием известной методики редактирования генома, таким образом, что данная нуклеиновая кислота может экспрессироваться под контролем, оказываемым подходящим промотором. Примеры известных методик редактирования генов включают методику с использованием эндонуклеазы, такой как нуклеаза с цинковыми пальцами, TALEN (эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции) или система CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками)-Саs.

В случае, при котором нуклеиновая кислота, подлежащая включению, включается в клетку, данная нуклеиновая кислота может интегрировать в геном данной клетки или может сохраняться на векторе в пределах клетки. В случае, при котором две или более чем две нуклеиновые кислоты, подлежащие включению, включаются в ту же самую клетку, данные нуклеиновые кислоты могут быть интегрированы в геном данной клетки рядом друг с другом или интегрированы в геном данной клетки отдельно, или включаются в тот же самый вектор, или раздельно включаются в разные векторы. Может приниматься конфигурация, в которой некоторые нуклеиновые кислоты, подлежащие включению, включаются в геном, а другие нуклеиновые кислоты, подлежащие включению, включаются в вектор или векторы.

В случае, при котором нуклеиновая кислота, подлежащая включению, включается в носитель для доставки нуклеиновых кислот, данная нуклеиновая кислота может быть включена сама по себе или может сохраняться на векторе. В случае, при котором две или более чем две нуклеиновые кислоты, подлежащие включению, включаются в тот же самый носитель для доставки нуклеиновых кислот, данные нуклеиновые кислоты могут быть включены в тот же самый вектор или отдельно включены в отдельные векторы, или могут быть включены в тот же самый вирус, или включены в отдельные вирусы. Разные нуклеиновые кислоты могут быть включены в тот же самый носитель для доставки нуклеиновых кислот или в отдельные носители доставки нуклеиновых кислот.

Вектор может быть линейным или кольцевым, или может быть невирусным вектором, таким как плазмида, вирусный вектор или транспозоновый вектор. Данный вектор может включать одну или более чем одну регуляторную последовательность, такую как промотор или терминатор, или последовательность селективного маркера, такого как ген лекарственной устойчивости или ген-репортер. Экспрессия гена, включенного в вектор, может осуществляться с использованием промотора, содержащегося в данном векторе.

Комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию демонстрирует неожиданно улучшенный терапевтический эффект против рака из-за синергического эффекта, оказываемого комбинацией факторов: IL-7, CCL19 и ингибитор иммуносупрессии. Данный эффект является более заметным в случае, при котором комбинированное лекарственное средство В согласно настоящему раскрытию включает клетку или носитель для доставки нуклеиновых кислот, который включает нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и еще более заметным, в случае, при котором комбинированное лекарственное средство В включает иммунореактивную клетку, которая включает нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

В комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию вводимая композиция (ниже также именуемая «третья вводимая композиция»), включающая один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, может дополнительно включать фармацевтически приемлемую добавку, и примеры данной добавки включают физиологический раствор, буферизованный раствор, среду культуры клеток, декстрозу, воду для инъекции, глицерин, этанол и их комбинации, стабилизатор, солюбилизатор, поверхностно-активное вещество, буферизующий агент, консервант, изотоничный агент, наполнитель и смазку.

Описание вводимых композиций в комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию может применяться к вводимым композициям для введения комбинированного лекарственного средства В согласно настоящему раскрытию при замене первой вводимой композиции третьей вводимой композицией.

Например, вторая вводимая композиция может представлять собой такую же композицию, как и третья вводимая композиция, причем в данном случае одна вводимая композиция включала бы и (1) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинацию и (2) ингибитор иммуносупрессии. В данном случае предложена фармацевтическая композиция, которая включает и (1) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и (2) ингибитор иммуносупрессии (комбинированное лекарственное средство).

Когда вторая вводимая композиция представляет собой отдельную композицию от третьей вводимой композиции, третья вводимая композиция и вторая вводимая композиция могут вводиться совместно или могут вводиться в разное время (разные моменты времени), как описано выше.

Таким образом, один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация и ингибитор иммуносупрессии могут вводиться раздельно в разные моменты времени.

Здесь будет применяться описание количества иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию в объяснении вводимых композиций в комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию как описание количества клеток в третьей вводимой композиции, когда один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация включают клетку, к описанию вводимых композиций в комбинированном лекарственном средстве В согласно настоящему раскрытию.

Кроме того, объяснение комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию может применяться к комбинированному лекарственному средству В согласно настоящему раскрытию при замене комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию комбинированным лекарственным средством В согласно настоящему раскрытию и замене иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию и «иммунореактивной клетки, экспрессирующей IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген» одним или более чем одним видом клеток, одним или более чем одним видом носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацией, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, если не возникает противоречия. Применимое объяснение включает объяснение относительно способа применения комбинированного лекарственного средства, как, например, вида организма, индивида и типа заболевания, подлежащего лечению, дозы и схемы введения.

Когда один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация включают носитель для доставки нуклеиновых кислот, количество носителя для доставки нуклеиновых кислот в третьей вводимой композиции может корректироваться сообразно обстоятельствам согласно, например, типу, положению и тяжести рака, или возрасту, массе тела или состоянию субъекта, подлежащего лечению, и данное количество носителя для доставки нуклеиновых кислот может представлять собой подходящее количество для доставки терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, подлежащей доставке.

Объяснение относительно лечения рака с использованием комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию можно применять к лечению рака с использованием комбинированного лекарственного средства В согласно настоящему раскрытию при замене комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию комбинированным лекарственным средством В согласно настоящему раскрытию и замене иммунореактивной клетки А согласно настоящему раскрытию, и иммунореактивной клетки, экспрессирующей IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, одним или более чем одним видом клеток, одним или более чем одним видом носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацией, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Например, согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен способ лечения рака у субъекта (ниже также именуемый «способ лечения рака В согласно настоящему раскрытию»), включающий введение субъекту следующего (а) и (б) в комбинации:

(а) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и

(б) ингибитор иммуносупрессии.

Кроме того, согласно настоящму раскрытию предложено применение (а) одного или более чем одного вида клеток, одного или более чем одного вида носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинации, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и (б) ингибитора иммуносупрессии в изготовлении лекарственного средства для лечения рака. Кроме того, предложено лекарственное средство для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии в лечении рака у субъекта, включающее один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Кроме того, предложен один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии в лечении рака у субъекта. Данные один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и ингибитор иммуносупрессии могут вводиться совместно или вводиться раздельно в разное время.

Кроме того, согласно настоящему раскрытию также предложено лекарственное средство, включающее ингибитор иммуносупрессии для комбинированного применения с одним или более чем одним видом клеток, одним или более чем одним видом носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацией, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в лечении рака у субъекта. Также предложен ингибитор иммуносупрессии для комбинированного применения с одним или более чем одним видом клеток, одним или более чем одним видом носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацией, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в лечении рака у субъекта.

Согласно настоящему раскрытию предложено лекарственное средство, которое включает один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, причем данное лекарственное средство содержится в контейнере, несущем указание инструкции для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии. Особенности контейнера, указание и тому подобное являются такими, как описано выше. Кроме того, также предложены продукт, включающий (1) этикетку, описывающую инструкцию для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии, и (2) контейнер, содержащий лекарственное средство, включающее один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Особенности контейнера, этикетки и тому подобного являются такими, как описано выше.

Как описано выше, согласно одному воплощению настоящего раскрытия можно получать неожиданно улучшенный терапевтический эффект против рака из-за синергического эффекта, оказываемого комбинацией ингибитора иммуносупрессии и одного или более чем одного вида клеток, одного или более чем одного вида носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинации, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

Согласно другому аспекту настоящего раскрытия предложена иммунореактивная клетка, экспрессирующая интерлейкин-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген (ниже также именуемая «иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию»).

Здесь особенности, такие как определения, примеры, аминокислотные последовательности, последовательности оснований и предпочтительные воплощения молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, интерлейкин-7, CCL19, нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и ингибитор иммуносупрессии в иммунореактивной клетке С согласно настоящему раскрытию, соответственно, являются такими же, как особенности, такие как определения, примеры, аминокислотные последовательности, последовательности оснований и предпочтительные воплощения молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, интерлейкин-7, CCL19, нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и ингибитор иммуносупрессии в иммунореактивной клетке А согласно настоящему раскрытию и комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию.

Иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию может рассматриваться как клетка, которая представляет собой иммунореактивную клетку А согласно настоящему раскрытию, и которая дополнительно экспрессирует полипептид, ингибирующий иммуносупрессию. Следовательно, вопросы, которые уже были объяснены в объяснении иммунореактивной клетки А (как, например, объяснения относительно интерлейкина-7, CCL19 и молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген), являются такими же, как вопросы в объяснении иммунореактивной клетки А, и их дублирующие объяснения опускаются.

Полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, относится к веществу, которое представляет собой полипептид, и которое находится в пределах объема ингибитора иммуносупрессии в комбинированном лекарственном средстве А согласно настоящему раскрытию. Полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, отменяет или уменьшает подавление активации иммунореактивных клеток.

Примеры полипептида, ингибирующего иммуносупрессию, включают полипептид, ингибирующий иммунологическую контрольную точку, полипептид, который ингибирует инфильтрацию, выживание или функцию иммуносупрессивной клетки, такой как Treg или происходящая из миелоида клетка-супрессор (MDSC), полипептид, ингибирующий CCR4, полипептид, ингибирующий индоламин-2,3-диоксигеназу (IDO), полипептид, ингибирующий простагландин Е2 [PGE2], и цитотоксический противораковый полипептид. Полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, может представлять собой антитело, при условии, что данное антитело имеет вышеописанную функцию, и может представлять собой, например, моноклональное антитело IgG или фрагмент антитела.

Полипептид, ингибирующий иммунологическую контрольную точку, типично представляет собой полипептид, который отменяет или ослабляет иммуносупрессивный механизм, который работает через молекулу иммунологической контрольной точки, которая экспрессируется на поверхности Т-клетки. Полипептид, ингибирующий иммунологическую контрольную точку, может уменьшать реакцию подавления иммунного ответа, например, посредством связывания с молекулой иммунологической контрольной точки (например, PD-1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, TIGIT, или LAG-3) или с лигандом молекулы иммунологической контрольной точки (например, PD-L1, PD-L2, CD80/CD86 или Siglec-15) для подавления инициации трансдукции сигнала от молекулы иммунологической контрольной точки, запускаемой лигандом.

Примеры полипептида, ингибирующего иммунологическую контрольную точку, включают полипептид, ингибирующий PD-1, полипептид, ингибирующий PD-L1, полипептид, ингибирующий CTLA-4, полипептид, ингибирующий CD47, полипептид, ингибирующий SIRPa, полипептид, ингибирующий BTLA, полипептид, ингибирующий TIM-3, полипептид, ингибирующий TIGIT, полипептид, ингибирующий LAG-3, полипептид, ингибирующий Siglec-15, и полипептид, ингибирующий галектин-9. Примеры полипептида, ингибирующего CCR4, включают антитело против CCR4 (например, могамулизумаб).

Полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, может включать по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из полипептида, ингибирующего PD-1, полипептида, ингибирующего PD-L1, полипептида, ингибирующего PD-L2, полипептида, ингибирующего CTLA-4, полипептида, ингибирующего BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), полипептида, ингибирующего TIM-3 (иммуноглобулин и домен 3 муцина Т-клетки), полипептида, ингибирующего TIGIT (иммунорецептор Т-клетки с доменами Ig и ITIM), полипептида, ингибирующего LAG-3 (ген-3 активации лимфоцитов), и полипептида, ингибирующего Siglec-15.

Полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, может быть полипептидом, ингибирующим иммунологическую контрольную точку, более конкретно полипептидом, ингибирующим PD-1, или полипептидом, ингибирующим PD-L1, и еще более конкретно, антителом против PD-1 или антителом против PD-L1. Примеры антитела против PD-1 включают ниволумаб, пембролизумаб, торипалимаб, цемиплимаб-rwlc и синтилима. Примеры антитела против PD-L1 включают атезолизумаб, дурвалумаб и авелумаб. Примеры антитела против CTLA-4 включают ипилимумаб. Дополнительные примеры включают антитело к CD47 и антитело к SIRPα.

Данное антитело может представлять собой моноклональное антитело IgG, фрагмент Fab, scFv или другое антитело или фрагмент антитела, при условии, что данное антитело или фрагмент антитела имеет предписанное свойство связывания антигена. Примером scFv против PD-1 в качестве полипептида, ингибирующего иммуносупрессию, является аминокислотная последовательность, простирающаяся от 592-го положения до 835-го положения, считая от N-конца в SEQ ID NO: 16, и примером последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, является последовательность нуклеиновой кислоты, простирающаяся от 1717-го остатка до 2505-го остатка, считая от 5'-конца в SEQ ID NO: 15.

Одноцепочечное антитело (scFv) против интересующей мишени может быть получено с использованием известных способов. Например, лимфоидная ткань может быть отобрана после инокулирования антигена в мышь или тому подобное, из нее может быть получена библиотека генов антител, может быть получена последовательность оснований, кодирующая антитело, которое распознает раковый антиген, посредством прямого клонирования антитела, и одноцепочечное антитело может быть сконструировано на основе данной последовательности оснований. В качестве альтернативы, могут быть получены гибридомы с использованием отобранной лимфоидной ткани, может быть идентифицирована гибридома, кодирующая антитело, которое распознает раковый антиген, с получением моноклонального антитела, и одноцепочечное антитело может быть сконструировано на основе информации по последовательности моноклонального антитела. В качестве альтернативы, библиотека одноцепочечных антител может быть получена на основе, например, библиотеки наивных антител, полученных из В-клеток нормального человека, или библиотеки антител, полученных из В-клеток человека, страдающего от рака, имеющего антисыворотку, демонстрирующую высокую активность нейтрализации против ракового антигена, библиотека одноцепочечных антител может подвергаться фаговому дисплею, и из нее может быть отобрано одноцепочечное антитело, которое распознает раковый антиген.

Иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию экспрессирует IL-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген. Здесь выражение «экспрессирует IL-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген» относится к ситуации, при которой IL-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген» продуцируются иммунореактивной клеткой, таким образом, что по меньшей мере некоторые молекулы клеточной поверхности, которые специфично распознают раковый антиген, локализуются на клеточной поверхности (поверхности клетки на наружной стороне клетки) и таким образом, что IL-7, CCL19 и полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, секретиуются наружу из клетки.

