ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ, СОДЕРЖАЩИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ ПТИЦ Российский патент 2025 года по МПК C12N5/71 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Область настоящего изобретения относится к промышленному получению синтетических питательных пищевых продуктов для потребления человеком и/или животными. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению линий клеток птиц, в частности линий куриных и утиных эмбриональных стволовых (ES) клеток, полученных из стволовых клеток эмбрионального происхождения, для получения биомассы клеток, подходящей в качестве пищи или пищевых добавок. Настоящее изобретение охватывает способ получения таких синтетических пищевых продуктов, а также указанные продукты.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Мировое производство мяса быстро выросло за последние 50 лет, т.е. с 1961 года общее мировое производство выросло в 4-5 раз (Ritchie and Roser, 2018). В 2014 году общее производство мяса составило приблизительно 300 миллионов тонн, в основном мяса птицы, свинины и говядины. В это же время общее поголовье сельскохозяйственных животных составляло приблизительно 1,4 миллиарда голов крупного рогатого скота, 1,2 миллиарда овец, 1 миллиард коз и приблизительно 1 миллиард свиней, при этом имеется очень сильная тенденция к увеличению в основном за счет повышения спроса в Азии. За последние 50 лет общее потребление мяса на душу населения увеличилось вдвое, т.е. потребление мяса превышает увеличение населения. Кроме того, согласно оценкам в 2030 году мировое потребление мяса увеличится на 25% по сравнению с 2015 годом и достигнет 460 миллионов тонн в 2050 году (GEAS 2012).

Другой стороной этого значительного роста являются серьезные проблемы, ассоциированные с нынешним производством мяса животных, которое и далее будет увеличиваться в соответствии с прогнозируемой тенденцией.

Во-первых, обычные способы производства мяса животных очень неэффективны. Значительная часть всего сельскохозяйственного зерна используется для потребления животными. Кроме того, для производства одного фунта мяса требуются тысячи фунтов воды. Например, для производства одного килограмма свинины, баранины/козлятины или говядины требуется 5988, 8768 и 15415 литров воды, соответственно (Mekonnen and Hoekstra, 2010). Несмотря на это, в настоящее время усилия сосредоточены на ускорении роста сельскохозяйственных животных за счет использования гормонов и антибиотиков и, следовательно, меньшего потребления зерна и воды. Однако такое усовершенствование приводит к другой проблеме, при которой мясо сельскохозяйственных животных, загрязненное гормонами роста (в частности, стероидными гормонами, такими как тестостерон, прогестерон, эстроген или их синтетические производные) и антибиотиками, представляет собой угрозу для здоровья населения (Galbraith, 2002; Jeong et al., 2010).

Во-вторых, интенсификация животноводства ассоциирована с быстрым распространением патогенов и новых заболеваний по всему миру (Greger, 2007). Патогены, передающиеся с пищей, такие как Salmonella, Campylobacter и Escherichia coli, являются причиной миллионов эпизодов болезней каждый год и влекут за собой огромные расходы в системах здравоохранения человека и животных.

В-третьих, огромные выбросы углекислого газа и метана в секторе животноводства являются серьезной проблемой для окружающей среды (GEAS 2012; Opio et al., 2013; Hedenus et al., 2014). По оценкам Всемирного банка 18% мировых выбросов CO₂ вызваны нынешним неэффективным производством мяса. Институт всемирного наблюдения (Worldwatch Institute) утверждает, что истинная цифра составляет 51% (см. https://www.independent.co.uk/environment/climate-change/study-claims-meat-creates-half-of-all-greenhouse-gases-1812909.html).

В-четвертых, нынешние способы получения мяса связаны со страданиями животных, против которых в наши дни возражают многие люди.

В-пятых, дополнительный недостаток потребления натурального мяса заключается в высоком содержании вредных веществ, таких как холестерин и насыщенный жир, которые вызывают некоторые проблемы с питанием и угрозами для здоровья.

Таким образом, существует потребность в разработке новых подходов к получению мяса и/или мясоподобных продуктов, которые могут по меньшей мере частично решить или уменьшить упомянутые выше проблемы.

Один из подходов может заключаться в разработке нетрадиционных мясных продуктов, полученных ex vivo. Так называемое «синтетическое» или «мясо in vitro», также известное как «мясо, выращенное из клеточной культуры», «искусственное мясо», «чистое мясо» или «мясо, выращенное в лаборатории», изготавливается с использованием клеток, культивируемых in vitro и первоначально полученных от животных. Такое синтетическое мясо имеет ряд преимуществ по сравнению с обычным мясом с точки зрения эффективности использования природных ресурсов (земли, энергии, воды), меньшей выработки парниковых газов и лучшего благополучия животных (Tuomisto, 2014). Кроме того, питательный состав культивированного мяса можно тщательно контролировать, избегая посредством этого загрязнения опасными компонентами, такими как холестерин, насыщенный жир, гормоны, антибиотики и инфекционные микроорганизмы.

Теоретически синтетическое мясо может играть дополнительную роль наряду с обычными мясными продуктами или даже может рассматриваться как альтернатива мясу, при условии, что его физические свойства, цвет, вкус, аромат, текстура, вкусовые качества и питательная ценность будут сопоставимы с традиционным мясом животных или просто будут приемлемы для людей. Несмотря на то, что в последние годы был достигнут некоторый прогресс, технологии в области получения синтетического мяса или мясоподобных продуктов все еще находятся на очень раннем этапе внедрения (рассматривается в Kadim et al., 2015). Остаются нерешенными важные проблемы, включая выбор подходящих типов клеток, совершенствование условий культивирования и разработку культуральных сред, которые являются рентабельными и не содержат опасных загрязнений.

Одна важная проблема, которая, помимо прочего, решается с помощью настоящего изобретения, заключается в увеличении масштаба для получения очень больших количеств мясоподобных продуктов по целесообразной цене.

Авторы настоящего изобретения разработали линии клеток птиц, которые могут устойчиво размножаться в культуре и продуцировать большую биомассу клеток. В частности, линии клеток, предложенные в настоящей заявке, обладают всеми характеристиками, необходимыми для реализации культивирования в больших промышленных масштабах.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует значительная потребность в поиске альтернативных способов получения пищевых продуктов, которые не содержат антибиотиков и требуют меньше энергии и воды. Культивирование линий клеток птиц в суспензии неожиданно обеспечило источник чрезвычайно высокого выхода таких пищевых продуктов.

Согласно настоящей заявке предложен новый способ получения синтетических мясных продуктов, который может помочь в решении серьезных проблем окружающей среды, здравоохранения и этики, ассоциированных с традиционными подходами, и удовлетворить быстро растущие потребности потребителей. Раскрытый способ не включает трудоемкую методику тканевой инженерии, а основан на недорогой культуре клеток. Аспекты настоящего изобретения обеспечивают, в частности, следующее:

А1. Производственный способ/способ получения «in vitro» питательного пищевого продукта для потребления человеком или животными, включающий культивирование линии клеток птиц в суспензии, причем указанная линия клеток птиц i) происходит из эмбриональных стволовых клеток птиц, ii) способна к пролиферации в основной культуральной среде в отсутствие экзогенных факторов роста, питающих клеток и/или сыворотки животных, и iii) способна непрерывно размножаться в суспензии.

