СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ T-КЛЕТОК ДЛЯ T-КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2025 года по МПК C12N5/783 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/895381, поданной 3 сентября 2019 года, содержание которой настоящим включено посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[002] Настоящее изобретение относится к способам получения одной или более Т-клеток для Т-клеточной терапии. В частности, настоящее изобретение относится к способу повышения процентной доли по меньшей мере одного подтипа Т-клеток в клеточной популяции посредством приведения клеточной популяции, характеризующейся предварительно определенной плотностью клеток, в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 в концентрации, выбранной для повышения процентной доли подтипа Т-клеток.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[003] Виды рака человека по своей природе состоят из нормальных клеток, которые претерпели генетическое или эпигенетическое преобразование при превращении в аномальные раковые клетки. При этом раковые клетки начинают экспрессировать белки и другие антигены, которые отличаются от экспрессируемых нормальными клетками. Данные аберрантные опухолевые антигены могут использоваться врожденной иммунной системой организма для специфического нацеливания и уничтожения раковых клеток. Однако раковые клетки используют различные механизмы для предотвращения успешного нацеливания иммунных клеток, таких как Т- и В-лимфоциты, на раковые клетки.

[004] Виды Т-клеточной терапии человека основаны на Т-клетках человека, обогащенных или модифицированных в условиях ex vivo для нацеливания и уничтожения раковых клеток у субъекта, например пациента. Были разработаны различные технологии для повышения концентрации встречающихся в природе Т-клеток, способных нацеливаться на опухолевый антиген, или генетической модификации Т-клетки, чтобы обеспечить их специфическое нацеливание на известный раковый антиген. Было доказано, что данные виды терапии являются перспективными с точки зрения оказания влияния на размер опухоли и выживаемость пациентов.

[005] Трансплантация смешанной популяции Т-клеток является одним из факторов, которые могут затруднять полное раскрытие потенциала видов Т-клеточной терапии. При традиционных видах Т-клеточной терапии донорские Т-клетки собирают, необязательно модифицируют для нацеливания на специфический антиген (например, опухолевую клетку) или их отбирают по противоопухолевым характеристикам (например, инфильтрирующие опухоль лимфоциты), размножают в условиях in vitro и вводят субъекту, нуждающемуся в этом. Как правило, полученные Т-клетки содержат смешанную популяцию преимущественно зрелых клеток, многие из которых являются окончательно дифференцированными. Вследствие этого, ожидаемая персистенция данных клеток в условиях in vivo может быть ограниченной, а первоначально наблюдаемые положительные эффекты со временем могут исчезнуть, поскольку опухоли восстанавливаются в отсутствие трансплантированных Т-клеток. Таким образом, остается потребность в продлении персистенции Т-клеток в условиях in vivo для применения в Т-клеточной терапии.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[006] В настоящем изобретении представлен способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в клеточной популяции, включающий: 1) приведение некоторого объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с некоторым объемом исходной клеточной популяции при некотором объемном отношении, где исходная клеточная популяция характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл, а объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 17,4 объема исходной клеточной популяции или меньше, и 2) культивирование клеточной популяции в культуральной среде, при этом полученная популяция Т-клеток содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй популяцией Т-клеток, где вторую исходную клеточную популяцию при той же плотности клеток приводят в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 17,5 объема второй исходной клеточной популяции или больше.

[007] В настоящем изобретении представлен способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в клеточной популяции, включающий: 1) приведение некоторого объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с некоторым объемом исходной клеточной популяции при некотором объемном отношении, где исходная клеточная популяция характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл, а объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 17,4 объема исходной клеточной популяции или меньше, и 2) культивирование клеточной популяции в культуральной среде, при этом полученная популяция Т-клеток содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй популяцией Т-клеток, где вторую исходную клеточную популяцию при той же плотности клеток приводят в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 17,5 объема второй исходной клеточной популяции или больше, дополнительно включающий трансдукцию и/или трансфекцию исходных клеточных популяций до, во время или после культивирования исходных клеточных популяций с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28.

[008] В настоящем изобретении дополнительно представлен способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в популяции РВМС, включающий: 1) приведение некоторого объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с некоторым объемом исходной популяции РВМС при некотором объемном отношении, где исходная популяция РВМС характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,50×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,00×10⁶ клеток/мл, а объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 5 или 10 объемам исходной клеточной популяции, и 2) культивирование популяции РВМС в культуральной среде в течение 14-18 дней, при этом полученная популяция РВМС содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй популяцией РВМС, где вторую исходную популяцию РВМС при той же плотности клеток приводят в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 20 или 40 объемам второй исходной популяции РВМС, и культивируют в течение того же числа дней.

[009] В настоящем изобретении дополнительно представлен способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в популяции очищенных Т-клеток, включающий: 1) приведение некоторого объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с некоторым объемом исходной популяции очищенных Т-клеток при некотором отношении, где исходная популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,80×10⁶ клеток/мл до приблизительно 1,60×10⁶ клеток/мл, а объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 10 или 15 объемам исходной клеточной популяции, и 2) культивирование популяции очищенных Т-клеток в культуральной среде в течение 11-18 дней, при этом полученная популяция очищенных Т-клеток содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй популяцией очищенных Т-клеток, где вторую исходную популяцию очищенных Т-клеток при той же плотности клеток приводят в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 20, 25 или 50 объемам второй исходной популяции Т-клеток, и культивируют в течение того же числа дней.

[010] В настоящем изобретении дополнительно представлен способ лечения, включающий введение терапевтически эффективного количества полученной обогащенной Tscm популяции Т-клеток субъекту, нуждающемуся в этом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[011] На фиг. 1 представлена столбчатая диаграмма, на которой показан общий фактический выход клеток от дня 1 вплоть до дня 18 для клеток, активированных при указанных объемных отношениях Transact™ к клеточной культуре, и соответствующих контролей.

[012] На фиг. 2 представлена столбчатая диаграмма, на которой показан фактический выход клеток от дня 1 вплоть до дня 8 перед культивированием клеток в G-Rex^® для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[013] На фиг. 3 представлена столбчатая диаграмма, на которой показан фактический выход клеток в G-Rex^® от дня 8 до дня 18 для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[014] На фиг. 4 представлен график, на который нанесена кратность размножения клеток в зависимости от дней в способе, показывающем общую кратность размножения клеток для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[015] На фиг. 5 представлена столбчатая диаграмма и таблица, на которых изображена кратность размножения от дня 0 до дня 1, от дня 1 до дня 4, от дня 4 до дня 6, от дня 6 до дня 8 и от дня 8 до дня 18 для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[016] На фиг. 6 представлена столбчатая диаграмма, на которой изображена кратность размножения от дня 0 до дня 1, от дня 1 до дня 4, от дня 4 до дня 6, от дня 6 до дня 8 перед размножением в G-Rex^® для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[017] На фиг. 7 представлена столбчатая диаграмма, на которой показана процентная доля подгрупп клеток РВМС в день 18 процесса для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[018] На фиг. 8 представлена столбчатая диаграмма, на которой показана доля субпопуляций CD5⁺ Т-клеток памяти (содержащих маркеры CD45RO и CD62L) в день 18 процесса для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[019] На фиг. 9 представлена столбчатая диаграмма, на которой показана процентная доля подгрупп CD4⁺ и CD8⁺ клеток в день 18 процесса для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[020] На фиг. 10А представлена столбчатая диаграмма, на которой показана процентная доля подгрупп в общей подгруппе CD5⁺ Т-клеток с применением маркеров CD45RA и CD62L в день 18 процесса для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[021] На фиг. 10В-10Н представлены контурные графики с CD62L на вертикальной оси и CD45RA на горизонтальной оси, на которых показана процентная доля субпопуляций CD5⁺ Т-клеток для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[022] На фиг. 11А представлена столбчатая диаграмма, на которой показана процентная доля подгрупп общей подгруппы CD5⁺ Т-клеток с применением маркеров CD45RO и CD62L в день 18 процесса для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[023] На фиг. 11В-11Н представлены контурные графики с CD62L на вертикальной оси и CD45RA на горизонтальной оси, на которых показана процентная доля субпопуляций CD5⁺ Т-клеток для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[024] На фиг. 12 представлена столбчатая диаграмма, на которой показана процентная доля CAR⁺ клеток и TCR α/β- клеток в день 18 для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[025] На фиг. 13А представлен график, на который нанесена процентная доля жизнеспособных клеток в зависимости от дня в способе для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[026] На фиг. 13В представлен график, на который нанесен диаметр клеток в зависимости от дня в способе для клеток, активированных с помощью Transact™ при указанных объемных отношениях к клеточной культуре и соответствующих контролей.

[027] На фиг. 14А и 14В представлены графики, на которые нанесено оптимальное размножение Т-клеток, достигаемое при разведениях TransAct™ 1:10 и 1:15. Т-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19, и контрольные Т-клетки UT от двух разных доноров стимулировали с помощью гранул из набора для активации/размножения Т-клеток (Miltenyi Biotec) или полимерной наноматрицы TransAct™ для Т-клеток (Miltenyi Biotec) при указанных отношениях гранула : клетка или объем : объем соответственно. Общее число Т-клеток измеряли в день 9 и день 14 после активации (день 0) и рассчитывали кратность размножения. 561 = номер донора; 658 = номер донора; UT = нетрансдуцированные Т-клетки; M = набор для активации/размножения Т-клеток; T = TransAct™; FMC = CAR-T-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19; D9 = день 9; D14 = день 14.

[028] На фиг. 15А и 15В представлены столбчатые диаграммы, на которых показано, что разведение TransAct™ не приводит к изменению процентной доли CAR⁺ Т-клеток в конце технологического процесса. Т-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19, от двух разных доноров стимулировали с помощью гранул из набора для активации/размножения Т-клеток (Miltenyi Biotec) или полимерной наноматрицы TransAct™ для Т-клеток (Miltenyi Biotec) при указанных отношениях гранула : клетка или объем : объем соответственно. Процентную долю CAR⁺ Т-клеток в день 14 определяли с помощью проточной цитометрии. 561 = номер донора; 658 = номер донора; Miltenyi = набор для активации/размножения Т-клеток; T = TransAct™; D14 = день 14; CAR = химерный антигенный рецептор.

[029] На фиг. 16А и 16В представлены столбчатые диаграммы, на которых показано, что низкие концентрации TransAct™ приводят к повышению процентной доли CD4⁺ Т-клеток с CAR в конечном продукте. Т-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19, и контрольные Т-клетки UT от двух разных доноров стимулировали с помощью гранул из набора для активации/размножения Т-клеток (Miltenyi Biotec) или полимерной наноматрицы TransAct™ для Т-клеток (Miltenyi Biotec) при указанных отношениях гранула : клетка или объем : объем соответственно. Процентную долю CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток в день 14 определяли с помощью проточной цитометрии. 561 = номер донора; 658 = номер донора; UT = нетрансдуцированные Т-клетки; M = набор для активации/размножения Т-клеток; T = TransAct™; FMC = CAR-T-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19; D14 = день 14.

[030] На фиг. 17A-17D представлены столбчатые диаграммы, на которых показано, что разведения TransAct™ 1:10 и 1:15 приводят к более низкой процентной доле CD25⁺ Т-клеток с CAR в конечном продукте. Т-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19, и контрольные Т-клетки UT от двух разных доноров стимулировали с помощью гранул из набора для активации/размножения Т-клеток (Miltenyi Biotec) или полимерной наноматрицы TransAct™ для Т-клеток (Miltenyi Biotec) при указанных отношениях гранула : клетка или объем : объем соответственно. Процентную долю CD25⁺ и 4-1ВВ⁺ Т-клеток в день 14 определяли с помощью проточной цитометрии. 561 = номер донора; 658 = номер донора; UT = нетрансдуцированные Т-клетки; M = набор для активации/размножения Т-клеток; T = TransAct™; FMC = CAR-T-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19; D14 = день 14.

[031] На фиг. 18A-18D представлены столбчатые диаграммы, на которых показано, что разведения TransAct™ 1:10 и 1:15 приводят к сохранению T_SCM-клеток как в CD4⁺, так и в CD8⁺ CAR-T-клетках, и Т_СМ клеток в CD8⁺ CAR-T-клетках. Т-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19, и контрольные Т-клетки UT от двух разных доноров стимулировали с помощью гранул из набора для активации/размножения Т-клеток (Miltenyi Biotec) или полимерной наноматрицы TransAct™ для Т-клеток (Miltenyi Biotec) при указанных отношениях гранула : клетка или объем : объем соответственно. Процентную долю T_SCM и Т_СМ клеток в день 14 определяли с помощью проточной цитометрии. 561 = номер донора; 658 = номер донора; UT = нетрансдуцированные Т-клетки; M = набор для активации/размножения Т-клеток; T = TransAct™; FMC = CAR-T-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19; D14 = день 14; T_EFF = эффекторные Т-клетки; Т_{ЕМ = эффекторные Т-клетки памяти; ТСМ = центральные Т-клетки памяти; TSCM = стволовые Т-клетки памяти.}

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[032] Настоящее изобретение относится к способам получения Т-клеток для применения в Т-клеточной терапии. В частности, настоящее изобретение относится к повышению процентной доли определенных подтипов Т-клеток, в том числе незрелых, менее дифференцированных Т-клеток (например, стволовых Т-клеток памяти (далее в данном документе «T_SCM»)) в популяции Т-клеток. За счет обогащения незрелыми, менее дифференцированными Т-клетками может быть увеличена потенциальная персистенция Т-клеток после введения субъекту, например пациенту. Вследствие этого, обогащенная популяция незрелых Т-клеток с большей вероятностью будет приводить к устойчивому противоопухолевому эффекту, чем популяция Т-клеток на смешанных стадиях дифференцировки.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[033] Чтобы можно было легче понять настоящее изобретение, вначале приведены определения некоторых терминов. Если в данном документе явно не предусмотрено иное, каждый из следующих терминов, используемых в настоящей заявке, будет иметь значение, изложенное ниже. Дополнительные определения изложены по всему настоящему изобретению.

[034] Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту средней квалификации в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; и the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press предоставляют специалисту общий словарь многих из терминов, используемых в настоящем изобретении.

[035] Единицы, префиксы и символы обозначены в своей форме, принятой в метрической системы единиц измерения (СИ). Числовые диапазоны включают в себя числа, определяющие диапазон. Заголовки, представленные в данном документе, не ограничивают различные аспекты настоящего изобретения, которые могут быть доступны посредством ссылки на настоящее описание в целом. Соответственно термины, определенные непосредственно ниже, более полно определены посредством ссылки на настоящее описание во всей его полноте.

[036] Используемые в данном документе формы единственного числа следует понимать как относящиеся к «одному или более» из любого перечисленного или пронумерованного компонента.

[037] Термины «приблизительно» или «содержащий по сути» относятся к значению или композиции, которые находятся в пределах диапазона допустимой погрешности для конкретного значения или композиции, как определено специалистом средней квалификации в данной области техники, которые отчасти будут зависеть от того, как значение или композиция измеряют или определяют, т.е. от ограничений измерительной системы. Например, «приблизительно» или «содержащий по сути» могут означать в пределах 1 или более 1 стандартного отклонения, как это принято в данной области техники. В качестве альтернативы «приблизительно» или «содержащий по сути» могут означать диапазон вплоть до 10% (т.е. +/-10%). Например, «приблизительно 3 мг» может включать любое число между 2,7 мг и 3,3 мг (в случае 10%). Кроме того, особенно в отношении биологических систем или способов, термины могут означать вплоть до десятикратного или вплоть до 5-кратного значения. Если в настоящей заявке и формуле изобретения представлены конкретные значения или композиции, то, если не указано иное, значение «приблизительно» или «содержащий по сути» следует понимать, как находящиеся в пределах диапазона допустимой погрешности для такого конкретного значения или композиции.

[038] Как описано в данном документе, должно быть понятно, что, если не указано иное, любой диапазон концентраций, диапазон процентных долей, диапазон отношений или диапазон целых чисел включает значение любого целого числа в пределах упомянутого диапазона и при необходимости их долей (таких как одна десятая и одна сотая целого числа).

[039] При использовании в данном документе термин «и/или» должен приниматься как специфическое раскрытие каждого из двух определенных признаков или компонентов с другим или без него. Таким образом, в данном документе подразумевается, что термин «и/или», используемый в такой фразе, как «А и/или В», включает «А и В»; «А или В»; «А» (отдельно) и «В» (отдельно). Аналогичным образом, подразумевается, что термин «и/или», используемый в такой фразе, как «А, В и/или С», охватывает каждый из следующих аспектов: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (отдельно); В (отдельно) и С (отдельно).

[040] Должно быть понятно, что во всех случаях, когда аспекты описаны в данном документе посредством формулировки «содержащий», также предусмотрены другие аналогичные аспекты, описываемые выражениями «состоящий из» и/или «состоящий по сути из».

