СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ПРОФИЛИРОВАНИЯ СТЕРОИДОВ В СЛЮНЕ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2025 года по МПК G01N33/74 G01N30/72 G01N33/487 G01N1/40 

[1] Изобретение относится к аналитической химии, а именно к экспрессному количественному профилированию стероидов в слюне человека методом тандемной жидкостной хроматомасс-спектрометрии с целью изучения влияния физической нагрузки на гормональный статус человека. Заявленный способ включает в себя следующие этапы:

1) приготовление синтетической матрицы;

2) приготовление на основе синтетической матрицы растворов калибраторов и контролей качества;

3) построение градуировочной зависимости;

4) подготовку образцов слюны к анализу;

5) хроматографическое разделение определяемых соединений с последующим масс-спектрометрическим детектированием;

6) установление количественного профиля стероидов в слюне человека.

[2] Известен способ количественного определения андростендиона и 17α-OH-прогестерона в слюне человека радиоиммуным методом (Monique J M de Groot, Karijn J Pijnenburg-Kleizen, Chris M G Thomas, Fred C G J Sweep, Nike M M L Stikkelbroeck, Barto J Otten, Hedi L Claahsen-van der Grinten. Salivary morning androstenedione and 17α-OH progesterone levels in childhood and puberty in patients with classic congenital adrenal hyperplasia. Clin Chem Lab Med . 2015; 53(3): 461-8. doi: 10.1515/cclm-2014-0375.) Подготовка образцов слюны к анализу данным способом включает в себя жидкостно-жидкостную экстракцию аналитов 3 мл диэтилового эфира с последующей очисткой экстрактов методом тонкослойной хроматографии с использованием Ватмана в качестве неподвижной фазы. Для детектирования определяемых соединений авторы используют антитела против 19-карбоксиметилового эфира андростендиона и 21-гемисукцината 11-деоксикортизола, конъюгированных с бычьим сывороточным альбумином. Недостатком вышеописанного способа является низкая селективность, обусловленная перекрестными реакциями антител с родственными целевым соединениям эндогенными стероидами.

[3] Известен способ количественного определения тестостерона и дегидроэпиандростерона в слюне человека методом тандемной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (Yujin Shibayama, Tatsuya Higashi, Kazutake Shimada, Akira Odani, Atsushi Mizokami, Hiroyuki Konaka, Eitetsu Koh, Mikio Namiki. Simultaneous determination of salivary testosterone and dehydroepiandrosterone using LC-MS/MS: Method development and evaluation of applicability for diagnosis and medication for late-onset hypogonadism. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009; 877(25): 2615-23. doi: 10.1016/j.jchromb.2008.10.051). Отсутствие перекрестных реакций и регистрация MRM-переходов позволяют повысить селективность и снизить пределы детектирования. Подготовка образцов к анализу начинается с осаждения белков – для этого к 500 мкл слюны добавляют 1 мл ацетонитрила. Полученную смесь центрифугируют в течение 5 мин при температуре 4°С, затем после разбавления водой экстрагируют определяемые соединения из надосадочной жидкости методом твердофазной экстракции. Детектирование определяемых соединений осуществляется методом тандемной хроматомасс-спектрометрии. Недостатком вышеописанного способа является неудовлетворительная мультиплексность – данным способом детектируются два стероида – тестостерон и дегидроэпиандростерон, а также длительная и дорогостоящая стадия подготовки образцов к анализу.

[4] Известен способ количественного определения кортизола, кортизона, тестостерона, дегидроэпиандростерона, прогестерона в слюне человека методом тандемной жидкостной хроматомасс-спектрометрии с предварительной дериватизацией стероидов (Nirosa Nadarajah, Øyvind Skadberg, Joanne Adaway, Cato Brede. Multiplexed analysis of steroid hormones in saliva by LC-MS/MS with 2-hydrazinopyridine derivatization. Clin Mass Spectrom. 2017; 4–5: 1–10 10.1016/j.clinms.2017.08.001). Подготовка образцов слюны к анализу начинается с осаждения белков. Затем методом жидкостно-жидкостной экстракции с использованием 10%-ного раствора бутанола в метил-терт-бутиловом эфире осуществляется извлечение определяемых соединений из биологического материала. После упаривания досуха органического экстракта выполняется дериватизация стероидных гормонов в присутствии 2-гидразинопиридина. Для детектирования определяемых соединений авторы используют тандемную хроматомасс-спектрометрию. Преимуществом данного способа является мультиплексность, а недостатками – низкая экспрессность, связанная с длительной стадией подготовки образцов к анализу, а также отсутствие механизма контроля полноты протекания реакции карбоксилирования и возможности масштабирования панели определяемых соединений, связанной с наличием кето-группы в структуре стероидов.

