МЕТАБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ С СОРБИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 A61K35/741 A61K35/747 A61K47/02 A61P1/00 

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к способу получения композиций на основе метаболитов пробиотических микроорганизмов, иммобилизованных на минеральном сорбенте, для лечения и профилактики заболеваний, ассоциированных с нарушением количественного и качественного состава микрофлоры кишечника, а также с интоксикацией организма. Настоящее изобретение может быть использовано в пищевой промышленности, ветеринарии и медицине.

Уровень техники

[0002] Нарушения качественного и/или количественного состава микрофлоры кишечника связаны с развитием различных заболеваний, таких как острые инфекционные заболевания или хронические болезни, например, болезнь Крона или острый язвенный колит. Микрофлора кишечника обеспечивает колонизационную резистентность, формирование иммунного ответа, переваривание пищи, регуляцию моторной функции кишечника, дезинтоксикацию. Отсутствие колонизационной резистентности приводит к значительному ослаблению противоинфекционной защиты организма, увеличению численности и спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а, следовательно, к повышению вероятности возникновения инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы (Бондаренко с соавт, 2003; Петровская, 1982; Бухарин, 1999), развитию эндогенных инфекций и суперинфекций различных локализаций (Ленцнер, 1987; Юшков, 2002; Минушкин с соавт., 1999).

[0003] Нарушение микрофлоры кишечника может быть вызвано такими факторами, как стресс, физические и психоэмоциональные нагрузки, курение, несбалансированное питание, а также прием антибиотиков (Shah et al., 2021). Лечение дисбактериоза в подобных случаях связано с применением различных иммунобиологических препаратов.

[0004] Наиболее популярными иммунобиологическими препаратами, используемыми для лечения и профилактики дисбактериоза, являются пробиотические композиции, включающие живые пробиотические микроорганизмы, или пробиотики. Несколько видов бактерий Lactobacillus, Lactococcus, Bacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus и Propionibacterium являются хорошо известными пробиотиками. Дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, S. carisbergensis и S. boulardii, и грибы, такие как Aspergillus niger и A. oryzae, также рассматриваются в качестве пробиотиков (K.S. Yoha et al., 2022). Пробиотические микроорганизмы проявляют антагонистическую активность в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Они способны синтезировать вещества, обладающие противомикробными свойствами, конкурировать с патогенными микроорганизмами за питательные вещества и участки микробной адгезии, модифицировать токсины или рецепторы токсинов (Воробейчиков с соавт., 2005).

[0005] В настоящее время для лечения и профилактики дисбактериоза популярны препараты «Линекс» (фирма «Лек», Словения) и «Бифиформ» («Ферросан Интернейшнл А/С», Дания). «Линекс» включает живые лактобактерии Lactobacillus acidophilus, бифидобактерии Bifidobacterium infantis и энтерококки Enterococcus faecium. «Бифиформ» включает бифидобактерии Bifidobacterium longum (штамм АТСС 15707) и энтерококки Enterococcus faecium (штамм SF68). В составы указанных препаратов включены штаммы бактерий с достаточно высоким уровнем антибиотикорезистентности и зачастую рекомендуют их применение одновременно с антибиотиками. Однако опыт использования указанных препаратов в клинической практике с широким спектром антибиотиков при рекомендуемых схемах их назначения показал, что большая часть бактерий при таком сочетанном назначении гибнет, а активность попавших в кишечник в жизнеспособном состоянии чрезвычайно низка. Кроме того, препараты, включающие молочнокислые бактерии, отличаются отсутствием стабильности при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности лечебно-профилактических процедур.

[0006] Более стабильными при хранении являются пробиотики, включающие спорообразующие бактерии. Популярными для создания пробиотиков являются спорообразующие пробиотические штаммы Bacillus subtilis (B. subtilis). Например, известна пищевая добавка, включающая пробиотический штамм B. subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-67989 (DE111) (US20210315808A1, опубл. 14.10.2021 МПК: A61K9/00, A61K35/742, A61P1/14). Однако данная композиция включает живые микроорганизмы, а значит, при сочетании с антибиотиками она может терять эффективность.

[0007] Одним из перспективных направлений лечения и профилактики дисбактериоза, особенно вызванного антибиотиками, является применение метабиотиков – препаратов, которые содержат не живые пробиотические микроорганизмы, а их метаболиты (Шендеров, 2019). Например, известна композиция, включающая стерилизованные высушенные культуральные жидкости, содержащие метаболиты пробиотических штаммов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335, Enterococcus faecium L-3, Lactobacillus delbrueckii TS1-06, бактерий Lactobacillus fermentum TS3-06 (RU2589818C1, опубл. 10.07.2016; МПК: A61K35/02; A61K35/74; A61K36/899; A61K47/48; A61K9/48). Указанная композиция нормализует микрофлору кишечника за счет создания благотворных условий для размножения бифидо- и лактобактерий, а также подавления роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

[0008] Также известна композиция, включающая культуральную жидкость и инактивированные клетки Lactobacillus paracasei штамма B111H (CN113322216A, опубл. 23.08.2021; МПК: A23L33/135; A61K35/747; A61P1/16; A61P3/04; A61P3/06; A61P37/02; A61P7/00; C12N1/20; C12R1/225). Данная композиция обладает эффектом снижения уровня липидов в крови, способностью ингибировать накопление липидов в клетках печени, препятствует ожирению, вызванному диетой с высоким содержанием жиров. Однако помимо полезных метаболитов пробиотических микроорганизмов культуральные жидкости, входящие в состав указанных метабиотических композиций, могут включать вещества, вредные или, как минимум, бесполезные для симбиотической микрофлоры. Это может снижать эффективность метабиотических препаратов на основе культуральных жидкостей.

[0009] Кроме пробиотиков, для профилактики и лечения различных патологических состояний кишечника используют энтеросорбенты. Энтеросорбенты представляют собой сорбенты с высокоселективной сорбционной способностью, нетоксичные для животных, в том числе, человека, соответственно, пригодные для перорального приема. Механизм терапевтического действия энтеросорбентов связан с такими явлениями, как адсорбция экзотоксинов, адсорбция ядов, отделяющихся с выделениями слизистых оболочек ЖКТ, печени, поджелудочной железы, адсорбция и гиролиз продуктов эндогенной секреции, адсорбция патогенных бактерий и вирусов; связывание газов, раздражающих зоны желудочно-кишечного тракта, а также предотвращение или ослабление токсико-аллергических реакций, снижение метаболической нагрузки на органы выделения и детоксикации, коррекция обменных процессов; восстановление целостности и проницаемости слизистых оболочек, улучшение кровоснабжения; стимуляция перистальтики кишечника. Поэтому энтеросорбенты широко используются в гастроэнтерологии, токсикологии, лечении инфекционных заболеваниях, аллергологии, дерматологии, хирургии, онкологии, наркологии, гепатологии и нефрологии.

[0010] Применение энтеросорбентов снижает метаболическую нагрузку на органы выделения и детоксикации (печень, почки и др.), способствует нормализации моторной, эвакуаторной и пищеварительной функций ЖКТ, способствует восстановлению целостности и проницаемости слизистой оболочки кишечника, кровообращения. Энтеросорбенты успешно используются не только в качестве патогенетической, но и этиотропной моно- и комбинированной терапии кишечных инфекций. Это особенно важно в связи с ростом мультирезистентности микроорганизмов к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам.

[0011] Применяя дезинтоксикационную терапию к пациентам с различными патологиями пищеварительной системы, вызванными действием тяжелых металлов и хлорорганических пестицидов, были проведены тесты для оценки эффективности использования энтеросорбентов для снижения уровня этих токсинов. После курса лечения у пациентов наблюдается эффективное снижение уровня таких токсичных тяжелых металлов, как свинец и кадмий, а также хлорорганических пестицидов.

[0012] Детоксикационные свойства энтеросорбентов могут усиливаться при совместном использовании с метаболитами пробиотических микроорганизмов. При этом ферментативная активность метаболитов может повышаться за счет их иммобилизации на сорбенте, что в конечном итоге увеличивает эффективность применения метаболитов.

[0013] Известна комбинация клеточных стенок дрожжей с метаболитами спорообразующих микроорганизмов, иммобилизованных на природных энтеросорбентах типа глауконита (RU 2475254 C1, опубл. 20.03.2013; МПК: A61K 35/74, A61P 1/00). Указанная комбинация значительно расширяет спектр сорбционных свойств сорбента с пребиотическим компонентом, представляющим собой смесь метаболитов бактерий рода Bacillus и бактерий рода Halobacterium, а также фрагменты оболочек дрожжей рода Saccharomyces, и способов применения данной композиции, в том числе в комбинации с антибиотиками. Воздействие на организм оказывают как цельные оболочки дрожжевых клеток, так и составляющие их компоненты: сами полисахариды и их конъюгаты с белком. Однако из-за содержания в составе композиции фрагментов клеточных стенок дрожжей, которые обладают сильными иммуногенными свойствами, у пациента может развиться аллергическая реакция.

[0014] Известен препарат «Бактистатин», включающий стерилизованную культуральную жидкость, содержащую метаболиты Bacillus subtilis (RU 2287335 C1, опубл. 20.11.2006; МПК: A61K35/74; A61P1/00), сорбент - цеолит и дополнительные активные вещества. Указанный препарат нормализует количественный и качественный состав микрофлоры кишечника за счет селективного стимулирования роста и размножения бифидо- и лактобактерий, детоксикационных свойств сорбента, а также специфической антагонистической активности в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Однако помимо полезных метаболитов Bacillus subtilis цельная культуральная жидкость также может включать вещества, вредные или, как минимум, бесполезные для симбиотической микрофлоры, что снижает эффективность метабиотического препарата на основе цельной культуральной жидкости.