A2. Производственный способ/способ по аспекту A1, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц получена с помощью указанного производственного способа, включающего следующие этапы:

a) выделение эмбриональных стволовых клеток птиц из эмбриона (ов) на стадии развития, примерно соответствующей откладке яиц;

b) культивирование указанных клеток в основной культуральной среде, содержащей по меньшей мере один экзогенный фактор роста SCF, IGF-1, bFGF, IL-6, IL-6R и/или CNT, слой питающих клеток и сыворотку животных, в течение по меньшей мере двадцати пассажей;

c) модификация указанной культуральной среды путем постепенного истощения указанных факторов роста, питающих клеток и сыворотки животных, и последующее культивирование указанных клеток по меньшей мере в течение нескольких пассажей; и

d) адаптация указанных клеток из этапа c) к суспензии,

с получением посредством этого устойчивой линии клеток птиц, способной к пролиферации в основной культуральной среде в отсутствие экзогенных факторов роста, питающих клеток и/или сыворотки животных в течение по меньшей мере 50 дней.

A3. Производственный способ/способ по аспектам A1 и A2, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц получена с помощью указанного производственного способа, включающего следующие этапы:

a) выделение эмбриональных стволовых клеток птиц из эмбриона (ов) на стадии развития, примерно соответствующей откладке яиц;

b) культивирование указанных клеток в основной культуральной среде, содержащей экзогенный фактор роста IGF-1 и CNTF, слой питающих клеток и сыворотку животных, по меньшей мере в течение одного пассажа;

c) постепенное удаление указанных факторов роста из указанной культуры из этапа b) и выращивание по меньшей мере в течение одного пассажа;

d) постепенное удаление питающих клеток из указанной культуры из этапа c) и выращивание по меньшей мере в течение одного пассажа;

e) постепенное удаление сыворотки животных из указанной культуры из этапа d) и выращивание по меньшей мере в течение одного пассажа; и

f) адаптация указанных клеток из этапа e) к суспензии,

с получением посредством этого непрерывной линии клеток птиц, способной к пролиферации в основной среде в отсутствие экзогенных факторов роста, питающих клеток и/или сыворотки животных.

A4. Производственный способ/способ по любому из аспектов A1-A3, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц происходит из куриных эмбриональных стволовых клеток.

А5. Производственный способ/способ по любому из аспектов A1-A4, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц происходит из утиных эмбриональных стволовых клеток.

А6. Производственный способ/способ по любому из аспектов A1-A5, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц не содержит функциональных эндогенных ретровирусных или других вирусных частиц.

A7. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А6, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц происходит из вида SPF.

А8. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А7, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц выбрана из группы, состоящей из линии куриных клеток EB14, линии куриных клеток EB 0, линии куриных клеток EBv13, линии куриных клеток DL43, линии куриных клеток DL46, линии утиных клеток EB24, линии утиных клеток EB26 и линии утиных клеток EB66.

А9. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А8, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц представляет собой линию куриных клеток DL43, линию куриных клеток DL46, линию утиных клеток EB24, линию утиных клеток EB26.

A10. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А9, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц представляет собой линию куриных клеток DL43 или линию утиных клеток EB26.

A11. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А10, отличающийся тем, что указанную линию клеток выращивают в культуральной среде, которая представляет собой синтетическую среду или среду с определенным химическим составом (CD), не содержащую веществ, опасных для человека и/или животных.

A12. Производственный способ/способ по аспекту A11, отличающийся тем, что указанная синтетическая среда представляет собой среду Ex-Cell^® GRO-I и/или HYQ CDM4 Avian.

A13. Производственный способ/способ по аспекту A11, отличающийся тем, что указанная синтетическая среда или среда CD также дополнена одним или более ингредиентами, выбранными из группы, состоящей из аминокислот, нуклеотидов, витаминов, сахаридов, жирных кислот, бета-меркаптоэтанола, инсулина, глицина, холина, плюроновой кислоты F-68 и пирувата натрия.

A14. Производственный способ/способ по аспекту A13, отличающийся тем, что указанный дополнительный ингредиент представляет собой L-глутамин, используемый в концентрации от 0 до 12 или от 1 до 5 мМ, предпочтительно приблизительно 2,5 мМ.

A15. Производственный способ/способ по любому из аспектов A11-A13, отличающийся тем, что указанная культуральная среда дополнительно содержит гидролизаты растений и/или дрожжей.

A16. Производственный способ/способ по любому из аспектов A11-A15, отличающийся тем, что указанная культуральная среда не содержит никаких продуктов животного происхождения, включая сыворотку.

A17. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А16, отличающийся тем, что указанную линию клеток культивируют в условиях периодической подпитки.

A18. Производственный способ по любому из аспектов А1-А16, отличающийся тем, что указанную линию клеток культивируют в условиях перфузии.

A19. Производственный способ/способ по любому из аспектов A1-A18, отличающийся тем, что указанные клетки культивируют в биореакторе с объемом равным или более 30 литров, 50 литров, 100 литров, 1000 литров, предпочтительно 10000 литров.

A20. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А19, отличающийся тем, что указанную линию клеток культивируют при температуре приблизительно 37°C, pH 7,2, pO₂ приблизительно 50% и при скорости перемешивания приблизительно 40 об./мин или выше.

A21. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А20, отличающийся тем, что указанную линию клеток культивируют до достижения плотности клеток приблизительно 10⁷ клеток/мл.

A22. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А21, отличающийся тем, что указанную клетку культивируют до достижения плотности клеток приблизительно 10⁸ клеток/мл.

A23. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А21, отличающийся тем, что указанную линию клеток культивируют до достижения плотности клеток более 10⁸ клеток/мл.

A24. Производственный способ/способ по любому из аспектов A1-A23, отличающийся тем, что выход указанного производственного способа составляет по меньшей мере приблизительно от 0,5 до 1 г биомассы на 1 г среды.

A25. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А24, дополнительно включающий этап сбора биомассы клеток путем седиментации и декантации.

A26. Производственный способ/способ по аспекту A25, отличающийся тем, что седиментацию клеток выполняют путем добавления соли кальция к суспензии клеток.

A27. Производственный способ/способ по аспекту A26, отличающийся тем, что соль кальция представляет собой хлорид кальция, используемый в конечной концентрации от 10 до 500 мг/л, предпочтительно от 50 до 300 мг/л, более предпочтительно 50 мг/л.

A28. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А27, дополнительно включающий этап добавления к указанной биомассе клеток одного или более ингредиентов, повышающих питательную ценность указанного пищевого продукта, выбранных из группы, включающей витамины, ковитамины, минералы, незаменимые аминокислоты, незаменимые жирные кислоты, ферменты и антиоксиданты.

A29. Производственный способ/способ по любому из аспектов А1-А28, дополнительно включающий добавление к указанной биомассе клеток одного или более ароматизаторов, вкусоароматических веществ и/или красителей.

A30. Производственный способ/способ по любому из аспектов A1-A29, дополнительно включающий один или более этапов обработки пищи, выбранных из охлаждения, замораживания, отверждения, высушивания, маринования, кипячения, кулинарной обработки, запекания, жарки, копчения, 3D-печати и упаковки.

B1. Пищевой продукт, полученный с помощью производственного способа/способа по любому из аспектов А1-А30.

C1. Биомасса клеток, полученная с помощью производственного способа/способа по любому из аспектов A1-A27.

D1. Применение биомассы клеток по аспекту C1 для получения синтетического пищевого продукта для потребления человеком или животными.

B2. Пищевой продукт, содержащий или по существу состоящий из биомассы клеток по аспекту C1.

B3. Пищевой продукт по аспектам B1 или B2, дополнительно содержащий другие клетки, такие как мышечные клетки, жировые клетки или хрящевые клетки, происходящие не от человека, или их комбинации, которые выращивают in vitro вместе с указанными птичьими клетками или добавляют после сбора указанных клеток птиц.

B4. Пищевой продукт по любому из аспектов B1, B2 или B3, дополнительно содержащий дополнительные ингредиенты, повышающие питательную ценность, выбранные из группы, включающей минералы, витамины, ковитамины, незаменимые жирные кислоты, незаменимые аминокислоты, ферменты и антиоксиданты или их комбинации.

