ЭНХАНСЕР T-КЛЕТОК ИЛИ B-КЛЕТОК, ИМЕЮЩИХ ФУНКЦИЮ ПАМЯТИ, ИНГИБИТОР РЕЦИДИВА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ И ИНДУКТОР ДЛЯ ИНДУЦИРОВАНИЯ ФУНКЦИИ ПАМЯТИ В T-КЛЕТКАХ ИЛИ B-КЛЕТКАХ Российский патент 2023 года по МПК C07K14/52 C07K14/54 C12N15/09 A61K48/00 A61K35/17 A61P35/00 A61P37/02 

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к энхансеру T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти, в организме субъекта, которому его вводят, ингибитору рецидива злокачественной опухоли и индуктору для индуцирования функции памяти у T-клеток или B-клеток в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения препарата, причем упомянутый энхансер содержит носитель для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив).

Предшествующий уровень техники

[0002] Злокачественные опухоли представляет собой болезнь, поражающую многих людей во всем мире. Как правило, для борьбы с ними широко применяются химиотерапия, радиотерапия или хирургическое лечение. Однако существуют различные проблемы, такие как возникновение побочных реакций, потеря некоторых функций и необратимость рецидива или метастазирования. В связи с этим в последние годы развивается иммунная клеточная терапия для поддержания высокого качества жизни (КЖ) пациентов. Иммунная клеточная терапия представляет собой вариант терапии, включающий сбор иммунных клеток пациента, обработку иммунных клеток таким образом, чтобы усилить их иммунную функцию, амплификацию клеток и передачу клеток этому же пациенту. В частности, известен способ, который включает сбор Т-клеток пациента, введение нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, в Т-клетки, амплификацию Т-клеток и передачу Т-клеток этому же пациенту (см. документ 1, не относящийся к патентным). В настоящее время эта терапия проходит клинические испытания во всем мире и дает результаты, которые указывают на ее эффективность для лечения гемопоэтических злокачественных опухолей, таких как лейкемия или лимфома.

[0003] По меньшей мере, несколько сотен типов факторов, таких как цитокины, хемокины и сигнальные регуляторные белки, известны в качестве факторов регуляции иммунной функции у иммунных клеток, таких как Т-клетки. В их число входит интерлейкин-7 (IL-7), представляющий собой цитокин, необходимый для выживания Т-клеток, и продуцируемый, как известно, негемопоэтическими клетками, например, стромальными клетками костного мозга, тимуса и лимфоидных органов или тканей. Т-клетки, экспрессирующие химерный рецептор цитокинов IL-7 и альфа-IL-7R, слитых друг с другом (см. патентный документ 1), описаны как Т-клетки, использующие функцию IL-7. Однако химерный рецептор цитокинов в этих Т-клетках экспрессируется в виде одного гибридного белка способом, ограниченным поверхностью мембраны Т-клеток, несущей химерный рецептор цитокинов, и просто передает аутоантигенным клеткам сигналы цитокинов IL-7R или им подобных лиганд-независимым образом. Таким образом, химерный рецептор цитокинов не способен усиливать функцию тех Т-клеток, которые не несут этот рецептор.

[0004] В других публикациях говорится, что сниженная экспрессия CCL19, CCL21 или IL-7 ответственна за недостаточное поддержание зоны Т-клеток в селезенках мышей, мутантных по SIRP альфа (см. непатентный документ 2) и что CCL19, CCL21 или IL-7 несут функцию поддержания гомеостаза Т-клеток во вторичных лимфоидных тканях (селезенка или лимфатический узел) (см. непатентный документ 3). Однако в непатентных документах 2 и 3 показано воздействие на неактивированные Т-клетки, которые постоянно находятся в зонах Т-клеток вторичных лимфоидных тканей, но нет указаний на прямую связь с противоопухолевым иммунным ответом. Кроме того, в непатентных документах 2 и 3 клетки, экспрессирующие CCL19, CCL21 или IL-7, являются клетками ретикулоэндотелиальной системы, а не Т-клетками, находящимися во вторичных лимфоидных тканях.

[0005] В то же время авторы настоящего изобретения предложили иммунную клеточную терапию для существенного подавления солидного рака путем совместной экспрессии IL-7 и CCL19 (см. патентные документы 2 и 3). Этот метод может усиливать активацию эндогенных иммунных клеток или их способность накапливаться в опухолевых клетках хозяина (реципиента). Тем не менее, неясно, может ли иммунная клеточная терапия в течение длительного периода времени предотвращать рецидивы и т. п. и продолжать отторжение злокачественной опухоли.

Документы уровня техники

Патентные документы

[0006] Патентный документ 1: Международная публикация WO2013/123061

Патентный документ 2: Международная публикация WO2016/056228

Патентный документ 3: Международная публикация WO2017/159736

Непатентные документы

[0007] 1. Yozo Nakazawa, The Shinshu Medical Journal, 61 (4): 197-203 (2013)

2. SATO-HASHIMOTO M. et al., J. Immunol., 2011, vol. 187, no. 1, 291-7

3. SIEGERT S. et al., Front. Immunol., 2012, vol. 3, article 285

Сущность изобретения

Задача, которую должно решить изобретение

[0008] Как упомянуто выше, была разработана иммунная клеточная терапия с использованием CAR-экспрессирующих T-клеток, TCR-экспрессирующих T-клеток или аналогичных им, коэкспрессирующих IL-7 и CCL19, также в стадии разработки находятся методы значительного улучшения способности иммунных клеток к пролиферации, выживанию или способности иммунных клеток хозяина накапливаться и адаптироваться к солидному раку, при котором обычная терапия иммунными клетками не оказывает достаточного терапевтического эффекта. Однако злокачественная опухоль часто рецидивирует. Неясно, продолжает ли иммунная клеточная терапия отторгать злокачественную опухоль в течение длительного периода времени, даже если способна в течение некоторого времени лечить злокачественную опухоль. Кроме того, не обсуждались профилактические меры против рецидива. Поэтому задачей настоящего изобретения является создание энхансера эндогенных Т-клеток или В-клеток, имеющих функцию памяти, ингибитора рецидива злокачественной опухоли и индуктора для индуцирования функции памяти в эндогенных Т-клетках или В-клетках для продолжения отторжения злокачественной опухоли в течение длительного периода времени.

Средства решения указанной задачи

[0009] Авторы настоящего изобретения изучили дополнительные возможности ранее разработанных T-клеток, экспрессирующих CAR, IL-7 и CCL19, и в результате обнаружили, что: введение T-клеток субъекту индуцирует функцию памяти не только во введенных T-клетках, но и в эндогенных Т-клетках субъекта (хозяина) и увеличивает абсолютное количество клеток, имеющих функцию памяти; а в эксперименте на модели рецидива злокачественной опухоли это введение подавляет образование злокачественной опухоли в клетках, не имеющих антигена, который распознается CAR. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что использование TCR вместо CAR или использование вируса вместо T-клеток также приводит к аналогичным эффектам. На основании этих результатов было сделано настоящее изобретение.

[0010] Сущность настоящего изобретения следующая.

(1) Энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти, в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, содержит носитель для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив).

(2) Энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно пункту (1), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты представляет собой, по меньшей мере, один элемент, выбранный из группы, включающей иммунную клетку, вирус, анаэробный микроорганизм, липосому, мезенхимальную стволовую клетку (МСК) и наночастицу.

(3) Энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно пункту (1) или (2), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты обладает способностью накапливаться в клетках злокачественной опухоли или способностью специфически пролиферировать в клетках злокачественной опухоли.

(4) Энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно любому из пунктов (1) - (3), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты обладает цитотоксичностью по отношению к клеткам злокачественной опухоли.

(5) Энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно любому из пунктов (1) - (4), причем носителем для доставки нуклеиновой кислоты является иммунная клетка, при этом иммунная клетка содержит молекулу клеточной поверхности, которая распознает антиген злокачественной опухоли.

(6) Энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно пункту (5), при этом молекула клеточной поверхности, которая распознает антиген злокачественной опухоли, представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или T-клеточный рецептор (TCR).

(7) Энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно пункту (5) или (6), при этом иммунная клетка представляет собой T-клетку.

(8) Энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно любому из пунктов (1) - (7), при этом Т-клетки или В-клетки, имеющие функцию памяти, являются центральными Т-клетками памяти.

(9) Фармацевтическая композиция, содержащая энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно любому из пунктов (1) - (8), и фармацевтически приемлемую добавку.

(10) Ингибитор рецидива злокачественной опухоли, содержащий носитель для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив).

(11) Ингибитор рецидива злокачественной опухоли по пункту (10), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты представляет собой, по меньшей мере, один элемент, выбранный из группы, включающей иммунную клетку, вирус, анаэробный микроорганизм, липосому, мезенхимальную стволовую клетку (МСК) и наночастицу.

(12) Ингибитор рецидива злокачественной опухоли по пункту (10) или (11), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты обладает способностью накапливаться в клетках злокачественной опухоли или способностью специфически пролиферировать в клетках злокачественной опухоли.

(13) Ингибитор рецидива злокачественной опухоли по любому из пунктов (10) - (12), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты обладает цитотоксичностью в отношении клеток злокачественной опухоли.

(14) Ингибитор рецидива злокачественной опухоли по любому из пунктов (10) - (13), при этом носителем для доставки нуклеиновой кислоты является иммунная клетка, при этом иммунная клетка имеет молекулу клеточной поверхности, которая распознает антиген злокачественной опухоли.

(15) Ингибитор рецидива злокачественной опухоли по пункту (14), при этом носителем для доставки нуклеиновой кислоты является иммунная клетка, имеющая молекулу клеточной поверхности, которая распознает клеточный антиген злокачественной опухоли, а рецидив злокачественной опухоли представляет собой рецидив злокачественной опухоли, приписывемый клетке злокачественной опухоли, не имеющей антигена злокачественной опухоли, который специфически распознается молекулой клеточной поверхности.

(16) Ингибитор рецидива злокачественной опухоли по пункту (14) или (15), при этом молекула клеточной поверхности, которая распознает клеточный антиген злокачественной опухоли, представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).

(17) Ингибитор рецидива злокачественной опухоли по любому из пунктов (14) - (16), при этом иммунная клетка является T-клеткой.

(18) Ингибитор рецидива злокачественной опухоли по пункту (11), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты представляет собой онколитический вирус.

(19) Фармацевтическая композиция, содержащая ингибитор рецидива злокачественной опухоли по любому из пунктов (10) - (18) и фармацевтически приемлемую добавку.

(20) Индуктор для индуцирования функции памяти у T-клеток или B-клеток в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, содержащий носитель для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив).

[0011] Другие объекты настоящего изобретения следующие.

1) Использование носителя для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновой кислоты, кодирующей лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив) для приготовления энхансера Т-клеток или В-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения.

2) Способ стимуляции T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти, включающий введение субъекту носителя для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновой кислоты, кодирующей лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив).

3) Использование носителя для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновой кислоты, кодирующей лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив) для приготовления ингибитора рецидива злокачественной опухоли.

4) Способ ингибирования рецидива злокачественной опухоли, включающий введение субъекту носителя для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновой кислоты, кодирующей лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив).

5) Использование носителя для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновой кислоты, кодирующей лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив) для приготовления индуктора для индуцирования функции памяти Т-клеток или В-клеток в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения.

6) Способ индуцирования функции памяти Т-клеток или В-клеток, включающий введение субъекту носителя для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, кодирующей интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновой кислоты, кодирующей лиганд 19 (CCL19) хемокина (C-C мотив).

7) Индуктор для индуцирования функции памяти Т-клеток или В-клеток в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно пункту (20), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты представляет собой, по меньшей мере, один элемент, выбранный из группы, включающей иммунную клетку, вирус, анаэробный микроорганизм, липосому, мезенхимальную стволовую клетку (МСК) и наночастицу.

8) Индуктор для индуцирования функции памяти Т-клеток или В-клеток в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно пункту (20) или (7), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты обладает способностью накапливаться в клетках злокачественной опухоли или способностью специфически пролиферировать в клетках злокачественной опухоли.

9) Индуктор для индуцирования функции памяти Т-клеток или В-клеток в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно любому из пунктов (20), (7) или (8), при этом носитель для доставки нуклеиновой кислоты обладает цитотоксичностью по отношению к клеткам злокачественной опухоли.

10) Индуктор для индуцирования функции памяти Т-клеток или В-клеток в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно любому из пунктов (20) и (7) - (9), при этом носителем для доставки нуклеиновой кислоты является иммунная клетка, причем иммунная клетка имеет молекулу клеточной поверхности, которая распознает антиген злокачественной опухоли.

11) Индуктор для индуцирования функции памяти Т-клеток или В-клеток в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно пункту (10), при этом молекула клеточной поверхности, которая распознает антиген злокачественной опухоли, представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR) или T-клеточный рецептор (TCR).

(12) Индуктор для индуцирования функции памяти Т-клеток или В-клеток в организме субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, согласно пункту (10) или (11), при этом иммунная клетка представляет собой T-клетку.

Технический результат изобретения

[0012] Использование энхансера T-клеток или B-клеток, обладающих функцией памяти, согласно настоящему изобретению позволяет стимулировать Т-клетки или В-клетки, имеющие функцию памяти, в организме субъекта, к которому применяется воздействие путем введения препарата. Кроме того, использование ингибитора рецидива злокачественной опухоли по настоящему изобретению позволяет ингибировать рецидивы злокачественной опухоли после лечения. Использование индуктора для индуцирования функции памяти Т-клеток или В-клеток согласно настоящему изобретению позволяет индуцировать функцию памяти Т-клеток или В-клеток в организме субъекта, к которому применяется воздействие путем введения препарата.

Краткое описание чертежей

[0013]

Фигура 1(а) представляет собой результаты Примера 1, в котором локализацию Т-клеток в тканях злокачественной опухоли наблюдали под микроскопом путем окрашивания меченым антителом. Фигура 1(b) представляет собой график, полученный путем анализа изображений и обработки результатов наблюдаемых на Фигуре 1(а) и показывающий площади (мкм²) вводимых донорских Т-клеток и эндогенных Т-клеток реципиента.

Фигура 2 представляет собой график объемов злокачественных опухолей (мм³), исследованных на 14 день после введения мышам Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19 (7×19) , или антител против CD90.2 (анти-CD90.2) вместе с Т-клетками из Примера 2.