Поскольку раковые клетки имеют иммуносупрессивный механизм, который подавляет действия иммунореактивных клеток по атаке раковых клеток или по высылке инструкций для атаки раковых клеток, подавляется атака против раковых клеток посредством собственной иммунной системы человека, страдающего от рака. Понятно, что полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, экспрессируемый иммунореактивной клеткой С согласно настоящему раскрытию, облегчает атаку против раковых клеток иммунной системой человека, страдающего от рака, посредством подавления иммуносупрессивного механизма, оказываемого раковыми клетками.

Кроме того, понятно, что иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию также экспрессирует IL-7 и CCL19, не только иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию, но также эндогенные иммунореактивные клетки у человека, срадающего от рака, накапливаются вокруг раковых клеток, обеспечивая, посредством этого, более эффективную атаку против раковых клеток.

Понятно, что причина, почему иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию оказывает значительно улучшенный теапевтический эффект против рака заключается в том, что иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию дает синергический эффект, оказываемый комбинацией факторов секретируемого IL-7, CCL19 и полипептида, ингибирующего иммуносупрессию, и иммунореактивной клетки, экспрессирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, посредством экспрессирования интерлейкина-7, CCL19, полипептида, ингибирующего иммуносупрессию, и молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген. Данный синергический эффект является превосходящим по уровню, который нельзя прогнозировать из индивидуальных эффектов соответствующих факторов.

Например, даже в случае лечения рака, который сложно лечить иммунореактивной клеткой, экспрессирующей интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, но не экспрессирует полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, или иммунореактивной клеткой, экспрессирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, но не экспрессирующей интерлейкин-7 или CCL19, такой рак можно лечить иммунореактивной клеткой С согласно настоящему раскрытию. Кроме того, такой высокий терапевтический эффект делает возможным получение терапевтического эффекта даже с пониженной дозой клеток, что делает возможным получение терапевтического эффекта даже в случае, при котором нельзя собрать достаточное число иммунореактивных клеток для применения аутологичных клеток. Данные эффекты не ожидаются от совместной экспрессии интерлейкина-7, CCL19 и молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, или от совместной экспрессии полипептида, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

Иммунореактивную клетку С согласно настоящему раскрытию можно получать введением нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, например, в иммунореактивную клетку, отобранную из живого организма, или в иммунореактивную клетку, индуцированную от плюрипотентной стволовой клетки, такой как клетка iPS или клетка ES, или индуцированную от соматической стволовой клетки, такой как гематопоэтическая стволовая клетка. Иммунореактивную клетку С согласно настоящему раскрытию, в качестве альтернативы, можно получать отбором иммунореактивной клетки, которая по своей природе экспрессирует молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген (например, TCR, который специфично распознает раковый антиген), из живого организма и введением нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию.

В случае введения нуклеиновой кислоты в иммунореактивную клетку, отобранную из живого организма, отторжение может быть минимизировано отбором иммунореактивной клетки человека, страдающего от рака, подлежащего лечению лекарственым средством, включающим иммунореактивную клетку С согласно настоящему раскрытию (т.е. аутологичную иммунореактивную клетку). Однако применение аллогенной иммунореактивной клетки не исключается. Другими словами, иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию может быть или может не быть иммунореактивной клеткой, полученной от самого субъекта.

Каждая из нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, может присутствовать в геноме иммунореактивной клетки С согласно настоящему раскрытию или может сохраняться в векторе, который присутствует вне генома. Например, может обеспечиваться присутствие каждой нуклеиновой кислоты в геноме с точки зрения стабильности сохранения нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, могут присутствовать в геноме сосредоточенно (например, связанными) или могут присутствовать рассредоточенно (отдельно друг от друга), или могут присутствовать таким образом, что только некоторые из данных нуклеиновых кислот присутствуют сосредоточенно (например, связанными), тогда как остальные данные нуклеиновые кислоты присутствуют рассредоточено (отдельно друг от друга). В случае, при котором молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой гетеродимер, как, например, TCR, образованный из αβ-димера или γδ-димера, или гетеромультимер, нуклеиновые кислоты, кодирующие соответствующие молекулы, составляющие гетеродимер или гетеромультимер, могут присутствовать в геноме сосредоточенно или могут присутствовать рассредоточенно (отдельно друг от друга).

В одном воплощении по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, или нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, является экзогенной, и допустимо, что все из данных нуклеиновых кислот являются экзогенными. Каждая из нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, может быть независимо интегрирована в геном или интегрирована в вектор. В одном воплощении все из нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, интегрируют в геном иммунореактивной клетки С согласно настоящему раскрытию или интегрируют совместно или раздельно в один или более чем один вектор, присутствующий в иммунореактивной клетке С. В другом воплощении некоторые из нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, интегрируют в геном иммунореактивной клетки С согласно настоящему раскрытию, а остальные из данных нуклеиновых кислот интегрируют в один или более чем один вектор, присутствующий в иммунореактивной клетке С согласно настоящему раскрытию.

В одном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, интегрирует в геном иммунореактивной клетки или интегрирует в вектор, который является таким же или другим от одного или более чем одного вектора, который присутствует в иммунореактивной клетке, и которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

Присутствуют ли или нет соответствующие нуклеиновые кислоты в клетке, можно легко подтвердить с использованием известной методики, такой как ПЦР.

Информацию относительно аминокислотной последовательности полипептида, ингибирующего иммуносупрессию, и последовательности оснований, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, можно получать, по желанию, посредством поиска в известных публикациях или базах данных, таких как NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/).

Когда иммунореактивная клетка по своей природе экспрессирует молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, например, когда подлежит выделению Т-клетка, экспрессирующая TCR, который специфично распознает данный раковый антиген, нет необходимости вводить нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, извне. В других случаях одна или более чем одна нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, или нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, вводятся извне.

Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, для введения в иммунореактивную клетку может быть получена на основе информации по последовательностям оснований, кодирующим соответствующие молекулы, с использованием известных методик, таких как способ химического синтеза или способ амплификации с использованием ПЦР. Кодоны в кодирующей области могут быть модифицированы таким образом, чтобы оптимизировать экспрессию гена в иммунореактивной клетке, в которую подлежит введению нуклеиновая кислота, содержащая ген.

Введение нуклеиновых кислот, подлежащих введению, может осуществляться посредством включения нуклеиновых кислот в один или более чем один носитель для доставки нуклеиновых кислот. Примеры носителей для доставки нуклеиновых кислот включают вышеупомянутые вирусы, липосомы и наночастицы. Данные липосомы и наночастицы могут включать нуклеиновую кислоту, которая находится в состоянии содержания в векторе. Таким образом, согласно настоящему раскрытию также предложен один или более чем один носитель для доставки нуклеиновой кислоты, которые совместно включает нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию. В случае, при котором иммунореактивная клетка по своей природе не экспрессирует молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, носитель для доставки нуклеиновых кислот может дополнительно включать нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

В следующем объяснении описываются вектор или векторы, которые включают нуклеиновые кислоты. Однако то же самое объяснение будет применимо к случаю носителя для доставки нуклеиновых кислот или носителей для доставки нуклеиновых кислот, если не возникает противоречие. В качестве альтернативы, носитель для доставки нуклеиновых кислот может включать вектор, такой как векторы, описанные ниже.

Нуклеиновые кислоты, подлежащие введению, могут вводиться в состоянии, в котором данные нуклеиновые кислоты сохраняются, соответственно, на разных векторах или в состоянии, в котором две или более чем две из данных нуклеиновых кислот сохраняются в том же самом векторе. Например, в случае введения нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, в иммунореактивную клетку данная нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, может вводиться посредством сохранения в отдельных векторах, или обе нуклеиновые кислоты могут вводиться посредством сохранения в том же самом векторе. Нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, может вводиться посредством сохранения в отдельных векторах, или обе нуклеиновые кислоты могут вводиться посредством сохранения на том же самом векторе. Нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, может вводиться посредством сохранения в отдельных векторах, или обе нуклеиновые кислоты могут вводиться посредством сохранения на том же самом векторе. Следующее объяснение для случая, при котором дополнительно вводится нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, может применяться к случаю, при котором вводятся нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию (т.е. к случаю, при котором введение нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхости, которая специфично распознает раковый антиген, не является необходимым), за исключением того, что «нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхости, которая специфично распознает раковый антиген» должна быть опущена.

Когда нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, подлежат введению в иммунореактивную клетку,

(1) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняются на, соответственно, разных векторах; или

(2) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, сохраняются на том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, сохраняется на другом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняется на дополнительном другом векторе; или

(3) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7 сохраняется в другом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняется в дополнительном другом векторе; или

(4) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняются на том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, сохраняется на другом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, сохраняется на дополнительном другом векторе; или

(5) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, сохраняется в другом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняется в дополнительном другом векторе; или

(6) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, сохраняется в другом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, сохраняется в дополнительном другом векторе; или

(7) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, сохраняется в другом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, сохраняется в дополнительном другом векторе; или

(8) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, совместно сохраняются в другом векторе; или

(9) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, совместно сохраняются в другом векторе; или

(10) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, совместно сохраняются в другом векторе; или

(11) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняется в другом векторе;

(12) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, сохраняется в другом векторе; или

(13) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, сохраняется в другом векторе; или

(14) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняются в том же самом векторе, и в котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, сохраняется в другом векторе; или

(15) введение может осуществляться в состоянии, при котором нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, сохраняются в том же самом векторе.

Введение может осуществляться в состоянии, при котором две или более чем две нуклеиновые кислоты сохраняются в том же самом векторе, с учетом эффективности введения. В данном случае две или более чем две нуклеиновые кислоты будут присутствовать в иммунореактивной клетке сосредоточенно.

Например, можно использовать следующий вектор или группу векторов:

(е) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипепид, ингибирующий иммуносупрессию (соответствующий приведенному выше случаю (15));

(ж) группа векторов, состоящая из следующего вектора (ж-1) и вектора (ж-2) (соответствующая приведенному выше случаю (14))

(ж-1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген,

(ж-2) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, ингибирующий иммуносупрессию.

Подходящие векторы также могут быть сконструированы в других случаях аналогичным способом.

Такая группа векторов может быть сконструирована таким образом, что нуклеиновые кислоты содержатся избыточно. Другими словами, конкретная нуклеиновая кислота среди нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, может быть включена в два или более чем два вектора, приадлежащих к группе векторов.

Один или более чем один другой фактор, регулирующий иммунную функцию, такой как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-23, IL-27, IP-10, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL4L1, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL17, CX3CL1, XCL1, XCL2, CCL3L1, CCL3L3, CCL4L1, CCL4L2, Flt3L, интерферон-гамма, MIP-1 альфа, GM-CSF, M-CSF, TGF-бета, или TNF-альфа, может быть дополнительно включен в любой из приведенных выше векторов или в отличный от приведенных выше векторов и может быть введен в иммунореактивную клетку.

Способ, используемый для введения вектора, сохраняющего нуклеиновую кислоту, в иммунореактивную клетку конкретно не ограничивается, и его примеры включают известные способы, такие как способ вирусной инфекции, транспозоновый способ, способ с фосфатом кальция, способ липофекции, способ микроинъекции и способ электропорации. Способ, включающий введение с использованием способа вирусной инфекции, который способен вводить чужеродную нуклеиновую кислоту в геном, может обеспечивать стабильность сохранения нуклеиновой кислоты.

Примером способа вирусной инфекции является способ, включающий транс фицирование упаковывающей клетки, такой как клетка GP2-293 (изготовленная Takara Bio Inc.), клетки Plat-GP (изготовленная Cosmo Bio Co., Ltd.), клетки PG13 (ATCC CRL-10686) или клетки PA317 (ATCC CRL-9078) вектором и упаковывающей плазмидой с получением рекомбинантного вируса, и инфицирование иммунореактивной клетки данным рекомбинантным вирусом. Это может осуществляться с использованием имеющегося в продаже набора, такого как упаковывающий набор ретровируса Eco (изготовленный Takara Bio Inc.). Применение ретровирусной экспрессионной системы MSCV или тому подобной обеспечивает введение в геном чужеродной нуклеиновой кислоты.

Введение в геном нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и, если необходимо, нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, также может осуществляться с использованием известной методики редактирования генома. Примеры известных методик редактирования генома включают методику с использованием эндонуклеазы, такой как нуклеаза с цинковыми пальцами, TALEN (эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции) или система CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками)-Саs. Интеграцию в геном нуклеиновой кислоты, кодирующей другой чужеродный белок, который возможно вводиться, можно осуществлять с использованием таких способов.

В случае интегрирования данных нуклеиновых кислот (генов) в геном иммунореактивной клетки данные нуклеиновые кислоты могут быть интегрированы совместно с расположенным выше промотором или расположенными выше промоторами для регулирования генов в некодирующую область или тому подобные генома функциональным образом (т.е. способными к экспрессии под контролем, оказываемым данным промотором) или могут быть интегрированы функциональным образом без промотора ниже промотора, который уже присутствует в геноме. Примеры промотора, который уже присутствует в геноме, включают промотор TCRα или TCRβ.

Когда две или более чем две нуклеиновые кислоты среди нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, нуклеиновой кислоты, кодирующей полипепид, ингибирующий иммуносупрессию, и, возможно, введенной нуклеиновой кислоты, кодирующей дополнительный чужеродный белок, присутствуют рядом друг с другом, данные две или более чем две нуклеиновые кислоты могут экспрессироваться под контролем, оказываемым общим промотором. В случае, при котором нуклеиновые кислоты экспрессируются под контролем, оказываемым общим промотором, транскрипция и/или трансляция может быть отделена с использованием пептида 2А, пептида IRES или тому подобных для обеспечения экспрессии индивидуальных полипептидов.

В случае, при котором вектор, вмещающий две или более чем две нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, или нуклеиновую кислоту, кодирующую полипепид, ингибирующий иммуносупрессию, вводится в иммунореактивную клетку, порядок выравнивания данных двух или более чем двух нуклеиновые кислот в векторе конкретно не ограничивается. Например, в векторе (е), содержащем нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипепид, ингибирующий иммуносупрессию, порядок выравнивания данных четырех нуклеиновых кислот не ограничивается. В частности, относительно порядка от расположенной выше (5'-концевая сторона) до расположенной ниже (3'-концевая сторона) порядок может быть следующим:

(1) одна из нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, с последующими

(2) одной из остальных (три нуклеотида) из приведеных выше четырех нуклеиновых кислот, с последующими

(3) одной из остальных (два нуклеотида) из приведеных выше четырех нуклеиновых кислот, с последующей

(4) последней остающейся нуклеиновой кислотой из данных четырех нуклеиновых кислот.