[5] Наиболее близким по своей экспрессности является способ определения стероидов в слюне, предложенный Ланфермайером и коллегами (Mirthe Lanfermeijer, Lennart J van Winden, Danielle E J Starreveld, Serry Razab-Sekh, Martijn van Faassen, Eveline M A Bleiker, Huub H van Rossum. An LC-MS/MS-based method for the simultaneous quantification of melatonin, cortisol and cortisone in saliva. Anal Biochem. 2024: 689: 115496. doi: 10.1016/j.ab.2024.115496). В отличие от предыдущего способа определения стероидов в слюне в данном подходе не применяется очистка экстрактов и дериватизация, что приводит к существенному повышению экспрессности. Недостатком данного способа является его невысокая мультиплексность.

[6] Данное изобретение направлено на устранение недостатков, присущих существующим решениям, известным из уровня техники.

[7] В представленном способе слюна рассматривается как альтернативный объект исследования при проведении биохимического контроля, например, спортсменов. С одной стороны, в отличие от процедуры отбора крови сбор слюны осуществляется неинвазивно, что позволяет многократно увеличить количество отбираемых образцов у спортсменов без вмешательства в тренировочный процесс, сводя к минимуму дискомфорт, связанный с венепункцией. С другой стороны, важным аспектом данного подхода является тот факт, что концентрации стероидных гормонов в слюне на порядок ниже по сравнению с их уровнями в крови. Данная физиологическая особенность предъявляет повышенные требования к используемым способам анализа с точки зрения селективности и предела количественного определения. До представленного в заявке способа, для решения этой чрезвычайно сложной аналитической задачи в процедуру подготовки образцов включались дополнительные стадии: дериватизация, концентрирование и очистка экстрактов, приводившие к существенному увеличению продолжительности анализа. Следовательно, задача определения стероидных гормонов, отвечающая таким требованиям спортивной биохимии, как правильность, экспрессность, мультиплексность и неинвазивный характер отбора биоматериала, оставалась нерешенной.

[8] Таким образом техническим результатом, достигаемым при решении вышеописанной проблемы, является повышение точности и скорости количественного профилирования стероидов в слюне человека.

[9] Указанный технический результат реализуется посредством способа количественного профилирования стероидов в слюне человека, состоящего из следующих стадий:

• приготовление синтетической матрицы, имитирующей состав нативного биоматериала, но лишенной определяемых эндогенных стероидных гормонов:

○ исходную матрицу разливают в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл;

○ в пробирки добавляют измельченный активированный уголь из расчета 350 мг угля/15 мл слюны;

○ стероидные гормоны абсорбируют на поверхности активированного угля путем перемешивания смеси на орбитальном шейкере в течение 12 ч при ~200 об/мин;

○ центрифугируют пробирки в течение ~15 мин при скорости вращения ротора центрифуги ~13 000 об/мин;

○ надосадочный слой переносят в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл;

○ для предотвращения размножения микроорганизмов в очищенную матрицу добавляют консервант – азид натрия из расчета 0.1 г консерванта/100 мл жидкости;

○ матрицу проверяют на предмет отсутствия в ней определяемых соединений;

• приготовление растворов калибраторов и контролей качества с использованием синтетической матрицы и построение градуировочной зависимости. Для этого подготавливают 10 стеклянных пробирок и маркируют их следующим образом – BL, Cal1, Cal2, Cal3, Cal4, Cal5, Cal6, QCL, QCH и номер пробы, в пробирку BL добавляют 500 мкл синтетической матрицы, в Cal#, QCL и QCH – 450 мкл синтетической матрицы и 50 мкл раствора соответствующего калибратора или образца контроля качества, а в пробирку с номером пробы – 500 мкл образца слюны человека;