[0015] Таким образом, существует необходимость разработки эффективных средств для лечения и/или профилактики заболеваний ЖКТ, ассоциированных с нарушением количественного и качественного состава микрофлоры кишечника, не теряющих эффективность при одновременном приеме с антибиотиками и обладающих детоксикационной активностью.

Термины и сокращения

[0016] Биомасса – совокупность клеточных составляющих фильтрата; содержит, в том числе, споры.

[0017] Дисбактериоз – это качественное и/или количественное изменение бактериальной микрофлоры в организме, перемещение различных ее представителей в несвойственные им места обитания, сопровождающееся метаболическими и иммунными нарушениями. Причем указанные нарушения не исчезают после устранения неблагоприятного фактора, вызвавшего дисбактериоз. Чаще всего под дисбактериозом подразумевают нарушение микрофлоры кишечника (Хурса с соавт., 2017; Жучкова, 2015).

[0018] Культуральная жидкость – жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих клеток (Тарантула, 2005).

[0019] Культуральная суспензия – жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая культивируемые клетки и/или споры.

[0020] Метабиотики – вещества, являющиеся структурными компонентами пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов, которые способны оптимизировать физиологические функции, метаболические, эпигенетические, информационные, регуляторные, транспортные, иммунные, нейрогормональные, и/или поведенческие реакции, связанные с деятельностью симбиотической (индигенной) микрофлоры организма-хозяина (Шендеров с соавт., 2018).

[0021] Микрофлора (микробиота) – совокупность различных видов микроорганизмов, населяющих определенную среду обитания. Постоянно живущие в симбиозе с хозяином микроорганизмы называются нормальной, или симбиотической, микрофлорой (Фирсов, 2006 г.). В данном тексте термин «микрофлора» относится к микрофлоре кишечника.

[0022] Пермеат – фаза, прошедшая через мембрану в процессе мембранного разделения, основанного на преимущественной проницаемости одного или нескольких компонентов жидкой либо газовой смеси, а также коллоидной системы, через разделительную перегородку-мембрану. При этом задержанная фаза называется концентратом (Химическая энциклопедия, 1988).

[0023] Пребиотики – физиологически функциональные пищевые ингредиенты, обеспечивающие благоприятное воздействие на организм человека в результате избирательной стимуляции роста и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника (ГОСТ Р 52349-2005, Gibson et al., 2017).

[0024] Пробиотики – функциональный пищевой ингредиент в виде полезных для человека непатогенных и нетоксикогенных живых микроорганизмов, обеспечивающий при систематическом употреблении в пищу в виде препаратов или в составе пищевых продуктов благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника (ГОСТ Р 52349-2005).

[0025] Тангенциальная ультрафильтрация – ультрафильтрация, в процессе которой фильтруемая жидкость движется параллельно мембране.

[0026] Ультрафильтрация – процесс мембранного разделения, а также фракционирования и концентрирования веществ, осуществляемый путем фильтрования жидкости под действием разности давлений до и после мембраны. При этом размер выделяемых частиц (т.е. частицы какого размера не проходят через фильтр, а остаются в концентрате) составляет приблизительно 0,001-0,05 мкм (5-500 кДа).

[0027] Энтеросорбенты – лекарственные средства различной структуры, осуществляющие связывание экзо- и эндогенных веществ в ЖКТ путём адсорбции.

[0028] ЖКТ – желудочно-кишечный тракт.

[0029] кДа – килодальтон.

[0030] B. subtilis – Bacillus subtilis.

[0031] E. сoli – Escherichia coli.

[0032] L. reuteri – Lactobacillus reuteri.

[0034] CD64 – мембранный белок Fc-гамма-рецептор 1, моноцитарный маркер, также провоспалительный маркер макрофагов.

[0035] IL1b – интерлейкин 1 бета, провоспалительный цитокин.

[0036] IL6 – интерлейкин 6, про- и противовоспалительный цитокин, фактор регенерации, фактор активации макрофагов, фактор стимуляции лимфоцитов.

[0037] IL10 – интерлейкин 10, противовоспалительный цитокин.

[0038] MRSA – метициллин-резистентные штаммы S. aureus.

[0039] RI – индекс удерживания.

[0040] RT – время удерживания.

[0041] TNFa – фактор некроза опухолей альфа, фактор активации макрофагов.

[0042] TGFb – трансформирующий фактор роста бета, блокирует активацию макрофагов, подавляет воспалительный иммунный ответ.

Сущность изобретения

[0043] Задачей настоящего изобретения является получение средства для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с дисбактериозом кишечника и/или интоксикацией организма.

[0044] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата, как создание композиции, модулирующей микрофлору кишечника, обладающей детоксикационной активностью и иммуномодулирующим потенциалом, не теряющей эффективность при одновременном приеме с антибиотиками. Также важной частью технического результата является разработка доступного способа получения заявленной композиции.

[0045] Заявленный технический результат достигается за счет того, что заявленная композиция включает комплекс метаболитов, по меньшей мере, одного пробиотического штамма бактерий B. subtilis или бактерий семейства Lactobacillaceae, а также сорбент. При этом соотношение компонентов в мас. %:

- комплекс метаболитов бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae – 0,1-7,0;

- сорбент – 93,0-99,9.

[0046] Комплекс метаболитов включает в себя все вещества, полученные из культуральной жидкости одного или нескольких пробиотических штаммов бактерий B. subtilis и/или одного или нескольких пробиотических штаммов семейства Lactobacillaceae.

[0047] В одном варианте реализации комплекс метаболитов дополнительно включает в себя инактивированные вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis. В другом варианте реализации комплекс метаболитов дополнительно включает в себя инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae. В еще одном варианте реализации комплекс метаболитов дополнительно включает в себя инактивированные вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis и инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae. В предпочтительном варианте реализации инактивированные вегетативные клетки и споры пробиотического штамма B. subtilis и инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae являются высушенными. Это позволяет создавать композицию в сухом виде, что облегчает ее хранение и транспортировку.

[0048] Метаболиты B. subtilis способны селективно подавлять рост широкого ряда патогенных и условно патогенных микроорганизмов, обладают иммуномодулирующим потенциалом, а метаболиты бактерий семейства Lactobacillaceae создают условия естественной среды нормальной микрофлоры кишечника.

[0049] При этом в заявленной композиции достаточно присутствия метаболитов хотя бы одного из указанных пробиотических микроорганизмов, так как метабиотические компоненты, необходимые для эффективности композиции, оказывают, в целом, сходное действие на микрофлору кишечника. Сочетание метабиотиков нескольких штаммов позволит расширить действие композиции в зависимости от целей конкретного препарата, за основу которого и будет взята описываемая композиция.

[0050] В качестве пробиотических штаммов B. subtilis могут быть использованы штаммы B. subtilis ВКПМ №В-2335 (3), B. subtilis 534, B. subtilis ТПИ 13 - 07.06.21 - ДЕП/ВГНКИ, B. subtilis ВКПМ №В4759 (3), B. subtilis р ВМВ105, B. subtilis ТПИ 9; B. subtilis рВМВ 105. В предпочтительном варианте реализации пробиотический штамм B. subtilis представляет собой B. subtilis ВКМ В-3536D или ВКПМ №В-2335 (3). В качестве пробиотических штаммов бактерий семейства Lactobacillaceae могут быть использованы штаммы L. reuteri DSM-17648 или ATCC-55730, SALR01, GMNL-0902, а также штамм L. plantarum - ВКПМ В-11342 или SALP01.

[0051] Сорбент представляет собой один или несколько силикатных и/или алюмосиликатных минералов, которые могут способствовать сохранению целостности композиции, сохранению биологической активности указанных метаболитов и/или могут усиливать полезное действие композиции за счет собственных сорбционных свойств. Используемый в данной композиции сорбент выступает в роли энтеросорбента – вещества, способного связывать в желудочно-кишечном тракте экзогенные и эндогенные соединения, а также надмолекулярные структуры и клетки, тем самым обеспечивающего детоксикационную активность композиции. В предпочтительном варианте реализации в качестве сорбента используются силикатные или алюмосиликатные сорбенты, такие как смектит, бентонит, цеолит или их смесь.

[0052] В предпочтительном варианте реализации описанный комплекс метаболитов иммобилизован на сорбенте. Это обеспечивает постепенное высвобождение метаболитов поверхности сорбента, что позволяет поддерживать активность композиции в ЖКТ в течение продолжительного времени.

[0053] Благодаря отсутствию живых микроорганизмов, заявленная композиция не теряет эффективности при сочетанном приеме с антибиотиками, что позволяет использовать ее для лечения и профилактики дисбактериоза для широкого круга пациентов. Благодаря присутствию указанных метаболитов пробиотических микроорганизмов заявленная композиция нормализует количественный и качественный состав микрофлоры в кишечнике, селективно ингибируя рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и создавая условия для роста симбиотической микрофлоры кишечника. Кроме того, заявленная композиция обладает детоксикационными свойствами за счет присутствия сорбента.