Аналогично приведенному выше, относительно вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипепид, ингибирующий иммуносупрессию, который может использоваться в случае, при котором иммунореактивная клетка по своей природе экспрессирует молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, порядок данных нуклеиновых кислот может быть следующим:

(1) одна из нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, с последующими

(2) одной из остальных (две нуклеиновые кислоты) из приведеных выше трех нуклеиновых кислот, с последующей

(3) последней остающейся нуклеиновой кислотой из данных трех нуклеиновых кислот.

Нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, и нуклеиновая кислота, кодирующая полипепид, ингибирующий иммуносупрессию, может транскрибироваться из-за действия, соответственно, разных промоторов или может транскрибироваться из-за действия одного промотора с использованием участка внутренней посадки рибосомы (IRES) или саморасщепляемого пептида 2А.

В случае, при котором многие нуклеиновые кислоты транскрибируются из-за действия одного промотора, последовательность оснований, простирающаяся между соответствующими нуклеиновыми кислотами, может включать свободно выбранную последовательность оснований, при условии, что возможна экспрессия индивидуальных нуклеиновых кислот. Последовательность оснований, простирающаяся между соответствующими нуклеиновыми кислотами, может включать последовательность оснований, кодирующую саморасщепляемый пептид (пептид 2А), или последовательность оснований, кодирующую 1RES, или может включать последовательность оснований, кодирующую пептид 2А. Эффективная экспрессия соответствующих нуклеиновых кислот обеспечивается связыванием многих нуклеиновых кислот с такой последовательностью оснований. Последовательность оснований, простирающаяся между соответствующими нуклеиновыми кислотами, которая может включать последовательность оснований, кодирующую саморасщепляемый пептид (пептид 2А) или 1RES, может представлять собой последовательность оснований, простирающуюся между нуклеиновой кислотой, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислотой, кодирующей CCL19, или последовательность оснований, простирающуюся между нуклеиновой кислотой, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, или последовательность оснований, простирающуюся между нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновой кислотой, кодирующей IL-7, или последовательность оснований, простирающуюся между нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновой кислотой, кодирующей CCL19, или последовательность оснований, простирающуюся между нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, или последовательность оснований, простирающуюся между нуклеиновой кислотой, кодирующей CCL19, и нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, или последовательность оснований, простирающуюся между нуклеиновой кислотой, кодирующей альфа цепь, и нуклеиновой кислотой, кодирующей бета цепь в альфа-бета TCR, или последовательность оснований, простирающуюся между нуклеиновой кислотой, кодирующей гамма цепь, и нуклеиновой кислотой, кодирующей дельта цепь в гамма-дельта TCR. То есть, каждая из данных межгенных областей может включать последовательность оснований, кодирующую саморасщепляемый пептид (пептид 2А) или IRES, если это желательно.

Пептид 2А представляет собой саморасщепляемый пептид из вируса. Его особенности являются такими, как описано выше.

Вектор, используемый для введения нуклеиновой кислоты в иммунореактивную клетку, может быть линейным или кольцевым или может быть невирусным вектором, таким как плазмида, вирусный вектор или транспозоновый вектор. Вектор, используемый для введения нуклеиновой кислоты в иммунореактивную клетку, может включать одну или более чем одну регуляторную последовательность, такую как промотор или терминатор, или последовательность селективного маркера, как например, нуклеиновая кислота гена лекарственной устойчивости или нуклеиновая кислота репортера. При экспрессии данной нуклеиновой кислоты может использоваться промотор, содержащийся в векторе, даже после введения нуклеиновой кислоты в иммунореактивную клетку. Например, посредством размещения функциональным образом одной или более чем одной нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, ниже последовательности промотора в векторе, данные нуклеиновые кислоты могут эффективно транскрибироваться.

Примеры промотора включают промоторы от вирусов, такие как промотор LTR ретровируса, ранний промотор SV40, промотор цитомегаловируса и промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса, и промоторы от млекопитающих, такие как промотор фосфоглицераткиназы (PGK), промотор Xist, промотор β-актина, промотор РНК-полимеразы II и промотор гена фактора элонгации полипептидной цепи. Также можно использовать реагирующий на тетрациклин промотор, индуцированный тетрациклином, промотор Mxl, индуцированный интерфероном, или тому подобные.

Посредством применения промотора, который индуцируется конкретным веществом, экспрессия гена, подвергающегося транскрипционной регуляции посредством промотора (например, одного или более чем одного гена, кодирующего молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, гена, кодирующего IL-7, гена, кодирующего CCL19, или гена, кодирующего полипептид, ингибирующий иммуносупрессию), может регулироваться согласно ходу лечения рака.

Примеры вирусного вектора включают ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, аденовирусный вектор, вектор на основе аденосателлитного вируса. Примеры ретровирусного вектора включают вектор pMSGV (Tamada К. et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445 (2002)) и вектор pMSCV (изготовленный Takara Bio Inc.). Применение ретровирусного вектора обеспечивает стабильную экспрессию введенной нуклеиновой кислоты в течение длительного времени с момента интеграции введенной нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина.

Экспрессию IL-7, CCL19, полипептида, ингибирующего иммуносупрессию, и молекулы клеточной повехности, которая специфично распознает раковый антиген, в иммунореактивной клетке можно определять, например, посредством проточной цитометрии, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) или вестерн-блоттинга. Введение нуклеиновых кислот, кодирующих данные молекулы, может быть подтверждено посредством проверки продуктов экспрессии, как описано выше, или посредством применения, например, норзерн-блоттинга, саузерн-блоттинга или ПЦР (полимеразная цепная реакция), такой как ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией). Когда вектор, используемый для введения нуклеиновой кислоты, включает маркерный ген, введение данной нуклеиновой кислоты может быть подтверждено посредством проверки экспрессии маркерного гена, вставленного в экспрессионный вектор.

Лекарственное средство, включающее иммунореактивную клетку С согласно настоящему раскрытию

Согласно настоящему раскрытию предложено лекарственное средство, включающее иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19, пептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген (ниже также именуемое «лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию»). Другими словами, лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию представляет собой лекарственное средство, которое включает иммунореактивную клетку С согласно настоящему раскрытию.

Лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию может дополнительно включать фармацевтически приемлемую добавку, и примеры данной добавки включают физиологический раствор, буферизованный раствор, среду культуры клеток, декстрозу, воду для инъекции, глицерин, этанол и их комбинации, стабилизатор, солюбилизатор, поверхностно-активное вещество, буферизующий агент, консервант, изотоничный агент, наполнитель и смазку.

Количество иммунореактивных клеток С согласно настоящему раскрытию, содержащихся в лекарственном средстве С согласно настоящему раскрытию можно корректировать, сообразно обстоятельствам, например, согласно типу, положению или тяжести рака, или возрасту, массе тела или состоянию субъекта, подлежащего лечению. Количество иммунореактивных клеток С согласно настоящему раскрытию, содержащихся в лекарственном средстве С согласно настоящему раскрытию, составляет, например, от 1х10⁴ до 1x10^й клеток, более конкретно от 1х10⁵ до 1х10¹⁰ клеток и еще более конкретно от 1х10^б до 1х10⁹ клеток на одно введение. Кроме того, количество иммунореактивных клеток С согласно настоящему раскрытию может быть малым, таким как 1х10⁶ клеток или меньше, например, от 1х10⁵ до 5х10⁵ клеток, и более конкретно от 1,5х10⁵ до 4х10⁵ клеток на одно введение.

Как описано выше, даже в случае лечения рака, который сложно лечить иммунореактивной клеткой, экспрессирующей интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, но не экспрессирует полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, или иммунореактивной клеткой, экспрессирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, но не экспрессирует интерлейкин-7 или CCL19, такой рак можно лечить иммунореактивной клеткой С согласно настоящему раскрытию. Следовательно, количество иммунореактивных клеток С согласно настоящему раскрытию, содержащихся в лекарственном средстве С, может быть таким маленьким количеством, при котором противораковый эффект не оказывался бы в случае применения данного количества иммунореактивных клеток, экспрессирующих интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, но не экспресирующих полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, или применения данного количества иммунореактивных клеток, экспрессирующих полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, но не экспресирующих интерлейкин-7 или CCL19. Данная нижняя граница количества иммунореактивных клеток С конкретно не ограничивается, при условии, что иммунореактивные клетки С в данном количестве способны оказывать противораковый эффект.

Лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию может вводиться с частотой четыре раза в сутки, три раза в сутки, дважды в сутки, один раз в сутки, один раз в каждые вторые сутки, один раз в каждые третьи сутки, один раз в каждые четвертые сутки, один раз в каждые пятые сутки, один раз в каждые шестые сутки, один раз в неделю, один раз в каждые восьмые сутки, один раз в каждые девятые сутки, один раз в каждые десятые сутки, дважды в неделю, один раз в месяц или дважды в месяц. Кроме того, число введений может составлять в совокупности от 1 до 10, в частности, в совокупности 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Также допустимым является введение более чем 10 раз в совокупности.

Как описано выше, лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию оказывает неожиданно улучшенный терапевтический эффект против рака из-за синергического эффекта, оказываемого комбинацией факторов: секретируемыми IL-7 и CCL19, полипептидом, ингибирующим иммуносупрессию, и иммунореактивной клеткой, которая экспрессирует молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

Лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию может вводиться субъекту, нуждающемуся в лечении рака, с использованием способа, известного специалистам в данной области, и может вводиться, например, посредством местной инфузии или инъекции (включая катетерную инфузию), системной инфузии или инъекции, внутривенной инфузии или инъекции, или парентерального введения (например, чрескожное введение или введение через слизистую, более конкретно назальное, глазное, подъязычное, посредством суппозитория, посредством пластыря или тому подобного). Лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию может быть приготовлено в форме (раствор, суспензионная жидкость или эмульсионная жидкость), обеспечивающей инфузию или инъекцию едиичной дозы, с точки зрения удобства в обращении. Более конкретные примеры способов введения включают внутривенную инъекцию, внутриопухолевую инъекцию, внутрикожную инъекцию, подкожную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутриартериальную инъекцию, интрамедуллярную инъекцию, внутрисердечную инъекцию, внутрисуставную инъекцию, инъекцию в синовиальную жидкость, внутричерепную инъекцию, подоболочечную инъекцию и субарахноидальную инъекцию (инъекцию в спинномозговую жидкость).

После получения от пациента, который является субъектом лечения, иммунореактивной клетки или ее клетки-предшестенника в качестве отправной точки в нее вводятся требующиеся гены для превращения данной клетки в иммунореактивную клетку С согласно настоящему раскрытию, данная иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию может вводиться тому же самому пациенту (аутологичное введение) или другому пациенту (аллогенное введение). В качестве альтернативы, иммунореактивную клетку или ее клетку-предшестенника в качестве отправной точки можно получать из плюрипотентной стволовой клетки, такой как клетка iPS или клетка ES, или из соматической стволовой клетки, такой как гематопоэтическая стволовая клетка.

Лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию может вводиться, например, в виде стерильного жидкого препарата, который может быть буферизован до заданного рН, такого как изотоничный водный раствор, суспензионная жидкость, эмульсионная жидкость, дисперсионная жидкость или вязкая композиция. Данный жидкий препарат может представлять собой жидкий препарат для инъекции. Данный жидкий препарат может находиться в форме вязкой композиции, имеющей вязкость в пределах подходящего интервала вязкости таким образом, чтобы продлевать продолжительность контакта с определенной тканью. Данный жидкий препарат может включать растворитель или диспергирующую среду, выбранную из, например, воды, физиологического раствора, фосфатно-солевого буферного раствора, полиола (например, глицерин, пропиленгликоль или жидкий полиэтиленгликоль) или их комбинации.

Данный жидкий препарат может быть получен добавлением иммунореактивной клетки С согласно настоящему раскрытию в подходящее количество подходящего растворителя совместно с разными количествами других компонентов. Данный жидкий препарат может включать подходящий носитель, разбавитель или эксципиент. Данный жидкий препарат может быть лиофилизированным. Данный жидкий препарат может дополнительно включать разные вспомогательные средства, в зависимости от желаемого пути введения, и примеры вспомогательных средств включают увлажнитель, диспергент или эмульгатор (например, метилцеллюлоза), буферизующий агент, гелеобразующий агент или агент, увеличивающий вязкость, консервант, корригент и краситель. Относительно компонентов, которые могут быть включены в данный жидкий препарат, можно привести ссылку "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17-е издание (1985).

Данный жидкий препарат может дополнительно включать разные добавки, которые увеличивают стабильность и стерильность жидкого препарата, примеры которых включают противомикробные консерванты, антиоксиданты, хелаторы и буферизующие агенты. Для предупреждения действия микроорганизмов можно использовать разные антибактериальные средства и противогрибковые средства, такие как парабены, хлорбутанол, фенол и сорбиновая кислота. Носители, разбавители и добавки для применения в жидком препарате должны иметь совместимость с иммунореактивной клеткой С согласно настоящему раскрытию, которая включена в данный жидкий препарат.

Жидкий препарат может быть изотоничным крови. Изотоничность может достигаться обеспечением включения в данный жидкий препарат хлорида натрия или другого фармацевтически приемлемого вещества, регулирующего осмотичность (например, декстроза, борная кислота, тартрат натрия, пропиленгликоль или другое неограническое или органическое растворимое вещество).

Лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию может включать другое противораковое средство, помимо иммунореактивной клетки С согласно настоящему раскрытию. Примеры другого противоракового средства включают алкилирующие агенты, такие как бендамустин, ифосфамид и дакарбазин, антиметаболиты, такие как пентостатин, флударабин, кладрибин, метотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин и эноцитабин, молекулярные таргентные лекарственные средства, такие как ритуксимаб, цетуксимаб и трастузумаб, ингибиторы киназы, такие как иматиниб, гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, дасатиниб, сунитиниб и траметиниб, ингибиторы протеасомы, такие как бортезомиб, ингибиторы кальциневрина, такие как циклоспорин и такролимус, противораковые антибиотики, такие как идарубицин, доксорубицин и митомицин С, растительные алкалоиды, такие как иринотекан и этопозид, лекарственные средства, содержащие платину, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин, средства гормональной терапии, такие как тамоксифен и бикалутамид, и средства иммунного контроля, такие как интерферон. Другое противораковое средство может включать по меньшей мере одно из алкилирующего средства и антиметаболита.