[041] Термин «активация» или «активированный» относится к состоянию иммунной клетки, например Т-клетки, которая была достаточно простимулирована для индукции обнаруживаемой клеточной пролиферации. Активация также может быть ассоциирована с индуцированной выработкой цитокинов и обнаруживаемыми эффекторными функциями. Термин «активированные Т-клетки» относится, среди прочего, к Т-клеткам, которые подвергаются клеточному делению. Активация Т-клеток может характеризоваться повышенной экспрессией одного или более биомаркеров в Т-клетках, в том числе без ограничения CD57, PD1, CD107a, CD25, CD137, CD69 и/или CD71.

[042] «Введение» относится к физическому введению средства субъекту с применением любого из различных способов и систем доставки, известных специалистам в данной области техники. Иллюстративные пути введения Т-клеток, полученных с помощью способов, раскрытых в данном документе, включают внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрипозвоночный или другие парентеральные пути введения, например, путем инъекции или инфузии. Используемая в данном документе фраза «парентеральное введение» означает способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно осуществляемые путем инъекции и включающие без ограничения внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, внутриоболочечную, внутрилимфатическую, внутриочаговую, внутрикапсулярную, интраорбитальную, интракардиальную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию или инфузию, а также электропорацию в условиях in vivo. Введение также может осуществляться, например, один раз, несколько раз и/или в течение одного или более длительных периодов.

[043] Термин «антитело» (Ab) включает без ограничения иммуноглобулин, который специфически связывается с антигеном. В общем случае антитело может содержать по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая цепь H содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи может содержать три или четыре константных домена, CH1, СН2, СН3 и/или СН4. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи может содержать один константный домен, CL. Области VH и VL дополнительно могут подразделяться на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), которые чередуются с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL содержит три CDR и четыре FR, упорядоченные от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном.

[044] Иммуноглобулин может быть получен из любого из общеизвестных изотипов, включая без ограничения IgA, секреторный IgA, IgG и IgM. Подклассы IgG также хорошо известны специалистам в данной области техники, и они включают без ограничения IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека. «Изотип» относится к классу или подклассу Ab (например, IgM или IgG1), который кодируется генами константной области тяжелой цепи. В качестве примера, термин «антитело» включает как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе Ab; моноклональные и поликлональные Ab; химерные и гуманизированные Ab; человеческие или отличные от человеческих Ab; полностью синтетические Ab и одноцепочечные Ab, в том числе верблюжьи антитела. Отличное от человеческого Ab можно гуманизировать с помощью рекомбинантных способов для снижения его иммуногенности у человека. Если явно не заявлено и если в контексте не указано иное, термин «антитело» также включает антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающую часть любого из вышеупомянутых иммуноглобулинов и включает моновалентный и бивалентный фрагмент или часть, а также одноцепочечное Ab.

[045] «Антигенсвязывающая молекула» или «фрагмент антитела» относятся к любой части антитела, которая меньше целого антитела. Антигенсвязывающая молекула может содержать области, определяющие комплементарность с антигеном (CDR). Примеры фрагментов антител включают без ограничения Fab-, Fab'-, F(ab')₂-и Fv-фрагменты, dAb, линейные антитела, scFv-антитела и полиспецифические антитела, образованные из антигенсвязывающих молекул.

[046] Термин «аутологичный» относится к любому материалу, полученному от того же индивидуума, которому его позднее будут повторно вводить. Например, терапия сконструированными аутологичными клетками (еАСТ™) подразумевает сбор лимфоцитов от донора, например пациента, которые затем подвергают конструированию для экспрессии, например, конструкции CAR, а затем вводят обратно тому же донору, например пациенту.

[047] Термин «аллогенный» относится к любому материалу, полученному от одного индивидуума, который затем вводят другому индивидууму того же вида, например, при аллогенной Т-клеточной трансплантации или терапии.

[048] Термин «наноматрица на основе антител к CD3/28» относится к матрице нанометрового размера, которая содержит антитела и/или их фрагменты, которые связывают CD3 и CD28, предоставляемой, например, Miltenyi Biotec Inc (Оберн, Калифорния, США) в виде реагента TransAct™ для Т-клеток (см., например, MACS GMP Transact для Т-клеток, каталожный номер CRR 200-076-202, MACS GMP Transact для Т-клеток для применения в исследованиях, каталожный номер 170-076-156).

[049] «Рак» относится к широкой группе различных заболеваний, которые характеризуются неконтролируемым ростом аномальных клеток в организме. Нерегулируемое клеточное деление и рост приводят к образованию злокачественных опухолей, которые прорастают в соседние ткани и также могут метастазировать в отдаленные части организма через лимфатическую систему или кровоток. «Рак» или «раковая ткань» могут включать опухоль на различных стадиях. В определенных вариантах осуществления рак или опухоль находятся на стадии 0, например, при этом рак или опухоль находятся на очень ранней стадии развития и не метастазировали. В некоторых вариантах осуществления рак или опухоль находятся на стадии I, например, при этом рак или опухоль имеют относительно небольшой размер, не распространились на близлежащие ткани и не метастазировали. В других вариантах осуществления рак или опухоль находятся на стадии II или стадии III, например, при этом рак или опухоль крупнее, чем на стадии 0 или стадии I, и они проросли в соседние ткани, но не метастазировали, за исключением, возможно, в лимфатические узлы. В других вариантах осуществления рак или опухоль находятся на стадии IV, например, при этом рак или опухоль метастазировали. Стадию IV также можно обозначить как запущенный или метастатический рак.

[050] Используемый в данном документе «противоопухолевый эффект» относится к биологическому эффекту, который может проявляться в виде уменьшения объема опухоли, торможению роста опухоли, уменьшения числа опухолевых клеток, уменьшения пролиферации опухолевых клеток, уменьшения числа метастазов, увеличения общей выживаемости или выживаемости без прогрессирования, увеличения ожидаемой продолжительности жизни или уменьшения интенсивности различных физиологических симптомов, ассоциированных с опухолью. Противоопухолевый эффект также может относиться к предотвращению возникновения опухоли, например, обусловленному вакциной.

[051] Используемый в данном документе термин «выживаемость без прогрессирования», который может сокращенно обозначаться как PFS, относится к времени от даты лечения до даты прогрессирования заболевания согласно пересмотренным критериям ответа IWG для злокачественной лимфомы или смерти по любой причине.

[052] «Прогрессирование заболевания» оценивают путем измерения злокачественных очагов на рентгенограммах или с помощью других способов.

[053] Используемая в данном документе «продолжительность ответа», которая может сокращенно обозначаться как DOR, относится к периоду времени от первого объективного ответа субъекта до даты подтвержденного прогрессирования заболевания согласно пересмотренным критериям ответа IWG для злокачественной лимфомы или смерти.

[054] Термин «общая выживаемость», который может сокращенно обозначаться как OS, определяют как время от даты лечения до даты смерти.

[055] Используемый в данном документе «цитокин» относится к отличному от антитела белку, который может высвобождаться иммунными клетками, включая макрофаги, В-клетки, Т-клетки и тучные клетки, для распространения иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления в ответ на Т-клеточную терапию высвобождаются один или более цитокинов. В определенных вариантах осуществления такие цитокины, секретируемые в ответ на Т-клеточную терапию, могут быть признаком эффективной Т-клеточной терапии.

[056] Используемые в данном документе «терапевтически эффективное количество» или «терапевтически эффективная доза» относятся к количеству Т-клеток или DC-клеток, которые получают с помощью способов по настоящему изобретения и которые, при применении их в отдельности или в комбинации с другим терапевтическим средством, защищают субъекта от проявления заболевания или содействуют регрессу заболевания, о чем свидетельствует уменьшение тяжести симптомов заболевания, увеличение частоты и продолжительности бессимптомных периодов заболевания или предупреждение ухудшения состояния или инвалидности вследствие поражения заболеванием. Способность Т-клеток или DC-клеток содействовать регрессу заболевания можно оценивать с применением различных способов, известных квалифицированному практикующему специалисту, как, например, на субъектах-людях во время клинических испытаний, на животных модельных системах, предсказывающих эффективность у человека, или путем анализа активности средства в анализах в условиях in vitro.

[057] Используемый в данном документе термин «лимфоцит» может включать клетки естественные киллеры (NK), Т-клетки или В-клетки. NK-клетки представляют собой тип цитотоксических (токсических для клеток) лимфоцитов, которые представляют главный компонент врожденной иммунной системы. NK-клетки отторгают опухоли и клетки, инфицированные вирусами. Это осуществляется посредством процесса апоптоза или запрограммированной клеточной смерти. Их назвали «естественными киллерами», поскольку им не требуется активация для уничтожения клеток. Т-клетки играют главную роль в клеточно-опосредованном иммунитете (без вовлечения антител). Их Т-клеточные рецепторы (TCR) отличают их от других типов лимфоцитов. Тимус, специализированный орган иммунной системы, в первую очередь отвечает за созревание Т-клеток.

[058] Существует несколько типов Т-клеток, а именно: Т-клетки-хелперы (например, CD4⁺ клетки, эффекторные T_EFF-клетки), цитотоксические Т-клетки (также известные как ТС, цитотоксические Т-лимфоциты, CTL, Т-киллеры, цитолитические Т-клетки, CD8⁺ Т-клетки или Т-клетки-киллеры), Т-клетки памяти ((i) стволовые T_SCM-клетки памяти, подобно наивным клеткам они являются CD45RO^-, CCR7⁺, CD45RA⁺, CD62L⁺ (L-селектин), CD27⁺, CD28⁺ и IL-7Rα⁺, но они также экспрессируют большие количества CD95, IL-2Rβ, CXCR3 и LFA-1, и демонстрируют многочисленные функциональные свойства, характерные для клеток памяти); (ii) центральные Т_СМ-клетки памяти экспрессируют L-селектин и являются CCR7⁺ и CD45RO⁺, и они секретируют IL-2, но не IFNβ или IL-4, и (iii) эффекторные Т_ЕМ-клетки памяти хотя не экспрессируют L-селектин или CCR7, но действительно экспрессируют CD45RO и вырабатывают эффекторные цитокины, такие как IFNγ и IL-4), регуляторные Т-клетки (Treg, супрессорные Т-клетки или регуляторные CD4⁺CD25⁺ Т-клетки), Т-клетки, относящиеся к естественным киллерам (NKT), и гамма-дельта Т-клетки. Т-клетки, обнаруженные в пределах опухолей, обозначаются как «инфильтрирующие опухоль лимфоциты» или «TIL».

[059] «Наивная» Т-клетка относится к зрелой Т-клетке, которая остается иммунологически недифференцированной. После положительного и отрицательного отбора в тимусе Т-клетки выходят либо как CD4⁺, либо как CD8⁺ наивные Т-клетки. В своем наивном состоянии Т-клетки экспрессируют L-селектин (CD62L⁺), рецептор IL-7-α (IL-7R-α) и CD132, но не экспрессируют CD25, CD44, CD69 или CD45RO. Используемый в данном документе термин «незрелая» также может относиться к Т-клетке, которая демонстрирует фенотип, характерный либо для наивной Т-клетки, либо для незрелой Т-клетки, такой как T_SCM-клетка или Т_СМ-клетка. Например, незрелая Т-клетка может экспрессировать одно или более из L-селектина(CD62L⁺), IL-7R-α, CD132, CCR7, CD45RA, CD45RO, CD27, CD28, CD95, CXCR3 и LFA-1. Наивные или незрелые Т-клетки можно противопоставить терминально дифференцированным эффекторным Т-клеткам, таким как Т_ЕМ-клетки и T_EFF-клетки.

[060] «Т-клеточная функция», как обозначено в данном документе, относится к нормальным характеристикам здоровых Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления Т-клеточная функция предусматривает пролиферацию Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления Т-клеточная функция предусматривает Т-клеточную активность. В некоторых вариантах осуществления Т-клеточная функция предусматривает цитолитическую активность.

[061] Используемая в данном документе «пролиферация клеток» относится к способности Т-клеток увеличивать свое количество посредством клеточного деления. Пролиферация может быть измерена, например, путем окрашивания клеток сложным сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE). Пролиферация клеток может происходить в условиях in vitro, например, во время культивирования Т-клеток, или в условиях in vivo, например, после введения средства Т-клеточной терапии.

[062] Используемая в данном документе «Т-клеточная активность» относится к любой активности, характерной для здоровых Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления Т-клеточная активность предусматривает выработку цитокинов. В определенных вариантах осуществления Т-клеточная активность предусматривает выработку одного или более цитокинов, выбранных из интерферона-гамма (IFNγ), фактора некроза ткани-альфа (TNFα), и их обоих.

[063] Используемые в данном документе «цитолитическая активность» или «цитотоксичность» относятся к способности Т-клетки разрушать клетку-мишень. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой раковую клетку, например опухолевую клетку. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка экспрессирует химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), а клетка-мишень экспрессирует антиген-мишень.

[064] Термин «генетически сконструированный», «редактирование гена» или «сконструированный» относится к способу модификации генома клетки, включая без ограничения удаление кодирующей или некодирующей области или ее части или вставку кодирующей области или ее части. В некоторых вариантах осуществления клетка, которая подвергается модифицированию, представляет собой лимфоцит, например Т-клетку, которая может быть получена либо от пациента, либо от донора. Клетку можно модифицировать для экспрессии экзогенной конструкции, такой как, например, химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR), которая встраивается в геном клетки.

[065] «Иммунный ответ» относится к действию клетки иммунной системы (например, Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, клеток естественных киллеров (NK), макрофагов, эозинофилов, тучных клеток, дендритных клеток и нейтрофилов) и растворимых макромолекул, выработанных любой из этих клеток или печенью (включая Ab, цитокины и молекулы комплемента), которое приводит к селективному нацеливанию, связыванию, повреждению, разрушению и/или устранению из организма позвоночного инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раково-перерожденных или других аномальных клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных клеток или тканей человека.

[066] Термин «иммунотерапия» относится к лечению субъекта, пораженного заболеванием или подверженного риску заражения или страдающего от его рецидива, с помощью способа, включающего индуцирование, усиление, подавление или иную модификацию иммунного ответа. Примеры иммунотерапии включают без ограничения виды Т-клеточной терапии. Т-клеточная терапия может включать адоптивную Т-клеточную терапию, иммунотерапию инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TIL), терапию аутологичными клетками, терапию сконструированными аутологичными клетками (еАСТ™), терапию сконструированными аллогенными клетками и трансплантацию аллогенных Т-клеток. Однако специалисту в данной области техники будет понятно, что способы получения Т-клеток, раскрытые в данном документе, будут приводить к повышению эффективности любой терапии с помощью трансплантированных Т-клеток. Примеры видов Т-клеточной терапии описаны в публикациях заявок на патент США №2014/0154228 и 2002/0006409 и международной публикации № WO 2008/081035.

[067] Т-клетки для иммунотерапии могут происходить из любого источника, известного в данной области техники. Например, Т-клетки можно дифференцировать в условиях in vitro из популяции гемопоэтических стволовых клеток, или Т-клетки можно получать от донора. Донором может быть субъект, например субъект, нуждающийся в противораковом лечении, или здоровый донор. Т-клетки можно получать, например, из мононуклеарных клеток периферической крови, костного мозга, ткани лимфатического узла, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцитов, плеврального выпота, ткани селезенки и опухолей. Кроме того, Т-клетки могут быть получены из одной или более линий Т-клеток, доступных в данной области техники. Т-клетки также могут быть получены из порции крови, собранной у субъекта, с применением любого числа методик, известных специалистам в данной области техники, таких как разделение с помощью FICOLL™ и/или аферез. Т-клетки также можно получать из системы культивирования клеток на основе искусственного органоида тимуса (АТО), которая копирует среду человеческого тимуса для поддержания эффективной дифференцировки Т-клеток из первичных и перепрограммированных плюрипотентных стволовых клеток в условиях ex vivo. Дополнительные способы выделения Т-клеток для Т-клеточной терапии раскрыты в публикации заявки на патент США №2013/0287748, которая включена в данный документ посредством ссылок во всей своей полноте.