Фигура 3 представляет собой график, показывающий результаты Примера 3, в котором введенные донорские Т-клетки и эндогенные Т-клетки реципиента были исследованы с целью определения их потенциала памяти.

Фигура 4 представляет собой график, показывающий результаты Примера 3, в котором введенные донорские Т-клетки и эндогенные Т-клетки реципиента были исследованы с целью определения функционирования их потенциала памяти при производстве IFN-γ. На Фигуре 4(а) показано соотношение между IFN-γ-позитивными клетками и CD90.1-позитивными донорскими T-клетками. На Фигуре 4(b) показаны результаты обнаружения IFN-γ-позитивных клеток среди CD90.2-позитивных и эндогенных CD8-позитивных Т-клеток методом проточной цитометрии.

Фигура 5А представляет собой график, показывающий результаты Примера 4, в котором было исследовано изменение репертуара T-клеточных рецепторов (TCR) до обработки Т-клетками, экспрессирующими CAR-IL-7/CCL19 (α-цепь: до обработки, CAR-позитивные).

Фигура 5B представляет собой график, показывающий результаты Примера 4, в котором было исследовано изменение репертуара T-клеточных рецепторов (TCR) до обработки Т-клетками, экспрессирующими CAR-IL-7/CCL19 (α-цепь: до обработки, CAR-негативные).

Фигура 5C представляет собой график, показывающий результаты Примера 4, в котором было исследовано изменение репертуара T-клеточных рецепторов (TCR) после обработки Т-клетками, экспрессирующими CAR-IL-7/CCL19 (α-цепь: после обработки, CAR-позитивные).

Фигура 5D представляет собой график, показывающий результаты Примера 4, в котором было исследовано изменение репертуара T-клеточных рецепторов (TCR) после обработки Т-клетками, экспрессирующими CAR-IL-7/CCL19 (α-цепь: после обработки, CAR-негативные).

Фигура 6A представляет собой график, показывающий результаты Примера 4, в котором было исследовано изменение репертуара T-клеточных рецепторов (TCR) до обработки Т-клетками, экспрессирующими CAR-IL-7/CCL19 (β-цепь: до обработки, CAR-позитивные).

Фигура 6B представляет собой график, показывающий результаты Примера 4, в котором было исследовано изменение репертуара T-клеточных рецепторов (TCR) до введения обработки Т-клетками, экспрессирующими CAR-IL-7/CCL19 (β-цепь: до обработки, CAR-негативные).

Фигура 6C представляет собой график, показывающий результаты Примера 4, в котором было исследовано изменение репертуара T-клеточных рецепторов (TCR) после обработки Т-клетками, экспрессирующими CAR-IL-7/CCL19 (β-цепь: после обработки, CAR-позитивные).

Фигура 6D представляет собой график, показывающий результаты Примера 4, в котором было исследовано изменение репертуара T-клеточных рецепторов (TCR) после обработки Т-клетками, экспрессирующими CAR-IL-7/CCL19 (β-цепь: после обработки, CAR-негативные).

Фигура 7А представляет собой схему, показывающий результаты измерения объемов опухоли на 140 день после инокуляции клеточной линии P815-hCD20 в Примере 5, в котором клеточную линию P815-hCD20 или родительскую линию P815, не экспрессирующую hCD20, инокулировали в каждую из правых и левых боковых областей живота мышей с отторжением опухоли или контрольных мышей, не подвергнутых воздействию согласно изобретению.

Фигура 7B представляет собой схему, показывающий результаты измерения объемов опухоли на 140 день после инокуляции клеточной линии 3LL-hCD20 в Примере 5, в котором клеточную линию 3LL-hCD20 или родительскую линию 3LL, не экспрессирующую hCD20, инокулировали в каждую из правых и левых боковых областей живота мышей с отторжением опухоли или контрольных мышей, не подвергнутых воздействию согласно изобретению.

Фигура 8 представляет собой схему, показывающую экспериментальный протокол для подтверждения эффекта ингибирования рецидива опухоли из Примера 6.

Фигура 9А представляет собой схему, показывающую результаты Примера 6, в котором после введения клеточной линии ACC-MESO1-GFP-Luc, упомянутой ниже, мыши из группы, получавшей T-клетки, экспрессирующие CAR-IL-7/CCL19 против человеческого мезотелина (7×19 CAR-T), были сфотографированы с выдержкой 30 секунд в 1, 3, 7, 10, 14, 21, 31 и 38-й день, а мыши из группы, получавшей обычные Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина (обычные CAR-T), были аналогично сфотографированы в 1-й день.

Фигура 9B представляет собой схему, показывающую результаты Примера 6, в котором после введения клеточной линии ACC-MESO1-GFP-Luc, упомянутой ниже, мыши из группы, получавшей T-клетки, экспрессирующие CAR-IL-7/CCL19 против человеческого мезотелина (7×19 CAR-T), были сфотографированы с выдержкой 30 секунд в 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129 и 143-й день, а мыши из группы, получавшей обычные Т-клетки, экспрессирующие CAR против человеческого мезотелина (обычные CAR-T), были аналогично сфотографированы в 1-й день. Фотография второго слева животного не приводится, поскольку оно умерло на 129 день.

Фигура 10 представляет собой график, показывающий взаимосвязь между количеством дней после введения клеточной линии ACC-MESO1-GFP-Luc, упомянутой ниже, и показателями выживаемости мышей в Примере 6.

Фигура 11 представляет собой график, показывающий взаимосвязь между количеством дней после введения клеточной линии ACC-MESO1-GFP-Luc, упомянутой ниже, и общей величиной флюоресценции в Примере 6.

Фигура 12(а) представляет собой результаты Примера 7, в котором соотношение CD8⁺GFP⁺ клеток и клеток селезенки анализировали с использованием проточной цитометрии. Фигура 12 (b) представляет собой результаты Примера 7, в котором абсолютное количество CD8⁺GFP⁺ клеток анализировали с использованием проточной цитометрии.

Фигура 13(a) представляет собой диаграмму, показывающую количество CD44⁺ клеток среди CD8⁺ клеток селезенки у мышей линии BDA/2, не подвергнутых воздействию по изобретению, и CD8⁺GFP^- или CD8⁺GFP⁺ клеток селезенки у мышей, получавших Т-клетки, экспрессирующие P1A-специфические TCR/IL-7/CCL19/eGFP из Примера 7. Фигура 13(b) представляет собой диаграмму, показывающую соотношение CD44⁺ клеток Фигуры 13(a).

Фигура 14 представляет собой диаграмму, показывающую результаты Примера 7, в котором после совместного культивирования в течение приблизительно 5 дней с тучными клетками слизистой оболочки (MMC), обработанными P815, концентрацию IFN-γ в супернатанте культуральной среды определяли с использованием ELISA (фермент-связанное иммуносорбентное исследование).

Фигура 15(а) представляет собой схему, показывающую структуру генетически рекомбинантного вируса осповакцины LC16mO TK-SP мыши IL-7-F2A мыши CCL19-F2A-eGFP (TK-ICE) из Примера 8. Фигура 15(b) представляет собой схему, показывающую структуру генетически рекомбинантного вируса осповакцины LC16mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP (TK-LE) из Примера 8.

Фигура 16 представляет собой изображения результатов наблюдения взаимосвязи между цитопатическим эффектом генетически рекомбинантного вируса осповакцины TK-ICE или TK-LE в A549 клетках и CT26 клетках, инфицированных вирусом осповакцины, и флуоресцентным излучением eGFP, из Примера 8.

Фигура 17 представляет собой диаграмму, показывающую результаты исследования количества IL-7 и CCL19, секретируемых в A549 клетках или CT26 клетках, инфицированных генетически рекомбинантным вирусом осповакцины TK-ICE или TK-LE из Примера 8.

Фигура 18 представляет собой схему, показывающую принцип подкожной трансплантации CT26 клеток рака толстой кишки мыши в правую и левую части живота мыши из Примера 8.

Фигура 19 представляет собой диаграмму, показывающую переходные изменения размера опухоли (мм³) после внутриопухолевого введения генетически рекомбинантного вируса осповакцины TK-ICE или TK-LE в моделях опухоли с двухсторонней подкожной трансплантацией на мышах линии BALB/c, полученных с использованием CT26 клеток рака толстой кишки мыши, из Примера 9.

Способ осуществления изобретения

[0014] В настоящем изобретении «энхансер Т-клеток или В-клеток, имеющих функцию памяти» не ограничен конкретными вариантами при условии, что упомянутый энхансер содержит носитель для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7 и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Этот энхансер обеспечивает стимуляцию Т-клеток или В-клеток, имеющих функцию памяти. В настоящем изобретении, «индуктор для индуцирования функции памяти в Т-клетках или В-клетках» не ограничен конкретными вариантами, при условии, что упомянутый индуктор содержит носитель для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Этот индуктор обеспечивает индукцию функции памяти в Т-клетках или В-клетках. Далее в описании настоящего изобретения «энхансер T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти» и «индуктор для индуцирования функции памяти в T-клетках или B-клетках» также в совокупности именуется «предлагаемый энхансер или индуктор».

[0015] В настоящем изобретении, «ингибитор рецидива злокачественной опухоли» не ограничен конкретными вариантами, при условии, что упомянутый ингибитор рецидива злокачественной опухоли содержит носитель для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Этот ингибитор рецидива злокачественной опухоли обеспечивает ингибирование рецидива злокачественной опухоли. Далее в описании настоящего изобретения «ингибитор рецидива злокачественной опухоли» также именуется «предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли».

[0016] Предпочтительные примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, могут включать нуклеиновую кислоту человеческого происхождения. Каждая из этих нуклеиновых кислот может быть соответствующим образом выбрана в соответствии с типом клеток, предназначенных для введения. Информация о нуклеотидной последовательности каждой из нуклеиновых кислот может быть соответствующим образом получена из документа, известного в данной области техники или из базы данных, такой как NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, могут включать нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность представленной в SEQ ID NO: 1 аминокислотной последовательности 80% или выше, предпочтительно 85% или выше, более предпочтительно 90% или выше, еще более предпочтительно 95% или выше, наиболее предпочтительно 98% или выше, можно использовать при условии, что полученный IL-7 способен увеличивать скорость пролиферации клеток или выживаемость клеток. Примеры нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, могут включать нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность представленной в SEQ ID NO: 2 аминокислотной последовательности 80% или выше, предпочтительно 85% или выше, более предпочтительно 90% или выше, еще более предпочтительно 95% или выше, наиболее предпочтительно 98% или выше, можно использовать при условии, что полученный CCL19 оказывает действие, присущее мигрирующим клеткам. Действие, увеличивающее скорость клеточной пролиферации или выживаемость клеток с помощью IL-7, и действие мигрирующих клеток с помощью CCL19 можно подтвердить способами, описанными в патентном документе 2.

[0017] В настоящем изобретении термин «идентичность» означает степень сходства полипептидной или полинуклеотидной последовательности (которая определяется путем сопоставления искомой последовательности с другой последовательностью, предпочтительно того же типа (последовательностью нуклеиновой кислоты или белка)). Предпочтительные примеры способа расчета и определения «идентичности» с помощью компьютерных программ могут включать использование GCG BLAST (средство поиска основного локального выравнивания) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3389-3402; и Devereux et al., Nucleic Acid Res. 1984, 12: 387), BLASTN 2.0 (Gish W., http://blast.Wustl.edu, 1996-2002), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 2444-2448) и GCG GelMerge, который включает в себя определение и выравнивание пары контигов с наибольшим перекрытием (Wibur and Lipman, SIAM J. Appl. Math. 1984, 44: 557-567; и Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453).

[0018] Нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, может быть включена в вектор, содержащий регуляторную последовательность, такую как промотор или терминатор, и селективную маркерную последовательность, такую как ген лекарственной устойчивости или репортерный ген. Вектор может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую ген «самоубийства», или нуклеиновую кислоту, кодирующую 2А пептид или участок внутренней посадки рибосомы (IRES). Вектор, нуклеиновая кислота, кодирующая ген «самоубийства», и нуклеиновая кислота, кодирующая пептид 2А или IRES, могут быть получены или изготовлены согласно патентным документам 2 и 3. Примеры промотора могут включать IE (немедленно-ранний) промотор гена цитомегаловируса (CMV), ранний промотор SV40, промотор ретровируса, промотор металлотионеина, промотор теплового шока, промотор SRα, промотор NFAT (Nuclear Factor Of Activated T-cells - ядерный фактор активированных Т-клеток) и промотор HIF (Higher Integrative Functions - высокие интегративные функции). Примеры вектора могут включать ретровирусный вектор, например, pMSGV-вектор (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) и pMSCV-вектор (произведенный компанией Takara Bio Inc.), а также и вектор, произведенный на основе любого из этих векторов.

[0019] Нуклеиновая кислота, кодирующая дополнительный регулирующий фактор иммунной функции, такой как IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, CCL4, Flt3L, интерферон-γ, MIP-1α, GM-CSF, M-CSF, TGF-β, TNF-α, антитело, ингибирующее контрольную точку, или фрагмент любого из перечисленных факторов может содержаться вместе с нуклеиновой кислотой, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислотой, кодирующей CCL19. Однако предлагаемый энхансер или индуктор или предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли, даже свободный от нуклеиновой кислоты, кодирующей дополнительный регулирующий фактор иммунной функции, может в достаточной степени оказывать действие в качестве предлагаемого энхансера или индуктора или предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли, при условии, что предлагаемый энхансер или индуктор или предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли содержит, по меньшей мере, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в качестве нуклеиновых кислот, кодирующих регулирующие факторы иммунной функции.

[0020] «Функция памяти» означает функцию более быстрой и сильной активации без предварительной стимуляции опухолевым антигеном тех Т-клеток или В-клеток, которые ранее испытывали стимуляцию опухолевым антигеном и снова вступают в контакт со злокачественными опухолевыми клетками, по сравнению с наивными Т-клетками или наивными В-клетками и, таким образом, позволяет Т-клеткам или В-клеткам проявлять высокий уровень иммунной функции против клеток злокачественной опухоли. Примеры T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти, могут включать в себя центральные T-клетки памяти и B-клетки памяти. Наличие у T-клеток или B-клеток функции памяти может быть подтверждено всесторонней оценкой их позитивности/негативности (+/-) или интенсивности экспрессии в отношении каждого из белков CD44, CD62L и CD127 (IL-7R). Молекула CD, подлежащая оценке, может быть соответствующим образом выбрана в соответствии с субъектом, к которому применяется воздействие по изобретению, таким как человек или мышь. Далее в описании настоящего изобретения позитивность и негативность также описываются как «+» и «-», соответственно.