Лечение рака с использованием лекарстенного средства С согласно настоящему раскрытию

В случае применения лекарственного средства С по настоящему раскрытию в лечении рака субъект, подлежащий лечению, может представлять собой, например, любое млекопитающее животное. Субъект, подлежащий лечению, представляет собой, например, животное-примата и, более конкретно, может представлять собой человека. Субъект, подлежащий лечению, в качестве альтернативы, может представлять собой домашнее животное или сельскохозяйственное животное, примеры которых включают собаку, кошку, свинью, крупный рогатый скот, лошадь, овцу и козу.

Раковое заболевание, подлежащее лечению, может представлять собой либо солидное раковое заболевание, либо рак крови, и их примеры включают такие раковые заболевания, как аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома, аденоплоскоклеточная карцинома, недифференцированная карцинома, крупноклеточная карцинома, мелкоклеточная карцинома, рак кожи, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак вагины, рак шейки матки, рак матки, рак печени, рак почки, рак поджелудочной железы, рак селезенки, рак легкого, рак трахеи, бронхиальная карцинома, рак толстой кишки, рак тонкой кишки, рак желудка, рак пищевода, рак желчного пузыря, рак яичка и рак яичника; раковые заболевания костной ткани, ткани хряща, жировой ткани, мышечной ткани, сосудистой ткани и гематопоэтической ткани; саркомы, такие как хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная саркома сосудистого эндотелия, злокачественная шваннома, остеосаркома и саркома мягкой ткани; бластомы, такие как гепатобластома, медуллобластома, нефробластома, нейробластома, панкреатобластома, плевролегочная бластома и ретинобластома; герминома; лимфома и лейкоз.

Поскольку лекарственное средство С по настоящему раскрытию способно уменьшать иммуносупрессию в раковом микроокружении, рак, подлежащий лечению, не ограничивается раком клеток крови, и лекарственное средство С также оказывает терапевтический эффект против солидного рака. Следовательно, лекарственное средство С имеет высокую эффективность даже против солидного рака, который сложно лечить традиционными способами.

В ситуации, при которой подозревают присутствие раковых клеток у субъекта, лекарственное средство С по настоящему раскрытию можно вводить субъекту профилактически перед тем, как делается доказательный диагноз рака. В настоящем раскрытии такой способ применения также включается в идею применения в лечении рака.

Способ лечения рака у субъекта

Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен способ лечения рака у субъекта (ниже также именуемый «способ лечения рака С согласно настоящему раскрытию»), включающий введение субъекту следующего: (а) иммунореактивная клетка, экспрессирующая IL-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

Здесь иммунореактивная клетка в способе лечения рака С согласно настоящему раскрытию представляет собой иммунореактивную клетку С согласно настоящему раскрытию, и вышеописанное объяснение относительно иммунореактивной клетки С согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к подробной конфигурации и примерам иммунореактивной клетки в способе лечения рака С согласно настоящему раскрытию.

Кроме того, объяснение относительно лекарственного средства С согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к особенностям способа лечения, таким как субъект, тип рака, доза и схема введения в способе лечения рака С согласно настоящему раскрытию. Иммунореактивная клетка С согласно настоящему раскрытию может вводиться в терапевтически эффективном количестве.

Из-за синергического эффекта, оказываемого комбинацией факторов: IL-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, которые экспрессируются данной иммунореактивной клеткой, способ лечения рака С согласно настоящему раскрытию дает неожиданно улучшенный терапевтический эффект против рака.

Кроме того, согласно настоящему раскрытию предложено применение иммунореактивной клетки, экспрессирующей IL-7, CCL19, полипптид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, в изготовлении лекарственного средства для лечения рака. Также в данном применении объяснение относительно комбинированного лекарственного средства С согласно настоящему раскрытию применяется в сложившихся условиях к особенностям иммунореактивной клетки, лечения рака и тому подобного.

Кроме того, согласно настоящему раскрытию для применения в лечении рака у субъекта предложена иммунореактивная клетка, экспрессирующая интерлейкин-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

Лекарственное средство С согласно настоящему раскрытию может содержаться в контейнере, таком как контейнеры, описанные в объяснении относительно комбинированного лекарственного средства А согласно настоящему раскрытию. Также предложен продукт, включающий контейнер, содержащий лекарственное средство С.

Как описано выше, согласно одному аспекту настоящего раскрытия может быть получен неожиданно улучшенный терапевтический эффект, благодаря синергическому эффекту, оказываемому комбинацией IL-7, CCL19, полипептида, ингибирующего иммуносупрессию, и молекулы клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, которые экспрессируются данной иммунореактивной клеткой.

ПРИМЕРЫ

Ниже более конкретно описываются воплощения на основе примеров. Однако данные примеры не ограничивают настоящее раскрытие каким-либо способом. В следующем ниже и %, и млн^-1 основываются на массе, если не определяется иначе.

Получение экспрессионного вектора IL-7 × CCL19

Фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19 (SEQ ID NO: 9), который кодирует мышиный IL-7 (без стоп-кодона) с последующими F2A и мышиным CCL19, синтезировали искусственно. Для того, чтобы получить вектор, который экспрессирует IL-7, CCL19 и eGFP, синтезированный фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19 вставляли в MCS (сайт множественного клонирования) ретровирусного экспрессионного вектора pMSGV, имеющего последовательность F2A-eGFP (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)), посредством обработки рестрикционными ферментами (Ncol and EcoRI) и лигирования с получением вектора pMSGV (экспрессионный вектор 7x19), который включает фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP (SEQ ID NO: 10). Карта полученного вектора показана на Фиг. 1Б. Кроме того, в качестве контроля получали вектор pMSGV (вектор eGFP-Conv.), который включает eGFP, но не включает ни IL-7, ни CCL19. Карта вектора eGFP-Conv. показана на Фиг. 1А. В SEQ ID NO: 10 основания 1-462 соответствуют IL-7 (основания 1-75 соответствуют сигнальной последовательности IL-7), основания 463-537 соответствуют F2A, основания 538-861 соответствуют CCL19 (основания 538-612 соответствуют сигнальной последовательности CCL19), основания 868-942 соответствуют F2A, основания 946-1662 соответствуют нуклеиновой кислоте, кодирующей eGFP, и основания 1663-1665 соответствуют стоп-кодону. Аминокислотная последовательность, соответствующая последовательности оснований SEQ ID NO: 10, показана как SEQ ID NO: 11. Для того, чтобы принять применение рестрикционного фермента Ncol, четвертое основание в SEQ ID NO: 10 было заменено с тимина (t) на гуанин (g) (приводя к изменению второй аминокислоты в SEQ ID NO: 11с фенилаланина (F) на валин (V)).

Для трансдукции мышиных Т-клеток получали ретровирус. С использованием LIPOFECTAMINE 3000 (изготовленного Thermo Fisher Scientific К.К.), упаковывающие клетки GP2-293 (изготовленные Takara Bio Inc.) трансфицировали экспрессионным вектором 7x19 или вектором eGFP-Conv. и плазмидой pCL-Eco (изготовленной Imgenex), с получением ретровируса, в который был введен экспрессионный вектор 7x19 или вектор eGFP-Conv.

Культуральная жидкость, используемая для клеток GP2-293, представляла собой DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко), дополненную 10% FCS (фетальная телячья сыворотка), 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культуральная жидкость, используемая для Т-клеток в описанных позднее примерах, представляла собой RPMI-1640, дополненную 10% FCS, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мМ 2-меркаптоэтанолом.

Получение Т-клеток, экспрессирующих IL-7, CCL19, eGFP и TCR, который специфично распознает опухолевый антиген P1А Р815

Самцов и самок мышей DBA/2 (в возрасте от 6 до 8 недель) приобретали у Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Япония) и использовали для экспериментов. Трансгенных мышей, экспрессирующих TCR, который специфично распознает ограниченный H-2L^d опухолевый антиген P1A Р815 (Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med. 189: 811-820), подвергали обратному скрещиванию с мышами DBA/2 на протяжении 10 поколений. Всех мышей содержали в условиях без патогенов.

После обратного скрещивания отбирали у трансгенных мышей спленоциты, которые экспрессировали TCR, способный к специфичному распознаванию P1A, и получали мышиные Т-клетки, экспрессирующие TCR, специфичный в отношении антигена P1A опухоли Р815, и полученные из спленоцитов (Р1А-специфичные TCR-T клетки; далее также именуемые «P1A-TCRT клетки без введенного вектора»). Мышиные Т-клетки, экспрессирующие Р1А-специфичный TCR, будут совокупно называться «P1A-TCRT клетки», независимо от того, был ли введен вектор или нет. Для осуществления трансдукции P1A-TCRT клетки без введенного вектора активировали посредством инкубации в течение 48 часов в присутствии пептида P1A (LPYLGWLVF; SEQ ID NO: 12) и IL-2 в подходящих количествах для активации клеток. После 48 часов инкубации культивируемые клетки отбирали, и P1A-TCRT клетки без введенного вектора обогащали посредством проведения отрицательной магнитной сортировки с использованием набора для выделения мышиных Т-клеток Pan (изготовлен Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия). Выделенные P1A-TCRT клетки без введенного вектора переносили в планшеты, которые были покрыты 25 мкг/мл RETRONECTIN (зарегистрированный товарный знак, изготовлен Takara Bio Inc.). Полученный выше супернатант, который содержал ретровирус, транс дуциро ванный экспрессионным вектором 7x19 или вектором eGFP-Conv., смешивали с P1A-TCRT клетками без введенного вектора (1 × 10⁶ клеток/мл), которые были активированы на планшете, и данные клетки центрифугировали при 1500 об./мин в течение 2 часов, и затем культивировали в течение 6 часов. Для того чтобы удалить ретровирус из культуральной жидкости, Т-клетки отбирали, промывали, переносили в свежую ростовую культуральную жидкую среду (RPMI-1640), содержащую IL-2, и культивировали в течение еще 2 суток для получения популяции P1A-TCRT клеток, которая включала P1A-TCRT клетки, трансдуцированные экспрессионным вектором 7×19 (далее также именуемые «экспрессирующие eGFP Р1А-7×19 TCRT клетки»), или популяции P1A-TCRT клеток, которая включала P1A-TCRT клетки, трансдуцированные вектором eGFP-Conv. (далее также именуемые «экспрессирующие eGFP PI A-TCRT клетки»). Трансдукция соответствующими экспрессионными векторами была подтверждена анализом проточной цитометрией, который выявил eGFP в качестве суррогатного маркера. Как описано выше, Р1А-7×19 TCRT клетки, экспрессирующие eGFP, и P1A-TCRT клетки, экспрессирующие eGFP, составляли только часть соответствующих им популяций P1A-TCRT клеток. Тем не менее, ради простоты описания, лечение на соответствующей популяции клеток описывается в настоящем описании изобретения как лечение на Р1А-7×19 TCRT клетках, экспрессирующих eGFP, или на P1A-TCRT клетках, экспрессирующих eGFP, если не определено иначе.

Подтверждение трансдукции

Анализ проточной цитометрией

Уровни экспрессии eGFP и CD8 проверяли посредством анализа двухцветной проточной цитометрией. P1A-TCRT клетки без введенного вектора, которые не подвергались трансдукции ретровирусом, Р1А-7×19 TCRT клетки, экспрессирующие eGFP, и P1A-TCRT клетки, экспрессирующие eGFP, культивировали в присутствии моноклонального антитела против CD8, конъюгированного с аллофикоцианином (АРС) (53-6.7, изготовленным Affymetrix). Проточную цитометрию проводили с использованием ЕС800 (изготовленного Sony Corporation) или BD LSRForetessa Х-20 (изготовленного BD Biosciences), и анализ данных осуществляли с использованием программы Flow Jo (изготовленной Tree Star).

Результаты показаны на Фиг. 2 в виде графика рассеяния. На Фиг. 2, 3А и 3Б «трансдукция (-)» представляет P1A-TCRT клетки, которые не подверглись трансдукции (P1A-TCRT клетки без введенного вектора), «Conv. Р1А-Т-клетки» представляет P1A-TCRT клетки, экспрессирующие eGFP, и «7x19 P1A-Т-клетки» представляет Р1А-7×19 TCRT клетки, экспрессирующие eGFP. Каждое из значений процентной доли на Фиг. 2 указывает долю числа клеток, присутствующих в каждой области.

Как показано на Фиг. 2, в случаях Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, наблюдали то, что примерно от 70% до 80% Т-клеток экспрессировали eGFP, демонстрируя то, что экспрессионный вектор 7x19 или вектор eGFP-Conv. был успешно введен.

Анализ посредством ELISA

Отбирали кондиционированную среду, полученную после культивирования Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, или P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, в течение 2 суток, и концентрации IL-7 и CCL19 в данной кондиционированной среде измеряли с использованием доступного в продаже набора ELISA (изготовленного R&D systems). Результаты показаны на Фиг. 3А и 3Б. Наряду со средними значениями по лункам в тройной повторности, на графике также показано стандартное отклонение. «N.D.» на графике показывает то, что присутствие не было выявлено, и «***» указывает Ρ менее 0,001. Как показано на Фиг. 3А и 3Б, экспрессия IL-7 и экспрессия CCL19 была подтверждена в случае Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP.

Анализ противоракового эффекта, продуцированного введением мышам, несущим опухоль

В сутки 0 5х10⁵ мастоцитомных клеток Р815, которые были суспендированы в 0,1 мл HBSS (сбалансированный соляной раствор Хэнка), подкожно инокулировали в бока самцов и самок мышей DBA/2 в возрасте от 6 до 8 недель. Данные мастоцитомные клетки Р815 были сингенными по отношению к DBA/2 мышам и далее также просто назывались «клетки Р815» или «опухолевые клетки Р815». В сутки 6 данных мышей подвергали сублетальному облучению (от 3 до 5 Гр) для предварительной адаптации. В сутки 7 данных мышей делили на шесть групп. Группа 1 и группа 2 получали внутривенное введение 1×10⁶ Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, группа 3 и группа 4 получали внутривенное введение l×l0⁶ P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и группа 5 и группа 6 не получали введения Т-клеток (как описано выше, указанное число клеток представляет собой общее число Т-клеток в популяции P1A-TCRT клеток, которые включали Р1А-7×19 TCRT клетки, экспрессирующие eGFP, или P1A-TCRT клетки, экспрессирующие eGFP). Мышам в группе 2, группе 4 и группе 6 дополнительно внутрибрюшинно инъецировали моноклональное антитело против PD-1 (изготовленное Merck, клон G4; то же самое применимо к моноклональным антителам против PD-1, описанным ниже) в дозе 100 мкг/индивида и с частотой один раз в неделю всего шесть раз, начиная в сутки 10. Анализировали выживаемость соответствующих мышей, и объем опухоли каждой мыши измеряли дважды в неделю. Объем опухоли измеряли цифровым циркулем и получали согласно следующему выражению:

Объем опухоли = 1/2 × (длина длинной оси опухоли) × (длина короткой оси опухоли)²

Результаты анализа выживаемости соответствующих мышей показаны на Фиг. 4, и результаты измерения объема опухоли показаны на Фиг. 5А-5Е. Указанные данные были получены объединением результатов пяти независимых экспериментов.