[0054] Технический результат также достигается за счет разработки доступного способа получения композиции на основе метаболитов, по меньшей мере, одного пробиотического штамма бактерий B. subtilis или бактерий семейства Lactobacillaceae. Способ включает следующие этапы:

а) выращивание бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae в жидкой питательной среде, имеющей исходный рН 7,0±0,2. В предпочтительном варианте реализации проводят глубинное выращивание в ферментере с коэффициентом заполнения 60-70% при температуре 30-40°С при постоянном перемешивании. При этом выращивание бактерий рода Bacillus проводят при аэрировании и заканчивают, когда рН культуральной суспензии достигает 8,5-8,9. Такой рН соответствует максимальной концентрации метаболитов бактерий B. subtilis. Завершением процесса культивирования бактерий семейства Lactobacillaceae считают отсутствие падения pH от заданного. рН стабилен в оптимальных условиях культивирования бактерий семейства Lactobacillaceae, в случае выхода бактерий из экспоненциальной фазы роста, показатель кислотности уменьшается. Указанный способ выращивания позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения метаболитов бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae;

б) центрифугируют культуральную суспензию на проточной центрифуге с получением культуральной жидкости и осадка, включающего вегетативные клетки и споры B. subtilis и/или клетки бактерий семейства Lactobacillaceae или проводят ультрафильтрацию для отделения культуральной жидкости от клеточного осадка;

в) затем проводят ультрафильтрацию полученной культуральной жидкости с определенным порогом отсечения, для концентрирования метаболитов, а также если требуется фракция метаболитов определенного моелкулярного веса, с получением пермеата;

г) высушивают полученные метаболиты на сорбенте до содержания метаболитов в конечной композиции в диапазоне 0,1-7,0% по массе.

В предпочтительном варианте реализации метаболиты высушивают на сорбенте путем лиофилизации.

[0055] В некоторых вариантах реализации заявленный способ дополнительно включает смешивание метаболитов с инактивированными вегетативными клетками и спорами бактерий B. subtilis и/или инактивированными клетками бактерий семейства Lactobacillaceae. В этом случае способ включает несколько дополнительных этапов:

д) инактивируют вегетативные клетки и споры бактерий B. subtilis и/или клетки бактерий Lactobacillaceae путем нагревания осадка, полученного на этапе б). При этом клетки и споры бактерий B. subtilis инактивируют при температуре 60-140°С в течение 5-120 минут; клетки пробиотического штамма бактерий семейства Lactobacillaceae инактивируют при 60-120°С в течение 20-40 минут;

В некоторых вариантах реализации заявленный способ дополнительно включает смешивание метаболитов с инактивированными вегетативными клетками и спорами бактерий B. subtilis и/или инактивированными клетками бактерий семейства Lactobacillaceae. В этом случае способ включает несколько дополнительных этапов:

е) смешивают метаболиты и инактивированные вегетативные клетки и споры бактерий B. subtilis и/или инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae. Способ может дополнительно включать высушивание инактивированных вегетативных клеток и спор бактерий B. subtilis и/или инактивированных клеток бактерий семейства Lactobacillaceae. В предпочтительном варианте реализации инактивированные клетки высушивают методом лиофилизации на сорбенте. Для этого используют тот же сорбент, что и при высушивании метаболитов. При этом сорбент может представлять собой смектит, бентонит, цеолит или их смесь. В одном варианте реализации инактивированные вегетативные клетки и споры бактерий B. subtilis и/или инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae высушивают отдельно от метаболитов с молекулярным весом 5-300 кДа. В предпочтительном варианте реализации вегетативные клетки и споры бактерий B. subtilis и/или инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae сначала смешивают с метаболитами, полученными после концентрирования ультрафильтрацией на этапе в), а потом совместно высушивают полученные метаболиты на сорбенте досодержания метаболитов в конечной композиции в диапазоне 0,1-7,0% по массе.

[0056] Заявленный способ обеспечивает получение композиции, включающей широкий спектр метаболитов бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae, а также сорбент. Заявленный способ обеспечивает получение метаболитов в количествах, необходимых для производства заявленной композиции в промышленных масштабах.

[0057] В предпочтительном варианте реализации для получения композиции все компоненты используют в сухом виде. Это увеличивает срок хранения композиции без потери ее эффективности. Это связано с сохранением активности метаболитов и с минимизацией риска загрязнения композиции какими-либо нежелательными живыми микроорганизмами.

Описание чертежей

[0058] На Фиг. 1 представлены результаты исследования иммуномодулирующих свойств комплекса метаболитов B. subtilis.

Подробное описание изобретения

[0059] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.

[0060] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.

[0061] Заявленная композиция нормализует количественный и качественный состав микрофлоры в кишечнике, селективно ингибируя рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, обладает детоксикационными свойствами за счет действия сорбента и создает условия для роста симбиотической микрофлоры.

[0062] Заявленная композиция включает комплекс метаболитов пробиотических штаммов бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae, а также сорбент. При этом соотношение компонентов в мас. %:

- комплекс метаболитов бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae – 0,1-7,0;

- сорбент – 93,0-99,9.

[0063] Комплекс метаболитов включает метаболиты, полученные из культуральной жидкости, по меньшей мере, одного пробиотического штамма бактерий B. subtilis или бактерий семейства Lactobacillaceae. Указанные пробиотические микроорганизмы вырабатывают различные ферменты и коферменты, полипептиды, пребиотические компоненты, способствующие росту симбиотической микрофлоры, влияющие на обменные процессы и оказывающие иммуномодулирующее действие (Пример 6).

[0064] Метаболиты B. subtilis и бактерий семейства Lactobacillaceae включают разнообразные биологически активные вещества, которые обладают противомикробным, пробиотическим, иммунномодулирующим действием.

[0065] Например, амикумацины, вырабатываемые B. subtilis, активны в отношении устойчивых к антибиотикам штаммов возбудителя S. aureus (MRSA – метициллин-резистентные штаммы S. aureus), поэтому представляет особый интерес для борьбы с растущей устойчивостью штаммов возбудителя к антибиотикам. Амикумацин A активен против грамположительных бактерий Salmonella sp. и Shigella sp. (Maksimova et al., 2021; Kaspar et al., 2019; Park et al., 2016; Prokhorova et al., 2016; Tosco et al., 2015; Hamdache et al., 2011).

[0066] Также метаболиты B. subtilis включают циклические дипептиды (2,5-дикетопиперазины), которые проявляют противоопухолевую, нейропротекторную и антигипергликемическую активность. Кроме того, циклические дипептиды проявляют противирусную, противогрибковую и антибактериальную активность. В частности, цикло(лейцилпролил) (L-Phe-D-Pro лактам) и цикло(D-фенилаланин-L-пролил) показывают антагонистическую активность в отношении S. аureus, E. coli, P. aeruginosa и C. аlbicans. При этом P. аeruginosa – один из самых распространенных возбудителей внутрибольничных инфекций, приобретающий устойчивость к обычно используемым антибиотикам., а C. аlbicans – частая причина возникновения грибковых инфекций (Zhao et al., 2020).

[0067] Молочная кислота также относится к метаболитам B. subtilis и обладает противовоспалительным эффектом за счет стимуляции противовоспалительного цитокина IL-10 и подавления активности провоспалительного цитокина IL-12. Также молочная кислота и ее производные (например, 3-фенилмолочная кислота, 4-гидроксифенилмолочная кислота) обладают антибактериальным и противогрибковым эффектом. Например, 3-фенилмолочная кислота (самостоятельно или в сочетании с молочной кислотой) проявляет подавляет рост таких патогенов, как L. monocyotgenes, E. coli, S. typhimurium, B. cereus, E. faecalis (Ning et al., 2021; Liu et al., 2020; Zheng et al., 2019; Wang et al., 2018; Ning et al., 2017; Sun et al., 2017; Narayana et al., 2007).

[0068] а-Гидроксиизокапроновая кислота обладает широким антибактериальным действием, включая такие бактерии, как MRSA (метициллин-резистентные штаммы S. aureus), устойчивые к множеству системно применяемых противомикробных препаратов (Sakko et al., 2012).

[0069] Индол представляет собой гетероциклическое конденсированное ароматическое соединение, образующееся в результате разложения аминокислоты триптофана. Индол обладает пробиотическими свойствами и поддерживает нормальный количественный и качественный состав микробиоты кишечника. Также индол поддерживает функцию эпителиального барьера и способствует иммунной толерантности для поддержания микробного комменсализма при защите от патогенных инфекций. Кроме того, индол обладает антикарциногенным, антиоксидантным и противовоспалительным действием. Последнее, вероятно, за счет стимуляции выработки цитокина IL-22 иммунными клетками кишечника (Guimarães et al., 2018; Zhang and Davies, 2016).

[0070] Длинноцепочечные мононенасыщенные жирные кислоты (т.н. Омега-9 жирные кислоты), например, миристолеиновая (C14:1), пальмитолеиновая (C16:1), олеиновая (C18:1) и элаидиновая (C18:1) кислоты увеличивают разнообразие кишечной микробиоты (Machate et al., 2020).

[0071] Некоторые насыщенные жирные кислоты с длинной цепью (ДЦЖК, LCFAs) обладают противомикробным и противовоспалительным действием. Например, пальмитиновая кислота обладает антогонистической активностью в отношении S.mutans, S.gordonii, S.sanquis, P.ginbivalis, F.nucleatum. Пентадекановая и маргариновая кислоты оказывают противовоспалительное действие (Venn-Watson et al., 2020; Huang et al., 2011).

[0072] Насыщенные жирные кислоты со средней длиной цепи, например, каприловая (C8), каприновая (C10), ундециловая (C11) и лауриновая (C12) кислоты, улучшают функцию кишечного эпителия, повышение активности ферментов микроворсинок слизистой оболочки в тонкой кишке. Указанные кислоты обладают антибактериальным, противогрибковым, противовоспалительным действием. Например, лауриновая кислота является наиболее эффективной в отношении Campylobacter jejuni, каприновая и лауриновая кислоты обладают антибактериальным действием в отношении Helicobacter pylori (Machate et al., 2020; Bae and Rhee 2019; Jung et al., 2016; Omura et al., 2011).

[0073] Витамин B5 (пантотеновая кислота) замедляет рост бактерий посредством регуляции врожденного иммунитета и адаптивного иммунитета у мышей, инфицированных Mycobacterium tuberculosis (He et al., 2018).

