СПОСОБЫ ЭКСПАНДИРОВАНИЯ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ CAR-T-КЛЕТОК, КОМПОЗИЦИИ И ПРИМЕНЕНИЯ, СВЯЗАННЫЕ С НИМИ Российский патент 2023 года по МПК A61K35/17 A61K39/395 A61K39/42 A61P35/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/729089, поданной 10 октября 2018 г., и предварительной заявки на патент США № 62/896707, поданной 6 сентября 2019 г., полное содержание которых включено здесь посредством ссылки.

Уровень техники

Адоптивная иммунотерапия включает имплантацию или инфузию специфических для заболевания и/или сконструированных Т-клеток, таких как антигенспецифические цитотоксические Т-клетки (CTL) и Т-клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор (CAR), субъектам с целью распознавания, нацеливания и разрушения клеток, ассоциированных с заболеванием. Адоптивная иммунотерапия стала многообещающим подходом к лечению многих заболеваний и расстройств, включая рак, посттрансплантационные лимфопролиферативные расстройства, инфекционные заболевания (например, вирусные инфекции) и аутоиммунные заболевания.

Например, было показано, что воздействие широко распространенного вируса Эпштейна-Барра (EBV, также известного как вирус герпеса человека 4 типа) может приводить к предрасположенности к развитию или иным образом играть роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, включая рассеянный склероз (MS), системное аутоиммунное заболевание (SAD) и воспалительное заболевание кишечника (IBD). Такие патологии (т.е. MS, SAD и IBD) возникают в результате аномального иммунного ответа против собственной ткани организма. MS характеризуется разрушением миелина, защитной липидной оболочки, окружающей нервные волокна, собственными иммунными клетками организма. SAD представляют собой группу заболеваний соединительной ткани с различными симптомами, включая ревматоидный артрит (RA), системную красную волчанку (SLE) и синдром Шегрена (SS). IBD представляют собой группу воспалительных состояний толстого и тонкого кишечника, которые включают болезнь Крона, целиакию и язвенный колит. Результаты недавних исследований показали, что у субъектов с диагнозом MS имеют место более высокие уровни белков, связанных с EBV, в В-клетках, агрегированных в нервной ткани, чем у здоровых субъектов.

Связь между вирусной инфекцией и патогенезом множества патологических состояний (например, рака и аутоиммунных заболеваний) дала толчок для нескольких исследовательских групп к разработке получения аллогенных (см., например, WO 2017/203368, включенную здесь посредством ссылки) и аутологичных (см., например, Pender et al., Multiple Sclerosis Journal.2014; 20 (11): 1541-1544) антигенспецифических Т-клеток.

Иммунологический надзор с участием Т-клеток играет критическую роль в обнаружении и киллинге широкого ряда злокачественных клеток (Gottschalk et al., 2005, Leuk. Lymphoma, 46: 1-10; Ochsenbein et al., 2002, Cancer Gene Ther., 9: 1043-10). Выживаемость и распространение злокачественных клеток связано со способностью таких клеток уклоняться от распознавания CTL (Bubenik et al., 2003. Oncol. Rep., 10: 2005-2008; Rees et al., 1999, Cancer Immunol. Immunother., 48: 374-381). В частности, функции процессинга и презентации антигена остаются неизменными при EBV-ассоциированных злокачественных новообразованиях, таких как лимфома Ходжкина и назофарингеальная карцинома (Khanna et al., 1998, Cancer Res., 58: 310-314, Lee et al., 1998, Blood, 92: 1020-1030). Результаты недавних исследований показали, что иммунный надзор (и последующий ответ) может быть нарушен за счет опосредованного регуляторными Т-клетками подавления EBV-специфических Т-клеток, что приводит к неспособности элиминировать злокачественные клетки. Например, повышающая регуляция ингибирующих рецепторов иммунных контрольных точек, таких как PD-1 и Tim-3, коррелирует с дисфункцией Т-клеток, и ее наблюдали как для специфических для вируса гепатита С (HCV), так и для HCV-неспецифических CD8⁺ Т-клеток, у пациентов с хронической HCV инфекцией. Частичное восстановление пролиферации Т-клеток и секреции IFN-γ может быть достигнуто ex vivo посредством ингибирования связывания PD-1 и Tim-3 с их соответствующими лигандами (т.е. B7-H1, также известным как PD-L1, и галектин-9). Более того, недавние сообщения показали, что длительное проведение терапии интерфероном может привести к «истощению» Т-клеток, дисфункциональному состоянию, характеризующемуся пониженным пролиферативным потенциалом, прогрессирующей потерей функции и устойчивой экспрессией ингибирующих рецепторов иммунных контрольных точек.

T-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR) являются препаратом, разрешенным для применения FDA в лечении острого лимфобластного лейкоза у детей и диффузной крупноклеточной лимфомы. Пролиферация и персистентность CAR-T-клеток in vivo является важным фактором эффективности лечения. С этой целью авторы настоящего изобретения описывают в настоящем документе способы получения и/или продукции аутологичных и аллогенных антигенспецифических Т-клеток (например, Т-клеток, специфически сенсибилизированных для выявления, например, EBV- ассоциированного антигена(ов)), и также авторы изобретения сконструировали для экспрессии, по меньшей мере, один функциональный химерный антигенный рецептор, направленный против выбранного антигена, ассоциированного с заболеванием. Создание антигенспецифических CTL, которые также экспрессируют один или более CAR, обеспечивает новую платформу для адоптивной иммунотерапии в целях лечения широкого ряда заболеваний. Кроме того, CAR-T-клетки, представляющие фенотипы Т-клеток центральной памяти (Tcm) и стволовых Т-клеток памяти (Tscm), способствуют пролиферативному потенциалу и устойчивой экспансии in vivo после инфузии CAR-T-клеток (Kalos, 2018). Следовательно, обогащение продуктов для адоптивной иммунотерапии (например, CAR-T-клеток) фенотипами Tcm и Tscm с использованием методов усиленного культивирования и стимуляции является преимущественным для активности, персистентности и эффективности in vivo для этого режима терапии. Такое усиление Т-клеточного ответа против опухолевых и/или аутоиммунных антигенов посредством адоптивного переноса сконструированных антигенспецифических Т-клеток (например, антигенспецифических, экспрессирующих CAR-Т-клеток) может предложить привлекательные альтернативы для существующих стратегий лечения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам получения аллогенных или аутологичных Т-клеток, которые экспрессируют Т-клеточный рецептор, который специфически связывается с антигеном (например, вирусным антигеном, таким как EBV пептид), презентированным молекулами главного комплекса гистосовместимости класса I (MHC), и химерному антигенному рецептору (CAR), который специфически связывается с антигеном клетки-мишени или маркером клеточной поверхности (например, антигеном, ассоциированным с опухолевыми клетками, таким как CD19). В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические Т-клетки получают инкубированием образца, содержащего Т-клетки (клетки-респондеры, например, образец PBMC или Т-клетки, выделенные из него) с антигенпрезентирующими клетками (APC, т.е. клетками-стимуляторами), презентирующим антиген (например, вирусный пептид) на молекулах MHC класса I (например, молекулах MHC класса I, кодированных аллелем HLA, который присутствует у субъекта), тем самым индуцируя пролиферацию антигенспецифических Т-клеток-респондеров. Предпочтительно антигенспецифические Т-клетки-респондеры трансдуцируют вирусным вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR. Настоящее изобретение также относятся к способам индукции пролиферации ex vivo популяции CAR-экспрессирующих антигенспецифических Т-клеток, включающим культивирование популяции выделенных Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами и трансдукцию полученных антигенспецифических Т-клеток вирусным вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR. В некоторых вариантах осуществления трансдуцированные Т-клетки культивируют с антиген-презентирующими клетками-стимуляторами для индукции пролиферации антигенспецифических CAR-Т-клеток. В некоторых других вариантах осуществления выделенные Т-клетки трансдуцируют вирусным вектором, кодирующим CAR, перед культивированием с APC. В еще одних вариантах осуществления выделенные Т-клетки культивируют с APC до и после трансдукции вирусным вектором, кодирующим CAR.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам ex vivo для обогащения Т-клетками центральной памяти. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают получение образца клеток от субъекта, содержащего CD3⁺ Т-клетки, и контактирование указанных CD3⁺ Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами. В предпочтительных вариантах осуществления CD3⁺ Т-клетки выделяют из образца перед контактированием с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами методами, известными в данной области (например, положительная селекция CD3⁺ клеток из образца и/или отрицательная селекция посредством истощения нежелательных клеток или компонентов из образца). Например, и без ограничения, такие методы включают селекцию с помощью анти-CD3 шариков (например, магнитных шариков), прилипание к пластику, элютриационное центрифугирование, истощение NK-клеток (например, с использованием анти-CD56 шариков) и/или их комбинации. В некоторых таких вариантах осуществления CD3⁺ Т-клетки трансдуцируют вирусным вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR), до и/или после контактирования с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами. В некоторых таких вариантах осуществления CAR-экспрессирующие CD3⁺ антигенспецифические Т-клетки культивируют с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами.

В некоторых вариантах осуществления клетки-стимуляторы сконструированы для презентации, по меньшей мере, одного вирусного пептидного антигена посредством инкубирования предназначенных клеток-стимуляторов с нативным вирусом/вирусом дикого типа или с вирусным вектором, кодирующим вирусный пептидный антиген. В некоторых таких вариантах осуществления вирусные пептидные антигены происходят от таких типов вирусов, как вирус герпеса (например, EBV и CMV), папилломавирус (например, HPV), аденовирус, полиомавирус (например, BKV, JCV и вирус клеток Меркеля), ретровирус (например, HTLV-I, также включая лентивирус, такой как ВИЧ), пикорнавирус (например, вирус гепатита A), гепаднавирус (например, вирус гепатита B), гепацивирус (например, вирус гепатита C), дельтавирус (например, вирус гепатита D), гепевирус (например, вирус гепатита Е), онковирус и тому подобное. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетки-стимуляторы сконструированы для презентации EBV пептида инкубацией PBMC с нативным вирусом/вирусом дикого типа EBV. В других предпочтительных вариантах осуществления клетки-стимуляторы сконструированы для презентации EBV пептида инкубацией PBMC с вирусным вектором, кодирующим EBV пептид, тем самым индуцируя клетки-стимуляторы к презентации EBV пептида. В некоторых вариантах осуществления EBV пептид включает пептид LMP1 или его фрагмент, пептид LMP2A или его фрагмент и/или пептид EBNA1 или его фрагмент. В некоторых вариантах осуществления EBV пептид содержит последовательность, представленную в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой репликационно-некомпетентный рекомбинантный аденовирус (например, AdE1-LMPpoly). В некоторых вариантах осуществления клетки-стимуляторы могут представлять собой B-клетки, антигенпрезентирующие T-клетки, дендритные клетки или искусственные антигенпрезентирующие клетки (например, клеточную линию, экспрессирующую CD80, CD83, 41BB-L и/или CD86, такую как клетки aK562). Предпочтительно, антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы, описанные здесь, также презентируют антиген клетки-мишени или маркер клеточной поверхности для CAR (такой как CD19). В некоторых вариантах осуществления клетки-стимуляторы подвергают облучению.

Настоящее изобретение также относится к способам идентификации терапевтического препарата на основе CAR-T-клеток в качестве подходящего для введения. В некоторых вариантах осуществления образец терапевтического препарата на основе CAR-T-клеток получают и оценивают на наличие многочисленных типов и субтипов T-клеток. В некоторых таких вариантах осуществления оценивается количество CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD62L⁺ и/или CD45RO⁺ клеток.

В определенных аспектах настоящее изобретение относится к способам повышения пролиферативной способности Т-клеток, включающим выполнение способов, раскрытых здесь. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам повышения жизнеспособности Т-клеток, экспрессирующих CAR, включающим выполнение способов, раскрытых здесь. В определенных аспектах настоящее изобретение относится к Т-клеточным композициям, полученным любым из способов, раскрытых здесь.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана блок-схема, показывающая процедуру и экспериментальные группы для сравнения CAR трансдукции EBV-T-клеток, полученных из PBMC или выделенных T-клеток.

На фиг. 2 показан устойчивый фенотип центральной памяти в антиген-стимулированных Т-клетках (EBV-CTL).

На фиг. 3 приведены кривые роста EBV-T-клеток, полученных из PBMC и выделенных Т-клеток, и трансдуцированных для экспрессии CAR.

На фиг. 4 показано обогащение жизнеспособных CAR⁺ клеток, полученных из выделенных Т-клеток после селекции по бластицидину.

На фиг. 5 показан дизайн исследования фенотипа памяти Т-клеток после стимуляции и CAR трансдукции.

На фиг. 6 показана типичная стратегия гейтирования в проточной цитометрии для идентификации CD3, CD4, CD8, CD62L и CD45RO на CD19-CAR-T-клетках.

На фиг. 7 приведены репрезентативные точечные диаграммы для CD62L и CD45RO (гейтированные по CD3⁺ клеткам) на клетках CD19-CAR-T без стимуляции, со стимуляцией BLCL, растворимыми анти-CD3/CD28 и анти-CD3/CD28, связанным с шариками. Наивные PBMC также оценивали, и они служили в качестве стандарта для гейтирования субпопуляций клеток памяти; красный прямоугольник показывает экспрессию CD62L на CD45RO⁺ клетках.

На фиг. 8 приведены репрезентативные точечные диаграммы для экспрессии CD4 и CD8 (гейтированные по CD3) на CD19-CAR Т-клетках.

На фиг. 9 показано, что EBV-специфические анти-CD19 CAR Т-клетки обладают высокой и специфической цитотоксичностью.

На фиг. 10 показано, что EBV-специфические анти-CD19 CAR Т-клетки индуцируют CD19-специфическую цитотоксичность.

На фиг. 11 показан специфический и сильный HLA-независимый цитолиз как в совместимых по HLA-антигенам (мишени BLCL), так и несовместимых по HLA-антигенам (мишени BLCL и Raji) клетках, тогда как EBV-CTL могут только индуцировать значительный цитолиз только в совпадающих клетках-мишенях BLCL.

На фиг. 12 показано, что анти-CD19 CAR-Т-клетки, полученные обычным способом, демонстрируют усиленную аллореактивную пролиферацию по сравнению с EBV-специфическими анти-CD19 CAR Т-клетками.

На фиг. 13 показаны результаты анализа разбавления CellTrace™ Violet при совместном культивировании с указанными клеточными линиями. Вкратце, анти-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL индуцировали цитолиз линий CD19⁺ клеток (т.е. BLCL, Raji и NALM/ 6; внизу слева), не воздействуя при этом аутологичные и аллогенные мишени без экспрессии антигенов CD19 и EBV (т.е. K562 и PHA-бласты) с заметно меньшей аллореактивностью по сравнению с обычными CAR Т-клетками (внизу справа, заштрихованы).

На фиг. 14 показано, что цитокиновый профиль EBV-антиген-специфических анти-CD19 CAR-Т-клеток и анти-CD19 CAR-Т-клеток, полученных обычным способом, проявляет различные ответы.

Подробное описание изобретения

Общая информация

Исследования, описанные здесь, направлены на определение воздействия различных стимулов CAR-T-клеток, поддающихся высокопроизводительному способу получения, и/или на обогащение иммунофенотипов Т-клеток памяти в конечном терапевтическом продукте. Стандартная стимуляция на основе анти-CD3/CD28 шариков широко используется в данной области в качестве способа экспандирования Т-клеток ex vivo или in vitro перед трансдукцией с помощью векторов, кодирующих CAR. Однако в настоящем документе раскрываются способы получения антиген-стимулированных Т-клеток (например, вирус-специфических Т-клеток), которые также экспрессируют один или более CAR. Такие способы могут включать начальную стадию обогащения Т-клеток, где CD3⁺ Т-клетки обогащаются/очищаются из более гетерогенной клеточной смеси (например, из цельной крови, из PBMC и т.п.); стимулируются для распознавания и ответа на заранее выбранные антигены (например, вирусные антигены или другие антигены, ассоциированные с опухолью/заболеванием и т.д.); и трансдуцируются одной или более конструкциями CAR. Например, клеточный образец полученный от субъекта, содержащий CD3⁺ T-клетки (например, PBMC), может быть обогащен CD3⁺ T-клетками, и указанные CD3⁺ T-клетки приводятся в контактирование с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами. Предпочтительно CD3⁺ Т-клетки выделяют из образца перед контактированием с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами. Более предпочтительно, чтобы Т-клетки и антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы (например, BLCL) происходили из одного и того же образца и, таким образом, были совместимыми по HLA-антигенам. Такие способы и методы селекции клеток обычно включают положительную селекцию CD3⁺ и/или CD19⁺ клеток из образца и/или отрицательную селекцию посредством истощения нежелательных клеток или компонентов из образца. Например, и без ограничения, такие методы включают селекцию методами сортинга живых клеток (например, сортинг клеток с активированной флуоресценцией), анти-CD3 и/или анти-CD19 шарики (например, магнитные шарики), прилипание к пластику, истощение NK-клеток, элютриационное центрифугирование и/или их комбинации. Полученные CD3⁺ Т-клетки можно трансдуцировать вирусным вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR), до и/или после контактактирования с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами.

Исследование, описанное здесь, также обеспечивает сравнение субпопуляций Т-клеток центральной памяти и эффекторных Т-клеток памяти анти-CD19 CAR-T-клеток, полученных в результате стимуляции CTL совместным культивированием с CD3/CD28 или BLCL.

Определения

В рамках настоящего изобретения, некоторые термины, используемые в описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения, собраны и поясняются здесь.

Артикли «а» и «an» используются в данном документе для обозначения одного или более чем одного (т. е., по меньшей мере, одного) грамматического объекта артикля. В качестве примера «элемент» означает один или более элементов.

В рамках настоящего изобретения, термин «введение» означает обеспечение фармацевтического средства или композиции субъекту и включает, не ограничиваясь этим, введение медицинским специалистом и самостоятельное введение. Такое средство может содержать, например, пептид, описанный здесь, антигенпрезентирующую клетку, обеспеченную здесь, и/или CTL, обеспеченную здесь.

Термин «связывание» или «взаимодействие» относится к ассоциации, которая может представлять собой стабильную ассоциацию между двумя молекулами, например, между TCR и пептидом/MHC, за счет, например, электростатического, гидрофобного, ионного взаимодействия и/или за счет водородных связей в физиологических условиях.

Термин «биологический образец», «образец ткани» или просто «образец» каждый относится к коллекции клеток, полученных из ткани субъекта. Источником образца ткани может быть солидная ткань, например, из свежеотобранного, замороженного и/или консервированного органа, образца ткани, биопсийного материала или аспирата; цельная кровь или любые компоненты крови, сыворотка, кровь; жидкости организма, такие как спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, перитонеальная жидкость или интерстициальная жидкость; или клетки на любой стадии беременности или на любой стадии развития субъекта.

В рамках настоящего изобретения, термин «цитокин» относится к любому секретируемому полипептиду, который влияет на функции клеток и представляет собой молекулу, которая модулирует взаимодействия между клетками при иммунном, воспалительном или гематопоэтическом ответе. Цитокин включает, не ограничиваясь этим, монокины и лимфокины, независимо от того, какие клетки их продуцируют. Например, монокин обычно относится к цитокину, продуцированному и секретированному мононуклеарной клеткой, такой как макрофаг и/или моноцит. Однако многие другие клетки также продуцируют монокины, такие как естественные клетки-киллеры, фибробласты, базофилы, нейтрофилы, эндотелиальные клетки, астроциты головного мозга, стромальные клетки костного мозга, эпидермальные кератиноциты и B-лимфоциты. Лимфокины обычно продуцируются лимфоцитарными клетками. Примеры цитокинов включают, не ограничиваясь этим, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-15 (IL-15), фактор некроза опухолей альфа (TNFα) и фактор некроза опухолей бета (TNFβ).

Термин «фрагмент антитела» относится к любому производному антитела, длина которого меньше полной длины антитела. В иллюстративных вариантах осуществления фрагмент антитела сохраняет, по меньшей мере, значительную часть способности к специфическому связыванию, присущему полноразмерному антителу. Примеры фрагментов антител включают, не ограничиваясь этим, фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, Fv, dsFv диатело, Fc и Fd. Фрагмент антитела можно получить любым способом. Например, фрагмент антитела может быть получен ферментативно или химически фрагментацией интактного антитела, он может быть получен рекомбинантно из гена, кодирующего частичную последовательность антитела, или он может быть получен полностью или частично синтетическим путем. Фрагмент антитела необязательно может представлять собой одноцепочечный фрагмент антитела. Альтернативно, фрагмент может содержать несколько цепей, которые связаны вместе, например, дисульфидными связями. Фрагмент также может необязательно представлять собой мультимолекулярный комплекс. Функциональный фрагмент антитела обычно будет содержать, по меньшей мере, примерно 50 аминокислот и более типично будет содержать, по меньшей мере, примерно 200 аминокислот.

Термин «сайт связывания антигена» относится к области антитела, которая специфически связывает эпитоп на антигене.

Термин «одноцепочечный вариабельный фрагмент» или «scFv» относится к Fv-фрагменту, в котором область тяжелой цепи и область легкой цепи связаны. Один или более фрагментов scFv могут быть связаны с другими фрагментами антитела (такими как константная область тяжелой цепи или легкой цепи) с образованием конструкций антител, имеющих один или более сайтов распознавания антигена.

Термин «Fab-фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему антигенсвязывающий сайт, образованному расщеплением антитела ферментом папаином, который «разрезает» шарнирную область на N-конце по внутренней дисульфидной связи H-цепи и образует два Fab-фрагмента из одной молекулы антитела.

Термин «фрагмент F(ab')₂» относится к фрагменту антитела, содержащему два антигенсвязывающих сайта, образованному расщеплением молекулы антитела ферментом пепсином, который «разрезает» шарнирную область на С-конце по внутренней дисульфидной связи H-цепи.

Термин «Fc-фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему константную область его тяжелой цепи.

Термин «Fv-фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему вариабельные области его тяжелой цепи и легкой цепи.

Термин «сконструированное антитело» относится к рекомбинантной молекуле, которая содержит, по меньшей мере, фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающий сайт, происходящий из вариабельной области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела, и может необязательно включать все или часть вариабельных и/или константных областей антитела из любого класса Ig (например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и IgY).

В рамках настоящего изобретения, термин «специфически связывает», «специфическое связывание» или «нацеливание», когда относится к полипептиду (включая антитела) или рецептору, относится к реакции связывания, которая определяет присутствие белка или полипептида или рецептора в гетерогенной популяции белков и других биологических соединений. Таким образом, в определенных условиях (например, условиях иммуноанализа в случае антитела) указанный лиганд или антитело «специфически связывается» со своей конкретной «мишенью» (например, антитело специфически связывается с эндотелиальным антигеном), в то время оно не связывается со значительным количеством других белков, присутствующих в образце, или другими белками, с которыми лиганд или антитело могут контактировать в организме. Как правило, первая молекула, которая «специфически связывает» вторую молекулу, имеет константу аффинности (Ka) выше, чем примерно 10⁵ M^-1 (например, 10⁶ M^-1, 10⁷ M^-1, 10⁸ M^-1, 10⁹ M^-1, 10¹⁰ M^-1, 10¹¹ M^-1 и 10¹² M^-1 или более), с этой второй молекулой. Например, в случае способности TCR связываться с пептидом, презентированном молекулами MHC (например, MHC класса I или MHC класса II), то, как правило, TCR специфически связывается со своим пептидом/MHC с аффинностью, по меньшей мере, с K_D примерно 10^-4 M или ниже, и связывается с заранее определенным антигеном/партнером по связыванию с аффинностью (выраженной с помощью K_D), которая, по меньшей мере, в 10 раз ниже, по меньшей мере, в 100 раз ниже или, по меньшей мере, в 1000 раз ниже, чем его аффинность связывания с неспецифическим и неродственным комплексом пептид/MHC (например, комплексом, содержащим пептид BSA или пептид казеина).