На Фиг. 4 и 5А-5Е □ указывает мышей, которые не получали введения (размер выборки 15 мышей; описанная выше группа 5), ■ указывает мышей, которые получали введение одного моноклонального антитела против PD-1 (размер выборки 11 мышей; описанная выше группа 6), Δ указывает мышей, которые получали введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP (размер выборки 17 мышей; описанная выше группа 3), ▲ указывает мышей, которые получали введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP и моноклонального антитела против PD-1 (размер выборки 14 мышей; описанная выше группа 4), о указывает мышей, которые получали введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP (размер выборки 24 мыши; описанная выше группа 1), и ● указывает мышей, которые получали введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и моноклонального антитела против PD-1 (размер выборки 19 мышей; описанная выше группа 2). На Фиг. 4 и 5А-5Е абсцисса представляет число суток, которые прошли с момента подкожной инокуляции мастоцитомных клеток Р815. Число мышей, отторгающих опухоль (числитель), относительно общего числа мышей в каждой группе (знаменатель) также показано на Фиг. 5А-5Е. Значения Ρ в логранговом критерии составляли 0,0005 между группами Δ и о, 0,0002 между группами ▲ и ●, 0,7284 между группами Δ и ▲, и 0,0253 между группами о и ●.

Результаты, показанные на Фиг. 4 и 5А-5Е демонстрируют то, что мыши, которые получали введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и моноклонального антитела против PD-1 (●), достигали увеличения выживаемости и подавления увеличения объема солидной опухоли на уровне, который не мог быть достигнут у мышей (о), которые получали введение Р1А-7х19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, или мышей (▲), которые получали введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и моноклонального антитела против PD-1. В отличие от этого, мыши, которые получали введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и моноклонального антитела против PD-1 (▲), не демонстрировали высокого синергического эффекта.

Получение P1A-TCRT с разрушенным PD-1 или разрушенным ROSA26

Для редактирования генов, аналогично описанному выше, P1A-TCRT клетки без введенного вектора активировали посредством инкубации в течение 48 часов в присутствии пептида P1A (LPYLGWLVF; SEQ ID NO: 12) и IL-2 в подходящих количествах для активации клеток. После 48 часов инкубации культивируемые клетки отбирали, и P1A-TCRT клетки без введенного вектора обогащали посредством проведения отрицательной магнитной сортировки с использованием набора для выделения мышиных Т-клеток Pan (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия). Полученные Т-клетки промывали PBS, ресуспендировали в буфере R (изготовлен Thermo Fisher Scientific К.К.) и смешивали с комплексом Cas9-PHП (рибонуклеопротеин), который включал белок Cas9 v2 TRUECUT (зарегистрированный товарный знак) (изготовлен Thermo Fisher Scientific К.К.) и геноспецифичную РНК-проводник. Данный комплекс Cas9-PHП вводили в Т-клетки посредством электропорации с использованием трансфекционной системы Neon (изготовленной Invitrogen). Это приводило к разрушению гена-мишени. Кроме того, сразу после электропорации Т-клетки ресуспендировали в cRPMI, содержащей IL-2, экспрессионный вектор 7х 19 упаковывали в ретровирус и вводили в Т-клетки таким же способом, как способ, описанный выше. Конструировали РНК-проводник, нацеленный на мышиный PD-1, со ссылкой на Okada M, et al. Blockage of Core Fucosylation Reduces Cell-Surface Expression of PD-1 and Promotes Anti-tumor Immune Responses of Τ Cells. Cell Rep. 2017; 20(5): 1017-1028, и последовательность части в виде РНК-проводника представляла собой 5'-UCUGGGCAUGUGGGUCCGGC-3' (SEQ ID NO: 13). Синтез РНК-проводника был отдан на аутсорсинг Thermo Fisher Scientific К.К. В качестве контроля, РНК-проводник был заменен 5'-CUCCAGUCUUUCUAGAAGAU-3' (SEQ ID NO: 14), нацеленной на ROSA26, с разрушением мышиного ROSA26. РНК-проводник, нацеленный на ROSA26, приобретали у Thermo Fisher Scientific К.К.

Эксперимент по введению P1A-TCRT с разрушенным PD-1 или разрушенным ROSA26

В сутки 0 5х10⁵ мастоцитомных клеток Р815, суспендированных в 0,1 мл HBSS, подкожно инокулировали в бока самцов и самок мышей DBA/2 в возрасте от 6 до 8 недель. В сутки 6 данных мышей подвергали сублетальному облучению (от 3 до 5 Гр) для предварительной адаптации. В сутки 7 данных мышей делили на четыре группы, которые, соответственно, получали следующие обработки в сутки 7 и последующие сутки.

Группа 1 : не вводили ни Т-клеток, ни антитела.

Группа 2: в сутки 7 внутривенно вводили 1×10⁶ Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, ROSA 26 которых был подвергнут нокауту.

Группа 3: в сутки 7 внутривенно вводили 1х10⁶ клеток популяции клеток, включающей Р1А-7х19 TCRT клетки, экспрессирующие eGFP, PD-1 которых был подвергнут нокауту.

Группа 4: в сутки 7 внутривенно вводили 1х10⁶ клеток популяции клеток, включающей Р1А-7х19 TCRT клетки, экспрессирующие eGFP, PD-1 которых был подвергнут нокауту, и внутрибрюшинно инъецировали моноклональное антитело против PD-1 в дозе 100 мкг/индивида и с частотой один раз в неделю всего шесть раз, начиная в сутки 10.

Как описано выше, указанное число клеток представляет собой общее число Т-клеток в популяции P1A-TCRT клеток, которая включала Р1А-7×19 TCRT клетки, экспрессирующие eGFP.

Затем анализировали выживаемость соответствующих мышей, и объем опухоли каждой мыши измеряли дважды в неделю согласно описанной выше методике с использованием цифрового циркуля. Результаты анализа выживаемости соответствующих мышей показаны на Фиг. 6А, и результаты измерения объема опухоли показаны на Фиг. 6Б-6Д. Размер выборки составлял N равно 6 для всех групп.

На Фиг. 6А-6Д × указывает мышей, которые не получали введения (описанная выше группа 1), □ указывает мышей, которые получали введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, область ROSA 26 которых была подвергнута нокауту (описанная выше группа 2), ◊ указывает мышей, которые получали введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, PD-1 которых был подвергнут нокауту (описанная выше группа 3), ♦ указывает мышей, которые получали введение моноклонального антитела против PD-1, помимо Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, PD-1 которых был подвергнут нокауту (описанная выше группа 4).

На Фиг. 6А-6Д абсцисса представляет число суток, которые минули с момента подкожной инокуляции мастоцитомных клеток Р815. Число мышей, отторгающих опухоль (числитель), относительно общего числа мышей в каждой группе (знаменатель) также показано на Фиг. 6Б-6Д. Значения Ρ в логранговом критерии составляли 0,0454 между группами × и о, 0,0431 между группами □ и ◊, и 0,0402 между группами ◊ и ♦.

Результаты, показанные на Фиг. 6А-6Д, демонстрируют то, что терапевтический эффект против рака, который может быть получен у мышей, которые получали введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и моноклонального антитела против PD-1, значительно выше, чем терапевтический эффект, полученный в случае простого нокаутирования PD-1 в Р1А-7×19 TCRT клетках, экспрессирующих eGFP. Это демонстрирует то, что введение моноклонального антитела против PD-1 не только стимулирует иммунный ответ Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, но также стимулирует функцию эндогенных иммунных клеток, которые были привлечены в область рядом с раковыми клетками посредством Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP.

Сохранение P1A-TCRT клеток в мышиной селезенке

В сутки 0 5×10⁵ мастоцитомных клеток Р815, суспендированных в 0,1 мл HBSS, подкожно инокулировали в бока самцов и самок мышей DBA/2 в возрасте от 6 до 8 недель. В сутки 6 данных мышей подвергали сублетальному облучению (от 3 до 5 Гр) для предварительной адаптации. В сутки 7 данных мышей делили на две группы, из которых первая группа получала внутривенное введение l×10⁶ Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и вторая группа получала внутривенное введение 1×10⁶ Р1А-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP. Мышиных индивидов, которые демонстрировали полную регрессию опухоли, умерщвляли в сутки 119, их спленоциты отбирали, подсчитывали и анализировали проточной цитометрией для оценки сохранения P1A-TCRT клеток в селезенке. Кроме того, Т-клетки выделяли из спленоцитов с использованием способа магнитной сортировки, и 2×10⁶ Т-клеток инкубировали с 1×10⁶ клеток Р815, которые обрабатывали митомицином С. Через 3 суток и через 5 суток кондиционированную среду отбирали, и концентрацию IFN-γ измеряли посредством ELISA. Число P1A-TCRT клеток (на лунку) на протяжении периода культивирования с клетками Р815 также измеряли посредством проточной цитометрии. На основе данных анализов оценивали функцию P1A-TCRT клеток в селезенке.

Объем выборки составлял пять мышей в отношении группы, которая получала введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и составлял две мыши в отношении группы, которая получала введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP.

Отобранные спленоциты измеряли относительно экспрессии CD8 и eGFP на основе проточной цитометрии аналогично измерению в эксперименте, показанном на Фиг. 2 (при условии, что ворота были изменены от четвертичных ворот до оптимизированных ворот, включающих ворота CD8"eGFP⁺ и ворота CD8⁺eGFP⁺), и результаты показаны на Фиг. 7. Средняя доля клеток, которые экспрессировали eGFP, но не экспрессировали CD8 (клетки CD8^-eGFP⁺) в спленоцитах указывается незакрашенными столбиками на Фиг. 8А, и среднее число клеток указывается незакрашенными столбиками на Фиг. 8Б. Средняя доля клеток, которые экспрессировали и CD8, и eGFP, (клетки CD8⁺eGFP⁺) в спленоцитах указывается черными закрашенными столбиками на Фиг. 8А, и среднее число клеток указывается черными закрашенными столбиками на Фиг. 8Б. На Фиг. 8А и 8Б незакрашенные столбики располагаются слева от черных закрашенных столбиков, хотя данные для «Conv. Р1А-Т клеток» являются едва видимыми из-за их малых значений. На Фиг. 7, 8А и 8Б «Conv. Р1А-Т клетки» представляют группу, которая получала введение Р1А-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и «7×19 Р1А-Т клетки» представляют группу, которая получала введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP. Результаты, показанные на Фиг. 7, 8А и 8Б, демонстрируют то, что в группе мышей, которая получала введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, данные мыши сохраняли P1A-TCRT клетки, удерживающие введенные гены, даже в сутки 119. Отмеченные процентные доли на Фиг. 7 представляют долю клеток, которые экспрессировали eGFP, но не экспрессировали CD8 (клетки CD8^-eGFP⁺) (0,055% в группе, которая получала введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и 0,97% в группе, которая получала введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP), и долю клеток, которые экспрессировали и CD8, и eGFP (клетки CD8⁺eGFP⁺) (0,0068% в группе, которая получала введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и 0,47% в группе, которая получала введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP).

Кроме того, число P1A-TCRT клеток (на лунку), которые экспрессировали и CD8, и eGFP во время периода культивирования с клетками Р815, измеряли посредством проточной цитометрии, и данные результаты показаны на Фиг. 8В. Концентрация IFN-γ, полученная измерением ELISA кондиционированной среды, показана на Фиг. 8Г. На Фиг. 8В и 8Г результаты, полученные в группе, которая получала введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, показаны левыми столбиками (незакрашенными столбиками) в соответствущие моменты времени, и результаты, полученные в группе, которая получала введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, показаны правыми столбиками (черными закрашенными столбиками) в соответствущие моменты времени. Здесь на Фиг. 8В левые столбики, указывающие результаты, полученные в группе, которая получала введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, перекрываются с абсциссой (т.е. число P1A-TCRT клеток, которые экспрессировали и CD8, и eGFP, почти равно нулю), в результате чего левые столбики фактически не видны. На Фиг. 8В и 8Г результаты показаны в показателях среднего значения и стандартного отклонения, где «*» указывает то, что значение Ρ удовлетворяет Ρ менее 0,05, и «**» указывает то, что значение Ρ удовлетворяет Ρ менее 0,01.

Результаты, показанные на Фиг. 8В и 8Г, демонстрируют то, что функция Р1А-TCRT клеток, удерживающих введенные гены, сохранялась у мышей даже в сутки 119.

Эксперимент по повторному заражению раковыми клетками

В сутки 0 5×10⁵ клеток Р815, суспендированных в 0,1 мл HBSS, подкожно инокулировали в бока самцов и самок мышей DBA/2 в возрасте от 6 до 8 недель. В сутки 6 данных мышей подвергали сублетальному облучению (от 3 до 5 Гр) для предварительной адаптации. В сутки 7 внутривенно вводили l×10⁶ Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP (как описано выше, указанное число клеток представляет собой общее число Т-клеток в популяциях P1A-TCRT клеток, которые включали Р1А-7х19 TCRT клетки, экспрессирующие eGFP). Кроме того, внутрибрюшинно инъецировали моноклональное антитело против PD-1 в дозе 100 мкг/индивида и с частотой один раз в неделю всего шесть раз, начиная в сутки 10. В сутки 117 5х10⁵ мастоцитомных клеток Р815, суспендированных в 0,1 мл HBSS, вновь подкожно инокулировали в бока четырех мышей, которые демонстрировали полную регрессию опухоли. Кроме того, 5×10⁵ мастоцитомных клеток Р815, суспендированных в 0,1 мл HBSS, подкожно инокулировали в бока шести наивных мышей DBA/2 в качестве контроля. Результаты измерения объема опухоли мышей показаны на Фиг. 9, наряду с числом минувших суток вплоть до суток 20, предполагая то, что сутки повторной инокуляции клеток Р815 мышам, которые демонстрировали полную регрессию опухоли, или сутки инокуляции клеток Р815 наивным мышам DBA/2 представляют собой сутки 0. Объемы опухолей мышей измеряли цифровым циркулем, как описано относительно Фиг. 5А-5Е, но объем опухоли в данном эксперименте указывается в показателях среднего значения и стандартного отклонения.