B5. Пищевой продукт по любому из аспектов B1, B2-B4, дополнительно содержащий один или более ароматизаторов, вкусоароматических веществ и/или красителей или их комбинации.

B6. Пищевой продукт по любому из аспектов B1, B2-B5, отличающийся тем, что указанный пищевой продукт переработан в любую из форм для потребления, выбранную из группы, включающей пасту, пюре, суп, пирог, порошок, гранулы, чипсы, таблетку, капсулу, спред и колбасу.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими Фигурами, Таблицами и Примерами, из которых могут быть взяты дополнительные признаки, варианты реализации и преимущества. Таким образом, обсуждаемые конкретные модификации не должны быть истолкованы как ограничения объема настоящего изобретения. Специалист в данной области техники поймет, что различные эквиваленты, изменения и модификации могут быть выполнены без отклонения от объема настоящего изобретения, и, таким образом, следует понимать, что такие эквивалентные варианты реализации должны быть включены в настоящую заявку.

В рамках настоящего изобретения

Фигура 1: Способ адаптации стволовых клеток птиц к среде CDM4 Avian перед помещением в банк клеток.

Фигура 2: Параметры размножения клеток при адаптации стволовых клеток птиц в среде CD. (A) Плотность клеток (сплошная линия) и жизнеспособность (пунктирная линия). (B) Время удвоения популяции (PDT).

Фигура 3: Восстановление клеток после размораживания. (A) Плотность клеток (сплошная линия) и жизнеспособность (пунктирная линия) после размораживания. (B) Время удвоения популяции (PDT).

Фигура 4: Кинетика размножения стволовых клеток птиц, посеянных в различных концентрациях. (A) Плотность клеток, полученная после 3 или 4 дней культивирования в среде CD с добавлением 2,5 мМ L-глутамина. (B) Процент жизнеспособности, полученный на День 3 и День 4 после посева в различных концентрациях.

Фигура 5: Способ увеличения масштаба для амплификации клеток для засева биореактора объемом 30 л.

Фигура 6: Типичные значения плотности стволовых клеток птиц, полученные во время увеличения масштаба. Плотность клеток (сплошная линия) и жизнеспособность (пунктирная линия) стволовых клеток птиц во время способа амплификации.

Фигура 7: Размножение клеток для CD-адаптированных стволовых клеток птиц в биореакторе объемом 30 л. Плотность клеток (сплошные линии) и жизнеспособность (пунктирные линии) стволовых клеток птиц во время способа амплификации в биореакторе.

Фигура 8: Бутылки объемом 1 л, содержащие клеточную суспензию, собранную из биореактора объемом 30 л.

Фигура 9: Пробирки объемом 500 мл, содержащие осадок стволовых клеток птиц, полученный в биореакторе объемом 30 л.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения установили, что мясо домашних птиц, в частности, куриное и утиное мясо, является основным источником съедобного белка. Также было установлено, что традиционные подходы к получению мяса птицы или мяса в целом неэффективны и не позволяют получать здоровый продукт в количествах, достаточных для удовлетворения быстро растущих потребностей потребителей и растущего числа потребителей мяса.

Пищевой продукт из «птицы», выращенный in vitro, может представлять собой альтернативу мясу птицы, полученному обычным способом, или добавку к пищевым продуктам. Важно отметить, что культивирование in vitro выполняют в контролируемых стерильных условиях, что позволяет получать синтетические пищевые продукты, не содержащие вредных загрязнений. Кроме того, описанные в настоящей заявке способы культивирования подходят для получения биомассы клеток в промышленных масштабах по целесообразной цене.

Таким образом, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении пищевого продукта, полученного из клеток птиц, выращенных in vitro, который можно применять в качестве замены обычного куриного или утиного мяса или любого мяса, или добавки к синтетическим мясным продуктам.

Согласно одному аспекту настоящей заявки предложен способ получения синтетического пищевого продукта, культивируемого in vitro.

Термин «синтетический пищевой продукт» относится к продукту, полученному в культуре клеток, выделенных из животных, отличных от человека, который можно применять для потребления. В настоящей заявке термин «синтетический пищевой продукт» является взаимозаменяемым с такими терминами как «мясоподобный продукт», «синтетическое мясо», «мясо in vitro», «культивированное мясо», «мясо, выращенное из клеточной культуры», «чистое мясо», «искусственное мясо» и «мясо, выращенное в лаборатории».

Под «in vitro» подразумевается, что способ осуществляют на выделенных клетках вне живого организма, в частности, на выделенных клетках, выращенных в синтетической культуральной среде.

Линия клеток птиц

Согласно одному варианту реализации способ согласно настоящему изобретению выполняют, но не исключительно, на линии клеток птиц. Термин «птичий» или «птица» относится к любому виду, подвиду или расе организма из таксономического класса «ava». Более конкретно, «птицы» относятся к любому животному из таксономического отряда Anseriformes (утка, гусь, лебедь и родственные виды), Galliformes (курица, перепела, индейка, фазан и родственные виды) и Columbiformes (голубь и родственные виды).

Согласно одному варианту реализации птица выбрана из видов, свободных от специфической патогенной микрофлоры (SPF), которые не продуцируют инфекционные эндогенные ретровирусные частицы. «Эндогенная ретровирусная частица» означает ретровирусную частицу или ретровирус, кодируемые и/или экспрессируемые провирусной последовательностью ALV-E или EAV, присутствующей в некоторых геномах клеток птиц. Например, известно, что провирусные последовательности ALV-E присутствуют в геноме домашней курицы (за исключением курицы Линии-0), банкивской джунглевой курицы и охотничьего фазана. Известно, что провирусные последовательности EAV присутствуют у всех представителей рода Gallus, который включает домашнюю курицу, курицу Линии-0, банкивскую джунглевую курицу, зеленую джунглевую курицу, серую джунглевую курицу и родственные виды (см. Resnick et al., 1990). Таким образом, предпочтительно птица выбрана из группы, включающей уток, гусей, лебедей, индеек, перепелов, японского перепела, цесарку, павлина, которые не продуцируют инфекционные эндогенные частицы ALV-E и/или EAV.

Согласно предпочтительному варианту реализации птица представляет собой курицу, в частности, курицу из рода Gallus. Например, линия курицы выбрана среди видов домашней курицы ev-0 (подвид Gallus gallus domesticus), в частности, из линий ELL-0, DE или PE11. Согласно другому предпочтительному варианту реализации курица выбрана из видов SPF, проверенных на отсутствие вируса ретикулоэндотелиоза (REV) и экзогенного вируса лейкоза птиц (ALV-A, ALV-B, ALV-C, ALV-D или ALV-J), в частности, из линии белого леггорна, наиболее предпочтительно из линии Valo.

Согласно другому предпочтительному варианту реализации птица представляет собой утку, более предпочтительно домашнюю пекинскую или московскую утку, наиболее предпочтительно пекинскую утку линии M14 или GL30.

Согласно еще одному варианту реализации линия клеток согласно настоящему изобретению происходит из плюрипотентных эмбриональных стволовых (ES) клеток птиц. Под «плюрипотентный» подразумевают, что клетки являются недифференцированными или что клетки способны давать начало нескольким разным типам клеток, например, мышечным клеткам, жировым клеткам, костным клеткам или хрящевым клеткам, но не способны развиваться в целый живой организм. Предпочтительно птичьи плюрипотентные ES-клетки получают из птичьего эмбриона (ов), в частности, на очень ранней стадии развития, например, на стадии бластулы. Более конкретно, ES-клетки выделяют из эмбриона примерно во время откладки яиц, например, перед откладкой яиц, при откладке яиц или после откладки яиц. Предпочтительно ES-клетки выделяют из эмбриона при откладке яиц. Специалист в данной области техники может определить временные рамки до откладки яиц, что позволяет собрать соответствующие клетки (см. Sellier et al., 2006; Eyal-Giladi and Kochan, 1976).