Термин «эпитоп» означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом или TCR. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров. Определенные эпитопы можно определить по конкретной аминокислотной последовательности, с которой антитело способно связываться.

В рамках настоящего изобретения, выражение «фармацевтически приемлемый» относится к тем агентам, соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые в рамках здравого медицинского заключения подходят для использования в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соразмерно разумному соотношению польза/риск.

В рамках настоящего изобретения, выражение «фармацевтически приемлемый носитель» означает фармацевтически приемлемый материал, композицию или носитель, такой как жидкий или твердый наполнитель, разбавитель, эксципиент, растворитель или инкапсулирующий материал, участвующий в переносе или транспортировке средства из одного органа или части тела, к другому органу или части тела. Каждый носитель должен быть «приемлемым» в том смысле, что он совместим с другими ингредиентами состава, и не является токсичным для пациента. Некоторые примеры веществ, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают: (1) сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; (2) крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; (3) целлюлоза и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; (4) порошкообразный трагакант; (5) солод; (6) желатин; (7) тальк; (8) эксципиенты, такие как масло какао и воска для суппозиториев; (9) масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; (10) гликоли, такие как пропиленгликоль; (11) полиолы, такие как глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; (12) сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; (13) агар; (14) буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; (15) альгиновая кислота; (16) апирогенная вода; (17) изотонический физиологический раствор; (18) раствор Рингера; (19) этиловый спирт; (20) pH-буферные растворы; (21) сложные полиэфиры, поликарбонаты и/или полиангидриды; и (22) другие нетоксичные совместимые вещества, используемые в фармацевтических составах.

Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используются взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию. Ниже приведены неограничивающие примеры полинуклеотидов: кодирующие или некодирующие участки гена или фрагмента гена, локусы (локус), определенные в результате анализа соединения, экзоны, интроны, информационная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомная РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Если они присутствуют, то модификации нуклеотидной структуры могут быть внесены до или после сборки полимера. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать, например, посредством конъюгации с метящим компонентом. Во всех последовательностях нуклеиновых кислот, представленных здесь, U-нуклеотиды взаимозаменяемы с Т-нуклеотидами.

В рамках настоящего изобретения, терапевтическое средство, которое «профилактирует» патологическое состояние, относится к соединению, которое при введении в статистический образец до начала развития расстройства или патологического состояния снижает возникновение расстройства или патологического состояния в обработанном образце по сравнению с необработанным контрольным образцом, или задерживает начало, или снижает тяжесть одного или более симптомов расстройства или патологического состояния по сравнению с необработанным контрольным образцом.

В рамках настоящего изобретения, термин «специфическое связывание» относится к способности TCR связываться с пептидом, презентированном молекулами MHC (например, MHC класса I или MHC класса II). Обычно TCR специфически связывается со своим пептидом/MHC с аффинностью, по меньшей мере, с K_D примерно 10^-4 M или ниже, и связывается с заранее определенным антигеном/партнером по связыванию с аффинностью (выраженной значением K_D), которая, по меньшей мере, В 10 раз меньше, по меньшей мере, в 100 раз меньше или, по меньшей мере, в 1000 раз меньше, чем его аффинность связывания с неспецифическим и неродственным комплексом пептид/MHC (например, комплексом, содержащим пептид BSA или пептид казеина).

В рамках настоящего изобретения, термин «субъект» означает человека или животное, отличное от человека, выбранное для лечения или терапии.

В некоторых вариантах осуществления средства по изобретению можно использовать самостоятельно или совместно с другим типом терапевтического средства. В рамках настоящего изобретения, выражения «совместное введение» или «вводимые совместно» относятся к любой форме введения двух или более различных терапевтических средств (например, композиции, содержащей CAR T, раскрытые здесь, и ингибитор иммунных контрольных точек), так что второе средство вводят, в то время как ранее введенное терапевтическое средство все еще проявляет эффективность в организме (например, два средства одновременно являются эффективными в организме субъекта, что может включать синергетические эффекты двух средств). Например, разные терапевтические средства можно вводить либо в одном составе, либо в отдельных составах, либо одновременно, либо последовательно. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления CAR-T-клетки экспрессируют (например, присутствуют на поверхности клетки или секретируют) дополнительные терапевтические средства. В некоторых вариантах осуществления различные терапевтические средства (например, CAR-Т-клетки и молекулы, блокирующие иммунные контрольные точки) можно вводить в течение примерно 1 ч, примерно 12 ч, примерно 24 ч, примерно 36 ч, примерно 48 ч, примерно 72 ч или примерно недели друг от друга. Таким образом, субъект, получающий такое лечение, может получить пользу от комбинированного действия различных терапевтических средств.

В рамках настоящего изобретения, термин «лечение» относится к клиническому вмешательству, предназначенному для изменения естественного течения клинической патологии у субъекта, подвергающегося лечению. Желательные эффекты лечения включают снижение скорости прогрессирования, ослабление или смягчение патологического состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза конкретного заболевания, расстройства или состояния. Субъекта успешно «лечат», например, если ослабляются или устраняются один или более симптомов, связанных с конкретным заболеванием, нарушением или состоянием.

Термин «вектор» относится к агентам, с помощью которых нуклеиновая кислота может реплицироваться и/или переноситься между организмами, клетками или клеточными компонентами. Векторы включают плазмиды, вирусы, бактериофаг, провирусы, фагмиды, транспозоны, искусственные хромосомы и т.п., которые могут или не могут быть способны автономно реплицироваться или интегрироваться в хромосому клетки-хозяина.

Обогащение Т-клеток

К настоящему времени способы получения CAR-T-клеток, известные в данной области техники, основывались либо на неочищенном и гетерогенном исходном материале, таком как PBMC (см. Sun et al., Journal for ImmunoTherapy of Cancer (2015) 3: 5), либо на высокоочищенных изолятах определенных типов Т-клеток, т. е. CD4⁺, CD8⁺ Т-клеток или их определенных соотношений (см. Terakura et al., Blood (2011) 119: 1 и Turtle et al., Sci. Transl. Med. (2016) Sep 7; 8). Однако изобретение, раскрытое здесь, относится к способам ex vivo для обогащения антигенспецифических Т-клеток, которые предназначены для применения в получении CAR-T-клеток. Примечательно, что в некоторых предпочтительных вариантах осуществления такие способы включают получение образца клеток (например, PBMC) от субъекта, содержащего CD3⁺ клетки и контактирование указанных CD3⁺ клеток с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами. Предпочтительно CD3⁺ Т-клетки выделяют из образца перед контактированием с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами методами, известными в данной области (например, положительная селекция CD3⁺ клеток из образца и/или отрицательная селекция посредством истощения нежелательных клеток или компонентов). Например, и без ограничения, такие методы включают селекцию с использованием сортинга клеток с активированной флуоресценцией (FACS), с использованием анти-CD3 шариков (например, магнитных шариков), прилипания к пластику, истощения NK-клеток с использованием анти-CD56, элютриационного центрифугирования и/или их комбинации. Сенсибилизация выбранных CD3⁺ клеток к заранее определенным антигенам, таким как вирусные антигены, может способствовать фенотипу центральной памяти в полученной популяции антигенспецифических Т-клеток. Такие Т-клетки можно трансдуцировать вирусным вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR), до и/или после контактирования с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами. В некоторых таких вариантах осуществления CAR-экспрессирующие антигенспецифические CD3⁺ Т-клетки культивируют с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами.

В рамках настоящего изобретения, начальная стадия обогащения CD3⁺ клетками обеспечивает исходный материал, который является существенно менее гетерогенным, чем образец PBMC, но сохраняет некоторый уровень гетерогенности по сравнению с высокоочищенными фракциями Т-клеток. Не желая связываться теорией, полагается, что при использовании начальной стадии обогащения CD3⁺ исходный материал содержит смесь клеток (включая, по меньшей мере, множество типов эффекторных Т-клеток, Т-хелперные клетки (CD4⁺ Т-клетки/Т_Н-клетки), цитотоксические Т-клетки (CD8⁺ Т-клетки/CTL), типы Т-клеток памяти (например, Т-клетки центральной памяти (TCM-клетки), эффекторные Т-клетки памяти (TEM-клетки), резидентные Т-клетки памяти (TRM-клетки) и Т-клетки виртуальной памяти (TVM-клетки)), регуляторные Т-клетки (Treg-клетки), естественные Т-клетки-киллеры (NKT-клетки), инвариантные клетки, связанные со слизистой оболочкой (MAIT-клетки), гамма-дельта-Т-клетки (γδТ-клетки), двойные отрицательные Т-клетки (DNT), CD3⁺ B-клетки или любую их комбинацию), которые могут функционировать синергетически или обеспечивать благоприятную среду для повышения жизнеспособности и пролиферации антигенспецифических Т-клеток после контактирования с APC, повышенную эффективность трансдукции CAR-экспрессирующего вектора в такие антигенспецифические Т-клетки и более высокий процент Tcm-клеток в конечной терапевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления дополнительное обогащение проводят после стимуляции Т-клеток антигеном. Например, истощение NK (например, истощение CD56) может использоваться до следующей стадии стимуляции антигеном (т.е. перед рестимуляцией обогащенных антигенспецифических Т-клеток, антигеном).

Стимуляция и трансдукция

Для получения Т-клеток, экспрессирующих Т-клеточный рецептор, который специфически связывается с пептидом, презентированным молекулами MHC класса I, требуется экспансия Т-клеток против определенных антигенов. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки также экспрессируют CAR, который специфически связывается с пептидом, ассоциированным с заболеванием (например, опухоль-ассоциированным пептидом, антигеном, лигандом или т.п.).

Доставка антигена может осуществляться посредством вирусного инфицирования нативным вирусом или посредством трансдукции с использованием рекомбинантного вируса, образца мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от здоровых доноров или выделенных из них лимфобластоидных B-клеток (например, CD19⁺ BLCL). Таким образом, инфицированные или трансдуцированные клетки функционируют в качестве антигенпрезентирующих клеток и называются «стимуляторами». В некоторых вариантах осуществления клетки-стимуляторы также экспрессируют пептид (т.е. антиген) на клеточной поверхности, который распознается CAR. Клетки-стимуляторы могут эндогенно экспрессировать такие CAR- нацеленные пептиды, или могут быть сконструированы для экспрессии таких пептидов. Вирусный вектор, используемый для трансдукции стимуляторов, может представлять собой репликационно-некомпетентный рекомбинантный вирус (например, аденовирус, такой как AdE1-LMPpoly). Альтернативно указанные клетки-стимуляторы инфицируются вирусом дикого типа/нативным вирусом. Отдельный образец или культура (например, PBMC от одного и того же донора, которые не используются для трансдукции, образец PBMC от другого здорового донора или выделенные из них CD3⁺ клетки) включает «респондеры» и содержит Т-клетки, которые становятся активным компонентом терапии, экспрессирующие Т-клеточный рецептор, который специфически связывается с пептидным антигеном, презентированным молекулами MHC класса I. Т-клетки-респондеры можно выделить из РВМС любым подходящим методом, многие из которых хорошо известны в данной области. Например, Т-клетки-«респондеры» можно выделить из образца перед презентацией фракции стимуляторов методами, известными в данной области, такими как анти-CD3 шарики (например, магнитные шарики), прилипание к пластику, элютриационное центрифугирование и/или их комбинации. Предпочтительно клетки-«стимуляторы» (например, PBMC или BLCL) получают из той же клеточной популяции (например, образца PBMC), что и клетки-«респондеры», так что они являются идентично совместимыми по антигенам HLA. Например, образец PBMC от донора разделяют на фракцию клеток-«стимуляторов» и фракцию клеток-«респондеров», где клетки-стимуляторы могут быть обогащены CD3⁺ клетками; и клетки-респондеры трансдуцируют или инфицируют для презентации определенных антигенов на клеточной поверхности. Необязательно, фракция клеток-стимуляторов может быть обогащена способами, известными в данной области до трансдукции/инфицирования, такими как селекция на CD19⁺ клетки. Таким образом, антигенпрезентирующие клетки будут презентировать антиген Т-клеткам (например, CD3⁺ обогащенным клеткам), тем самым активируя и индуцируя пролиферацию антигенспецифических Т-клеток. В некоторых таких вариантах осуществления Т-клетки-респондеры (например, выделенные Т-клетки) трансдуцируют вектором, кодирующим CAR, до презентации антигена фракцией стимуляторов. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки-респондеры (например, выделенные Т-клетки) трансдуцируют вектором, кодирующим CAR, после презентации антигена фракцией стимуляторов.

Следовательно, настоящее изобретение относится к способам получения аллогенных или аутологичных Т-клеток, которые экспрессируют Т-клеточный рецептор, который специфически связывается, например, с EBV пептидом, презентированным молекулами MHC класса I, и дополнительно экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), который связывается с выбранной мишенью (например, CD19). В некоторых вариантах осуществления APC получают в результате вирусного инфицирования клеток-стимуляторов, например, с помощью EBV дикого типа/нативного или аденовирусного вектора, такого как AdE1-LMPpoly. Вектор AdE1-LMPpoly кодирует полиэпитоп из определенных эпитопов CTL из LMP1 и LMP2, слитых с последовательностью EBNA1 без повторов Gly-Ala. Вектор AdE1-LMPpoly описан, например, в публикациях Smith et al., Cancer Research, 72: 1116 (2012); Duraiswamy et al., Cancer Research, 64: 1483-9 (2004); и Smith et al., J. Immunol., 117: 4897-4906 (2006), каждая из которых включена здесь посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления клетки-стимуляторы смешивают с неинфицированными выделенными Т-клетками (респондерами), чтобы презентировать полипитопы EBV указанным Т-клеткам. В некоторых вариантах осуществления выделенные вирус-специфические Т-клетки, презентированные с полиэпитопами EBV, активируются и индуцируются для пролиферации.

Т-клетки можно разделить на наивные или один из трех основных субтипов, подвергающихся действию антигена: Т-клетки центральной памяти, эффекторные Т-клетки памяти и терминально дифференцированные эффекторные Т-клетки. Т-клетки центральной памяти (TCM-клетки) обычно находятся в лимфатических узлах и в периферическом кровотоке. Данный субтип экспрессирует CD45RO, C-C хемокиновый рецептор типа 7 (CCR7) и L-селектин (CD62L). Эффекторные Т-клетки памяти (ТЕМ-клетки) лишены хоминг-рецепторов в лимфатических узлах и, таким образом, обнаруживаются в основном в периферическом кровотоке и тканях. ТЕМ-клетки экспрессируют CD45RO, но не обладают способностью экспрессировать CCR7 и L-селектин. В определенных аспектах настоящее изобретение относится к способам идентификации терапевтического препарата на основе CAR-T-клеток в качестве подходящего для введения реципиенту. В некоторых вариантах осуществления получают образец терапевтического препарата на основе CAR-T-клеток и оценивают его в отношении присутствия различных субтипов T-клеток. Предпочтительно препарат состоит преимущественно из CAR-экспрессирующих Tcm-клеток и/или CD4⁺ T-клеток.

В некоторых вариантах осуществления как клетки-респондеры, так и клетки-стимуляторы происходят из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). В некоторых таких вариантах осуществления клетки-респондеры и клетки-стимуляторы происходят из PBMC от одного и того же донора. В других вариантах осуществления клетки-респондеры и клетки-стимуляторы происходят из PBMC от разных доноров. В некоторых таких вариантах осуществления перед контактированием с клетками-стимуляторами клетки-респондеры выделяют и/или очищают для того, чтобы они состояли по существу из Т-клеток. В предпочтительных вариантах осуществления клетки-респондеры выделяют и/или очищают для того, чтобы они состояли по существу из CD3⁺ клеток. Наиболее предпочтительно, чтобы клетки-респондеры состояли в основном из CD3⁺ Т-клеток.

Перед презентацией клеткам-респондерам (например, Т-клеткам) клетки-стимуляторы могут быть инфицированы нативным вирусом, таким как EBV, тем самым презентируя вирусные антигены на их поверхности. В некоторых вариантах осуществления клетки-стимуляторы трансдуцируют вирусным вектором, предпочтительно аденовирусным вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген вируса герпеса. В некоторых таких вариантах осуществления аденовирусный вектор является репликационно-некомпетентным вирусом. Более предпочтительно, аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более антигенов EBV. Один или более антигенов EBV могут включать пептид LMP1 или его фрагмент, пептид LMP2A или его фрагмент и/или пептид EBNA1 или его фрагмент. Наиболее предпочтительно аденовирусный вектор представляет собой AdE1-LMPpoly и кодирует полиэпитоп из определенных эпитопов CTL из LMP1 и LMP2, слитых с последовательностью EBNA1 без повторов Gly-Ala. В некоторых вариантах осуществления клетки-стимуляторы инкубируют с одним или более цитокинами перед культивированием (т.е. презентацией) с клетками-респондерами (например, неинфицированными PBMC или обогащенными CD3⁺ клетками). Такие клетки-стимуляторы могут включать В-клетки (например, BLCL), антигенпрезентирующие Т-клетки, дендритные клетки, искусственные антигенпрезентирующие клетки и/или клетки aK562. В предпочтительных вариантах осуществления клетки-стимуляторы представляют собой антигенпрезентирующие BLCL.

Несмотря на то, что антигенспецифические Т-клетки достигают активации и пролиферации, когда они презентированы с антигеном фракцией стимуляторов, присутствие таких клеток-стимуляторов нежелательно в конечном продукте собранных CAR-T-клеток. Более того, чтобы минимизировать риск любых событий вирусной рекомбинации в пролиферирующих клетках, ведущих к образованию компетентного вируса, клетки-стимуляторы обрабатывают и/или модифицируют перед культивированием с Т-клетками-респондерами в целях ингибирования пролиферации, например, облучением гамма-лучами или воздействием агента, такого как митомицин С. Например, в таких условиях культивирования клетки-респондеры (например, Т-клетки) презентируются с пептидными антигенами непролиферирующими клетками-стимуляторами. В некоторых таких вариантах осуществления культуру поддерживают, по меньшей мере, от 24 ч до, по меньшей мере, 28 суток до трансдукции CAR-кодирующим вектором. В некоторых вариантах осуществления культуру поддерживают в течение, по меньшей мере, 24 ч, по меньшей мере, 2 суток, по меньшей мере, 3 суток, по меньшей мере, 4 суток, по меньшей мере, 5 суток, по меньшей мере, 6 суток, по меньшей мере, 7 суток, по меньшей мере, 8 суток, по меньшей мере, 9 суток, по меньшей мере, 9 суток, по меньшей мере, 10 суток, по меньшей мере, 11 суток, по меньшей мере, 12 суток, по меньшей мере, 13 суток, по меньшей мере, 14 суток, по меньшей мере, 17 суток или, по меньшей мере, 28 суток до трансдукции CAR-кодирующим вектором. Предпочтительно культуру поддерживают в течение, по меньшей мере, 2 суток после презентации антигена клетками-стимуляторами до трансдукции CAR-кодирующим вектором. Наиболее предпочтительно, чтобы культура поддерживалась в течение, по меньшей мере, 6 суток после презентации антигена клетками-стимуляторами до трансдукции CAR-кодирующим вектором. В дополнительных вариантах осуществления культура поддерживается, по меньшей мере, от 24 ч до, по меньшей мере, 28 суток после трансдукции CAR-кодирующим вектором. В некоторых вариантах осуществления культуру поддерживают в течение, по меньшей мере, 24 ч, по меньшей мере, 2 суток, по меньшей мере, 3 суток, по меньшей мере, 4 суток, по меньшей мере, 5 суток, по меньшей мере, 6 суток, по меньшей мере, 7 суток, по меньшей мере, 8 суток, по меньшей мере, 9 суток, по меньшей мере, 9 суток, по меньшей мере, 10 суток, по меньшей мере, 11 суток, по меньшей мере, 12 суток, по меньшей мере, 13 суток, по меньшей мере,14 суток, по меньшей мере, 17 суток или, по меньшей мере, 28 суток после трансдукции CAR-кодирующим вектором. В некоторых вариантах осуществления при необходимости культуру повторно высевают и/или рестимулируют. Например, Т-клетки-респондеры проходят, по меньшей мере, первую стадию стимуляции (т.е. презентируются с антигеном на APC) и могут быть повторно высеяны и/или рестимулированы при необходимости (т.е. второй раз или более). Указанная повторно высеянная и/или рестимулированная культура поддерживается, по меньшей мере, 24 ч, по меньшей мере, 3 суток, по меньшей мере, 9 суток, по меньшей мере, 11 суток, по меньшей мере, 14 суток, по меньшей мере,17 суток или, по меньшей мере, 28 суток до/или после трансдукции CAR-кодирующим вектором. В предпочтительных вариантах осуществления культуру клеток-респондеров стимулируют, по меньшей мере, один раз перед трансдукцией CAR-кодирующим вектором. Более предпочтительно, чтобы культуру респондеров стимулировали несколько раз, где последующие стадии стимуляции разделяют интервалом от 2 до 14 суток. Например, культура, подвергающаяся первой стимуляции, может подвергнуться второй стимуляции (например, рестимуляции) через 11 суток после первой стимуляции; необязательно, третью стимуляцию (например, рестимуляцию) начинают через 7 суток после второй стадии стимуляции. Культуру, подвергающуюся стадии стимуляции (например, рестимуляции), поддерживают, по меньшей мере, от 1 до 10 суток перед трансдукцией CAR-кодирующим вектором. Предпочтительно культуру поддерживают в течение, по меньшей мере, 2 суток перед трансдукцией CAR-кодирующим вектором. Наиболее предпочтительно, чтобы культура поддерживалась в течение, по меньшей мере, 6 суток после презентации антигена клетками-стимуляторами до трансдукции CAR-кодирующим вектором. Необязательно, перед стимуляцией применяют стадию истощения NK-клеток. Например, CD56⁺ клетки могут быть истощены из культуры (например, с помощью анти-CD56 шариков) непосредственно перед стимуляцией APC.

В некоторых вариантах осуществления после, по меньшей мере, первой презентации антигена для достижения активации и пролиферации, антигенспецифические Т-клетки можно заморозить и хранить до и/или после трансдукции CAR-кодирующим вектором, чтобы разморозить их в более поздний срок. Например, антигенспецифические, CAR-экспрессирующие Т-клетки, рассматриваемые здесь, можно ввести субъекту, нуждающемуся в этом, или заморозить для хранения в банке клеток или репозитории клеток для размораживания в более поздний срок. В некоторых таких вариантах осуществления размороженную культуру рестимулируют, по меньшей мере, еще раз антигеном (например, антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами, такими как BLCL и т.п., как здесь описано) до и/или после трансдукции, как здесь описано. В некоторых вариантах осуществления указанную размороженную культуру рестимулируют и/или повторно высевают при необходимости, и указанную рестимулированную и/или повторно высеянную культуру поддерживают в течение, по меньшей мере, 24 ч, по меньшей мере, 2 суток, по меньшей мере, 3 суток, по меньшей мере, 9 суток, по меньшей мере, 11 суток, по меньшей мере, 14 суток, по меньшей мере, 17 суток или, по меньшей мере, 28 суток до/или после трансдукции CAR-кодирующим вектором, как здесь описано. Аналогичным образом, в таких случаях, когда культура многократно рестимулируется, то последующие стадии стимуляции разделяют интервалом от 2 до 14 суток, как здесь описано.