[0074] Аминокислоты поддерживают функцию кишечного барьера и эндокринную функцию кишечника. Аминокислоты, попадающие в кишечник извне метаболизируются кишечной микробиотой, которая использует их для синтеза собственных белков и катаболических путей. Показано, что пищевые аминокислоты могут регулировать состав микробиоты. Например, лизин поддерживает комменсальную (пробиотическую) микробиоту в кишечнике. Кроме того, лизин способствует поддержанию иммунной системы (Levine and Lohinai, 2021; Lin et al., 2017).

[0075] В культуральной жидкости бактерий семейства Lactobacillaceae в виде метаболитов присутствуют бактериоцины. Они представляют собой катионные и амфипатические малые молекулы с антагонистической активностью против микроорганизмов, тесно связанных со штаммом-продуцентом. Эти метаболиты принадлежат в основном к семействам органических кислот, кетонов, спиртов, аминокислот и моносахаридов. Среди наиболее распространенных бактериальных молекул-метаболитов известны лактат, маннит, глицин, бетаин, ацетат, этанол, фенилаланин, формиат, уридин и изолейцин, а также аланин и валин. Некоторые из этих молекул иначально присутствовуют в культуральной среде; другие являются естественными метаболитами лактобацилл (например, ацетат и этанол), в то время как некоторые являются вторичными продуктами метаболизма.

[0076] При добавлении в композицию высушенных клеток в конечный продукт дополнительно попадают в малом количестве все возможные метаболиты, которые содержатся в клетках, в том числе, вещества, составляющие клеточные стенки бактерий. В некоторых вариантах реализации комплекс метаболитов включает более узкие фракции метаболитов, выделенных из культуральных жидкостей указанных пробиотических микроорганизмов. Например, в некоторых вариантах реализации комплекс метаболитов представлен веществами с молекулярным весом 5-100 кДа.

[0077] В одном варианте реализации комплекс метаболитов состоит из метаболитов по меньшей мере, одного пробиотического штамма бактерий B. subtilis или бактерий семейства Lactobacillaceae. В другом варианте реализации комплекс метаболитов состоит из метаболитов более чем одного пробиотического штамма бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae. В предпочтительном варианте реализации комплекс метаболитов включает метаболиты одного или нескольких пробиотических штаммов бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae, а также включает инактивированные вегетативные клетки и споры пробиотического штамма бактерий B. subtilis и/или инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae.

[0078] При этом инактивированные вегетативные клетки и споры пробиотического штамма бактерий B. subtilis, а также инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae являются неживыми, например, умерщвлёнными посредством термической обработки. Соответственно, инактивированные вегетативные клетки и споры пробиотического штамма бактерий B. subtilis, а также инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae не способны к размножению и не составляют конкуренцию нормальной микрофлоре пациента, при этом выполняя антагонистическую роль в отношении ряда патогенных бактерий.

[0079] В качестве пробиотического штамма B. subtilis могут быть использованы штаммы B. subtilis ВКПМ №В-2335 (3), B. subtilis 534, B. subtilis ТПИ 13 - 07.06.21 - ДЕП/ВГНКИ, B. subtilis ВКПМ №В4759 (3), B. subtilis р ВМВ105, B. subtilis ТПИ 9; B. subtilis рВМВ 105. В предпочтительном варианте реализации пробиотический штамм B. subtilis представляет собой B. subtilis ВКМ В-3536D и/или ВКПМ №В-2335 (3).

[0080] В качестве пробиотических штаммов бактерий семейства Lactobacillaceae могут быть использованы штаммы L. reuteri DSM-17648 или ATCC-55730, SALR01, GMNL-0902, а также штаммы L. plantarum - ВКПМ В-11342 или SALP01.

[0081] Использование указанного комплекса метаболитов в концентрации менее 0,1% мас. приводит к существенному снижению эффективности композиции. Увеличение содержания комплекса метаболитов более 7% мас. нерационально, так как увеличивает стоимость производства и при этом не оказывает значительного влияния на эффективность композиции. В предпочтительном варианте реализации комплекс метаболитов иммобилизован на сорбенте. Благодаря этому биологически активные вещества, содержащиеся в комплексе метаболитов, высвобождаются с пористой поверхности сорбента постепенно в процессе движения по ЖКТ. Это позволяет поддерживать активность метаболитов в ЖКТ в течение продолжительного времени.

[0082] Сорбент представляет собой один или несколько силикатных минералов, в том числе, алюмосиликатных минералов. В предпочтительном варианте реализации композиции сорбент представляет собой смектит, бентонит, цеолит или их смесь. При этом сорбент обладает большой площадью активной поверхности, высокой адсорбционной способностью по отношению к токсинам, селективностью действия с минимальной потерей незаменимых микроэлементов. Используемый сорбент не разрушается в ЖКТ, не является токсичным, не вызывает аллергических реакций, обладает нейтральным вкусом. Сорбент способствует сохранению целостности композиции, сохранению биологической активности веществ, входящих в комплекс метаболитов, а также может усиливать действие композиции за счет собственных сорбционных свойств.

[0083] В предпочтительном варианте реализации все компоненты заявленной композиции высушены до такого состояния, что их влажность составляет не более 6% мас. Это позволяет создавать сухую композицию, пригодную для длительного хранения и удобную для транспортировки.

[0084] Благодаря отсутствию живых микроорганизмов, заявленная композиция не теряет эффективности при сочетанном приеме с антибиотиками, что позволяет использовать ее для лечения и профилактики заболеваний мочевыводящих путей у широкого круга пациентов. Кроме того, инактивированные вегетативные клетки и споры B. subtilis или инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae не создают конкуренции микрофлоре кишечника, которая является уникальной для каждого пациента, и соответственно, не нарушают ее баланс.

[0085] Заявленная композиция может применяться для изготовления препаратов, включающих дополнительные компоненты.

[0086] Заявленная композиция может применяться для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника различного генеза: при хронических заболеваниях пищеварительного тракта, после перенесенных острых кишечных инфекций, на фоне и после приема антибиотиков, после проведения химиотерапии, на фоне длительной гормональной терапии, в условиях хронических стрессовых состояний, при нерациональной диете.

[0087] Заявленная композиция может быть использована для изготовления пищевой добавки или фармацевтического препарата в виде порошка, эмульсии, таблетки или капсулы. Последняя форма является наиболее удобной для применения. При этом оболочка капсулы может быть выполнена из желатина.

[0088] Способ получения заявленной композиции включает следующие этапы. На этапе а) проводят глубинное выращивание одного или нескольких пробиотических штаммов бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae (Пример 4) в жидкой питательной среде, имеющей исходный рН 7,0±0,2. В предпочтительном варианте реализации глубинное выращивание проводят в ферментере. При этом коэффициент заполнения ферментера может составлять от приблизительно 60% до приблизительно 70%. Указанный коэффициент заполнения, с одной стороны, позволяет избежать нежелательного пенообразования, и с другой стороны, позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения культуральной суспензии, насыщенной метаболитами бактерий B. subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae. Глубинное выращивание проводят при температуре 30-40°С при постоянном перемешивании. При культивировании бактерий B. subtilis при постоянной аэрации глубинное выращивание проводят до тех пор, когда рН культуральной суспензии достигнет 8,5-8,9 и/или до достижения созревания более 90%. При культивировании бактерий семейства Lactobacillaceae глубинное выращивание завершают при отсутствии падения pH от заданного, пока бактерии находятся в экспоненциальной фазе роста. При выходе из экспоненциальной зоны роста, pH падает.

[0089] На этапе б) проводят центрифугирование культуральной суспензии на проточной центрифуге или ультрафильтрация до получения прозрачного супернатанта, представляющего собой культуральную жидкость. При этом происходит отделение основного количества клеток и спор от культуральной жидкости, включающей метаболиты.

[0090] На этапе в) проводят концентрирование ультрафильтрацией культуральной жидкости, полученной на этапе б). В предпочтительном варианте реализации применяют тангенциальную ультрафильтрацию со степенью концентрирования в 10-15 раз. Процесс ультрафильтрации завершают при снижении скорости фильтрации в 2-3 раза. Для ультрафильтрации могут использовать любые подходящие фильтрующие мембраны с первым порогом отсечения. Первый порог отсечения может меняться в зависимости от характера активности целевого продукта. В некоторых вариантах реализации первый порог отсечения составляет 100 кДа. В результате получают пермеат, включающий метаболиты с молекулярным весом не более установленного порога отсечения. Ультрафильтрация позволяет удалить низкомолекулярные токсичные вещества, которые при использовании всей культуральной жидкости могут попасть в конечную композицию. На этапе г) совместно высушивают полученные метаболиты на сорбенте до содержания метаболитов в конечной композиции в диапазоне 0,1-7,0% по массе. Во время этого процесса происходит первичная иммобилизация активных компонентов на силикатном сорбенте. Подготовка сорбента перед иммобилизацией метаболитов включает перемалывание, просеивание, прокаливание, удаление магнитных примесей. Размер частиц, используемых в композиции, находится в диапазоне: 0,005-0,5 мм.

[0091] В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает этап е), где инактивируют вегетативные клетки и споры B. subtilis и/или инактивируют клетки Lactobacillaceae. Инактивация вегетативных клеток и споры бактерий B. subtilis и/или клеток бактерий Lactobacillaceae провоходит путем инкубации осадка, полученного на этапе б), при температуре 60-140°С в течение 5-120 минут; клетки пробиотического штамма бактерий семейства Lactobacillaceae инактивируют путем обработки осадка, полученного на этапе центрифугирования культуральной суспензии, тепловой обработкой при 60-120°С в течение 20-40 минут.