[068] Термин «терапия сконструированными аутологичными клетками», который может сокращенно обозначаться как «еАСТ™», также известный как адоптивный перенос клеток, представляет собой процесс, при котором собственные Т-клетки пациента собирают, а затем подвергают генетическому изменению для распознавания и нацеливания на один или более антигенов, экспрессируемых на клеточной поверхности одной или более специфических опухолевых клеток или злокачественных новообразований. Т-клетки могут быть сконструированы для экспрессии, например, одного или более химерных антигенных рецепторов (CAR) или одного или более Т-клеточных рецепторов (TCR) и их комбинаций. CAR-положительные (+) Т-клетки конструируют для экспрессии внеклеточного одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), характеризующегося специфичностью в отношении конкретного опухолевого антигена, который связан с внутриклеточной сигнальной частью, содержащей костимулирующий домен и активирующий домен. Костимулирующий домен может быть получен, например, из CD28, CTLA4, CD16, ОХ-40, 4-1BB/CD137, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, белка-1 запрограммированной клеточной смерти (PD-1), лиганда-1 запрограммированной клеточной смерти (PD-L1), индуцируемого Т-клеточного костимулятора (ICOS), ICOS-L, функционально-ассоциированного антигена-1 лимфоцитов (LFA-1 (CD11a/CD18)), CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD247, CD276 (В7-Н3), LIGHT (представитель 14 суперсемейства фактора некроза опухоли; TNFSF14), NKG2C, Ig-альфа (CD79a), DAP-10, Fc гамма-рецептора, молекулы МНС I класса, белков TNF-рецептора, иммуноглобулиноподобных белков, цитокиновых рецепторов, интегринов, сигнальных лимфоцит-активирующих молекул (белки SLAM), активирующих рецепторов NK-клеток, BTLA, Toll-подобного рецептора, ICAM-1, В7-Н3, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8, CD8-альфа, CD8-бета, IL2R-бета, IL2R-гамма, IL7R-альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244,2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, лиганда, который специфически связывается с CD83, или любой их комбинации. Активирующий домен может быть получен, например, из CD3, такого как CD3-дзета, эпсилон, дельта, гамма и т.п. В определенных вариантах осуществления CAR разрабатывают таким образом, чтобы он содержал два, три, четыре или более костимулирующих доменов. scFv CAR может быть разработан для нацеливания, например, на CD19, который представляет собой трансмембранный белок, экспрессируемый клетками линии дифференцировки В-клеток, включая все нормальные В-клетки и В-клеточные злокачественные новообразования, включая без ограничения NHL, CLL и отличный от Т-клеточного ALL. Примеры видов CAR+ Т-клеточной терапии и конструкций описаны в публикациях заявок на патент США №№2013/0287748, 2014/0227237, 2014/0099309 и 2014/0050708, и эти литературные источники включены посредством ссылки во всей своей полноте.

[069] Используемый в данном документе «пациент» включает любого человека, страдающего заболеванием, включая рак (например, лимфому или лейкоз). Термины «субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо. Термин «субъект-донор» относится в данном документе к субъекту, клетки которого получают для дальнейшего конструирования в условиях in vitro. Субъект-донор может представлять собой пациента с раком, которому следует получать лечение с помощью популяции клеток, полученной с помощью способов, описанных в данном документе (т.е. аутологичного донора), или может представлять собой индивидуума, который является донором образца лимфоцитов, которые после получения популяции клеток, полученных с помощью способов, описанных в данном документе, будут применяться для лечения другого индивидуума или пациента с раком (т.е. аллогенного донора). Субъекты, которые получают клетки, которые были получены с помощью способов по настоящему изобретению, могут обозначаться как «субъект-реципиент».

[070] Используемая в данном документе «стимуляция» относится к первичному ответу, индуцированному за счет связывания стимулирующей молекулы с ее когнатным лигандом, где связывание опосредует событие передачи сигнала. «Стимулирующая молекула» представляет собой молекулу на Т-клетке, например комплекс Т-клеточного рецептора (TCR)/CD3, которая специфически связывается с когнатным стимулирующим лигандом, присутствующим на антигенпрезентирующей клетке. «Стимулирующий лиганд» представляет собой лиганд, который, если он присутствует на антигенпрезентирующей клетке (например, искусственной антигенпрезентирующей клетке (аАРС), дендритной клетке, В-клетке и т.п.), может специфически связываться со стимулирующей молекулой на Т-клетке, за счет чего опосредуется первичный ответ Т-клетки, включая без ограничения активацию, запуск иммунного ответа, пролиферацию и т.п. Стимулирующие лиганды включают без ограничения молекулу МНС I класса, нагруженную пептидом, антитело к CD3, суперагонистическое антитело к CD28 и суперагонистическое антитело к CD2. Используемый в данном документе термин «активированная» или «активная» относится к Т-клетке, которая была простимулирована. Активная Т-клетка может характеризоваться экспрессией одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из CD137, CD25, CD71, CD26, CD27, CD28, CD30, CD154, CD40L и CD134.

[071] Термин «экзогенное» относится к любому веществу, полученному из внешнего источника.

[072] Используемый в данном документе термин «персистенция» относится к способности, например, одной или более трансплантированных Т-клеток, введенных субъекту, или их потомков (например, дифференцированных или зрелых Т-клеток), оставаться в субъекте на обнаруживаемом уровне в течение некоторого периода времени. Используемое в данном документе увеличение персистенции одной или более трансплантированных Т-клеток или их потомков (например, дифференцированных или зрелых Т-клеток) относится к увеличению периода времени, в течение которого трансплантированные Т-клетки являются обнаруживаемыми у субъекта после введения. Например, персистенция одной или более трансплантированных Т-клеток в условиях in vivo может быть увеличена на по меньшей мере приблизительно 1 день, по меньшей мере приблизительно 2 дня, по меньшей мере приблизительно 3 дня, по меньшей мере приблизительно 4 дня, по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 6 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 8 дней, по меньшей мере приблизительно 9 дней, по меньшей мере приблизительно 10 дней, по меньшей мере приблизительно 11 дней, по меньшей мере приблизительно 12 дней, по меньшей мере приблизительно 13 дней, по меньшей мере приблизительно 14 дней, по меньшей мере приблизительно 3 недели, по меньшей мере приблизительно 4 недели, по меньшей мере приблизительно 1 месяц, по меньшей мере приблизительно 2 месяца, по меньшей мере приблизительно 3 месяца, по меньшей мере приблизительно 4 месяца, по меньшей мере приблизительно 5 месяцев или по меньшей мере приблизительно 6 месяцев. Кроме того, персистенция одной или более трансплантированных Т-клеток в условиях in vivo может быть увеличена в по меньшей мере приблизительно 1,5 раза, в по меньшей мере приблизительно 2 раза, в по меньшей мере приблизительно 2,5 раза, в по меньшей мере приблизительно 3 раза, в по меньшей мере приблизительно 3,5 раза, в по меньшей мере приблизительно 4 раза, в по меньшей мере приблизительно 4,5 раза, в по меньшей мере приблизительно 5 раз, в по меньшей мере приблизительно 6 раз, в по меньшей мере приблизительно 7 раз, в по меньшей мере приблизительно 8 раз, в по меньшей мере приблизительно 9 раз или в по меньшей мере приблизительно 10 раз по сравнению с одной или более трансплантированными Т-клетками, которые не были получены с применением способов по настоящему изобретению, раскрытых в данном документе.

[073] Термины «снижение» и «уменьшение» используются в данном документе взаимозаменяемо и обозначают любое изменение, которое приводит к меньшему значению, чем исходное значение. «Снижение» и «уменьшение» являются относительными терминами, требующими сравнения между измерениями, полученными до и после воздействия. «Снижение» и «уменьшение» включают полное истощение. В некоторых вариантах осуществления термины «снижение» и «уменьшение» включают сравнение Т-клеточных эффектов у Т-клеток, полученных с помощью способов по настоящему изобретению, раскрытых в данном документе (например, сильной активации), и Т-клеток, не подвергнутых получению.

[074] Используемый в данном документе термин «модулирование» созревания Т-клеток относится к применению любого вмешательства, описанного в данного документе, для воздействия на созревание, т.е. дифференцировку одной или более Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления «модулирование» относится к задержке или торможению созревания Т-клеток. В других вариантах осуществления «модулирование» относится к ускорению или стимуляции созревания Т-клеток. В частности, используемый в данном документе термин «задержка или торможение созревания Т-клеток» относится к поддержанию одной или более Т-клеток в незрелом или недифференцированном состоянии. Например, «задержка или торможение созревания Т-клеток» может относиться к поддержанию Т-клеток в наивном состоянии или состоянии ТСМ, в противовес прогрессированию в состояние Т_ЕМ или T_EFF. Термин «задержка или торможение созревания Т-клеток» также может относиться к увеличению общей процентной доли незрелых или недифференцированных Т-клеток (например, наивных Т-клеток и/или Т_СМ клеток) или их обогащению в пределах смешанной популяции Т-клеток. Состояние Т-клетки (например, как зрелой или незрелой) можно определить, например, путем скрининга в отношении экспрессии различных генов и присутствия различных белков, экспрессируемых на поверхности Т-клеток. Например, присутствие одного или более маркеров, выбранных из группы, состоящей из L-селектина (CD62L⁺), IL-7R-а, CD132, CR7, CD45RA, CD45RO, CD27, CD28, CD95, IL-2Rβ, CXCR3, LFA-1 и любой их комбинации, может быть свойственно менее зрелым, недифференцированным Т-клеткам.

[075] «Лечение» или «осуществление лечения» субъекта относится к любому типу вмешательства или процесса, осуществляемых на субъекте, или к введению субъекту одной или более Т-клеток, полученных с применением настоящего изобретения, имеющих своей целью обратить, облегчить, уменьшить интенсивность, затормозить, замедлить или предупредить возникновение, прогрессирование, развитие, тяжесть или рецидив симптома, осложнения или состояния или биохимических признаков, ассоциированных с заболеванием. В одном варианте осуществления «лечение» или «осуществление лечения» включают частичную ремиссию. В другом варианте осуществления «лечение» или «осуществление лечения» включают полную ремиссию.

[076] Различные аспекты настоящего изобретения описаны более подробно в следующих подразделах.

Способы получения иммунных клеток

[077] Настоящее изобретение относится к способам получения иммунных клеток (например, лимфоцитов или дендритных клеток) для применения в клеточной терапии. Обнаружено, что определенные конструируемые в условиях in vitro клетки (например, CAR-T-клетки, Т-клетки или дендритные клетки) могут быть не столь эффективны при введении пациенту после конструирования в условиях in vitro. Без желания ограничиваться какой-либо конкретной теорией, отмечается, что одной из причин может быть преждевременная дифференцировка лимфоцитов в условиях in vitro перед введением пациенту. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения изложены способы увеличения числа незрелых, менее дифференцированных клеток в популяции Т-клеток с применением жестких условий активации.

[078] В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам повышения процентной доли незрелых, менее дифференцированных клеток (например, стволовых Т-клеток памяти; T_SCM) в популяции собранных Т-клеток. Соответственно, способы, описанные в данном документе, можно применять для увеличения персистенции трансплантированных Т-клеток или DC-клеток или их потомков в условиях in vivo при клеточной терапии (например, Т-клеточной терапии). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрено, что полученные Т-клетки проявляют повышенное размножение в условиях in vitro. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрено, что у полученных Т-клеток наблюдается повышенная процентная доля CD8+ Т-клеток.

[079] В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способы увеличения процентной доли незрелых, менее дифференцированных клеток в популяции Т-клеток посредством приведения одной или более клеток в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), где популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл. Дальнейшее получение Т-клеток описано в других разделах данного документа.

[080] В настоящем изобретении продемонстрировано, что приведение клеточной популяции, содержащей одну или более Т-клеток, в контакт с более высокой концентрацией наноматрицы на основе антител к CD3/28 в условиях in vitro может приводить к повышению концентрации незрелых и менее дифференцированных Т-клеток, например T_SCM-клеток, в образце по сравнению с концентрацией более терминально дифференцированных Т-клеток. Соответственно, в другом варианте осуществления настоящего изобретения представлен способ получения подобных стволовым клеткам CD4⁺ Т-клеток или CD8⁺ Т-клеток, включающий культивирование одной или более Т-клеток в среде, содержащей отношение, составляющее один объем наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, к 17 объемам популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемам), где популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл. В других вариантах осуществления настоящего изобретения представлен способ обогащения популяции CD8⁺ CD45RA⁺/CD62L⁺ Т-клеток и/или CD8⁺ CD45RO^-/CD62L⁺ Т-клеток в образце, включающий: (а) приведение одной или более Т-клеток в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), где популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл, и (с) осуществление размножения одной или более Т-клеток. Создание повышенной концентрации незрелых и недифференцированных Т-клеток или DC-клеток может приводить к увеличению персистенции клеток в условиях in vivo после трансплантации субъекту, нуждающемуся в клеточной терапии (например, Т-клеточной терапии или DC-клеточной терапии). Таким образом, в другом варианте осуществления настоящего изобретения представлен способ продления персистенции одной или более Т-клеток в условиях in vivo при адоптивной клеточной терапии, включающий приведение одной или более Т-клеток в контакт с: (i) одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), где популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл перед введением субъекту; при этом персистенция в условиях in vivo продлевается по сравнению с одной или более трансплантированными Т-клетками, приведенными в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на более чем 15 объемов (например, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 25, 30 или 40 объемов) популяции Т-клеток.

[081] Способы, раскрытые в данном документе, включают модулирование, например, обогащение популяции Т-клеток незрелыми, менее дифференцированными клетками в условиях in vitro. Задержка или торможение созревания или дифференцировки одной или более Т-клеток или DC-клеток могут быть измерены с применением любых способов, известных в данной области техники. Например, обогащение клеточной популяции незрелыми, менее дифференцированными Т-клетками или DC-клетками может быть измерена путем обнаружения присутствия одного или нескольких биомаркеров. Присутствие одного или более биомаркеров может быть обнаружено с помощью любого способа, известного в данной области техники, включая без ограничения иммуногистохимический анализ и/или сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS). В некоторых вариантах осуществления один или более биомаркеров выбраны из группы, состоящей из L-селектина (CD62L⁺), IL-7Rα, CD132, CCR7, CD45RA, CD45RO, CD27, CD28, CD95, IL-2Rβ, CXCR3, LFA-1 или любой их комбинации. В определенных вариантах осуществления обогащение клеточной популяции незрелыми, менее дифференцированными Т-клетками может быть измерено путем обнаружения присутствия одного или более из L-селектина (CD62L⁺), CD45RA и CD45RO. Специалисту в данной области техники будет понятно, что, хотя способы по настоящему изобретению могут приводить к повышению относительной доли незрелых и недифференцированных Т-клеток или DC-клеток в популяции собранных клеток, некоторое количество зрелых и дифференцированных клеток все еще может присутствовать. Вследствие этого, обогащение клеточной популяции незрелыми, менее дифференцированными Т-клетками может быть измерено путем расчета общего процента незрелых и недифференцированных клеток в клеточной популяции до и после приведения одной или более клеток в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), где популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл. Способы, раскрытые в данном документе, приводят к повышению процентной доли незрелых и недифференцированных Т-клеток в популяции Т-клеток. В определенных вариантах осуществления одну или более Т-клеток приводят в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), при этом она содержит по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или приблизительно 100% незрелых или недифференцированных Т-клеток. В других вариантах осуществления одну или более Т-клеток приводят в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), где популяция Т-клеток характеризуется плотностью, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл, при этом она содержит от по меньшей мере приблизительно 10% до по меньшей мере приблизительно 90%, от по меньшей мере приблизительно 20% до по меньшей мере приблизительно 80%, от по меньшей мере приблизительно 30% до по меньшей мере приблизительно 70%, от по меньшей мере приблизительно 40% до по меньшей мере приблизительно 60%, от по меньшей мере приблизительно 10% до по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 40%, от по меньшей мере приблизительно 35% до по меньшей мере приблизительно 45%, от по меньшей мере приблизительно 20% до по меньшей мере приблизительно 60% или от по меньшей мере приблизительно 50% до по меньшей мере приблизительно 90% незрелых или недифференцированных Т-клеток. В определенных вариантах осуществления незрелые или недифференцированные Т-клетки представляют собой наивные Т-клетки и/или центральные T_SCM-клетки памяти.

[082] В другом варианте осуществления обогащение клеточной популяции незрелыми, менее дифференцированными Т-клетками или DC-клетками может быть измерено путем расчета общего процента незрелых и недифференцированных клеток в клеточной популяции, которая была приведена в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), где популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл, и сравнения с процентной долей незрелых, менее дифференцированных Т-клеток или DC-клеток в эталонной клеточной популяции, которая была приведена в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на более чем 17 объемов популяции Т-клеток, где эталонная популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл. В определенных вариантах осуществления одну или более Т-клеток приводят в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), при этом она содержит на по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% больше незрелых или недифференцированных Т-клеток, например Tscm-клеток, по сравнению с эталонной популяцией Т-клеток. В определенных вариантах осуществления одну или более Т-клеток приводят в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), при этом она содержит в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз или в 10 раз больше незрелых или недифференцированных Т-клеток, например T_SCM-клеток, чем эталонная популяция Т-клеток.

[083] В настоящем изобретении представлен способ увеличения процентной доли незрелых, менее дифференцированных клеток в популяции Т-клеток посредством приведения одной или более клеток в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), где популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл. Одну или более Т-клеток или DC-клеток можно приводить в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/28 любыми способами, известными в данной области техники. Например, наноматрицу на основе антител к CD3/28 можно добавлять в культуральную среду, применяемую для культивирования одной или более Т-клеток или DC-клеток.

