ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS REUTERI SALR01, ОБЛАДАЮЩИЙ ПОДАВЛЯЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ HELICOBACTER PYLORI Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 A61K35/747 A61P1/04 C12R1/225 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящие изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к использованию штамма Lactobacillus reuteri SALR01, подходящего для создания пробиотиков и метабиотиков за счет антагонистического действия в отношении Helicobacter pylori.

Уровень техники

[0002] Активность бактерий Helicobacter pylori (далее H. pylori, или Нр) является одной из основных причин возникновения патологических процессов, приводящих к заболеваниям желудочно-кишечного тракта. Тем не менее, эрадикационное лечение H. pylori-ассоциированных заболеваний является лишь временной мерой, так как остается высокий риск заразится H. pylori вновь [1]. Также стало известно, что большинство людей, зараженных H. pylori, не имеют вышеназванных заболеваний [2]. Это и привело к выводу о том, что причина Hp-ассоциированных заболеваний лежит не в наличии H. pylori у пациента, а в повышенной активности данного патогена, вызванной в том числе дисбактериозом. Сейчас направлены большие усилия на разработку препаратов, которые могли бы помочь пациентам поддерживать баланс микробиоты желудочно-кишечного тракта, тем самым снизив проявление заболеваний. В составе пробиотиков для терапии Hp-ассоциированных заболеваний, таких как гастрит, дуоденит, язвенная болезнь и т.д., часто используют бактерии Lactobacillus reuteri (далее L. reuteri) и их метаболиты, в виду их неоднократно показанного антихеликобактерного действия [3]. L. reuteri представляют собой вид факультативных анаэробных грамположительных неспорообразующих молочнокислых бактерий, относящихся к нормальной микрофлоре толстой кишки человека и ряда животных. L. reuteri не является патогенным микроорганизмом [4].

[0003] Микроорганизмы семейства Lactobacillaceae выделяют бактериоцины в качестве метаболитов [5]. Они представляют собой катионные и амфипатические малые молекулы с антагонистической активностью против микроорганизмов, тесно связанных со штаммом-продуцентом. Эти метаболиты принадлежат в основном к семействам органических кислот, кетонов, спиртов, аминокислот и моносахаридов. Среди наиболее распространенных бактериальных молекул-метаболитов известны лактат, маннит, глицин, бетаин, ацетат, этанол, фенилаланин, формиат, уридин и изолейцин, а также аланин и валин. Одними из отличительных бактериоцинов L. reuteri являются противомикробные соединения реутерин и реутерициклин, подавляющие рост вредных грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также некоторых видов плесени, дрожжей и простейших [6]. L. reuteri секретирует реутерин в количествах, достаточных для ингибирования роста вредных микроорганизмов в ЖКТ, но при этом не оказывающих влияние на остальную микрофлору [7].

[0004] В данном изобретении предлагается новый штамм, относящийся к виду L. reuteri.

[0005] Известно множество штаммов вида L. reuteri: ATCC РТА 4660, ATCC РТА 4964, ATCC PTA 5289, ATCC 55730, DSM 17938, DSM 20016, DSM17648, NCIMB 30242, SD-RD830-FR, YLR001. В патенте RU 2 435 844 C2 (опубл.: 10.12.2011; МПК: C12N1/20; A61K35/74; A61P1/06; A61K47/44; C12R1/225) описан пробиотический продукт для терапии колик у новорожденных младенцев, полученного с использованием штамма L. reuteri DSM 17938 в качестве активного ингредиента. Полученный пробиотический продукт, полученный с использованием L. reuteri, уменьшал ежедневное время плача у младенцев, снижая избыточную активацию моторики кишечника путем стимуляции IL-10.

[0006] В настоящее время существует необходимость в расширении арсенала штаммов L. reuteri, обладающих антихеликобактерным действием.

Термины и сокращения

[0007] Дисбактериоз — это качественное и/или количественное изменение бактериальной микрофлоры в организме, перемещение различных ее представителей в несвойственные им места обитания, сопровождающееся метаболическими и иммунными нарушениями. Причем указанные нарушения не исчезают после устранения неблагоприятного фактора, вызвавшего дисбактериоз. Чаще всего под дисбактериозом подразумевают нарушение микрофлоры кишечника [8].

[0008] Живые микроорганизмы — вегетативные клетки и споры, если микроорганизмы спорообразующие или клетки неспорообразующих микроорганизмов, сохраняющие возможность осуществлять основные жизненные процессы.

[0009] Культуральная жидкость — жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих клеток [9].

[0010] Метабиотики — вещества, являющиеся структурными компонентами пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов, которые способны оптимизировать физиологические функции, метаболические, эпигенетические, информационные, регуляторные, транспортные, иммунные, нейрогормональные, и/или поведенческие реакции, связанные с деятельностью симбиотической (индигенной) микрофлоры организма-хозяина [10].