• подготовка образцов слюны к анализу:

○ добавляют 10 мкл смеси внутренних стандартов, содержащей метилтестостерон (250 нг/мл), тестостерон-d3 (250 нг/мл) и кортизон-d8 (250 нг/мл);

○ добавляют 0.5 мл деионизованной воды и 1.8 мл этилацетата;

○ перемешивают смесь на вибрационном шейкере в течение ~10 мин при скорости ~1000 об/мин;

○ центрифугируют смесь в течение ~5 мин при скорости вращения ротора центрифуги ~2 500 об/мин;

○ переносят1 мл органического слоя в 96-луночный микропланшет с объемом лунок 2 мл;

○ упаривают органический экстракт досуха в токе азота (стадия призвана повысить концентрации определяемых стероидов в конечных экстрактах);

○ в каждую лунку микропланшета добавляют 150 мкл смеси метанол:вода (50:50, об.%);

○ содержимое лунок встряхивают в течение ~5 мин при ~2 000 об/мин, повышая эффективность растворения сухого остатка;

○ центрифугируют смесь в течение ~10 мин при скорости вращения ротора центрифуги ~2 000 об/мин (стадия позволяет осадить нерастворившиеся соединения, мешающие хроматомасс-спектрометрическому анализу);

○ верхний слой смеси переносят в 96-луночный микропланшет с объемом лунок 1.1 мл и закрывают силиконовым матом для обеспечения целостности образца, а также его корректной подачи и дозирования соответствующим модулем жидкостного хроматографа;

• хроматографическое разделение определяемых соединений с последующим масс-спектрометрическим детектированием и установлением количественного профиля стероидов в слюне человека.

[10] Признаки и преимущества настоящего технического решения станут очевидными из приводимого ниже подробного описания и прилагаемых чертежей, на которых:

[11] Фиг.1 иллюстрирует масс-хроматограммы исходной матрицы (ДО) и матрицы, подвергшейся очистке активированным углем (ПОСЛЕ), полученные в MRM-режиме.

[12] Фиг.2 иллюстрирует объединенную масс-хроматограмму образца контроля качества с высокими концентрациями определяемых соединений.

[13] Техническая проблема, описанная ранее в [7], решается посредством реализации способа количественного определения стероидных гормонов в слюне человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в режиме регистрации селективных переходов с предварительной жидкостно-жидкостной экстракцией этилацетатом и с использованием синтетической матрицы.

[14] Способ включает в себя процедуру построения градуировочной зависимости. С этой целью был разработан способ приготовления матрицы, имитирующей состав нативного биоматериала, но лишенной определяемых эндогенных стероидных гормонов. Схема протокола приготовления синтетической матрицы представлена ниже:

– неочищенную слюну разливали в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл;

– в пробирки добавляли измельченный активированный уголь из расчета 350 мг угля/15 мл слюны;

– стероидные гормоны абсорбировали на поверхности активированного угля путем перемешивания смеси на орбитальном шейкере в течение 12 ч при ~200 об/мин;

– центрифугировали пробирки в течение ~15 мин при скорости вращения ротора центрифуги ~13 000 об/мин;

– надосадочный слой переносили в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл;

– для предотвращения размножения микроорганизмов в очищенную матрицу добавляли консервант – азид натрия из расчета 0.1 г консерванта/100 мл жидкости;

– очищенную матрицу использовали для дальнейших исследований после подтверждения отсутствия в ней определяемых соединений (на ФИГ.1).

[15] Правильность анализа обеспечивается путем построения градуировочной зависимости с использованием вышеупомянутой синтетической матрицы. До предлагаемого в данной заявке способа в качестве синтетической матрицы ученые использовали труднодоступный и дорогостоящий коммерческий продукт – SMx Oral Fluid (UTAK, CA, США), имитирующий состав слюны человека. Согласно предоставленному производителем сертификату анализа SMx Oral Fluid представляет собой смесь, состоящую из α-амилазы, холестерина, аминокислот, γ-глобулина человека, муцина, хлорида и бикарбоната натрия, хлорида калия, сульфата магния, гидрофосфата натрия, стабилизированную консервантом Proclin 300.