[084] Одну или более Т-клеток по настоящему изобретению можно вводить субъекту для применения в Т-клеточной терапии. Соответственно, одну или более Т-клеток можно собрать от субъекта, нуждающегося в Т-клеточной терапии, или от донора. После сбора одну или более Т-клеток можно обрабатывать в течение любого подходящего периода времени перед введением субъекту. В течение данного времени одну или более Т-клеток можно приводить в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), где популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл в течение любого периода времени между сбором Т-клеток от донора и введением субъекту. Например, одну или более Т-клеток можно приводить в контакт, например культивировать, в присутствии одного объема наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов) в течение по меньшей мере приблизительно 1 дня, по меньшей мере приблизительно 2 дней, по меньшей мере приблизительно 3 дней, по меньшей мере приблизительно 4 дней, по меньшей мере приблизительно 5 дней, по меньшей мере приблизительно 6 дней, по меньшей мере приблизительно 7 дней, по меньшей мере приблизительно 8 дней, по меньшей мере приблизительно 9 дней, по меньшей мере приблизительно 10 дней, по меньшей мере приблизительно 11 дней, по меньшей мере приблизительно 12 дней, по меньшей мере приблизительно 13 дней, по меньшей мере приблизительно 14 дней, по меньшей мере приблизительно 15 дней, по меньшей мере приблизительно 16 дней, по меньшей мере приблизительно 17 дней, по меньшей мере приблизительно 18 дней, по меньшей мере приблизительно 19 дней или по меньшей мере приблизительно 20 дней. В некоторых вариантах осуществления одну или более Т-клеток приводят в контакт (например, культивируют в присутствии) с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов) в течение от приблизительно 1 дня до приблизительно 18 дней, в течение от приблизительно 1 дня до приблизительно 14 дней, в течение от приблизительно 1 дня до приблизительно 10 дней, в течение от приблизительно 1 дня до приблизительно 7 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 6 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 5 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 4 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 3 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 2 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 3 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 4 дней, от приблизительно 2 дней до приблизительно 5 дней или от приблизительно 2 дней до приблизительно 6 дней. В одном конкретном варианте осуществления одну или более Т-клеток приводят в контакт, например культивируют в присутствии, с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов) с того дня, когда Т-клетки собирают (например, дня 0), до дня, когда Т-клетки вводят субъекту. В другом варианте осуществления Т-клетки приводят в контакт, например культивируют в присутствии, с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов) от дня 0 до введения, от дня 1 до введения, от дня 2 до введения, от дня 3 до введения, от дня 4 до введения, от дня 5 до введения или от дня 6 до введения. В некоторых вариантах осуществления одну или более Т-клеток промывают перед введением для удаления наноматрицы на основе антител к CD3/28.

[085] Способы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать обогащение популяции лимфоцитов, полученных от донора. Обогащение популяции лимфоцитов, например одной или более Т-клеток, можно осуществлять с помощью любого подходящего способа разделения, включая без ограничения применение среды для разделения (например, FICOLL^®PAQUE, коктейля для обогащения общей популяции лимфоцитов ROSETTESEP™ HLA, среды для разделения лимфоцитов (LSA) (MP Biomedical, каталожный номер 0850494Х) и т.п.), разделения клеток по размеру, форме или плотности путем фильтрации или элютриации, иммуномагнитного разделения (например, системы сортировки клеток с магнитной активацией, MACS), флуоресцентного разделения (например, системы сортировки клеток с активированной флуоресценцией, FACS) или разделения на колонках с гранулами. Кроме того, обогащение популяции Т-клеток можно осуществлять с применением набора для выделения тотальной популяции Т-клеток человека (Miltenyi Biotec Inc., Оберн, Калифорния, №130-096-535), набора для отбора по CD4/CD8 (Miltenyi Biotec Inc., Оберн, Калифорния, №130-122-352, набора микрогранул для CD4/CD8 StraightFrom® Leukopak^®, №130-030-401, набора микрогранул для CD4 CliniMACS, №130-030-801, микрогранул для CD8 CliniMACS и микрогранул для CD3).

[086] Способы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать стимулирование популяции лимфоцитов с помощью одного или более стимулирующих Т-клетки средств с получением популяции активированных Т-клеток в подходящих условиях. Лимфоциты, например Т-клетки или РВМС, могут быть только полученными или замороженными, они могут быть получены, например, из периферической крови или пуповинной крови. Любую комбинацию из одного или более подходящих стимулирующих Т-клетки средств можно применять для получения популяции активированных Т-клеток, включая без ограничения антитело или его функциональный фрагмент, которые нацеливаются на стимулирующую или костимулирующую молекулу Т-клетки (например, антитело к CD2, антитело к CD3, антитело к CD28 или их функциональный фрагмент), или любой другой подходящий митоген (например, тетрадеканоилфорболацетат (ТРА), фитогемагглютинин (РНА), конканавалин А (conA), липополисахарид (LPS), митоген лаконоса (PWM)), или природный лиганд стимулирующей или костимулирующей молекулы Т-клетки, или наноматрицу на основе антител к CD3/28, например реагент TransAct™ для Т-клеток (Miltenyi Biotec Inc., Оберн, Калифорния).

[087] Подходящие условия для стимулирования популяции лимфоцитов, как описано в данном документе, могут включать температуру, период времени и/или присутствие СО₂ на некотором уровне. В определенных вариантах осуществления температура стимуляции составляет приблизительно 34°С, приблизительно 35°С, приблизительно 36°С, приблизительно 37°С или приблизительно 38°С. В определенных вариантах осуществления температура стимуляции составляет приблизительно 34-38°С. В определенных вариантах осуществления температура стимуляции составляет приблизительно 35-37°С. В определенных вариантах осуществления температура стимуляции составляет приблизительно 36-38°С. В определенных вариантах осуществления температура стимуляции составляет приблизительно 36-37°С или приблизительно 37°С.

[088] Другое условие для стимуляции популяции лимфоцитов, описанной в данном документе, может включать время стимуляции. В некоторых вариантах осуществления время стимуляции составляет от приблизительно 0-72 часа. В некоторых вариантах осуществления время стимуляции составляет приблизительно 0-24 часа, приблизительно 24-72 часа, приблизительно 24-36 часов, приблизительно 30-42 часа, приблизительно 36-48 часов, приблизительно 40-52 часа, приблизительно 42-54 часа, приблизительно 44-56 часов, приблизительно 46-58 часов, приблизительно 48-60 часов, приблизительно 54-66 часов или приблизительно 60-72 часа. В одном конкретном варианте осуществления время стимуляции составляет приблизительно 48 часов или по меньшей мере приблизительно 48 часов. В других вариантах осуществления время стимуляции составляет приблизительно 44-52 часа. В определенных вариантах осуществления время стимуляции составляет приблизительно 40-44 часа, приблизительно 40-48 часов, приблизительно 40-52 часа или приблизительно 40-56 часов. В одном варианте осуществления время стимуляции составляет приблизительно 0-24 часа, и популяция лимфоцитов является только полученной.

[089] Другие условия для стимулирования популяции лимфоцитов, описанной в данном документе, могут включать уровень СО₂. В некоторых вариантах осуществления уровень СО₂ для стимуляции составляет приблизительно 1,0-10% СО₂. В некоторых вариантах осуществления уровень СО₂ для стимуляции составляет приблизительно 1,0%, приблизительно 2,0%, приблизительно 3,0%, приблизительно 4,0%, приблизительно 5,0%, приблизительно 6,0%, приблизительно 7,0%, приблизительно 8,0%, приблизительно 9,0% или приблизительно 10,0% СО₂. В одном варианте осуществления уровень СО₂ для стимуляции составляет приблизительно 3-7% СО₂. В одном варианте осуществления уровень СО₂ для стимуляции составляет приблизительно 4-6% СО₂. В еще одних вариантах осуществления уровень СО₂ для стимуляции составляет приблизительно 4,5-5,5% СО₂. В одном конкретном варианте осуществления уровень СО₂ для стимуляции составляет приблизительно 5% СО₂.

[090] Условия для стимуляции популяции лимфоцитов могут включать температуру, период времени стимуляции и/или присутствие СО₂ на некотором уровне в любой комбинации. Например, стадия стимулирования популяции лимфоцитов может включать стимулирование популяции лимфоцитов с помощью одного или более стимулирующих Т-клетки средств при температуре, составляющей приблизительно 36-38°С, в течение периода времени, составляющего приблизительно 44-52 часа, и при присутствии СО₂ на уровне, составляющем приблизительно 4,5-5,5% СО₂.

[091] Концентрация лимфоцитов, применимая для способов в данном документе, может составлять приблизительно 0,5-10,0×10⁶ клеток/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация лимфоцитов составляет приблизительно 1,0-2,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-3,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-4,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-5,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-6,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-7,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-8,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-9,0×10⁶ клеток/мл или приблизительно 1,0-10,0×10⁶ клеток/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация лимфоцитов составляет приблизительно 1,0-2,0×10⁶ клеток/мл или 2,0-3,0×10⁶ клеток/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация лимфоцитов составляет приблизительно 1,0-1,2×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-1,4×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-1,6×10⁶ клеток/мл, приблизительно 1,0-1,8×10⁶ клеток/мл или приблизительно 1,0-2,0×10⁶ клеток/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация лимфоцитов составляет приблизительно 2,1-3,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 2,1-3,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 2,1-3,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 2,4-3×10⁶ клеток/мл, приблизительно 2,5-3,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 2,6-3,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 2,7-3,0×10⁶ клеток/мл, приблизительно 2,8-3,0×10⁶ клеток/мл или 2,8-3,0×10⁶ клеток/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация лимфоцитов составляет по меньшей мере приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл, 0,3×10⁶ клеток/мл, 0,4×10⁶ клеток/мл, 0,5×10⁶ клеток/мл, 0,6×10⁶ клеток/мл, 0,7×10⁶ клеток/мл, 0,8×10⁶ клеток/мл, 0,9×10⁶ клеток/мл, 1,0×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 1,1×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 1,2×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 1,3×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 1,4×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 1,5×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 1,6×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 1,7×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 1,8×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 1,9×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 4,0×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 6,0×10⁶ клеток/мл, по меньшей мере приблизительно 8,0×10⁶ или по меньшей мере приблизительно 10,0×10⁶ клеток/мл.

[092] Антитело к CD3 (или его функциональный фрагмент), антитело к CD28 (или его функциональный фрагмент) или комбинация антител к CD3 и CD28 могут быть использованы в соответствии со стадией стимулирования популяции лимфоцитов. Можно применять любое растворимое или иммобилизованное антитело к CD2, антитело к CD3 и/или антитело к CD28 или их функциональный фрагмент (например, клон OKT3 (антитело к CD3), клон 145-2С11 (антитело к CD3), клон UCHT1 (антитело к CD3), клон L293 (антитело к CD28), клон 15Е8 (антитело к CD28)). В некоторых аспектах антитела можно приобрести коммерчески у поставщиков, известных в данной области техники, включая без ограничения Miltenyi Biotec (например, реагент для промышленного масштаба TransAct™ для Т-клеток, №130-109-104), BD Biosciences (например, MACS GMP CD3 pure 1 мг/мл, № по каталогу 170-076-116) и eBioscience, Inc. Кроме того, специалисту в данной области техники будет понятно, как получить антитело к CD3 и/или CD28 с применением стандартных способов. В некоторых вариантах осуществления одно или более стимулирующих Т-клетки средств, которые применяют в соответствии со стадией стимулирования популяции лимфоцитов, включают антитело или его функциональный фрагмент, которые нацеливаются на стимулирующую или костимулирующую молекулу Т-клетки в присутствии Т-клеточного цитокина. В одном аспекте одно или более стимулирующих Т-клетки средств включают антитело к CD3 и IL-2. В определенных вариантах осуществления стимулирующее Т-клетки средство включает антитело к CD3 при концентрации, составляющей от приблизительно 20 нг/мл до 100 нг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация антитела к CD3 составляет приблизительно 20 нг/мл, приблизительно 30 нг/мл, приблизительно 40 нг/мл, приблизительно 50 нг/мл, приблизительно 60 нг/мл, приблизительно 70 нг/мл, приблизительно 80 нг/мл, приблизительно 90 нг/мл или приблизительно 100 нг/мл. В одном конкретном варианте осуществления концентрация антитела к CD3 составляет приблизительно 50 нг/мл.

[093] Способы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать трансдуцирование популяции активированных Т-клеток с помощью вирусного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует представляющий интерес белок (например, CAR), с применением одноцикловой трансдукции для получения популяции трансдуцированных Т-клеток. Несколько рекомбинантных вирусов применялись в качестве вирусных векторов для доставки генетического материала в клетку. Вирусные векторы, которые можно применять в соответствии со стадией трансдукции, могут представлять собой вектор на основе любого экотропного или амфотропного вируса, включая без ограничения рекомбинантные ретровирусные векторы, рекомбинантные лентивирусные векторы, рекомбинантные аденовирусные векторы и рекомбинантные векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает трансдуцирование одной или более Т-клеток с помощью ретровируса. В одном варианте осуществления вирусный вектор, применяемый для трансдукции популяции активированных Т-клеток, представляет собой гамма-ретровирусный вектор MSGV1. Согласно одному аспекту данного варианта осуществления вирусный вектор выращивают в суспензионной культуре в среде, которая является специфической для получения вирусного вектора, при этом она обозначается в данном документе как «инокулят вирусного вектора». Для получения инокулята вирусного вектора в соответствии со способами, представленными в данном документе, можно применять любые подходящие ростовые среды и/или добавки для выращивания вирусных векторов. Согласно некоторым аспектам инокулят вирусного вектора добавляют в культуральную среду на стадии трансдукции.

[094] В некоторых вариантах осуществления одну или более Т-клеток можно трансдуцировать с помощью лентивируса. В одном варианте осуществления лентивирус содержит гетерологичный ген, кодирующий представляющий интерес белок. В одном конкретном варианте осуществления представляющий интерес белок способен связывать антиген на поверхности клетки-мишени, например, на поверхности опухолевой клетки, и может представлять собой CAR.

[095] Условия трансдуцирования популяции активированных Т-клеток, описанной в данном документе, могут включать определенное время, определенную температуру и/или присутствие СО₂ на определенном уровне. В некоторых вариантах осуществления температура трансдукции составляет приблизительно 34°С, приблизительно 35°С, приблизительно 36°С, приблизительно 37°С или приблизительно 38°С. В одном варианте осуществления температура трансдукции составляет приблизительно 34-38°С. В другом варианте осуществления температура трансдукции составляет приблизительно 35-37°С. В другом варианте осуществления температура трансдукции составляет приблизительно 36-38°С. В еще одном варианте осуществления температура трансдукции составляет приблизительно 36-37°С. В одном конкретном варианте осуществления температура трансдукции составляет приблизительно 37°С.

[096] В определенных вариантах осуществления время трансдукции составляет приблизительно 0-36 часов после активации. В некоторых вариантах осуществления время трансдукции составляет приблизительно 12-16 часов, приблизительно 12-20 часов, приблизительно 12-24 часа, приблизительно 12-28 часов или приблизительно 12-32 часа. В других вариантах осуществления время трансдукции составляет приблизительно 20 часов или по меньшей мере приблизительно 20 часов. В одном варианте осуществления время трансдукции составляет приблизительно 16-24 часов. В других вариантах осуществления время трансдукции составляет по меньшей мере приблизительно 14 часов, по меньшей мере приблизительно 16 часов, по меньшей мере приблизительно 18 часов, по меньшей мере приблизительно 20 часов, по меньшей мере приблизительно 22 часа, по меньшей мере приблизительно 24 часа или по меньшей мере приблизительно 26 часов.

[097] В определенных вариантах осуществления уровень СО₂ для трансдукции составляет приблизительно 1,0-10% СО₂. В других вариантах осуществления уровень СО₂ для трансдукции составляет приблизительно 1,0%, приблизительно 2,0%, приблизительно 3,0%, приблизительно 4,0%, приблизительно 5,0%, приблизительно 6,0%, приблизительно 7,0%, приблизительно 8,0%, приблизительно 9,0% или приблизительно 10,0% СО₂. В одном варианте осуществления уровень СО₂ для трансдукции составляет приблизительно 3-7% СО₂. В другом варианте осуществления уровень СО₂ для трансдукции может составлять приблизительно 4-6% СО₂. В другом варианте осуществления уровень СО₂ для трансдукции составляет приблизительно 4,5-5,5% СО₂. В одном конкретном варианте осуществления уровень СО₂ для трансдукции составляет приблизительно 5% СО₂.

[098] В некоторых вариантах трансдуцирование популяции активированных Т-клеток, описанной в данном документе, можно осуществлять в течение конкретного времени, при определенной температуре и/или в присутствии СО₂ на определенном уровне в любой комбинации: температура приблизительно 36-38°С, в течение приблизительно 16-24 часов и в присутствии СО₂ на уровне, составляющем приблизительно 4,5-5,5% СО₂.