В качестве альтернативы, линия клеток птиц может происходить из тотипотентных ES-клеток, таких как клетки со стадии бластоцисты оплодотворенных яиц.

В качестве альтернативы, линия ES-клеток может быть получена из примордиальных зародышевых клеток (PGC). Например, PGC могут быть выделены из эмбриональной крови, собранной из дорсальной аорты куриного эмбриона на стадии 12-14 по классификации Гамбургера и Гамильтона (Hamburger & Hamilton, 1951). В ином случае PGC могут быть собраны из зародышевого серпа путем механической диссекции птичьего эмбриона или из гонад (см., например, Chang et al., 1992; Yasuda et al., 1992; Naito et al., 1994).

Кроме того, линия клеток птиц согласно настоящему изобретению может происходить из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) птиц.

Также в качестве альтернативы, линия клеток птиц согласно настоящему изобретению может происходить из соматических стволовых клеток птиц.

Согласно другому варианту реализации линия клеток птиц согласно настоящему изобретению может служить клетками-предшественниками для получения частично дифференцированных или дифференцированных клеток. Действительно, эти стволовые клетки являются плюрипотентными, это означает, что их можно индуцировать по нескольким путям дифференцировки, в частности, превратить в мышечные клетки или жировые клетки, или хрящевые клетки, или другие подходящие клетки.

Согласно еще одному варианту реализации линия клеток птиц представляет собой непрерывную линию клеток. Под «непрерывный» подразумевается, что клетки способны реплицироваться в культуре в течение продолжительного периода времени. Более конкретно, клетки согласно настоящему изобретению способны к пролиферации в культуре по меньшей мере 50 дней, по меньшей мере 75 дней, по меньшей мере 100 дней, по меньшей мере 125 дней, по меньшей мере 150 дней, по меньшей мере 175 дней, по меньшей мере 200 дней, по меньшей мере 250 дней или неограниченно.

Согласно еще одному варианту реализации линия клеток птиц, такая как, например, линия утиных или куриных клеток, является непрерывной и стабильной. Под «стабильный» подразумевается, что клетки имеют стабильную продолжительность клеточного цикла, обеспечивающую стабильное время удвоения популяции и контролируемую пролиферацию, стабильный фенотип (форма, размер, ультраструктура, нуклеоцитоплазматическое соотношение), стабильную оптимальную плотность при поддержании в определенных условиях, и стабильную экспрессию белков (таких как, например, теломераза) и маркеров (таких как, например, SSEA1 и EMA-1). Согласно предпочтительному варианту реализации линия клеток птиц, в частности, линия клеток EBx, имеет стабильный фенотип (форма, размер, ультраструктура, нуклеоцитоплазматическое соотношение), характеризующийся высоким нуклеоцитоплазматическим соотношением, высокой теломеразной активностью и экспрессией одного или более маркеров ES-клеток, таких как щелочная фосфатаза и эпитопы SSEA-1, EMA-1 и ENS1, и имеет стабильный клеточный цикл. Эти параметры можно измерить с помощью методик, хорошо известных в данной области техники. Например, стабильный фенотип можно измерить с помощью электронной микроскопии. Клеточный цикл можно измерить на основе мониторинга содержания ДНК с помощью проточной цитометрии с использованием совместного окрашивания бромдезоксиуридином (BrDU) и йодидом пропидия (PI). Специалист в данной области техники также может использовать другие методы.

Согласно еще одному варианту реализации линия клеток согласно настоящему изобретению является генетически стабильной, это означает, что все клетки сохраняют сходный кариотип на протяжении пассажей.

Предпочтительно птичьи ES-клетки согласно настоящему изобретению не подвергают какой-либо намеренно введенной генетической модификации для неограниченной репликации. Непрерывная линия клеток может быть получена спонтанно в соответствии с многоэтапным способом, позволяющим отбирать стабильные клетки, которые поддерживают некоторые уникальные биологические свойства ES-клеток, такие как экспрессия специфических маркеров ES-клеток (например, теломеразы, SSEA-1, EMA-1), способность к неограниченному самообновлению in vitro и долгосрочная генетическая стабильность (Olivier et al., 2010; Biswas and Hutchins, 2007).

В качестве альтернативы, постоянный клеточный фенотип может быть получен путем генетических модификаций и/или способа иммортализации. Под «иммортализацией» подразумевается, что клетки, которые в норме не могли бы неограниченно пролиферировать, из-за мутации (мутаций) избежали нормального клеточного старения и могут продолжать делиться. Мутация (мутации) может быть индуцирована намеренно, например, путем физической, химической или генетической модификации. Физическая модификация может быть достигнута с помощью УФ-, рентгеновского или гамма-излучения. Химическая модификация может быть достигнута с помощью химических мутагенов (веществ, которые повреждают ДНК). Под генетической модификацией подразумевается, что клетки можно кратковременно или стабильно трансфецировать вирусным или невирусным вектором для сверхэкспрессии генов, например, протоонкогенов, теломеразы или факторов транскрипции, таких как OCT4, Klf4, Myc, Nanog, LIN28 и т. д. Способы иммортализации клеток описаны, например, в заявках на патент: WO 2009137146 (перепелиные клетки, иммортализованные УФ-светом), WO 2005042728 (утиные клетки, иммортализованные вирусной трансфекцией) и WO 2009004016 (утиные клетки, трансфецированные невирусным вектором), которые полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.

Согласно еще одному варианту реализации линия клеток птиц согласно настоящему изобретению представляет собой неадгезивную линию клеток, это означает, что клетки могут размножаться в суспензии без какой-либо поддерживающей поверхности или матрикса. Клетки согласно настоящему изобретению могут спонтанно становиться неадгезивными во время культивирования или неадгезивность достигается путем удаления питающего слоя. Неадгезивные клетки могут пролиферировать в культуральной суспензии в течение продолжительного периода времени, пока не будут достигнуты высокие значения плотности клеток. Таким образом, они идеально подходят для крупномасштабного изготовления в биореакторах.

Кроме того, клетки согласно настоящему изобретению обладают по меньшей мере одной из следующих характеристик: большое ядро, высокое нуклеоцитоплазматическое соотношение, стабильное количество хромосом, повышенная теломеразная активность, положительная активность щелочной фосфатазы и экспрессия поверхностных эпитопов EMA1, ENS1 и SSEA-1 (ES-специфические маркеры). В качестве альтернативы, эти клетки могут быть генетически модифицированы так, чтобы продуцировать представляющее интерес вещество, например, белок, липид, фермент, витамин и т. д.

Согласно одному варианту реализации линия клеток птиц согласно настоящему изобретению получена с помощью способов, ранее описанных в WO 2003076601, WO 2005007840 или WO 2008129058, которые полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. В общих чертах, птичьи ES-клетки выделяют из эмбриона (ов) птицы примерно во время откладки яиц. Клетки культивируют в основной культуральной среде, содержащей все факторы для поддержания размножения клеток, также дополненной по меньшей мере одним, предпочтительно двумя факторами роста, такими как инсулиновый фактор роста 1 (IGF-1), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), интерлейкин 6 (IL-6), рецептор интерлейкина 6 (IL-6R), фактор стволовых клеток (SCF) и/или фактор роста фибробластов (FGF), сыворотку животных и клетки питающего слоя. После нескольких пассажей культуральную среду постепенно модифицируют путем уменьшения и/или полного удаления факторов роста, сыворотки животных и клеток питающего слоя с последующей адаптацией клеток к суспензии. Данная постепенная адаптация культивируемых клеток к основной синтетической среде приводит к получению адгезивных или неадгезивных линий клеток птиц (также называемых в настоящей заявке «EBx» или «линия (линии) клеток EBx»), которые способны пролиферировать в культуре в течение длительного времени, в частности, по меньшей мере 50 дней, по меньшей мере 250 дней, предпочтительно неограниченно. Устойчивые линии клеток EBx могут размножаться в суспензии в основной культуральной среде, не содержащей экзогенных факторов роста, сыворотки животных и клеток питающего слоя, в течение по меньшей мере 50 дней, 100 дней, 150 дней, 300 дней или 600 дней.