Для активации и пролиферации антигенспецифических Т-клеток также требуется достаточная презентация антигена клетками-стимуляторами. Следовательно, культуры для стимуляции, рассматриваемые здесь (например, включая культуры для рестимуляции) имеют известные соотношения клеток-респондеров к клеткам-стимуляторам. Например, соотношение клеток-респондеров к клеткам-стимуляторам составляет от 0,1:1 до 20:1. Предпочтительно соотношение клеток-респондеров к клеткам-стимуляторам составляет примерно от 0,2:1 до примерно 5:1. В некоторых вариантах осуществления соотношение клеток-респондеров к клетам-стимуляторам составляет примерно 20:1, примерно 19:1, примерно 18:1, примерно 17:1, примерно 16:1, примерно 15:1, примерно 14:1, примерно 13:1, примерно 12:1, примерно 11:1, примерно 10:1, примерно 9:1, примерно 8:1, примерно 7:1, примерно 6:1, примерно 5:1, примерно 4:1, примерно 3:1, примерно 2:1, примерно 1:1, примерно 0,9:1, примерно 0,8:1, примерно 0,7: 1, примерно 0,6:1, примерно 0,5:1, примерно 0,4:1, примерно 0,3: 1, примерно 0,2:1 или примерно 0,1:1. В некоторых таких вариантах осуществления соотношение клеток-респондеров к клеткам-стимуляторам составляет примерно 0,25:1, 0,43:1 или 4:1. Более того, в таких случаях, когда культура многократно рестимулируется, то каждая стимуляция может включать такое же соотношение или другое соотношение клеток-респондеров к клеткам-стимуляторам. Например, и без ограничения, в предпочтительных вариантах осуществления начальная стимуляция включает соотношение респондеры:стимуляторы примерно 0,43:1. Последующая стимуляция (например, рестимуляция) может включать соотношение респондеры:стимуляторы 0,25:1, и еще одна стимуляция (например, рестимуляция) включает соотношение респондеры:стимуляторы 4:1.

Специалист в данной области понимает, что пролиферация клеток в культуре может варьироваться и ограничивается потребностями в питательных веществах и кислороде, а также накоплением продуктов жизнедеятельности, таких как диоксид углерода и молочная кислота. Таким образом, специалист в данной области сможет эмпирически определить подходящие схемы культивирования и (при необходимости) повторного высева для получения Т-клеток по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления культуру поддерживают до заранее определенной даты сбора клеток. Оценка культуры и определение наличия или отсутствия активного вируса имеет место до и/или в день сбора клеток. Наиболее предпочтительно, чтобы культуры и/или препараты, раскрытые здесь, по существу не содержали активного вируса на время сбора CTL.

Антигенные пептиды

В определенных аспектах изобретение относится к способам получения аллогенных или аутологичных CAR-T-клеток, экспрессирующих TCR, которые специфически связываются с пептидами (например, антигенами), содержащими Т-клеточные эпитопы, презентированные молекулами MHC класса I, и CAR, которые связываются с выбранной мишенью, такой как ассоциированная с заболеванием пептидная мишень, для лечения аутоиммунных расстройств и рака (например, MS, SAD, IBD и/или CD19⁺ B-клеточных злокачественных новообразований, лимфом и лейкозов). Настоящее изобретение относится к Т-клеткам, подходящим для получения CAR-T-клеток, полученных инкубированием образца, содержащего Т-клетки (например, образца PBMC или выделенных из него CD3⁺ клеток), с антигенпрезентирующими клетками (APC), которые презентируют один или более T-клеточных эпитопов, описанных здесь (например, APC, которые презентируют пептид, описанный здесь, содержащий эпитоп EBV, молекулами MHC класса I, например, инфицированные EBV или рекомбинантно трансдуцированные BLCL).

В некоторых таких вариантах осуществления пептиды, содержащие Т-клеточный эпитоп, как здесь описано, включают эпитопы вирусов, таких как, без ограничения, вирус герпеса (например, EBV и CMV), папилломавирус (например, HPV), аденовирус, полиомавирус (например, BKV, JCV и вирус клеток Меркеля), ретровирус (например, HTLV-I, также включая лентивирус, такой как ВИЧ), пикорнавирус (например, вирус гепатита A), гепаднавирус (например, вирус гепатита B), гепацивирус (например, вирус гепатита C), дельтавирус (например, вирус гепатита D) и гепевирус (например, вирус гепатита E) и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения эпитопы представляют собой Т-клеточные эпитопы, совместимые по HLA-антигенам класса I. В других вариантах осуществления эпитопы представляют собой Т-клеточные эпитопы, совместимые по HLA-антигенам класса II.

Пептиды, обеспеченные здесь, могут содержать последовательность любого EBV вирусного белка (например, последовательность, по меньшей мере, из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот любого белка EBV). В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат не более 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 смежных аминокислот EBV вирусного белка.

Пептиды, обеспеченные здесь, могут содержать последовательность LMP1 (например, последовательность, по меньшей мере, из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот LMP1). В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат не более 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 смежных аминокислот LMP1. Примерная аминокислотная последовательность LMP1 представлена ниже (SEQ ID NO: 1):

1 mdldlergpp gprrpprgpp lssyialall llllallfwl yiimsnwtgg allvlyafal

61 mlviiiliif ifrrdllcpl galcllllmi tlllialwnl hgqalylgiv lfifgcllvl

12 1giwvyfleil wrlgatiwql lafflaffld illliialyl qqnwwtllvd llwlllflai

18 1liwmyyhgqr hsdehhhdds lphpqqatdd ssnhsdsnsn egrhhllvsg agdapplcsq

24 1nlgapgggpd ngpqdpdntd dngpqdpdnt ddngphdplp qdpdntddng pqdpdntddn

30 1gphdplphnp sdsagndggp pnlteevenk ggdrgppsmt dggggdphlp tlllgtsgsg

361 gddddphgpv qlsyyd

В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат последовательность LMP2A (например, последовательность, по меньшей мере, из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот LMP2A). В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат не более 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 смежных аминокислот LMP2A. Примерная аминокислотная последовательность LMP2A представлена ниже (SEQ ID NO: 2):

1 mgslemvpmg agppspggdp dgddggnnsq ypsasgsdgn tptppndeer esneeppppy

61 edldwgngdr hsdyqplgnq dpslylglqh dgndglpppp ysprddssqh iyeeagrgsm

121 npvclpviva pylfwlaaia ascftasvst vvtatglals llllaavass yaaaqrkllt

181 pvtvltavvt ffaicltwri edppfnsllf allaaagglq giyvlvmlvl lilayrrrwr

241 rltvcggimf lacvlvlivd avlqlspllg avtvvsmtll llafvlwlss pgglgtlgaa

301 lltlaaalal laslilgtln lttmfllmll wtlvvllics scsscpltki llarlflyal

361 allllasali aggsilqtnf kslsstefip nlfcmllliv agilfilail tewgsgnrty

421 gpvfmclggl ltmvagavwl tvmtntllsa wiltagflif ligfalfgvi rccryccyyc

481 ltleseerpp tpyrntv

В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат последовательность EBNA1 (например, последовательность, по меньшей мере, из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот EBNA1). В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат не более 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 смежных аминокислот EBNA1. Примерная аминокислотная последовательность EBNA1 представлена ниже (SEQ ID NO: 3):

1 pffhpvgead yfeylqeggp dgepdvppga ieqgpaddpg egpstgprgq gdggrrkkgg

61 wfgkhrgqgg snpkfeniae glrvllarsh vertteegtw vagvfvyggs ktslynlrrg

121 talaipqcrl tplsrlpfgm apgpgpqpgp lresivcyfm vflqthifae vlkdaikdlv

181 mtkpaptcni kvtvcsfddg vdlppwfppm vegaaaegdd gddgdeggdg degeegqe

Предпочтительно пептид содержит последовательность эпитопа, приведенную в таблице 1.

Таблица 1
Примерные EBV вирусные белковые эпитопы Последовательность эпитопа Совместимые по HLA-антигенам SEQ ID NO. CLGGLLTMV A*02 4 FLYALALLL A*02 5 YLQQNWWTL A*02, A*68, A*69 6 YLLEMLWRL A*02 7 ALLVLYSFA A*02 8 LLSAWILTA A*0203 9 LTAGFLIFL A*0206 10 SSCSSCPLSKI A*11 11 PYLFWLAA A*23, A*24, A*30 12 TYGPVFMCL A*24 13 VMSNTLLSAW A*25 14 CPLSKILL B*08 15 RRRWRRLTV B*27 16 IEDPPFNSL B*40 17 IALYLQQNW B*57, B*58 18 MSNTLLSAW B*58 19 VLKDAIKDL A*0203 20 RPQKRPSCI B*07 21 IPQCRLTPL B*07 22 YNLRRGTAL B*08 23 HPVGEADYFEY B*35 24 LSRLPFGMA B*57 25 FVYGGSKTSL Cw*03 26

В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат последовательность любого белка полиомавируса, например пептиды, содержащие эпитопы BKV, эпитопы JCV, эпитопы MCV и/или эпитопы, которые содержат последовательности, гомологичные между эпитопами BKV, JCV и/или MCV, которые распознаются CTL, когда презентированы на HLA. В некоторых вариантах осуществления эпитопы, описанные здесь, пригодны для профилактики и/или лечения полиомавирусной инфекции (например, вирусных инфекций BKV, JCV или MCV) и/или рака (например, злокачественной опухоли, ассоциированной с полиомавирусом, экспрессирующей эпитоп, представленный здесь) и/или для создания фармацевтических средств (например, CTL и/или APC), которые пригодны для профилактики и/или лечения полиомавирусной инфекции (например, вирусных инфекций BKV, JCV или MCV) и/или рака (например, злокачественной опухоли, ассоциированной с полиомавирусом, экспрессирующей эпитоп, представленный здесь). В некоторых вариантах осуществления эпитоп представляет собой гибридный эпитоп, содержащий аминокислоты как из эпитопа BKV, так и из гомологичного эпитопа JCV и/или аминокислотных вариантов, обнаруженных в различных эпитопах BKV или JCV. В некоторых вариантах осуществления композиции и способы, обеспеченные здесь, дополнительно содержат эпитоп MCV. Типичные пептиды, содержащие эпитопы BKV, эпитопы JCV, эпитопы MCV и/или эпитопы, которые содержат последовательности, гомологичные для эпитопов BKV, JCV и/или MCV (например, гибридные эпитопы), можно найти в WO2018049165, в полном объеме включенной здесь посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат последовательность любого белка цитомегаловируса, например пептиды, содержащие эпитопы, которые распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) и которые пригодны для профилактики и/или лечения инфекции CMV и/или рака (например, рака, экспрессирующего эпитоп CMV). Примеры пептидов, содержащих эпитопы CMV, можно найти в любой из заявок WO2017203370, WO2014059489 и WO2006056027, в полном объеме включенных здесь посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат последовательность любого белка вируса папилломы человека, например пептиды, содержащие эпитопы HPV, которые распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) и которые пригодны для профилактики и/или лечения HPV инфекции и/или рака (например, злокачественной опухоли, экспрессирующей эпитоп HPV) и/или предраковых состояний. Типичные пептиды, содержащие эпитопы HPV, можно найти в PCT/US2019/014727, в полном объеме включенной здесь посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления пептиды содержат эпитопы двух или более вирусов. В некоторых вариантах осуществления пептиды содержат эпитопы трех или более вирусов. В некоторых вариантах осуществления пептиды содержат эпитопы из четырех или более вирусов. В некоторых вариантах осуществления пептиды содержат эпитопы пяти или более вирусов. Например, в некоторых вариантах осуществления пептиды содержат последовательности, по меньшей мере, из двух, трех, четырех или пяти из JCV, BKV, MCV, EBV, CMV и/или HPV.

В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат два или более Т-клеточных эпитопов (например, вирусных эпитопов). В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 Т-клеточных эпитопов. Например, в некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат два или более Т-клеточных эпитопов, связанных линкерами (например, полипептидными линкерами). В некоторых вариантах осуществления полипептид или белок дополнительно содержит промежуточную аминокислотную последовательность, по меньшей мере, между двумя из множества эпитопов. В некоторых вариантах осуществления промежуточные аминокислоты или аминокислотные последовательности представляют собой аминокислоты или аминокислотные последовательности, которые высвобождаются из протеасомы. Неограничивающие примеры аминокислот или аминокислотных последовательностей, которые высвобождаются из протеасомы, представляют собой или содержат AD, K или R. В некоторых вариантах осуществления промежуточные аминокислоты или аминокислотные последовательности представляют собой мотивы распознавания TAP. Обычно мотивы распознавания TAP могут соответствовать следующей формуле: (R/N:I/Q:W/Y) n, где n равно любому целому числу ≥1. Неограничивающие примеры мотивов распознавания TAP включают RIW, RQW, NIW и NQY. В некоторых вариантах осуществления эпитопы, описанные здесь, связаны или соединены аминокислотной последовательностью, которая высвобождается из протеасомы и, необязательно, мотивом распознавания ТАР на карбоксильном конце каждого эпитопа.

В некоторых вариантах осуществления последовательность пептидов включает последовательность вирусного белка, за исключением 1 или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) консервативных модификаций последовательности. В рамках настоящего изобретения, термин «консервативные модификации последовательности» предназначен для обозначения аминокислотных модификаций, которые не оказывают существенного влияния или не изменяют взаимодействие между Т-клеточным рецептором (TCR) и пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, презентированную молекулами MHC. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, добавления (например, добавления аминокислот к N- или C-концу пептида) и делеции (например, делеции аминокислот с N- или C-конца пептида). Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим аналогичную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, известны и определены в данной области. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более аминокислотных остатков пептидов, описанных здесь, могут быть заменены другими аминокислотными остатками из того же семейства боковых цепей, и измененный пептид можно тестировать на сохранение связывания с TCR с использованием методов, известных в данной области. Модификации в антитело можно ввести стандартными методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез.

В некоторых вариантах осуществления пептиды, обеспеченные здесь, содержат последовательность, которая, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична последовательности белка (например, последовательности фрагмента вирусного белка). Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей, последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, могут быть введены гэпы в одну или обе из первой и второй аминокислотных последовательностей для оптимального выравнивания, и неидентичные последовательности можно не принимать во внимание для сравнения). Затем сравнивают аминокислотные остатки в соответствующих аминокислотных положениях. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком, что и соответствующее положение во второй последовательности, то тогда молекулы идентичны по этому положению. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей, с учетом количества гэпов и длины каждого гэпа, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей.

Пептид может представлять собой химерный или гибридный пептид. В рамках настоящего изобретения, термин «химерный пептид» или «гибридный пептид» включает пептид, имеющий последовательность, представленную здесь, связанную с отдельным пептидом, имеющим последовательность, с которой он не связан в природе. Например, отдельный пептид может быть слит с N-концом или C-концом пептида, обеспеченного здесь, напрямую, через пептидную связь или опосредованно через химический линкер. В некоторых вариантах осуществления пептид, обеспеченный здесь, связан с другим пептидом, содержащим отдельный эпитоп. В некоторых вариантах осуществления пептид, обеспеченный здесь, связан с пептидами, содержащими эпитопы, ассоциированные с другими вирусными и/ или инфекционными заболеваниями. Химерный или гибридный пептид, обеспеченный здесь, можно получить стандартными методами рекомбинантной ДНК. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные пептидные последовательности, лигируют вместе в рамке считывания в соответствии с общепринятыми методами, например, используя тупые концы или ступенчатые концы для лигирования, расщепление рестрикционным ферментом для обеспечения соответствующих концов, заполнение липких концов, при необходимости, обработку щелочной фосфатазой, чтобы избежать нежелательного соединения, и ферментативное лигирование. В другом варианте гибридный ген можно синтезировать обычными методами, включая автоматические синтезаторы ДНК. В качестве альтернативы, можно провести ПЦР-амплификацию фрагментов гена с использованием якорных праймеров, которые обеспечивают образование комплементарных выступов между двумя последовательными участками гена, которые затем можно подвергнуть отжигу и повторной амплификации для получения последовательности химерного гена (см., например, Current Protocols in Molecular Биология, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons: 1992). Более того, коммерчески доступны многие экспрессионные векторы, которые уже кодируют гибридный фрагмент.

Пептиды, обеспеченные здесь, можно выделить из клеточных или тканевых источников с помощью соответствующей схемы очистки с использованием стандартных методов очистки белков, и можно получить методами рекомбинантной ДНК и/или можно синтезировать химическим путем с использованием стандартных методов пептидного синтеза. Пептиды, описанные здесь, можно продуцировать в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах экспрессией нуклеотидов, кодирующих пептид(ы) по настоящему изобретению. Альтернативно такие пептиды можно синтезировать химическими методами. Способы экспрессии гетерологичных пептидов в рекомбинантных хозяевах, химический синтез пептидов и трансляция in vitro хорошо известны в данной области и описаны в следующих источниках Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. (1969) J. Am. Chem. Soc., 91:501; Chaiken I. M. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 11:255; Kaiser et al. (1989) Science 243:187; Merrifield, B. (1986) Science 232:342; Kent S. B. H. (1988) Annu. Rev. Biochem., 57:957; и Offord, R. E. (1980) Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, которые включены здесь посредством ссылки.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим пептиды, описанные здесь. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вектор. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты представляет собой вирусный вектор, такой как экспрессионный вектор на основе аденовируса, который содержит молекулы нуклеиновой кислоты, описанные здесь. В некоторых вариантах осуществления вектор, обеспеченный здесь, кодирует множество эпитопов, описанных здесь (например, в виде полиэпитопа). В некоторых вариантах осуществления вектор, обеспеченный здесь, кодирует, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 эпитопов, описанных здесь (например, эпитопы, приведенные в таблице 1).

В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор (например, аденовирусный вектор, такой как AdE1-LMPpoly). Вектор AdE1-LMPpoly кодирует полиэпитоп из определенных эпитопов CTL из LMP1 и LMP2, слитых с последовательностью EBNA1 без повторов Gly-Ala. Вектор AdE1-LMPpoly описан, например, в публикациях Smith et al., Cancer Research, 72: 1116 (2012); Duraiswamy et al., Cancer Research, 64: 1483-9 (2004); и Smith et al., J. Immunol., 117: 4897-4906 (2006), каждая из которых включена здесь посредством ссылки.

В рамках настоящего изобретения, термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Одним из типов вектора является «плазмида», которая относится к кольцевой двухцепочечной молекуле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип вектора представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов. Такие векторы называются здесь «рекомбинантными экспрессионными векторами» (или просто «экспрессионными векторами»). В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, функционально связанным с одной или более регуляторными последовательностями (например, промотором) в экспрессионном векторе. В некоторых вариантах осуществления клетка транскрибирует нуклеиновую кислоту, обеспеченную здесь, и тем самым экспрессирует пептид, описанный здесь. Молекула нуклеиновой кислоты может быть интегрирована в геном клетки или может быть внехромосомной.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клеткам, которые содержат нуклеиновую кислоту, описанную здесь (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, описанный здесь). Клетка может представлять собой, например, прокариотическую, эукариотическую клетку, клетку млекопитающего, птицы, мыши и/или человека. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой APC (например, антигенпрезентирующую Т-клетку, дендритную клетку, В-клетку или клетку aK562). В способах по настоящему изобретению нуклеиновую кислоту, описанную здесь, можно ввести в клетку, например, в виде нуклеиновой кислоты без носителя для доставки и в комбинации с реагентом для доставки. В некоторых вариантах осуществления любой способ доставки нуклеиновой кислоты, известный в данной области, можно использовать в способах, описанных здесь. Подходящие реагенты для доставки включают, не ограничиваясь этим, например, липофильный реагент Mirus Transit TKO; липофектин; липофектамин; целлфектин; поликатионы (например, полилизин), ателоколлаген, наноплексы и липосомы. В некоторых вариантах осуществления способов, описанных здесь, для доставки нуклеиновой кислоты в клетку или субъекту используются липосомы. Липосомы, подходящие для применения в способах, описанных здесь, можно приготовить из обычных липидов, образующих везикулы, которые обычно включают нейтральные или отрицательно заряженные фосфолипиды и стерол, такой как холестерин. Выбор липидов обычно осуществляется с учетом таких факторов, как желаемый размер липосом и период полураспада липосом в кровотоке. Известны различные способы получения липосом, например, как описано в публикации Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; и патентах США № 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369, полное описание которых включено здесь посредством ссылки.

CAR-T-клетки

Настоящее изобретение относится к способам лечения рака и аутоиммунных заболеваний (например, MS, SAD, IBD) введением субъекту аллогенных или аутологичных CAR-T-клеток, экспрессирующих Т-клеточный рецептор, который специфически связывается с антигеном (например, вирусным пептидным антигеном), презентированном молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC), и молекулу химерного антигенного рецептора со способностью как специфически связывать выбранный целевой пептид, так и трансдуцировать последующие сигналы активации через тирозин-содержащие активирующие мотивы иммунорецепторов (ITAM), присутствующие в их цитоплазматических хвостах.

В некоторых вариантах осуществления антигенспецифические Т-клетки, используемые для генерации CAR-T-клеток по настоящему изобретению, выбирают из банка или библиотеки клеток. Предпочтительно MHC представляет собой MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления MHC представляет собой MHC класса II и имеет полипептид с α-цепью, который представляет собой HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA или HLA-DRA. В некоторых таких вариантах осуществления MHC класса II имеет полипептид с β-цепью, который представляет собой HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB или HLA-DRB. Такие Т-клетки, как здесь описано (например, антигенспецифические Т-клетки и антигенспецифические Т-клетки, экспрессирующие CAR), хранятся в библиотеке или банке клеток до их введения субъекту.

В некоторых вариантах осуществления Т-клетки, используемые для получения CAR-T-клеток по изобретению, представляют собой полифункциональные Т-клетки, т.е. такие Т-клетки, которые способны индуцировать многочисленные иммунные эффекторные функции, которые обеспечивают более эффективный иммунный ответ на патоген, чем клетки, которые продуцируют, например, только один иммунный эффектор (например, единственный биомаркер, такой как цитокин или CD107a). Менее полифункциональные, монофункциональные или даже «истощенные» Т-клетки могут доминировать в иммунных ответах во время хронических инфекций, тем самым отрицательно влияя на защиту от вирус-ассоциированных осложнений. Аналогичным образом, CAR-T-клетки по изобретению также являются полифункциональными (например, проявляют, сохраняют или обладают повышенной полифункциональностью). В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, 50% Т-клеток, используемых для получения CAR-T-клеток по изобретению, являются CD4⁺ Т-клетками. В некоторых таких вариантах осуществления указанные Т-клетки составляют менее 50% CD4⁺ Т-клеток. В других вариантах осуществления указанные Т-клетки преимущественно представляют собой CD4⁺ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, 50% Т-клеток, используемых для получения CAR-T-клеток по изобретению, представляют собой CD8⁺ Т-клетки. В некоторых таких вариантах осуществления указанные Т-клетки составляют менее 50% CD8⁺ Т-клеток. В других вариантах осуществления указанные Т-клетки преимущественно представляют собой CD8⁺ Т-клетки.