[099] Способы, представленные в данном документе, могут включать осуществление размножения популяции одной или более трансдуцированных Т-клеток в течение конкретного периода времени, чтобы получить популяцию сконструированных Т-клеток. Предварительно определенный период времени для размножения может представлять собой любой подходящий период времени, который позволяет получить (i) количество клеток в популяции сконструированных Т-клеток, достаточное для по меньшей мере одной дозы для введения пациенту, (ii) популяцию сконструированных Т-клеток с подходящей долей ювенильных клеток по сравнению с типичным более длинным процессом, или (iii) как (i), так и (ii). Данный период времени будет зависеть от представляющего интерес белка, экспрессируемого Т-клетками, применяемого вектора, дозы, которая необходима для осуществления терапевтического эффекта, и других переменных. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предварительно определенный период времени для размножения может составлять 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней, 15 дней, 16 дней, 17 дней, 18 дней, 19 дней, 20 дней, 21 день или более 21 дня. В некоторых аспектах период времени для размножения является более коротким, чем в способах размножения, известных в данной области техники. Например, предварительно определенный период времени для размножения может быть короче на по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75% или может быть короче на более 75%. В одном аспекте период времени для размножения составляет приблизительно 3 дня, а период времени от обогащения популяции лимфоцитов до получения сконструированных Т-клеток составляет приблизительно 6 дней.

[0100] Условия для осуществления размножения популяции трансдуцированных Т-клеток могут включать температуру и/или присутствие СО₂ на некотором уровне. В определенных вариантах осуществления температура составляет приблизительно 34°С, приблизительно 35°С, приблизительно 36°С, приблизительно 37°С или приблизительно 38°С. В одном варианте осуществления температура составляет приблизительно 34-38°С. В другом варианте осуществления температура составляет приблизительно 35-37°С. В другом варианте осуществления температура составляет приблизительно 36-38°С. В еще одном варианте осуществления температура составляет приблизительно 36-37°С. В одном конкретном варианте осуществления температура составляет приблизительно 37°С. В определенных вариантах осуществления уровень СО₂ составляет приблизительно 1,0-10% СО₂. В других вариантах осуществления уровень СО₂ составляет приблизительно 1,0%, приблизительно 2,0%, приблизительно 3,0%, приблизительно 4,0%, приблизительно 5,0%, приблизительно 6,0%, приблизительно 7,0%, приблизительно 8,0%, приблизительно 9,0% или приблизительно 10,0% СО₂. В одном варианте осуществления уровень СО₂ составляет приблизительно 4,5-5,5% СО₂. В другом варианте осуществления уровень СО₂ составляет приблизительно 5% СО₂. В других вариантах осуществления уровень СО₂ составляет приблизительно 3,5%, приблизительно 4,0%, приблизительно 4,5%, приблизительно 5,0%, приблизительно 5,5% или приблизительно 6,5% СО₂. В некоторых вариантах осуществления условия для осуществления размножения популяции трансдуцированных Т-клеток включают температуру и/или присутствие СО₂ на некотором уровне в любой комбинации. Например, условия для осуществления размножения популяции трансдуцированных Т-клеток включают температуру, составляющую приблизительно 36-38°С, и присутствие СО₂ на уровне, составляющем приблизительно 4,5-5,5% СО₂.

[0101] Каждую стадию способов, представленных в данном документе, можно выполнять в полузакрытой или закрытой системе. В определенных вариантах осуществления закрытая система представляет собой закрытую систему на основе культурального пакета, содержащую любые подходящие пакеты для клеточных культур (например, пакеты для дифференцировки клеток Miltenyi Biotec MACS^® GMP, пакеты для клеточных культур Origen Biomedical PermaLife). В некоторых вариантах осуществления пакеты для клеточных культур, используемые в закрытой системе на основе культурального пакета, покрывают фрагментом рекомбинантного человеческого фибронектина во время стадии трансдукции. Фрагмент рекомбинантного человеческого фибронектина может содержать три функциональных домена: центральный клеточно-связывающий домен, гепарин-связывающий домен II и последовательность CS1. Фрагмент рекомбинантного человеческого фибронектина можно применять для повышения эффективности ретровирусной трансдукции генов в иммунные клетки за счет содействия колокализации клеток-мишеней и вирусного вектора. В определенных вариантах осуществления фрагмент рекомбинантного человеческого фибронектина представляет собой RETRONECTIN^® (Takara Bio, Япония). В некоторых вариантах осуществления пакеты для клеточных культур покрывают фрагментом рекомбинантного человеческого фибронектина при концентрации, составляющей приблизительно 1-60 мкг/мл или приблизительно 1-40 мкг/мл. В других вариантах осуществления пакеты для клеточных культур покрывают фрагментом рекомбинантного человеческого фибронектина при концентрации, составляющей приблизительно 1-20 мкг/мл, 20-40 мкг/мл или 40-60 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления пакеты для клеточных культур покрывают с помощью приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, приблизительно 6 мкг/мл, приблизительно 7 мкг/мл, приблизительно 8 мкг/мл, приблизительно 9 мкг/мл, приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 11 мкг/мл, приблизительно 12 мкг/мл, приблизительно 13 мкг/мл, приблизительно 14 мкг/мл, приблизительно 15 мкг/мл, приблизительно 16 мкг/мл, приблизительно 17 мкг/мл, приблизительно 18 мкг/мл, приблизительно 19 мкг/мл или приблизительно 20 мкг/мл фрагмента рекомбинантного человеческого фибронектина. В других вариантах осуществления пакеты для клеточных культур покрывают с помощью приблизительно 2-5 мкг/мл, приблизительно 2-10 мкг/мл, приблизительно 2-20 мкг/мл, приблизительно 2-25 мкг/мл, приблизительно 2-30 мкг/мл, приблизительно 2-35 мкг/мл, приблизительно 2-40 мкг/мл, приблизительно 2-50 мкг/мл или приблизительно 2-60 мкг/мл фрагмента рекомбинантного человеческого фибронектина. В определенных вариантах осуществления пакеты для клеточных культур покрывают с помощью по меньшей мере приблизительно 2 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 5 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 10 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 15 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 20 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 25 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 30 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 40 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 50 мкг/мл или по меньшей мере приблизительно 60 мкг/мл фрагмента рекомбинантного человеческого фибронектина. В одном конкретном варианте осуществления пакеты для клеточных культур покрывают с помощью фрагмента рекомбинантного человеческого фибронектина при концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 10 мкг/мл. Пакеты для клеточных культур, применяемые в закрытой системе на основе культурального пакета, можно необязательно блокировать с помощью человеческого сывороточного альбумина (HSA) во время стадии трансдукции. В альтернативном варианте осуществления пакеты для клеточных культур не блокируют с помощью HSA во время стадии трансдукции.

[0102] В других аспектах по меньшей мере одно из а) приведения одной или более Т-клеток в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), (b) трансдуцирования популяции активированных Т-клеток и (с) осуществления размножения популяции трансдуцированных Т-клеток осуществляют с применением культуральной среды для Т-клеток с человеческой сывороткой крови или без нее. В некоторых аспектах каждое из (а)-(с) осуществляют с применением культуральной среды для Т-клеток, не содержащей добавленной сыворотки крови. Упоминается в данном документе термин «бессывороточная среда» или «бессывороточная культуральная среда» означает, что применяемая ростовая среда не дополнена сывороткой крови (например, человеческой сывороткой крови или бычьей сывороткой крови). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления сыворотку не добавляют в культуральную среду в качестве индивидуального отдельного и особого ингредиента с целью поддержания жизнеспособности, активации и роста культивируемых клеток. Любую подходящую ростовую среду, представляющую собой культуральную среду для Т-клеток, можно применять для культивирования клеток в суспензии в соответствии со способами, описанными в данном документе. Например, ростовая среда для Т-клеток может содержать без ограничения стерильный раствор с низким содержанием глюкозы, который содержит подходящее количество буфера, магния, кальция, пирувата натрия и бикарбоната натрия. В одном варианте осуществления ростовая среда для Т-клеток представляет собой OPTMIZER™ (Life Technologies). В отличие от типичных способов получения сконструированных Т-клеток в способах, описанных в данном документе, можно применять культуральную среду, не дополненную сывороткой крови (например, человеческой или бычьей).

Наноматрица на основе антител к CD3/28

[0103] Наноматрица на основе антител к CD3/28 по настоящему изобретению представляет собой матрицы нанометрового размера, содержащие антитела и/или их фрагменты, которые связывают CD3 и CD28, и предоставлены Miltenyi Biotec Inc (Оберн, Калифорния) в виде реагента TransAct™ для Т-клеток (далее в данном документе «TransAct™»). Реагент TransAct™ представляет собой коллоидный реагент, состоящий из наноразмерных кристаллов оксида железа, заключенных в биосовместимую полисахаридную матрицу, с общим диаметром, составляющим приблизительно 100 нм. Антитела к CD3 (клон OKT3) и CD28 (клон 15Е8) ковалентно присоединены к матрице. См., например, Casati et al., Cancer Immunol Immunother 2013 Oct; 62(10): 1563-73, Casati et al., MACS & more, Vol 15, Feb. 2013, и US 2014/0087462.

Т-клетки

[0104] Одну или более Т-клеток, описанных в данном документе, можно получить из любого источника, в том числе, например, от донора-человека. Донор может представлять собой субъекта, нуждающегося в противораковом лечении, например лечении с помощью одной или более Т-клеток, полученных с помощью способов, описанных в данном документе (т.е. аутологичного донор), или может представлять собой индивидуума, который является донором образца лимфоцитов, которые после получении популяции клеток, полученных с помощью способов, описанных в данном документе, будут применяться для лечения другого индивидуума или пациента с раком (т.е. аллогенного донора). Популяция лимфоцитов может быть получена от донора с помощью любого подходящего способа, применяемого в данной области техники.

[0105] Способы, описанные в данном документе, можно применять для повышения процентной доли менее дифференцированных, незрелых клеток (например, T_SCM-клеток) в популяции Т-клеток посредством приведения одной или более клеток в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов). Как описано в данном документе, неожиданным образом было обнаружено, что значительная активация одной или более Т-клеток с помощью наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, приводит к повышению процентной доли наивных и незрелых Т-клеток в условиях in vitro. В частности, после активации одна или более Т-клеток могут экспрессировать один или более генов, свойственных недифференцированным или незрелым Т-клеткам. Один или более генов, свойственных недифференцированным или незрелым Т-клеткам, могут быть выбраны из группы, состоящей из CD8, CD45RA, CCR7, CD45RO, CD62L, CD28, CD95, IL-7Rα, CXCR4, TCF7, FOXO1, ID3, BCL6 и любой их комбинации. Например, приведение одной или более Т-клеток в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов) приводит к повышению процента клеток, экспрессирующих один или более генов, свойственных недифференцированным или незрелым Т-клеткам, выбранных из CD62L, CD45RA, CD45RO и любой их комбинации.

[0106] В других вариантах осуществления одна или более Т-клеток экспрессируют CD62L, CD45RA и/или CD45RO после приведения одной или более Т-клеток в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов). В одном конкретном варианте осуществления более высокая процентная доля одной или более Т-клеток экспрессируют CD62L, CD45RA и/или CD45RO после приведения в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/28 по сравнению с экспрессией до приведения в контакт. В одном конкретном варианте осуществления более высокая процентная доля одной или более Т-клеток, которые были приведены в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), экспрессируют CD62L, CD45RA и/или CD45RO, чем популяция Т-клеток, которые были приведены в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или больше (например, 17,5, 20, 30 или 40 объемов).

Т-клеточная терапия

[0107] В настоящем изобретении представлены способы повышения процентной доли незрелых, менее дифференцированных Т-клеток в популяции посредством приведения одной или более Т-клеток в контакт при отношении один объем наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, к 17 объемам популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемам) по сравнению с популяцией Т-клеток, которые были приведены в контакт при отношении один объем наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, к 17 объемам популяции Т-клеток или больше (например, 17,5, 20, 30 или 40 объемам). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение одной или более Т-клеток, полученных с применением способов, представленных в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Специалисту в данной области техники будет понятно, что одну или более Т-клеток, полученных с помощью способов, представленных в данном документе, можно применять в любом способе лечения пациента, включающем введение пациенту одной или более Т-клеток.

[0108] Например, но не ограничиваясь этим, способы, описанные в данном документе, могут приводить к повышению эффективности Т-клеточной терапии, которая может представлять собой адоптивную Т-клеточную терапию, выбранную из группы, состоящей из иммунотерапии инфильтрирующими опухоль лимфоцитами (TIL), терапии аутологичными клетками, терапии сконструированными аутологичными клетками (еАСТ™), трансплантации аллогенных Т-клеток, терапии сконструированными аллогенными Т-клетками, трансплантации клеток, отличных от Т-клеток, и любой их комбинации. Адоптивная Т-клеточная терапия в широком смысле включает любой способ отбора, обогащения в условиях in vitro и введения пациенту аутологичных или аллогенных Т-клеток, которые распознают опухолевые клетки и способны связываться с ними. Иммунотерапия TIL представляет собой тип адоптивной Т-клеточной терапии, при которой выделяют, обогащают в условиях in vitro и вводят пациенту лимфоциты, способные инфильтрировать опухолевую ткань. Клетки TIL могут быть или аутологичными, или аллогенными. Терапия аутологичными клетками представляет собой адоптивную Т-клеточную терапию, которая охватывает выделение Т-клеток, способных нацеливаться на опухолевые клетки, от пациента, обогащение Т-клеток в условиях in vitro и введение Т-клеток обратно тому же пациенту. Трансплантация аллогенных Т-клеток может включать трансплантацию встречающихся в природе Т-клеток, размноженных в условиях ex vivo, или генетически сконструированных Т-клеток. Трансплантация клеток, отличных от Т-клеток, может включать виды аутологичной или аллогенной терапии с помощью клеток, отличных от Т-клеток, таких как без ограничения клетки-естественные киллеры (NK).

[0109] В одном конкретном варианте осуществления Т-клеточная терапия по настоящему изобретению представляет собой терапию сконструированными аллогенными Т-клетками. В соответствии с данным вариантом осуществления способ может включать сбор клеток крови от донора. Выделенные клетки крови (например, Т-клетки) затем можно подвергать генетическому конструированию для снижения экспрессии одного или более встречающихся в природе белков (например, эндогенного TCR), приведению в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов) при плотности клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл. Т-клетки могут быть сконструированы для экспрессии химерного антигенного рецептора («сконструированные CAR-T-клетки») или Т-клеточного рецептора («сконструированные TCR-T-клетки»). В одном конкретном варианте осуществления сконструированные аллогенные CAR-T-клетки или сконструированные TCR-T-клетки, которые приводили в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов), затем вводят субъекту. В некоторых вариантах осуществления сконструированные Т-клетки направлены на солидную опухоль или опухоль жидких тканей у субъекта.

[0110] В одном варианте осуществления одну или более Т-клеток можно сконструировать для экспрессии химерного антигенного рецептора. Химерный антигенный рецептор может содержать связывающую молекулу для опухолевого антигена. Связывающая молекула может представлять собой антитело или его антигенсвязывающую молекулу. Например, антигенсвязывающая молекула может быть выбрана из Fab, Fab', Fv, F(ab')₂, верблюжьего антитела и dAb и любых их фрагментов или комбинаций.

[0111] Химерный антигенный рецептор может быть сконструирован для нацеливания на конкретный опухолевый антиген. В некоторых вариантах осуществления опухолевый антиген выбран из ВСМА, EGFRvIII, Flt-3, WT-1, CD20, CD23, CD30, CD38, CD70, CD33, CD133, MHC-WT1, TSPAN10, MHC-PRAME, Liv1, ADAM10, CHRNA2, LeY, NKG2D, CS1, CD44v6, ROR1, CD19, клаудина-18.2 (клаудин-18A2 или изоформа 2 клаудина-18), DLL3 (дельта-подобный белок 3, гомолог 3 дельта-белка Drosophila, дельта-3), Muc17 (муцин-17, Muc3, Muc3), FAP-альфа (белок-альфа активации фибробластов), Ly6G6D (белок локуса комплекса антигена-6 лимфоцитов G6d, c6orf23, G6D, MEGT1, NG25), RNF43 (убиквитин-протеинлигаза Е3 RNF43, белок с «цинковыми пальцами» RING 43), ErbB2 (HER2/neu), карциноэмбрионального антигена (СЕА), адгезивной молекулы эпителиальных клеток (ЕрСАМ), рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), CD40, дисиалоганглиозида GD2, GD3, лектиноподобной молекулы-1 С-типа (CLL-1), протоково-эпителиального муцина, gp36, TAG-72, гликосфинголипидов, антигена, ассоциированного с глиомой, человеческого хорионического гонадотропина-β, альфафетопротеина (AFP), лектин-реактивного AFP, тиреоглобулина, RAGE-1, MN-CA IX, теломеразной обратной транскриптазы человека, RU1, RU2 (AS), карбоксилэстеразы кишечника, mut hsp70-2, M-CSF, простазы, простатспецифического антигена (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, р53, простеина, PSMA, сурвивина и теломеразы, опухолевого антигена-1 карциномы предстательной железы (РСТА-1), MAGE, ELF2M, эластазы нейтрофилов, эфрина В2, CD22, инсулинового фактора роста-1 (IGF1), IGF-II, рецептора IGFI, мезотелина, молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС), презентирующей опухолеспецифический пептидный эпитоп, 5Т4, O1, Nkp30, опухолевых стромальных антигенов, экстрадомена-A (EDA) и экстрадомена-В (EDB) фибронектина, а также AI-домена тенасцина-С (TnC AI) и белка, ассоциированного с фибробластами (fap), LRP6, ассоциированного с меланомой хондроитинсульфатпротеогликана (MCSP), MARTI, MUC1, LMP2, идиотипа, NY-ESO-1, Ras-мутанта, gp100, протеиназы 3, bcr-abl, тирозиназы, hTERT, EphA2, ML-TAP, ERG, NA17, PAX3, ALK, андрогенного рецептора, специфического для линии дифференцировки или тканеспецифического антигена, такого как CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD34, CD79, CD116, CD117, CD135, CD123, CD138, CTLA-4, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), эндоглина, молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС), MUC16, PSCA, Trop2, CD171 (L1CAM), СА9, STEAP1, VEGFR2 и любой их комбинации.