[0092] В некоторых вариантах реализации способ включает в себя этап д), где высушивают инактивированные клетки и споры B. subtilis и/или клетки Lactobacillaceae.

[0093] В одном варианте реализации все компоненты заявленной композиции высушивают совместно. В другом варианте реализации часть композиции высушивают отдельно друг от друга, а потом смешивают друг с другом в сухом виде. В еще одном варианте реализации после смешивания всех компонентов композиции, независимо от степени их влажности, проводят окончательную сушку лиофилизации. В результате сушки получают композицию, влажность которой составляет не более 6% мас. Высушивание отдельных компонентов или всей композиции увеличивает срок хранения готовой композиции, а также упрощает хранение и транспортировку как отдельных компонентов, так и всей заявленной композиции.

[0094] Полученные метаболиты могут быть лиофилизированы стандартными методами, известными в данной области техники. Лиофилизированные метаболиты могут быть использованы для получения заявленной композиции в сухом виде. Лиофилизация продлевает срок хранения как самих метаболитов, так и заявленной композиции в сухом виде. В предпочтительном варианте реализации получают композицию в сухом виде, например, в виде порошка, капсул, таблеток.

ПРИМЕРЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пример 1. Исследование детоксикационной активности заявленной композиции при интоксикации токсинами Clostridium septicum

[0095] В данном примере исследовали антитоксический эффект заявленной композиции, включающей комплекс метаболитов B. subtilis, иммобилизованный на цеолите. Комплекс метаболитов представлял собой все метаболиты, полученные из культуральной жидкости B. subtilis. При этом содержание цеолита в композиции не превышало 99,9% мас.

[0096] Антитоксический эффект изучали на белых мышах, которым вводили комплекс токсинов C. septicum (Clostridium septicum). Clostridium septicum – анаэробный патоген, являющийся основным возбудителем газовой гангрены у пациентов с иммуносупрессией, злокачественными новообразованиями кишечника или онкогематологическими заболеваниями (Thomas et al., 2021). Развитие патологии обусловлено действием комплекса специфических токсинов, вырабатываемых этими бактериями. Комплекс известных токсинов C. septicum насчитывает 4 биотоксина с разным механизмом действия (Bryant & Stevens, 2015).

[0097] В исследовании использовали комплекс биотоксинов C. septicum типа A в количестве 2 и 20 половинных летальных доз (ЛД₅₀). Токсины вводили подопытным животным в хвостовую вену в объеме 0,2 мл. Наблюдение за животными осуществляли в течение 4 суток от момента введения токсинов, ежедневно отмечая количество живых и погибших животных. Использованные животные были получены из питомника «Рапполово» РАН (Ленинградская область). Всего было использовано 53 мыши массой 16-18 г.

[0098] Заявленную композицию растворяли в физиологическом растворе в концентрации 100 мкг/мл и вводили животным в объеме 0,3 мл, за 24 ч до введения токсина. Критерием, характеризующим эффективность композиции, являлось повышение выживаемости (%) животных, получавших комбинацию, по отношению к контрольным животным, не получавшим композицию. Процент выживших животных в подопытной и контрольных группах определяли по таблицам В.С. Генеса (Генес, 1964). Полученные результаты приведены в Табл. 1.

Таблица 1. Влияние заявленной композиции на устойчивость белых мышей к отравлению токсином типа А C. septicum.

Группа Вводимые вещества Количество животных Выживаемость, Х (Х-tm÷Х+tm), % Композиция Композиция + Токсины (2*) 20 60 (36-81) Композиция Композиция + Токсины (20*) 13 54 (25-81) Контроль Токсины (2*) 10 0 (0-31) Контроль Токсины (20*) 10 0 (0-31)

* - доза ЛД₅₀

[0099] Полученные результаты показывают, что доза токсина 2 ЛД₅₀ приводила к средней 100% летальности, однако введение заявленной композиции до введения токсинов повышала выживаемость мышей до 60%. Эти данные свидетельствуют о наличии у заявленной композиции антитоксического действия. Причем это действие незначительно зависит от заражающей дозы комплекса токсинов: с увеличением дозы в 10 раз (до 20 ЛД₅₀) антитоксическое действие снизилось всего на 6%.

[00100] Таким образом, заявленная композиция оказывает антитоксическое действие при интоксикации токсином Clostridium septicum типа A.

Пример 2. Исследование детоксикационной активности заявленной композиции при интоксикации токсинами Clostridium novyi (oedematiens)

[00101] В данном примере исследовали антитоксический эффект заявленной композиции, включающей комплекс метаболитов B. subtilis, иммобилизованный на цеолите. Комплекс метаболитов представлял собой все метаболиты, полученные из культуральной жидкости B. subtilis. При этом содержание цеолита в композиции не превышало 99,9% мас.

[00102] Антитоксический эффект заявленной композиции изучали на 2 видах животных – белых мышах и морских свинках. Животные были получены из питомника «Рапполово» РАН (Ленинградская область). Всего было использовано 60 мышей массой 16-18 г и 60 морских свинок массой 200-250 г.

[00103] Животным вводили токсин типа А, вырабатываемый Clostridium novyi (oedematiens) (С. novyi). Этот токсин является наиболее частым возбудителем газовой гангрены у человека и злокачественных отёков у различных видов животных. Летальность при заболевании газовой гангреной, вызванной С. novyi, составляет не менее 50% (Капустин, 2019).

[00104] В данном исследовании использовали комплекс биотоксинов C. novyi типа A в количестве 2 и 20 половинных летальных доз (ЛД₅₀). Токсины вводили подопытным животным в хвостовую вену в объеме 0,2 мл (мыши) или внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл (морские свинки). Наблюдение за животными осуществляли в течение 4 суток от момента введения токсинов, ежедневно отмечая количество живых и погибших животных.

[00105] Заявленную композицию растворяли в физиологическом растворе в концентрации 100 мкг/мл и вводили животным в объеме 0,3 мл, за 24 ч до введения токсинов. Критерием, характеризующим эффективность комбинации, являлось повышение выживаемости (%) животных, получавших кмпозицию, по отношению к контрольным животным, не получавшим композицию. Процент выживших животных в подопытной и контрольных группах определяли по таблицам В.С. Генеса (Генес, 1964). Полученные результаты приведены в Табл. 2.

Таблица 2. Влияние заявленной композиции на устойчивость белых мышей и морских свинок к отравлению токсином типа А C. novyi

Группа Вид животных Вводимые вещества Количество животных Выживаемость, Х (Х-tm÷Х+tm), % Композиция Мыши Композиция + Токсины (2*) 20 95 (75-100)** Композиция Мыши Композиция + Токсины (20*) 20 60 (36-81) Композиция Морские свинки Композиция + Токсины (2*) 20 90 (56-100)** Композиция Морские свинки Композиция + Токсины (20*) 20 50 (21-79) Контроль Мыши Токсины (2*) 10 0 (0-31) Контроль Мыши Токсины (20*) 10 0 (0-31) Контроль Морские свинки Токсины (2*) 10 0 (0-31) Контроль Морские свинки Токсины (20*) 10 0 (0-31)

* - доза ЛД₅₀

** - различия с соответствующим контролем достоверны при p<0,05.

[00106] Полученные результаты показывают, что доза токсинов 2 ЛД₅₀ приводила к средней 100% летальности, как у мышей, так и у морских свинок. При этом введение композиции до введения токсинов повышала выживаемость для данной дозы до 95% у мышей и 90% у морских свинок. Эти данные свидетельствуют о наличии у заявленной композиции антитоксического действия при интоксикации токсином типа A C. novyi.

Пример 3. Исследование детоксикационной активности заявленной композиции, включающей цеолит, при интоксикации альфа-токсином Clostridium perfringens типа A

[00107] В данном примере исследовали антитоксический эффект заявленной композиции, включающей комплекс метаболитов B. subtilis, иммобилизованный на цеолите. Комплекс метаболитов представлял собой все метаболиты, полученные из культуральной жидкости B. subtilis. При этом содержание цеолита в композиции не превышало 99,9% мас.

[00108] Антитоксический эффект заявленной композиции изучали на 2 видах животных – белых мышах и морских свинках. Животные были получены из питомника «Рапполово» РАН (Ленинградская область). Всего было использовано 60 мышей массой 16-18 г и 60 морских свинок массой 200-250 г.

[00109] Животным вводили альфа-токсин, вырабатываемый Clostridium perfringens (C. perfringens). Этот токсин является наиболее частой причиной посттравматической газовой гангрены, симптомы которой развиваются в течение 24 часов. Альфа-токсин С. рerfringens также вызывает пищевые отравления у человека и животных, и некротизирующие энтериты и маститы у животных (Goossens et al., 2017).

[00110] В исследовании использовали альфа-токсин C. Perfringens типа А в количестве 2 и 20 половинных летальных доз (ЛД₅₀). Токсин вводили подопытным животным в хвостовую вену в объеме 0,2 мл (мыши) или внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл (морские свинки). Наблюдение за животными осуществляли в течение 4 суток от момента введения токсина, ежедневно отмечая количество живых и погибших животных.

[00111] Заявленную композицию растворяли в физиологическом растворе в концентрации 100 мкг/мл и вводили животным в объеме 0,3 мл, за 24 ч до введения токсина. Критерием, характеризующим эффективность комбинации, являлось повышение выживаемости (%) животных, получавших комбинацию, по отношению к контрольным животным, не получавшим композицию. Процент выживших животных в подопытной и контрольных группах определяли по таблицам В.С. Генеса (Генес, 1964). Полученные результаты приведены в Табл. 3.