Более конкретно, линия клеток птиц может быть получена с помощью способа, включающего следующие этапы:

a) выделение эмбриональных стволовых клеток птиц из эмбриона (ов) на стадии развития, примерно соответствующей откладке яиц;

b) культивирование указанных клеток в основной культуральной среде, содержащей по меньшей мере один экзогенный фактор роста SCF, IGF-1, bFGF, IL-6, IL-6R и CNTF, слой питающих клеток и сыворотку животных, в течение по меньшей мере двадцати пассажей;

c) модификация указанной культуральной среды путем постепенного истощения указанных факторов роста, питающих клеток и сыворотки животных, и последующее культивирование указанных клеток по меньшей мере в течение нескольких пассажей; и

d) адаптация указанных клеток из этапа c) к суспензии,

с получением посредством этого устойчивой линии клеток, способной к пролиферации в основной культуральной среде в отсутствие экзогенных факторов роста, питающих клеток и/или сыворотки животных в течение по меньшей мере 50 дней, предпочтительно по меньшей мере 600 дней.

В качестве альтернативы, линия клеток птиц может быть получена с помощью способа, включающего следующие этапы:

a) выделение указанных эмбриональных стволовых клеток птиц из эмбриона (ов) на стадии развития, примерно соответствующей откладке яиц;

b) культивирование указанных клеток в основной культуральной среде, содержащей указанный экзогенный фактор роста IGF-1 и CNTF, слой питающих клеток и сыворотку животных, по меньшей мере в течение одного пассажа;

c) постепенное удаление указанных факторов роста из указанной культуры из этапа b) и последующее выращивание по меньшей мере в течение одного пассажа;

d) постепенное удаление указанных питающих клеток из указанной культуры из этапа c) и последующее выращивание по меньшей мере в течение одного пассажа;

e) постепенное удаление указанной сыворотки животных из указанной культуры из этапа d) и последующее выращивание по меньшей мере в течение одного пассажа; и

a) адаптация указанных клеток из этапа e) к суспензии,

с получением посредством этого устойчивой линии клеток птиц, способной к пролиферации в основной среде в отсутствие экзогенных факторов роста, питающих клеток и/или сыворотки животных в течение длительного периода времени (по меньшей мере 50 дней), предпочтительно неограниченно.

Под «пассажем» подразумевается перенос клеток, с разведением или без него, из одного культурального сосуда в другой. Этот термин является синонимом термина «субкультура». Номер пассажа представляет собой количество раз, когда клетки субкультивировали или переносили в новый сосуд. Этот термин не является синонимом времени удвоения популяции (PTD) или поколения, то есть времени, необходимого популяции клеток для однократной репликации. Например, выделенные птичьи ES-клетки из этапа а) способа, описанного выше, имеют PDT приблизительно >40 часов. Клетки устойчивой линии клеток птиц имеют PDT приблизительно <30 часов или приблизительно <20 часов. Для ES-клеток один пассаж обычно происходит каждые 3 поколения.

Под «последовательным истощением или удалением» подразумевается постепенное уменьшение любого компонента до его полного исчезновения (полного удаления) с течением времени. Для создания линии клеток согласно настоящему изобретению удаление факторов роста, сыворотки и/или питающего слоя приводит к выделению популяций стволовых клеток птиц эмбрионального происхождения, которые могут неограниченно размножаться в основных культуральных средах.

Под «адаптацией к суспензии» подразумевается адаптация клеток к размножению в качестве неадгезивных клеток без какой-либо поддерживающей поверхности, матрикса или носителя.

В соответствии с настоящим изобретением «основная культуральная среда» означает культуральную среду с составом классических сред, которая сама по себе обеспечивает по меньшей мере выживание клеток, а еще лучше размножение клеток. Предпочтительно основная среда представляет собой синтетическую среду или среду с определенным химическим составом (CD). Такая среда содержит неорганические соли (например, CaCl₂, KCl, NaCl, NaHCO₃, NaH₂PO₄, MgSO₄), аминокислоты (например, L-глутамин), витамины (например, тиамин, рибофлавин, фолиевую кислоту, D-Ca пантотенат) и необязательно другие компоненты, такие как глюкоза, сахароза, бета-меркаптоэтанол и пируват натрия. Неограничивающие примеры основных сред представляют собой среды SAFC Excell, BME (основная среда Игла), MEM (минимальная среда Игла), среду 199, DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), GMEM (среда Игла, модифицированная Глазго), DMEM-HamF12, Ham-F12 (Gibco) и Ham-F10 (Gibco), IMDM (среда Дульбекко, модифицированная Исковым), среду МакКоя 5A, RPMI 1640 и GTM3.

Согласно некоторым вариантам реализации основная синтетическая среда может быть дополнена по меньшей мере одним фактором роста, выбранным из группы, включающей IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IGF-1 и CNTF. Конечная концентрация каждого фактора роста, используемого на этапе b) способов, упомянутых выше, предпочтительно составляет приблизительно 1 нг/мл.

Кроме того, согласно некоторым вариантам реализации основная синтетическая среда может быть дополнена инсулином в концентрации от 1 до 50 мг/л, в частности, от 1 до 10 мг/л, предпочтительно приблизительно 10 мг/л.

Кроме того, согласно некоторым вариантам реализации основная синтетическая среда может быть дополнена L-глутамином (L-Gln) в концентрации от 0 до 12 мМ, предпочтительно от 1 до 5 мМ, более предпочтительно приблизительно 2,5 мМ.

Кроме того, согласно некоторым вариантам реализации основная синтетическая среда может быть дополнена одним или более ингредиентами, выбранными из группы, состоящей из аминокислот, нуклеотидов, витаминов, сахаридов, жирных кислот, бета-меркаптоэтанола, глицина, холина, плюроновой кислоты F-68 и пирувата натрия.

Кроме того, основная синтетическая среда может быть дополнена сывороткой животных (например, фетальной сывороткой теленка) в концентрации от 1% до 10%. Предпочтительно концентрация сыворотки животных на этапе b) способов, упомянутых выше, составляет приблизительно от 5 до 10%. Согласно некоторым вариантам реализации используют бессывороточную основную культуральную среду.

В качестве альтернативы сыворотке животных можно использовать белковый гидролизат неживотного происхождения в качестве дополнения к основной среде. Белковые гидролизаты неживотного происхождения выбраны из группы, состоящей из триптона бактерий, триптона дрожжей, дрожжевых или растительных гидролизатов, таких как гидролизаты сои, или их смеси. Согласно предпочтительному варианту реализации белковый гидролизат неживотного происхождения представляет собой гидролизат сои.

Для создания линии клеток птиц согласно настоящему изобретению предпочтительной основной средой является среда DMEM-HamF12, дополненная 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот, 1% витаминов, 0,16 мМ бета-меркаптоэтанола и необязательно 1x гидролизатом дрожжей.

Более подробную информацию об условиях, используемых для создания линии клеток птиц, можно найти в WO 2003076601, WO 2005007840 и WO 2008129058.