[0112] Способы, представленные в данном документе, могут предусматривать Т-клеточную терапию, включающую перенос одной или более Т-клеток пациенту. Т-клетки могут быть введены в терапевтически эффективном количестве. Например, терапевтически эффективное количество Т-клеток, например сконструированных CAR⁺ Т-клеток или сконструированных TCR⁺ Т-клеток, может составлять по меньшей мере приблизительно 10⁴ клеток, по меньшей мере приблизительно 10 клеток, по меньшей мере приблизительно 10⁶ клеток, по меньшей мере приблизительно 10⁷ клеток, по меньшей мере приблизительно 10⁸ клеток, по меньшей мере приблизительно 10⁹ или клеток, по меньшей мере приблизительно 10¹⁰. В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество Т-клеток, например, сконструированных CAR+ Т-клеток или сконструированных TCR⁺ Т-клеток, составляет приблизительно 10⁴ клеток, приблизительно 10⁵ клеток, приблизительно 10⁶ клеток, приблизительно 10⁷ клеток или приблизительно 10⁸ клеток. В одном конкретном варианте осуществления терапевтически эффективное количество Т-клеток, например сконструированных CAR⁺ Т-клеток или сконструированных TCR⁺ Т-клеток, составляет приблизительно 2×10⁶ клеток/кг, приблизительно 3×10⁶ клеток/кг, приблизительно 4×10⁶ клеток/кг, приблизительно 5×10⁶ клеток/кг, приблизительно 6×10⁶ клеток/кг, приблизительно 7×10⁶ клеток/кг, приблизительно 8×10⁶ клеток/кг, приблизительно 9×10⁶ клеток/кг, приблизительно 1×10⁷ клеток/кг, приблизительно 2×10⁷ клеток/кг, приблизительно 3×10⁷ клеток/кг, приблизительно 4×10⁷ клеток/кг, приблизительно 5×10⁷ клеток/кг, приблизительно 6×10⁷ клеток/кг, приблизительно 7×10⁷ клеток/кг, приблизительно 8×10⁷ клеток/кг или приблизительно 9×10⁷ клеток/кг.

[0113] В некоторых вариантах осуществления перед введением Т-клеточной терапии пациент подвергается прекондиционированию. Прекондиционирование пациента можно осуществлять в соответствии с любыми способами, известными в данной области техники, включая без ограничения лечение с помощью одного или более химиотерапевтических средств и/или лучевой терапии. В некоторых вариантах осуществления прекондиционирование может включать любое лечение, которое приводит к снижению числа эндогенных лимфоцитов, удалению цитокинового стока, повышению уровня одного или более гомеостатических цитокинов или провоспалительных факторов в сыворотке крове, усилению эффекторной функции Т-клеток, введенных после кондиционирования, усилению активации и/или доступности антигенпрезентирующих клеток или любой их комбинации перед Т-клеточной терапией.

Лечение рака

[0114] Способы по настоящему изобретению можно применять для лечения рака у субъекта, уменьшения размера опухоли, уничтожения опухолевых клеток, предотвращения пролиферации опухолевых клеток, предотвращения роста опухоли, устранения опухоли у пациента, предотвращения рецидива опухоли, предотвращения метастазирования опухоли, индуцирования ремиссии у пациента или любой их комбинации. В определенных вариантах осуществления способы приводят к индукции полного ответа. В других вариантах осуществления способы приводят к индукции частичного ответа.

[0115] Один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на способ лечения опухоли у субъекта, нуждающегося в Т-клеточной терапии, включающий введение субъекту одной или более Т-клеток, где одна или более Т-клеток были приведены в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов) при плотности клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения или уменьшения размера опухоли или торможения роста опухоли у субъекта, нуждающегося в Т-клеточной терапии, включающему введение субъекту одной или более Т-клеток, где одна или более Т-клеток были приведены в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например, Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов) при плотности клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл.

[0116] Виды рака, которые можно подвергать лечению, включают опухоли, которые не васкуляризированы, еще не васкуляризированы в значительной степени или васкуляризированы. Рак также может включать солидные или отличные от солидных опухоли. В определенных вариантах осуществления рак может быть выбран из опухоли, происходящей из острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелоидного лейкоза (AML), аденокистозной карциномы, адренокортикальной карциномы, связанных со СПИДом видов рака, рака анального канала, рака аппендикса, видов астроцитомы, атипичной тератоидной/рабдоидной опухоли центральной нервной системы, В-клеточного лейкоза, лимфомы или других В-клеточных злокачественных новообразований, таких как NHL, базальноклеточной карциномы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, рака кости, остеосаркомы и злокачественной фиброзной гистиоцитомы, глиомы ствола головного мозга, опухолей головного мозга, рака молочной железы, бронхиальных опухолей, лимфомы Беркитта, карциноидных опухолей, видов рака центральной нервной системы, рака шейки матки, хордомы, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), хронического миелогенного лейкоза (CML), хронических миелопролиферативных нарушений, рака толстой кишки, колоректального рака, краниофарингиомы, кожной Т-клеточной лимфомы, эмбриональных опухолей центральной нервной системы, рака эндометрия, эпендимобластомы, эпендимомы, рака пищевода, эстезионейробластомы, опухолей семейства саркомы Юинга, экстракраниальной герминогенно-клеточной опухоли, экстрагонадной герминогенно-клеточной опухоли, рака внепеченочного желчного протока, рака глаза, злокачественной фиброзной гистиоцитомы кости и остеосаркомы, рака желчного пузыря, желудочного рака (рака желудка), карциноидной опухоли желудочно-кишечного тракта, стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (GIST), саркомы мягких тканей, герминогенно-клеточной опухоли, гестационной трофобластической опухоли, глиомы, волосатоклеточного лейкоза, рака головы и шеи, рака сердца, гепатоцеллюлярного рака (рака печени), гистиоцитоза, лимфомы Ходжкина, гипофарингеального рака, внутриглазной меланомы, опухолей островковых клеток (эндокринной части поджелудочной железы), саркомы Капоши, рака почки, гистиоцитоза из клеток Лангерганса, рака гортани, лейкоза, рака губы и полости рта, рака печени (первичного), лобулярной карциномы in situ (LCIS), рака легкого, лимфомы, макроглобулинемии, рака молочной железы у мужчин, злокачественной фиброзной гистиоцитомы кости и остеосаркомы, медуллобластомы, медуллоэпителиомы, меланомы, карциномы из клеток Меркеля, мезотелиомы, метастатического плоскоклеточного рака шеи с первичной карциномой срединного тракта неизвестного происхождения с участием гена NUT, рака ротовой полости, синдромов множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы/новообразования из плазматических клеток, грибовидного микоза, миелодиспластических синдромов, миелодиспластических/миелопролиферативных новообразований, хронического миелогенного лейкоза (CML), острого миелоидного лейкоза (AML), множественной миеломы, миелопролиферативных нарушений, рака полости носа и околоносовых пазух, рака носоглотки, нейробластомы, неходжкинской лимфомы, немелкоклеточного рака легкого, рака ротовой полости, рака полости рта, рака ротоглотки, остеосаркомы и злокачественной фиброзной гистиоцитомы кости, рака яичника, рака поджелудочной железы, папилломатоза, параганглиомы, рака околоносовых пазух и полости носа, рака паращитовидной железы, рака полового члена, рак глотки, феохромоцитомы, паренхиматозных опухолей шишковидной железы с промежуточной дифференцировкой, пинеобластомы и супратенториальных примитивных нейроэктодермальных опухолей, опухоли гипофиза, новообразования из плазматических клеток/множественной миеломы, плевропульмональной бластомы, рака молочной железы во время беременности, первичной лимфомы центральной нервной системы (ЦНС), рака предстательной железы, рака прямой кишки, почечно-клеточного рака (рака почки), рака почечной лоханки и мочеточника, переходно-клеточного рака, ретинобластомы, рабдомиосаркомы, рака слюнной железы, саркомы, синдрома Сезари, мелкоклеточного рака легкого, рака тонкого кишечника, саркомы мягких тканей, плоскоклеточной карциномы, плоскоклеточного рака шеи, рака желудка (желудочного рака), супратенториальных примитивных нейроэктодермальных опухолей, Т-клеточной лимфомы кожи, рака яичка, рака горла, тимомы и карциномы тимуса, рака щитовидной железы, переходно-клеточного рака почечной лоханки и мочеточника, трофобластической опухоли, рака мочеточника и почечной лоханки, рака уретры, рака матки, саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы, макроглобулинемии Вальденстрема, опухоли Вильмса.

[0117] В одном варианте осуществления способ можно применять для лечения опухоли, где опухоль представляет собой лимфому или лейкоз. Лимфома и лейкоз представляют собой виды рака крови, которые, в частности, поражают лимфоциты. Все лейкоциты в крови происходят из одного типа мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток, находящихся в костном мозге. Данная стволовая клетка продуцирует как миелоидные клетки-предшественники, так и лимфоидные клетки-предшественники, которые затем дают начало различным типам лейкоцитов, встречающимся в организме. Лейкоциты, берущие начало из миелоидных клеток-предшественников, включают Т-лимфоциты (Т-клетки), В-лимфоциты (В-клетки), клетки-естественные киллеры и плазматические клетки. Лейкоциты, берущие начало из лимфоидных клеток-предшественников, включают мегакариоциты, тучные клетки, базофилы, нейтрофилы, эозинофилы, моноциты и макрофаги. Виды лимфомы и лейкоза могут поражать один или более из этих типов клеток у пациента.

[0118] Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способ можно применять для лечения лимфомы или лейкоза, где лимфома или лейкоз представляют собой В-клеточное злокачественное новообразование. Примеры В-клеточных злокачественных новообразований включают без ограничения виды неходжкинской лимфомы (NHL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому (SLL/CLL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), FL, лимфому из клеток маргинальной зоны (MZL), экстранодальную лимфому (MALT-лимфому), нодальную лимфому (моноцитоидную В-клеточную лимфому), селезеночную, диффузную крупноклеточную лимфому, В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз/лимфому, лимфому Беркитта и лимфобластную лимфому. В некоторых вариантах осуществления лимфома или лейкоз выбраны из В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза/мелкоклеточной лимфомы, В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы (например, макроглобулинемии Вальденстрема), лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки, волосатоклеточного лейкоза, новообразований из плазматических клеток (например, миеломы из плазматических клеток (т.е. множественной миеломы) или плазмоцитомы), экстранодальной В-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны (например, MALT-лимфомы), нодальной В-клеточной лимфомы из клеток маргинальной зоны, фолликулярной лимфомы (FL), трансформированной фолликулярной лимфомы (TFL), первичной кожной лимфомы из клеток центра фолликулов, мантийноклеточной лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL), положительной по вирусу Эпштейна-Барр DLBCL, лимфоматоидного гранулематоза, первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной В-клеточной лимфомы (PMBCL), внутрисосудистой крупноклеточной В-клеточной лимфомы, ALK+ крупноклеточной В-клеточной лимфомы, плазмобластной лимфомы, первичной выпотной лимфомы, крупноклеточной В-клеточной лимфомы, возникающей при ассоциированном с HHV8 мультицентрическом заболевании Кастлемана, лимфомы/лейкоза Беркитта, Т-клеточного пролимфоцитарного лейкоза, Т-клеточного лейкоза из крупных гранулярных лимфоцитов, агрессивного NK-клеточного лейкоза, Т-клеточного лейкоза/лимфомы взрослых, экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы, ассоциированной с энтеропатией Т-клеточной лимфомы, гепатоспленической Т-клеточной лимфомы, бластной NK-клеточной лимфомы, грибовидного микоза/синдрома Сезари, первичной кожной анапластической крупноклеточной лимфомы, лимфоматоидного папулёза, периферической Т-клеточной лимфомы, ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы, анапластической крупноклеточной лимфомы, В-лимфобластного лейкоза/лимфомы, В-лимфобластного лейкоза/лимфомы с рекуррентными генетическими аномалиями, Т-лимфобластного лейкоза/лимфомы и лимфомы Ходжкина. В некоторых вариантах осуществления рак является рефрактерным к одному или более видам предшествующего лечения, и/или рак рецидивировал после одного или более видов предшествующего лечения.

[0119] В определенных вариантах осуществления рак выбран из фолликулярной лимфомы, трансформированной фолликулярной лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы и первичной медиастинальной (тимусной) крупноклеточной В-клеточной лимфомы. В одном конкретном варианте осуществления рак представляет собой диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому.

[0120] В некоторых вариантах осуществления рак является рефрактерным к одному или более из химиотерапии, лучевой терапии, иммунотерапии (включая Т-клеточную терапию и/или лечение с помощью антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство), трансплантации аутологичных стволовых клеток или любой их комбинации или рецидивировал после них. В одном конкретном варианте осуществления рак представляет собой рефрактерную диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому.

[0121] В некоторых вариантах осуществления лечение рака осуществляют путем введения субъекту одной или более Т-клеток, где одна или более Т-клеток были приведены в контакт с одним объемом наноматрицы на основе антител к CD3/28, например Transact™ для Т-клеток, на 17 объемов популяции Т-клеток или меньше (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15 или 16 объемов) при плотности клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления одна или более Т-клеток предусматривают сконструированные клетки с CAR или сконструированные клетки с TCR. В одном варианте осуществления сконструированные клетки с CAR или сконструированные Т-клетки осуществляют лечения опухоли у субъекта.

[0122] Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует рассматривать как дополнительно ограничивающие. Содержание всех литературных источников, цитируемых по всей настоящей заявке, явным образом включено в данный документ посредством ссылки.

[0123] Следующие примеры предусмотрены для иллюстрации различных вариантов осуществления настоящего изобретения. Таким образом, обсуждаемые конкретные варианты осуществления не должны рассматриваться в качестве ограничений объема настоящего изобретения. Например, хотя приведенные ниже примеры сконцентрированы на Т-клетках, трансдуцированных химерным антигенным рецептором (CAR), связывающим CD19, специалисту в данной области техники будет понятно, что способы, описанные в данном документе, можно применять к Т-клеткам, трансдуцированным любым CAR. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что различные эквиваленты, изменения и модификации можно выполнять без отклонения от объема настоящего изобретения, и понятно, что такие эквивалентные варианты осуществления должны быть включены в данный документ. Кроме того, все литературные источники, процитированные в настоящем изобретении, настоящим включены в посредством ссылки во всей своей полноте, как если бы они были изложены в данном документе во всей своей полноте.

Варианты осуществления

[0124] Е1. Способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в клеточной популяции, включающий 1) приведение некоторого объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с некоторым объемом исходной клеточной популяции при некотором объемном отношении, где исходная клеточная популяция характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,2×10⁶ клеток/мл до приблизительно 5,8×10⁶ клеток/мл, а объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 17,4 объема исходной клеточной популяции или меньше, и 2) культивирование клеточной популяции в культуральной среде, при этом полученная популяция Т-клеток содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй популяцией Т-клеток, где вторую исходную клеточную популяцию при той же плотности клеток приводят в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 17,5 объема второй исходной клеточной популяции или больше.

[0125] Е2. Способ по Е1, где наноматрица представляет собой наноматрицу Macs^® GMP Transact™ для Т-клеток.

[0126] Е3. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где исходные клеточные популяции получены из периферической крови, костного мозга, ткани лимфатического узла, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцитов, плеврального выпота, ткани селезенки, опухоли, мезенхимальной ткани, линии Т-клеток или системы культивирования клеток на основе искусственного органоида тимуса (ATO).