Таблица 3. Влияние заявленной композиции на устойчивость белых мышей и морских свинок к отравлению альфа-токсином C. perfringens

Группа Вид животных Вводимые вещества Количество животных Выживаемость, Х (Х-tm÷Х+tm), % Композиция Мыши Композиция + Токсины (2*) 20 100 (69-100)** Композиция Мыши Композиция + Токсины (20*) 20 60 (36-81) Композиция Морские свинки Композиция + Токсины (2*) 20 100 (69-100)** Композиция Морские свинки Композиция + Токсины (20*) 20 50 (21-79) Контроль Мыши Токсины (2*) 10 0 (0-31) Контроль Мыши Токсины (20*) 10 0 (0-31) Контроль Морские свинки Токсины (2*) 10 0 (0-31) Контроль Морские свинки Токсины (20*) 10 0 (0-31)

* - доза ЛД₅₀

** - различия с соответствующим контролем достоверны при p<0,05.

[00112] Полученные результаты показывают, что доза альфа-токсина 2 ЛД₅₀ приводила к средней 100% летальности, как у мышей, так и у морских свинок. При этом введение композиции до введения токсина повышало выживаемость для данной дозы до 100% как у мышей, так и у морских свинок. Эти данные свидетельствуют о наличии у заявленной композиции антитоксического действия при интоксикации альфа-токсином C. perfringens.

Пример 4. Исследование детоксикационной активности заявленной композиции, включающей бентонит или смектит, при интоксикации альфа-токсином Clostridium perfringens

[00113] В данном примере были проверены эффекты сочетания других сорбентов – бентонита или смектита с комплексом метаболитов B. subtilis на устойчивость белых мышей к отравлению альфа-токсином C. perfringens. Комплекс метаболитов представлял собой фракцию веществ с молекулярным весом 5-100 кДа, полученную из культуральной жидкости B. subtilis. При этом содержание сорбента в композиции не превышало 99,9% мас.

[00114] Исследования проводили аналогично тому, которое описано в Примере 3. Действие композиций, включающих бентонит или смектит, было аналогично действию композиции с цеолитом.

Таблица 4. Влияние комбинации бентонита и комплекса метаболитов B. subtilis (композиции) на устойчивость белых мышей к отравлению альфа-токсином C. perfringens

Группа Вид животных Вводимые вещества Количество животных Выживаемость, Х (Х-tm÷Х+tm), % Композиция Мыши Композиция + Токсины (2*) 20 100 (69-100)** Композиция Мыши Композиция + Токсины (20*) 20 60 (36-81) Контроль Мыши Токсины (2*) 10 0 (0-31) Контроль Мыши Токсины (20*) 10 0 (0-31)

* - доза ЛД₅₀

** - различия с соответствующим контролем достоверны при p<0,05.

Таблица 5. Влияние комбинации смектита и метаболитов B. subtilis (композиции) на устойчивость белых мышей к отравлению альфа-токсином C. perfringens

Группа Вид животных Вводимые вещества Количество животных Выживаемость, Х (Х-tm÷Х+tm), % Композиция Мыши Композиция + Токсины (2*) 20 100 (69-100)** Композиция Мыши Композиция + Токсины (20*) 20 55 (28-82) Контроль Мыши Токсины (2*) 10 0 (0-31) Контроль Мыши Токсины (20*) 10 0 (0-31)

* - доза ЛД₅₀

** - различия с соответствующим контролем достоверны при p<0,05.

[00115] Введение композиций до введения токсина повышала выживаемость мышей для дозы токсина в 2 ЛД₅₀ до 100%. Этот эффект наблюдался как в композиции с бентонитом, так и со смектитом. Эти данные свидетельствуют об антитоксическом действии этих композиций.

[00116] Таким образом, примеры 1-4 достоверно демонстрируют детоксикационую активность разных вариантов заявленной композиции.

Пример 5. Получение комплекса, включающего инактивированные клетки и метаболиты бактерий семейства Lactobacillaceae, иммобилизованных на цеолите, на примере L. plantarum

[00117] Для получения комплекса метаболитов использовали штамм L. plantarum ВКПМ В-11342. Выращивание культуры проводили при температуре 37±1°С в течение 24 ч. С помощью щелочи доводили рН питательной среды до 6,8–7,0 до начала культивирования. Культивирование проводили в ферментере Биор-01 в объеме питательной среды 30 л. Общее время накопления биомассы в реакторе 18 ч. Завершением процесса культивирования считали отсутствие падения pH от заданного.

[00118] После завершения культивирования культуру охлаждали до 10°С. Титр клеток в культуре составил 6×10⁹ КОЕ/мл. Далее проводили концентрирование на ультрафильтрационной установке без этапа отделения культуральной жидкости от клеток центрифугированием, так как для приготовления композиции необходима смесь концентрата метаболитов из культуральной жидкости и клеток. Завершением процесса концентрирования считали снижение эффективности работы кассеты не менее чем в 5 раз по выходу фугата. Получили концентрированную суспензию клеток.

[00119] Полученные клетки инактивировали нагреванием при 80°С в течение 40 минут. Сорбент – цеолит - смешивали с дистиллированной водой. К полученной смеси добавляли инактивированные клетки. Анализ КОЕ перед лиофилизацией показал отсутствие жизнеспособных клеток. Лиофилизацию смеси сорбента и инактивированных клеток проводили на установке TG-50 при стандартных параметрах лиофилизации. На выходе получили комплекс метаболитов, иммобилизованный на сорбенте, с влажностью 2%.

Пример 6. Получение комплекса, включающего инактивированные клетки и метаболиты бактерий семейства Lactobacillaceae, иммобилизованных на цеолите, на примере L. reuteri

[00120] Для получения комплекса метаболитов и инактивированных клеток использовали штамм L. reuteri SALR01. Выращивание культуры проводили при температуре 36±1°С в течение 24 ч. До начала культивирования с помощью щелочи доводили рН питательной среды до 6,8–7,0. Культивирование проводили в ферментере АНКУМ 210 в объеме питательной среды 10 л. Общее время накопления биомассы в реакторе 18 ч. Завершением процесса культивирования считали отсутствие падения pH от заданного.

[00121] После завершения культивирования культуру охлаждали до 10°С. Титр клеток в культуре составил 6×10⁹ КОЕ/мл. Далее проводили разделение культуральной жидкости на проточной ультрацентрифуге GF105B. После процесса ультрацентрифугирования получили осадок. Титр в осадке составил 2,5°10¹⁰ КОЕ/мл. Осадок смешали со стерильной дистиллированной водой, получили суспензию клеток. Клетки инактивировали нагреванием при 80°С в течение 40 минут. Сорбент – цеолит - смешивали с дистиллированной водой. К полученной смеси добавляли инактивированные клетки. Анализ КОЕ перед лиофилизацией показал отсутствие жизнеспособных клеток. Лиофилизацию смеси сорбента и инактивированных клеток проводили на установке TG-50 при стандартных параметрах лиофилизации. На выходе получили комплекс инактивированных клеток и метаболитов, иммобилизованных на сорбенте, с влажностью 2%.

Пример 7. Получение метаболитов B. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа

[00122] В данном примере получали метаболиты штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Процесс глубинного культивирования вели в ферментере Р1000 фирмы Bioengineering (Швейцария) объемом 1000 дм³ с коэффициентом заполнения 0,6. В процессе культивирования поддерживали температуру 37±1°С. Скорость перемешивания составляля 250 об/мин. Начальная скорость аэрации составляла 0,2 об/об/мин, через 16 часов роста скорость изменяли до значения 0,5 об/об/мин. Процесс глубинного культивирования вели в течение 32 часов.

[00123] Культуральную суспензию B. subtilis ВКМ В-3536D подвергали центрифугированию на проточной суперцентрифуге Sharpless AS-26. Полученную культуральную жидкость подвергали ультрафильтрации на установке тангенциальной ультрафильтрации в две стадии. На первой стадии использовали фильтрующую мембрану АР-3-100. При этом получали концентрат №1 с порогом отсечения 100 кДа, включающий высокомолекулярную фракцию метаболитов весом более 100 кДа. Пермеат, полученный после первой стадии ультрафильтрации, вновь подвергали тангенциальной ультрафильтрации с использованием фильтрующей мембраны АР-3-5. В результате получали концентрат №2 с порогом отсечения 5 кДа. Полученный концентрат №2 составлял около 10% от исходного объема культуральной жидкости. Полученный концентрат №2 включал в себя метаболиты B. subtilis ВКМ В-3536D с молекулярным весом 5-100 кДа.

Пример 8. Оценка иммуномодулирующих свойств метаболитов B. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа

[00124] В данном примере исследовали иммуномодулирующие свойства метаболитов с молекулярным весом 5-100 кДа пробиотического штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Для этого лиофилизированные метаболиты 5-100 кДа с добавлением мальтодекстрина в качестве носителя, но не сорбента, добавляли в культуру клеток моноцитов человека ТНР-1. В данном примере рассматриваются только иммуномодулирующие свойства метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536D, а не их действие на организм в сочетание с носителем-мальтодекстрином. Сравнивали эффект добавления метаболитов по отношению к контролю без метаболитов 1) на стадии дифференцировки моноцитов в макрофаги с помощью форбол-миристат-ацетата и 2) на стадии поляризации ранее дифференцированных моноцитов. Эффект оценивали методом обратной транскрипции (RT-PCR), по экспрессии мРНК маркерных генов, кодирующих интерлейкины и другие факторы: IL1b, IL6, IL10, TNFa и CD64.