Настоящее изобретение относится к APC, которые презентируют пептид, описанный здесь (например, пептид, содержащий Т-клеточный эпитоп). В некоторых вариантах осуществления APC представляют собой В-клетки, антигенпрезентирующие Т-клетки, дендритные клетки или искусственные антигенпрезентирующие клетки (например, клетки aK562). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления APC происходят из лимфобластоидных клеток, таких как BLCL. Типичные антигенпрезентирующие BLCL описаны в публикациях O'Reily et al., Immunol. Res., 2007 38: 237-250 и Koehne et al., Blood 2002 99: 1730-1740, которые включены здесь посредством ссылки.

Дендритные клетки для применения в способе можно приготовить, выделив PBMC из образца пациента и прикрепив их к пластику. Как правило, популяция моноцитов прилипает, и все остальные клетки можно смыть. Затем прилипшую популяцию дифференцируют с помощью IL-4 и GM-CSF для получения дендритных клеток, происходящих из моноцитов. Данные клетки можно подвергнуть созреванию посредством добавления IL-1β, IL-6, PGE-1 и TNF-α (который активирует важные костимулирующие молекулы на поверхности дендритной клетки), и затем трансдуцировать одним или более пептидами, обеспеченными здесь.

В некоторых вариантах осуществления APC представляет собой искусственную антигенпрезентирующую клетку, такую как клетка aK562. В некоторых вариантах осуществления искусственные антигенпрезентирующие клетки сконструированы для экспрессии CD80, CD83, 41BB-L и/или CD86. Типичные искусственные антиген-презентирующие клетки, включая клетки aK562, описаны в опубликованной заявке на патент США 2003/0147869, которая включена здесь посредством ссылки.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам получения APC, которые презентируют один или более Т-клеточных эпитопов, описанных здесь, включающим контактирование APC с пептидом, содержащим эпитоп, и/или с нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный эпитоп. В некоторых вариантах осуществления APC подвергают облучению. Клетка, презентирующая пептид, описанный здесь, может быть получена стандартными методами, известными в данной области. Например, клетку можно подвергнуть импульсному воздействию, чтобы индуцировать захват пептида. В некоторых вариантах осуществления клетки трансфектируют нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид, обеспеченный здесь. Настоящее изобретение относится к способам получения антигенпрезентирующих клеток (APC), включающим введение в клетку пептидов, описанных здесь. Иллюстративные примеры получения антигенпрезентирующих клеток можно найти в WO2013088114, которая в полном объеме включена здесь посредством ссылки.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе обеспечиваются Т-клетки (например, CD4 Т-клетки и/или CD8 Т-клетки), которые экспрессируют TCR (например, αβ TCR или γδ TCR), который распознает пептид, описанный здесь, презентированный молекулами MHC. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка представляет собой CD8 Т-клетку (CTL), которая экспрессирует TCR, который распознает пептид, описанный здесь, презентированный молекулами MHC класса I. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка представляет собой CD4 Т-клетку (хелперную Т-клетку), которая распознает пептид, описанный здесь, презентированный молекулами MHC класса II.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения, активации и/или индукции пролиферации CAR-T-клеток, которые распознают один или более EBV эпитопов, описанных здесь, и также экспрессируют химерный антигенный рецептор (например, EBV-специфические, анти-CD19-CAR- -Т-клетки). В некоторых вариантах осуществления культуру (или ее образец), содержащую Т-клетки (т.е. выделенные Т-клетки), инкубируют в культуре с АРС, описанными здесь (например, АРС, которая презентирует пептид, содержащий EBV эпитоп на комплексе МНС класса I, такие как трансдуцированные вирусом PBMC, описанные здесь). В некоторых вариантах осуществления APC являются аутологичными по отношению к субъекту, от которого были получены Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления APC не являются аутологичными по отношению к субъекту, от которого были получены Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления образец, содержащий Т-клетки, инкубируют два или более раз с АРС, описанными здесь. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки (и/или CAR-T-клетки) инкубируют с APC в присутствии, по меньшей мере, одного цитокина. В некоторых вариантах осуществления цитокин представляет собой IL-2, IL-4, IL-7 и/или IL-15. Аналогичным образом, культуры Т-клеток и/или CAR-T-клеток могут поддерживаться в присутствии, по меньшей мере, одного цитокина, такого как IL-2, IL-4, IL-7 и/или IL-15. Примеры способов индукции пролиферации Т-клеток с использованием APC представлены, например, в опубликованной заявке на патент США 2015/0017723, которая включена здесь посредством ссылки. В предпочтительных вариантах осуществления такие антигенспецифические (например, EBV-специфические) Т-клетки трансдуцируют вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую химерный антигенный рецептор (CAR), который обычно включает внеклеточный домен (также называемый эктодоменом), и трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен (также называемый эндодоменом).

Внеклеточный домен позволяет CAR при экспрессии на поверхности Т-клетки направлять активность Т-клеток в те клетки, которые экспрессируют мишень, распознаваемую внеклеточным доменом. Включение костимулирующего домена, такого как костимулирующий домен 4-1BB (CD137), последовательно с CD3ζ во внутриклеточной области, позволяет Т-клетке получать костимулирующие сигналы.

В целях иллюстрации CAR первого поколения представляют собой искусственный рецептор, который при экспрессии Т-клетками может перенацеливать их на заранее определенный антиген, ассоциированный с заболеванием (например, опухоль-ассоциированные антигены). Такие CAR обычно содержат одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из мишень-специфического антитела (например, опухолевого антигена), слитого с сигнальными доменами из Т-клеточного рецептора (TCR), такими как CD3ζ. После связывания антигена CAR запускают фосфорилирование тирозин-содержащих активирующих мотивов иммунорецепторов (ITAMS) и инициируют сигнальный каскад, необходимый для цитолиза, секреции и пролиферации цитокинов, минуя путь эндогенного процессинга антигена и ограничение MHC. Конструкции CAR второго поколения включают дополнительные сигнальные домены для усиления активации и костимуляции, такие как CD28 и/или 4-1BB. CAR второго поколения индуцируют высокую секрецию IL-2, увеличивают пролиферацию и персистентность Т-клеток, опосредуют большее отторжение опухоли и увеличивают выживаемость Т-клеток. CAR третьего поколения получают объединением нескольких сигнальных доменов, таких как CD3ζ-CD28-OC40 или CD3ζ-CD28-41BB, для повышения эффективности за счет более сильной продукции цитокинов и способности к киллингу.

Эктодомен CAR, раскрытых здесь, обычно содержит нацеливающий домен, такой как лиганд-связывающий домен или домен распознавания антигена, который связывает целевой антиген. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен происходит от одноцепочечных альфа- и бета-цепей нативного Т-клеточного рецептора (TCR), как здесь описано. Предпочтительно такие нацеливающие домены имеют простые эктодомены (например, эктодомен CD4 для распознавания ВИЧ-инфицированных клеток). Альтернативно, такие домены распознавания антигена содержат экзотические компоненты распознавания, такие как связанный цитокин (что приводит к распознаванию клеток, несущих рецептор цитокина). Как правило, в отношении способов, раскрытых здесь, то почти все, которые связывают данную мишень с высокой аффинностью, можно использовать в качестве области распознавания антигена. Таким образом, такие нацеливающие домены обычно получают из антитела. В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен представляет собой функциональный фрагмент антитела или его производного (например, scFv или Fab, или любой подходящий антигенсвязывающий фрагмент антитела). В предпочтительных вариантах осуществления эктодомен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых таких вариантах осуществления scFv происходит из моноклонального антитела (mAb). В предпочтительных вариантах осуществления антигенспецифический связывающий домен (например, scFv) слит с трансмембранными и/ или сигнальными мотивами, участвующими в активации лимфоцитов, как описано в публикации Sadelain M. et al., Nat. Rev. Cancer, 2003, 3: 35-45, которая в полном объеме включена здесь посредством ссылки. Он также необязательно содержит сигнальный пептид (SP), так что CAR может быть гликозилирован и заякорен в клеточной мембране эффекторной иммунной клетки. Аффинность/специфичность scFv в значительной степени определяется специфическими последовательностями внутри определяющих комплементарность участков (CDR) в тяжелой (VH) и легкой (VL) цепи. Каждая последовательность VH и VL будет иметь три CDR (CDR1, CDR2, CDR3).

В некоторых вариантах осуществления нацеливающий домен происходит из природных антител, таких как моноклональные антитела. В некоторых случаях это человеческое антитело. В некоторых случаях антитело подвергают изменению, чтобы сделать его менее иммуногенным при введении людям. Например, изменение может включать один или более методов, выбранных из химеризации, гуманизации, CDR-прививки, деиммунизации и мутации аминокислот каркаса, чтобы соответствовать самой ближайшей последовательности зародышевой линии человека. В еще одних вариантах осуществления нацеливающий домен представляет собой нацеливающий домен на основе лиганда, где, например, scFv, описанный здесь, заменяется лигандом для опухолевого маркера. Таким образом, CAR, который экспрессирует лиганд рецептора IL13 (IL13R), позволит перенаправить Т-клетки на IL13R, экспрессируемый на глиобластоме.

Также раскрываются биспецифические CAR, которые способны связываться, по меньшей мере, с двумя молекулярными мишенями (например, клеточно-специфическими маркерами и опухолевыми антигенами). Также раскрываются CAR, предназначенные для функционирования только в сочетании с другим CAR, который связывает другой антиген, такой как антиген, ассоциированный с раком. Например, в этих вариантах осуществления эндодомен первого CAR содержит только сигнальный домен (SD) или костимулирующую сигнальную область (CSR), но не оба. Второй CAR обеспечивает недостающий сигнал, если он активирован. Например, если раскрытый CAR содержит SD, но не CSR, то иммунная эффекторная клетка, содержащая этот CAR, активируется только в том случае, если другой CAR (или Т-клетка), содержащий CSR, связывается с соответствующим антигеном. Аналогично, если раскрытый CAR содержит CSR, но не SD, то иммунная эффекторная клетка, содержащая этот CAR, активируется только в том случае, если другой CAR (или Т-клетка), содержащий SD, связывается с соответствующим антигеном.

Примеры антигенов включают, не ограничиваясь этим, опухолевые антигены, т.е. белки, которые продуцируются опухолевыми клетками, которые индуцируют иммунный ответ, в частности иммунные ответы, опосредованные Т-клетками. Дополнительный антигенсвязывающий домен может представлять собой антитело или природный лиганд опухолевого антигена. Выбор дополнительного антигенсвязывающего домена будет зависеть от конкретного типа рака, подлежащего лечению. Опухолевые антигены хорошо известны в данной области и включают, например, ассоциированный с глиомой антиген, карциноэмбриональный антиген (CEA), EGFRvIII, IL-llRa, IL-13Ra, EGFR, FAP, B7H3, Kit, CA LX, CS-1, MUC1, BCMA, bcr-abl, HER2, β-хорионический гонадотропин человека, альфа-фетопротеин (AFP), ALK, CD19, TIM3, циклин Bl, лектин-реактивный AFP, Fos-родственный антиген 1, ADRB3, тиреоглобулин, EphA2, RAGE-1, RU1, RU2, SSX2, AKAP-4, LCK, OY-TES1, PAX5, SART3, CLL-1, фукозил GM1, GloboH, MN-CA IX, EPCAM, EVT6-AML, TGS5, обратную транскриптазу теломеразы человека, полисиаловую кислоту, PLAC1, RU1, RU2(AS), кишечную карбоксилэстеразу, lewisY, sLe, LY6K, HSP70, HSP27, mut hsp70-2, M-CSF, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIBI, BORIS, простазу, простатспецифический антиген (PSA), PAX3, PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, LMP2, NCAM, p53, мутант p53, мутант Ras, gplOO, простеин, OR51E2, PANX3, PSMA, PSCA, Her2/neu, hTERT, HMWMAA, HAVCR1, VEGFR2, PDGFR-beta, сурвивин и теломеразу, легумаин, HPV E6, E7, белок спермы 17, SSEA-4, тирозиназу, TARP, WT1, опухолевый антиген-1 карциномы предстательной железы (PCTA-1), ML-IAP, MAGE, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-C1, MAGE-C2, аннексин-A2, MAD-CT-1, MAD-CT-2, MelanA/MART 1, XAGE1, ELF2M, ERG (гибридный ген TMPRSS2 ETS), NA17, эластазу нейтрофилов, контрольные точки транслокации саркомы, NY-BR-1, ephnnB2, CD20, CD22, CD24, CD30, TIM3, CD38, CD44v6, CD97, CD171, CD179a, рецептор андрогенов, FAP, инсулиноподобный фактор роста (IGF)-I, IGFII, рецептор IGF-I, GD2, о-ацетил-GD2, GD3, GM3, GPRC5D, GPR20, CXORF61, рецептор фолиевой кислоты (FRa), рецептор фолиевой кислоты бета, ROR1, Flt3, TAG72, TN Ag, Tie 2, TEM1, TEM7R, CLDN6, TSHR, UPK2 и мезотелин. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления опухолевый антиген выбран из рецептора фолиевой кислоты (FRa), мезотелина, EGFRvIII, IL-13Ra, CD123, CD19, TIM3, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUC1, HER2 и любой их комбинации.

Дополнительные неограничивающие примеры опухолевых антигенов включают следующие: антигены дифференцировки, такие как тирозиназа, TRP-1, TRP-2, и опухолеспецифические антигены многих линий дифференцировки, такие как MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pi 5; сверхэкспрессированные эмбриональные антигены, такие как СЕА; сверхэкспрессированные онкогены и мутированные гены-супрессоры опухолей, такие как p53, Ras, HER-2/neu; уникальные опухолевые антигены, образовавшиеся в результате хромосомных транслокаций; такие как BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; и вирусные антигены, такие как антигены вируса Эпштейна-Барра EBVA и антигены E6 и E7 вируса папилломы человека (HPV). Другие крупные антигены на основе белков включают SCCA, GP73, FC-GP73, TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, бета-катенин, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, альфа-фетопротеин, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3/CA 27.29/BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68/P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733/EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCASl, SDCCAG1 6, TA-90/Mac-2 связывающий белок/циклофилин C-ассоциированный белок, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, GPC3, MUC16, TAG-72, LMP1, EBMA-1, BARF-1, CS1, CD319, HER1, B7H6, L1CAM, IL6 и MET.

Трансмембранный домен (TD) соединяет эктодомен (т.е. внеклеточный домен) с эндодоменом (т.е. внутриклеточным доменом) и находится внутри клеточной мембраны при экспрессии клеткой. Трансмембранный домен может быть получен из природного или синтетического источника. Если источник является природным, то домен может происходить из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Например, трансмембранная область может происходить из (т.е. содержать, по меньшей мере, трансмембранную область(и)) альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8 (например, CD8 альфа, CD8 бета), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R бета, IL2R гамма, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7 , TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR и PAG/Cbp. Альтернативно трансмембранный домен может быть синтетическим, и в этом случае он будет содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как остатки лейцина и валина. В некоторых вариантах осуществления триплет из фенилаланина, триптофана и валина будет находиться на каждом конце синтетического трансмембранного домена. Короткий олиго- или полипептидный линкер, например, длиной от 2 до 10 аминокислот, может образовывать связь между трансмембранным доменом и эндоплазматическим доменом CAR.

Эндодомен передает сигнал активации иммунной эффекторной клетке после распознавания антигена, активируя, по меньшей мере, одну из нормальных эффекторных функций указанной иммунной эффекторной клетки. В некоторых вариантах осуществления эффекторная функция Т-клетки, например, может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Обычно эндодомен может содержать внутриклеточный сигнальный домен (ISD) и, необязательно, костимулирующую сигнальную область (CSR). Эндодомен может включать ISD Т-клеточного рецептора (TCR) и необязательные корецепторы. Несмотря на то, что можно использовать полный внутриклеточный сигнальный домен, нет необходимости использовать всю цепь. В той степени, в которой используется усеченный фрагмент внутриклеточного сигнального домена, такой усеченный фрагмент может использоваться вместо интактной цепи, при условии, что он передает сигнал эффекторной функции. «Сигнальный домен (SD)», такой как ISD, обычно содержит цитоплазматические сигнальные последовательности, которые регулируют первичную активацию комплекса TCR, которые функционируют стимулирующим образом и состоят из сигнальных мотивов, которые известны как тирозин-содержащие мотивы активации иммунорецепторов (ITAM). При фосфорилировании ITAM сигнальный каскад активируется. Термин «костимулирующая сигнальная область (CSR)» относится к внутриклеточным сигнальным доменам костимулирующих белковых рецепторов, таких как CD28, 41BB и ICOS, которые способны усиливать активацию Т-клеток рецепторами Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления эндодомен содержит SD или CSR, но не оба вместе. В этих вариантах осуществления иммунная эффекторная клетка, содержащая описанный CAR, активируется только в том случае, если другой CAR (или Т-клеточный рецептор), содержащий отсутствующий домен, также связывается с его соответствующим антигеном. Примеры ITAM-содержащих цитоплазматических сигнальных последовательностей включают последовательности, полученные из CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, CD32 (Fc gamma RIIa), DAP10, DAP12, CD79a, CD79b, FcγRIγ, FcγRIIIγ, FcεRIβ (FCERIB) и FcεRIγ (FCERIG).

В конкретных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен происходит из CD3 дзета (CD3ζ) (TCR zeta, идентификационный номер в GenBank BAG36664.1). Дзета-цепь CD3 (CD3ζ) гликопротеина Т-клеточной поверхности, также известная как дзета-цепь Т-клеточного рецептора или CD247 (кластер дифференцировки 247), представляет собой белок, который у человека кодируется геном CD247. Внутриклеточные хвосты молекул CD3 содержат один ITAM, который важен для сигнальной активности TCR. Внутриклеточный хвост ζ-цепи (CD3ζ) содержит 3 ITAM. В некоторых вариантах осуществления ζ-цепь представляет собой мутантную ζ-цепь. Например, мутантная ζ-цепь содержит мутацию, такую как точечная мутация, по меньшей мере в одном ITAM, чтобы сделать указанный ITAM нефункциональным. В некоторых таких вариантах осуществления либо проксимальный к мембране ITAM (ITAM1), либо дистальный к мембране ITAM (C-концевой третий ITAM, ITAM3), либо оба являются нефункциональными. В дополнительных вариантах осуществления либо два проксимальных к мембране ITAMS (ITAM1 и ITAM2), либо два дистальных к мембране ITAMS (ITAM2 и ITAM3) являются нефункциональными. В еще одних вариантах осуществления не функционирует только ITAM2. В некоторых вариантах осуществления мутантная ζ-цепь содержит делеционную мутацию (например, усечение), так что по меньшей мере один ITAM отсутствует. В некоторых таких вариантах осуществления ζ-цепь отсутствует в проксимальном к мембране ITAM (ITAM1), дистальном к мембране ITAM (ITAM3), или обоих. В еще одних вариантах осуществления ζ-цепь отсутствует в двух проксимальных к мембране ITAMS (ITAM1 и ITAM2) или в двух дистальных к мембране ITAMS (ITAM2 и ITAM3). В дополнительных вариантах осуществления ζ-цепь отсутствует в ITAM2. Способы получения мутантного CD3ζ известны специалистам в данной области (Bridgeman J.S. et al., Clin. Exp. Immunol., 2014 Feb; 175 (2): 258-67 и WO2019/133969, которые включены здесь посредством ссылки). Удаление, по меньшей мере, одного ITAM из введенного CAR может привести к снижению CD3-опосредованного апоптоза. В качестве альтернативы удаление, по меньшей мере, одного ITAM из введенного CAR может уменьшить его размер без потери функции.

В некоторых вариантах осуществления CAR содержит шарнирную последовательность. Шарнирная последовательность представляет собой короткую последовательность аминокислот, которая способствует гибкости антитела (см., например, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4 (2): 89-99 (2004)). Шарнирная последовательность может располагаться между фрагментом распознавания антигена (например, анти-CD19, анти-CD20, анти-CD22 или анти-CLEC4 scFv) и трансмембранным доменом. Шарнирная последовательность может быть любой подходящей последовательностью, происходящей или полученной из любой подходящей молекулы. В некоторых вариантах осуществления, например, шарнирная последовательность происходит от молекулы CD8a или молекулы CD28.

В предпочтительных вариантах осуществления раскрытый CAR определяется формулой:

SP-TD-HG-TM-CSR-SD; или

SP-TD-HG-TM-SD-CSR;

где “SP” представляет необязательный сигнальный пептид,

где “TD” представляет нацеливающий домен,

где “HG” представляет необязательный шарнирный домен (спейсерный домен),

где “TM” представляет трансмембранный домен,

где “CSR” представляет один или более костимулирующих сигнальных областей,

где “SD” представляет сигнальный домен, и

где “-” представляет пептидную связь или линкер.

В некоторых вариантах осуществления CAR содержит один сигнальный домен. В других вариантах осуществления CAR содержит один или более сигнальных доменов (включая костимулирующий сигнальный домен). Один или более сигнальных доменов могут представлять собой полипептиды, выбранные из: CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, FcγRI-γ, FcγRIII-γ, FcεRIβ, FcεRIγ, DAP10, DAP12, CD32, CD79a, CD79b, CD28, CD3C, CD4, b2c, CD137 (41BB), ICOS, CD27, CD28δ, CD80, NKp30, OX40 и их мутанты. Например, эндодомен CAR может быть сконструирован таким образом, чтобы включать сигнальный домен CD3ζ сам по себе или в сочетании с любым другим желаемым цитоплазматическим доменом(ами), пригодными в контексте CAR по настоящему изобретению. Альтернативно, цитоплазматический домен CAR может включать участок цепи CD3ζ и костимулирующую сигнальную область. Костимулирующая сигнальная область относится к участку CAR, содержащему внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенного рецептора или его лигандов, которая необходима для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, антиген-1, ассоциированный с функцией лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 и лиганд, который специфически связывается с CD83, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, BTNL3, NKG2D и их мутанты. Таким образом, несмотря на то, что CAR представлен в основном с CD28 в качестве костимулирующего сигнального элемента, другие костимулирующие элементы и их мутанты могут использоваться самостоятельно или в комбинации с другими костимулирующими сигнальными элементами. Например, в некоторых таких вариантах осуществления предпочтительным костимулирующим сигнальным доменом CAR является мутантный домен CD28, известный как «Mut06», как описано в WO2019/010383.

В некоторых вариантах осуществления CAR имеет более одного трансмембранного домена, который может представлять собой повтор одного и того же трансмембранного домена или может быть другим трансмембранным доменом.

В некоторых вариантах осуществления CAR представляет собой мультицепочечный CAR, описанный в WO2015/039523, которая включена здесь посредством ссылки. Мультицепочечный CAR может включать отдельные внеклеточные домены связывания лиганда и сигнальные домены в различных трансмембранных полипептидах. Сигнальные домены можно сконструировать таким образом, чтобы собираться в соседнем положении мембраны, что формирует гибкую структуру, близкую к естественным рецепторам, обеспечивая оптимальную передачу сигнала. Например, мультицепочечный CAR может включать участок альфа-цепи FCERI и участок бета-цепи FCERI, так что цепи FCERI спонтанно димеризуются вместе с образованием CAR.

Дополнительные конструкции CAR описаны, например, в публикации Fresnak A.D. et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy, Nat. Rev. Cancer, 2016 Aug 23;16(9):566-81, которая в полном объеме включена здесь посредством ссылки для пояснения таких моделей CAR.