[0021] «Стимуляция T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти» означает увеличение соотношения T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти, увеличение абсолютного количества T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти или усиление функции памяти в пересчете на одну клетку из числа T-клеток или B-клеток, имеющих функцию памяти, в популяции клеток, включающей T-клетки или B-клетки, имеющие функцию памяти.

[0022] «Индукция функции памяти в Т-клетках или В-клетках» означает индукцию наивных Т-клеток или наивных В-клеток с тем, чтобы они получили функцию памяти путем приобретения ими иммунной памяти в ответ на стимуляцию опухолевым антигеном, индукцию Т-клеток или B-клеток, уже имеющих функцию памяти с тем, чтобы они имели более высокий уровень функции памяти, и увеличение числа T-клеток или B-клеток, уже имеющих функцию памяти in vivo, в популяции клеток, включающей наивные T-клетки или наивные В-клетки. Конкретные примеры этого могут включать индукцию наивных Т-клеток в центральных Т-клетках памяти.

[0023] Предпочтительные примеры субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, могут включать млекопитающих и клетки млекопитающих. Среди млекопитающих более предпочтительными примерами могут быть человек, мышь, собака, крыса, морская свинка, кролик, птица, овца, свинья, крупный рогатый скот, лошадь, кошка, обезьяна и шимпанзе, наиболее предпочтительно человек.

[0024] «Носитель для доставки нуклеиновой кислоты» может представлять собой, по меньшей мере, один элемент, выбранный из группы, включающей иммунную клетку, вирус, анаэробный микроорганизм, липосому, мезенхимальную стволовую клетку (МСК) и наночастицу, причем два или более из перечисленных элементов могут быть смешаны и использованы.

[0025] В этом контексте иммунная клетка не ограничена конкретными вариантами при условии, что эта клетка участвует в иммунном ответе и может экспрессировать IL-7 и CCL19 путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19. Предпочтительной является иммунная клетка, выделенная (собранная) из живого организма. Примеры ее могут включать отдельную форму лимфоидной клеточной линии, такую как Т-клетка, естественная клетка-киллер (NK-клетка) и В-клетка; антиген-презентирующую клетку, такую как моноцит, макрофаг и дендритная клетка, или гранулоцит, такую как нейтрофил, эозинофил, базофил и тучная клетка, и может предпочтительно включать Т-клетку, выделенную из организма млекопитающего, такого как человек, собака, кошка, свинья или мышь, предпочтительно Т-клетку, выделенную из организма человека. Выделенные Т-клетки могут дополнительно включать в себя клетки, отличные от Т-клеток, при этом могут включать Т-клетки в пропорции 50% или более, предпочтительно 60% или более, более предпочтительно 70% или более, еще более предпочтительно 80% или более, наиболее предпочтительно 90% или более. Т-клетки могут быть получены путем отделения популяции клеток, включающей иммунную клетку, от жидкости организма, такой как кровь или жидкость костного мозга, выделения этой популяции из ткани, такой как ткань селезенки, тимуса или лимфатического узла, или иммунных клеток, инфильтрирующих ткань раковой опухоли, такой как первичная опухоль, метастатическая опухоль или злокачественный асцит. Чтобы повысить соотношение Т-клеток, включенных в популяцию клеток, клеточная популяция, выделенная таким образом, может быть дополнительно подвергнута, если это необходимо, выделению или очистке стандартным для получения Т-клеток способом. Альтернативно можно использовать T-клетки, изготовленные из эмбриональных стволовых (ЭС) клеток или индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПСК) клеток. Примеры такой Т-клетки могут включать альфа-бета Т-клетку, гамма-дельта Т-клетку, CD8⁺ Т-клетку, CD4⁺ Т-клетку; Т-клетку, инфильтрирующую опухоль; Т-клетку памяти, наивную Т-клетку и NK Т-клетку. Происхождение иммунной клетки и субъекта, подвергаемого воздействию путем введения, может быть одинаковым или различным, но предпочтительно одинаковым. Когда субъектом, подвергаемым воздействию путем введения, является человек, в качестве иммунной клетки может использоваться аутологичная клетка, выделенная из организма пациента, являющегося субъектом, подвергаемым воздействию путем введения, или аллогенная клетка, выделенная из организма другого человека. В частности, донор и реципиент могут быть одним и тем же лицом или разными, но предпочтительно, чтобы они представляли собой одно и то же лицо.

[0026]

Вирус не ограничен конкретными вариантами при условии, что он может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и способен инфицировать клетки злокачественной опухоли. Предпочтительным является онколитический вирус. Онколитический вирус представляет собой вирус, который редко размножается при инфицировании нормальных клеток, но размножается при инфицировании клеток злокачественной опухоли и обладает способностью уничтожать клетки злокачественной опухоли (цитотоксичность в отношении клеток злокачественной опухоли). Онколитический вирус рассмотрен, например, в публикации Molecular Therapy, Vol. 18, No. 2, February 2010, p. 233-234. Этот онколитический вирус не ограничен конкретными вариантами при условии, что он обладает способностью убивать клетки злокачественной опухоли путем инфицирования клеток злокачественной опухоли. Примеры такого вируса могут включать онколитический вирус осповакцины, онколитический аденовирус, онколитический вирус простого герпеса, онколитический реовирус, онколитический вирус кори, онколитический вирус ньюкаслской болезни, онколитический вирус коровьей оспы, онколитический вирус эпидемического паротита и онколитический вирус Коксаки. Примеры онколитического вируса осповакцины, который можно использовать, включают, помимо прочего, вирус, описанный в публикации Kim MK et al., Science Translational Medicine. 2013 May 15; 5 (185): 185ra63, Heo J, et al., Nature Medicine, 2013 (3): 329-36. doi: 10.1038/nm.3089. Epub 2013 Feb 10., и в Международной публикации № WO 2012/094386. Примеры онколитического аденовируса, который можно использовать, включают, помимо прочего, вирус, описанный в публикациях Tedcastle A et al., Mol Ther. 2016; 24: 796-804, Marino N, Illingworth S, Kodialbail P, Patel A, Calderon H, Lear R, Fisher KD, Champion BR, Brown ACN. PLoS One 2017; 12 (5): e0177810, Freedman JD, et al., EMBO Mol Med 9: 1067-1087 (2017), Lang FF et al., Journal of Clinical Oncology (2018), James M. et al., The Journal of Oncology, 188 (6): 2391-7, 2012 и Japanese Patent Nos. 3867968 и 5574284. Примеры онколитического вируса простого герпеса, который можно использовать, включают, помимо прочего, вирус, описанный в публикациях Mazzacurati et al., Mol Ther, 2015 Jan; 23 (1): 99-107, Hirooka Y, et al., BMC Cancer 2018, 18, 596, Nakatake R, et al., Cancer Sci. 2018 Mar, 109 (3); 600-610, and Andtbacka RHI, et al., J Clin Oncol. 2015; 33: 2780-2788. Примеры онколитического реовируса, который можно использовать, включают, помимо прочего, вирус, описанный в публикации Mahalingam, et al., Cancers 2018, 10, 160. Примеры онколитического вируса ньюкаслской болезни, который можно использовать, включают, помимо прочего, вирус, описанный в публикации Journal of Virology. 2016 Jun; 90 (11): 5343-5352. Примеры онколитического вируса везикулярного стоматита, который можно использовать, включают, помимо прочего, вирус, описанный в публикации Muik A. et al., Cancer Res; 74 (13); 3567-78. Некоторые онколитические вирусы имеют функцию экспрессии белка, добавленную за генетической модификацией, и могут экспрессировать IL-7 и CCL19, описанные выше, вместо или в дополнение к такому белку.

[0027] Анаэробный микроорганизм не ограничен конкретными вариантами при условии, что анаэробный микроорганизм может экспрессировать IL-7 и CCL19 при введении в его клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19. Предпочтительным анаэробным микроорганизмом является анаэробная грамположительная бактерия, обладающая способностью накапливаться в клетках злокачественной опухоли. Примеры ее могут включать бактерии рода Bifidobacterium, такие как бифидобактерии, бактерии рода Lactobacillus и бактерии рода Listeria. Известно, что анаэробный микроорганизм легко накапливается в злокачественных опухолевых клетках, потому что он легко растет в среде, содержащей меньше кислорода.

[0028] Липосома не ограничена конкретными вариантами при условии, что эта липосома может доставлять нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в опухолевые клетки и представляет собой липидную нанокапсулу, состоящую из фосфолипидного бислоя. Липосома может быть получена с использованием имеющегося в продаже продукта или путем синтеза по обычной методике.

[0029] Мезенхимальная стволовая клетка (МСК) не ограничена конкретными вариантами при условии, что МСК может экспрессировать IL-7 и CCL19 при введении в нее нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, и обладает способностью накапливаться в злокачественных опухолевых клетках.

[0030] Наночастица не ограничена конкретными вариантами при условии, что эта наночастица обладает способностью доставлять нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в опухолевые клетки и находится в форме частиц размерами, исчисляемыми в нанометрах, предпочтительно от 5 до 800 нм в диаметре. Примеры ее могут включать наночастицу металла, такую как наночастица золота, и наночастицу диоксида кремния. Наночастица может быть получена путем использования имеющегося в продаже продукта или путем синтеза по обычной методике.

[0031] Фраза «носитель для доставки нуклеиновой кислоты обладает способностью накапливаться в клетках злокачественной опухоли» означает, что носитель для доставки нуклеиновой кислоты обладает способностью специфически накапливаться в клетках злокачественной опухоли. Конкретные примеры такой способности могут включать а) способность носителя для доставки нуклеиновой кислоты накапливаться в клетках злокачественной опухоли под действием вещества, которое распознает молекулу клеточной поверхности клеток злокачественной опухоли, причем вещество переносится носителем для доставки нуклеиновой кислоты и b) способность носителя для доставки нуклеиновой кислоты накапливаться в злокачественных опухолевых клетках посредством эффекта EPR (enhanced permeability and retention - повышенной проницаемости и удержания), который использует отверстие в несколько сотен нм, открывающееся в сосудистой стенке опухолевой ткани и являющееся более широким на один или более разряд, чем отверстие нормальной ткани. Примеры вещества, распознающего молекулу клеточной поверхности клеток злокачественной опухоли и переносимого носителем для доставки нуклеиновой кислоты, могут включать химерный антигенный рецептор (CAR) и рецептор T-клеток (TCR). Рецептор, описанный в патентных документах 2 и 3, может использоваться в качестве CAR или TCR. Поэтому примеры носителя для доставки нуклеиновой кислоты, обладающего способностью накапливаться в клетках злокачественной опухоли, могут включать CAR-экспрессирующую иммунную клетку и TCR-экспрессирующую иммунную клетку. Химерный антигенный рецептор (CAR) представляет собой искусственный химерный белок, в котором одиночная цепь Fv (scFv), распознающая антиген клеточной поверхности раковых клеток, слита с областью сигнальной трансдукции, которая индуцирует активацию T-клеток.

[0032] «Способность специфически пролиферировать в клетках злокачественной опухоли» означает способность редко пролиферировать в инфицированных нормальных клетках, но размножаться в инфицированных клетках злокачественной опухоли. Примеры ее могут включать способность онколитического вируса специфически пролиферировать в клетках злокачественной опухоли. Таким образом, примеры носителя для доставки нуклеиновой кислоты, обладающего способностью специфически пролиферировать в клетках злокачественной опухоли, могут включать онколитический вирус.

[0033] «Цитотоксичность в отношении клеток злокачественной опухоли» означает способность лизировать или убивать клетки злокачественной опухоли, повреждая клетки этой злокачественной опухоли. Клетки злокачественной опухоли подвергают лизису или убивают, так что антиген злокачественной опухоли в клетках злокачественной опухоли высвобождается в среду, окружающую лизированные или убитые клетки.

[0034] «Молекула клеточной поверхности, которая распознает антиген злокачественной опухоли», может представлять собой любую молекулу клеточной поверхности, которая распознает антиген злокачественной опухоли на поверхности клетки злокачественной опухоли. Примеры ее могут включать химерный антигенный рецептор (CAR) и рецептор T-клеток (TCR). Рецептор, описанный в патентных документах 2 и 3, может использоваться в качестве CAR или TCR. Поэтому примеры иммунной клетки, имеющей молекулу клеточной поверхности, распознающую антиген злокачественной опухоли, могут включать CAR-экспрессирующую иммунную клетку и TCR-экспрессирующую иммунную клетку.

[0035] Антиген злокачественной опухоли означает вещество, такое как белок или гликолипид, которое экспрессируется в клетках злокачественной опухоли в более высокой концентрации, чем в нормальных клетках, или специфически экспрессируется в клетках злокачественной опухоли. Примеры такого антигена злокачественной опухоли могут включать эпитопный пептид опухолеспецифического антигена, антиген рака яичка, антиген, ассоциированный с ангиогенезом, или антиген, вновь образованный в злокачественной опухоли путем мутации гена (неоантиген), и может, в частности, включать белок, такой как WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glypican-3, KIF20A, Survivin, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, MESOTHELIN, NKG2D, P1A, 5T4, B7-H6, BCMA, CD123, CD133, CD138, CD171, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CEA, cMet, CS1, EGFR, EGFRvIII, EphA2, ErbB2, FAP, FR-α, HER2, IL13Ra2, MUC1, MUC16, NKG2D, PSCA, PSMA, ROR1, TARP, DLL3, PRSS21, Claudin18.2, Claudin18, CAIX, L1-CAM, FAP-α, CTAG1B и FR-α, а также гликолипид, такой как GD2 и GM2.

[0036] Фраза «содержащий носитель для доставки нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19» также включает аспект, означающий, что нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, содержатся в носителе для доставки нуклеиновой кислоты. Когда носителем для доставки нуклеиновой кислоты является, например, иммунная клетка, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, могут содержаться в иммунной клетке. Иммунная клетка может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, в состоянии, интегрированном в геном, или в состоянии, не интегрированном в геном (например, в эписомальном состоянии).