[0011] Микрофлора (микробиота) — совокупность различных видов микроорганизмов, населяющих определенную среду обитания. Постоянно живущие в симбиозе с хозяином микроорганизмы называются нормальной, или симбиотической, микрофлорой [11]. В данном тексте термин «микрофлора» относится к микрофлоре желудочно-кишечного тракта.

[0012] Пробиотики — функциональный пищевой ингредиент в виде полезных для человека непатогенных и нетоксикогенных живых микроорганизмов, обеспечивающий при систематическом употреблении в пищу в виде препаратов или в составе пищевых продуктов благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника [12].

[0013] Ультрафильтрация — процесс мембранного разделения, а также фракционирования и концентрирования веществ, осуществляемый путем фильтрования жидкости под действием разности давлений до и после мембраны. При этом размер выделяемых частиц (т.е. частицы какого размера не проходят через фильтр, а остаются в концентрате) составляет приблизительно 0,001 – 0,05 мкм (5 – 500 кДа).

[0014] ЖКТ — желудочно-кишечный тракт.

[0015] КОЕ — колониеобразующая единица.

[0016] ПЦР — полимеразная цепная реакция.

[0017] B. subtilis — Bacillus subtilis.

[0018] H. pylori — Helicobacter pylori.

[0019] L. reuteri — Lactobacillus reuteri.

Сущность изобретения

[0020] Задачей настоящего изобретения является выделение нового штамма бактерий L. reuteri для создания пробиотиков и метабиотиков для лечения и/или профилактики Hp-ассоциированных заболеваний.

[0021] Данная задача решается заявленным изобретением за счет достижения такого технического результата, как возможность применения нового штамма L. reuteri SALR01 для создания пробиотиков и метабиотиков для лечения и/или профилактики Hp-ассоциированных заболеваний.

[0022] Заявленный технический результат достигается за счет антагонистического действия штамма L. reuteri SALR01 в отношении H. pylori, а также адаптацией штамма L. reuteri SALR01 для культивирования в лабораторных и промышленных питательных средах.

Описание чертежей

[0023] Объект притязаний по настоящей заявке описан по пунктам и чётко заявлен в формуле изобретения. Упомянутые выше задачи, признаки и преимущества изобретения очевидны из нижеследующего подробного описания, в сочетании с прилагаемыми чертежами, на которых показано:

[0024] На Фиг. 1 представлены результаты исследования по оценке эффективности применения заявленной композиции при лечении хеликобактериоза на модели монгольских песчанок.

Подробное описание изобретения

[0025] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения перечислены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако квалифицированному в предметной области специалисту очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.

[0026] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.

[0027] Заявленный штамм L. reuteri SALR01 депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, обособленного подразделения Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук» под регистрационным номером ВКМ В-3734D.

[0028] Заявленный штамм выделен из содержимого кишечника человека. При этом заявленный штамм получил название L. reuteri SALR01. Следует понимать, что названия «L. reuteri ВКМ В-3734D» и «L. reuteri SALR01» обозначают один и тот же штамм.

[0029] Штамм L. reuteri SALR01 является диким штаммом с неизменными свойствами. Заявленный штамм представляет собой грамположительные, неподвижные короткие изогнутые палочки (2,0 – 5,0 x 0,7 – 1,0 мкм) с округлыми концами, расположенные одиночно, парно или в коротких цепочках. Спор не образуют, при глубинном посеве на полужидкую питательную среду образуют крошкообразные колонии диаметром 1 – 2 мм. Оптимальная температура роста + 37℃.

[0030] Штамм L. reuteri SALR01 может расти при 37±2℃ в анаэробной атмосфере на модифицированной питательной среде MRS для лактобактерий и рН 6,8 – 6,9. Заявленный штамм обладает следующими биохимическими признаками: факультативный анаэроб, облигатно гетероферментативный. Ферментирует глюкозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, арабинозу, рибозу. Не ферментирует ксилозу, треалозу, маннозу, целлобиозу.

[0031] В рамках заявленного изобретения штамм L. reuteri SALR01 был адаптирован под культивирование в лабораторных и промышленных питательных средах. В одном варианте реализации штамм L. reuteri SALR01 культивируют на твердой питательной среде. При этом может быть использована среда MRS для лактобактерий с добавлением агар-агара в количестве 15 г/л. При этом культивирование штамма на твердой питательной среде проводят посевом с использованием метода штрихов.

[0032] В другом варианте реализации штамм L. reuteri SALR01 культивируют в жидкой питательной среде. При этом жидкая среда для культивирования штамма L. reuteri SALR01 может иметь исходный рН 6,8 – 6,9. В состав жидкой питательной среды входят: пептон, дрожжевой экстракт, сахароза, мясо-пептонный бульон, аммоний лимоннокислый, сульфат магния, хлорид кальция, сульфат марганца, калиевые соли ортофорсфорной кислоты, ацетат натрия, гидроксид натрия и вода.