[0127] Е4. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где исходные клеточные популяции выбраны из группы, состоящей из: Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, хелперных Т-клеток, инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, Т-клеток памяти, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток, относящихся к естественным киллерам, лимфоцитов периферической крови, инфильтрирующих опухоль лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, дендритных клеток, стволовых клеток пуповинной крови, плюрипотентных стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток.

[0128] Е5. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где исходные клеточные популяции представляют собой мононуклеарные клетки периферической крови, прошедшие положительный отбор CD3, CD4 или CD8 Т-клетки или прошедшие отрицательный отбор CD3, CD4 или CD8 Т-клетки.

[0129] Е6. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где исходные клеточные популяции представляют собой мононуклеарные клетки периферической крови.

[0130] Е7. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, где исходные клеточные популяции представляют собой популяции очищенных Т-клеток.

[0131] Е8. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где исходная плотность клеток составляет от по меньшей мере приблизительно 0,50×10⁶ до приблизительно 6,00×10⁶, от приблизительно 0,56×10⁶ до приблизительно 5,72×10⁶, от приблизительно 0,80×10⁶ до приблизительно 4,0×10⁶, от приблизительно 1,00×10⁶ до приблизительно 3,0×10⁶, от приблизительно 2,00×10⁶ до приблизительно 3,5×10⁶ или от приблизительно 2,50×10⁶ до приблизительно 3,5×10⁶.

[0132] Е9. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где плотность клеток составляет приблизительно 2,86×10⁶ клеток/мл.

[0133] Е10. Способ по любому из вариантов осуществления 1-9, где исходная плотность клеток составляет приблизительно 3,00×10⁶ клеток/мл.

[0134] E11. Способ по любому из вариантов осуществления 1-9, где исходная плотность клеток составляет от по меньшей мере приблизительно 0,28×10⁶ до приблизительно 2,86×10⁶, от приблизительно 0,25×10⁶ до приблизительно 2,00×10⁶, от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 2×10⁶, от приблизительно 1,00×10⁶ до приблизительно 2,00×10⁶, от приблизительно 0,80×10⁶ до приблизительно 1,5×10⁶ или от приблизительно 1,20×10⁶ до приблизительно 1,5×10⁶ клеток/мл.

[0135] Е12. Способ по любому из вариантов осуществления 1-8 или 11, где плотность клеток составляет приблизительно 1,43×10⁶ клеток/мл.

[0136] Е13. Способ по любому из вариантов осуществления 1-8 или 11, где исходная плотность клеток составляет приблизительно 1,00×10⁶ клеток/мл.

[0137] E14. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где объемное отношение объема наноматрицы на основе антител к CD3/28 к объему исходной клеточной популяции составляет приблизительно 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1,12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16 или 1:17.

[0138] Е15. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, дополнительно включающий трансдуцирование исходных клеточных популяций до, во время или после культивирования исходных клеточных популяций с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28.

[0139] Е16. Способ по варианту осуществления 15, где исходные клеточные популяции трансдуцируют с помощью лентивирусного вектора, ретровирусного вектора и/или вектора на основе аденоассоциированного вируса.

[0140] E17. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, дополнительно включающий трансфицирование исходных клеточных популяций до, во время или после культивирования исходных клеточных популяций с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28.

[0141] Е18. Способ по варианту осуществления 17, где стадия трансфицирования включает электропорацию мРНК TALEN^® (ЕР) и/или электропорацию CRISPER Cas9.

[0142] E19. Способ по варианту осуществления 18, где стадия трансфицирования включает разрушение гена TCRαβ и/или гена β2M.

[0143] Е20. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где исходные клеточные популяции культивируют в течение приблизительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней.

[0144] Е21. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где полученная популяция Т-клеток экспрессирует один или более маркеров, свойственных недифференцированным или незрелым Т-клеткам.

[0145] Е22. Способ по варианту осуществления 21, где один или более маркеров, свойственных недифференцированным или незрелым Т-клеткам, выбраны из группы, состоящей из CD62L, CD45RA, CD45RO и любой их комбинации.

[0146] Е23. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где полученная популяция Т-клеток содержит на по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 100% больше стволовых Т-клеток памяти, чем вторая полученная популяция Т-клеток.

[0147] Е24. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, где объемное отношение для исходной клеточной популяции составляет 1:5, а объемное отношение для второй исходной клеточной популяции составляет 1:20, 1:25 или 1:50.

[0148] Е25. Способ по любому из вариантов осуществления 1-24, где объемное отношение для исходной клеточной популяции составляет 1:10, а объемное отношение для второй исходной клеточной популяции составляет 1:20, 1:25 или 1:50.

[0149] Е26. Способ по любому из вариантов осуществления 1-24, где объемное отношение для исходной клеточной популяции составляет 1:15, а объемное отношение для второй исходной клеточной популяции составляет 1:20, 1:25 или 1:50.

[0150] Е27. Способ по любому из вариантов осуществления 16-26, где лентивирус содержит гетерологичный ген, кодирующий рецептор клеточной поверхности.

[0151] Е28. Способ по варианту осуществления 27, где рецептор клеточной поверхности способен связывать антиген на поверхности клетки-мишени.

[0152] Е29. Способ по варианту осуществления 28, где клетка-мишень представляет собой опухолевую клетку.

[0153] Е30. Способ по 28 или 29, где рецептор клеточной поверхности представляет собой Т-клеточный рецептор (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR).

[0154] Е31. Способ по варианту осуществления 30, где TCR или CAR способны связывать антиген, выбранный из группы, состоящей из 707-АР (707 аланин-пролин), AFP (альфа (a)-фетопротеин), ART-4 (антиген аденокарциномы, распознаваемый Т4-клетками), BAGE (антиген В; b-катенин/m, мутированный b-катенин), ВСМА (антиген созревания В-клеток), Bcr-abl (кластерная область точечного разрыва-Абельсона), CAIX (карбоангидраза IX), CD19 (кластер дифференцировки 19), CD20 (кластер дифференцировки 20), CD22 (кластер дифференцировки 22), CD30 (кластер дифференцировки 30), CD33 (кластер дифференцировки 33), CD44v7/8 (кластер дифференцировки 44, экзоны 7/8), CAMEL (CTL-распознаваемый антиген меланомы), САР-1 (карциноэмбриональный антигенный пептид-1), CASP-8 (каспаза-8), CDC27m (мутированный белок-27 цикла клеточного деления), CDK4/m (мутированная циклин-зависимая киназа-4), СЕА (карциноэмбриональный антиген), СТ (раково-тестикулярный антиген), Сур-В (циклофилин В), DAM (дифференцировочный антиген меланомы), EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), EGFRvIII (рецептор эпидермального фактора роста, вариант III), EGP-2 (эпителиальный гликопротеин-2), EGP-40 (эпителиальный гликопротеин-40), Erbb2, 3, 4 (гомолог-2, -3, 4 вирусного онкогена эритробластного лейкоза), ELF2M (мутированный фактор-2 элонгации), ETV6-AML1 (ген варианта-6 Ets/ген-1 ETS острого миелоидного лейкоза), FBP (фолатсвязывающий белок), fAchR (фетальный ацетилхолиновый рецептор), G250 (гликопротеин-250), GAGE (антиген G), GD2 (дисиалоганглиозид-2), GD3 (дисиалоганглиозид-3), GnT-V (N-ацетилглюкозаминилтрансфераза V), Gp100 (гликопротеин с молекулярной массой 100 кДа), HAGE (хеликазный антиген), HER-2/neu (человеческий эпидермальный рецептор-2/неврологический; также известный как EGFR2), HLA-A (человеческий лейкоцитарный антиген A), HPV (человеческий папилломавирус), HSP70-2M (мутированный белок теплового шока 70-2), HST-2 (белок-2 перстневидно-клеточной опухоли человека), hTERT или hTRT (человеческая теломеразная обратная транскриптаза), iCE (кишечная карбоксиэстераза), IL-13R-a2 (субъединица альфа-2 рецептора интерлейкина-13), KIAA0205, KDR (рецептор с доменом киназной вставки), легкой каппа-цепи, LAGE (антиген L), LDLR/FUT (рецептор липидов низкой плотности/CDP-L-фукоза: bD-галактозидаза-2-а-L-фукозилтрансфераза), LeY (антитело Льюиса Y), L1CAM (молекула клеточной адгезии L1), MAGE (антиген меланомы), MAGE-A1 (ассоциированный с меланомой антиген-1), MAGE-А3, MAGE-A6, мезотелина, инфицированных CMV мышиных клеток, MART-1/мелана-А (антиген-1 меланомы, распознаваемый Т-клетками/антиген А меланомы), MC1R (рецептор меланокортина-1), миозина/т (мутированный миозин), MUC1 (муцин-1), MUM-1, -2, -3 (мутированный широко распространенный при меланоме белок-1, 2, 3), NA88-A (клон кДНК NA пациента М88), лигандов NKG2D (представитель D группы-2 естественных киллеров), NY-BR-1 (Нью-Йоркский антиген-1 дифференцировки молочной железы), NY-ESO-1 (белок-1 Нью-Йоркской плоскоклеточной карциномы пищевода), онкофетального антигена (h5T4), Р15 (белок-15), минорного белка p190 bcr-abl (белок bcr-abl с молекулярной массой 190 кДа), Pml/RARa (белок промиелоцитарного лейкоза/рецептор а ретиноевой кислоты), PRAME (преимущественно экспрессируемый антиген меланомы), PSA (простатспецифический антиген), PSCA (антиген стволовых клеток предстательной железы), PSMA (простатспецифический мембранный антиген), RAGE (почечный антиген), RU1 или RU2 (широко распространенный белок-1 или 2 почек), SAGE (антиген саркомы), SART-1 или SART-3 (антиген-1 или 3 плоскоклеточной карциномы, отторгающий опухоль), SSX1, -2, -3, 4 (белок синовиальной саркомы X1, -2, -3, -4), ТАА (опухолеассоциированный антиген), TAG-72 (опухолеассоциированный гликопротеин-72), TEL/AML1 (белок-1 семейства Ets с транслокацией, ассоциированный с лейкозом/острым миелоидным лейкозом), TPI/m (мутированная триозофосфатизомераза), TRP-1 (родственный тирозиназе белок-1 или gp75), TRP-2 (родственный тирозиназе белок-2), TRP-2/INT2 (TRP-2/интрон 2), VEGF-R2 (рецептор-2 фактора роста эндотелия сосудов), WT1 (ген опухоли Вильмса), CD70, FLT3, DLL3 и любой их комбинации.

[0155] Е33. Способ по любому из предыдущих вариантов осуществления, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества полученных Т-клеток субъекту, нуждающемуся в этом.

[0156] Е34. Способ лечения опухоли у субъекта, нуждающегося в Т-клеточной терапии, включающий введение субъекту одной или более из полученных Т-клеток по любому из предыдущих вариантов осуществления.

[0157] Е35. Способ снижения или уменьшения размера опухоли или торможения роста опухоли у субъекта, нуждающегося в Т-клеточной терапии, включающий введение субъекту одной или более из полученных Т-клеток по любому из предыдущих вариантов осуществления.

[0158] Е36. Способ по любому из вариантов осуществления 29-35, где опухоль представляет собой рак, выбранный из рака кости, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака головы или шеи, кожной или внутриглазной злокачественной меланомы, рака матки, рака яичника, рака прямой кишки, рака анальной области, рака желудка, рака яичка, рака матки, карциномы маточных труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, карциномы влагалища, карциномы вульвы, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы (NHL), первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (РМВС), диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (DLBCL), фолликулярной лимфомы (FL), трансформированной фолликулярной лимфомы, множественной миеломы, лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки (SMZL), рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечника, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, хронического или острого лейкоза, острого миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза (ALL) (включая отличный от Т-клеточного ALL), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), солидных опухолей детского возраста, лимфоцитарной лимфомы, рака мочевого пузыря, рака почки или мочеточника, карциномы почечной лоханки, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомы ЦНС, ангиогенеза опухоли, опухоли спинного мозга, глиомы ствола головного мозга, аденомы гипофиза, саркомы Капоши, эпидермоидного рака, плоскоклеточного рака, Т-клеточной лимфомы, индуцированных факторами внешней среды видов рака, включая индуцированные асбестозом, других В-клеточных злокачественных новообразований и любой их комбинации.

[0159] Е37. Способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в популяции РВМС, включающий: 1) приведение некоторого объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с некоторым объемом исходной популяции РВМС при некотором объемном отношении, где исходная популяция РВМС характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,5×10⁶ клеток/мл до приблизительно 2,0×10⁶ клеток/мл, а объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 5 или 10 объемам исходной клеточной популяции, и 2) культивирование популяции РВМС в культуральной среде в течение от 14 до 18 дней, при этом полученная популяция РВМС содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй популяцией РВМС, где вторую исходную популяцию РВМС при той же плотности клеток приводят в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 20 объемам второй исходной популяции РВМС, и культивируют в течение того же числа дней.

[0160] Е38. Способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в популяции очищенных Т-клеток, включающий: 1) приведение некоторого объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с некоторым объемом исходной популяции очищенных Т-клеток при некотором объемном отношении, где исходная популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,80×10⁶ клеток/мл до приблизительно 1,60×10⁶ клеток/мл, а объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 10 или 15 объемам исходной клеточной популяции, и 2) культивирование популяции РВМС в культуральной среде в течение от 11 до 18 дней, при этом полученная популяция очищенных Т-клеток содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй популяцией очищенных Т-клеток, где вторую исходную популяцию очищенных Т-клеток при той же плотности клеток приводят в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 20, 25 или 50 объемам второй исходной популяции Т-клеток, и культивируют в течение того же числа дней.

[0161] Е39. Способ повышения общего числа Т-клеток в популяции Т-клеток, включающий: 1) приведение некоторого объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с некоторым объемом исходной популяции Т-клеток при некотором объемном отношении, где исходная популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере приблизительно 0,80×10⁶ клеток/мл до приблизительно 1,60×10⁶ клеток/мл, а объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 10 или 15 объемам исходной клеточной популяции, и 2) культивирование популяции Т-клеток в культуральной среде в течение от 11 до 18 дней, при этом полученная популяция Т-клеток содержит повышенное число Т-клеток по сравнению со второй популяцией Т-клеток, где вторую исходную популяцию Т-клеток при той же плотности клеток приводят в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 20, 25 или 50 объемам второй исходной популяции Т-клеток, и культивируют в течение того же числа дней.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Получение аллогенных Т-клеток, активированных в условиях ex vivo, из популяции РВМС

[0162] Донорскую кровь собирали и разделяли на ее составные части посредством афереза. Затем РВМС обогащали с помощью ступенчатого градиента Ficoll®-hypaque и подвергали криоконсервации. В день 0 выделенные с помощью Ficoll® замороженные РВМС человека размораживали и один раз промывали культуральной средой, содержащей 10% человеческой сыворотки крови. Затем клетки культивировали в среде с 5% человеческой сыворотки крови и инкубировали при 37°С и 5% СО₂ на протяжении ночи. В день 1 полученные РВМС характеризовались плотностью клеток, составляющей приблизительно 3×10⁶ клеток/мл или меньше, и их разделили на тестируемые фракции и активировали следующим образом из расчета 1,5×10⁶ клеток/мл:

[0163] В случае контролей, тестируемые группы 1-2, клетки культивировали в присутствии mTransAct, который предоставляется в наборе mTransAct CD3/CD28 (каталожный №130-020-008, Miltenyi Biotec Inc., Оберн, Калифорния), в котором антитела к CD3 и CD28 представляют собой мышиные моноклональные антитела против CD3 и CD28 соответственно.

[0164] В случае тестируемых групп 3-5 клетки культивировали в присутствии Transact™ (Miltenyi Biotec Inc., Оберн, Калифорния), в котором наноматрица конъюгирована с гуманизированными антителами к CD3 и CD28 (далее в данном документе обозначается как «hTransAct™») при указанных объемных отношениях.

[0165] В случае всех тестируемых групп клетки активировали при объемных отношениях Transact™ к клеточной культуре, указанных в таблице 1. Культуральная среда, в которой активировали клетки, состоит из Х-vivo 15 (Lonza) и 5% человеческой сыворотки крови (Gemini), содержащая также IL-2 из расчета 100 МЕ/мл (Miltenyi Biotec Inc).

[0166] В день 4 активационную культуральную среду либо разбавляли свежей культуральной средой, либо полностью удаляли посредством центрифугирования, как указано в таблице 1. В случае тестируемых групп 1 и 5 клетки разводили по меньшей мере одним объемом свежей культуральной среды к одному объему активационной культуральной среды. В случае остальных тестируемых групп центрифугирование проводили при 540g в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем клетки один раз промывали культуральной средой.