[16] Для построения градуировочной зависимости готовили 10 стеклянных пробирок и подписывали их следующим образом BL, Cal1, Cal2, Cal3, Cal4, Cal5, Cal6, QCL, QCH и номер пробы. В пробирку BL добавляли 500 мкл синтетической матрицы, в Cal#, QCL и QCH – 450 мкл синтетической матрицы и 50 мкл раствора соответствующего калибратора или образца контроля качества, а в пробирку с номером пробы – 500 мкл образца слюны человека. Далее со всеми образцами выполняли следующие стадии:

– добавляли 10 мкл смеси внутренних стандартов, содержащей метилтестостерон (250 нг/мл), тестостерон-d3 (250 нг/мл) и кортизон-d8 (250 нг/мл) (стадия необходима для достижения необходимой правильности количественного определения);

– добавляли 0.5 мл деионизованной воды и 1.8 мл этилацетата (стадия позволяет избежать интерференций, связанных с определением стероидных гормонов, и достичь оптимальной степени их извлечения, включая ДГЭАС);

– перемешивали смесь на вибрационном шейкере в течение ~10 мин при скорости ~1000 об/мин (стадия позволяет повысить эффективность жидкостно-жидкостной экстракции);

– центрифугировали смесь в течение ~5 мин при скорости вращения ротора центрифуги ~2 500 об/мин (стадия предназначена для выделения и исключения из процесса подготовки образцов компонентов, мешающих хроматомасс-спектрометрическому анализу, методом осаждения);

– 1 мл органического слоя переносили в 96-луночный полипропиленовый микропланшет с объемом лунок 2 мл (стадия преследует цель исключить перекрестное загрязнение образцов и сорбцию определяемых соединений на материале путем использования одноразового полипропиленового микропланшета);

– органический экстракт упаривали досуха в токе азота (стадия призвана повысить концентрации определяемых стероидов в конечных экстрактах);

– в каждую лунку микропланшета добавляли 150 мкл смеси метанол : вода (50:50, об.%) (цель стадии – перенести определяемые соединения в раствор, по составу удовлетворяющий стартовым условиям программы хроматографического элюирования);

– содержимое лунок встряхивали в течение ~5 мин при ~2 000 об/мин, повышая эффективность растворения сухого остатка;

– центрифугировали смесь в течение ~10 мин при скорости вращения ротора центрифуги ~2 000 об/мин (стадия позволяет осадить нерастворившиеся соединения, мешающие хроматомасс-спектрометрическому анализу);

– верхний слой смеси переносили в 96-луночный микропланшет с объемом лунок 1.1 мл и закрывали силиконовым матом (для обеспечения целостности образца, а также его корректной подачи и дозирования соответствующим модулем жидкостного хроматографа).

[17] Для эффективного хроматографического разделения определяемых соединений использовали колонку Acquity UPLC BEH C18 с запатентованным сорбентом Bridged Ethyl Hybrid (BEH), представляющим собой гибридные частицы октадецилсиликагеля второго поколения, химически модифицированного этильными мостиками (полиэтоксисилан). Высокая эффективность сорбента BEH с размером частиц 1.7 мкм и пор 130 Å, а также оптимизированная программа градиентного элюирования позволили достичь удовлетворительного по времени и хроматографическим параметрам разделения соединений при использовании колонки в варианте СВЭЖХ с обращенной фазой (табл. 1).

Табл. 1 – Условия СВЭЖХ-анализа стероидных гормонов

Параметр Значение Стероидные гормоны Аналитическая колонка Acquity UPLC^® BEH C18, 100 × 2.1 мм, 1.7 мкм Защитная колонка Acquity UPLC^® BEH C18, 5 × 2.1 мм, 1.7 мкм Подвижная фаза (А) 0.1 % раствор муравьиной кислоты в воде Подвижная фаза (В) 0.1 % раствор муравьиной кислоты в метаноле Скорость потока подвижной фазы 350 мкл/мин Температура термостатирования колонки 60°С Объем инжекции 10 мкл Температура термостатирования автодозатора 15°С Программа градиентного элюирования Время, мин (А), % (В), % 0.00 55 45 4.50 35 65 6.00 5 95 7.00 5 95 7.01 55 45 8.50 55 45

[18] Оптимальная ионизация стероидных гормонов достигается за счет использования муравьиной кислоты в качестве модификатора подвижной фазы. Параметры источника ионизации и масс-спектрометрического детектирования стероидных гормонов и внутренних стандартов представлены в табл. 2 и 3, соответственно.