На Фиг. 9 × указывает результат инокуляции клеток Р815 наивным мышам DBA/2, и ● указывает результат повторной инокуляции клеток Р815 мышам, которые демонстрировали полную регрессию опухоли.

Результаты, показанные на Фиг. 9, демонстрируют то, что мыши, которые были излечены введением Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и моноклонального антитела против PD-1, сохраняли их устойчивость к раковым клеткам даже в сутки 117.

Получение Т-клеток с CAR, экспрессирущих IL-7 и CCL19 Контрольный вектор с CAR против hCD20 и вектор с CAR против hCD20, экспрессирующий IL-7/CCL19, получали согласно способу, описанному в абзацах [0061]-[0066] WO 2016/56228, и вводили в 3×10⁶ очищенных мышиных Т-клеток, полученных из селезенки и лимфатических узлов мышей DBA/2, с получением Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, или Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20. Контрольный вектор с CAR против hCD20 представляет собой вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR против hCD20, и вектор с CAR против hCD20, экспрессирующий IL-7/CCL19, представляет собой вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR против hCD20-F2A-IL-7-F2A-CCL19 в данном порядке.

Анализ противоракового эффекта, продуцированного введением мышам, несущим опухоль

В сутки 0 5×10⁵ опухолевых клеток P815-hCD20, суспендированных в 0,1 мл HBSS, подкожно инокулировали в бока самцов мышей DBA/2 в возрасте от 6 до 12 недель (см. Nat Biotechnol. 2018; 36(4): 346-351). В сутки 11 мышам внутрибрюшинно вводили циклофосфамид (CPA, 100 мг/кг), который представляет собой противораковое средство. Мышей делили на пять групп, и последующую обработку проводили следующим образом.

Группа 1 не получала ни введения Т-клеток, экспрессирующих CAR, ни введения антитела.

Группа 2 получала внутрибрюшинное введение моноклонального антитела против PD-1 каждые 4 или 5 суток всего пять раз, начиная с суток 17.

Группа 3 получала внутривенное введение 0,25×10⁶ Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20, в сутки 14 и получала внутрибрюшинное введение моноклонального антитела против PD-1 в дозе 100 мкг/индивида каждые 4-5 суток всего пять раз, начиная с суток 17.

Группа 4 получала внутривенное введение 0,25×10⁶ Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, в сутки 14 и получала внутрибрюшинное введение контрольного антитела IgG хомяка, которое не распознает PD-1, в дозе 100 мкг/индивида каждые 4-5 суток всего пять раз, начиная с суток 17.

Группа 5 получала внутривенное введение 0,25×10⁶ Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, в сутки 14 и получала внутрибрюшинное введение моноклонального антитела против PD-1 в дозе 100 мкг/индивида каждые 4-5 суток всего пять раз, начиная с суток 17.

Анализировали выживаемость соответствующих мышей, и объем опухоли каждой мыши измеряли дважды в неделю согласно приведенной выше методике с использованием цифрового циркуля. Результаты анализа выживаемости соответствующих мышей показаны на Фиг. 10А, и результаты измерения объема опухоли вплоть до суток 70 показаны на Фиг. 10Б-10Е. Указанные данные получали объединением результатов двух независимых экспериментов.

На Фиг. 10А-10Е × указывает мышей, которые не получали введения (объем выборки 10 мышей; приведенная выше группа 1), □ указывает мышей, которые получали введение одного моноклонального антитела против PD-1 (объем выборки 10 мышей; приведенная выше группа 2), ♦ указывает мышей, которые получали введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20, и моноклонального антитела против PD-1 (объем выборки 5 мышей; приведенная выше группа 3), о указывает мышей, которые получали введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, и контрольного антитела IgG хомяка, которое не распознает PD-1 (объем выборки 10 мышей; приведенная выше группа 4), и ● указывает мышей, которые получали введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, и моноклонального антитела против PD-1 (объем выборки 10 мышей; приведенная выше группа 5). На Фиг. 10Б-10Е N равно 5 для всех групп. На Фиг. 10А-10Е абсцисса представляет число суток, которые минули с момента подкожной инокуляции опухолевых клеток P815-hCD20. На Фиг. 10Б-10Е также показано число мышей, отторгающих опухоль (числитель) относительно общего числа мышей в каждой группе (знаменатель). Значения Ρ логрангового критерия составляли 0,7293 между группами □ и ♦, меньше 0,0001 между группами □ и ·, меньше 0,0001 между группами ♦ и ●, и меньше 0,0001 между группами о и ●.

Результаты, показанные на Фиг. 10А-10Е, демонстрируют то, что мыши, которые получали введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, и моноклонального антитела против PD-1 (●), достигали достоверно большей выживаемости и подавления увеличения объема опухоли солидной опухоли, даже когда Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19, и моноклональное антитело против PD-1 вводились в соответствующих им дозах, каждая из которых не дала бы достаточного противоракового эффекта при одиночном введении Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, или моноклонального антитела против PD-1. В отличие от этого, данный эффект не был получен у мышей (▲), которые получали введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20, и моноклонального антитела против PD-1, или мышей (о), которые получали введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, и контрольного антитела IgG.

Кроме того, доза Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20, была такой низкой как 0,25×10⁶ клеток, как описано выше, и обнаружили, что высокая эффективность достигалась даже с маленьким числом клеток в случае совместного введения с моноклональным антителом против PD-1.

Анализ инфильтрации лимфоцитов в опухолевую ткань

В сутки 0 опухолевые клетки Р815 инокулировали мышам DBA/2, а в сутки 7 внутривенно инъецировали им P1A-TCRT клетки, экспрессрующие eGFP, или Р1А-7×19 TCRT клетки, экспрессрующие eGFP. Перед инъекцией чистоту данных клеток увеличивали таким образом, что доля eGFP-позитивных клеток становилась больше, чем 95%. Опухолевые клетки отбирали и перерабатывали в суспензию одиночных клеток, в сутки 12 подсчитывали число клеток и проверяли экспрессию c-kit, eGFP, CDllc, CD3, CD4 и CD8 посредством анализа проточной цитометрией. На Фиг. 11А показан репрезентативный точечный график. На данной Фиг. показана доля c-kit-негативных клеток, которые были идентифицированы как неопухолевые клетки (верхняя левая панель), доля СD-3-негативных/СD11с-позитивных дендритных клеток в популяции c-kit-негативных клеток (верхняя правая панель), доля эндогенных Т-клеток, которые были СD3-позитивными/еGFР-негативными, и доля инъецированных P1A-TCRT клеток, которые были СD3-позитивными/еGFР-позитивными (средняя панель). На Фиг. 11А «Conv. Ρ1А-Т-клетки» представляет группу, которая получала введение P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, и «7×19 P1A-Т-клетки» представляет группу, которая получала введение Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP. Показана доля СD4-позитивных клеток или CD8-позитивных клеток в популяции эндогенных Т-клеток (левая нижняя панель) и доля инъецированных P1A-TCRT клеток (нижняя правая панель). На Фиг. 11Б показано число клеток разных инфильтрующих опухоль лимфоцитов на 1×10⁵ опухолевых клеток Р815 в показателях среднего значения и стандартного отклонения (SD) (n равно 5). «DC» представляет дендритные клетки, «Эндогенные Т» представляет эндогенные Т-клетки, и «Р1А-Т» представляет P1A-TCRT клетки. Незакрашенные столбики указывают поднаборы инфильтрующих опухоль лимфоцитов у мышей, которых обрабатывали P1A-TCRT клетками, экспрессирующими eGFP, и черные закрашенные столбики указывают поднаборы инфильтрующих опухоль лимфоцитов у мышей, которых обрабатывали Р1А-7×19 TCRT клетками, экспрессирующими eGFP. Кроме того, * представляет Ρ менее 0,05, ** представляет Ρ менее 0,01, и *** представляет Ρ менее 0,001.

Для того, чтобы отделить инфильтрующие опухоль лимфоциты от опухолевых клеток Р815 использовали окрашивание c-kit. Известно, что мастоцитома Р815 является высокопозитивной в отношении окрашивания c-kit, и что дендритные клетки и Т-клетки являются менее позитивными в отношении окрашивания c-kit. Результаты на Фиг. 11А и 11Б во-первых демонстрируют то, что доля c-kit-негативных инфильтрующих опухоль лимфоцитов у мышей с инъекцией Р1А-7х19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, была выше, чем доля c-kit-негативных инфильтрующих опухоль лимфоцитов у мышей с инъекцией P1A-TCRT клеткок, экспрессирующих eGFP. Доля CD3-негативных/CD 1 lc-позитивных дендритных клеток в поднаборе c-kit-негативных инфильтрующих опухоль лимфоцитов также показана на Фиг. 11А. Фиг. 11А также показывает долю экспрессии CD4 и CD8 в поднаборе эндогенных Т-клеток, которые являются СВв-позитивными/еОРР-негативными, и в поднаборе с инъекцией P1A-TCRT клеток или Р1А-7х19 TCRT клеток, которые являются CD3-позитивными/еОРР-позитивными. Дальнейший анализ окрашивания CD4/CD8 выявил то, что число инфильтрующих опухоль дендритных клеток, число С04-позитивных и С08-позитивных эндогенных Т-клеток и число С08-позитивных Р1А-Т-клеток у мышей, обработанных Р1А-7×19 TCRT клетками, экспрессирующими eGFP, было заметно выше, чем таковые у мышей, обработанных P1A-TCRT клетками, экспрессирующими eGFP. Это продемонстрировано на Фиг. 11Б. На Фиг. 11Б черные закрашенные столбики (поднабор инфильтрующих опухоль лимфоцитов у мышей, обработанных Р1А-7×19 TCRT клетками, экспрессирующими eGFP) демонстрируют большее число клеток, чем незакрашенные столбики (поднабор инфильтрующих опухоль лимфоцитов у мышей, обработанных P1A-TCRT клетками, экспрессирующими eGFP) по отношению к каждым из «DC» (дендритные клетки), «эндогенным Т» (эндогенные Т-клетки) и инъецированным P1A-TCRT клеткам или Р1А-7×19 TCRT клеткам. Данные результаты поддерживают важность роли эндогеных Т-клеток в лечении Р1А-7×19 TCRT клетками, экспрессирующими eGFP. Это согласуется с тем фактом, что синергический эффект получали от комбинации моноклонального антитела против PD-1 и Р1А-7×19 TCRT клеток, экспрессирующих eGFP, но не от комбинации моноклонального антитела против PD-1 и P1A-TCRT клеток, экспрессирующих eGFP.

Получение экспрессионного вектора с CAR против ЬСО20-антителом против PD-1

Конструкцию, имеющую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, вводили в ретровирусный экспрессионный вектор pMSGV (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445(2002)) с использованием сайтов Ncol и Salí, с получением вектора pMSGV, содержащего CAR с scFv против hCD20 и scFv против mPD-1 (далее также именуемого «экспрессионный вектор с CAR против Ь.СО20-антителом против PD-1»). Организация полученного вектора показана на Фиг. 12 в виде традиционного scFv CAR-PD-1. В последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, считая с 5'-конца, нуклеотиды в положениях 1-57 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерную последовательность, нуклеотиды в положениях 58-375 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь scFv против hCD20, нуклеотиды в положениях 376-420 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей линкер, нуклеотиды в положениях 421-783 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь scFv против hCD20, нуклеотиды в положениях 793-1635 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транс мембранный домен и цитоплазматический домен, нуклеотиды в положениях 1642-1716 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид 2А, нуклеотиды в положениях 1717-1773 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерную последовательность, нуклеотиды в положениях 1774-2106 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь scFv против mPD-1, нуклеотиды в положениях 2107-2151 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей линкерную последовательность, нуклеотиды в положениях 2152-2505 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь scFv против mPD-1, нуклеотиды в положениях 2506-2529 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей метку FLAG, и нуклеотиды в положениях 2539-2556 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей His метку.

В экспрессионном векторе с CAR против hСD20-антителом против PD-1 и экспрессионном векторе с CAR против hСD20-IL-7/ССL19-антителом против PD-1, описанных ниже, использованный пептид 2А представлял собой пептид 2А вируса ящура (также именуемый «пептид F2A»). Пептид 2А, вставленный между данными генами, обеспечивает одновременную экспрессию многих полипептидов. Кроме того, как описано выше, экспрессионный вектор с CAR против hСD20-антителом против PD-1 и экспрессионный вектор с CAR против hСD20-IL-7/ССL19-антителом против PD-1, описанные ниже, содержат последовательности метки FLAG и His метки (His × 6).

Аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 15, показана как SEQ ID NO: 16. В SEQ ID NO: 16, считая с N-конца, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 1 до положения 545, представляет собой аминокислотную последовательность CAR против hCD20, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 548 до положения 572, представляет собой аминокислотную последовательность пептида 2А, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 592 до положения 702, представляет собой аминокислотную последовательность VL против mPD-1, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 703 до положения 717, представляет собой аминокислотную последовательность линкера, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 718 до положения 835, представляет собой аминокислотную последовательность VH против mPD-1, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 836 до положения 843, представляет собой аминокислотную последовательность метки FLAG, и аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 847 до положения 852, представляет собой аминокислотную последовательность His метки.

Получение экспрессионного вектора с CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антителом против PD-1

Конструкцию с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17 вводили в ретровирусный экспрессионный вектор pMSGV (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445(2002)) с использованием сайтов Ncol и Salí с получением вектора pMSGV, содержащего CAR с scFv против hCD20, mIL-7, mCCL19 и scFv против mPD-1 (далее также именуемого «экспрессионный вектор с CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антителом против PD-1»). Организация полученного вектора показана на Фиг. 12 как scFv 7x19 CAR-PD-1. В последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, считая с 5'-конца, нуклеотиды в положениях 1-57 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерную последовательность, нуклеотиды в положениях 58-375 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь scFv против hCD20, нуклеотиды в положениях 376-420 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей линкер, нуклеотиды в положениях 421-783 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь scFv против hCD20, нуклеотиды в положениях 792-1038 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мышиный CD8, нуклеотиды в положениях 1039-1161 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мышиный CD28, нуклеотиды в положениях 1162-1296 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мышиный 4-1ВВ, нуклеотиды в положениях 1297-1635 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей мышиный 0Β6ζ, нуклеотиды в положениях 1642-1716 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид 2А, нуклеотиды в положениях 1720-1794 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерную последовательность mIL-7, нуклеотиды в положениях 1720-2181 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей mIL-7, нуклеотиды в положениях 2182-2256 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид 2А, нуклеотиды в положениях 2257-2331 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерную последовательность mCCL19, нуклеотиды в положениях 2257-2580 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей mCCL19, нуклеотиды в положениях 2584-2658 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид 2А, нуклеотиды в положениях 2659-2715 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей лидерную последовательность, нуклеотиды в положениях 2716-3048 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь scFv против mPD-1, нуклеотиды в положениях 3049-3093 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей линкерную последовательность, нуклеотиды в положениях 3094-3447 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь scFv против mPD-1, нуклеотиды в положениях 3448-3471 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей метку FLAG, и нуклеотиды в положениях 3480-3497 соответствуют последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей His метку.

Аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 17, показана как SEQ ID NO: 18. В SEQ ID NO: 18, считая от N-конца, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 1 до положения 261, представляет собой аминокислотную последовательность scFv против hCD20, последовательность, простирающаяся от положения 265 до положения 346, представляет собой аминокислотную последовательность mCD8, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 347 до положения 387, представляет собой аминокислотную последовательность mCD28, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 388 до положения 432, представляет собой аминокислотную последовательность т4-1ВВ, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 433 до положения 545, представляет собой аминокислотную последовательность mCD3, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 548 до положения 572, представляет собой аминокислотную последовательность пептида 2А, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 574 до положения 727, представляет собой аминокислотную последовательность mIL-7, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 728 до положения 752, представляет собой аминокислотную последовательность пептида 2А, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 753 до положения 860, представляет собой аминокислотную последовательность mCCL19, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 862 до положения 886, представляет собой аминокислотную последовательность пептида 2А, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 906 до положения 1016, представляет собой аминокислотную последовательность VL против mPD-1, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 1017 до положения 1031, представляет собой аминокислотную последовательность линкера, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 1032 до положения 1149, представляет собой аминокислотную последовательность VH против mPD-1, аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 1150 до положения 1157, представляет собой аминокислотную последовательность метки FLAG, и аминокислотная последовательность, простирающаяся от положения 1161 до положения 1166, представляет собой аминокислотную последовательность His метки.

Получение ретровируса, в который был введен экспрессионный вектор с CAR против hСD20-антителом против PD-1 или экспрессионный вектор с CAR против hСD20-IL-7/ССL19-антителом против PD-1

Получали ретровирусные векторы для трансдукции мышиных Т-клеток. С использованием LIPOFECTAMINE (зарегистрированный товарный знак) 2000 или 3000 (изготовлен Life Technologies Corporation), упаковывающие клетки GP2-293 (изготовленные Takara Bio Inc.) трансфицировали экспрессионным вектором с CAR против hСD20-антителом против PD-1 или экспрессионным вектором с CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антителом против PD-1, описанными выше, и ретровирусной упаковывающей плазмидой pCL-Eco (изготовлена Imgenex) с получением ретровируса, в который был введен экспрессионный вектор с CAR против ЬСО20-антителом против PD-1 или экспрессионный вектор с CAR против hСD20-IL-7/ССL19-антителом против PD-1. Супернатант, содержащий ретровирус, отбирали через 48 часов после трансфекции.

Культуральная жидкость, используемая для клеток GP2-293, представляла собой DMEM, дополненную 10% FCS, 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культуральная жидкость, используемая для Т-клеток в описанных позднее примерах, представляла собой RPMI-1640, дополненную 10% FCS, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 50 мМ 2-меркаптоэтанолом и 2 мМ L-глутамином.

Аналогичным образом получали экспрессионный вектор, который отличается от экспрессионного вектора с CAR против hСD20-антителом против PD-1 только тем, что данный экспрессионный вектор не включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую scFv против PD-1 (далее также именуемый экспрессионный вектор с CAR против hCD20), и экспрессионный вектор, который отличается от экспрессионного вектора с CAR против hСD20-IL-7/ССL19-антителом против PD-1 только тем, что данный экспрессионный вектор не включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую scFv против PD-1 (далее также именуемый экспрессионный вектор с CAR против hCD20-IL-7/CCL19), и ретровирусные векторы получали таким же способом с использованием данных экспрессионных векторов.

Трансдукция мышиных Т-клеток

Для осуществления трансдукции в мышиные Т-клетки очищенные мышиные Т-клетки, полученные из селезенки и лимфатических узлов, активировали иммобилизованным моноклональным антителом против CD3 (3 мкг/мл), моноклональным антителом против CD28 (1 мкг/мл) и IL-2 (100 IU/мл) в течение 48 часов. Затем супернатант, содержащий ретровирус, в который был введен экспрессионный вектор с CAR против hСD20-антителом против PD-1, экспрессионный вектор с CAR против hСD20-IL-7/ССL19-антителом против PD-1, экспрессионный вектор с CAR против hCD20 или экспрессионный вектор с CAR против hCD20-IL-7/CCL19, смешивали с описанными выше мышиными Т-клетками (1 × 10⁶ клеток/мл), которые были активированы на планшете, покрытом 25 мкг/мл RETRONECTIN (зарегистрированный товарный знак, изготовлен Takara Bio Inc.), центрифугировали при 1500 об./мин в течение 2 часов и затем культивировали в присутствии IL-2 (100 IU/мл) в течение 6 часов. Для удаления ретровируса из культуральной среды мышиные Т-клетки отбирали, переносили в новую ростовую среду (RPMI), содержащую IL-2 (100 IU/мл), и культивировали в течение еще 42 часов с получением мышиных Т-клеток, трансдуцировнных экспрессионным вектором с CAR против hСD20-антителом против PD-1 (также именуемых далее «Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-антитело против PD-1»), мышиных Т-клеток, трансдуцировнных экспрессионным вектором с CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антителом против PD-1 (также именуемых далее «Т-клетки, экспрессирующие CAR против hСD20-IL-7/ССL19-антитело против PD-1»), мышиных Т-клеток, трансдуцировнных экспрессионным вектором с CAR против hCD20 (также именуемых далее «Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20»), или мышиных Т-клеток, трансдуцировнных экспрессионным вектором с CAR против hCD20-IL-7/CCL19 (также именуемых далее «Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19»).

Для выявления экспрессии CAR нетрансдуцированные Т-клетки (обозначенные на Фиг. 13 как «uninf.») или Т-клетки, трансдуцированные разными ретровирусными векторами, кодирующими вышеописанный CAR, окрашивали биотинилированным рекомбинантным белком L (также обозначен как «proteinL-bil») и затем окрашивали стрептавидином, конъюгированным с аллофикоцианином (также обозначенным «sav-арс»). Уровень экспрессии CAR анализировали посредством проточной цитометрии. Результаты показаны на Фиг. 13.

На Фиг. 13 и последующих Фиг. «uninf.» представляет нетрансдуцированные Т-клетки, «conv.» представляет Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20, «conv./PD-l» представляет Т-клетки, экспрессирующие CAR против hСD20-антитело против PD-1, «7×19» представляет Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19, и «7×l9/PD-l» представляет Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/ССL19-антитело против PD-1. В данных для каждого типа Т-клеток на Фиг. 13 левый график представляет собой график FSC-SSC (прямое светорассеяние-боковое светорассеяние), и правый график представляет собой график, показывающий позитивность окрашивания аллофикоцианина (абсцисса) и числа клеток (ордината). Гистограмма, показанная на правом графике, представляет долю (%) клеток, которые были позитивными в отношении окрашивания. Как показано на Фиг. 13, в отличие от нетрансдуцированных Т-клеток, Т-клетки, трансдуцированные ретровирусным вектором, кодирующим CAR, экспрессировали CAR согласно ожиданию.

Перед применением разных Т-клеток с CAR в экспериментах измеряли концентрацию IL-7 и концентрацию CCL19 с использованием набора ELISA. В частности, нетрансдуцированные Т-клетки, Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20, Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19, Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-антитело против PD-1, или Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антителo против PD-1, культивировали в течение 2 суток, их кондиционированную среду отбирали, и концентрации IL-7 и CCL19 в кондиционированной среде измеряли с использованием имеющегося в продаже набора ELISA (R&D systems). Результаты показаны на Фиг. 14. На Фиг. 14 на графике показаны среднее значение по лункам в тройной повторности, а также его стандартное отклонение. На каждом графике данные организованы в порядке слева направо: нетрансдуцированные Т-клетки (uninf.), Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20 (conv.), Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19 (7×19), Т-клетки, экспрессирующие CAR против hСD20-антитело против PD-1 (conv./PD-l), Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19-aнтитело против PD-1 (7xl9/PD-l), и только культуральная среда (данные, полученные проведением такой же обработки на культуральной среде, в которую не были добавлены Т-клетки). Как показано на Фиг. 14, экспрессия IL-7 и CCL19 наблюдалась в случае Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19 (7×19), и в случае Т-клеток, экспрессирующих CAR против hСD20-IL-7/ССL19-антитело против PD-1 (7×l9/PD-l).

Перед применением в экспериментах разных Т-клеток с CAR измеряли концентрацию scFv против mPD-1 (также именуемого PD-lscFv) с использованием двух видов набора ELISA. В частности, кондиционированную среду нетрансдуцированных Т-клеток, Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20, Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, Т-клеток, экспрессирующих CAR против пСО20-антитело против PD-1, или Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антитело против PD-1, отбирали после 2 суток культивирования, и концентрации IL-7 и CCL19 в данной кондиционированной среде измеряли с использованием ELISA. В ELISA рекомбинантный слитый белок, включающий мышиный PD-1 и часть Fe иммуноглобулина иммобилизовали в лунках, scFv против PD-1 захватывали на ней, и использовали для выявления антитело против метки FLAG или антитело против 6xHis метки. Результаты показаны на Фиг. 15. На Фиг. 15 на графике показаны среднее значение по лункам в тройной повторности, а также его стандартное отклонение. На каждом графике данные организованы слева направо: нетрансдуцированные Т-клетки (uninf.), Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20 (conv.), Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19 (7×19), Т-клетки, экспрессирующие CAR против пСО20-антитело против PD-1 (conv./PD-l), Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антителo против PD-1 (7×19/PD-l), и только культуральная среда (данные, полученные проведением такой же обработки на культуральной среде, в которую не были добавлены Т-клетки). Как показано на Фиг. 15, экспрессию scFv против PD-1 наблюдали в случае Т-клеток, экспрессирующих CAR против hСD20-антитело против PD-1 (conv./PD-l), и в случае Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/ССL19-антитело против PD-1 (7×19/PD-l).

Анализ противоракового эффекта, продуцированного введением мышам, несущим опухоль

В сутки 0 5×10⁵ опухолевых клеток P815-hCD20, суспендированных в 0,1 мл HBSS (см. Nat Biotechnol. 2018; 36(4): 346-351), подкожно инокулировали в бока самцов мышей DBA/2 в возрасте от 6 до 12 недель. В сутки 11 мышам внутрибрюшинно вводили циклофосфамид (CPA, 100 мг/кг), который представляет собой противораковое средство. Мышей делили на пять групп, и последующую обработку проводили следующим образом.

Группа 1 не получала введения каких-либо Т-клеток, экспрессирующих CAR.

Группа 2 получала внутривенное введение 0,25 × 10⁶ Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20, в сутки 14.

Группа 3 получала внутривенное введение 0,25 × 10⁶ Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, в сутки 14.

Группа 4 получала внутривенное введение 0,25 × 10⁶ Т-клеток, экспрессирующих CAR против hСD20-антитело против PD-1, в сутки 14.

Группа 5 получала внутривенное введение 0,25 × 10⁶ Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антитело против PD-1, в сутки 14.

Анализировали выживаемость соответствующих мышей, и объем опухоли каждой мыши измеряли дважды в неделю согласно приведенной выше методике с использованием цифрового циркуля. Результаты анализа выживаемости соответствующих мышей показаны на Фиг. 16, и результаты измерения объема опухоли вплоть до суток 70 показаны на Фиг. 17. На Фиг. 17 объем опухоли на протяжении первых 14 суток показан в увеличеном виде на правой стороне каждого графика.

На Фиг. 17 «только сра» представляет группу 1 (группа, которая получала введение циклофосфамида, но не получала введение Т-клеток, экспрессирующих CAR). На Фиг. 17 N равно 10 для всех групп. На Фиг. 17 абсцисса представляет число суток от подкожной инокуляции опухолевых клеток P815-hCD20. Результаты логрангового критерия в отношении времени выживания мышей между соответствующими группами указаны в показателях значений Ρ в таблице и внизу Фиг. 16.

Результаты, показанные на Фиг. 16, демонстрируют то, что выживание мышей, несущих P815-hCD20, примечательно возрастало посредством применения Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антитело против PD-1, которые соответствуют иммунореактивным клеткам С согласно настоящему раскрытию. В частности, примечательным результатом было то, что 50% мышей все еще были живыми после 98 суток в случае, при котором использовались Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антитело против PD-1, хотя большинство мышей и умирало во время периода анализа в случае, при котором использовались Т-клетки, экспрессирующие CAR против hСD20-антитело против PD-1, или в случае, при котором использовались Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19. Данные результаты демонстрируют то, что даже в случае лечения рака, который сложно лечить иммунореактивной клеткой, экспрессирующей интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, но не экспрессирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, или иммунореактивной клеткой, экспрессирующей полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной повехности, которая специфично распознает раковый антиген, но не экспрессирующей интерлейкин-7 или CCL19, такой рак можно лечить иммунореактивной клеткой С согласно настоящему раскрытию. Кроме того, значения Ρ демонстрируют то, что терапевтический эффект, оказываемый Т-клетками, экспрессирующими CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антитело против PD-1, является высоким терапевтическим эффектом, который статистически явно отличается от результатов, полученных в других группах.

Как можно видеть из сравнения между количеством scFv против PD-1, экспрессируемым Т-клетками, экспрессирующими CAR против hСD20-антитело против PD-1, и количеством scFv против PD-1, экспрессируемым Т-клетками, экспрессирующими CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антитело против PD-1, на Фиг. 15, Т-клетки, экспрессирующие CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антитело против PD-1 проигрывают в показателях введения и экспрессии из-за большего числа введенных генов, что приводит к большей длине нуклеотидов. При рассмотрении данного момента будет понятно то, что терапевтический эффект, продуцируемый Т-клетками, экспрессирующими CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антитело против PD-1, обсуждавшийся выше, является неожиданным.