В определенных вариантах осуществления CAR может быть, например (и без ограничения), TRUCK, универсальный CAR, самонаправленные CAR, armored CAR, самоинактивирующийся CAR, кондиционный CAR, маркированный CAR, TanCAR, двойной CAR или sCAR.

TRUCK (Т-клетки перенаправленные для универсального цитокин-опосредованного уничтожения) коэкспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR) и противоопухолевый цитокин. Экспрессия цитокинов может быть конститутивной или индуцированной активацией Т-клеток. Нацеленная специфичностью CAR, локализованная продукция провоспалительных цитокинов привлекает эндогенные иммунные клетки к участкам опухоли и может усиливать противоопухолевый ответ.

Универсальные аллогенные CAR Т-клетки сконструированы таким образом, чтобы не экспрессировать длительно эндогенный Т-клеточный рецептор (TCR) и/или молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC), тем самым предупреждая развитие синдрома «трансплантат против хозяина» (GVHD) или отторжение, соответственно.

Самонаправленные CAR коэкспрессируют CAR и хемокиновый рецептор, который связывается с опухолевым лигандом, тем самым усиливая хоминг к опухолям.

В некоторых аспектах в изобретении, раскрытом здесь, используется стратегии ингибирования/блокирования иммунных контрольных точек. Терапия с использованием иммунных контрольных точек нацелена на ключевые регуляторы иммунной системы, которые либо стимулируют, либо подавляют иммунный ответ. Такие иммунные контрольные точки можно использовать при болезненном состоянии (например, при опухолях), чтобы избежать атак иммунной системы. Результаты исследования ингибиторов контрольных точек показали активность терапии ингибиторами PD-1 (El-Khoueiry, Sangro et al., 2017), и FDA разрешило к применению ниволумаб для лечения HCC второй линии с частотой объективного ответа 20%. CAR T-клетки, сконструированные для обеспечения устойчивости к иммуносупрессии (armored CAR), могут быть генетически модифицированы, чтобы более не экспрессировать различные молекулы иммунных контрольных точек (например, цитотоксический T-лимфоцит-ассоциированный антиген 4 (CTLA4) или белок запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1)). Примеры методов «нокдауна» и «нокаута» включают, не ограничиваясь этим, РНК-интерференцию (RNAi) (например, asRNA, miRNA, shRNA, siRNA и т.д.) и CRISPR-интерференцию (CRISPRi) (например, CRISPR-Cas9). В некоторых вариантах осуществления CAR T-клетки сконструированы для экспрессии доминантно-негативной формы молекулы контрольной точки. В некоторых таких вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен (т.е. эктодомен) молекулы иммунной контрольной точки сливается с трансмембранным рецептором мембраны, чтобы конкурировать за связывание лиганда. Например, внеклеточный лиганд-связывающий домен PD-1 может быть слит с трансмембранным доменом CD8, таким образом, конкурируя за лиганд PD-1 из клетки-мишени. В некоторых вариантах осуществления CAR T-клетки сконструированы для экспрессии рецептора переключения иммунных контрольных точек для использования ингибирующего лиганда иммунных контрольных точек, присутствующего на клетке-мишени. В таких вариантах осуществления внеклеточный лиганд-связывающий домен молекулы иммунной контрольной точки слит с сигнальным, стимулирующим и/ или костимулирующим доменом. Например, внеклеточный лиганд-связывающий домен PD-1 может быть слит с доменом CD28, тем самым обеспечивая костимуляцию CD28 при блокировании передачи сигнала PD-1. В дополнительных вариантах осуществления CAR-T-клетки можно вводить с аптамером или моноклональным антителом, которое блокирует сигнальный путь иммунных контрольных точек. В некоторых таких вариантах осуществления CAR-T-клетки (например, терапия CAR T-клетками) комбинируют с методом блокирования PD-1, таким как введение с антагонистическими аптаперами PD-1/PD-L1 или анти-PD-1/PD-L1 антитела. В предпочтительных вариантах осуществления CAR T-клетки и антитела, блокирующие путь PD-1, вводят одновременно. В дополнительных вариантах осуществления CAR-T-клетки сконструированы для экспрессии или секреции антитела, блокирующего иммунные контрольные точки, такого как анти-PD-1 или анти-PD-L1, или их фрагментов. В еще дополнительных вариантах осуществления CAR T-клетки вводят с вектором (например, сконструированным вирусным вектором), который экспрессирует молекулу, блокирующую иммунные контрольные точки, описанную здесь.

Самоинактивирующийся CAR может быть сконструирован с использованием РНК, доставленной электропорацией для кодирования CAR. Альтернативно, индуцируемый апоптоз Т-клетки может быть достигнут на основе связывания ганцикловира с тимидинкиназой в ген-модифицированных лимфоцитах или недавно описанной системы активации человеческой каспазы 9 с помощью низкомолекулярного димеризатора.

Кондиционная CAR-Т-клетка по умолчанию не отвечает или выключена до тех пор, пока не будет добавлена небольшая молекула для завершения «цепи» (например, молекулярного пути), что обеспечивает полную трансдукцию как сигнала 1, так и сигнала 2, тем самым активируя CAR-Т-клетку. Альтернативно, Т-клетки могут быть сконструированы для экспрессии адаптор-специфического рецептора с аффинностью к вторичным антителам, направленным на антиген-мишень, которые вводят позднее.

Маркированные CAR-Т-клетки экспрессируют CAR плюс опухолевый эпитоп, с которым связывается имеющееся моноклональное антитело. В условиях тяжелых побочных эффектов введение моноклональных антител приводит к клиренсу CAR-Т-клетки, и снижает эффекты, не связанные с лечением опухолей.

Тандемная CAR-Т-клетка (TanCAR) экспрессирует один CAR, состоящий из двух связанных одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), которые имеют разную аффинность, слитые с внутриклеточным костимулирующим доменом(ами) и доменом CD3ζ. Активация TanCAR Т-клеток достигается только тогда, когда клетки-мишени коэкспрессируют обе мишени.

Двойная CAR-Т-клетка экспрессирует два отдельных CAR с разными мишенями связывания лиганда. В качестве неограничивающего примера, один CAR может включать только домен CD3ζ, в то время как другой CAR включает только костимулирующий домен(ы). В некоторых таких вариантах осуществления двойная CAR-Т-клетка активируется, когда обе мишени экспрессируются в опухоли.

Безопасный CAR (sCAR) состоит из внеклеточного scFv, слитого с внутриклеточным ингибиторным доменом. sCAR Т-клетки, коэкспрессирующие стандартный CAR, активируются только при встрече с клетками-мишенями, которые обладают стандартной мишенью CAR, но не имеют мишени sCAR.

Также настоящее изобретение относится к полинуклеотидам и полинуклеотидным векторам, кодирующим раскрытые мишень-специфические CAR, которые обеспечивают экспрессию указанных CAR в раскрытых иммунных эффекторных клетках (например, Т-клетках).

Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие раскрытые CAR и их области, можно получить с использованием рекомбинантных методов, известных в данной области, например, таких как скрининг библиотек клеток, экспрессирующих ген, получением гена из вектора, о котором известно, что он включает его, или непосредственным выделением из клеток и тканей, содержащих его, с использованием стандартных методик. Альтернативно, ген, представляющий интерес, можно получить синтетически, и не клонировать.

Экспрессия нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, обычно достигается функциональным связыванием нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид CAR, с промотором и включением конструкции в экспрессионный вектор. Типичные клонирующие векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, инициирующие последовательности и промоторы, пригодные для регуляции экспрессии желаемой последовательности нуклеиновой кислоты.

Раскрытую нуклеиновую кислоту можно клонировать в ряд векторов различных типов. Например, нуклеиновая кислота может быть клонирована в вектор, включая, не ограничиваясь этим, плазмиду, фагмиду, производное фага, вирус животного и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают векторы экспрессии, векторы репликации, векторы генерации зондов и векторы секвенирования.

Кроме того, экспрессионный вектор может быть обеспечен в клетке в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна в данной области и описана, например, в Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), а также в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые можно использовать в качестве векторов, включают, не ограничиваясь этим, ретровирусы (например, гамма-ретровирус), аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. Как правило, подходящий вектор содержит ориджин репликации, функционирующий, по меньшей мере, в одном организме, промоторную последовательность, подходящие сайты рестрикционных эндонуклеаз и один или более селектируемых маркеров. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные векторы представляют собой лентивирусные или ретровирусные векторы. Предпочтительно полинуклеотидные векторы представляют собой гамма-ретровирусные векторы.

Для переноса генов в клетки млекопитающих был разработан ряд вирусных систем. Например, ретровирусы обеспечивают удобную платформу для систем доставки генов. Выбранный ген можно вставить в вектор и упаковать в ретровирусные частицы с использованием методов, известных в данной области. Затем рекомбинантный вирус можно выделить и доставить в клетки субъекта либо in vivo, либо ex vivo.

Одним примером подходящего промотора является последовательность промотора немедленно-ранних генов цитомегаловируса (CMV). Данная промоторная последовательность представляет собой последовательность конститутивного сильного промотора, способного обеспечивать высокие уровни экспрессии любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ним. Другим примером подходящего промотора является промотор фактора роста элонгации-1α (EF-1α). Однако также можно использовать другие конститутивные промоторные последовательности, включая, помимо прочего, ранний промотор обезьяньего вируса 40 (SV40), промотор MND (вируса миелопролиферативной саркомы), промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промотор длинного концевого повтора (LTR), промотор MoMuLV, промотор вируса лейкоза птиц, немедленно-ранний промотор вируса Эпштейна-Барра, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы генов человека, такие как, помимо прочего, промотор актина, промотор миозина, промотор гемоглобина и промотор креатинкиназы. В качестве альтернативы промотор может представлять собой индуцибельный промотор. Примеры индуцибельных промоторов включают, не ограничиваясь этим, промотор металлотионеина, промотор глюкокортикоида, промотор прогестерона и промотор тетрациклина.

Дополнительные промоторные элементы, например энхансеры, регулируют частоту инициации транскрипции. Обычно они располагаются в области 30-110 п.н. выше стартового сайта, хотя недавно было показано, что ряд промоторов также содержат функциональные элементы ниже стартового сайта. Расстояние между элементами промотора часто бывает гибким, так что функция промотора сохраняется, когда элементы инвертируются или перемещаются относительно друг друга.

Репортерные гены используются для идентификации потенциально трансфектированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. В общем, репортерный ген представляет собой ген, который отсутствует или не экспрессируется в организме или ткани реципиента и который кодирует полипептид, экспрессия которого проявляется некоторым легко обнаруживаемым свойством, например ферментативной активностью. Экспрессию репортерного гена анализируют в соответствующее время после того, как ДНК была введена в клетки-реципиенты. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу или ген зеленого флуоресцентного белка. Подходящие экспрессионные системы хорошо известны и могут быть получены с использованием известных методик или приобретены коммерчески. Как правило, конструкция с минимальной 5'-фланкирующей областью, показывающей наивысший уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируется в качестве промотора. Такие промоторные области могут быть связаны с репортерным геном и использоваться для оценки способности агентов модулировать регулируемую промотором транскрипцию.

Способы введения и экспрессии генов в клетке известны в данной области. В контексте экспрессионного вектора, вектор можно легко ввести в клетку-хозяин, например, в клетку млекопитающих, бактерий, дрожжей или насекомых, любым способом, известным в данной области. Например, экспрессионный вектор может быть перенесен в клетку-хозяин с использованием физических, химических или биологических методов.

Физические методы введения полинуклеотида в клетку-хозяин включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и тому подобное. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).

Биологические методы введения полинуклеотида, представляющего интерес, в клетку-хозяин включают использование ДНК- и РНК-векторов. Вирусные векторы, и особенно ретровирусные векторы, стали наиболее широко используемым методом встраивания генов в клетки млекопитающих, например, в клетки человека.

Химические методы введения полинуклеотида в клетку-хозяин включают коллоидные дисперсионные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, шарики и системы на основе липидов, включая эмульсии масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Типичной коллоидной системой для использования в качестве средства доставки in vitro и in vivo является липосома (например, искусственная мембранная везикула).

В случае использования невирусной системы доставки типичным средством доставки является липосома. В еще одном аспекте нуклеиновая кислота может быть связана с липидом. Нуклеиновую кислоту, связанную с липидом, можно инкапсулировать во внутреннем водном пространстве липосомы, встроить в липидный бислой липосомы, присоединить к липосоме через связывающую молекулу, которая связана как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, включенным в липосому, или комплексовать с липосомой, диспергировать в растворе, содержащем липид, смешать с липидом, объединить с липидом, включить в виде суспензии в липид, включить или комплексовать с мицеллой или иным образом связать с липидом. Композиции, связанные с липидом, липидом/ДНК или липидом/экспрессионным вектором, не ограничиваются какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, они могут находиться в бислойной структуре, в виде мицелл или с «сжатой» структурой. Они также могут быть просто введены в раствор, возможно, образуя агрегаты неоднородного размера или формы. Липиды представляют собой жирные вещества, которые могут быть природными или синтетическими липидами. Например, липиды включают жировые капли, которые естественным образом встречаются в цитоплазме, а также группу соединений, которые содержат длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды. Липиды, подходящие для использования, можно получить из коммерческих источников. Например, димиристилфосфатидилхолин («DMPC») можно получить от Sigma, St. Louis, Mo; дицетилфосфат («DCP») можно получить от K&K Laboratories (Plainview, N.Y.); холестерин («Choi») можно получить от Calbiochem-Behring; димиристилфосфатидилглицерин («DMPG») и другие липиды могут быть получены от Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.).

Селекция

Для оценки экспрессии CAR полипептида или его фрагментов, экспрессионный вектор, предназначенный для введения в клетку (например, антигенспецифическую Т-клетку), также может содержать селектируемый маркерный ген или репортерный ген, или оба, для обеспечения идентификации и селекции экспрессирующих клеток из популяции клеток, которые должны быть трансфектированы или инфицированы вирусными векторами. В других вариантах осуществления селектируемый маркер может находиться на отдельном участке ДНК и использоваться в процедуре котрансфекции. Как селектируемые маркеры, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках-хозяевах. В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий CAR, включает лентивирусный вектор. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления CAR-кодирующий вектор включает гамма-ретровирусный вектор. Наиболее предпочтительно, чтобы CAR-кодирующий вектор содержал последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селектируемый маркер или физическую метку, которая позволяет отбирать только те клетки, которые экспрессируют CAR, кодированный указанным вектором. Подходящие селектируемые маркеры включают, не ограничиваясь этим, гены устойчивости к антибиотикам, репортерные гены или экспрессию физической метки. Физические метки могут включать, не ограничиваясь этим, усеченные пептиды клеточной поверхности (например, рецептор клеточной поверхности, у которого отсутствуют внутриклеточные сигнальные домены) и могут быть селектированы с помощью подходящего антитела с использованием методов, известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления вектор, кодирующий CAR, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген устойчивости к антибиотикам, такой как устойчивость к бластицидину. В некоторых таких вариантах осуществления CAR-T-клетки (например, антигенспецифические CAR-T-клетки) культивируют в присутствии селектируемого маркера (например, бластицидина), тем самым обеспечивая селекцию и экспансию CAR-экспрессирующих T-клеток, описанных здесь.

Терапевтические способы

В некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, направлены на лечение рака и/или аутоиммунного расстройства у субъекта введением субъекту аутологичных или аллогенных CAR-T-клеток, обеспеченных здесь.

Способы по настоящему изобретению частично основываются на принципах ограничения и сведения Т-клеток к специфическим антигенам-мишеням. Например, и без ограничения, продукты и препараты, содержащие CTL, полученные от доноров, нацеленные против антигенов, экспрессированных вирусом, таким как вирус Эпштейна-Барра (EBV), могут быть индуцированы на целевых антигенпрезентирующих клеточных линиях (например, стимуляторах), включая EBV-трансформированные B-лимфобласты (BLCL). В отношении раскрытых вирусных антигенспецифических CAR Т-клеточных препаратов (например, анти-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL), то клетки-мишени и/или реципиенты продуктов CAR-T, полученные способами, представленными здесь, могут быть аутологичными или аллогенными. В случае аллогенных мишеней должна быть известна идентичность человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) донора и совпадать с HLA идентичностью мишени (т.е. культивированных клеточных линий и/или реципиентов).

CAR Т-клеточный препарат может содержать смесь антигенспецифических и неспецифических CTL. Таким образом, для количественной оценки аллореактивных CTL (например, антигенспецифических CTL с CAR или без него) индуцируется реакция против HLA-совпадающих мишеней. В идеале лизис клеток должен быть минимальным или ниже заранее определенного порога. Кроме того, уровень экспандированных CTL или CAR-экспрессирующих CTL можно определить количественным методом предельных разведений и разведения цитотоксичности против аллогенных мишеней.

Клетки-мишени для тестов, описанных здесь, обычно выбирают по их однородному фенотипу и доступности в больших количествах. В некоторых вариантах осуществления линии клеток-мишеней представляют собой антигенпрезентирующие клетки (APC). В некоторых таких вариантах осуществления линии клеток-мишеней представляют собой В-клетки, антигенпрезентирующие Т-клетки, дендритные клетки или искусственные антигенпрезентирующие клетки (например, клетки aK562). В некоторых вариантах осуществления линии клеток-мишеней включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC). В некоторых таких вариантах осуществления линии клеток-мишеней представляют собой лимфобласты. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления линии клеток-мишеней подвергаются трансформации вирусами. В предпочтительных вариантах осуществления линии клеток-мишеней включают любую из линий лимфоцитов периферической крови, стимулированных фитогемагглютинином (PHA-бласты/PHAb), и лимфобластоидных B-клеток, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (BLCL). Как показано здесь в качестве примера, для оценки CAR-экспрессирующих антигенспецифических CTL, BLCL имеют то преимущество, что являются более крупными клетками с высокой жизнеспособностью и способностью сохранять значительные запасы лактатдегидрогеназы (LDH) и/или большие внутриклеточные запасы хрома (Cr), что делает их подходящими для оценки цитотоксичности с помощью анализов высвобождения Cr или LDH. Однако в случае EBV антигена BLCL (например, которые используются в качестве APC) являются антиген-положительными по отношению к EBV, что обеспечивает антигенспецифическую перекрестную презентацию EBV Т-клеточным рецепторам (TCR), специфичные для HLA-несовпадающих аллелей. Преимущество PHA-бластов состоит в том, что они являются отрицательными по EBV антигену и не могут перекрестно презентовать EBV антигены для TCR. Тем не менее, PHA-бласты меньше по размеру и, как правило, являются более хрупкими клетками. Это приводит к уменьшению запасов и проницаемости репортера, что в конечном итоге обеспечивает более высокую вероятность ложноположительных результатов при оценке цитотоксичности. Таким образом, BLCL и PHA-бласты могут использоваться в качестве целевых пар, полученных от одного и того же донора. В некоторых таких вариантах осуществления клетки-мишени происходят от потенциального реципиента препарата аллогенных CAR-Т-клеток, описанного здесь, чтобы направлять соответствующий выбор препарата CAR T-клеток для введения.

В некоторых вариантах осуществления, если препарат индуцирует лизис во многих линиях клеток-мишеней выше заранее определенного порога, то способ дополнительно включает количественное определение в препарате частоты экспандированных CAR-T CTL, способных лизировать линию клеток-мишеней, где образец идентифицируется как не являющийся клинически аллореактивным, если он содержит уровень экспандированных CAR-T CTL, который находится на заранее определенном пороговом уровне или ниже. В некоторых вариантах осуществления перед количественным определением частоты цитолитических экспандированных CTL CAR-T препарат индуцирует более чем 15% лизис в каждой из аллогенной клеточной линии PHA-бластов и линии аллогенных клеток.

В некоторых вариантах осуществления изобретения количественная оценка частоты увеличения CTL CAR-T в препарате включает оценку цитолитической функции после периода экспансии CTL CAR-T, например, проведением метода предельных разведений. В дополнительных вариантах осуществления оценка цитолитической функции включает выполнение метода детектирования, такого как высвобождение радиоактивного хрома (например, ⁵¹Cr) или высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH).

В некоторых вариантах осуществления линии клеток-мишеней содержат аллогенные клетки. В некоторых таких вариантах осуществления клетки-мишени несут аллели лейкоцитарного антигена человека (HLA), которые не совместимы с аллелями HLA, которыми ограничены CAR-T CTL препарата. В других таких вариантах осуществления клетки-мишени несут аллели HLA, которые частично совместимы с аллелями HLA, которыми ограничены CAR-T CTL препарата. В еще одних таких вариантах осуществления клетки-мишени несут аллели HLA, которые совместимы с аллелями HLA, которыми ограничены CAR-T CTL препарата. В предпочтительных вариантах осуществления CTL CAR-T ограничены аллелями HLA клеток-мишеней, которые кодируют белки MHC класса I.

В еще одних вариантах осуществления линии клеток-мишеней содержат аутологичные клетки. В некоторых таких вариантах осуществления препарат CAR-T CTL идентифицируется как подходящий для использования против клеток-мишеней подтверждением способности препарата лизировать две или более аутологичных клеточных линий-мишеней на, выше или ниже заранее определенных пороговых значений.

В некоторых вариантах осуществления аутологичные или аллогенные CAR-T-клетки содержат Т-клетки центральной памяти (Tcm-клетки), например, по меньшей мере, 60%, 70%, 80% клеток являются Tcm-клетками. В некоторых вариантах осуществления аутологичные или аллогенные CAR-T-клетки имеют соотношение Т-клеток центральной памяти и эффекторных клеток памяти (Tcm: Tem), по меньшей мере, от 1:1 до, по меньшей мере, 3:1, например, по меньшей мере, 1:1, 1,4:1, 2,5:1 или 3:1). В некоторых таких вариантах осуществления аутологичные или аллогенные CAR-T-клетки представляют собой преимущественно CD4⁺ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления аутологичные или аллогенные CAR-T-клетки содержат, по меньшей мере, 80% CD4⁺ CAR-T-клеток и, по меньшей мере, 15% CD8⁺ CAR-T-клеток). В некоторых вариантах осуществления аутологичные или аллогенные CAR-T-клетки имеют соотношение CD4⁺ T-клеток к CD8⁺ T-клеткам, по меньшей мере, от 1:1 до, по меньшей мере, 3:1, например, по меньшей мере, 1:1, 1,4:1, 2,5:1 или 3:1. В некоторых способах, описанных здесь, аллогенные Т-клетки выбирают из банка клеток (например, предварительно созданного стороннего донорного банка эпитоп-специфических Т-клеток).

В некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, можно использовать для лечения любого аутоиммунного заболевания. Примеры аутоиммунных заболеваний включают, например, гломерулярный нефрит, артрит, заболевание, подобное дилатационной кардиомиопатии, язвенный колит, синдром Шегрена, болезнь Крона, системные эритематозы, хронический ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, болезнь Стилла, рассеянный склероз, псориаз, аллергический контактный дерматит, полимиозит, пахидермию, узелковый периартериит, ревматическую лихорадку, вульгарное витилиго, болезнь Бехчета, болезнь Хашимото, болезнь Аддисона, дерматомиозит, миастению гравис, синдром Рейтера, болезнь Грейвса, пернициозную анемию, бесплодие, пемфигус, аутоиммунную тромбопеническую пурпуру, аутоиммунную гемолитическую анемию, активный хронический гепатит, болезнь Аддисона, антифосфолипидный синдром, атопическую аллергию, аутоиммунный атрофический гастрит, аутоиммунную ахлоргидрию, целиакию, синдром Кушинга, дерматомиозит, дискоидную красную волчанку, синдром Гудпасчера, тиреоидит Хашимото, идиопатическую атрофию коры надпочечников, идиопатическую тромбоцитопению, инсульт-зависимый сахарный диабет, синдром Ламберта-Итона, волчаночный гепатит, лимфопению, смешанное заболевание соединительной ткани, пемфигоид, вульгарную пузырчатку, пернициозную анемию, факогенный увеит, узелковый полиартериит, полигландулярные аутосиндромы, первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, синдром Рейно, рецидивирующий полихондрит, синдром Шмидта, ограниченную склеродермию (или синдром гребня), симпатическую офтальмию, системную красную волчанку, артериит Такаясу, височный артериит, тиреотоксикоз, инсулинорезистентность типа B, диабет I типа, язвенный колит и гранулематоз Вегенера.

В некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, используются для лечения рассеянного склероза. В некоторых вариантах осуществления MS представляет собой рецидивирующий-ремиттирующий MS, вторичный прогрессирующий MS, первичный прогрессирующий MS или прогрессивно-рецидивирующий MS.

В некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, используются для лечения SAD. Например, в некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, используются для лечения ревматоидного артрита, системной красной волчанки и/или синдрома Шегрена.

В некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, используются для лечения IBD. Например, в некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, используются для лечения болезни Крона (региональное заболевание кишечника, например, неактивные и активные формы), целиакии (например, неактивные или активные формы) и/или язвенного колита например, неактивные и активные формы). В некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, используются для лечения синдрома раздраженного кишечника, микроскопического колита, лимфоцитарно-плазмоцитарного энтерита, целиакии, коллагенозного колита, лимфоцитарного колита, эозинофильного энтероколита, неопределенного колита, инфекционного колита (вызванного вирусами, бактериями или простейшими, например амебный колит) (например, колита, вызванного Clostridium dificile), псевдомембранозного колита (некротического колита), ишемического воспалительного заболевания кишечника, болезни Бехчета, саркоидоза, склеродермии, дисплазии, ассоциированной с IBD, дисплазии, ассоциированной с массами или поражениями, и/или первичного склерозирующего холангита.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения рака у субъекта введением субъекту терапевтического препарата на основе CAR-T-клеток, как здесь описано.

В некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, можно использовать для лечения любого типа рака. Например, в некоторых вариантах осуществления способы и CAR-T-клетки, описанные здесь, можно использовать для лечения любой злокачественной или предзлокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления рак включает солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления раковые заболевания, которые можно лечить способами и композициями, обеспеченными здесь, включают, не ограничиваясь этим, раковые клетки из мочевого пузыря, крови, кости, костного мозга, головного мозга, молочной железы, толстого кишечника, пищевода, желудочно-кишечного тракта, десен, головы, почки, печени, легких, носоглотки, шеи, яичника, предстательной железы, кожи, желудка, яичка, языка или матки. Кроме того, злокачественная опухоль, в частности, может относиться к следующему гистологическому типу, включая, без ограничения: новообразование, злокачественное; карциному; карциному недифференцированную; гигантоклеточную и веретено-клеточную карциному; мелкоклеточную карциному; папиллярную карциному; плоскоклеточную карциному; лимфоэпителиальную карциному; базальноклеточную карциному; пиломатричную карциному; переходно-клеточную карциному; папиллярную переходно-клеточную карциному; аденокарциному; гастриному злокачественную; холангиокарциному; гепатоцеллюлярную карциному; комбинированную гепатоцеллюлярную карциному и холангиокарциному; трабекулярную аденокарциному; аденоидно-кистозную карциному; аденокарциному при аденоматозном полипе; аденокарциному, семейный аденоматозный полипоз; солидную карциному; карциноидную опухоль злокачественную; бронхиолоальвеолярную аденокарциному; папиллярную аденокарциному; хромофобную почечную карциному; ацидофильную карциному; оксифильную аденокарциному; базофильную карциному; светлоклеточную аденокарциному; зернисто-клеточную карциному; фолликулярную аденокарциному; папиллярную и фолликулярную аденокарциному; неинкапсулированную склерозирующую карциному; карциному коры надпочечников; эндометриоидную карциному матки; карциному придатков кожи; апокринную аденокарциному; аденокарциному сальных желез; церуминозную аденокарциному; мукоэпидермоидную карциному; цистаденокарциному; папиллярную цистаденокарциному; папиллярную серозную цистаденокарциному; муцинозную цистаденокарциному; муцинозную аденокарциному; перстневидно-клеточную карциному; инфильтрирующую протоковую карциному; медуллярную карциному; дольковую карциному; воспалительную карциному; болезнь Педжета молочной железы; ацинарно-клеточную карциному; аденосквамозную карциному; аденокарциному с плоскоклеточной метаплазией; злокачественную тимому; злокачественную стромальную опухоль яичника; злокачественную текому; злокачественную гранулезно-клеточную опухоль и злокачественную робластому; карциному из клеток Сертоли; злокачественную опухоль из клеток Лейдига; злокачественную липидоклеточную опухоль; злокачественную параганглиому; злокачественную экстра-молочная параганглиому; феохромоцитому; гломангиосаркому; злокачественную меланому; амеланотическую меланому; поверхностно-распространяющуюся меланому; злокачественную меланому в гигантском пигментном невусе; эпителиоидноклеточную меланому; злокачественный голубой невус; саркому; фибросаркому; злокачественную фиброзную гистиоцитому; миксосаркому; липосаркому; лейомиосаркому; рабдомиосаркому; эмбриональную рабдомиосаркому; альвеолярную рабдомиосаркому; стромальную саркому; злокачественную смешанную опухоль; смешанную мюллерову опухоль; нефробластому; гепатобластому; карциносаркому; злокачественную мезенхимому; злокачественная опухоль Бреннера; злокачественную листовидную опухоль; синовиальную саркому; злокачественную мезотелиому; дисгерминому; эмбриональную карциному; злокачественную тератому; злокачественный струму яичника; хориокарциному; злокачественную мезонефрому; гемангиосаркому; злокачественную гемангиоэндотелиому; саркому Капоши; злокачественную гемангиоперицитому; лимфангиосаркому; остеосаркому; юкстакортикальную остеосаркому; хондросаркому; злокачественную хондробластому; мезенхимальную хондросаркому; гигантоклеточную опухоль кости; саркому Юинга; злокачественную одонтогенную опухоль; амелобластную одонтосаркому; злокачественную амелобластому; амелобластную фибросаркому; злокачественную пинеалому; хордому; злокачественную глиому; эпендимому; астроцитому; протоплазматическую астроцитому; фибриллярную астроцитому; астробластому; глиобластому; олигодендроглиому; олигодендробластому; примитивную нейроэктодермальную опухоль; саркому мозжечка; ганглионевробластому; нейробластому; ретинобластому; ольфакторную нейрогенную опухоль; злокачественную менингиому; нейрофибросаркому; злокачественную неврилеммому; злокачественную зернисто-клеточную опухоль; злокачественную лимфому; болезнь Ходжкина; лимфому Ходжкина; парагранулему; злокачественную лимфому из малых лимфоцитов; диффузную крупноклеточную злокачественную лимфому; фолликулярную злокачественную лимфому; грибовидный микоз; другие определенные неходжкинские лимфомы; злокачественный гистиоцитоз; множественную миелому; саркому из тучных клеток; иммунопролиферативное заболевание тонкого кишечника; лейкоз; лимфолейкоз; плазмоклеточный лейкоз; эритролейкоз; лимфосаркому из лейкозных клеток; миелоидный лейкоз; базофильный лейкоз; эозинофильный лейкоз; моноцитарный лейкоз; лейкоз из тучных клеток; мегакариобластный лейкоз; миелоидную саркому; и волосатоклеточный лейкоз. В некоторых таких предпочтительных вариантах осуществления композиции и способы, обеспеченные здесь, могут использоваться для лечения B-клеточных злокачественных новообразований (например, CD19⁺ злокачественных новообразований), включая хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), ALL и многие неходжкинские лимфомы.

В некоторых вариантах осуществления способы, обеспеченные здесь, используются для лечения EBV-ассоциированного рака. В некоторых вариантах осуществления изобретения EBV-ассоциированный рак представляет собой EBV-ассоциированный NPC. В некоторых вариантах осуществления EBV-ассоциированный рак представляет собой посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (PTLD), NK/T-клеточную лимфому, EBV⁺ рак желудка или EBV⁺ лейомиосаркому.

В некоторых вариантах осуществления субъект подвергся воздействию вируса (например, EBV), так что вирусные частицы можно обнаружить в крови субъекта. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает измерение вирусной нагрузки у субъекта (например, до или после введения субъекту пептид-специфических CAR-T-клеток). Определение вирусной нагрузки у субъекта может быть хорошим прогностическим маркером эффективности иммунотерапии. В некоторых вариантах осуществления выбор CAR-T-клеток дополнительно включает определение количества копий вирусной ДНК у субъекта (например, в образце ткани или крови). В некоторых вариантах вирусная нагрузка измеряется два или более раз. Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях, обеспеченных здесь, могут варьироваться, для получения количества активного ингредиента, которое эффективно для достижения желаемого терапевтического ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, не будучи токсичным для пациента.

Выбранный уровень дозировки будет зависеть от множества факторов, включая активность конкретного применяемого средства, путь введения, время введения, скорость выведения или метаболизм конкретного применяемого соединения, продолжительность лечения, применяемые другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретным используемым соединением, возраст, пол, масса тела, состояние, общее состояние здоровья и предшествующая история болезни пациента, которого подвергается лечению, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины.

В некоторых вариантах осуществления способы, описанные здесь, включают селекцию аллогенных Т-клеток из банка клеток (например, предварительно созданного стороннего донорского банка эпитоп-специфичных Т-клеток). В некоторых вариантах осуществления Т-клетки выбираются, поскольку они экспрессируют TCR, ограниченный MHC класса I, который кодируется аллелем HLA, присутствующим у субъекта. В некоторых вариантах осуществления Т-клетки выбираются, если Т-клетки и субъект имеют, по меньшей мере, 2 (например, по меньшей мере, 3, по меньшей мере, 4, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 6) аллелей HLA, и Т-клетки ограничены общим HLA аллелем. В некоторых вариантах осуществления способ включает тестирование репертуара TCR предварительно полученных эпитоп-специфических Т-клеток, полученных от стороннего донора (т.е. аллогенных Т-клеток), с помощью проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления эпитоп-специфические Т-клетки выявляют с использованием тетрамерного анализа, анализа ELISA, анализа вестерн-блоттингом, анализа флуоресцентной микроскопии, анализа деградации Эдмана и/или анализа масс-спектрометрией (например, секвенирования белка). В некоторых вариантах осуществления репертуар TCR анализируется с использованием нуклеиновокислотного зонда, анализа амплификации нуклеиновой кислоты и/или анализа секвенирования.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям (например, терапевтическим композициям), содержащим Т-клетки и/или APC, обеспеченные здесь, используемые для лечения и/или профилактики аутоиммунного заболевания у субъекта введением субъекту эффективного количества композиции. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам лечения аутоиммунных нарушений с использованием композиции (например, фармацевтической композиции, такие композиции, содержащие аллогенные CTL). В некоторых вариантах осуществления композиция включает комбинацию нескольких (например, двух или более) CTL, обеспеченных здесь.

Примеры

Пример 1: сравнение CAR трансдукции EBV CTL, полученных из PBMC, и выделенных Т-клеток

Замороженные РВМС от здоровых доноров размораживали и помещали в среду RPMI. Клетки разделяли на две фракции; 1/3 клеток (стимуляторы) инфицировали аденовирусным вектором AdE1-LMPpoly в течение одного 1 ч при 37°C. Затем стимуляторы дважды промывали и ресуспендировали в культуральной среде RPMI/AB сыворотка и облучали при 2500 сГр (2500 рад). Оставшиеся 2/3 клеток (респондеры) либо переносили в среду RPMI/AB сыворотка и выдерживали при 37°C до тех пор, пока их можно было смешать со стимуляторами (например, BLCL, полученным из PBMC), либо использовали для выделения CD3⁺ T-клеток, которые затем культивировали со стимуляторами из PBMC (см. фиг. 1).

Активация PBMC

На сутки 0 начинали культивирование в 6-луночных (10 см²) планшетах для культивирования GRex при соотношении 9×10⁶ облученных клеток-стимуляторов PBMC к 2,1×10⁷ клеткам-респондерам PBMC и возвращали к инкубации в тканевых культурах при 37°C. Несмотря на то, что это было необязательным, на сутки 9 и 10 проводили истощение клеточных культур в отношении CD56⁺ клеток, NK-клеток (естественных клеток-киллеров) перед трансдукцией.

Активация выделенных CD3+ Т-клеток

На сутки 0 Т-клетки выделяли (т.е. обогащали) из РВМС с использованием методов, известных в данной области (например, живые клетки анализом FACS или магнитные шарики, покрытые анти-CD3). Т-клетки помещали в 6-луночных (10 см²) культуральных планшетах GRex, содержащих среду, включающую 20 Е/мл IL2, при соотношении 1 Т-клетка/4 клетки-стимуляторы PBMC, и возвращали к инкубации в тканевых культурах при 37°C. На сутки 9 и 10 культуры клеток трансдуцировали для экспрессии CAR (как описано выше, истощение NK-клеток было необязательным до трансдукции). Сенсибилизация исходного материала (например, после обогащения CD3⁺) к вирусным антигенам, таким как EBV, приводит к увеличению процента Т-клеток с фенотипом центральной памяти в полученной популяции (см. фиг. 2, слева). Эти Т-клетки центральной памяти преимущественно сохраняются с течением времени, в то время как маркеры истощения Т-клеток (PD1 и CTLA4) остаются низкими в сенсибилизированных к вирусу клетках (фиг. 2 справа).

CAR трансдукция

На сутки 9 и 10 выделенные культуры Т-клеток и РВМС трансдуцировали рекомбинантным вирусом, кодирующим анти-CD19 CAR (и маркер селекции бластицидин). Вкратце, ретронектин (0,5 мл 10 мкг/мл) добавляли в каждую лунку 24-луночного планшета, необработанного тканевой культурой, для каждого условия стимуляции и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем ретронектин удаляли аспирацией, заменяли добавлением 0,5 мл блокирующего буфера в каждую лунку и планшеты инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем планшеты промывали промывочным буфером. Вирус, кодирующий анти-CD19 CAR, размораживали при комнатной температуре и вносили в планшеты. Планшеты обертывали парафиновой пленкой и центрифугировали при 2000g в течение 2 ч при 32°C. Вирус-содержащий супернатант аспирировали и добавляли 1 мл приготовленной клеточной суспензии из каждой группы стимуляции (0,5×10⁶ клеток/мл, ресуспендированных в среде YH5). Планшеты центрифугировали при 1000g в течение 15 мин при 32°C и инкубировали при 37°C, в атмосфере 5% CO₂ в течение ночи. Затем клетки для каждого условия стимуляции удаляли и объединяли для подсчета. Клетки ресуспендировали в свежей среде YH5 при титре 0,5-1,0×10⁶ клеток/мл.

На сутки 11 клетки для каждого условия стимуляции (т.е. выделенные Т-клетки или клетки-респондеры PBMC) возвращали в культуру с клетками-стимуляторами из PBMC. Образцы отбирали на сутки 15, 23 и 27 для сортинга клеток с активированной флуоресценцией (FACS) (например, для клеток CD3⁺, scFV⁺). Селекцию по препарату (бластицидину) индуцировали на сутки 19.

Результаты

EBV-CTL, полученные из выделенных Т-клеток, проявляют повышенную жизнеспособность и пролиферативную способность. Обогащенный CD3⁺ исходный материал имеет более чем 10-кратный выход по сравнению с обычными условиями экспансии и трансдукции, демонстрируя значительно повышенную жизнеспособность и пролиферативную способность (см. фиг. 3). Эффективность трансдукции ниже CAR вектора зависит от пролиферативной способности. Таким образом, более высокая жизнеспособность и пролиферативная способность Т-клеток, стимулированных антигеном, приводит к повышению эффективности последующей CAR трансдукции. При сравнении с трансдукцией в неочищенной культуре PBMC, CAR⁺ EBV CTL, полученные на начальной стадии обогащения CD3⁺, демонстрируют значительное повышение эффективности трансдукции ниже CAR после стимуляции BLCL, и также демонстрируют большую жизнеспособность клеток в ответ на селекцию по бластицидину (см. фиг. 4).

Пример 2: оценка фенотипа Т-клеток памяти на анти-CD19-CAR-EBV-CTL после стимуляции BLCL

Стандартная стимуляция на основе анти-CD3/CD28 шариков широко используется в данной области в качестве метода экспандирования Т-клеток in vitro перед трансдукцией с помощью CAR векторов. Следующий эксперимент проводили для определения влияния различных стимулов CAR-T-клеток, поддающихся высокопроизводительному способу получения, на иммуннофенотип Т-клеток памяти для конечного терапевтического продукта.

Дизайн и процедура исследования

Выделенные CD3⁺ EBV-антигенспецифические Т-клетки стимулировали и экспандировали в 4 различных условиях культивирования в течение 3 суток:

1. без стимуляции,

2. растворимые анти-CD3/CD28,

3. анти-CD3/CD28 магнитные шарики и

4. с клетками BLCL.

После 3 суток стимуляции каждую культуру трансдуцировали вирусным вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR), и возвращали для инкубации в течение 7 суток в стандартной (среда YH) культуре для обеспечения экспансии трансдуцированных Т-клеток. Затем клетки собирали, и фенотипы клеток анализировали окрашиванием клеток и сортингом клеток с активацией флуоресценции (FACS), как показано на фиг. 5.

Клеточные линии и условия культивирования

CD3+ EBV-антигенспецифические Т-клетки извлекали из систем хранения в жидком азоте, размораживали и суспендировали в среде YH с титром 2×10⁶ клеток/мл с 100 МЕ/мл IL-2. Суспензию помещали в 24-луночный планшет из расчета 2 мл суспензии на лунку и инкубировали в течение ночи. После этого восстановления в течение ночи клетки подсчитывали и разделяли на четыре различные группы обработки, как показано на фиг. 5 (см. также таблицу 2), с 6×10⁶ клеток на группу при титре 1×10⁶ клеток/мл.

Таблица 2
Условия стимуляции для оценки фенотипа Т-клеток памяти после стимуляции и CAR трансдукции Номер Условия стимуляции MOI лентивируса 15 1 Без стимуляции 28 2 Без стимуляции 4-1BB 3 CD3/CD28 магнитные шарики (1:1, шарик на клетку) 28 4 CD3/CD28 магнитные шарики (1:1, шарик на клетку) 4-1BB 5 CD3/CD28 ImmunoCult (25 мкл/мл) 28 6 CD3/CD28 ImmunoCult (25 мкл/мл) 4-1BB 7 BLCL 28 8 BLCL 4-1BB 9 BLCL нет

Стимуляцию анти-CD3/CD28 магнитными шариками проводили при соотношении клетки:шарики 1:1. Достаточный объем шариков удаляли и промывали DPBS перед непосредственным добавлением к клеточной суспензии. Соответственно, стимулирующую культуру высевали на 2 мл среды YH5 со 100 МЕ/мл IL-2 на лунку в 24-луночный планшет, как описано выше, и инкубировали в течение 3 суток.

Стимуляцию растворимыми анти-CD3/CD28 проводили непосредственным добавлением реагента CD3/CD28 ImmunoCult™ в концентрации 25 мкл на мл (т.е. 50 мкл на лунку 24-луночного планшета, как описано выше) и инкубировали в течение 3 суток.

Стимуляцию EBV трансформированной линии лимфобластоидных B-клеток (BLCL) проводили при соотношении 1 EBV- антигенспецифическая Т-клетка к 4 BLCL. Вкратце, CD3⁺ EBV-антигенспецифические Т-клетки удаляли из системы хранения в жидком азоте, размораживали, суспендировали в среде YH и давали возможность восстановиться. При подготовке к культивированию для стимуляции EBV-BLCL облучали общей дозой излучения 90 Гр (9000 рад). EBV-BLCL антигенспецифические Т-клетки объединяли в среде YH5 с 100 МЕ/мл IL-2 в том же 24-луночном планшете, как описано выше, и инкубировали в течение 3 суток.

CAR трансдукция

При подготовке к трансдукции 24-луночные планшеты готовили следующим образом: 0,5 мл ретронектина (10 мкг/мл) добавляли в каждую лунку 24-луночного планшета, не обработанного тканевой культурой, и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем ретронектин удаляли и заменяли добавлением 0,5 мл блокирующего буфера и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем удаляли блокирующий буфер и каждую лунку промывали не менее 1 мл промывочного буфера. Планшеты выдерживали в промывочном буфере при 4°C до использования.

Лентивирусный вектор, кодирующий CAR (содержащий домен трансдукции сигнала 4-1BB или CD28), размораживали при комнатной температуре и добавляли в каждую лунку покрытых ретронектином планшетов для достижения MOI (множественности инфекции) или 15 вирусных частиц на клетку (см. таблицу 2). Затем планшеты оборачивали парафиновой пленкой и центрифугировали при 2000 g в течение 2 ч при 32°C, в течение этого времени подсчитывали клетки из каждой группы вида стимуляции и ресуспендировали в среде YH5 с титром 0,5×10⁶ клеток/мл. После центрифугирования вирусный супернатант аспирировали из каждой лунки и заменяли 1 мл приготовленных клеточных суспензий, включая контрольные лунки. Планшеты центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин при 32°C, и затем инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение ночи.

Таблица 3
Реагенты FACS - конъюгированные антитела и красители для оценки жизнеспособности Антитело/реагент Клон Изготовитель Анти-CD3 APC-Cy7 UCHT1 Biolegend CD19-Fc биотин AcroBiosystems Стрептавидин PE eBioscience Анти-CD4 BV421 RPA-T4 BD Biosciences Анти-CD8 APC SK1 Biolegend Живые/Мертвые BV510 Tonbo CD45RA PerCP-Cy5.5 HI100 Biolegend CD45RO PE-Cy7 UCHL1 Biolegend CD62L BB515 DREG-56 BD Biosciences

Клетки из каждой группы вида стимуляции объединяли, подсчитывали и ресуспендировали при титре 0,5-1,0×10⁶ клеток/мл свежей среды YH5 перед возвращением к инкубации при 37°C, 5% CO₂ в течение 2 суток. Объединение и ресуспендирование повторяли каждые 2 суток до суток 7 (сбор клеток). После того, как собранные клетки были помечены (см. таблицу 3), использовали стратегию гейтирования в проточной цитометрии для идентификации CD3, CD4, CD8, CD62L и CD45RO на CAR-экспрессирующих Т-клетках (см. фиг. 6). Вкратце, сигналы клеток, представляющих интерес, сначала идентифицировали по размеру и гранулярности (т. е. прямое рассеяние (FSC) по сравнению с боковым рассеянием (SSC)). Затем идентифицировали живые клетки на основе окрашивания красителем для определения жизнеспособности (например, Live/Dead™ BV510). Затем жизнеспособные отдельные клетки гейтировали на основе зависимости импульс-площадь против импульс-высота (FSC-A против FSC-H). Затем отдельные CD3⁺ Т-клетки и последующие субпопуляции (например, CD4⁺, CD8⁺, Т-клетки центральной памяти) идентифицировали с использованием флуоресцентно меченных антител.