Табл. 2 – Параметры источника ионов

Параметр Значение Тип ионизации Электрораспылительная с нагреваемым потоком распыляющего газа Режим регистрации ионов MRM Полярность детектируемых ионов Положительные и отрицательные Скорость потока распыляющего газа, л/мин 3 Скорость потока осушающего газа, л/мин 10 Скорость потока нагревающего газа, л/мин 10 Температура интерфейса, °С 300 Температура линии десольватации, °С 250 Температура нагревающего блока, °С 400 Напряжение на интерфейсе, кВ 4

Табл. 3 – Параметры масс-спектрометрического детектирования стероидных гормонов

Целевое соединение Внутренний стандарт Прекурсор-ион, m/z Ион-продукт, m/z Напряжение смещения на Q1, В Энергия соударений, эВ Напряжение смещения на Q3, В Кортизон-d8 1 369.1 169.2 -50 -26 -18 Метилтестостерон 2 303.1 109.2 -12 -29 -12 Тестостерон-d3 3 292.6 109.3 -12 -24 -20 Кортизол-d4 4 367.2 121.3 11 -25 -12 Кортизон 1 361.1 163.1 -14 -24 -18 Кортизол 4 363.1 121.1 -14 -23 -24 Андростендион 2 287.1 97.1 -20 -22 -20 Тестостерон 3 289.1 97.1 -22 -24 -22 ДГЭА 2 271.1 253.2 -20 -13 -28 17α-OH-прогестерон 2 331.1 109.2 -8 -27 -12 Прогестерон 3 315.1 109.2 -12 -25 -24 ДГЭАС 2 367.1 97.0 19 35 33

[19] Уравнения калибровочных кривых, диапазоны линейности, коэффициенты корреляции, величины достоверности аппроксимации, эффект матрицы и степень извлечения способа количественного определения стероидных гормонов в слюне представлены в таблице 4. Точность, воспроизводимость, нижний предел количественного определения и предел обнаружения разработанного способа приведены в таблице 5. Объединенная масс-хроматограмма образца контроля качества с высокими концентрациями стероидов представлена на ФИГ.2.

Табл. 4 – Аналитические характеристики разработанного способа

Соединение Уравнение калибровочной кривой r R^2 Диапазон линейности, пг/мл Концентрация в образцах контроля качества, пг/мл Эффект матрицы, % Степень извлечения, % Кортизон y=0.60x+0.036 0.993 0.997 1 000–28 000 3 000 89.52±4.30 85.74±6.32 8 500 91.36±2.52 84.64±1.21 Кортизол y=0.37x+0.026 0.996 0.995 10–10 000 30 92.32±3.37 85.50±10.43 8 500 90.59±1.55 84.58±2.50 Андростендион y=0.04x+0.044 0.994 0.998 10–250 30 129.33±0.24 76.45±8.07 240 145.93±1.13 75.63±2.26 Тестостерон y=0.03x+0.264 0.996 0.997 5–1 000 15 106.05±3.54 75.85±11.65 850 107.64±2.18 77.72±2.30 ДГЭА y=5.50·10^-5x+0.001 0.995 0.992 50–1 000 150 127.79±5.03 74.47±23.81 850 123.88±3.44 74.89±8.28 Прогестерон y=2.91·10^-4x+0.001 0.997 0.996 5–1 000 15 152.83±4.69 62.31±2.92 850 152.59±1.06 65.65±3.44 ДГЭАС y=4.64·10^-3x+0.002 0.992 0.995 500–10 000 1 500 90.17±4.10 75.79±28.54 8 500 92.03±1.23 75.06±7.80 17α-ОН-прогестерон y=0.03x+0.135 0.996 0.997 10–150 30 94.84±1.59 66.59±0.92 145 99.80±1.94 66.52±2.43