[0033] В одном варианте реализации питательная среда может дополнительно включать факторы роста и/или специальные добавки. В предпочтительном варианте реализации питательная среда не включает дополнительных компонентов.

[0034] Способ хранения штамма L. reuteri SALR01 периодическими пересевами с хранением культуры в холодильнике при 4 – 6℃, либо в лиофилизированном состоянии.

[0035] Способ получения инактивированных клеток штамма L. reuteri SALR01 включает следующие этапы. Штамм L. reuteri SALR01 культивируют в жидкой питательной среде. После завершения культивирования культуру охлаждали до 10°С, затем культуральную суспензию подвергают центрифугированию на проточной центрифуге. Полученные клетки инактивируют нагреванием при 80℃ в течение 40 минут.

[0036] Штамм L. reuteri SALR01 может применяться для получения пробиотиков и/или метабиотиков, действие которых основано на подавлении активности H.pylori. Тем не менее, применимость данного штамма не ограничивается только лечением хеликобактериоза, но может быть использован для подавления других патогенных и/или условно-патогенных микроорганизмов.

ПРИМЕРЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0037] Пример 1. Генетический анализ L. reuteri SALR01.

[0038] Для идентификации заявленного штамма было проведено выделение ДНК из культуры клеток L. reuteri SALR01 [13]. Затем на приборе GeneAmp PCR System 2700 («Applied Biosystems», США) методом ПЦР амплифицировали фрагмент гена gyrB с использованием универсальных праймеров Up1F и UP2R. Определение нуклеотидной последовательности продукта ПЦР проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с праймером Up1S и последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Нуклеотидную последовательность фрагмента гена gyrB заявленного штамма L. reuteri SALR01 сравнивали с нуклеотидными последовательностями аналогичных фрагментов гена gyrB штаммов Lactobacillus reuteri DSM 20016, Limosilactobacillus reuteri strain reuteri (CP045049), Limosilactobacillus reuteri SD-RD830-FR (CP080621), Limosilactobacillus reuteri YLR001 (CP065540). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов гена gyrB выполняли в программе BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Определение филогенетического положения штаммов и процента сходства проводили с использованием программы «TaxonDC 1.3.1» [14]. Филогенетический анализ показал высокое сходство заявленного штамма L. reuteri SALR01 со всеми вышеперечисленными штаммами: для Lactobacillus reuteri DSM 20016 99,95% гомологии, для Limosilactobacillus reuteri strain reuteri (CP045049), Limosilactobacillus reuteri SD-RD830-FR (CP080621), Limosilactobacillus reuteri YLR001 (CP065540) — 100% (Таблица 1).

[0039]

Таблица 1. Сравнение штаммов по сходству нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Limosilactobacillus reuteri strain reuteri (CP045049) Limosilactobacillus reuteri SD-RD830-FR (CP080621) Limosilactobacillus reuteri YLR001 (CP065540) Lactobacillus reuteri DSM 20016 L. reuteri SALR01 100% 100% 100% 99,95%

[0040] Пример 2. Получение инактивированных клеток штамма L. reuteri SALR01, высушенных на мальтодекстрине.

[0041] Для получения инактивированных клеток, извлеченных из культуральной жидкости, использовали штамм L. reuteri SALR01. Выращивание культуры проводили при температуре 36 ± 1°С в течение 24 ч. До начала культивирования с помощью щелочи доводили рН питательной среды до 6,8 – 7,0. Культивирование проводили в ферментере АНКУМ 210 в объеме питательной среды 10 л. Общее время накопления биомассы в реакторе 18 ч. Завершением процесса культивирования считали отсутствие падения pH от заданного.

[0042] После завершения культивирования культуру охлаждали до 10°С. Титр клеток в культуре составил 6х10⁹ КОЕ/мл. Далее проводили разделение культуральной жидкости на проточной ультрацентрифуге GF105B. После процесса ультрацентрифугирования получили осадок. Титр в осадке составил 2,5х10¹⁰ КОЕ/мл. Осадок смешали со стерильной дистиллированной водой, получили суспензию клеток. Клетки инактивировали нагреванием при 80°С в течение 40 минут. Физиологически допустимый носитель — мальтодекстрин — смешивали с дистиллированной водой. К полученной смеси добавляли инактивированные клетки. Анализ КОЕ перед лиофилизацией показал отсутствие жизнеспособных клеток. Лиофилизацию смеси носителя и инактивированных клеток проводили на установке TG-50 при стандартных параметрах лиофилизации. На выходе получили инактивированные клетки, извлеченные из культуральной жидкости, высушенные на мальтодекстрине, с влажностью 2%.