[0037] Когда носителем для доставки нуклеиновой кислоты является иммунная клетка, предлагаемый энхансер или индуктор или предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли можно изготовить путем введения нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, в иммунную клетку, то есть путем введения чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19 (предпочтительно чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, которые функционально связаны с элементами ниже промотора). Способ введения может представлять собой любой способ введения ДНК в иммунную клетку. Его примеры могут включать, в частности, способ электропорации (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), способ с кальция фосфатом (публикация нерассмотренной патентной заявки Японии, №2-227075), способ липофекции (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7413 (1987)), а также способ вирусного инфицирования. Примеры способа вирусного инфицирования могут включать способ, в котором применяется трансфекция упаковывающих клеток, таких как клетки GP2-293 (произведенные Takara Bio Inc.), клетки Plat-GP (произведенные Cosmo Bio Co., Ltd.), клетки PG13 (ATCC CRL-10686) или клетки PA317 (ATCC CRL-9078) с вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, выбранную для введения, и упаковывающую плазмиду для приготовления рекомбинантного вируса, и инфицирование Т-клеток рекомбинантным вирусом (патентный документ 2).

[0038] Если носителем для доставки нуклеиновой кислоты является вирус, то «вирус, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и экспрессирует IL-7 и CCL19» можно приготовить путем введения в этот вирус нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, то есть путем введения чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19 (предпочтительно чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, которые функционально связаны с элементами ниже промотора). Произведенный таким образом вирус можно использовать в качестве предлагаемого энхансера или индуктора или предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли.

[0039] Аналогично, если носителем для доставки нуклеиновой кислоты является анаэробный микроорганизм, липосома или мезенхимальная стволовая клетка (МСК), то «анаэробный микроорганизм, липосому или мезенхимальную стволовую клетку (МСК), которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7 и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и экспрессируют IL-7 и CCL19» можно приготовить путем введения в этот анаэробный микроорганизм, липосому или мезенхимальную стволовую клетку (МСК) нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, то есть путем введения чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19 (предпочтительно чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, которые функционально связаны с элементами ниже промотора). Произведенные таким образом анаэробный микроорганизм, липосому или мезенхимальную стволовую клетку можно использовать в качестве предлагаемого энхансера или индуктора или предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли. Также, «вирус, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7 и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и экспрессирует IL-7 и CCL19», «анаэробный микроорганизм, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7 и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и экспрессирует IL-7 и CCL19», «липосому, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7 и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и экспрессирует IL-7 и CCL19», или «мезенхимальную стволовую клетку (МСК), которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и экспрессирует IL-7 и CCL19», можно использовать в качестве ингибитора пролиферации злокачественной опухоли.

[0040] Другим способом введения нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, в иммунную клетку может быть способ, который включает в себя интеграцию нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, в геном иммунной клетки путем использования метода генной инженерии, известного в данной области техники, таким образом, что эти нуклеиновые кислоты экспрессируются под контролем подходящего промотора. Примеры метода генной инженерии, известного в данной области техники, могут включать метод, использующий эндонуклеазу, такую, как цинк-пальцевая нуклеаза, TALEN (эффекторная нуклеаза, подобная активаторам транскрипции) или CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)-Cas-систему.

[0041] В случае изготовления «иммунной клетки, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и имеет CAR в качестве молекулы клеточной поверхности, распознающей антиген злокачественной опухоли, то есть, иммунной клетки, которая содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие CAR, IL-7 и CCL19 и экспрессирует CAR, IL-7 и CCL19» в качестве предлагаемого энхансера или индуктора или предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли, эту иммунную клетку можно изготовить любым из следующих способов:

(1) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии IL-7-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и вектора экспрессии CAR, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR;

(2) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии CAR-IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора экспрессии CAR-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(3) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии CAR-IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора экспрессии IL-7-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(4) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии CAR-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и вектора экспрессии IL-7-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(5) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии CAR-IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора экспрессии CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(6) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии CAR-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и вектора экспрессии IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; и

(7) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку трех типов векторов: вектора экспрессии CAR, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, вектора экспрессии IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора экспрессии CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

[0042] Аналогично, в случае изготовления «иммунной клетки, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и имеет TCR в качестве молекулы клеточной поверхности, распознающей антиген злокачественной опухоли, то есть, иммунной клетки, которая содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие TCR, IL-7 и CCL19 и экспрессирует CAR, IL-7 и CCL19» в качестве предлагаемого энхансера или индуктора или предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли, эту иммунную клетку можно изготовить любым из следующих способов:

(1) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии IL-7-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и вектора экспрессии TCR, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR;

(2) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии TCR-IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора экспрессии TCR-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(3) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии TCR-IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора экспрессии IL-7-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(4) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии TCR-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и вектора экспрессии IL-7-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(5) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии TCR-IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора экспрессии CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19;

(6) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии TCR-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19, и вектора экспрессии IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7; и

(7) способ одновременного или последовательного введения в иммунную клетку трех типов векторов: вектора экспрессии TCR, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, вектора экспрессии IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора экспрессии CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

[0043] В случае изготовления «иммунных клеток, экспрессирующих TCR, IL-7 и CCL19», иммунную клетку, экспрессирующую TCR, специфичную в отношении желаемого опухолевого антигена, готовят заранее, при этом иммунная клетка, экспрессирующая TCR, IL-7 и CCL19, может быть приготовлена любым из следующих способов с использованием TCR-экспрессирующей иммунной клетки:

(1) способ введения в TCR-экспрессирующую иммунную клетку вектора экспрессии IL-7-CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19; и

(2) способ одновременного или последовательного введения в TCR-экспрессирующую иммунную клетку двух типов векторов: вектора экспрессии IL-7, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и вектора экспрессии CCL19, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

[0044] Кроме того, «иммунная клетка, экспрессирующая CAR, TCR, IL-7 и CCL19» может быть изготовлена в качестве предлагаемого энхансера или индуктора или предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли. Конкретные примеры способа осуществления этого могут включать способ изготовления, который дополнительно дает возможность всем или любому из векторов, описанных в «случае изготовления иммунной клетки, экспрессирующей CAR, IL-7 и CCL19», содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую TCR, таким образом, что TCR также экспрессируется, способ изготовления, который дополнительно позволяет всем или любому из векторов, описанных в «случае изготовления иммунной клетки, экспрессирующей TCR, IL-7 и CCL19», содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR таким образом, что CAR также экспрессируется, и способ изготовления для введения векторов, описанных в «случае изготовления иммунной клетки, экспрессирующей CAR, IL-7 и CCL19», в «TCR-экспрессирующую иммунную клетку».

[0045] Кроме того, когда иммунная клетка в предлагаемом энхансере или индукторе или в предлагаемом ингибиторе рецидива злокачественной опухоли содержит CAR, может быть изготовлена «иммунная клетка, экспрессирующая множество, предпочтительно два типа CAR, распознающих различные антигены злокачественной опухоли». Конкретные примеры способа осуществления этого могут включать способ изготовления, позволяющий векторам, описанным в «случае изготовления иммунной клетки, экспрессирующей CAR, IL-7 и CCL19», содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие множество, предпочтительно два типа CAR, которые распознают различные антигены злокачественной опухоли, таким образом, что экспрессируется множество, предпочтительно два типа CAR. В частности, например, изготавливают и вводят в иммунную клетку CAR-IL-7-экспрессирующий вектор, распознающий X антиген злокачественной опухоли и содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, распознающий X антиген злокачественной опухоли, и нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, а также CAR-CCL19-экспрессирующий вектор, распознающий Y антиген злокачественной опухоли и содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR, распознающий Y антиген злокачественной опухоли, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19. Полученная таким способом иммунная клетка может иметь более высокую специфичность к опухоли, поскольку IL-7 и CCL19 секретируются в среду, окружающую клетки, содержащие X и Y антигены злокачественной опухоли.

[0046] Если носителем для доставки нуклеиновой кислоты является иммунная клетка, вирус, анаэроб или мезенхимальная стволовая клетка, то может быть использован культуральный продукт, который получают культивированием иммунной клетки, вируса, анаэроба или мезенхимальной стволовой клетки и который содержит иммунные клетки.

[0047] «Рецидив злокачественной опухоли» для ингибитора рецидива злокачественной опухоли означает повторное возникновение злокачественной опухоли после лечения злокачественной опухоли посредством общей химиотерапии, радиотерапии или хирургического вмешательства и т.д. Рецидив злокачественной опухоли предпочтительно является рецидивом, приписываемым клеткам злокачественной опухоли, которые обладают устойчивостью к способности носителя для доставки нуклеиновой кислоты накапливаться в клетках злокачественной опухоли или к способности носителя для доставки нуклеиновой кислоты специфически пролиферировать в клетках злокачественной опухоли.

[0048] В этом контексте примеры «рецидива, приписываемого клеткам злокачественной опухоли, которые обладают устойчивостью к способности накапливаться в клетках злокачественной опухоли», могут включать случай, когда носителем для доставки нуклеиновой кислоты является иммунная клетка, которая содержит молекулу клеточной поверхности, распознающую антиген злокачественной опухоли, причем рецидив злокачественной опухоли представляет собой рецидив злокачественной опухоли, приписываемый клеткам злокачественной опухоли, не имеющими антигена злокачественной опухоли, специфически распознающегося молекулой клеточной поверхности, или утратившими антиген злокачественной опухоли, специфически распознающийся молекулой клеточной поверхности. Примеры «рецидива, приписываемого клеткам злокачественной опухоли, обладающим устойчивостью к способности носителя для доставки нуклеиновой кислоты специфически пролиферировать в клетках злокачественной опухоли» могут включать рецидив опухоли, приписываемый клеткам злокачественной опухоли, не имеющим чувствительности к инфицированию онколитическим вирусом для образования злокачественной опухоли или потерявшим чувствительность к инфицированию онколитическим вирусом для образования злокачественной опухоли. «Рецидив, приписываемый клеткам злокачественной опухоли, обладающим устойчивостью к способности накапливаться в клетках злокачественной опухоли», может быть подтвержден, например, путем исследования антигена злокачественной опухоли в клетках злокачественной опухоли той ткани, которая подверглась рецидиву.

[0049] Ингибитор рецидива злокачественной опухоли может быть использован для введения субъекту, имеющему злокачественную опухоль, которую лечат с помощью иммунотерапии. Ингибитор рецидива злокачественной опухоли может быть использован для введения субъекту, имеющему злокачественную опухоль, которую лечили с помощью иммунотерапии, через 100 дней или позже после иммунотерапии с целью ингибирования рецидива в течение длительного периода.

[0050] Предлагаемый энхансер или индуктор или предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли может содержать фармацевтически приемлемую добавку. Предлагаемый энхансер или индуктор или ингибитор рецидива злокачественной опухоли может дополнительно содержать инструкцию по его применению. Предлагаемый энхансер или индуктор или предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли может быть введен в состав фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемую добавку. Далее в описании настоящего изобретения «фармацевтическая композиция, содержащая предлагаемый энхансер и фармацевтически приемлемую добавку», «фармацевтическая композиция, содержащая предлагаемый индуктор и фармацевтически приемлемую добавку» и «фармацевтическая композиция, содержащая предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли и фармацевтически приемлемую добавку», также вместе именуются как «предлагаемая фармацевтическая композиция». Примеры добавки могут включать физиологический раствор, содержащий буфер физиологический раствор, культуральную среду для культивирования клеток, декстрозу, воду для инъекций, глицерин, этанол и комбинацию всех вариантов, перечисленных выше, стабилизатор, солюбилизатор, поверхностно-активное вещество, буфер, антисептик, регулятор тоничности, наполнитель и смазывающее вещество.

[0051] Предлагаемый энхансер или индуктор, предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли или предлагаемая фармацевтическая композиция могут быть введены субъекту, нуждающемуся в лечении злокачественной опухоли или ингибировании ее рецидива, с использованием способа, известного специалистам в данной области. Примеры способа введения могут включать внутривенную, внутриопухолевую, внутрикожную, подкожную, внутримышечную, внутрибрюшинную, внутриартериальную, внутрикостную, внутрисердечную, внутрисуставную, интрасиновиальную, внутричерепную, внутриспинальную и субарахноидальную (в спинномозговую жидкость) инъекции.

[0052] Примеры способа введения предлагаемого энхансера или индуктора, предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли или фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут включать введение, независимо выполняемое четыре раза, три раза, два раза или один раз в день, каждые 2 дня, каждые 3 дня, каждые 4 дня, каждые 5 дней, каждые 6 дней, один раз в неделю, каждые 8 дней, каждые 9 дней, каждые 10 дней, два раза в неделю, один раз в месяц или два раза в месяц.

[0053] Доза предлагаемого энхансера или индуктора, предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть подходящим образом определена в соответствии с возрастом, полом, состоянием здоровья, массой тела и т. д. субъекта. Когда носителем для доставки нуклеиновой кислоты является, например, иммунная клетка, примеры ее дозы могут включать от 1×10³ до 1×10⁹ клеток, предпочтительно от 1 × 10⁴ до 1 × 10⁸ клеток, более предпочтительно от 1×10⁵ до 1×10⁷ клеток на кг массы тела взрослого человека. Когда носителем для доставки нуклеиновой кислоты является онколитический вирус, примеры его дозы могут включать приблизительно от 10² до 10¹⁰ бляшкообразующих единиц (БОЕ), предпочтительно от 10⁵ до 10⁶ бляшкообразующих единиц (БОЕ) в дозе для взрослого человека.

[0054] В настоящем описании злокачественная опухоль может представлять собой злокачественную опухоль плотных тканей или злокачественную опухоль кроветворных тканей. Примеры этих опухолей могут включать рак, такой как глиома, меланома, злокачественная мезотелиома, аденокарцинома, плоскоклеточную карциному, железисто-плоскоклеточную карциному, анапластическую злокачественную опухоль, крупноклеточный рак, мелкоклеточный рак, рак кожи, рак щитовидной железы, рак молочной железы, рак простаты, рак мочевого пузыря, рак влагалища, рак головы и шеи, рак шеи, рак матки, рак печени, рак почки, рак поджелудочной железы, рак селезенки, рак легких, рак трахеи, рак бронхов, рак толстой кишки, рак ободочной кишки, рак тонкой кишки, рак желудка, рак пищевода, рак желчных путей, рак желчного пузыря, рак яичка, рак яичника, опухоль головного мозга, рак костной ткани, рак хрящевой ткани, рак жировой ткани, рак мышечной ткани, рак сосудистой ткани или рак кроветворных тканей, а также саркому, такую как хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная гемангиоэндотелиома, злокачественная шваннома, остеосаркома и саркома мягких тканей, и кроме того, бластому, такую как гепатобластома, медуллобластома, нефробластома, нейробластома, панкреатобластома, плевролегочная бластома, ретинобластома, и наконец, герминому, лимфому, лейкоз и миелому.