Табл. 5 – Результаты валидации разработанного способа

Соединение Концентрация в образцах контроля качества, пг/мл Точность, % Воспроизводимость, % НПКО, пг/мл ПО, пг/мл внутри одной серии (n=6) между сериями (n=18) внутри одной серии (n=6) между сериями (n=18) Кортизон 3 000 5.72 6.56 5.13 6.36 500 100 8 500 3.96 4.83 4.48 4.62 Кортизол 30 6.15 7.34 6.89 7.40 5 0.5 8 500 5.88 6.95 6.26 6.96 Андростендион 30 4.76 5.48 6.31 6.92 5 1 240 4.29 5.33 5.08 5.37 Тестостерон 15 6.91 7.54 7.99 8.37 1 1 850 6.23 6.82 4.36 4.84 ДГЭА 150 5.67 6.78 7.54 8.20 5 0.5 850 5.33 6.09 4.73 5.44 Прогестерон 15 6.68 7.82 6.34 6.83 1 1 850 5.42 6.34 4.72 5.85 ДГЭАС 1 500 4.83 5.14 6.62 7.12 50 5 8 500 4.46 3.52 5.49 6.77 17α-ОН-прогестерон 30 6.53 7.79 7.56 8.82 5 1 145 5.82 6.38 5.51 6.46

[20] Представленные материалы заявки раскрывают предпочтительные примеры реализации технического решения и не должны трактоваться как ограничивающие иные, частные примеры его воплощения, не выходящие за пределы испрашиваемой правовой охраны, которые являются очевидными для специалистов соответствующей области техники.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинико-лабораторной диагностике, и может быть использовано для количественного определения стероидов в слюне человека, включающий следующие этапы: 1) приготовление синтетической матрицы, имитирующей состав нативного биоматериала, но лишенной определяемых эндогенных стероидных гормонов: а) исходную матрицу разливают в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл; б) в пробирки добавляют измельченный активированный уголь из расчета 350 мг угля/15 мл слюны; в) стероидные гормоны абсорбируют на поверхности активированного угля путем перемешивания смеси на орбитальном шейкере в течение 12 ч при 200 об/мин; г) центрифугируют пробирки в течение 15 мин при 13000 об/мин; д) надосадочный слой переносят в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл; е) для предотвращения размножения микроорганизмов в очищенную матрицу добавляют консервант - азид натрия из расчета 0,1 г консерванта/100 мл жидкости; ж) очищенную матрицу проверяют на предмет отсутствия в ней определяемых соединений; 2) приготовление растворов калибраторов: Cal1, Cal2, Cal3, Cal4, Cal5, Cal6 и контролей качества: QCL, QCH и построение градуировочной зависимости с использованием синтетической матрицы, для этого подготавливают 10 стеклянных пробирок и маркируют их следующим образом - BL, Cal1, Cal2, Cal3, Cal4, Cal5, Cal6, QCL, QCH и номер пробы, в пробирку BL добавляют 500 мкл синтетической матрицы, в Cal1-6, QCL и QCH - 450 мкл синтетической матрицы и 50 мкл раствора соответствующего калибратора или образца контроля качества, а в пробирку с номером пробы - 500 мкл образца слюны человека; 3) подготовку образцов слюны: а) добавляют 10 мкл смеси внутренних стандартов, содержащей метилтестостерон - 250 нг/мл, тестостерон-d3 - 250 нг/мл и кортизон-d8 - 250 нг/мл; б) добавляют 0,5 мл деионизованной воды и 1,8 мл этилацетата; в) перемешивают смесь на вибрационном шейкере в течение 10 мин при скорости 1000 об/мин; г) центрифугируют смесь в течение 5 мин при скорости вращения ротора центрифуги 2500 об/мин; д) 1 мл органического слоя переносят в 96-луночный микропланшет с объемом лунок 2 мл; е) упаривают органический экстракт досуха в токе азота; ж) в каждую лунку микропланшета добавляют 150 мкл смеси метанол:вода 50:50 объемных %; з) содержимое лунок встряхивают в течение 5 мин при 2000 об/мин, повышая эффективность растворения сухого остатка; и) центрифугируют смесь в течение 10 мин при скорости вращения ротора центрифуги 2000 об/мин; к) верхний слой смеси переносят в 96-луночный микропланшет с объемом лунок 1,1 мл и закрывают силиконовым матом для обеспечения целостности образца, а также его корректной подачи и дозирования соответствующим модулем жидкостного хроматографа; 4) хроматографическое разделение определяемых соединений в соответствии с таблицами 1, 2 описания с последующим масс-спектрометрическим детектированием в соответствии с таблицей 3 описания и количественным определением стероидов в слюне человека. Способ обеспечивает возможность повышения точности и скорости количественного определения стероидов в слюне человека за счет количественного определения стероидных гормонов в слюне человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в режиме регистрации селективных переходов с предварительной жидкостно-жидкостной экстракцией этилацетатом и с использованием синтетической матрицы. 2 ил., 5 табл.