[0043] Пример 3. Оценка антихеликобактерного эффекта композиций, полученных с использованием штамма L. reuteri SALR01, на модели монгольских песчанок.

[0044] Монгольские песчанки представляют собой эффективную модель изучения патогенеза H. pylori, отражающую многие черты воспаления тканей желудка, вызываемых H. pylori у человека. Животных заражали двукратным (через день) внутрижелудочным введением бактериальной суспензии H. pylori. После двукратного заражения за животными наблюдали в течение 11-ти недель. К 12-й неделе после заражения у животных наблюдалось развитие гастрита и язвенных поражений тканей желудка. С 12-й недели начинали введение исследуемых субстанций в соответствии со схемой (Таблица 2). Исследуемая субстанция представляла собой смесь инактивированных клеток штамма L. reuteri SALR01 и физиологически допустимого носителя.

[0045] Физиологически допустимым носителем являлся крахмал в количестве 1% мас. В качестве позитивного контроля использовали препараты стандартной эрадикационной терапии H. pylori у человека, которая включает в себя ингибитор протонной помпы омепразол и антибиотики кларитромицин и амоксициллин. В качестве негативного контроля использовали просто носитель. Также исследовали воздействие указанной субстанции в сочетании с препаратами позитивного контроля.

[0046]

Таблица 2. Схема заражения монгольских песчанок и характеристика полученных модельных групп Группы Число животных Исследуемая субстанция Доза на животное (мг/кг) Схема введения Интактные 3 – – – Негативный контроль 7 Носитель 0 Ежедневно в течение 28 дней до эвтаназии Позитивный контроль 7 Омепразол 60 Ежедневно в течение 14 дней (начало – за 28 дней до эвтаназии) Кларитромицин 100 Амоксициллин 40 Субстанция 7 L. reuteri
+ носитель 6,6 Ежедневно в течение 28 дней до эвтаназии Субстанция
+ позитивный контроль 7 Омепразол 60 Ежедневно в течение 14 дней (начало – за 28 дней до эвтаназии) Кларитромицин 100 Амоксициллин 40 L. reuteri
+ носитель 6,6 Ежедневно в течение 28 дней до эвтаназии

[0047] Носитель, препараты позитивного контроля и исследуемую субстанцию вводили песчанкам внутрижелудочно, поскольку этот способ является аналогом перорального способа применения у человека. По окончании эксперимента животных выводили из эксперимента для гистологического исследования тканей желудка и двенадцатиперстной кишки. Оценка состояния желудка проводилась по следующим параметрам: площадь воспаления; макроскопические изменения слизистой; морфологические изменения (степень воспаления; активность воспаления; атрофия желудочных желёз; метаплазия; обсеменение слизистой оболочки H. pylori). Для морфологической оценки степени выраженности патологии использовали визуально-аналоговые шкалы, предложенные в Сиднейской системе. В данном случае применяли балльную систему оценки: 0 – норма; 1 – слабо выраженная; 2 – умеренная; 3 – выраженная.

[0048] При макроскопической оценке тканей желудка и двенадцатиперстной кишки во всех экспериментальных группах видимых патологических изменений не обнаружили. Результаты микроскопических гистологических исследований приведены в Таблице 3.

[0049]

[0050] Медиана, верхний и нижний квартиль (Me (Q₁; Q₃)) указаны в белых ячейках, сумма баллов в группе указана в серых ячейках; а – достоверное отличие от интактной группы мышей, (p<0,05); b – достоверное отличие от группы негативного контроля (p<0,05). В интактной группе мышей, не подвергавшихся заражению и лечению, строение стенки желудка соответствовало норме. В группе негативного контроля у всех животных были выявлены морфологические изменения слизистой оболочки желудка, характерные для катарального гастрита различной степени выраженности: от слабого до умеренного, с тенденцией к хронизации процесса. Развитие инфекции у животных группы негативного контроля привело к формированию преимущественно пангастрита (площадь воспаления 3, средний балл 15, Таблица 3). В данной группе отмечали достоверное увеличение степени выраженности патологических изменений, степени и активности воспаления, атрофии желудочных желез и обсеменения слизистой оболочки желудка H. pylori по сравнению с интактной группой (p<0,05). В группе позитивного контроля происходило значимое снижение показателей по всем исследованным критериям по сравнению с группой негативного контроля.

[0051] На Фиг.1 представлены диаграммы размаха суммарных показателей выраженности патологических симптомов для исследуемых субстанций. Негативному контролю соответствует бокс-плот 1. Позитивному контролю соответствует бокс-плот 2. Субстанции (L. reuteri + носитель) соответствует бокс-плот 3. Сочетание субстанции и позитивного контроля отвечает бокс-плоту 4. По оси ординат высота диаграмм соответствует суммарной выраженности патологических симптомов в баллах визуально-аналоговой шкалы. Указаны средние значения и медиана экспериментов, по семь повторов в каждом эксперименте.