[0055] Предлагаемый энхансер или индуктор, предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли или предлагаемая фармацевтическая композиция могут быть использованы в комбинации с дополнительным противоопухолевым агентом. Кроме того, способ с использованием предлагаемого энхансера или индуктора, предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли или предлагаемой фармацевтической композиции может применяться в комбинации со способом лечения рака, в котором используется облучение. Примеры дополнительного противоопухолевого агента могут включать алкилирующее лекарственное средство, такое как циклофосфамид, бендамустин, ифосфамид и дакарбазин, антиметаболическое лекарственное средство, такое как пентостатин, флударабин, кладрибин, метотрексат, 5-фторурацил, 6-меркаптопурин и эноцитабин, молекулярно-таргетное лекарственное средство, такое как ритуксимаб, цетуксимаб и трастузумаб, ингибитор киназы, такой как иматиниб, гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, дазатиниб, сунитиниб и траметиниб, ингибитор протеасом, такой как бортезомиб, ингибитор кальциневрина, такой как циклоспорин и такролимус, противораковый антибиотик, такой как идарубицин и доксорубицин-митомицин С, растительный алкалоид, такой как иринотекан и этопозид, платиносодержащее лекарственное средство, такое как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин, гормональное терапевтическое средство, такое как тамоксифен и бикалутамид, и иммунорегуляторное лекарственное средство, такое как интерферон, ниволумаб и пембролизумаб.

[0056] Примеры способа с использованием предлагаемого энхансера или индуктора, предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли или предлагаемой фармацевтической композиции в сочетании с дополнительным противоопухолевым агентом могут включать способ, при котором используется дополнительный противоопухолевый агент, а затем применяется предлагаемый энхансер или индуктор, предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, способ с одновременным использованием предлагаемого энхансера или индуктора, предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли или предлагаемой фармацевтической композиции и дополнительного противоопухолевого агента и способ, при котором используется предлагаемый энхансер или индуктор, предлагаемый ингибитор рецидива злокачественной опухоли или предлагаемая фармацевтическая композиция, а затем применяется дополнительный противоопухолевый агент. В случае использования предлагаемого энхансера или индуктора, предлагаемого ингибитора рецидива злокачественной опухоли или предлагаемой фармацевтической композиции и дополнительного противоопухолевого агента в комбинации терапевтическое воздействие на рак дополнительно усиливается, тогда как соответствующие побочные реакции могут быть уменьшены путем соответствующего снижения частоты введения или дозы.

[0057] Все официальные документы и патентные заявки, процитированные здесь, явным образом включены в описание настоящего изобретения посредством ссылки во всей их полноте и объеме, равно как и каждый конкретно описанный документ и заявка.

Примеры

[0058] Далее в настоящем документе данное изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на Примеры. Тем не менее, объем данного изобретения не ограничен приведенными примерами.

[0059] Изготовление Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, и Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR

«Т-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR, IL-7 мыши и CCL19 мыши (при этом T-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, также упоминаются как «7×19» в следующих ниже Примерах или на фигурах)» и «Т-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR, также упоминаются как «Обычн.» в следующих ниже Примерах или на фигурах)», использованные в Примерах, упомянутых ниже, были изготовлены в соответствии со способами, описанными в патентном документе 3 и статье Tamada et al. (Nature Biotechnology doi: 10.1038/nbt.4086). Далее в описании настоящего изобретения будет кратко описан способ приготовления. «Т-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR, IL-7 мыши и CCL19 мыши», представляют собой Т-клетки, содержащие анти-CD20-человека-CAR в качестве молекулы клеточной поверхности, распознающей антиген злокачественной опухолевой клетки, и содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19.

[0060] Для изготовления Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, сначала заранее готовили pMSGV-вектор, экспрессирующий анти-CD20-человека-CAR-IL-7-CCL19, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-CD20-человека-CAR, нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7 мыши, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19 мыши. Затем этот вектор вводили с использованием ретровируса в мышиные Т-клетки, выделенные из селезенки и лимфатических узлов CD90.1-позитивных (CD90.1⁺) и CD90.2-негативных (CD90.2^-) конгенных мышей (произведенных The Jackson Laboratory) с использованием набора для выделения Т-клеток Pan T Cell Isolation Kit II (произведенных Miltenyi Biotec), для изготовления Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19. В то же время, Т-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR (T-клетки, экспрессирующие CAR, направленный против CD20 человека), изготавливали, заранее получая pMSGV-вектор экспрессии анти-CD20-человека-CAR и вводя этот вектор в выделенные мышиные T-клетки с использованием ретровируса. Выделенные мышиные T-клетки без введения гена (нетрансдуцированные T-клетки) также упоминаются как «нетрансдуцированные» в следующих Примерах или на фигурах. В этом контексте pMSGV-вектор был использован в качестве ретровирусного вектора для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-CD20-человека-CAR, нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-7, и нуклеиновой кислоты, кодирующей CCL19, в мышиные T-клетки, выделенные, как описано выше. Следовательно, при культивировании с целью пролиферации полученных таким образом мышиных Т-клеток, содержащих нуклеиновые кислоты, некоторые мышиные Т-клетки содержали в своих цитоплазмах ретровирусный вектор, тогда как в геномы большинства мышиных Т-клеток интегрированы нуклеиновая кислота, кодирующая анти-CD20-человека-CAR, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19. Мышиные Т-клетки экспрессируют анти-CD20-человека-CAR, IL-7 и CCL19 на основе чужеродной рекомбинантной конструкции, когда нуклеиновая кислота, кодирующая анти-CD20-человека-CAR, нуклеиновая кислота, кодирующая IL-7, и нуклеиновая кислота, кодирующая CCL19, интегрированы в геномы этих клеток.

[0061] В культуре Т-клеток использовали культуральную среду RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 25 мМ HEPES и 2 мМ L-глутамина.

[0062] Пример 1

Локализация T-клеток

Для изучения противоопухолевого эффекта CAR-IL-7/CCL19-экспрессирующих Т-клеток исследовали, будут ли эндогенные Т-клетки хозяина (реципиента) проникать в опухолевые ткани так же, как и введенные донорские Т-клетки. Сначала 2,5×10⁶ клеток линии 3LL-hCD20 (мышиные клетки 3LL, полученные из рака легких, которые обрели способность экспрессировать человеческий CD20 за счет рекомбинации генов), инокулировали подкожно каждой из мышей линии C57BL/6 в возрасте от 7 до 10 недель (производство Japan SLC, Inc.) (день 0). Затем на 7-й день им внутрибрюшинно вводили противораковое средство циклофосфамид (CPA; 100 мг/кг). На 10-й день им вводили внутривенно 1×10⁶ Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR, или Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, полученных от CD90.1-позитивных (CD90.1⁺) и CD90.2-негативных (CD90.2^-) конгенных мышей, или выделенных мышиных Т-клеток без введения гена, как описано выше. На 19 день опухолевые ткани у мышей были удалены. Меченное биотином антитело против CD90.1 (клон OX-7, произведенный BioLegend, Inc.; связывание с донорскими Т-клетками) и антитело против CD3 (клон 17A2; произведенный Tonbo Biosciences Inc.; связывание как с донорскими Т-клетками, так и с эндогенными Т-клетками реципиента) использовали в комбинации при первичном окрашивании, а конъюгированный с Alexa Fluor 488 стрептавидин (произведенный Thermo Fisher Scientific, Inc.; зеленое окрашивание) и конъюгированный с Alexa Fluor 647 анти-IgG2b крысы (произведенный Abcam PLC; красное окрашивание) использовались при вторичном окрашивании. Ядра были окрашены DAPI (произведенным Thermo Fisher Scientific Inc.; синее окрашивание). Наблюдение под микроскопом проводили при увеличении ×400. Результаты представлены на Фигуре 1(a). Вторичное окрашивание выявляет клетки, связанные с меченным биотином антителом против CD90.1, окрашивая их зеленым цветом, и клетки, связанные с антителом против CD3, окрашивая их красным цветом. Поэтому донорские Т-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, были желтыми (зеленый цвет + красный цвет; CD90.1⁺ + CD3⁺), а эндогенные Т-клетки реципиента были красными (CD90.1^- + CD3⁺). На Фигуре 1(а) клетки показаны в оттенках серого цвета.

[0063] На Фигуре 1(b) показаны результаты количественной оценки каждой положительной области, отмеченной на Фигуре 1(a), с использованием программы Hybrid Cell Count (разработанной Keyence Corp.). На Фигуре 1(b) заполненный столбец отображает площадь эндогенных Т-клеток реципиента (хозяина) (показанных красным цветом на правом изображении Фигуры 1(а)), а открытый столбец отображает площадь введенных донорских Т-клеток (показаны желтым цветом на правом изображении Фигуры 1(а)). На Фигурах 1(а) и 1(b) показано, что введение Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, усиливает локальное накопление в опухоли не только введенных Т-клеток, но и эндогенных T-клеток реципиента (хозяина), другими словами, усиливает локальное накопление даже эндогенных Т-клеток в опухоли путем локальной секреции IL-7 и CCL19 в опухоль.

[0064] Пример 2

Участие Т-клеток в противоопухолевом эффекте

2,5×10⁶ клеток 3LL-hCD20 инокулировали подкожно каждой из мышей линии C57BL/6 (день 0). Затем на 3-й день им ввели внутривенно 1×10⁶ T-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR (Обычных: Обычн.) или Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19 (7×19), полученных от CD90.1-позитивных (CD90.1⁺) и CD90.2-негативных (CD90.2^-) конгенных мышей. Антитело против CD90.2 (антитело против CD90.2; изготовленное с использованием гибридомы, приобретенной в компании ATCC авторами настоящего изобретения), антитело против CD90.2 (Thy1.2), экспрессированное в эндогенных Т-клетках, вводили внутрибрюшинно дважды в неделю с 1-го дня. Первые две дозы были приняты равными 1 мг/мышь, а последующие дозы составляли 0,5 мг/мышь. На Фигуре 2 показано среднее значение ± СО объема опухоли на 14 день в каждой группе (n = 5). Знаком отмечено его численное значение для каждой мыши.

[0065] Как показано на Фигуре 2, введение Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, подавляло пролиферацию злокачественной опухоли, и опухоль исчезала из-за очень высокого противоопухолевого эффекта. Однако введение антитела против CD90.2 уменьшало противоопухолевый эффект приблизительно на 50 %. Эти результаты показали, что эндогенные Т-клетки реципиента также участвуют в противоопухолевом эффекте, вызванном T-клетками, экспрессирующими анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, другими словами, не только Т-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19 сами по себе, но и эндогенные Т-клетки реципиента в значительной степени вовлечены в противоопухолевый эффект, вызванный T-клетками, экспрессирующими анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19.

[0066] Пример 3

Потенциал памяти эндогенных Т-клеток реципиента

Т-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, оценивали на предмет приобретения функции памяти донорскими CAR-T-клетками и эндогенными Т-клетками и увеличения числа клеток, имеющих функцию памяти, с использованием CD44 и CD62L маркеров клеток памяти.

[0067] 2,5×10⁶ клеток 3LL-hCD20 инокулировали подкожно каждой из мышей линии C57BL/6 (день 0). На 3-й день им вводили внутривенно 1×10⁶ Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR (Обычн.), или Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19 (7×19), полученных от CD90.1-позитивных (CD90.1⁺) и CD90.2-негативных (CD90.2^-) конгенных мышей, как описано выше. На 28-й день клетки селезенки собрали и использовали в следующем анализе.

[0068] Донорские Т-клетки были идентифицированы как CD90.1-позитивные клетки (CD90.1⁺), а T-клетки реципиента были идентифицированы как CD90.2-позитивные клетки (CD90.2⁺). Экспрессия маркеров T-клеток памяти (CD44 и CD62L) и CAR в CD4-позитивных и CD8-позитивных T-клетках определялась с помощью проточной цитометрии. Числовые значения точечных диаграмм или гистограмм представляют долю клеток в каждом гейте. Результаты представлены на Фигуре 3.

[0069] Приобретение функции потенциала памяти, то есть способности реагировать на стимуляцию, определяли путем продуцирования IFN-γ. Сначала клетки селезенки, собранные на 28 день, стимулировали путем совместного культивирования с клеточной линией 3LL-hCD20 или родительской линией 3LL, не экспрессирующей hCD20, обработанной митомицином C (произведенным Kyowa Kirin Co., Ltd.) при 37°C в течение 90 минут. Продукцию IFN-γ исследовали путем внутриклеточного окрашивания цитокинов. Результаты представлены на Фигуре 4. Числовые значения на гистограммах Фигуры 4(а) представляют собой отношение числа IFN-γ-позитивных клеток к числу донорских CD90.1-позитивных Т-клеток. На Фигуре 4(b) показаны результаты обнаружения IFN-γ-позитивных клеток среди CD90.2-позитивных и эндогенных CD8-позитивных Т-клеток методом проточной цитометрии. Числовые значения на точечных диаграммах отображают соотношения клеток в 4 квадрантах.

[0070] Как показано на Фигуре 3, в случае введения Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR (Обычн.), гейтированные по CD90.2 клетки (эндогенные Т-клетки реципиента) включали центральные Т-клетки памяти (клетки, позитивные по маркерам Т-клеток памяти CD44 и CD62L) в количестве 5,5% CD4-позитивных клеток и 24,8% CD8-позитивных клеток. С другой стороны, в случае введения Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19 (7×19), гейтированные по CD90.2 клетки (эндогенные Т-клетки реципиента) включали центральные Т-клетки памяти в количестве 6,76% CD4-позитивных клеток и 49,2% CD8-позитивных клеток. Соотношение центральных Т-клеток памяти было увеличено в обоих случаях. Эти результаты показали, что введение Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19 (7×19), т.е. совместная секреция IL-7 и CCL19 из отдельных клеток, может активировать эндогенные Т-клетки реципиента, индуцируя дифференцировку эндогенных Т-клеток реципиента в Т-клетки центральной памяти, за счет чего увеличивается количество центральных Т-клеток памяти, а также увеличивается отношение количества центральных Т-клеток памяти к группе клеток селезенки. Другими словами, очевидно, что T-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, можно использовать в качестве индуктора T-клеток, которые имеют функцию памяти в организме субъекта, к которому применяется воздействие путем введения, или энхансера T-клеток, имеющих функцию памяти в организме субъекта, к которому применяется воздействие путем введения.