Из результатов, показанных на Фиг. 17, также можно понять то, что само увеличение объема опухоли подавлялось у мышей, которые получали введение Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19-антитело против PD-1. Данное подавление увеличения объема опухоли было не только очевидным по сравнению со случаем без введения Т-клеток, экспрессирующих CAR (только сра), и случаем введения Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20 (conv.), но также очевидным по сравнению со случаем введения Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20-IL-7/CCL19, и случаем введения Т-клеток, экспрессирующих CAR против hСD20-антитело против PD-1.

Доза Т-клеток, экспрессирующих CAR против hCD20, была такой низкой как 0,25×10⁶ клеток, как описано выше, и было продемонстрировано то, что высокая эффективность достигалась даже с маленьким числом клеток.

Как описано выше, в Примерах демонстрируется то, что высокий терапевтический эффект против раковых клеток может быть получен на основе комбинированных лекарственных средств и иммунореактивных клеток согласно разным аспектам настоящего раскрытия.

Типичные воплощения настоящего раскрытия включают следующие воплощения.

1. Комбинированное лекарственное средство для применения в лечении рака у субъекта, включающее:

(а) иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген; и

(б) ингибитор иммуносупрессии.

2. Комбинированное лекарственное средство по п. 1, где иммунореактивную клетку и ингибитор иммуносупрессии вводят раздельно в разное время.

3. Комбинированное лекарственное средство по п. 1 или п. 2, где нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрирована в геном иммунореактивной клетки, или нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрированы совместно или раздельно в один или более чем один вектор, присутствующий в иммунореактивной клетке.

4. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-3, где иммунореактивная клетка происходит из самого субъекта.

5. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-4, где иммунореактивная клетка выбрана из группы, состоящей из лимфоцитарных клеток, таких как Т-клетки, природные клетки-киллеры (NK-клетки) и В-клетки, антигенпрезентирующих клеток, таких как моноциты, макрофаги и дендритные клетки, и нейтрофилов, эозинофилов, базофилов и тучных клеток.

6. Комбинированное лекарственное средство для применения в лечении рака у субъекта, включающее:

(а) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителя для доставки нуклеиновых кислот, или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19; и

б) ингибитор иммуносупрессии.

7. Комбинированное лекарственное средство по п. 6, где один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация включают по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из иммунореактивной клетки, вируса, анаэробного микроорганизма, липосомы, мезенхимной стволовой клетки (MSC) и наночастицы.

8. Комбинированное лекарственное средство по п. 6 или п. 7, где один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация имеют на их поверхности молекулу, которая специфично распознает раковый антиген.

9. Комбинированное лекарственное средство по п. 6 или п. 7, где один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация дополнительно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, и данная молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой химерный рецептор антигена (CAR) или рецептор Т-клетки (TCR).

10. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 6-9, где ингибитор иммуносупрессии представляет собой полипептид, и клетки, носители для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация совместно дополнительно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, ингибирующий иммуносупрессию.

11. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 6-9, где клетки, носители для доставки нуклеиновых кислот или их комбинация и ингибитор иммуносупрессии вводятся раздельно в разное время.

12. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-5, где молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой химерный рецептор антигена (CAR) или рецептор Т-клетки (TCR).

13. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-12, где ингибитор иммуносупрессии включает по меньшей мере один ингибитор, выбранный из группы, состоящей из ингибитора PD-1, ингибитора PD-L1, ингибитора PD-L2, ингибитора CTLA-4, ингибитора BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), ингибитора TIM-3 (иммуноглобулин и домен 3 муцина Т-клетки), ингибитора TIGIT (иммунорецептор Т-клетки с доменами Ig и ITIM), ингибитора LAG-3 (ген-3 активатора лимфоцитов) и ингибитора Siglec-15.

14. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-13, где ингибитор иммуносупрессии представляет собой антитело.

15. Комбинированное лекарственное средство по п. 14, где антитело представляет собой моноклональное антитело IgG или фрагмент антитела.

16. Комбинированное лекарственное средство по любому из пп. 1-15, где рак представляет собой солидный рак.

17. Лекарственное средство для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии в лечении рака у субъекта, содержащее (1) иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, или (2) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

18. Лекарственное средство для комбинированного применения с (1) иммунореактивной клеткой, экспрессирующей интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, или (2) одним или более чем одним видом клеток, одним или более чем одним видом носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацией, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в лечении рака у субъекта, причем данное лекарственное средство включает ингибитор иммуносупрессии.

19. Лекарственное средство по п. 17 или п. 18 для применения в способе, при котором ингибитор иммуносупрессии и иммунореактивная клетка или один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацию вводят раздельно в разное время.

20. Лекарственное средство, включающее (1) иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, или (2) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, причем данное лекарственное средство содержится в контейнере, несущем указание инструкции для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии.

21. Продукт, включающий:

этикетку, описывающую инструкцию для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии, и

контейнер, содержащий лекарственное средство, включающее (1) иммунореактивную клетку, экспрессирующую IL-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, или (2) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

22. Фармацевтическая композиция для применения в лечении рака у субъекта, включающая:

(а) (1) иммунореактивную клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, или (2) один или более чем один вид клеток, один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот или их комбинацию, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19; и

(б) ингибитор иммуносупрессии.

23. Фармацевтическая композиция по п. 22, где молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой химерный рецептор антигена (CAR) или рецептор Т-клетки (TCR).

24. Иммунореактивная клетка, экспрессирующая интерлейкин-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

25. Иммунореактивная клетка по п. 24, где нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрированы в геном данной иммунореактивной клетки, или нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрированы совместно или раздельно в один или более чем один вектор, присутствующий в иммунореактивной клетке.

26. Иммунореактивная клетка по п. 25, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, интегрирована в геном данной иммунореактивной клетки, или интегрирована в вектор, который является таким же, как и один или более чем один вектор, которые присутствуют в иммунореактивной клетке, или отличным от любого одного или более чем одного вектора, которые присутствуют в иммунореактивной клетке.

27. Иммунореактивная клетка по любому из пп. 24-26, где молекула клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген, представляет собой химерный рецептор антигена (CAR) или рецептор Т-клетки (TCR).

28. Иммунореактивная клетка по любому из пп. 24-27, где полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, включает по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, состоящей из полипептида, ингибирующего PD-1, полипептида, ингибирующего PD-L1, полипептида, ингибирующего PD-L2, полипептида, ингибирующего CTLA-4, полипептида, ингибирующего BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), полипептида, ингибирующего TIM-3 (иммуноглобулин и домен 3 муцина Т-клетки), полипептида, ингибирующего TIGIT (иммунорецептор Т-клетки с доменами Ig и ITIM), полипептида, ингибирующего LAG-3 (ген-3 активации лимфоцитов), и полипептида, ингибирующего Siglec-15.

29. Иммунореактивная клетка по любому из пп. 24-28, где полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, представляет собой антитело.

30. Иммунореактивная клетка по п. 29, где антитело представляет собой моноклональное антитело IgG или фрагмент антитела.

31. Иммунореактивная клетка по любому из пп. 24-30, где данная иммунореактивная клетка выбрана из группы, состоящей из лимфоцитарных клеток, таких как Т-клетки, природные клетки-киллеры (NK-клетки) и В-клетки, антигенпрезентирующих клеток, таких как моноциты, макрофаги и дендритные клетки, и нейтрофилов, эозинофилов, базофилов и тучных клеток.

32. Лекарственное средство, включающее иммунореактивную клетку по любому из пп. 24-31.

33. Лекарственное средство по п. 32 для применения в лечении рака у субъекта.

34. Лекарственное средство по п. 33, где рак представляет солидный рак.

35. Лекарственное средство по п. 33 или п. 34, где иммунореактивная клетка происходит из самого субъекта.

36. Один или более чем один вид носителей для доставки нуклеиновых кислот, которые совместно включают нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, ингибирующий иммуносупрессию.

37. Носители для доставки нуклеиновых кислот по п. 36, дополнительно включающие нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу клеточной поверхности, которая специфично распознает раковый антиген.

В данной заявке испрашивается приоритет от японской патентной заявки № 2019-195407, поданной 28 октября 2019 г. Раскрытие японской патентной заявки № 2019-195407 включается сюда посредством ссылки во всей его полноте.

Все публикации, патентные заявки и технические стандарты, упомянутые в данном описании изобретения, включаются сюда посредством ссылки в той же самой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патентная заявка или технический стандарт были конкретно и индивидуально указаны как включенные посредством ссылки.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Раскрыты применения комбинированного лекарственного средства для лечения солидного рака у субъекта, содержащего Т-клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 (лиганд 19 хемокина с мотивом С-С) и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген и ингибитор иммуносупрессии, где ингибитор иммуносупрессии представляет собой моноклональное антитело IgG или его фрагмент, лекарственное средство для лечения солидного рака, содержащее Т-клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген, набор и фармацевтическая композиция для применения в лечении солидного рака у субъекта, включающий контейнер, содержащий лекарственное средство. Также представлены Т-клетка, экспрессирующая интерлейкин-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие интерлейкин-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген, и лекарственное средство для лечения солидного рака, содержащее указанную Т-клетку. Группа изобретений применяется для лечения солидного рака у субъекта. 9 н. и 10 з.п. ф-лы, 17 ил., 1 пр.

1. Применение комбинированного лекарственного средства, содержащего:

(а) Т-клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 (лиганд 19 хемокина с мотивом С-С) и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген; и

(б) ингибитор иммуносупрессии,

где ингибитор иммуносупрессии представляет собой моноклональное антитело IgG или его фрагмент, в лечении солидного рака у субъекта.

2. Применение по п. 1, в котором Т-клетку и ингибитор иммуносупрессии вводят раздельно в разное время.

3. Применение по п. 1 или 2, в котором нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрированы в геном Т-клетки, или нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрированы совместно или раздельно в один или более чем один вектор, присутствующий в Т-клетке.

4. Применение по любому из пп. 1-3, в котором Т-клетка происходит из самого субъекта.

5. Применение по любому из пп. 1-4, в котором ингибитор иммуносупрессии содержит по меньшей мере один ингибитор, выбранный из группы, состоящей из ингибитора PD-1 (рецептор программируемой клеточной гибели 1), ингибитора PD-L1 (лиганд рецептора программируемой клеточной гибели 1), ингибитора PD-L2, ингибитора CTLA-4 (антиген-4 цитотоксических Т-лимфоцитов), ингибитора BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), ингибитора TIM-3 (Т-клеточный белок, содержащий иммуноглобулин- и муцин-домены 3), ингибитора TIGIT (иммунорецептор Т-клетки с доменами Ig и ITIM (иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив)), ингибитора LAG-3 (ген-3 активатора лимфоцитов) и ингибитора Siglec-15 (Ig-подобный лектин, связывающий сиаловую кислоту-15).

6. Применение лекарственного средства в комбинации с ингибитором иммуносупрессии в лечении солидного рака у субъекта, где лекарственное средство содержит Т-клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген,

где ингибитор иммуносупрессии представляет собой моноклональное антитело IgG или его фрагмент.

7. Применение лекарственного средства в комбинации с Т-клеткой, экспрессирующей интерлейкин-7, CCL19 и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген, в лечении солидного рака у субъекта, где лекарственное средство содержит ингибитор иммуносупрессии, который представляет собой моноклональное антитело IgG или его фрагмент.

8. Применение по п. 6 или 7, при котором ингибитор иммуносупрессии и Т-клетка вводятся раздельно в разное время.

9. Лекарственное средство для лечения солидного рака, содержащее Т-клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген, причем данное лекарственное средство содержится в контейнере, несущем указание инструкции для комбинированного применения с ингибитором иммуносупрессии,

где ингибитор иммуносупрессии представляет собой моноклональное антитело IgG или его фрагмент.

10. Набор для применения в лечении солидного рака у субъекта, включающий контейнер, содержащий лекарственное средство, включающее Т-клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген, и этикетку, описывающую инструкцию по комбинированному применению с ингибитором иммуносупрессии, где ингибитор иммуносупрессии представляет собой моноклональное антитело IgG или его фрагмент.

11. Фармацевтическая композиция для применения в лечении солидного рака у субъекта, содержащая:

(а) Т-клетку, экспрессирующую интерлейкин-7, CCL19 и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген, и

(б) ингибитор иммуносупрессии,

где ингибитор иммуносупрессии представляет собой моноклональное антитело IgG или его фрагмент.

12. Т-клетка, экспрессирующая интерлейкин-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие интерлейкин-7, CCL19, полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, и химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген,

где полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, представляет собой моноклональное антитело IgG или его фрагмент.

13. Т-клетка по п. 12, в которой нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрированы в геном данной Т-клетки, или нуклеиновая кислота, кодирующая интерлейкин-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрированы совместно или раздельно в один или более чем один вектор, присутствующий в Т-клетке.

14. Т-клетка по п. 13, в которой нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, интегрирована в геном данной Т-клетки, или интегрирована в вектор, который является таким же, как один из одного или более чем одного вектора, которые присутствуют в Т-клетке, или отличным от любого одного или более чем одного вектора, которые присутствуют в Т-клетке.

15. Т-клетка по любому из пп. 12-14, где полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, содержит по меньшей мере один полипептид, выбранный из группы, выбранный из группы, состоящей из ингибитора PD-1 (рецептор программируемой клеточной гибели 1), ингибитора PD-L1 (лиганд рецептора программируемой клеточной гибели 1), ингибитора PD-L2, ингибитора CTLA-4 (антиген-4 цитотоксических Т-лимфоцитов), ингибитора BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), ингибитора TIM-3 (Т-клеточный белок, содержащий иммуноглобулин- и муцин-домены 3), ингибитора TIGIT (иммунорецептор Т-клетки с доменами Ig и ITIM (иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив)), ингибитора LAG-3 (ген-3 активатора лимфоцитов) и ингибитора Siglec-15 (Ig-подобный лектин, связывающий сиаловую кислоту-15).

16. Лекарственное средство для лечения солидного рака, содержащее Т-клетку по любому из пп. 12-15.

17. Лекарственное средство по п. 16, где Т-клетка происходит из самого субъекта.

18. Носитель для доставки нуклеиновых кислот, который представляет собой носитель одного вида для доставки нуклеиновых кислот или носители более чем одного вида для доставки нуклеиновых кислот, которые совместно содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7, нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, где полипептид, ингибирующий иммуносупрессию, представляет собой моноклональное антитело IgG или его фрагмент.

19. Носитель для доставки нуклеиновых кислот по п. 18, дополнительно содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), который специфично распознает раковый антиген.