Результаты

Таблица 4
Частота CD62L⁺/CD45RO⁺ на CD19-CAR-T-клетках Культура со стимуляцией Частота CD62L⁺/CD45RO⁺ Частота CD62L^-/CD45RO^- Сигнальный домен 4-1BBz CD28z 4-1BBz CD28z BLCL 61,2% 65,5% 21,9% 19,1% Растворимые
анти-CD3/CD28 36,3% 35,1% 31,8% 29,9% Связанные с шариками анти-CD3/CD28 35,1% 44,9% 45% 45,3% Без стимуляции 25,2% 31,9%

Результаты оценки проточной цитометрией показали, что трансдуцированные CD19-CAR-T-клетки, стимулированные EBV-BLCL, показали более высокий процент субпопуляций Т-клеток центральной памяти при оценке по CD62L⁺/CD45RO⁺ клеткам по сравнению со стимуляцией растворимыми CD3/CD28 или шариками (см. фиг. 7). Клетки CD19-CAR-T, стимулированные растворимыми или связанными с шариками CD3/CD28, имели более высокий процент субпопуляций эффекторных Т-клеток памяти при оценке по CD62L^-/ CD45RO⁺ клеткам по сравнению с клетками, стимулированными BLCL (см. таблицу 4).

Таблица 5
Частота CD4 и CD8 на CD19-CAR-T-клетках (гейтировано по CD3) Стимуляция Частота CD3⁺CD4⁺ Частота CD3⁺CD8⁺ 4-1BBz 28z 4-1BBz 28z BLCL 83,5 83,8 15,6 15,2 CD3/CD28
ImmunoCult 52,8 45,7 43,1 49,3 Связанные с шариками анти-CD3/CD28 29,5 22,3 56,5 53,0 Без стимуляции 54,5 44,1

Экспрессию CD4 и CD8 также оценивали на CD19-CAR-T-клетках. В популяции CD3⁺ CD19-CAR-T-клеток имел место более высокий процент CD4⁺ клеток при стимуляции BLCL по сравнению со стимуляцией CD3/CD28 (см. фиг. 8 и таблицу 5).

Полученные данные демонстрируют, что стимуляция культур CAR-T-клеток с использованием BLCL, экспрессирующих CAR-нацеленные антигены, приводит к сдвигу к преобладающему фенотипу центральной памяти по сравнению с результатами стимуляции CD3/CD28, связанных с шариками или в виде растворимых антител. Результаты данного исследования убедительно подтверждают потенциал повышения качества культур CAR-T-клеток, при использовании стимуляции антигенположительных APC (представленных антигенпрезентирующими BLCL) по сравнению с качеством, ожидаемым при использовании стандартных анти-CD3/ CD28 шариков или других бесклеточных способов стимуляции.

Пример 3: анти-CD19-CAR-EBV-CTL проявляют высокую и специфическую цитотоксичность

Аналогично тому, как описано выше, лентивирусный вектор, кодирующий CAR (содержащий домен трансдукции сигнала 4-1BB или CD28), использовали для трансдукции стимулированных EBV-BLCL, CD3⁺ антигенспецифических Т-клеток.

Вкратце, CAR-экспрессирующие вирус-специфические Т-клетки получали следующим образом.

- Сутки 0: образцы PBMC оттаивали, и CD3⁺ клетки обогащали (например, с помощью анализа живых клеток FACS или магнитных шариков, покрытых анти-CD3). Затем данные CD3⁺ Т-клетки стимулировали культивированием с EBV-антигенпрезентирующими BLCL, как здесь описано.

- Через 11 суток после стимуляции (на сутки 11) культуру истощали по NK-клеткам (например, с использованием анти-CD56 шариков) и рестимулировали свежими EBV-антигенпрезентирующими BLCL при соотношении респондеры/стимуляторы 1:4 в течение 7 суток.

- На сутки 18 культуру стимулировали в третий раз при соотношении респондеры/стимуляторы 4:1 в течение 2 суток.

- На сутки 20 трансдукцию проводили вирусным вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR), и возвращали к инкубации в стандартной (среда YH) культуре для обеспечения экспансии трансдуцированных вирус-специфических Т-клеток. Необязательно, непосредственно перед трансдукцией можно использовать стадию истощения NK-клеток.

- К суткам 25 оценивали экспрессию CAR (например, с помощью анализа FACS), и CAR-экспрессирующие вирус-специфические Т-клетки (эффекторы) добавляли к целевым культурам для анализа цитотоксичности. Необязательно, клетки можно заморозить на сутки 25, затем разморозить и анализировать на цитотоксичность на сутки 28.

Цитотоксичность, измеренную по высвобождению ЛДГ, оценивали через 4 ч при совместном культивировании с EBV-CAR19-CAR Т-клетками или контрольными EBV CTL в указанных соотношениях E:T (см. фиг. 9 и 10). EBV-CD19-CAR Т-клетки демонстрируют совместимую с HLA-антигенами, CD19-специфическую цитотоксичность с низкой аллоцитотоксичностью, что наблюдается по специфическому киллингу CD19⁺ клеток (NALM6 и Raji) и EBV⁺/CD19⁺ совместимые с HLA-антигенами и несовместимые с HLA-антигенами BLCL (см. фиг.9, A и B; и фиг. 10). В противоположность, клетки K562 и совместимые с HLA-антигенами и несовместимые с PHA-бластами, все без антигена EBV и CD19, не подвергаются киллингу (см. фиг. 9, A и C; и фиг. 10). Более того, EBV-сенсибилизированные, анти-CD19 CAR Т-клетки были цитотоксичными в отношении всех клеточных линий CD19⁺ с меньшей цитотоксичностью вне мишени, то есть меньшей или отсутствующей цитотоксичностью в отношении клеток без экспрессии как CD19, так и EBV. При наблюдении в течение трех суток после добавления эффектора (т.е. добавления EBV-CTL или EBV-CD19 CAR Т-клеток) в клетках-мишенях наблюдали специфический и сильный HLA-независимый цитолиз. Цитолиз индуцировали как в совместимых по HLA-антигенам (мишени BLCL), так и в несовместимых по HLA-антигенам (BLCL и Raji мишени) клетках. Однако EBV-CTL может вызывать значительный цитолиз только в совместимых клетках-мишенях для BLCL (см. фиг. 11).

По сравнению с CAR-Т-клетками, полученными обычным способом (т.е. без обогащения или стимуляции антигеном стартовых Т-культур) антигенспецифические CAR-Т-клетки (например, анти-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL) демонстрируют сопоставимую, если не более высокую, цитотоксичность (см. фиг. 12). Однако анти-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL, по-видимому, являются менее аллореактивными. Пролиферативную способность EBV-специфических CD19-CAR Т-клеток оценивали с помощью анализа разведения CellTrace^TM Violet при совместном культивировании с указанными клеточными линиями (см. фиг. 13). Анти-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL сохраняли способность к киллингу линии B-лимфобластоидных клеток (BLCL) (фиг. 13, внизу слева), но избавили от аутологичных и аллогенных мишеней PHA-бластов без экспрессии антигенов CD19 и EBV, с заметно меньшей аллореактивностью по сравнению с обычными CAR-Т-клетками (фиг. 13, внизу справа, заштрихованно). Более того, по сравнению с CAR-Т-клетками, которые получали обычным способом, анти-CD19-CD28-CAR-EBV-CTL отчетливо демонстрируют цитокиновый профиль, характеризующийся повышенной продукцией IFNγ (см. фиг. 14).

Дополнительные варианты осуществления

Ниже приведены некоторые конкретные нумерованные варианты осуществления изобретения, раскрытого здесь. Эти варианты осуществления являются примерными и предназначены только для иллюстрации. Следует понимать, что изобретение не ограничивается вариантами осуществления, а охватывает все такие формы и комбинации, которые входят в объем вышеприведенного раскрытия.

Вариант осуществления 1. Способ получения препарата, содержащего антигенспецифические Т-клетки, которые экспрессируют химерный антигенный рецептор (CAR), включающий:

i) приготовление культуры CD3⁺ клеток, содержащей Т-клетки и антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы;

ii) трансдукцию Т-клеток указанной культуры вирусным вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR;

iii) культивирование трансдуцированных Т-клеток для обеспечения пролиферации CAR-экспрессирующих антигенспецифических Т-клеток; и

iv) сбор CAR-экспрессирующих антигенспецифических Т-клеток.

Вариант осуществления 2. Способ индукции пролиферации ex vivo популяции CAR-экспрессирующих антигенспецифических Т-клеток, включающий:

i) приготовление культуры CD3⁺ клеток, содержащей Т-клетки и антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы;

ii) трансдукцию Т-клеток вирусным вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR;

iii) культивирование популяции трансдуцированных Т-клеток для обеспечения пролиферации CAR-экспрессирующих антиген-специфических Т-клеток; и

iv) сбор CAR-экспрессирующих антигенспецифических Т-клеток для обработки.

Вариант осуществления 3. Способ по вариантам осуществления 1 или 2, дополнительно включающий культивирование трансдуцированных Т-клеток со стадии iii) с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами.

Вариант осуществления 4. Способ по любому из вариантов осуществления 1-3, дополнительно включающий инкубирование культуры на стадиях i), ii), iii) или любой их комбинации с одним или более цитокинами.

Вариант осуществления 5. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, дополнительно включающий инкубирование клеток-стимуляторов с одним или более цитокинами перед культивированием с CD3⁺ клетками.

Вариант осуществления 6. Способ по любому из вариантов осуществления 1-5, где клетки-стимуляторы представляют собой облученные антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы.

Вариант осуществления 7. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, где CD3⁺ клетки включают образец мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), с истощением эритроцитов, тромбоцитов, моноцитов и гранулоцитов.

Вариант осуществления 8. Способ по любому из вариантов осуществления 1-7, где CD3⁺ клетки содержат образец PBMC, из которого положительно селектированы CD3⁺ лимфоциты.

Вариант осуществления 9. Способ по варианту осуществления 8, где CD3⁺ клетки включают множество типов клеток, включая любой из эффекторных Т-клеток, Т-хелперных клеток (ТН-клеток), цитотоксических Т-клеток (CTL), типы Т-клеток памяти, регуляторных Т-клеток (T_reg-клетки), естественных Т-клеток-киллеров (NKT-клетки), инвариантных клеток, связанных со слизистой оболочкой (MAIT-клеток), гамма-дельта-Т-клеток (γβ-Т-клеток), двойных отрицательных Т-клеток (DNT), CD3⁺ B-клеток или любую их комбинацию.

Вариант осуществления 10. Способ по любому из вариантов осуществления 1-9, где CD3⁺ клетки и клетки-стимуляторы происходят от одного и того же донора.

Вариант осуществления 11. Способ по любому из вариантов осуществления 1-9, где CD3⁺ клетки получены от донора, отличного от донора клеток-стимуляторов.

Вариант осуществления 12. Способ по любому из вариантов осуществления 1-11, где клетки-стимуляторы включают лимфобластоидные клетки, В-клетки, антигенпрезентирующие Т-клетки, дендритные клетки, искусственные антигенпрезентирующие клетки и/или клетки K562.

Вариант осуществления 13. Способ по любому из вариантов осуществления 1-12, где клетки-стимуляторы включают лимфобластоидные В-клетки (BLCL).

Вариант осуществления 14. Способ по любому из вариантов осуществления 1-13, где клетки-стимуляторы положительно селектированы из образца донора.

Вариант осуществления 15. Способ по варианту осуществления 14, где положительно селектированные клетки представляют собой CD19⁺ клетки.

Вариант осуществления 16. Способ по любому из вариантов осуществления 1-15, где клетки-стимуляторы инфицированы нативным вирусом и/или вирусом дикого типа, содержащим, по меньшей мере, один иммуногенный пептидный антиген, содержащий Т-клеточный эпитоп.

Вариант осуществления 17. Способ по любому из вариантов осуществления 1-15, где клетки-стимуляторы экспрессируют вирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую, по меньшей мере, один иммуногенный пептидный антиген, содержащий Т-клеточный эпитоп.

Вариант осуществления 18. Способ по вариантам осуществления 16 или 17, где иммуногенный пептидный антиген происходит от онковируса.

Вариант осуществления 19. Способ по любому из вариантов осуществления 16-18, где иммуногенный пептидный антиген происходит от вируса герпеса, папилломавируса, аденовируса, полиомавируса или ретровируса.

Вариант осуществления 20. Способ по любому из вариантов осуществления 16-19, где иммуногенный пептидный антиген происходит от вируса Эпштейна-Барра (EBV), цитомегаловируса (CMV), вируса папилломы человека (HPV), вируса BK (BKV), вируса Джона Каннингема (JCV), вируса клеток Меркеля (MCV), Т-лимфотропного вируса человека (HTLV) или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Вариант осуществления 21. Способ по любому из вариантов осуществления 16-18, где иммуногенный пептидный антиген происходит от вируса, о котором известно, что он вызывает вирусный гепатит.

Вариант осуществления 22. Способ по варианту осуществления 17, где вирусный вектор является репликационо-некомпетентным.

Вариант осуществления 23. Способ по любому из вариантов осуществления 17-22, где вирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более иммуногенных пептидных антигенов.

Вариант осуществления 24. Способ по любому из вариантов осуществления 17-23, где вирусный вектор представляет собой аденовирусный вектор.

Вариант осуществления 25. Способ по варианту осуществления 24, где аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более EBV антигенов.

Вариант осуществления 26. Способ по вариантам осуществления 24 или 25, где аденовирусный вектор представляет собой AdE1-LMPpoly.

Вариант осуществления 27. Способ по любому из вариантов осуществления 1-26, где клетки-стимуляторы презентируют более одного иммуногенного пептидного антигена, содержащего Т-клеточный эпитоп.

Вариант осуществления 28. Способ по любому из вариантов осуществления 1-27, где клетки-стимуляторы экспрессируют один или более EBV антигенов.

Вариант осуществления 29. Способ по варианту осуществления 28, где один или более EBV антигенов содержат пептид LMP1 или его фрагмент, пептид LMP2A или его фрагмент и/или пептид EBNA1 или его фрагмент.

Вариант осуществления 30. Способ по любому из вариантов осуществления 1-29, где клетки-стимуляторы эндогенно экспрессируют антиген или лиганд, на которые нацелен CAR.

Вариант осуществления 31. Способ по любому из вариантов осуществления 1-29, где клетки-стимуляторы экспрессируют вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген или лиганд, на которые нацелен CAR.

Вариант осуществления 32. Способ по вариантам осуществления 30 или 31, где антиген или лиганд CAR представляет собой CD19.

Вариант осуществления 33. Способ по любому из вариантов осуществления 1-32, необязательно включающий замораживание и хранение культуры CD3⁺ клеток для трансдукции в более поздний срок.

Вариант осуществления 34. Способ по варианту осуществления 33, где перед трансдукцией культуру CD3⁺ клеток размораживают и повторно культивируют с клетками-стимуляторами, по меньшей мере, один раз.

Вариант осуществления 35. Способ по любому из вариантов осуществления 1-34, включающий поддержание CD3⁺ клеток в указанной культуре, по меньшей мере, от 2 суток до, по меньшей мере, 28 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 36. Способ по варианту осуществления 35, включающий поддержание CD3⁺ клеток в указанной культуре в течение, по меньшей мере, 2 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 37. Способ по варианту осуществления 35, включающий поддержание CD3⁺ клеток в указанной культуре в течение, по меньшей мере, 9 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 38. Способ по варианту осуществления 35, включающий поддержание CD3⁺ клеток в указанной культуре в течение, по меньшей мере, 20 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 39. Способ по варианту осуществления 35, включающий поддержание CD3⁺ клеток в указанной культуре в течение, по меньшей мере, 28 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 40. Способ по любому из вариантов осуществления 1-39, включающий поддержание трансдуцированных Т-клеток в указанной культуре, по меньшей мере, от 2 суток до, по меньшей мере, 17 суток после трансдукции.

Вариант осуществления 41. Способ по варианту осуществления 40, включающий поддержание трансдуцированных Т-клеток в указанной культуре в течение, по меньшей мере, 2 суток после трансдукции.

Вариант осуществления 42. Способ по варианту осуществления 40, включающий поддержание трансдуцированных Т-клеток в указанной культуре в течение, по меньшей мере, 7 суток после трансдукции.

Вариант осуществления 43. Способ по варианту осуществления 40, включающий поддержание трансдуцированных Т-клеток в указанной культуре в течение, по меньшей мере, 17 суток после трансдукции.

Вариант осуществления 44. Способ по любому из вариантов осуществления 37-39, дополнительно включающий повторное культивирование CD3⁺ клеток указанной культуры с клетками-стимуляторами, по меньшей мере, один раз.

Вариант осуществления 45. Способ по любому из вариантов осуществления 37-39, дополнительно включающий повторное культивирование CD3⁺ клеток указанной культуры с клетками-стимуляторами, по меньшей мере, дважды.

Вариант осуществления 46. Способ по вариантам осуществления 44 или 45, где повторное культивирование проводят, по меньшей мере, каждые 2-14 суток.

Вариант осуществления 47. Способ по любому из вариантов осуществления 44-46, где первое повторное культивирование проводят через 11 суток после приготовления указанной культуры.

Вариант осуществления 48. Способ по любому из вариантов осуществления 44-47, где второе повторное культивирование проводят через 7 суток после первого повторного культивирования.

Вариант осуществления 49. Способ по любому из вариантов осуществления 1-48, где вирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, представляет собой лентивирусный вектор.

Вариант осуществления 50. Способ по варианту осуществления 49, где вирусный вектор, кодирующий CAR, представляет собой гамма-ретровирусный вектор.

Вариант осуществления 51. Способ по вариантам осуществления 49 или 50, где вирусный вектор является репликационно некомпетентным.

Вариант осуществления 52. Способ по варианту осуществления 51, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, содержит один или более доменов передачи сигнала.

Вариант осуществления 53. Способ по варианту осуществления 52, где один или более доменов передачи сигнала содержат сигнальный домен CD28, сигнальный домен 4-1BB и/или сигнальный домен CD3 или их фрагменты.

Вариант осуществления 54. Способ по варианту осуществления 53, где сигнальный домен CD3 представляет собой CD3ζ.

Вариант осуществления 55. Способ по любому из вариантов осуществления 49-54, где вирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селектируемый маркер.

Вариант осуществления 56. Способ по варианту осуществления 55, где вирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую устойчивость к антибиотикам.

Вариант осуществления 57. Способ по варианту осуществления 56, где антибиотик представляет собой бластицидин.

Вариант осуществления 58. Способ по любому из вариантов осуществления 1-57, где собранные Т-клетки, экспрессирующие CAR, представляют собой CD3⁺ Т-клетки.

Вариант осуществления 59. Способ по варианту осуществления 58, необязательно включающий замораживание и хранение собранных CAR-экспрессирующих Т-клеток в банке клеток для получения композиции для адоптивной иммунотерапии в более поздний срок.

Вариант осуществления 60. Способ по варианту осуществления 59, где перед приготовлением композиции для адоптивной иммунотерапии CAR-экспрессирующие Т-клетки размораживают и повторно культивируют с клетками-стимуляторами, по меньшей мере, один раз.

Вариант осуществления 61. Способ по любому из вариантов осуществления 58-60, где собранные CAR-экспрессирующие Т-клетки включают Т-клетки центральной памяти (Тсм-клетки) и эффекторные Т-клетки памяти (Tem-клетки).

Вариант осуществления 62. Способ по любому из вариантов осуществления 58-60, где собранные CAR-экспрессирующие Т-клетки являются преимущественно Tcm-клетками.

Вариант осуществления 63. Способ по варианту осуществления 61, где соотношение Tcm-клеток к Tem-клеткам составляет более 1:1.

Вариант осуществления 64. Способ по варианту осуществления 63, где соотношение Tcm-клеток к Tem-клеткам составляет, по меньшей мере, 1,4:1.

Вариант осуществления 65. Способ по варианту осуществления 63, где соотношение Tcm-клеток к Tem-клеткам составляет, по меньшей мере, 2,5:1.

Вариант осуществления 66. Способ по варианту осуществления 63, где соотношение Tcm-клеток к Tem-клеткам составляет, по меньшей мере, 3:1.

Вариант осуществления 67. Способ по любому из вариантов осуществления 58-60, где собранные CAR-экспрессирующие Т-клетки содержат любые из CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток.

Вариант осуществления 68. Способ по любому из вариантов осуществления 58-60, где собранные CAR-экспрессирующие Т-клетки представляют собой преимущественно CD4⁺ Т-клетки.

Вариант осуществления 69. Способ по варианту осуществления 68, где соотношение CD4⁺ Т-клеток к CD8⁺ Т-клеткам составляет больше 1:1.

Вариант осуществления 70. Способ по варианту осуществления 69, где соотношение CD4⁺ Т-клеток к CD8⁺ Т-клеткам составляет, по меньшей мере, 1,4:1.

Вариант осуществления 71. Способ по варианту осуществления 69, где соотношение CD4⁺ Т-клеток к CD8⁺ Т-клеткам составляет, по меньшей мере, 2,5:1.

Вариант осуществления 72. Способ по варианту осуществления 69, где соотношение CD4⁺ Т-клеток к CD8⁺ Т-клеткам составляет, по меньшей мере, 3:1.

Вариант осуществления 73. Способ по любому из вариантов осуществления 62-72, где, по меньшей мере, 60% собранных CAR-экспрессирующих Т-клеток являются TCM-клетками.

Вариант осуществления 74. Способ ex vivo обогащения антиген-специфических, CAR-экспрессирующих Т-клеток, включающий:

(i) получение образца клеток от субъекта, где образец содержит CD3⁺ Т-клетки;

(ii) выделение CD3⁺ клеток из указанного образца и контактирование указанных CD3⁺ клеток с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами, тем самым избирательно усиливая пролиферацию антигенспецифических CD3+Т-клеток;

(iii) трансдукцию CD3⁺ клеток вирусным вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR), для получения популяции антигенспецифических, CAR-экспрессирующих CD3⁺ Т-клеток; и

(iv) необязательно культивирование популяции CAR-экспрессирующих CD3⁺ Т-клеток ex vivo в культуре с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами для избирательного усиления пролиферации антигенспецифических, CAR-экспрессирующих CD3⁺ Т-клеток.

Вариант осуществления 75. Способ по варианту осуществления 74, где образец содержит мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC).

Вариант осуществления 76. Способ по вариантам осуществления 74 или 75, где выделенные CD3⁺ клетки и антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы получены от одного и того же субъекта.

Вариант осуществления 77. Способ по любому из вариантов осуществления 74-76, где выделенные CD3⁺ клетки получены от другого субъекта, чем антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы.

Вариант осуществления 78. Способ по любому из вариантов осуществления 74-77, где антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы включают лимфобластоидные клетки, В-клетки, антигенпрезентирующие Т-клетки, дендритные клетки, искусственные антигенпрезентирующие клетки и/или клетки K562.

Вариант осуществления 79. Способ по любому из вариантов осуществления 74-78, где антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы представляют собой BLCL.

Вариант осуществления 80. Способ по любому из вариантов осуществления 74-79, где антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами являются CD19⁺.

Вариант осуществления 81. Способ по любому из вариантов осуществления 74-80, где антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы экспрессируют один или более EBV антигенов.

Вариант осуществления 82. Способ по варианту осуществления 81, где один или более EBV антигенов содержат пептид LMP1 или его фрагмент, пептид LMP2A или его фрагмент и/или пептид EBNA1 или его фрагмент.