Согласно одному варианту реализации линия клеток, созданная в соответствии с описанными выше способами, представляет собой линию куриных клеток. Согласно другому варианту реализации линия клеток, созданная в соответствии с описанными выше способами, представляет собой линию утиных клеток. Линии клеток, созданные в соответствии с описанными выше способами, являются генетически стабильными, непрерывными, способны размножаться в суспензии в основной синтетической среде в отсутствие экзогенных факторов роста, питающих клеток и/или сыворотки животных. Они также проявляют устойчивую жизнеспособность и репликативную способность в условиях долгосрочного культивирования и поэтому идеально подходят для выращивания в промышленных масштабах для получения биомассы с высоким выходом, пригодной для использования в качестве пищи.

Согласно другому варианту реализации линия клеток птиц согласно настоящему изобретению выбрана, но не ограничивается указанными, из линий клеток птиц EBx, уже описанных в заявках на патент WO 2003076601, WO 2005007840 и WO 2008129058, при условии, что линия клеток имеет все характеристики, описанные выше. Соответственно, линия клеток согласно настоящему изобретению может представлять собой линию куриных клеток, в частности, неадгезивную линию куриных клеток, выбранную из группы, состоящей из линий клеток EB1, EB3, EB4, EB5, EB14, линии EB 0 и EBv13 (описанных в WO 2003076601 в WO 2005007840). Предпочтительно линия куриных клеток не содержит инфекционных эндогенных ретровирусов, как линия EB 0, или линия куриных клеток происходит из видов SPF, как EBv13, оба варианта описаны в WO 2008129058. Наиболее предпочтительно линия куриных клеток представляет собой линию клеток, происходящую из EBv13, в частности, DL43 и DL46, полученную с помощью способа по аспекту A3, описанного выше в разделе «Сущность изобретения».

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации линия клеток может представлять собой любую линию утиных клеток EBx, описанную в WO 2008129058. В частности, линия утиных клеток может быть выбрана из группы, состоящей из линий клеток EB24, EB26 и EB66, но не ограничивается указанными. Наиболее предпочтительно линия утиных клеток представляет собой EB24 (WP24) или EB26 (WP26). Названия линий клеток EB24 и WP24, а также EB26 и WP26, используемые в настоящей заявке, взаимозаменяемы. Все линии утиных клеток EBx имеют общие признаки: они происходят из утиных ES-клеток, стабильны, непрерывны, могут размножаться в суспензии высокой плотности в синтетической среде в отсутствие экзогенных факторов роста, питающих клеток и/или сыворотки животных в течение длительного периода времени или неограниченно. Важно отметить, что они не содержат провирусных последовательностей ALV-E и/или EAV в их геномах и, следовательно, не содержат ретровирусных частиц, способных к эндогенной репликации.

Согласно еще одному варианту реализации линия клеток согласно настоящему изобретению представляет собой новую линию клеток птиц, полученную с помощью одного из способов, описанных выше, при этом указанная линия клеток характеризуется тем, что она стабильна, непрерывна, не содержит никаких эндогенных или экзогенных вирусных частиц, геномных провирусных и/или канцерогенных последовательностей, способна пролиферировать в основной синтетической среде в отсутствие дополнительного фактора (ов) роста, такого как природные или синтетические гормоны или их производные, питающих клеток и/или любого дополнительного продукта животного происхождения (включая сыворотку), может размножаться в суспензии до высокой плотности клеток и продуцировать биомассу с высоким выходом.

В качестве альтернативы, линия клеток птиц может быть выбрана из любых коммерчески доступных линий клеток, включая, но не ограничиваясь указанными, линию утиных клеток AGE1.CR^®.pIX (описанную в WO 2005042728), линию клеток DuckCelt^®-T17 (описанную в WO 2009004016) и линию перепелиных клеток QOR/2E11 (описанную в WO 2009137146). В общих чертах, AGE1.CR^®.pIX представляет собой генетически модифицированную линию утиных клеток, происходящую из сетчатки или эмбриональных фибробластов, иммортализованных путем трансфекции генов аденовируса. Другая генетически модифицированная линия утиных клеток DuckCelt^®-T17 была получена из первичных эмбриональных клеток Cairina moschata путем интеграции последовательностей E1A в геном. Линия перепелиных клеток QOR/2E11 была получена из эмбрионов перепелов путем УФ-облучения в качестве адгезивной линии клеток, но также сообщалось об адаптации к размножению в суспензии (см. Kraus et al., 2011).

Линии клеток птиц согласно настоящему изобретению могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью стандартных способов, известных в данной области техники. Например, один из возможных способов характеристики и определения конкретного признака (ов) линии клеток может представлять собой секвенирование генома указанной линии клеток. После установления полного генома можно получить копию линии клеток, начав с линии клеток с очень похожей геномной последовательностью, а затем изменив последовательность путем редактирования генов, такого как метод CRISPR-Cas 9 (см. Hsu et al., 2014).

Способ получения биомассы клеток птиц

Согласно другому аспекту настоящей заявки предложен способ увеличения масштаба и получения с высоким выходом биомассы клеток, происходящей из линии клеток птиц, описанной выше. В общих чертах, этот способ включает, но не ограничивается указанными, следующие этапы: адаптацию клеток из основного или рабочего банка к клеточной культуральной среде; увеличение масштаба адаптированной клеточной субкультуры в Т-колбах или колбах Эрленмейера разного размера, посев адаптированных клеток в подходящий биореактор; культивирование суспензии адаптированных клеток птиц в синтетической культуральной среде до достижения высокой плотности клеток; и сбор биомассы клеток путем фильтрации или центрифугирования, или осаждения (седиментации и декантации), или с помощью любых способов, позволяющих отделить клетки от среды.

Также следует отметить, что варианты упомянутого выше способа, которые могут привести к продукции большой биомассы клеток, также охватываются настоящим изобретением.

Согласно настоящей заявке также предложены условия для крупномасштабного получения биомассы клеток птиц.

В частности, согласно настоящей заявке предложена клеточная культуральная среда, которая представляет собой синтетическую среду, не содержащую веществ, опасных для человека и/или животных. Более конкретно, среда может быть выбрана из группы, включающей BME (основная среда Игла), MEM (минимальная среда Игла), среду 199, DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), GMEM (среда Игла, модифицированная Глазго), DMEM-HamF12, Ham-F12, Ham-F10, IMDM (среда Дульбекко, модифицированная Исковым), среду МакКоя 5A, RPMI 1640, GTM3, Ex-Cell^® EBx^™ GRO-I, HYQ CDM4 PermAb и среду HYQ CDM4 Avian (Hyclone), L-15 (Leibovitz), OptiPRO^™ SFM и 293 SFM II или их комбинации, но не ограничивается указанными. В качестве альтернативы, культуральная среда может представлять собой новую синтетическую среду, разработанную экспериментально, например, путем комбинирования или модификации коммерческих сред. Для улучшения размножения клеток в среду могут быть добавлены дополнительные ингредиенты. Они включают аминокислоты (заменимые или незаменимые аминокислоты), в частности, L-глутамин, метионин, глутамат, аспартат, аспарагин, нуклеотиды, инсулин, витамины (например, тиамин, рибофлавин, фолиевую кислоту, пантотенат D-Ca), сахариды (например, D-глюкозу, D-сахарозу, D-галактозу или их смеси), жирные кислоты, бета-меркаптоэтанол, глицин, холин, плюроновую кислоту F-68 и пируват натрия, но не ограничиваются указанными. Конечная концентрация L-глутамина (L-Gln) в культуральной среде может использоваться в диапазоне от 0 до 12 мМ или от 0 до 10 мМ, в частности, от 1 до 5, более конкретно от 2 до 4 мМ, предпочтительно приблизительно 2,5 мМ. Конечная концентрация инсулина в среде может находиться в диапазоне от 1 до 50 мг/л, в частности, от 1 до 10 мг/л, предпочтительно приблизительно 10 мг/л.