[0167] Далее в день 4 активированные клетки можно генетически модифицировать с помощью трансдукции лентивирусного вектора для введения CAR с применением способов, известных из в данной области техники. Вкратце, в тестируемых группах 1 и 5, в которых активационную культуральную среду разводили свежей клеточной культуральной средой, в культуральную среду добавляли лентивирусный вектор (LVV №1831P, Lentigen Technology, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд, США) и клетки трансдуцировали в соответствии с инструкциями производителя. В случае остальных тестируемых групп клетки трансдуцировали в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки собирали, однократно промывали, ресуспендировали в культуральной среде, в которую добавляли лентивирусный вектор (Lentigen Technology, Inc., Гейтерсберг, Мэриленд, США) из расчета 1-10% об./об. лентивирусного вектора на клеточную культуру. В обоих способах плотность клеток при трансдукции составляла 1×10⁶ клеток/мл.

[0168] Клетки размножали в Т-колбах от дня 4 до дня 6. В день 6 клетки далее подвергали редактированию генов с помощью электропорации (ЕР) мРНК TALEN^® для разрушения гена TCRαβ и нокаута его генной экспрессии. Электропорацию мРНК TALEN^® проводили с применением системы для электропорации AgilePulse® (доступной от ВТХ®, подразделение Harvard Bioscience, Inc., Холлистон, Массачусетс, США) в соответствии с инструкциями производителя.

[0169] Аллогенные Т-клетки, включая генетически модифицированные аллогенные CAR-T-клетки, размножали в G-Rex® 10 (Wilson Wolf Corporation, Сент-Пол, Миннесота, США) от дня 8 до дня 18 в соответствии с инструкциями производителя.

Рост и выход клеток

[0170] Фактический выход клеток измеряли в день 1, 4, 6, 8 и 18 с применением автоматического счетчика клеток NucleoCounterNC-200 (Chemometec, Аллерёд, Дания). На фиг. 1 проиллюстрированы результаты, полученные от дня 1 вплоть до дня 18. Результаты для дней 1, 4, 6 и 8 перед размножением клеток в G-Rex® проиллюстрированы на фиг. 2, а результаты для размножения в G-Rex^® от дня 8 вплоть по день 18 проиллюстрированы на фиг. 3.

[0171] Определяли общую кратность размножения клеток, и на фиг. 4 проиллюстрированы результаты, полученный от результаты дня 1 вплоть до дня 18. На фиг. 5 проиллюстрирована кратность размножения на каждой стадии способа для каждой тестируемой группы, при этом у тестируемых групп 3-5 кратность размножения была выше, чем у тестируемых групп 6 и 7 на протяжении дня 8-18. На фиг. 6 проиллюстрированы результаты кратности размножения на каждой стадии способа для каждой тестируемой группы от дня 0 до дня 6.

Клеточный фенотип

[0172] Клеточные фенотипы анализировали в день 1 и день 18. Клетки метили флуоресцентными антителами против соответствующих мишеней в соответствии с инструкциями производителя.

[0173] Затем клетки с флуоресцентной меткой анализировали с применением цитометра LSRFortessa™ (BD Biosciences, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США) в соответствии с инструкциями производителя и данные анализировали с применением программного обеспечения FlowJo версии 10 (FlowJo, LLC, Ашленд, Орегон, США).

[0174] Подгруппы клеток РВМС определяли для каждой из тестируемых групп и соответствующих контролей в день 1 с применением коммерческих антител против CD5 (BD Horizon), CD14 (Biolegend), CD56 (BD Biosciences) и CD19 (Biolegend).

[0175] Субпопуляции CD8 Т-клеток определяли для каждой из тестируемых групп и соответствующих контролей в день 1 с применением коммерческих антител против CD8 (BD Biosciences), CD45RA (Biolegend) и CD62L (BD Biosciences).

[0176] Отношения CD4:CD8 клеток определяли для каждой из тестируемых групп и соответствующих контролей в день 1 с применением коммерческих антител против CD4 (BD Biosciences) и CD8 (BD Biosciences).

[0177] Общую подгруппу CD5⁺ клеток, которые являются CD45RA⁺, CD62L⁺, определяли для каждой из тестируемых групп и соответствующих контролей в день 18 с применением коммерческих антител против CD5 (BD Horizon), CD45RA (Biolegend) и CD62L (BD Biosciences).

[0178] Общую подгруппу CD5⁺ клеток, которые являются CD45RO⁺, CD62L⁺, определяли для каждой из тестируемых групп и соответствующих контролей в день 18 с применением коммерческих антител против CD5 (BD Horizon), CD45RO (Biolegend) и CD62L (BD Biosciences).

[0179] Процентную долю клеток CAR+% и TCRαβ-% клеток для каждой тестируемой группы и соответствующих контролей определяли в день 18 с применением антиидиотипического антитела к CAR, конъюгированного с флуорохромом, и коммерческого антитела против TCRαβ (Biolegend).

[0180] Жизнеспособность клеток контролировали на протяжении дня 0-18 для каждой тестируемой группы и соответствующих контролей с применением NucleoCounter® NC-200™ (Chemometec, Аллерёд, Дания) в соответствии с инструкциями производителя.

[0181] Диаметр клеток контролировали на протяжении дня 0-18 для каждой тестируемой группы и соответствующих контролей с применением NucleoCounter® NC-200™ (Chemometec, Аллерёд, Дания) в соответствии с инструкциями производителя.

Пример 2

Получение аллогенных Т-клеток, активированных в условиях ex vivo, из популяции очищенных Т-клеток

[0182] Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкоцитарных пленок от анонимных доноров крови с применением Ficoll®-Paque PLUS (GE Healthcare Life Sciences) и пробирок SepMate™-50 (STEMCELL Technologies) в соответствии с протоколом, предоставленным STEMCELL Technologies. Затем из свежеприготовленных РВМС выделяли тотальную популяцию Т-клеток с применением набора для выделения всех Т-клеток (Miltenyi Biotec) в соответствии с протоколом, предоставленным Miltenyi Biotec. Тотальную популяцию Т-клеток хранили в жидком азоте до приготовления к использованию.

[0183] Первичную тотальную популяцию человеческих Т-клеток (10-30×10⁶) размораживали в день 0, ресуспендировали из расчета приблизительно 2×10⁶ клеток/мл в среде для трансдукции Т-клеток - Х-Vivo™ 15 (Lonza), содержащей также 10% фетальной телячьей сыворотки HyClone (GE Healthcare Life Sciences), и инкубировали в течение 30 мин в инкубаторе с увлажнением при 37°С с 5% СО₂. После инкубации в течение 30 мин Т-клеток подсчитывали и плотность клеток регулировали с использованием среды для трансдукции Т-клеток. Затем Т-клетки смешивали либо с гранулами из набора для активации/размножения Т-клеток (Miltenyi Biotec) при отношении 1:1 гранул к Т-клеткам, либо с полимерной наноматрицей TransAct™ для Т-клеток (Miltenyi Biotec) при следующих объемных разведениях: 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:50. Добавляли рекомбинантный человеческий IL-2 (Miltenyi Biotec) до конечной концентрации, составляющей 100 ЕД/мл. Затем Т-клетки возвращали в инкубатор при 37°С.

[0184] Через два дня (день 2) Т-клетки подсчитывали, ресуспендировали из расчета 5×10⁵ клеток/мл в среде для трансдукции Т-клеток и добавляли свежий IL-2. Затем Т-клетки трансдуцировали с помощью лентивирусного вектора, кодирующего FMC63-41BB-CD3ζ, CAR, связывающий CD19, и возвращали в инкубатор при 37°С. Параллельно получали нетрансдуцированные (UT) контроли. В день 5 эффективность трансдукции подтверждали с помощью проточной цитометрии, а CAR-T-клетки с FMC63-41BB-CD3ζ, связывающим CD19, и контрольные Т-клетки UT переносили в 6-луночный планшет G-Rex^® (Wilson Wolf). Культуральную среду для Т-клеток - Х-Vivo™ 15 (Lonza), содержащую также 5% человеческой сыворотки крови АВ (Off the Clot) (Gemini BioProducts) и 100 МЕ/мл рекомбинантного человеческого IL-2 (Miltenyi Biotec), добавляли до 35 мл.

[0185] Иммунофенотипирование проводили с помощью проточной цитометрии с использованием анализатора клеток LSRFortessa™ Х-20 (BD Biosciences) и данные анализировали с применением программного обеспечения FlowJo® v10 (FlowJo, LLC). Использовали следующие антитела: конъюгированное с Alexa Fluor (AF) 700 антитело к CD25 человека (BioLegend №302622); конъюгированное с BUV395 антитело к CD62L человека (BD Bioscience №565219); конъюгированное с BV605 антитело к CD8a человека (BioLegend №301040); конъюгированное с BV786 антитело к CD4 человека (BD Bioscience №563914); конъюгированное с РЕ антитело к CD137 человека (4-1ВВ) (BioLegend №309804); конъюгированное с перидинин-хлорофиллом (PerCP)/Су5.5 антитело к CD45RO человека (BioLegend №304222).

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к способам получения Т-клеток для Т-клеточной терапии, включающим приведение клеточной популяции, характеризующейся предварительно определенной плотностью клеток, в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28, характеризующейся некоторой концентрацией, и культивирование клеток, за счет чего получают популяцию Т-клеток, содержащую повышенную процентную долю по меньшей мере одного подтипа Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления способ приводит к повышению процентной доли стволовых Т-клеток памяти. Изобретение позволяет продлевать персистенцию Т-клеток в условиях in vivo для применения в Т-клеточной терапии. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 18 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в популяции Т-клеток, включающий:

a) приведение объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с объемом исходной популяции Т-клеток при объемном отношении, где

i) исходная популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере 0,2 × 10⁶ кл./мл до 5,8 × 10⁶ кл./мл; и

ii) объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 17,4 объема исходной популяции Т-клеток или меньше; и

b) культивирование популяции Т-клеток в культуральной среде,

при этом полученная популяция Т-клеток содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй полученной популяцией Т-клеток, причем вторая полученная популяция Т-клеток была получена путем приведения второй исходной популяции Т-клеток при той же плотности клеток в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 17,5 объема второй исходной популяции Т-клеток или больше.

2. Способ по п. 1, где исходные популяции Т-клеток получены из периферической крови, костного мозга, ткани лимфатического узла, пуповинной крови, ткани тимуса, ткани из очага инфекции, асцитов, плеврального выпота, ткани селезенки, опухоли, мезенхимальной ткани, линии Т-клеток, индуцированной плюрипотентной стволовой клетки или системы культивирования на основе искусственного органоида тимуса (АТО).

3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где исходные популяции Т-клеток выбраны из группы, состоящей из Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, хелперных Т-клеток, инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, Т-клеток памяти, цитотоксических Т-клеток, Т-клеток, относящихся к естественным киллерам, лимфоцитов периферической крови, инфильтрирующих опухоль лейкоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови, дендритных клеток, стволовых клеток пуповинной крови, плюрипотентных стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток.

4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где исходные популяции Т-клеток представляют собой мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), прошедшие положительный отбор CD3, CD4 или CD8 Т-клетки или прошедшие отрицательный отбор CD3, CD4 или CD8 Т-клетки или их комбинации.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где исходные популяции Т-клеток представляют собой мононуклеарные клетки периферической крови.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где исходные популяции Т-клеток представляют собой популяции очищенных Т-клеток, содержащие CD4⁺ и/или CD8⁺ Т-клетки.

7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где плотность клеток составляет от по меньшей мере приблизительно 0,50 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 6,00 × 10⁶ кл./мл, от приблизительно 0,56 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 5,72 × 10⁶ кл./мл, от приблизительно 0,80 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 4,0 × 10⁶ кл./мл, от приблизительно 1,00 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 3,0 × 10⁶ кл./мл, от приблизительно 2,00 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 3,5 × 10⁶ кл./мл или от приблизительно 2,50 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 3,5 × 10⁶ кл./мл.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где плотность клеток составляет приблизительно 2,86 × 10⁶ кл./мл.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где плотность клеток составляет приблизительно 1,50 × 10⁶ кл./мл.

10. Способ по любому из пп. 1-8, где плотность клеток составляет от по меньшей мере приблизительно 0,28 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 2,86 × 10⁶ кл./мл, от приблизительно 0,25 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 2,00 × 10⁶ кл./мл, от приблизительно 0,5 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 2,00 × 10⁶ кл./мл, от приблизительно 1,00 ×10⁶ кл./мл до приблизительно 2,00 × 10⁶ кл./мл, от приблизительно 0,80 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 1,5 х 10⁶ кл./мл или от приблизительно 1,20 × 10⁶ кл./мл до приблизительно 1,5 × 10⁶ кл./мл.

11. Способ по любому из пп. 1-7 или 10, где плотность клеток составляет приблизительно 1,43 × 10⁶ кл./мл.

12. Способ по любому из пп. 1-7 или 10, где плотность клеток составляет приблизительно 1,00 × 10⁶ кл./мл.

13. Способ по любому из предыдущих пунктов, где объемное отношение объема наноматрицы на основе антител к CD3/28 к объему исходной популяции Т-клеток составляет приблизительно 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1,12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16 или 1:17.

14. Способ по любому из предыдущих пунктов, где исходные популяции Т-клеток культивируют в течение приблизительно 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней.

15. Способ по любому из предыдущих пунктов, где полученная популяция Т-клеток экспрессирует один или более маркеров, свойственных недифференцированным или незрелым Т-клеткам.

16. Способ по п. 15, где один или более маркеров, свойственных недифференцированным или незрелым Т-клеткам, выбраны из группы, состоящей из CD62L, CD45RA, CD45RO или любой их комбинации.

17. Способ по любому из предыдущих пунктов, где полученная популяция Т-клеток содержит на по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 100% больше стволовых Т-клеток памяти, чем вторая полученная популяция Т-клеток.

18. Способ по любому из предыдущих пунктов, где объемное отношение для исходной популяции Т-клеток составляет 1:5, а объемное отношение для второй исходной клеточной популяции составляет 1:20, 1:25 или 1:50.

19. Способ по любому из пп. 1-18, где объемное отношение для исходной популяции Т-клеток составляет 1:10, а объемное отношение для второй исходной клеточной популяции составляет 1:20, 1:25 или 1:50.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где объемное отношение для исходной популяции Т-клеток составляет 1:15, а объемное отношение для второй исходной клеточной популяции составляет 1:20, 1:25 или 1:50.

21. Способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в популяции РВМС, включающий:

a) приведение объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с объемом исходной популяции РВМС при объемном отношении, где

i) исходная популяция РВМС характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере 0,50 × 10⁶ кл./мл до 2,00 × 10⁶ кл./мл; и

ii) объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 5 или 10 объемам исходной клеточной популяции; и

b) культивирование популяции РВМС в культуральной среде в течение от 14 до 18 дней,

при этом полученная популяция РВМС содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй полученной популяцией РВМС, причем вторая полученная популяция РВМС была получена путем приведения второй исходной популяции РВМС при той же плотности клеток в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 20 объемам второй исходной популяции РВМС, и культивирования в течение того же числа дней.

22. Способ повышения процентной доли стволовых Т-клеток памяти в популяции очищенных Т-клеток, включающий:

a) приведение объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с объемом исходной популяции очищенных Т-клеток при объемном отношении, где

i) исходная популяция очищенных Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере 0,80 × 10⁶ кл./мл до 1,60 × 10⁶ кл./мл; и

ii) объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 10 или 15 объемам исходной популяции очищенных Т-клеток; и

b) культивирование исходной популяции очищенных Т-клеток в культуральной среде в течение от 11 до 18 дней,

при этом полученная популяция очищенных Т-клеток содержит повышенную процентную долю стволовых Т-клеток памяти по сравнению со второй полученной популяцией очищенных Т-клеток, где вторая полученная популяция очищенных Т-клеток была получена путем приведения второй исходной популяции очищенных Т-клеток при той же плотности клеток в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 20, 25 или 50 объемам второй исходной популяции очищенных Т-клеток, и культивирования в течение того же числа дней.

23. Способ повышения общего числа Т-клеток в популяции Т-клеток, включающий:

a) приведение объема наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 в контакт с объемом исходной популяции Т-клеток при объемном отношении, где

i) исходная популяция Т-клеток характеризуется плотностью клеток, составляющей от по меньшей мере 0,80 × 10⁶ кл./мл до 1,60 × 10⁶ кл./мл; и

ii) объемное отношение составляет 1 объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 10 или 15 объемам исходной клеточной популяции; и

b) культивирование популяции Т-клеток в культуральной среде в течение от 11 до 18 дней,

при этом полученная популяция Т-клеток содержит повышенное число Т-клеток по сравнению со второй полученной популяцией Т-клеток, причем вторая полученная популяция Т-клеток была получена путем приведения второй исходной популяции Т-клеток при той же плотности клеток в контакт с наноматрицей на основе антител к CD3/CD28 при отношении, составляющем один объем наноматрицы на основе антител к CD3/CD28 к 20, 25 или 50 объемам второй исходной популяции Т-клеток, и культивирования в течение того же числа дней.