[0052] При монотерапии субстанцией (L. reuteri + носитель) наблюдалось достоверное снижение большинства исследованных показателей: площади и активности воспаления, морфологических изменений желудка и степени обсеменения слизистой оболочки желудка H. pylori по сравнению с негативным контролем. При этом не наблюдалось достоверных отличий между группой позитивного контроля и монотерапией субстанцией. Монотерапия субстанцией уступала позитивному контролю только по снижению степени воспаления.

[0053] Комбинированная терапия субстанцией вместе с препаратами позитивного контроля превосходила позитивный контроль по некоторым показателям. Так, добавление исследуемой субстанции к препаратам позитивного контроля более эффективно снижало активность воспаления, выраженность атрофии желудочных желез, а также степень обсеменения слизистой оболочки желудка H. pylori (Таблица 3).

[0054] Полученные данные показывают, что композиция, включающая L. reuteri, может снижать проявления инфекции H. pylori в монотерапии, а также увеличивает эффективность лечения препаратами стандартной эрадикационной терапии H. pylori.

[0055] Пример 4. Оценка эффективности применения композиции на основе инактивированных клеток штамма L. reuteri SALR01 в терапии у пациентов с хроническим гастритом или функциональной диспепсией, ассоциированных с инфекцией H. pylori.

[0056] В данном примере проводили открытое рандомизированное проспективное контролируемое исследование эффективности и безопасности заявленной композиции с участием пациентов с функциональной диспепсией и/или хроническим гастритом, ассоциированных с инфекцией H. pylori. Использованная в примере композиция включала инактивированные клетки пробиотического штамма L. reuteri SALR01, комплекс метаболитов пробиотического штамма B. subtilis ВКМ B-3536D, и физиологически допустимый носитель, включающий цитрат тригидрата цинка, а также фруктоолигосахариды. В исследование было включено 40 пациентов обоих полов в возрасте от 18 до 65 лет включительно с подтверждённым диагнозом функциональная диспепсия или хронический гастрит, и с положительным анализом на наличие ДНК H. pylori в кале методом ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Отдельным требованием для пациентов было отсутствие в анамнезе ранее проведённой эрадикационной терапии менее чем за год до скрининга.

[0057] Все пациенты были поровну разбиты на экспериментальную группу 1 и контрольную группу 2. Пациенты из экспериментальной группы 1 в течение 14 дней получали заявленную композицию 2 раза в сутки утром и вечером после еды дополнительно к стандартной трёхкомпонентной эрадикационной терапии первой линии (эзомепразол 20 мг перорально 2 раза в сутки утром и вечером после еды, амоксициллин 1000 мг 2 раза в сутки утром и вечером после еды, кларитромицин 500 мг 2 раза в сутки утром и вечером после еды). Следующие 14 дней после окончания терапии пациенты данной группы получали заявленную композицию 2 раза в сутки утром и вечером после еды в качестве монопрепарата. Пациенты из контрольной группы 2 получали в течение 14 дней эрадикационную терапию, включающую эзомепразол 20 мг перорально 2 раза в сутки утром и вечером после еды, амоксициллин 1000 мг перорально 2 раза в сутки утром и вечером после еды, кларитромицин 500 мг перорально 2 раза в сутки утром и вечером после еды. Выраженность симптомов, характерных для хронического гастрита или функциональной диспепсии оценивали с помощью опросников, которые все пациенты заполняли перед началом эксперимента и через 28 дней от начала эксперимента (Таблица 4).

[0058]

Таблица 4. Динамика гастроинтестинальных жалоб у пациентов основной и контрольной группы Жалобы Момент наблюдения (начало / окончание курса терапии) Количество пациентов, абс. (%) Значимость различий между группами, p Экспериментальная группа, n=20 Контрольная группа, n=20 Избыточное отхождение газов начало 8 (40) 7 (35) 0,005** окончание 0 (0) 10(50) Урчание в животе начало 11(55) 11(55) <0,001** окончание 2 (10) 14(70) Боли в животе начало 15 (75) 16(80) 0,336 окончание 4(20) 5 (25) Чувство тяжести в животе начало 14(70) 12(60) 0,7150 окончание 5(25) 5(25) Отрыжка начало 7(35) 9(45) 0,439 окончание 3(15) 4 (25) Изжога начало 8(40) 8 (40) 0,234 окончание 2 (10) 0 (0) Тошнота начало 7(45) 6 (30) 0,017 окончание 2 (10) 9(45) Рвота начало 0 (0) 0 (0) – окончание 0 (0) 0 (0) Неприятный привкус во рту начало 0 (0) 2 (13) – окончание 0 (0) 0 (0) Склонность к запорам начало 6(30) 7(35) – окончание 0(0) 0 (0) Склонность к диарее начало 8(40) 8 (40) 0,002** окончание 4(20) 14(70) Снижение работоспособности начало 10(50) 6(30) 0,5 окончание 5 (25) 4(20) Слабость начало 9(45) 6(30) 0,358