Предпочтительно культуральная среда не содержит никаких продуктов животного происхождения, в частности, сыворотку животных. «Бессывороточная среда» (SFM) означает готовую к использованию клеточную культуральную среду, для которой не требуется сыворотка животных. Среда SFM согласно настоящему изобретению содержит ряд ингредиентов, включая аминокислоты, витамины, органические и неорганические соли, источники углеводов, при этом каждый ингредиент присутствует в количестве, которое поддерживает культивирование клетки in vitro. Эта среда не обязательно имеет определенный химический состав и может содержать гидролизаты различного происхождения, например, из растения (например, сои) или дрожжей. Согласно предпочтительному варианту реализации культуральная среда представляет собой SFM с определенным химическим составом, которая не содержит компоненты животного или человеческого происхождения («без компонентов животного происхождения»).

Предпочтительно культивирование клеток осуществляют в среде HYQ CDM4 Avian или ее комбинации, в частности, в среде HYQ CDM4 Avian с добавлением L-Gln, используемого в концентрации от 2,5 до 4 мМ.

В соответствии с другим вариантом реализации настоящего изобретения клетки выращивают в суспензии без какой-либо подложки или матрикса. В качестве альтернативы, клетки могут быть прикреплены к субстрату, прикреплены к каркасу или прикреплены к микрогранулам носителя или гелям.

В соответствии с другими вариантами реализации настоящего изобретения культивирование клеток можно выполнять в периодическом, подпитываемом, перфузионном или непрерывном режимах.

В общих чертах, культивирование с подпиткой в самом широком смысле определяется как рабочая методика в биотехнологических способах, в которой одно или более питательных веществ подают в биореактор во время культивирования и в которой продукт остается в биореакторе до конца цикла (Yamanè & Shimizu, 1984). Стратегия подпитки, как правило, используется в биопромышленных способах для достижения высокой плотности клеток в биореакторе. Чаще всего подаваемый раствор имеет высокую концентрацию, чтобы избежать разбавления в биореакторе, повышения pH и осмоляльности. Контролируемое добавление питательного вещества напрямую влияет на скорость размножения культуры и помогает избежать истощения питательных веществ, избыточного метаболизма и ограничения кислорода (Jeongseok Lee et al., 1999).

Периодическая культура с подпиткой представляет собой культуру, в которой скорость подачи ограничивающего размножение субстрата постоянна, т.е. во время культивирования скорость подачи является неизменной. Если скорость подачи ограничивающего размножение субстрата увеличивается пропорционально экспоненциальной скорости размножения клеток, экспоненциальную скорость размножения клеток можно поддерживать в течение длительного времени, это называется экспоненциальной культурой с подпиткой.

Перфузионная культура означает поддержание культуры клеток в биореакторе, при этом одновременно добавляют и удаляют эквивалентные объемы сред, в то время как клетки остаются в реакторе. Это обеспечивает стабильный источник свежих питательных веществ и постоянное удаление продуктов жизнедеятельности клеток.

Сосуд для культивирования согласно настоящему изобретению может быть выбран из взбалтываемой колбы, колбы Эрленмейера, вращающейся колбы и лопастных биореакторов или волновых биореакторов с мешалкой, но не ограничивается указанными. В частности, сосуд для культивирования может быть выбран из резервуарного биореактора с перемешиванием для периодической культуры, биореактора Wave^™, биореактора Bello^™, биореактора Mobius^®, биореактора с взбалтыванием (например, Orbshake), биореактора с системами перфузии, но не ограничивается указанными. Для увеличения масштаба получения предпочтительный сосуд для культивирования представляет собой биореактор. Объем биореактора может быть равен или более 20 литров, более 100 литров, более 1000 литров, предпочтительно до 10000 литров. В соответствии с предпочтительным вариантом реализации сосуд для культивирования представляет собой резервуарный биореактор с перемешиванием для периодической культуры, который позволяет контролировать температуру, аэрацию, pH и другие контролируемые условия и который оборудован соответствующими впускными отверстиями для введения клеток, стерильного кислорода, различных сред для культивирования и выпускными отверстиями для установки зондов, удаления клеток и сред, а также средствами для взбалтывания культуральной среды в биореакторе.

Как правило, клетки нарабатывают из флакона основного или рабочего банка клеток с помощью Т-образных колб, колб Эрленмейера, роллерных бутылок или биореакторов Wave™ различных размеров. Полученная суспензия клеток затем подается в биореактор большего размера для дальнейшего культивирования. Например, для засева биореактора объемом 30 л используется приблизительно 16 миллиардов клеток.

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения культивирование клеток осуществляют при pH 7,2 (регулируется введением CO₂ или NaOH), pO₂ на уровне 50% при скорости перемешивания 40 об/мин и температуре 37°C.

Время удвоения популяции (PDT) в культуре с подпиткой может находиться в диапазоне от 10 до 40 часов, предпочтительно от 10 до 20 часов, более предпочтительно от 10 до 15 часов, наиболее предпочтительно приблизительно (или менее) 12 часов.

Считается, что теоретическая максимальная концентрация клеток (плотность клеток), которая может быть получена для клеток животных в суспензионной культуре, составляет приблизительно от 10⁹ до 10¹¹ клеток/мл. Для многих обычных линий клеток, используемых для промышленного получения, плотность клеток находится в диапазоне от 2×10⁶ до 4×10⁶ клеток/мл, полученных в режиме с подпиткой, и до 3×10⁷ клеток/мл, полученных в режиме перфузии (см. Tapia et al., 2016).

Линия клеток птиц, используемая в способе согласно настоящему изобретению, является очень перспективной для получения в промышленных масштабах, и важен выбор подходящей линии клеток. Основным критерием отбора является способность сохранять стабильность на протяжении нескольких пассажей и безопасность для получения биомассы как можно в большем количестве в кратчайшие сроки. Например, линия клеток EB66 может достигать плотности клеток выше 1,6×10⁸ клеток/мл при культивировании в режиме перфузии (см. Nikolay et al., 2018). Как правило, плотность клеток, которая может быть получена для клеток EBx в культуре с подпиткой, находится в диапазоне от 1×10⁷ до 2×10⁷ клеток/мл. Согласно предпочтительному варианту реализации плотность культуры клеток достигает приблизительно 1×10⁷ клеток/мл или более, приблизительно 2×10⁷ клеток/мл или более, приблизительно 5×10⁷ клеток/мл или более, приблизительно 10⁸ клеток/мл или более.

Как правило, биомасса клеток находится в диапазоне от 0,5 до 1,0 мг или более на миллион клеток, предпочтительно от 0,7 до 1,0 мг или более на миллион клеток, более предпочтительно приблизительно 1 мг или более на миллион клеток. Предполагается, что валовой выход клеток, который может быть достигнут с помощью способа согласно настоящему изобретению, может превышать 10¹¹ клеток/л.

Типичный способ культивирования суспензии клеток птиц включает следующие этапы:

1) от 10 до 20 миллионов клеток, адаптированных к среде CD, содержащихся в замороженных флаконах, размораживают на водяной бане при 37°C, суспендируют приблизительно в 30 мл предварительно нагретой среды CD и помещают в инкубатор при взбалтывании на орбитальном шейкере с орбитальным радиусом 25 мм при 150 об/мин, 37°C, 7,5% CO₂ в увлажненной атмосфере (более 80%),

2) после восстановления клетки из этапа 1 субкультивируют и амплифицируют в течение 3 пассажей в более крупные колбы Эрленмейера, засеянные при концентрации приблизительно от 0,3×10⁶ до 0,5×10⁶ клеток/мл. Между каждым субкультивированием колбы Эрленмейера инкубируют при 37°C, 7,5% CO₂ и 150 об/мин в течение 3 дней.