Вариант осуществления 83. Способ по любому из вариантов осуществления 74-82, включающий поддержание CD3⁺ Т-клеток после контактирования с указанными антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами в течение, по меньшей мере, от 3 суток до, по меньшей мере, 28 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 84. Способ по варианту осуществления 83, включающий поддержание CD3⁺ Т-клеток после контактирования с указанными антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами в течение, по меньшей мере, 3 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 85. Способ по варианту осуществления 83, включающий поддержание CD3⁺ Т-клеток после контактирования с указанными антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами в течение, по меньшей мере, 6 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 86. Способ по варианту осуществления 83, включающий поддержание CD3⁺ Т-клеток после контактирования с указанными антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами в течение, по меньшей мере, 9 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 87. Способ по варианту осуществления 83, включающий поддержание CD3⁺ Т-клеток после контактирования с указанными антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами в течение, по меньшей мере, 28 суток до трансдукции.

Вариант осуществления 88. Способ по любому из вариантов осуществления 83-87, дополнительно включающий повторное контактирование указанных выделенных CD3⁺ Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами, по меньшей мере, один раз.

Вариант осуществления 89. Способ по любому из вариантов осуществления 83-88, дополнительно включающий повторное контактирование указанных выделенных CD3⁺ Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами, по меньшей мере, дважды.

Вариант осуществления 90. Способ по вариантам осуществления изобретения 88 или 89, где повторное контактирование указанных выделенных CD3⁺ Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами проводится, по меньшей мере, каждые 2-14 суток.

Вариант осуществления 91. Способ по любому из вариантов осуществления 88-90, где первое повторное контактирование указанных выделенных CD3⁺ Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами проводится через 11 суток.

Вариант осуществления 92. Способ по любому из вариантов осуществления 88-91, где второе повторное контактирование проводится через 7 суток после первого повторного контактирования указанных выделенных CD3⁺ Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками-стимуляторами.

Вариант осуществления 93. Способ по любому из вариантов осуществления 74-92, где культура, которая избирательно усиливает пролиферацию антигенспецифических, CAR-экспрессирующих CD3⁺ Т-клеток, включает антигенпрезентирующие клетки-стимуляторы.

Вариант осуществления 94. Способ по варианту осуществления 93, включающий поддержание антигенспецифических, CAR- экспрессирующих, CD3⁺ Т-клеток в культуре, которая избирательно усиливает пролиферацию антигенспецифических, CAR-экспрессирующих Т-клеток, в течение, по меньшей мере, 2 суток после трансдукции.

Вариант осуществления 95. Способ по варианту осуществления 94, включающий поддержание антигенспецифических, CAR-экспрессирующих CD3⁺ Т-клеток в культуре, которая избирательно усиливает пролиферацию антигенспецифических, CAR-экспрессирующих Т-клеток, в течение, по меньшей мере, 7 суток после трансдукции.

Вариант осуществления 96. Способ по варианту осуществления 94, включающий поддержание антигенспецифических, CAR- экспрессирующих CD3⁺ Т-клеток в культуре, которая избирательно усиливает пролиферацию антигенспецифических, CAR-экспрессирующих Т-клеток, в течение, по меньшей мере 17 суток после трансдукции.

Вариант осуществления 97. Способ по любому из вариантов осуществления 74-96, где вирусный вектор, кодирующий CAR, представляет собой лентивирусный вектор.

Вариант осуществления 98. Способ по варианту осуществления 97, где вирусный вектор, кодирующий CAR, представляет собой гамма-ретровирусный вектор.

Вариант осуществления 99. Способ по любому из вариантов осуществления 97 или 98, где вирусный вектор, кодирующий CAR, является репликационно-некомпетентным.

Вариант осуществления 100. Способ по варианту осуществления 99, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, содержит один или более доменов передачи сигнала.

Вариант осуществления 101. Способ по варианту осуществления 100, где один или более доменов передачи сигнала содержат сигнальный домен CD28, сигнальный домен 4-1BB и/или сигнальный домен CD3 или их фрагменты.

Вариант осуществления 102. Способ по варианту осуществления 101, где сигнальный домен CD3 представляет собой CD3ζ или его фрагмент.

Вариант осуществления 103. Способ по любому из вариантов осуществления 97-102, где вирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер.

Вариант осуществления 104. Способ по любому из вариантов осуществления 97-102, где вирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую устойчивость к антибиотикам.

Вариант осуществления 105. Способ по любому из вариантов осуществления 74-104, где культура, которая избирательно усиливает пролиферацию антигенспецифических, CAR-экспрессирующих CD3⁺ Т-клеток, дополнительно содержит антибиотик.

Вариант осуществления изобретения 106. Способ по варианту осуществления изобретения 105, где антибиотик представляет собой бластицидин.

Вариант осуществления 107. Способ получения композиции для адоптивной иммунотерапии, включающий любой из вариантов осуществления 74-106, где композиция содержит преимущественно антигенспецифические, CAR-экспрессирующие CD3⁺ Т-клетки центральной памяти (Tcm).

Вариант осуществления 108. Способ по варианту осуществления 107, где, по меньшей мере, 60% композиции для адоптивной иммунотерапии содержит антигенспецифические, CAR-экспрессирующие CD3⁺ Tcm.

Вариант осуществления 109. Способ по любому из вариантов осуществления 107 или 108, где антигенспецифические, CAR- экспрессирующие, CD3⁺ Tcm представляют собой преимущественно CD4⁺ Т-клетки.

Вариант осуществления 110. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, где CAR содержит нацеливающий домен, который связывает CD19.

Вариант осуществления 111. Способ по варианту осуществления 110, где CAR содержит анти-CD19 одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).

Вариант осуществления 112. Способ повышения пролиферативной способности Т-клеток, включающий выполнение способа по любому из предшествующих вариантов осуществления.

Вариант осуществления 113. Способ повышения эффективности трансдукции Т-клеток, включающий выполнение способа по любому из предшествующих вариантов осуществления.

Вариант осуществления 114. Способ повышения жизнеспособности CAR-экспрессирующих Т-клеток, включающий выполнение способа по любому из предшествующих вариантов осуществления.

Вариант осуществления 115. Композиция Т-клеток, полученная способом по любому из предшествующих вариантов осуществления.

Вариант осуществления 116. Препарат Т-клеток, содержащий антигенспецифические Т-клетки, которые экспрессируют рекомбинантный химерный антигенный рецептор (CAR); где, по меньшей мере, 60% CAR-экспрессирующих Т-клеток являются Tcm-клетками.

Вариант осуществления 117. Препарат Т-клеток по варианту осуществления 116, где CAR-экспрессирующие Tcm-клетки представляют собой преимущественно CD4⁺ Т-клетки.

Включение по ссылке

Все публикации, патенты, заявки на патент и идентификационные номера последовательностей, указанные здесь, включены здесь посредством ссылки во всей своей полноте, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были специально и индивидуально указаны для включения посредством ссылки. В случае конфликта настоящая заявка, включая любые определения в данном документе, будет иметь преимущественную силу.

Эквивалентные варианты

Специалисты в данной области понимают или могут установить, используя не более чем рутинное экспериментирование, что имеются многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных здесь. Такие эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения.

--->

Список последовательностей

<110> ATARA BIOTHERAPEUTICS, INC.

<120> СПОСОБЫ ЭКСПАНДИРОВАНИЯ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ CAR-T-КЛЕТОК,

КОМПОЗИЦИИ И ПРИМЕНЕНИЯ, СВЯЗАННЫЕ С НИМИ

<130> ABH-00425

<140> PCT/US2019/050404

<141> 2019-09-10

<150> 62/896,707

<151> 2019-09-06

<150> 62/729,089

<151> 2018-09-10

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 376

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 1

Met Asp Leu Asp Leu Glu Arg Gly Pro Pro Gly Pro Arg Arg Pro Pro

1 5 10 15

Arg Gly Pro Pro Leu Ser Ser Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

20 25 30

Leu Leu Ala Leu Leu Phe Trp Leu Tyr Ile Ile Met Ser Asn Trp Thr

35 40 45

Gly Gly Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ala Phe Ala Leu Met Leu Val Ile

50 55 60

Ile Ile Leu Ile Ile Phe Ile Phe Arg Arg Asp Leu Leu Cys Pro Leu

65 70 75 80

Gly Ala Leu Cys Leu Leu Leu Leu Met Ile Thr Leu Leu Leu Ile Ala

85 90 95

Leu Trp Asn Leu His Gly Gln Ala Leu Tyr Leu Gly Ile Val Leu Phe

100 105 110

Ile Phe Gly Cys Leu Leu Val Leu Gly Ile Trp Val Tyr Phe Leu Glu

115 120 125

Ile Leu Trp Arg Leu Gly Ala Thr Ile Trp Gln Leu Leu Ala Phe Phe

130 135 140

Leu Ala Phe Phe Leu Asp Ile Leu Leu Leu Ile Ile Ala Leu Tyr Leu

145 150 155 160

Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu Leu Val Asp Leu Leu Trp Leu Leu Leu

165 170 175

Phe Leu Ala Ile Leu Ile Trp Met Tyr Tyr His Gly Gln Arg His Ser

180 185 190

Asp Glu His His His Asp Asp Ser Leu Pro His Pro Gln Gln Ala Thr

195 200 205

Asp Asp Ser Ser Asn His Ser Asp Ser Asn Ser Asn Glu Gly Arg His

210 215 220

His Leu Leu Val Ser Gly Ala Gly Asp Ala Pro Pro Leu Cys Ser Gln

225 230 235 240

Asn Leu Gly Ala Pro Gly Gly Gly Pro Asp Asn Gly Pro Gln Asp Pro

245 250 255

Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp

260 265 270

Asn Gly Pro His Asp Pro Leu Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp

275 280 285

Asn Gly Pro Gln Asp Pro Asp Asn Thr Asp Asp Asn Gly Pro His Asp

290 295 300

Pro Leu Pro His Asn Pro Ser Asp Ser Ala Gly Asn Asp Gly Gly Pro

305 310 315 320

Pro Asn Leu Thr Glu Glu Val Glu Asn Lys Gly Gly Asp Arg Gly Pro

325 330 335

Pro Ser Met Thr Asp Gly Gly Gly Gly Asp Pro His Leu Pro Thr Leu

340 345 350

Leu Leu Gly Thr Ser Gly Ser Gly Gly Asp Asp Asp Asp Pro His Gly

355 360 365

Pro Val Gln Leu Ser Tyr Tyr Asp

370 375

<210> 2

<211> 497

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 2

Met Gly Ser Leu Glu Met Val Pro Met Gly Ala Gly Pro Pro Ser Pro

1 5 10 15

Gly Gly Asp Pro Asp Gly Asp Asp Gly Gly Asn Asn Ser Gln Tyr Pro

20 25 30

Ser Ala Ser Gly Ser Asp Gly Asn Thr Pro Thr Pro Pro Asn Asp Glu

35 40 45

Glu Arg Glu Ser Asn Glu Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Glu Asp Leu Asp

50 55 60

Trp Gly Asn Gly Asp Arg His Ser Asp Tyr Gln Pro Leu Gly Asn Gln

65 70 75 80

Asp Pro Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Gln His Asp Gly Asn Asp Gly Leu

85 90 95

Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Pro Arg Asp Asp Ser Ser Gln His Ile Tyr

100 105 110

Glu Glu Ala Gly Arg Gly Ser Met Asn Pro Val Cys Leu Pro Val Ile

115 120 125

Val Ala Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala Ile Ala Ala Ser Cys Phe

130 135 140

Thr Ala Ser Val Ser Thr Val Val Thr Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser

145 150 155 160

Leu Leu Leu Leu Ala Ala Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln Arg

165 170 175

Lys Leu Leu Thr Pro Val Thr Val Leu Thr Ala Val Val Thr Phe Phe

180 185 190

Ala Ile Cys Leu Thr Trp Arg Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu

195 200 205

Leu Phe Ala Leu Leu Ala Ala Ala Gly Gly Leu Gln Gly Ile Tyr Val

210 215 220

Leu Val Met Leu Val Leu Leu Ile Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Arg

225 230 235 240

Arg Leu Thr Val Cys Gly Gly Ile Met Phe Leu Ala Cys Val Leu Val

245 250 255

Leu Ile Val Asp Ala Val Leu Gln Leu Ser Pro Leu Leu Gly Ala Val

260 265 270

Thr Val Val Ser Met Thr Leu Leu Leu Leu Ala Phe Val Leu Trp Leu

275 280 285

Ser Ser Pro Gly Gly Leu Gly Thr Leu Gly Ala Ala Leu Leu Thr Leu

290 295 300

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Ala Ser Leu Ile Leu Gly Thr Leu Asn

305 310 315 320

Leu Thr Thr Met Phe Leu Leu Met Leu Leu Trp Thr Leu Val Val Leu

325 330 335

Leu Ile Cys Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Thr Lys Ile Leu Leu

340 345 350

Ala Arg Leu Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ser Ala

355 360 365

Leu Ile Ala Gly Gly Ser Ile Leu Gln Thr Asn Phe Lys Ser Leu Ser

370 375 380

Ser Thr Glu Phe Ile Pro Asn Leu Phe Cys Met Leu Leu Leu Ile Val

385 390 395 400

Ala Gly Ile Leu Phe Ile Leu Ala Ile Leu Thr Glu Trp Gly Ser Gly

405 410 415

Asn Arg Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr

420 425 430

Met Val Ala Gly Ala Val Trp Leu Thr Val Met Thr Asn Thr Leu Leu

435 440 445

Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu Ile Gly Phe

450 455 460

Ala Leu Phe Gly Val Ile Arg Cys Cys Arg Tyr Cys Cys Tyr Tyr Cys

465 470 475 480

Leu Thr Leu Glu Ser Glu Glu Arg Pro Pro Thr Pro Tyr Arg Asn Thr

485 490 495

Val

<210> 3

<211> 238

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 3

Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu

20 25 30

Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg

35 40 45

Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys

50 55 60

His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn Ile Ala Glu

65 70 75 80

Gly Leu Arg Val Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg Thr Thr Glu

85 90 95

Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr

100 105 110

Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile Pro Gln Cys

115 120 125

Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala Pro Gly Pro

130 135 140

Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met

145 150 155 160

Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys Asp Ala Ile

165 170 175

Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn Ile Lys Val

180 185 190

Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro Trp Phe Pro

195 200 205

Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly Asp Asp Gly

210 215 220

Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln Glu

225 230 235

<210> 4

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 4

Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 5

Phe Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Leu Leu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 6

Tyr Leu Gln Gln Asn Trp Trp Thr Leu

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 7

Tyr Leu Leu Glu Met Leu Trp Arg Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 8

Ala Leu Leu Val Leu Tyr Ser Phe Ala

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 9

Leu Leu Ser Ala Trp Ile Leu Thr Ala

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 10

Leu Thr Ala Gly Phe Leu Ile Phe Leu

1 5

<210> 11

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 11

Ser Ser Cys Ser Ser Cys Pro Leu Ser Lys Ile

1 5 10

<210> 12

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 12

Pro Tyr Leu Phe Trp Leu Ala Ala

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 13

Thr Tyr Gly Pro Val Phe Met Cys Leu

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 14

Val Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp

1 5 10

<210> 15

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 15

Cys Pro Leu Ser Lys Ile Leu Leu

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 16

Arg Arg Arg Trp Arg Arg Leu Thr Val

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 17

Ile Glu Asp Pro Pro Phe Asn Ser Leu

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 18

Ile Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Asn Trp

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 44

<400> 19

Met Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Trp

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 20

Val Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Leu

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 21

Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 22

Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 23

Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu

1 5

<210> 24

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 24

His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr

1 5 10

<210> 25

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 25

Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala

1 5

<210> 26

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Гамма-герпесвирус человека 4

<400> 26

Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Ser Leu

1 5 10

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам получения композиции, содержащей цитотоксические Т-клетки, которые содержат Т-клеточный рецептор (TCR) и химерный антигенный рецептор (CAR). Настоящее изобретение также относится к способу повышения пролиферативной способности экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении антигена, способу повышения эффективности трансдукции экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении антигена, и способу повышения жизнеспособности экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении антигена. 5 н. и 27 з.п. ф-лы, 14 ил.

1. Способ получения композиции, содержащей цитотоксические Т-клетки (CTL), которые содержат (a) Т-клеточный рецептор (TCR), который связывается с первым антигеном, и (b) химерный антигенный рецептор (CAR), который связывается со вторым антигеном, где указанный способ включает:

i) получение культуры клеток, содержащей мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) человека;

ii) совместное культивирование указанной культуры, содержащей РВМС, с лимфобластоидными B-клетками (BLCL) человека, которые были сконструированы для экспрессии указанного первого антигена;

iii) поддержание указанной культуры, содержащей PBMC и BLCL, в течение времени, достаточного для индукции селективной пролиферации CTL, содержащих TCR, который связывается с указанным первым антигеном;

iv) трансдукцию CTL указанной культуры вирусным вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, который связывается с указанным вторым антигеном, посредством чего обеспечиваются CTL, которые содержат (а) TCR, который связывается с указанным первым антигеном, и (b) CAR, который связывается с указанным вторым антигеном;

v) культивирование указанных экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении первого антигена, для обеспечения пролиферации таких CTL;

vi) необязательно повторное культивирование указанных экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении первого антигена, один или более раз с BLCL, которые были сконструированы для экспрессии указанного первого антигена, посредством чего указанные экспрессирующие CAR CTL, специфичные в отношении первого антигена, дополнительно сенсибилизируются в отношении указанного первого антигена; и

vii) сбор композиции, содержащей CTL, которые содержат (а) TCR, который связывается с указанным первым антигеном, и (b) CAR, который связывается с указанным вторым антигеном.

2. Способ получения композиции для адоптивной иммунотерапии, содержащей цитотоксические Т-клетки (CTL), которые содержат (a) Т-клеточный рецептор (TCR), который связывается с первым антигеном, и (b) химерный антигенный рецептор (CAR), который связывается со вторым антигеном, где указанный способ включает:

i) получение культуры клеток, содержащей мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) человека;

ii) совместное культивирование указанной культуры, содержащей РВМС, с лимфобластоидными B-клетками (BLCL) человека, которые были сконструированы для экспрессии указанного первого антигена;

iii) поддержание указанной культуры, содержащей PBMC и BLCL, в течение времени, достаточного для индукции селективной пролиферации CTL, содержащих TCR, который связывается с указанным первым антигеном;

iv) трансдукцию CTL указанной культуры вирусным вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, который связывается с указанным вторым антигеном, посредством чего обеспечиваются CTL, которые содержат (а) TCR, который связывается с указанным первым антигеном, и (b) CAR, который связывается с указанным вторым антигеном;

v) культивирование указанных экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении первого антигена, для обеспечения пролиферации таких клеток;

vi) необязательно повторное культивирование указанных экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении первого антигена, один или более раз с BLCL, которые были сконструированы для экспрессии указанного первого антигена, посредством чего указанные экспрессирующие CAR CTL, специфичные в отношении первого антигена, дополнительно сенсибилизируются в отношении указанного первого антигена; и

vii) сбор композиции, содержащей CTL, которые содержат (а) TCR, который связывается с указанным первым антигеном, и (b) CAR, который связывается с указанным вторым антигеном, посредством чего получают указанную композицию для адоптивной иммунотерапии.

3. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий инкубирование культуры с любой из стадий i), ii), iii), v), iv) или любой их комбинации с одним или более цитокинами.

4. Способ по п.3, где указанные один или более цитокинов включают IL-2.

5. Способ по п.1 или 2, где указанное совместное культивирование стадии (ii) выполняют при соотношении PBMC к BLCL, составляющем 20:1.

6. Способ по п.1 или 2, где указанная трандукция стадии (iv) происходит через трое суток после указанного совместного культивирования стадии (ii).

7. Способ по п. 1 или 2, включающий стадию повторного культивирования (vi).

8. Способ по п.1 или 2, где стадия (iv) включает повторное культивирование указанных экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении первого антигена, с BLCL, которые были сконструированы для экспрессии указанного первого антигена, через восемь суток после указанной стадии трансдукции (iv).

9. Способ по п.8, где указанную стадию повторного культивирования (vi) выполняют при соотношении CTL к BLCL, составляющем 0,2:1.

10. Способ по п.9, где непосредственно перед стадией повторного культивирования (vi) CD56⁺ клетки истощают из указанной клеточной культуры.

11. Способ по п. 1 или 2, где стадия (vi) включает

(a) повторное культивирование указанных экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении первого антигена, с BLCL, которые были сконструированы для экспрессии указанного первого антигена, через восемь суток после указанной стадии трансдукции (iv), и

(b) снова повторное культивирование указанных экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении первого антигена, с BLCL, которые были сконструированы для экспрессии указанного первого антигена, по меньшей мере через четырнадцать суток после указанной стадии трансдукции (iv).

12. Способ по п.11, где указанную стадию повторного культивирования (a) выполняют при соотношении CTL к BLCL, составляющем 0,2:1, и указанную стадию повторного культивирования (b) выполняют при соотношении CTL к BLCL, составляющем 4:1.

13. Способ по п.11, где первую стадию повторного культивирования проводят, по меньшей мере, через 7 суток после начала стадии совместного культивирования.

14. Способ по п.1 или 2, где PBMC и BLCL получены от одного и того же донора.

15. Способ по п.1 или 2, где BLCL подвергают гамма-облучению перед совместным культивированием с указанными PBMC.

16. Способ по п.1 или 2, где BLCL инфицированы вирусом, содержащим, по меньшей мере, один иммуногенный пептидный антиген, и где указанный по меньшей мере один иммуногенный пептидный антиген содержит указанный первый антиген.

17. Способ по п.16, где указанный первый антиген представляет собой антиген вируса Эпштейна-Барра (EBV), антиген цитомегаловируса (CMV), антиген вируса папилломы человека (HPV), антиген вируса BK (BKV), антиген вируса Джона Каннингема (JCV), антиген вируса клеток Меркеля (MCV), антиген Т-лимфотропного вируса человека (HTLV) или антиген вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

18. Способ по п.17, где вирусный антиген включает EBV пептид LMP1 или его фрагмент, EBV пептид LMP2A или его фрагмент или EBV пептид EBNA1 или его фрагмент.

19. Способ по п.1 или 2, включающий стадию крио-сохранения указанных экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении первого антигена, для введения пациенту, нуждающемуся в этом, в более поздний срок.

20. Способ по п.1 или 2, где вирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, представляет собой лентивирусный или ретровирусный вектор.

21. Способ по п.1 или 2, где вирусный вектор является репликационно-некомпетентным.

22. Способ по п.1 или 2, где CAR содержит один или более доменов передачи сигнала.

23. Способ по п.22, где один или более доменов передачи сигнала содержат сигнальный домен CD28, сигнальный домен 4-1BB, сигнальный домен CD3 или их варианты или фрагменты.

24. Способ по п.23, где сигнальный домен CD3 представляет собой CD3ζ.

25. Способ по п. 23, где CAR содержит вариант домена CD3 без, по меньшей мере, одной функциональной области ITAM.

26. Способ по п.22, где CAR содержит домен Mut06.

27. Способ по п.1 или 2, где вирусный вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селектируемый маркер.

28. Способ по п.27, где селектируемый маркер придает устойчивость к антибиотикам.

29. Способ по п.28, где антибиотик представляет собой бластицидин.

30. Способ повышения пролиферативной способности экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении антигена, включающий выполнение способа по п. 1 или 2.

31. Способ повышения эффективности трансдукции экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении антигена, включающий выполнение способа по п.1 или 2.

32. Способ повышения жизнеспособности экспрессирующих CAR CTL, специфичных в отношении антигена, включающий выполнение способа по п.1 или 2.