[0059] Статистическое сравнение эффектов терапии в экспериментальной и контрольной группах показало, что применение заявленной композиции достоверно облегчало такие симптомы, как избыточное отхождение газов, урчание в животе и склонность к диарее. При этом в экспериментальной группе частота данных симптомов снизилась после курса терапии по сравнению с моментом начала терапии. В то же время в контрольной группе указанные симптомы стали встречаться чаще после прохождения терапии, чем вначале. Это свидетельствует о том, что стандартная эрадикационная терапия нарушает работу ЖКТ. Вероятнее всего, это связано с дисбактериозом, вызванным антибиотиками широкого спектра. При этом применение заявленной композиции вместе с препаратами стандартной эрадикационной терапии снижало частоту практически всех симптомов после прохождения терапии. Это может быть связано с облегчением или предотвращением дисбактериоза, благодаря благотворному влиянию заявленной композиции на представителей нормальной микрофлоры кишечника в условиях принятия антибиотиков.

[0060] Пример 5. Изучение воздействия штамма L. reuteri SALR01 на ингибирование роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры.

[0061] В данном примере изучали способность штамма L. reuteri SALR01 подавлять рост индикаторных культур. Исследование проводили с использованием адаптированного метода стандартных дисков для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Использованные в данном примере индикаторные культуры представлены патогенными и условно-патогенными для человека микроорганизмами различной исходной локализации (кишечник, ротовая полость, кожа, урогенитальный тракт). Для реализации метода индикаторные культуры помещали на поверхность агаризованной питательной среды Луриа-Бертани в чашке Петри в количестве 10⁷ КОЕ. После застывания чашки Петри подсушивали в течение 15 минут при 37°С. Затем на поверхность питательной среды с индикаторными культурами в виде капель диаметром 5±1 мм наносили по 10 мкл культуры штамма L. reuteri SALR01, выращенной в жидкой питательной среде.

[0062] Чашки Петри с нанесенными растворами оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капель и затем инкубировали при 37⁰С в течение 24 – 48 часов. Детекцию результатов проводили путем определения наличия зоны задержки роста индикаторных культур вокруг области нанесения культуры L. reuteri SALR01. Появление зон, свободных от индикаторных культур, вокруг области нанесения культуры свидетельствуют об антагонистической активности L. reuteri SALR01 в отношении индикаторных культур, указанных в Таблице 5.

[0063] Из Таблицы 5 видно, что штамм L. reuteri SALR01 способен подавлять рост ряда патогенных и условно-патогенных бактерий различной локализации. Среди них условно-патогенный штамм Enterococcus faecium, клинические изоляты патогена Staphylococcus aureus, два специфических патогена женского урогенитального тракта вида Streptococcus agalactiae, относящиеся к наиболее опасным возбудителям неонатальных инфекций, патогенные штаммы ротовой полости Streptococcus mutans и Streptococcus gordonii, участвующие в патогенезе кариеса и пародонтита. Эти данные показывают наличие у штамма L. reuteri SALR01 разнообразного спектра антагонистической активности, обеспечивающего его эффективность в профилактике различных инфекционных заболеваний.

[0064]

Таблица 5. Наличие зоны задержки роста индикаторных культур L. reuteri SALR01 Локализация патогена Тест-культура Задержка роста Кишечник и другие локусы Escherichia coli АТСС 25922 –* Enterococcus faecium 247 +** Enterococcus faecalis 267 – Enterococcus faecalis cl.is. 1 – Klebsiella oxytoca cl. is. – Кожа Staphylococcus aureus 3.2 ±*** Staphylococcus aureus 4.1 ± Staphylococcus epidermidis 3.1 – Урогенитальный тракт женщин Candida albicans cl.is. – Streptococcus agalactiae 42 – Streptococcus agalactiae 30 + Streptococcus agalactiae 9177 + Ротовая полость Streptococcus mutans 43 + Streptococcus gordonii 221 + Streptococcus mitis cl.is. 1 –

Примечание:

* отсутствие задержки роста

** наличие зоны подавления роста индикаторной культуры (бактерицидное действие)

*** неполное подавление роста индикаторной культуры (бактериостатическое действие)

[0065] Пример 6. Исследование безвредности, токсичности, аллергенности и токсигенных свойств штамма L. reuteri SALR01.