[00125] На Фиг. 1 показаны значения экспрессии указанных маркерных генов при добавлении метаболитов, нормализованные к контролю без добавления метаболитов. Указаны средние значения двух экспериментов, по три повтора в каждом эксперименте. Статистически значимые (р≤0,05) количественные изменения (не менее чем в два раза по сравнению с контролем) в обоих экспериментах отмечены звездочкой (*). Светло-серые столбцы отражают уровень экспрессии соответствующего гена на стадии дифференцировки, темно-серые столбцы отражают уровень экспрессии на стадии поляризации.

[00126] Видно, что на стадии дифференцировки исследованные метаболиты значительно усиливали экспрессию гена TNFa, и в то же время значительно снижали экспрессию гена CD64. Это указывает на усиление процесса дифференцировки моноцитов в макрофаги. Также значительно снижалась экспрессия цитокина IL1b, что указывает на противовоспалительный эффект. На стадии поляризации исследуемые метаболиты значительно повышали экспрессию цитокинов IL6 и IL10. IL10 – классический противовоспалительный цитокин, и повышение его экспрессии свидетельствует об активации противовоспалительной поляризации макрофагов. IL6 – важный цитокин, высокие концентрации которого также ассоциированы с противовоспалительным эффектом.

[00127] Полученные данные указывают на то, что исследованные метаболиты обладают иммуномодулирующими свойствами. Они могут способствовать дифференцировке моноцитов в макрофаги, а также способствовать противовоспалительной поляризации макрофагов, которая необходима для окончания воспаления и регенерации тканей.

Пример 9. Изучение воздействия метаболитов B. subtilis на ингибирование роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры

[00128] В данном примере изучали способность метаболитов штамма B. subtilis ВКМ В-3536D с молекулярным весом 5-100 кДа подавлять рост индикаторных культур. Исследование проводили с использованием адаптированного метода стандартных дисков для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Использованные в данном примере индикаторные культуры представлены патогенными и условно-патогенными для человека микроорганизмами. Для реализации метода индикаторные культуры помещали на поверхность агаризованной питательной среды Луриа-Бертани в чашке Петри в количестве 10⁷ КОЕ. После застывания чашки Петри подсушивали в течение 15 минут при 37°С. Затем на поверхность питательной среды с индикаторными культурами в виде капель диаметром 5±1 мм наносили по 10 мкл концентратов №1 и №2, полученных ранее. Затем чашки Петри оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капель и затем инкубировали при 37°С в течение 24-48 часов. Детекцию результатов проводили путем измерения зоны задержки роста индикаторных культур вокруг области нанесения культур, вокруг области нанесения концентратов указывает на антагонистическое действие метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536 в отношении указанных в Табл. 6 индикаторных культур. Величина зон, свободных от индикаторных культур, указывает на эффективность антагонистического действия метаболитов B. subtilis ВКМ В-3536.

Таблица 6. Задержка роста индикаторных культур при воздействии метаболитов B. subtilis

Индикаторная культура Зона задержки роста за пределами капли концентрата Концентрат №1 Концентрат №2 Escherichia coli DH5α 1 мм* - Staphylococcus aureus 3.2 2 мм 2 мм Staphylococcus aureus 4.1 3 мм 2 мм Staphylococcus epidermidis 3.1 4 мм 4 мм Streptococcus agalactiae 42 1 мм 2 мм Streptococcus agalactiae 30 1 мм 1 мм Streptococcus agalactiae 9177 1 мм 1 мм Enterococcus faecium 24 1 мм 2 мм Enterococcus faecalis 4387 1 мм 1 мм Enterococcus faecalis 4661 1 мм 1 мм Streptococcuss salivarius 1453 0,5мм* 0,5мм* Streptococcus gordonii 221 - - Streptococcus mitis cl.is. 1 1 мм* 1 мм* Klebsiella oxytoca cl.is. - - Pseudomonas spp. cl.is. - -

* – бактериостатическое действие

«-» – задержка роста не наблюдалась

[00129] Из Табл. 6 видно, что способностью к подавлению роста обладают как высокомолекулярные метаболиты весом более 100 кДа (концентрат №1), так и метаболиты весом 5-100 кДа (концентрат №2). При этом в воздействии этих двух вариантов метаболитов есть существенная разница: высокомолекулярные метаболиты вызывают задержку роста E. coli, а целевые метаболиты весом 5-100 кДа не вызывают. При том, что E. coli является представителем нормальной микрофлоры кишечника, отсутствие подавляющего воздействия концентрата 2 на данную культуру, говорит об избирательности действия метаболитов весом 5-100кДа.

[00130] Стоит отметить, что культуральная суспензия штамма B. subtilis ВКМ В-3536D, включающая все метаболиты, также вызывала значительную задержку роста E. coli. Такие данные были получены в исследовании антагонистической активности штамма B. subtilis ВКМ В-3536D методом перпендикулярных штрихов.

[00131] В результате исследования установлена выраженная избирательная способность метаболитов штамма B. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа к подавлению роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Количественно исследовали состав культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis ВКМ В-3536D. Исследование было выполнено в Федеральном государственном унитарном предприятии «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» федерального медико-биологического агентства (ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА РОССИИ).

[00132] Образец культуральной жидкости после перемешивания был разделен на пробы, которые хранились до анализа в замороженном виде при –18°С. В дальнейшем пробы были разделены на аликвоты, в которых было проведено измерение массовых концентраций. Также проводили скрининг с использованием высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (ВЭЖХ-МС ВР). В результате скрининга методом ВЭЖХ-МС ВР были идентифицированы соединения, представленные в Табл. 7. Отличие теоретической массой от практической составляет 0,7 ppm, таким образом можно утверждать о достоверной идентификации.

Таблица 7. Соединения в культуральной жидкости пробиотического штамма B. subtilis, идентифицированные методом ВЭЖХ-МС ВР

Идентифицированные соединения Химическая формула M+H M+2H RT Проба, мкг/мл Тирамин (Фенилэтаноламин) C₈H₁₁NO 138,091 6,95 15,315 Фенилэтиламин C₈H₁₁N 122,096 8,03 12,727 Урацил C₄H₄N₂O₂ 113,0345 5,5 11,563 Дигидроурацил C₄H₆N₂O₂ 115,0502 5,42 0,793 Тимин C₅H₆N₂O₂ 126,1133 7,73 4,049 Амикумацин B C₂₀H₂₈O₈N₂ 425,1918 8,75 133,463 Амикумацин A C₂₀H₂₉N₃O₇ 424,2078 8,65 0,509 Фенгицин A C15–ЖК C₇₁H₁₀₈N₁₂O₂₀ 1449,788 725,3977 10,75 0,000 Фенгицин A C16 – ЖК C₇₂H₁₁₀N₁₂O₂₀ 1463,803 732,405 11,55 0,000 Фенгицин A C17 – ЖК C₇₃H₁₁₂N₁₂O₂₀ 1477,819 739,413 12,74 0,000 Фенгицин n B C16 – ЖК C₇₄H₁₁₄N₁₂O₂₀ 1491,835 749,42 13,11 0,000 Фенгицин B C17 – ЖК C₇₅H₁₁₆N₁₂O₂₀ 1505,85 753,428 13,62 0,000 Фенгицин B C18 – ЖК C₇₆H₁₁₈N₁₂O₂₀ 1519,866 760,436 15,12 0,000

RT – Время удерживания, ЖК – жирная кислота

[001]

Литература

Bryant, A.E. and Stevens, D.L. Clostridial toxins in the pathogenesis of gas gangrene, in J. Alouf, D. Ladant, and M.R. Popoff (eds) The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins (Fourth Edition) // Boston: Academic Press. 2015, №33 pp. 977–994. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-800188-2.00033-1.

Gibson, G., Hutkins, R., Sanders, M. et al. «Expert consensus document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics» // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2017, 14, 491–502. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.75.

Goossens, E. et al. Rethinking the role of alpha toxin in Clostridium perfringens-associated enteric diseases: a review on bovine necro-haemorrhagic enteritis // Veterinary research. – 2017. – 48(1), p. 9.

https://doi.org/10.1186/s13567-017-0413-x.

Ongena M., Jourdan E., Adam A., Paquot M., Brans A., Joris B., Arpigny J.L., Thonart P. «Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants» // Environ Microbiol. 2007, 9(4): 1084-90.

doi: 10.1111/j.1462-2920.2006.01202.x.

Roberts P.H., Davis K.C., Garstka W., Bhunia A.K., «Lactate dehydrogenase release assay from Vero cells to distinguish verotoxin producing Escherichia coli from non-verotoxin producing strains» // Journal of Microbiological. 2001, Methods, 43: 171-181. https://doi.org/10.1016/S0167-7012(00)00222-0.

Rychen G., Aquilina G., Azimonti G., Bampidis V., Bastos M.L., Bories G., Chesson A., Cocconcelli P.S., Flachowsky G., Gropp J., Kolar B., Kouba M., Lopez-Alonso M., Lopez Puente S., Mantovani A., Mayo B., Ramos F., Saarela M., Villa R.E., Wallace R.J., Wester P., Glandorf B., Herman L., Kärenlampi S., Aguilera J., Anguita M., Brozzi R., Galobart J. «EFSA FEEDAP Panel (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed): Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms» // EFSA Journal. 2018, 16(3), 5206, 24 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206.

Shah T., Baloch Z., Shah Z., Cui X., Xia X. «The Intestinal Microbiota: Impacts of Antibiotics Therapy, Colonization Resistance and Diseases» // Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 6597. https://doi.org/10.3390/ijms22126597.

Thomas, P. et al. First Comparative Analysis of Clostridium septicum Genomes Provides Insights Into the Taxonomy, Species Genetic Diversity, and Virulence Related to Gas Gangrene // Frontiers in microbiology. 2021, №12, p. 771945. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.771945.