[0071] С другой стороны, гейтированные по CD90.1 клетки (донорские Т-клетки) включали центральные Т-клетки памяти в количестве 75,8% CD4-позитивных клеток и 90,7 % CD8-позитивных клеток, подтверждая тем самым, что сами донорские Т-клетки индуцируются в центральные Т-клетки памяти. В случае использования Обычн. клеток гейтированные по CD90.1 клетки составляли 0%, а CD90.1-позитивные клетки не были обнаружены (н.о.), потому что Обычн. клетки не экспрессировали ни IL-7, ни CCL19, а выживаемость CAR-экспрессирующих T-клеток была низкой.

[0072] Как показано на Фигуре 4, донорские клетки включали 90,5% CD4-позитивных клеток и 93,6% CD8-позитивных клеток, продуцирующих IFN-γ путем стимуляции с использованием 3LL. Кроме того, среди эндогенных Т-клеток реципиента (не экспрессирующих CAR-T) 0,957% CD4-позитивных клеток продуцировали IFN-γ при введении Обычн. клеток, тогда как 14,9 % CD4-позитивных клеток продуцировали IFN-γ при введении клеток 7×19. Эти результаты показали, что при секреции IL-7 и CCL19 с использованием Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, как донорские Т-клетки, так и клетки реципиента вырабатывают IFN-γ под действием стимуляции и приобретают функцию памяти.

[0073] Пример 4

Изменение уровня экспрессии генов Т-клеточного рецептора

Для изучения разнообразия Т-клеточных эпитопов (антигенных детеминантов) были исследованы изменения в репертуаре Т-клеточных рецепторов (TCR) до и после введения CAR-IL-7/CCL19-экспрессирующих Т-клеток. 5×10⁵ клеток линии P815-hCD20 (мышиные клетки мастоцитомы P815, получившие способность экспрессировать человеческий CD20 путем рекомбинации генов), инокулировали подкожно мышам линии DBA/2 (n = 5) (день 0). Затем на 10-й день им вводили внутривенно для лечения опухоли циклофосфамид (CPA; 100 мг/кг) и 1×10⁶ Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19. На 140-й день после введения опухолевых клеток P815 производили забор клеток селезенки у мышей, полностью вылеченных от опухоли с помощью методики, описанной выше (мыши с отторжением опухоли), и культивировали с линией P815-hCD20 или родительской линией P815, не экспрессирующей hCD20 (hCD20-негативные: hCD20^-) в течение 4 дней для пролиферации CAR-позитивных T-клеток или CAR-негативных T-клеток, отсортированных с использованием клеточного сортера (SH800; произведенный Sony Corp.). Затем для анализа репертуара TCR популяцию CD8-позитивных и CAR-позитивных (CD8⁺CAR⁺) или CD8-позитивных и CAR-негативных (CD8⁺CAR^-) клеток сортировали с использованием проточного цитометра. До введения мышам популяцию CD8-позитивных и CAR-позитивных или CD8-позитивных и CAR-негативных клеток сортировали в качестве контроля. Репертуар TCR анализировали с использованием секвенатора нового поколения, после чего частота использования областей V и J в α- и β-цепях была показана на 3-мерном графике. Результаты показаны на Фигурах 5А-5D и 6А-6D. На Фигурах 5А-5D показаны результаты по α-цепи, а на Фигурах 6А-6D отражены результаты по β-цепи. На Фигурах 5А, 5В, 6А и 6В показаны результаты, полученные до введения клеток каждой линии, а на Фигурах 5С, 5D, 6С и 6D отражены результаты, полученные после введения клеток каждой линии. Числовые значения в верхнем левом углу на диаграммах представляют собой индексы разнообразия, рассчитанные с использованием индекса выровненности Пиелу (более высокое его значение указывает на меньшее разнообразие) и их более низкое числовое значение указывает на более высокое разнообразие.

[0074] Рецептор Т-клеток представляет собой молекулу антигенного рецептора, экспрессирующуюся на клеточных мембранах Т-клеток. Рецептор Т-клеток существует в виде гетеродимера, состоящего из α-цепи и β-цепи или γ-цепи и δ-цепи, также известно, что он активирует Т-клетки путем распознавания молекулы антигена, связанной с главным комплексом гистосовместимости (ГКГС).

[0075] Как явствует из индексов разнообразия, показанных на Фигурах 5A-5D и 6A-6D, значение индексов разнообразия повышалось как для α-цепи, так и для β-цепей при введении Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19. Таким образом, разнообразие TCR снижалось не только во введенных Т-клетках, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, но и в эндогенных T-клетках реципиента, что показывает, что количество T-клеток, предположительно имеющих функцию памяти против опухолевого антигена, избирательно увеличивается путем локальной секреции IL-7 и CCL19 в опухоль при разрушении опухолевых клеток.

[0076] Пример 5

Ингибирование рецидива опухоли - 1

Модели рецидива рака на животном были произведены следующим способом: во-первых, опухолеспецифический вторичный иммунный ответ Т-клеток реципиента исследовали на мышах, которым вводили T-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19. 5×10⁵ клеток P815-hCD20 инокулировали подкожно каждой из 7-10-недельных мышей, больных раком (DBA/2; n = 4; произведено Japan SLC, Inc.). Затем на 10-й день им внутрибрюшинно вводили противораковое средство циклофосфамид (CPA; 100 мг/кг). На 14 день им внутривенно инокулировали 1×10⁶ Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19. На 140 день после инокуляции клеточной линии P815-hCD20 клеточную линию P815-hCD20 или родительскую линию P815, не экспрессирующую hCD20, инокулировали в каждую из правых и левых боковых областей живота мышей с отторжением опухоли или контрольных мышей, не подвергнутых воздействию. Объемы опухоли измеряли дважды в неделю. Результаты представлены на Фигуре 7A. Аналогичный анализ также проводили с использованием мышей линии C57BL/6, инокулированных вместо клеточной линии P815-hCD20 клеточной линией 3LL-hCD20 или родительской линией 3LL, не экспрессирующей hCD20. Результаты представлены на Фигуре 7B. Родительские линии P815 и 3LL не экспрессируют CD20 человека и, следовательно, служат в качестве клеток злокачественной опухоли, не имеющих антигена злокачественной опухоли, который специфически распознается молекулой клеточной поверхности Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19.

[0077] Абсцисса на Фигуре 7А отображает количество дней со дня, в который первоначально вводили линию P815-hCD20 или P815 (день 0) мышам, не подвергнутым воздействию, а также количество дней со дня, когда линию P815-hCD20 снова инокулировали в 140-й день после первоначальной инокуляции линии P815-hCD20 (день 0) мышам с отторжением опухоли. Абсцисса на Фигуре 7В показывает количество дней со дня, в который линию 3LL-hCD20 или 3LL первоначально вводили (день 0) мышам, не подвергнутым воздействию, а также количество дней со дня, когда линию 3LL-hCD20 снова инокулировали (день 0) мышам с отторжением опухоли. Ординаты на Фигурах 7А и 7В отображают объемы опухолей (мм³).

[0078] Как показано на нижних графиках Фигур 7А и 7В, у мышей с отторжением опухоли, инокулированных клеточной линией P815-hCD20 или 3LL-hCD20, опухоль не образовывалась. Эти результаты показали, что лечение опухоли Т-клетками, экспрессирующими анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, может ингибировать рецидив опухоли, приписываемый опухолевым клеткам, имеющим антиген, который распознается рецептором CAR. Как показано на верхних графиках Фигур 7А и 7В, неожиданно оказалось, что образование опухоли было заметно ингибировано у мышей с отторжением опухоли, инокулированных родительской линией P815 или 3LL, не имеющей CD20 на поверхности клетки, по сравнению с мышами, не подвергнутым воздействию. Эти результаты показали, что введение Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, может ингибировать формирование опухоли, приписываемое опухолевым клеткам, не имеющим антигена, который распознается рецептором CAR, другими словами, рецидива опухоли, приписываемого опухолевым клеткам, не имеющим антигена, который распознается рецептором CAR. Такое явление, при котором введение Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, влияет на иммунную функцию субъекта, к которому применяется воздействие путем введения, и ингибирует рецидив, за счет чего у этого субъекта в течение длительного периода времени продолжается отторжение опухоли, образованной из родительской клеточной линии, не экспрессирующей антиген, являющийся мишенью CAR, было неожиданным с точки зрения специфической реактивности CAR-T-клеток в отношении молекулы-мишени. Если рассматривать этот факт в совокупности с результатами, касающимися изменения характера экспрессии генов рецептора Т-клеток в Примере 4, то введение Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, вызывало разрушение опухолевых клеток, а в результате этого эндогенные Т-клетки реципиента, по-видимому, реагировали с опухолевым антигеном, исходно перенесенным опухолевыми клетками, что приводило к индуцированию функции долговременной памяти. Это говорит о том, что введение Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, разрушает опухолевые клетки, в результате чего IL-7 и CCL19 локально секретируются в опухоль, тем самым ингибируя рецидив злокачественной опухоли за счет высокоэффективной индукции феномена распространения эпитопа, а также индукции и усиления функции памяти. При использовании вышеуказанных моделей рецидива рака сначала проводили подкожную инокуляцию линий P815-hCD20, P815, 3LL-hCD20 или 3LL, а на 140-й день клетки каждой линии инокулировали в каждую из правых и левых боковых областей живота. Следовательно, введение Т-клеток, экспрессирующих анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, не только ингибирует рецидив злокачественной опухоли, но может ингибировать метастазирование злокачественной опухоли. Таким образом, Т-клетки, экспрессирующие анти-CD20-человека-CAR-IL-7/CCL19, вероятно, также могут применяться в качестве «ингибитора метастазирования злокачественной опухоли».

[0079] Пример 6

Ингибирование рецидива опухоли - 2

Чтобы подтвердить эффект ингибирования рецидива опухоли, опухоль формировали путем введения мышам клеточной линии злокачественной плевральной мезотелиомы человека, а затем проверяли наличие или отсутствие рецидива опухоли в течение 143 дней путем введения или невведения T-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7/CCL19. На Фигуре 8 показан конкретный экспериментальный протокол. Способы изготовления линий «ACC-MESO1-GFP-Luc», «Т-клеток, экспрессирующих CAR, направленный против мезотелина», «анти-мезотелин-CAR-IL-7/CCL19-экспрессирующих T-клеток», показанных на Фигуре 8, и метод активации Т-клеток заключаются в следующем.

[0080] Изготовление клеточной линии ACC-MESO1-GFP-Luc

Ген зеленого флуоресцентного белка-люциферазы (GFP-Luc) был введен с использованием лентивируса в клеточную линию злокачественной мезотелиомы человека ACC-MESO1, линию мезотелин-позитивных опухолевых клеток, любезно предоставленную профессором Йошитака Секидо из исследовательского института онкологического центра Айти.

[0081] В 0-й день линию ACC-MESO1 высевали по 1×10³ клеток на лунку в 96-луночный планшет. В качестве культуральной среды использовали RPMI1640 (произведенную Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). В 1-й день частицы лентивируса для приготовления люминесцентных клеток RediFect Red-FLuc-GFP (произведенных PerkinElmer, Inc.) добавляли к культуре при MOI 100 для начала трансдукции. Для того, чтобы повысить эффективность введения гена, к культуральной среде добавляли гексадиметрина бромид (произведенный Sigma-Aldrich Co. LLC) таким образом, чтобы конечная концентрация составляла 4 мкг/мл. Через 24 часа после добавления вируса (в день 2) культуральную среду, содержащую вирус, удаляли и заменяли свежей культуральной средой. После продолжения культивирования проводили сортировку только клеток, экспрессирующих GFP, с использованием SH800 (произведенного Sony Corp.), и использовали их в качестве линии ACC-MESO1-GFP-Luc.

[0082] Изготовление Т-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7/CCL19, и Т-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR

Т-клетки, экспрессирующие анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7-CCL19, и T-клетки, экспрессирующие анти-мезотелин-человека-CAR (обычные T-клетки, экспрессирующие CAR), изготавливали на основе способов, описанных в заявке на патент Японии № 2017-247109 и Международной публикации № WO 2016/056228. Согласно краткому описанию, была изготовлена конструкция CAR третьего поколения (SEQ ID NO: 6), которая содержала одноцепочечный анти-мезотелин-человека-Fv, состоящий из аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в SEQ ID NO: 3, аминокислотной последовательности линкера, представленной в SEQ ID NO: 4, и аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в SEQ ID NO: 5, трансмембранной области человеческого CD8 и внутриклеточного сигнального мотива человеческого CD28-4-1BB-CD3ζ в указанном порядке. Генная конструкция, содержащая человеческий IL-7, представленный в SEQ ID NO: 1, затем 2A-пептид, полученный из пикорнавируса (F2A), представленный в SEQ ID NO: 7, человеческий CCL19, представленный в SEQ ID NO: 2, и ген тимидинкиназы, полученный из вируса герпеса (HSV-tk), следующие в этом порядке на С-конце конструкции, была изготовлена и вставлена в pMSGV1-ретровирусный вектор экспрессии (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18): 6436-6445 (2002)) с целью изготовления ретровирусного pMSGV1- вектора экспрессии для экспрессии человеческого IL-7/CCL19 и HSV-tk. Полученный ретровирусный pMSGV1-вектор экспрессии вводили в Т-клетки мыши с использованием ретровируса для изготовления Т-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7-CCL19. Аналогично, ретровирусный pMSGV1 вектор экспрессии конструкции CAR третьего поколения, содержащий одноцепочечный анти-мезотелин-человека-Fv, трансмембранную область человеческого CD8 и внутриклеточный сигнальный мотив человеческого CD28-4-1BB-CD3ζ в указанном порядке, был введен вместо ретровирусного pMSGV1-вектора экспрессии с целью экспрессии человеческих IL-7/CCL19 и HSV-tk в мышиных Т-клетках с использованием ретровируса для изготовления T-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR (обычные T-клетки, экспрессирующие анти-мезотелин-человека-CAR). В качестве сигнального пептида использовали сигнальный пептид, представленный в SEQ ID NO: 8.