[0066] Для определения безвредности культуру бактерий L. reuteri SALR01 вводили перорально белым мышам (10 самок массой 14 – 16 г) в дозе 0,5 мл. Наблюдение за животными в течение 5 суток показало, что введение штамма молочнокислых бактерий L. reuteri SALR01 не вызывало гибели животных, признаков интоксикации и снижения групповой массы тела животных по сравнению с исходной. Таким образом, результаты показали, что исследуемый штамм молочнокислых бактерий является непатогенным и безвредным для лабораторных животных.

[0067] Для определения токсикогенности культуру бактерий L. reuteri SALR01 вводили крысам (10 животных одного пола массой 250 – 300 г) подкожно в дозе 0,5 мл, в качестве контроля использовали стерильный физиологический раствор, который вводили так же в дозе 0,5 мл. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток. В период наблюдения не было выявлено гибели животных. Таким образом, результаты показали, что исследуемый штамм молочнокислых бактерий L. reuteri SALR01 не обладает токсикогенными свойствами.

[0068] Для определения токсичности инактивированную нагреванием культуру бактерий L. reuteri SALR01 вводили белым крысам (10 животных одного пола массой 250 – 300 г) внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. За животными вели наблюдение в течение 7 дней. В течение всего срока наблюдения гибель подопытных животных и признаки интоксикации отсутствовали; групповая масса тела животных по сравнению с исходной не снижалась. В связи с этим, нами сделано заключение, что исследуемый штамм молочнокислых бактерий L. reuteri SALR01 в дозе 10¹⁰ убитых клеток не обладает токсичностью.

[0069] Для определения аллергенности культуру бактерий L. reuteri SALR01 наносили однократно на боковую поверхность туловища крыс одного пола (10 животных массой 250 – 300 г) в дозе 0,02 мл. Реакцию учитывали визуально через 24 часа. В период наблюдения не выявлено аллергических отеков и эритемы тканей на месте нанесения бактерий у животных, что свидетельствует об отсутствии аллергенности.

[0070] Для определения раздражающего действия на кожные покровы культуру бактерий L. reuteri SALR01 наносили однократно на кожу крыс (10 животных массой 180 – 200 г) в дозе 0,1 мл. Реакция кожи регистрировалась по окончании экспозиции, через 1 час и через 16 часов после однократного нанесения. В течение всего срока наблюдения признаки раздражающего действия- эритема и отек кожи животных в месте нанесения испытуемого препарата образца отсутствовали.

[0071] В другой модели определяли раздражающее действие на конъюнктиву изучаемого штамма L. reuteri SALR01 путем однократного нанесения культуры бактерий в конъюнктивальный мешок глаза крыс (10 животных массой 180 – 200 г) в дозе 0,02 мл. Состояние слизистой оболочки глаза наблюдали ежедневно в течение 14 дней. В течение всего срока наблюдения признаки раздражающего действия — отек, гиперемия и другие изменений слизистой оболочки глаза животных — не были зафиксированы.

[0072] Пример 7. Изучение антихеликобактерной коагрегационной активности in vitro штамма L. reuteri SALR01.

[0073] Изучение способности к коагрегации между L. reuteri SALR01 и H. pylori проводили по адаптированной методике теста на коаггрегацию в искусственном желудочном соке [15].

[0074] Использовались клинические изоляты, полученные от больных с патологией желудка H. pylori-362 и H. pylori-420. Пассирование штаммов H. pylori осуществляли на кровяной питательной среде (5 – 7% лошадиная кровь, основа агара Columbia, 1 % IsoVitalex (Becton Dickinson, USA)). Инкубацию посевов осуществляли в микроаэрофильных условиях при содержании кислорода около 5 %, используя анаэростаты системы GasPak100 (BBL CampyPak System, Becton Dickinson, USA). Для создания в анаэростате микроаэрофильных условий использовали систему атмосферной генерации для in vitro диагностики CampyGen 2.5 L (Oxoid LTD, UK). После загрузки анаэростаты размещали в термостате при температуре 37°С, оптимальной для роста H. pylori. Длительность инкубирования штаммов H. pylori с образованием минимального количества коккоидных форм составила 3-4 суток.

[0075] В качестве положительного и отрицательного контроля использовали лиофилизированные инактивированные субстанции штаммов L. reuteri DSM17648 и L. plantarum SALP01, соответственно. В качестве тестируемых образцов использовали инактивированные разными способами субстанции штамма L. reuteri SALR01, высушенные по разной технологии. Навески лиофилизатов ресуспендировали в буфере PBS и инкубировали 2 ч при комнатной температуре для регидратации. Клетки промывали и ресуспендировали в буфере PBS с получением раствора с OD₆₀₀ = 4,0.

[0076] Далее тест проводили согласно указанной методике. Ни один из исследованных штаммов и образцов не показал автоагрегации, что свидетельствует о качественной подготовке образцов для теста. Тесты показали одинаковые результаты с обоими использованными штаммами H. pylori-362 и H. pylori-420. Обобщенные результаты 3 независимых экспериментов показаны в Таблице 6.