Способ количественного определения стероидов в слюне человека, включающий следующие этапы:

1) приготовление синтетической матрицы, имитирующей состав нативного биоматериала, но лишенной определяемых эндогенных стероидных гормонов:

а) исходную матрицу разливают в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл;

б) в пробирки добавляют измельченный активированный уголь из расчета 350 мг угля/15 мл слюны;

в) стероидные гормоны абсорбируют на поверхности активированного угля путем перемешивания смеси на орбитальном шейкере в течение 12 ч при 200 об/мин;

г) центрифугируют пробирки в течение 15 мин при 13000 об/мин;

д) надосадочный слой переносят в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл;

е) для предотвращения размножения микроорганизмов в очищенную матрицу добавляют консервант - азид натрия из расчета 0,1 г консерванта/100 мл жидкости;

ж) очищенную матрицу проверяют на предмет отсутствия в ней определяемых соединений;

2) приготовление растворов калибраторов: Cal1, Cal2, Cal3, Cal4, Cal5, Cal6 и контролей качества: QCL, QCH и построение градуировочной зависимости с использованием синтетической матрицы, для этого подготавливают 10 стеклянных пробирок и маркируют их следующим образом - BL, Cal1, Cal2, Cal3, Cal4, Cal5, Cal6, QCL, QCH и номер пробы, в пробирку BL добавляют 500 мкл синтетической матрицы, в Cal1-6, QCL и QCH - 450 мкл синтетической матрицы и 50 мкл раствора соответствующего калибратора или образца контроля качества, а в пробирку с номером пробы - 500 мкл образца слюны человека;

3) подготовку образцов слюны:

а) добавляют 10 мкл смеси внутренних стандартов, содержащей метилтестостерон - 250 нг/мл, тестостерон-d3 - 250 нг/мл и кортизон-d8 - 250 нг/мл;

б) добавляют 0,5 мл деионизованной воды и 1,8 мл этилацетата;

в) перемешивают смесь на вибрационном шейкере в течение 10 мин при скорости 1000 об/мин;

г) центрифугируют смесь в течение 5 мин при скорости вращения ротора центрифуги 2500 об/мин;

д) 1 мл органического слоя переносят в 96-луночный микропланшет с объемом лунок 2 мл;

е) упаривают органический экстракт досуха в токе азота;

ж) в каждую лунку микропланшета добавляют 150 мкл смеси метанол : вода 50:50 объемных %;

з) содержимое лунок встряхивают в течение 5 мин при 2000 об/мин, повышая эффективность растворения сухого остатка;

и) центрифугируют смесь в течение 10 мин при скорости вращения ротора центрифуги 2000 об/мин;

к) верхний слой смеси переносят в 96-луночный микропланшет с объемом лунок 1,1 мл и закрывают силиконовым матом для обеспечения целостности образца, а также его корректной подачи и дозирования соответствующим модулем жидкостного хроматографа;

4) хроматографическое разделение определяемых соединений в соответствии с таблицами 1, 2 описания с последующим масс-спектрометрическим детектированием в соответствии с таблицей 3 описания и количественным определением стероидов в слюне человека.