[0083] Активация Т-клеток

В день 0 было начато культивирование 2×10⁶ мононуклеарных клеток периферической крови, собранных у здоровых людей-доноров, вместе с 200 МЕ/мл IL-2 (произведенных PeproTech, Inc.) при 37°С в 6-луночном планшете для клеточной культуры, на котором иммобилизовали 25 мкл/мл ретронектина (произведенного Takara Bio Inc.) и 5 мкг/мл моноклонального антитела против CD3 человека (произведенного Invitrogen Corp., 5 мкг/мл) с использованием инкубатора, содержащего 5% CO₂. Используемый культуральный раствор содержал OpTmizer CTS (произведенный Gibco) с добавлением 2 мМ L-глутамина (произведенного Gibco), 1% пенициллин-стрептомицина (произведенного Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и 2,5 мкг/мл фунгизона (произведенного Bristol-Myers Squibb Company). После культивирования в течение 3 дней наличие активации и морфологических изменений у Т-клетки подтверждали на 3-й день с помощью микроскопа.

[0084] Наблюдение рецидива опухоли

Сначала в день 0 линию ACC-MESO1-GFP-Luc вводили интраторакально по 2×10⁶ клеток/мышь 8-недельным самкам иммунодефицитных NSG-мышей. В 1-й день приживление интраторакальной опухоли было подтверждено с использованием системы визуализации in vivo (IVIS). В день 1 подвергали оттаиванию обычные Т-клетки, экспрессирующие CAR, Т-клетки, экспрессирующие анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7-CCL19, и Т-клетки, активированные указанным способом, которые были приготовлены из мононуклеарных клеток периферической крови здорового донора (РВМС) и законсервированы с использованием криотехнологии. Обычные Т-клетки, экспрессирующие анти-мезотелин-человека-CAR, и Т-клетки, экспрессирующие анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7-CCL19, имели уровень экспрессии CAR 49,6% и 32,5%, соответственно. Поэтому активированные Т-клетки добавляли к обычным Т-клеткам, экспрессирующим анти-мезотелин-человека-CAR, чтобы добиться совпадения их скоростей экспрессии CAR. Затем была сформирована группа (N = 5), получавшая 1×10⁵ обычных Т-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR, и группа (N = 5), получавшая 1×10⁵ Т-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7-CCL19. Введение обычных Т-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR, и Т-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7-CCL19, производили внутривенно в хвостовые вены. На 3-й день или позже измеряли интенсивность флуоресценции опухоли (общий поток (фотонов/сек) с использованием IVIS. Результаты представлены на Фигурах 9A и 9B. На Фигуре 10 графически показана взаимосвязь между количеством дней с момента введения и показателями выживаемости мышей по результатам, описанным выше. Фигура 11 графически показывает взаимосвязь между количеством дней после введения и общим количеством флуоресценции (фотонов в секунду) по результатам, описанным выше. На Фигурах 9А, 9В, 10 и 11 мыши, которым вводили Т-клетки, экспрессирующие анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7-CCL19, обозначены как «7×19 CAR-T», а мыши, которым давали обычные Т-клетки, экспрессирующие анти-мезотелин-человека-CAR, обозначены как «Обычные CAR-T». В Примере 6 иммунодефицитных NSG мышей, дефектных по эндогенным Т-клеткам, использовали в качестве реципиентов. Таким образом, влияние эндогенных Т-клеток реципиента было устранено, и был оценен эффект введенных Т-клеток, экспрессирующих анти-мезотелин-человека-CAR-IL-7-CCL19.

[0085] Как показано на Фигурах 9А, 9В, 10 и 11, интенсивность флуоресценции опухоли редко наблюдалась как в 7×19 CAR-T клетках, так и в обычных CAR-T клетках в день 21 или в близкие к нему дни. После этого, вплоть до 143-го дня не наблюдалось флуоресценции опухоли в 7×19 CAR-T клетках; это подтверждает, что рецидив полностью ингибирован. С другой стороны, флуоресценция опухоли стала наблюдаемой в обычных CAR-T клетках на 45-й день или в близкие к нему дни, а интенсивность флюоресценции опухоли была повышена на 115-й день: одно животное погибло на 129-й день, а остальные четыре также погибли на 143-й день. Эти результаты показали, что рецидив злокачественной опухоли можно ингибировать путем введения Т-клеток, экспрессирующих CAR-IL-7-CCL19, то есть путем локальной секреции IL-7 и CCL19 в опухоль при разрушении опухолевых клеток.

[0086] Пример 7

Потенциал памяти эндогенных Т-клеток реципиента

В описанных выше примерах использовали T-клетки, содержащие CAR в качестве молекулы клеточной поверхности, которая распознает антиген злокачественной опухоли. Потенциал памяти эндогенных Т-клеток реципиента исследовали с использованием Т-клеток, имеющих рецептор Т-клеток (TCR) вместо CAR в качестве молекулы клеточной поверхности, которая распознает антиген злокачественной опухоли.

[0087] Изготовление P1A-специфических TCR/IL-7/CCL19/eGFP-экспрессирующих T-клеток

Т-клетки, экспрессирующие TCR, специфичные в отношении опухолевого антигена P1A P815, IL-7 мыши, CCL19 мыши и GFP, изготавливали в соответствии со способом, описанным в патентном документе 3. Способ изготовления будет кратко описан ниже.

[0088] Был искусственно синтезирован фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19, кодирующий мышиный IL-7 (без стоп-кодона), следующий за ним пептид 2А, полученный из пикорнавируса (F2A), и мышиный CCL19 (Life Technologies Corp.). Синтезированный таким образом фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19 встраивали в сайт множественного клонирования ретровирусного pMSGV-вектора экспрессии (патентный документ 3), содержащего последовательность F2A-eGFP, путем обработки и лигирования рестриктазой (NCOI и ECORI) с получением pMSGV-вектора, содержащего фрагмент ДНК IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP (SEQ ID NO: 9) (IL-7×CCL19-eGFP вектор экспрессии). Кроме того, pMSGV-вектор, содержащий eGFP и не содержащий ни IL-7, ни CCL19 (eGFP контрольный вектор), изготавливали в качестве контроля. В SEQ ID NO: 9 нуклеотиды с 1 по 462 соответствуют нуклеиновой кислоте, кодирующей IL-7 (нуклеотиды с 1 по 75 соответствуют нуклеиновой кислоте, кодирующей сигнальную последовательность IL-7), нуклеотиды с 463 по 537 соответствуют нуклеиновой кислоте, кодирующей F2A, нуклеотиды с 538 по 861 соответствуют нуклеиновой кислоте, кодирующей CCL19 (нуклеотиды с 538 по 612 соответствуют нуклеиновой кислоте, кодирующей сигнальную последовательность CCL19), нуклеотиды с 868 по 942 соответствуют нуклеиновой кислоте, кодирующей F2A, нуклеотиды с 946 по 1662 соответствуют нуклеиновой кислоте, кодирующей eGFP, а нуклеотиды с 1663 по 1665 соответствуют стоп-кодону.

[0089] Производили забор клеток селезенки у трансгенных мышей, экспрессирующих TCR, специфичный в отношении H-2L^d-рестриктированного опухолевого антигена P1A P815 (Sarma S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med. 189:811.), полученного от Y. Liu. Из них были произведены полученные из клеток селезенки мышиные T-клетки, экспрессирующие TCR, специфичный к опухолевому антигену P1A P815 (P1A-специфические TCR-T-клетки). Затем был изготовлен ретровирус, несущий вектор экспрессии IL-7×CCL19-eGFP, или контрольный вектор eGFP, а также были получены клетки путем активации клеток селезенки (3×10⁶ клеток на лунку), которая включала трансдукцию ретровирусом P1A-специфических TCR-T-клеток с P1A пептидом в течение 48 часов для получения P1A-специфических TCR/IL-7/CCL19/eGFP-экспрессирующих T-клеток (7×19 P1A-CTL) или P1A-специфических TCR/eGFP-экспрессирующих T-клеток (обычн. P1A-CTL). Результат трансдукции с каждым вектором экспрессии был подтвержден с помощью анализа методом проточной цитометрии путем выявления eGFP в качестве суррогатного маркера. Уровень экспрессии eGFP полученных Т-клеток каждой линии составлял от 70 до 80% во всех экспериментах.

[0090] На Фигурах 12(a) и 12(b) показаны результаты анализа методом проточной цитометрии отношения CD8⁺GFP⁺ клеток к клеткам селезенки и абсолютного количества CD8⁺GFP⁺ клеток у мышей, получавших P1A-специфические T-клетки, экспрессирующие TCR/IL-7/CCL19/eGFP, или P1A-специфические T-клетки, экспрессирующие TCR/eGFP. Было подтверждено, что обработка P1A-специфическими T-клетками, экспрессирующими TCR/IL-7/CCL19/eGFP, увеличивает отношение CD8⁺GFP⁺ клеток к клеткам селезенки и абсолютное количество CD8⁺GFP⁺ клеток.

[0091] На Фигурах 13(a) и 13(b) показаны результаты анализа методом проточной цитометрии экспрессии CD44 в CD8⁺ клетках селезенки мышей линии BDA/2, не подвергнутых воздействию, и в CD8⁺GFP^- или CD8⁺GFP⁺ клетках селезенки мышей, получавших P1A-специфические T-клетки, экспрессирующие TCR/IL-7/CCL19/eGFP. На Фигуре 13(а) показано репрезентативное количество CD44⁺ клеток. На Фигуре 13(b) показано соотношение CD44⁺ клеток. Как показано на Фигурах 13(а) и 13(b), не только во введенных Т-клетках (гейтированных по GFP⁺), но и в эндогенных Т-клетках реципиента (гейтированных по GFP^-) доля CD44⁺ клеток увеличилась в два или более раз по сравнению с наивными Т-клетками. Таким образом, было подтверждено, что P1A-специфические Т-клетки, экспрессирующие TCR/IL-7/CCL19/eGFP, обладают воздействием, сообщающим потенциал памяти собственным Т-клеткам реципиента, то есть воздействием, индуцирующим функцию памяти у собственных Т-клеток реципиента и усиливающим функцию памяти в собственных Т-клетках реципиента.

[0092] Для подтверждения приобретения функции потенциала памяти, то есть способности реагировать на стимуляцию, определяли продуцирование IFN-γ. Т-клетки выделяли магнитным способом из клеток селезенки и культивировали в течение приблизительно 5 дней с тучными клетками слизистой оболочки (MMC), обработанными P815. На Фигуре 14 показаны результаты определения концентрации IFN-γ в супернатанте культуральной среды с помощью ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Как показано на Фигуре 14, было подтверждено, что P1A-специфические T-клетки, экспрессирующие TCR/IL-7/CCL19/eGFP, обладают высокой продукцией IFN-γ. Таким образом, было подтверждено, что P1A-специфические T-клетки, экспрессирующие TCR/IL-7/CCL19/eGFP, повышают противоопухолевую активность эндогенных T-клеток реципиента. На основании этого следует предположить, что P1A-специфические T-клетки, экспрессирующие TCR/IL-7/CCL19/eGFP, индуцируют эффект ингибирования рецидива у реципиентов.

[0093] Пример 8

Вирус, экспрессирующий IL-7 и CCL19

В описанных выше примерах в качестве носителя для доставки нуклеиновой кислоты использовали иммунную клетку. Улучшение в T-клетках или B-клетках, имеющих функцию памяти, или ингибирование рецидива злокачественной опухоли у субъекта, к которому применяется воздействие путем введения, должно быть достигнуто без использования иммунной клетки при условии, что IL-7 и CCL19 локально секретируются в опухоль. Соответственно, анализ проводился с использованием вируса вместо иммунной клетки в качестве носителя для доставки нуклеиновой кислоты.

[0094] Приготовление генетически рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего мышиный IL-7 и мышиный CCL19

Генетически рекомбинантный вирус осповакцины, экспрессирующий IL-7 мыши и CCL19 мыши, изготавливали в соответствии со способом, описанным в патентном документе 3 и международной публикации № WO 2011/125469, используя следующий способ. Область гена синего флуоресцентного белка (BFP) была амплифицирована на основании ДНК pTagBFP-N-вектора (FP172, Evrogen) в качестве матрицы с использованием двух праймеров (5'-ATG GCC GGA CCG GCC ACC GGT CGC CAC CAT GAG CGA G-3': SEQ ID NO: 10) и (5'-TCG AAT TCG CTA GCG GCC GCT TAA TTA AGC TTG TGC CCC AG-3': SEQ ID NO: 11). Продукт ПЦР расщепляли рестриктазами SfiI и EcoRI, и продукт этой реакции клонировали в соответствующий сайт рестрикции pTK-SP-LG-вектора (Международная публикация WO2011/125469) с целью получения конструкции pTK-SP-BFP, в которой ген BFP связан с синтетическим промотором вируса осповакцины (Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66 (1): 135-138). Затем pAmCyan1-N1 вектор (произведенный Takara Bio Inc.) расщепляли рестрикционными ферментами AgeI и NotI, и полученный в результате этого фрагмент флуоресцентного белка AmCyan1 клонировали в сайт, обработанный такими же рестрикционными ферментами, как и pTK-SP-BFP для того, чтобы получить конструкцию pTK-SP-AmCyan1.

[0095] Плазмиду pMSGV, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий мышиный IL-7, следующий за ним 2А-пептид, полученный из пикорнавируса (F2A), мышиный CCL19, F2A и eGFP (патентный документ 3), расщепляли рестриктазой BamHI, обрабатывали с образованием тупого конца, а затем расщепляли с помощью NcoI. Полученный фрагмент IL-7-F2A-mouse CCL19-F2A-eGFP был клонирован в сайт, полученный расщеплением pTK-SP-AmCyan1 с помощью NheI и обработкой с образованием тупого конца, а затем подвергнут расщеплению с помощью NcoI с целью конструирования векторной плазмиды для переноса pTK-SP-mouse IL-7-F2A-mouse CCL19-F2A-eGFP.