[0077]

Таблица 6. Степень коагрегации L. reuteri SALR01 к H. pylori. Образец Степень коаггрегации, % Название Инактивация Сушка Негативный контроль (L.plantarum SALP01) Т°С Л 0% Позитивный контроль (L.reuteri DSM17648) Т°С Р 75-100% L. reuteri SALR01 Т°С Л 50-75% Т°С Р 75% * Н₂О₂ Л 50-75%

Примечания:

Т°С — инактивация температурой;

Н₂О₂ — инактивация перекисью водорода;

Л — лиофильная сушка;

Р — сушка распылением;

* — образец оценивали в одном эксперименте.

[0078] Образцы штаммов негативного и позитивного контроля показали ожидаемые результаты, что свидетельствует о корректности проведения эксперимента. Образцы штамма L. reuteri SALR01 показали результаты сравнимые с позитивным контролем. Это доказывает, что высушенные инактивированные клетки штамма L. reuteri SALR01 проявляют антихеликобактерную коагрегационную активность.

[0079] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.

Источники информации:

1. Циммерман Я.С. Нерешенные и спорные проблемы современной гастроэнтерологии. – М.: МЕДпресс-информ, 2013. – 224 с.

2. Algood H.M., Cover T.L. Helicobacter pylori persistence: an overview of interactions between H. pylori and host immune defenses. Clin Microbiol Rev, 2006, 19(4): 597-613.

3. Kandler O., Stetter K., Kohl R. Lactobacillus reuteri sp. nov. a new species of heterofermentative lactobacilli. ZBL. Bakt. Hyg. Abt. Orig., 1980, C1: 264–9.

4. Dore M.P., Cuccu M., Pes G.M. et al. Lactobacillus reuteri in the treatment of Helicobacter pylori infection. Intern Emerg Med 9, 2014, 649–654.

5. Cotter P., Ross R., Hill C. Bacteriocins — a viable alternative to antibiotics? // Nat Rev Microbiol, 2012, 11, 95–105.

6. Talarico T.L., Dobrogosz W.J. Chemical characterization of an antimicrobial substance produced by Lactobacillus reuteri. // Antimicrob Agents Chemother 33, 1989.

7. Casas I.A., Dobrogosz W.J. Validation of the Probiotic Concept: Lactobacillus reuteri Confers Broad-spectrum Protection against Disease in Humans and Animals. // Microbial Ecology in Health and Disease, 2000, 12:4, 247-285.

8. Хурса Р.В., Месникова И.Л., Микша Я.С. Кишечная микрофлора: роль в поддержании здоровья и развитии патологии, возможности коррекции: учеб.-метод. пособие. Минск : БГМУ, 2017, 36 с.

9. Тарантул В.З. и др. Словарь биотехнологических терминов. Москва: ИНИЦ Роспатента, 2005, 126 с.

10. Шендеров Б.А., Ткаченко Е.И., Лазебник Л.Б., Ардатская М.Д., Синица А.В., Захарченко М.М. Метабиотики - новая технология профилактики и лечения заболеваний, связанных с микроэкологическими нарушениями в организме человека. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2018, 151(3), 83-92.

11. Фирсов Н.Н. Микробиология: словарь терминов. Москва: Дрофа, 2026, 256 с.

12. ГОСТ Р 52349-2005 Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины и определения (с Изменением N 1) // ГОСТ Р от 31 мая 2005 г. № 52349-2005.

13. Ausubel F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, New York (1994).

14. Tarlachkov S.V., Starodumova I.P. TaxonDC: calculating the similarity value of the 16S rRNA gene sequences of prokaryotes or ITS regions of fungi. // Journal of Bioinformatics and Genomics, 2017, 3(5).

15. Holz, C., Busjahn, A., Mehling, H., Arya, S., Boettner, M., Habibi, H., & Lang, C. Significant Reduction in Helicobacter pylori Load in Humans with Non-viable Lactobacillus reuteri DSM17648: A Pilot Study. // Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2015, 7(2), 91–100.

Изобретения относятся к области биотехнологии. Предложен штамм Lactobacillus reuteri ВКМ В-3734D, обладающий антагонистическим действием в отношении Helicobacter pylori. При этом штамм нетоксичен для клеток млекопитающих. Это обеспечивает возможность применения заявленного штамма для создания пробиотиков и метабиотиков. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 7 пр.

1. Штамм Lactobacillus reuteri SALR01, депонированный во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, обособленного подразделения Федерального исследовательского центра «Пущинский научный центр биологических исследований Российской Академии наук» под регистрационным номером ВКМ В-3734D, обладающий антагонистическим действием в отношении Helicobacter pylori.

2. Применение штамма Lactobacillus reuteri SALR01 ВКМ B-3734 D для получения пробиотиков или метабиотиков.