Fatullayeva, S. et al. A review on enterosorbents and their application in clinical practice: Removal of toxic metals // Colloid and Interface Science Communications. 2021, Vol. 45, 100545.

https://doi.org/10.1016/j.colcom.2021.100545

Yoha K.S, Nida S., Dutta S., Moses J.A., Anandharamakrishnan C.: «Targeted Delivery of Probiotics: Perspectives on Research and Commercialization» // Probiotics Antimicrob Proteins. 2022, 14(1):.15-48.

https://doi.org/10.1007/s12602-021-09791-7

Архипов В.Ю. «Инулин и олигофруктоза: эффективность в качестве пребиотического волокна для кондитерской промышленности» // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 9 (6) – С. 1216-1219.

Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. «Дисбактериозы кишечника у взрослых» // М.: КМК. - 2003. - 224 с.

Бухарин О.В. «Персистенция патогенных бактерий» // М.: Медицина - 1999. - 364 с.

Воробейчиков Е.В., Василенко А.Ж., Синица А.В и др. «Методологические аспекты применения пробиотиков и антибиотиков для экстренной профилактики инфекционных заболеваний» // Сб. научн. тр. III съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - М: МаксПресс, 2005. - С. 35-36.

Генес, В.С. Таблицы достоверных различий между группами наблюдений по качественным показателям: пособие по статистической обработке результатов наблюдений и опытов в медицине и биологии / В.С. Генес. – Москва : Медицина, 1964. – 80 с.

ГОСТ Р 52349-2005 «Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения» (с Изменением N 1) // ГОСТ Р от 31 мая 2005 г. № 52349-2005.

Жучкова Т.В., «Современные представления о микрофлоре человека: что такое дисбактериоз?» // Медицинская энциклопедия Видаль: Гастроэнтерология, 2015.

Капустин, А.В. Этиологическая структура и специфическая профилактика клостридиозов крупного рогатого скота и овец. Диссертация на соискание ученой степени доктора наук, 2019.

https://dissercat.com/content/etiologicheskaya-struktura-i-spetsificheskaya-profilaktika-klostridiozov-krupnogo-rogatogo (Accessed: 27 March 2023).

Кнунянц И.Л. «Химическая энциклопедия» // М.: Советская энциклопедия. 1988.

Крамарь Л.В. «Микроэкология кишечника здоровых людей в условиях техногенного воздействия крупного промышленного города» // Вестн. РАМН. - 2002. - №8. - С. 37-40.

Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. «Лактофлора и колонизационная резистентность» // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1987. - №3. - С. 173-179.

Лузина Е.В. «Пищевая ценность цикория» // Вопр. питания. 2013; № 2: 62-65.

Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В. «Дисбактериоз кишечника» // Рос.мед. журнал. - 1999. - №3. - С. 40-45.

Петровская В.Г. «Общие закономерности взаимодействия в системе паразит-хозяин и проблема смешанных инфекций» // Журн. микробиол. - 1982. - №8. - С. 24-31.

Тагиева С.А., Гахраманова Ф.Х. «Преимущества применения бактериоцинных препаратов по сравнению с химическими антибиотиками для лечения инфекций у человека и животных» // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация, 2020.

Тарантула В.З. «Словарь биотехнологических терминов» // Москва: Роспатент, 2005.

Технический регламент Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».

Фирсов Н.Н., «Микробиология: словарь терминов» // М: Дрофа, 2006.

Хурса Р.В., Месникова И.Л., Микша Я.С. «Кишечная микрофлора: роль в поддержании здоровья и развитии патологии, возможности коррекции» // Минск БГМУ, 2017.

Шендеров Б.А., Ткаченко Е.И., Лазебник Л.Б., Ардатская М.Д., Синица А.В., Захарченко М.М. «Метабиотики – новая технология профилактики и лечения заболеваний, связанных с микроэкологическими нарушениями в организме человека» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2018; 151(3): 83–92.

Шендеров Б.А. «Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. / Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции» // М.: ГРАНТЪ, 1998. - 288 с.

Юшков В.В. и др. «Иммунокорректоры: Руководство для врачей и провизоров» // Екатеринбург: ООО «ИРА УТК», 2002. - 255 с.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены метабиотическая композиция для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с нарушением состава микробиоты желудочно-кишечного тракта и/или интоксикацией организма, включающая 0,1-7,0 мас.% комплекса метаболитов, полученного из культуральной жидкости по меньшей мере одного пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae и 93,0-99,9 мас.% алюмосиликатного сорбента; и способ ее получения, включающий выращивание по меньшей мере одного пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae в жидкой питательной среде, центрифугирование культуральной суспензии с получением культуральной жидкости и осадка, ультрафильтрацию культуральной жидкости. Полученный концентрат высушивают и смешивают с алюмосиликатным сорбентом или высушивают на алюмосиликатном сорбенте. Изобретения обеспечивают расширение арсенала средств для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с дисбактериозом кишечника и/или интоксикацией организма. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 9 пр.

1. Метабиотическая композиция для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с нарушением состава микробиоты желудочно-кишечного тракта и/или интоксикацией организма, включающая комплекс метаболитов, полученный из культуральной жидкости по меньшей мере одного пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae, а также алюмосиликатный сорбент, при этом соотношение компонентов, мас. %:

- комплекс метаболитов, полученный из культуральной жидкости по меньшей мере одного пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae – 0,1-7,0;

- алюмосиликатный сорбент – 93,0-99,9.

2. Метабиотическая композиция по п. 1, включающая метаболиты пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis ВКМ В-3536D и/или штамма ВКПМ №В-2335.

3. Метабиотическая композиция по п. 1, дополнительно включающая инактивированные клетки и споры бактерий Bacillus subtilis.

4. Метабиотическая композиция по п. 1, дополнительно включающая инактивированные клетки бактерий семейства Lactobacillaceae.

5. Метабиотическая композиция по п. 1, включающая метаболиты бактерий по меньшей мере одного пробиотического штамма из следующего ряда: Lactobacillus reuteri GMNL-0902, Lactobacillus reuteri DSM-17648, Lactobacillus reuteri ATCC-55730, Lactobacillus reuteri SALR01, Lactobacillus plantarum ВКПМ В-11342, Lactobacillus plantarum SALP01.

6. Метабиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что комплекс метаболитов иммобилизован на алюмосиликатном сорбенте.

7. Метабиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что алюмосиликатный сорбент включает алюмосиликатный минерал, выбранный из группы: бентонит, смектит, цеолит.

8. Метабиотическая композиция по п. 1, отличающаяся влажностью не более 6% мас.

9. Способ получения композиции по п. 1, включающий следующие этапы:

а) выращивают по меньшей мере один пробиотический штамм бактерий Bacillus subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae в жидкой питательной среде с получением культуральной суспензии;

б) центрифугируют культуральную суспензию на проточной центрифуге с получением культуральной жидкости и осадка, включающего вегетативные клетки и споры пробиотического штамма Bacillus subtilis и/или клетки пробиотического штамма бактерий семейства Lactobacillaceae;

в) проводят ультрафильтрацию культуральной жидкости с получением концентрата;

г) высушивают полученный концентрат и смешивают с алюмосиликатным сорбентом или высушивают концентрат на алюмосиликатном сорбенте.

10. Способ по п. 9, в котором выращивание бактерий Bacillus subtilis и/или бактерий семейства Lactobacillaceae проводят глубинным способом.

11. Способ по п. 9, в котором выращивание бактерий Bacillus subtilis и/или штаммов бактерий семейства Lactobacillaceae проводят в ферментере с коэффициентом заполнения 60-70% при перемешивании, при этом Bacillus subtilis аэрируется.

12. Способ по п. 9, в котором выращивание бактерий Bacillus subtilis и/или семейства Lactobacillaceae проводят при температуре 30-40°С.

13. Способ по п. 9, в котором концентрат высушивают на алюмосиликатном сорбенте до такого состояния, что его влажность составляет не более 6% мас.

14. Способ по п. 9, в котором концентрат высушивают на алюмосиликатном сорбенте путем лиофилизации.

15. Способ п. 9, дополнительно включающий смешивание концентрата с инактивированными вегетативными клетками и спорами пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis и/или инактивированными клетками пробиотического штамма бактерий семейства Lactobacillaceae.

16. Способ по п. 15, в котором вегетативные клетки и споры пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis инактивируют путем инкубации осадка, полученного на этапе центрифугирования культуральной суспензии, при температуре 60-140°С в течение 5-120 мин.

17. Способ по п. 15, в котором клетки пробиотического штамма бактерий семейства Lactobacillaceae инактивируют путем инкубации осадка, полученного на этапе центрифугирования культуральной суспензии, при 60-120°С в течение 20-40 мин.

18. Способ по п. 16 или 17, в котором после инактивации вегетативные клетки и споры пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis и/или клетки пробиотического штамма бактерий семейства Lactobacillaceae высушивают до влажности не более 6% мас.

19. Способ по п. 9, в котором в качестве пробиотического штамма используют Bacillus subtilis ВКМ В-3536D, и/или Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335, и/или бактерии семейства Lactobacillaceae из следующего ряда: Lactobacillus reuteri GMNL-0902, Lactobacillus reuteri DSM-17648, Lactobacillus reuteri ATCC-55730, Lactobacillus reuteri SALR01, Lactobacillus plantarum ВКПМ В-11342, Lactobacillus plantarum SALP01.

20. Способ по п. 19, где инактивированные клетки и споры высушивают путем лиофилизации на сорбенте до содержания концентрата клеток в конечной композиции в диапазоне 0,1-7,0% по массе.

21. Способ по п. 9, где в качестве алюмосиликатного сорбента используют алюмосиликатный минерал, выбранный из группы: бентонит, смектит, цеолит.

22. Способ по п. 9, в котором используют частицы алюмосиликатного сорбента размером 0,005-0,5 мм.