[0096] Область гена люциферазы светлячка была амплифицирована на основании ДНК pGL4.20 (произведенного Promega Corp.) в качестве матрицы с использованием двух праймеров (5'-GCT CCG GAC GCC ACC ATG GAA GAT GCC AAA AAC-3' (SEQ ID NO: 12) и 5'-GCG AAT TCC ACG GCG ATC TTG CCG CCC TTC T-3' (SEQ ID NO: 13)). Продукт ПЦР расщепляли рестрикционными ферментами BspEI и EcoRI, а полученный фрагмент Luc и фрагмент, содержащий часть eGFP и полученный путем расщепления pTK-SP-mouse IL-7-F2A-mouse CCL19-F2A-eGFP рестрикционными ферментами EcoRI и BsrGI, были одновременно клонированы в сайт конструкции pTK-SP-mouse IL-7-F2A-mouse CCL19-F2A-eGFP, расщепленной рестрикционными ферментами BspEI и BsrGI, с целью конструирования векторной плазмиды для переноса pTK-SP-Luc-F2A-eGFP.

[0097] Чтобы выделить рекомбинантный вирус осповакцины, имеющий вирусный геном, показанный на Фигурах 15(а) или 15(b), клетки CV1, культивированные при конфлюэнтности 80% в 6-луночном планшете, инфицировали вирусом осповакцины (LC16mO) при MOI = 0,02-0,1. После адсорбции при комнатной температуре в течение 1 часа ДНК векторной плазмиды для переноса (pTK-SP-mouse IL-7-F2A-mouse CCL19-F2A-eGFP или pTK-SP-Luc-F2A-eGFP), смешанную с реагентом FuGENE HD (произведенным Promega Corp.), добавляли к клеткам в соответствии с руководством, для включения ДНК в клетки. Клетки культивировали при 37°С в течение от 2 до 5 дней. Клетки извлекали, подвергали замораживанию и оттаиванию, затем обрабатывали ультразвуком, соответствующим образом разбавляли и инокулировали в почти сливающиеся BSC1 клетки. К ним добавляли культуральную среду Eagle MEM, содержащую 0,8% метилцеллюлозы и 5% ФБС, и затем клетки культивировали при 37°С в течение от 2 до 5 дней. Культуральную среду удаляли и бляшки, экспрессирующие BFP, соскабливали наконечником пипетки и суспендировали в культуральной среде Opti-MEM (произведенной Invitrogen Corp.). Эту операцию повторяли три или более раз, используя клетки BSC1 для очистки бляшек. Суспензию бляшек, собранных после очистки бляшек, обрабатывали ультразвуком. Затем геномную ДНК экстрагировали из аликвоты суспензии объемом 200 мкл с использованием набора High Pure Viral Nucleic Acid Kit (произведенного F. Hoffmann-La Roche, Ltd.) в соответствии с руководством и подвергали скринингу с помощью ПЦР. ПЦР проводили с использованием двух праймеров (5'-ATT TCT CCG TGA TAG GTA TCG ATG-3' (SEQ ID NO: 14) и 5'-AAC GGT TTA CGT TGA AAT GTC C-3' SEQ ID NO: 15), и клоны с заранее определенным размером обнаруженного продукта ПЦР были непосредственно секвенированы для подтверждения нуклеотидной последовательности продукта ПЦР. Клон вируса, не имеющий нарушений нуклеотидной последовательности, отбирали и амплифицировали в A549 клетках с последующим определением титра вируса в RK13 клетках. Полученный вирус подвергали воздействию генетически рекомбинантного вируса осповакцины LC16mO TK-SP-mouse IL-7-F2A-mouse CCL19-F2A-eGFP (TK-ICE; Фигура 15(а)) или LC16mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP (TK-LE; Фигура 15(b)) в следующем эксперименте.

[0098] Клетки A549 (1×10⁵ клеток на лунку) или клетки CT26 (5×10⁴ клеток на лунку) высевали в 24-луночный планшет и культивировали при 37°C. Затем клетки A549 и клетки CT26 инфицировали TK-ICE или TK-LE при значении множественности заражения MOI = 0,1 и MOI = 10, соответственно (n = 3). Через 24, 48 и 72 часа после заражения клетки наблюдали под флуоресцентным микроскопом (произведенным Olympus Corp.) (Фигура 16) и из них извлекали супернатанты. Супернатант, отделенный от клеток каждой линии спустя 24, 48 или 72 часа, разводили в 100 раз, и количества IL-7 и CCL19, секретируемые в 0,5 мл супернатанта, измеряли с использованием наборов DuoSet ELISA Mouse IL-7 (DY407, произведенного R&D Systems, Inc.), DuoSet ELISA Mouse CCL-19 (DY440, произведенного R&D Systems, Inc.) и DuoSet Ancillary Reagent Kit 2 (DY008, произведенного R&D Systems, Inc.). Результаты измерений представлены на Фигуре 17.

[0099] Как показано на Фигурах 16 и 17, флуоресцентное излучение eGFP в клетках A549 и клетках CT26 через 24, 48 или 72 часа после инфицирования было одинаковым при введении как TK-ICE, так и TK-LE. Флуоресцентное излучение eGFP было обнаружено почти во всех клетках A549 через 48 часов после инфицирования. Флуоресцентное излучение eGFP увеличивалось в клетках CT26 с течением времени. IL-7 и CCL19 были обнаружены через 24 часа после инфицирования в клетках A549 и клетках CT26, инфицированных TK-ICE. Количество IL-7 и CCL19 в клетках A549 почти достигло плато через 48 часов после инфицирования. Количества IL-7 и CCL19 в клетках CT26 повышались с течением времени. С другой стороны, количества IL-7 и CCL19 были равны или ниже пределов обнаружения в клетках, инфицированных TK-LE. На основании этих результатов было подтверждено, что TK-ICE секретирует IL-7 и CCL19 при разрушении опухолевых клеток.

[0100] Пример 9

Противоопухолевый эффект

В Примере 8 было подтверждено, что генетически рекомбинантный вирус осповакцины TK-ICE, изготовленный, как описано выше, секретирует IL-7 и CCL19 при уничтожении клеток раковой опухоли путем инфицирования опухолевых клеток. Соответственно, генетически рекомбинантный вирус осповакцины TK-ICE был исследован на наличие у него противоопухолевого эффекта.

[0101] Как показано на Фигуре 18, клетки CT26 рака толстой кишки мыши (5×10⁵ клеток) подкожно трансплантировали в правую и левую части живота каждой из мышей линии BALB/c и давали возможность опухоли расти. Затем каждый генетически рекомбинантный вирус осповакцины (3-5×10⁷ бляшкообразующих единиц (БОЕ)) вводили интратуморально в общей сложности три раза (в 0, 2 и 4-й дни) в большую из выбранных опухолей, сформировавшихся в правой и левой частях живота. Затем исследовали противоопухолевый эффект вируса путем измерения диаметра опухоли в правой и левой частях живота. Опухоль на стороне, в которую производилось введение, до первой дозы составляла от 43 до 102 мм³, а опухоль на стороне, в которую не производилось введение, до первой дозы составляла от 24 до 82 мм³. Результаты представлены на Фигуре 19.

[0102] Согласно результату на Фигуре 19, пролиферация опухоли на стороне введения была подавлена в группе, получавшей TK-LE, не экспрессирующий ни IL-7, ни CCL19 (N = 7), по сравнению с группой, получавшей PBS (N = 8), тогда как в группе без введения не наблюдалось подавления опухоли. Напротив, в группе, получавшей TK-ICE, экспрессирующий IL-7 и CCL19 (N = 4), по сравнению с группой, получавшей PBS (N = 4), подавление пролиферации опухоли наблюдалось не только в опухоли на стороне введения вируса, но и в опухоли на стороне без введения. Генетически рекомбинантный вирус осповакцины, вводимый в опухоль на одной стороне брюшной полости не мигрировал в опухоль на другой стороне, что было подтверждено методом неинвазивного обнаружения вируса путем введения субстрата (люциферина) для люминесцентного фермента (люциферазы), экспрессирующегося в опухолевых клетках, инфицированных TK-LE, по наличию или отсутствию свечения (не показано). Это свидетельствует о том, что разрушение опухолевых клеток под воздействием TK-ICE, а также локальная секреция IL-7 и CCL19 в опухоль вызывает опухолевый иммунитет у субъекта, к которому применяется воздействие путем введения, одновременно усиливая функцию памяти эндогенных Т-клеток, что подтверждается фактами не только исчезновения опухоли на стороне введения, но и подавления пролиферации опухоли на стороне без введения, а также ингибирования рецидива злокачественной опухоли.

--->

Перечень последовательностей

<110> YAMAGUCHI UNIVERSITY

NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOTTORI UNIVERSITY

<120> Enhancer of T cells or B cells with memory function, inhibitor of

malignant tumor recurrence, and inducerr of T cells or B cells with

memory function

<130> FH29-024

<150> JP2017-196718

<151> 2017-10-10

<160> 15

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 177

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> human IL-7 AA

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> Inventor: Tamada, Koji

Inventor: Sakoda, Yukimi

Inventor: Adachi, Keishi

Inventor: Nakamura, Takafumi

<400> 1

Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile

1 5 10 15

Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe

50 55 60

Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe

65 70 75 80

Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser

85 90 95

Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr

100 105 110

Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala

115 120 125

Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu

130 135 140

Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu

145 150 155 160

Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu

165 170 175

His

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> human CCL19 AA

<400> 2

Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro

1 5 10 15

Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser

20 25 30

Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr

35 40 45

Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr

50 55 60

Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu

65 70 75 80

Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg

85 90 95

Ser Ser

<210> 3

<211> 128

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VH07_aa

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn

65 70 75 80

Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser

115 120 125

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> linker 15_aa

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 116

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> VL07_aa

<400> 5

Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Pro

20 25 30

Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr

35 40 45

Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val

65 70 75 80

Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu

100 105 110

Thr Val Leu Ser

115

<210> 6

<211> 283

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> hCD8-hCD28-h4-1BB-hCD3

<400> 6

Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

35 40 45

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

50 55 60

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn

65 70 75 80

His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

85 90 95

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

100 105 110

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val

115 120 125

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

130 135 140

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

145 150 155 160

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

165 170 175

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

180 185 190

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

195 200 205

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

210 215 220

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

225 230 235 240

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

245 250 255

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

260 265 270

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

275 280

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> F2A_aa

<400> 7

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> signal peptide_aa

<400> 8

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser

<210> 9

<211> 1665

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Mouse Il-7-F2A-mouseCCL19-F2A-eGFP

<400> 9

atggtccacg tctccttcag atacatcttc ggcatccccc ccctgatcct ggtcctcctg 60

cctgtcacct ccagcgaatg tcatatcaag gacaaagagg gcaaggctta tgagagcgtc 120

ctgatgatct ccattgatga gctggataag atgaccggca ccgacagcaa ctgtcccaac 180

aatgagccca acttctttag aaagcacgtg tgtgacgata ccaaggaggc tgccttcctg 240

aacagggccg ccagaaagct gaagcagttc ctgaagatga acatttccga ggagttcaac 300

gtgcacctcc tcaccgtgag ccagggcacc cagacactgg tcaattgcac ctccaaggag 360

gagaagaacg tgaaagagca gaaaaagaat gatgcttgtt tcctcaagag gctgctgagg 420

gagatcaaga cctgttggaa taagatcctg aaaggcagca tcggcagcgg agtcaagcaa 480

accctgaact tcgacctgct gaaactggcc ggagatgtgg agagcaatcc cggccctatg 540

gcccccagag tcacccctct gctggccttc agcctgctcg tgctgtggac cttccccgct 600

cccaccctgg gcggcgccaa tgatgctgag gactgttgcc tctccgtgac ccagaggccc 660

atccctggaa acatcgtcaa agccttcagg tacctgctca acgaagacgg atgtagggtg 720

cctgccgtgg tgttcacaac actgagaggc taccagctct gcgcccctcc tgatcagccc 780

tgggtcgaca gaatcatcag aaggctgaag aagtccagcg ccaagaacaa aggcaatagc 840

acaaggagaa gccctgtgag cgaattcgga agcggagtga aacagacttt gaattttgac 900

cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc aaccctggac catgcatggt gagcaagggc 960

gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 1020

cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 1080

aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 1140

acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 1200

aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 1260

aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 1320

ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 1380

tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 1440

ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 1500

aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 1560

tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 1620

accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaa 1665

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 10

atggccggac cggccaccgg tcgccaccat gagcgag 37

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 11

tcgaattcgc tagcggccgc ttaattaagc ttgtgcccca g 41

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 12

gctccggacg ccaccatgga agatgccaaa aac 33

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 13

gcgaattcca cggcgatctt gccgcccttc t 31

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 14

atttctccgt gataggtatc gatg 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> primer

<400> 15

aacggtttac gttgaaatgt cc 22

<---

Настоящее изобретение относится к энхансеру T- или B-клеток, имеющих функцию памяти, в организме субъекта, которому его вводят, ингибитору рецидива злокачественной опухоли и индуктору для индуцирования функции памяти у T-клеток или B-клеток в организме. Предложено применение Т-клетки, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую IL-7, и нуклеиновую кислоту, кодирующую CCL19 хемокина, экспрессирует IL-7 и CCL19 и имеет молекулу клеточной поверхности (CAR или TCR), или фармацевтической композиции, состоящей из указанной Т-клетки и фармацевтически приемлемой добавки, в качестве ингибитора рецидива злокачественной опухоли, приписываемого клетке злокачественной опухоли, не имеющей антигена, который специфически распознается указанной молекулой клеточной поверхности. Изобретение позволяет индуцировать функцию памяти в эндогенных Т- или В-клетках для продолжения отторжения злокачественной опухоли в течение длительного периода времени. 2 з.п. ф-лы, 19 ил., 9 пр.

1. Применение Т-клетки, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-7 (IL-7), и нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд 19 (CCL19) хемокина, экспрессирует IL-7 и CCL19 и имеет молекулу клеточной поверхности, выбранную из химерного антигенного рецептора (CAR) или Т-клеточного рецептора (TCR), или фармацевтической композиции, состоящей из указанной Т-клетки и фармацевтически приемлемой добавки, в качестве ингибитора рецидива злокачественной опухоли, приписываемого клетке злокачественной опухоли, не имеющей антигена, который специфически распознается указанной молекулой клеточной поверхности.

2. Применение по п. 1, при этом Т-клетка имеет CAR, а клетка злокачественной опухоли не имеет антигена, который специфически распознается CAR.

3. Применение по п. 1, при этом Т-клетка имеет TCR, а клетка злокачественной опухоли не имеет антигена, который специфически распознается TCR.