3) после 3 пассажей клетки высевают в биореактор объемом 30 л в 20 л среды CD в объемном соотношении приблизительно 1:10; клетки культивируют в течение 3 дней при 37°C, 40 об/мин, 50% O₂ до достижения плотности клеток по меньшей мере 10⁷ клеток/мл.

4) клетки собирают путем центрифугирования при 3450 g в течение 10 мин или фильтрации, или осаждения.

Согласно одному варианту реализации осаждение клеток может быть выполнено путем добавления соли кальция к суспензии клеток. Соль кальция может быть выбрана из группы, состоящей из хлорида кальция, ацетата кальция, карбоната кальция, цитрата кальция и лактата кальция, но не ограничивается указанными. Предпочтительно используется хлорид кальция. Конечная концентрация хлорида кальция находится в диапазоне от 10 до 500 мг/л, предпочтительно от 50 до 300 мг/л, более предпочтительно составляет 50 мг/л. После добавления хлорида кальция птичьи клетки образуют большие агрегаты (скопления), которые выпадут в осадок. Хлорид кальция может быть добавлен в биореактор в конце способа амплификации клеток. В результате биомасса клеток будет осаждаться на дне контейнера, а супернатант можно будет удалить путем декантации. Если отверстия для сбора расположены в самой нижней части контейнеров, концентрированная клеточная «паста» в уменьшенном объеме может быть собрана и использована на следующих этапах биоспособа.

Пример перфузионного культивирования линии клеток птиц EBx, в частности, линии клеток EB66, в биореакторе описан в Nikolay at el., 2018. В общих чертах, биореакторы объемом 1 л работали с масштабируемыми перфузионными системами фильтрации с тангенциальным потоком на основе полых волокон (TFF) и фильтрации с переменным тангенциальным потоком (ATF).

Культивирование в перфузионном биореакторе выполняли при фиксированной специфической для клеток скорости перфузии (CSPR), рассчитанной как CSPR=D_perf/X_v, где D_perf представляет собой объем перфузируемых сред, а X_v представляет собой концентрацию жизнеспособных клеток. Значения CSPR могут значительно различаться между биоспособами и, как правило, выбраны в диапазоне 50-500 пл/клетку/сутки в зависимости от профиля питания (Konstantinov et al., 2006). В результате размножения клеток EB66 в среде с определенным химическим составом CDM4 Avian при CSPR 34 пл/клетку/сутки получили концентрацию клеток 1,6×10⁸ клеток/мл. В другом примере перфузии при культивировании линии клеток AGE1.CR.pIX^®, проводимом в ручном режиме при CSPR приблизительно 60 пл/клетку/сутки, была достигнута концентрация клеток 5,0×10⁷ клеток/мл (Vázquez-Ramírez et al., 2018).

Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения для культивирования клеток птиц и приготовления готовых пищевых продуктов, которые по существу не содержат опасных микробов, таких как бактерии, грибки, вирусы, прионы, простейшие или любая комбинация перечисленных выше, должны быть использованы асептические методики. Предпочтительно получение осуществляют в соответствии с требованиями Надлежащей производственной практики (GMP), избегая любых вредных загрязнений.

Согласно другому аспекту настоящей заявки предложена биомасса клеток, происходящая из линии клеток птиц, культивируемых in vitro. Биомасса клеток содержит или по существу состоит из клеток птиц, культивируемых in vitro. Биомасса клеток может быть получена с помощью способа, предложенного в настоящей заявке, или с помощью любого модифицированного способа. Можно рассмотреть любой способ получения, подходящий для культуры клеток птиц. Предпочтительным является культивирование клеток с высоким выходом, выполняемое в промышленном масштабе.

Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к применению линии клеток птиц и биомассы клеток, описанных выше, для получения синтетических пищевых продуктов для потребления человеком или животными.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложены синтетические пищевые продукты, происходящие из клеток птиц, выращенных in vitro, подходящие для потребления человеком или животными.

Согласно одному варианту реализации синтетический пищевой продукт согласно настоящему изобретению содержит или по существу состоит из биомассы клеток птиц, полученной в соответствии с любым из способов, описанных выше. Согласно одному конкретному варианту реализации синтетический пищевой продукт содержит или по существу состоит из биомассы клеток, происходящей из линии куриных клеток, предпочтительно линии куриных клеток, выбранной из группы, состоящей из линий клеток EB1, EB3, EB4, EB5, EB14, линии EB 0 и EBv13, DL43 и DL46, описанных выше, но не ограничивается указанными. Согласно другому конкретному варианту реализации линия клеток может быть выбрана из группы, состоящей из линий утиных клеток EB24, EB26 и EB66, но не ограничивается указанными. В качестве альтернативы, синтетический пищевой продукт может содержать или по существу состоять из биомассы клеток, происходящей из линии клеток птиц, полученной с помощью любого из способов, описанных в настоящей заявке.

Предпочтительно синтетический пищевой продукт согласно настоящему изобретению содержит или по существу состоит из биомассы клеток, полученной из линии куриных клеток DL43 или линии утиных клеток EB26 (WP26).

Согласно одному варианту реализации синтетические пищевые продукты согласно настоящему изобретению не содержат никаких дополнительных компонентов животного происхождения, таких как клетки, белки, полипептиды, ферменты, липиды, телесные жиры, ткани животных, сыворотки и т. д.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения синтетические пищевые продукты согласно настоящему изобретению могут дополнительно включать другие клетки, происходящие из любых тканей животных, такие как мышечные, жировые или хрящевые клетки, или их комбинации. Эти клетки могут представлять собой первичные соматические клетки, происходящие из любых животных, таких как млекопитающие (например, крупный рогатый скот, буйвол, кролик, свинья, овца, олень и т.д.), птицы (например, курица, утка, страус, индейка, фазан и т.д.), рыба (например, рыба-меч, лосось, тунец, морской окунь, форель, сом и т. д.), беспозвоночные (например, омар, краб, креветка, моллюски, устрица, мидии, морской еж и т. д.), рептилии (например, змея, аллигатор, черепаха и т.д.) и земноводные (например, лягушачьи лапки). В качестве альтернативы, эти клетки могут представлять собой клетки, происходящие из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток, индуцированных в дифференцированные клетки. Например, мышечные клетки могут представлять собой первичные мышечные клетки или могут происходить из плюрипотентных эмбриональных мезенхимальных стволовых клеток, дающих начало мышечным клеткам, жировым клеткам, костным клеткам и хрящевым клеткам. Примеры клеток птиц включают, но не ограничиваются указанными, линии клеток ATTC DF1 (CRL-12203, курица), QM7 (перепел), DE (утка) и куриные эмбриональные фибробласты, описанные в WO 2018011805. Эти клетки можно выращивать in vitro вместе с птичьими клетками или добавлять после сбора клеток птиц. Добавление этих клеток может улучшить вкус, аромат и/или питательные качества синтетического мяса. Например, более жирное мясо вкуснее и может улучшить вкусовые качества продукта. Соотношение мясных клеток и жировых клеток можно регулировать in vitro для получения пищевых продуктов с оптимальным вкусом и ароматом и воздействием на здоровье. Мышечные и хрящевые клетки могут улучшить текстуру (консистенцию) продукта. Примеры синтетических пищевых продуктов, содержащих мышечные и хрящевые клетки, включают куриную грудку или свиные ребра.

Согласно еще одному варианту реализации для увеличения питательной ценности синтетического пищевого продукта могут быть добавлены другие питательные вещества, такие как витамины, которые обычно отсутствуют в мясных продуктах от целых животных. Это может быть достигнуто либо путем непосредственного добавления питательных веществ в ростовую среду, либо с помощью методик генной инженерии. Например, ген или гены ферментов, ответственных за биосинтез конкретного витамина, такого как витамин D, A, или различных комплексов витаминов группы B, могут быть трансфецированы в культивируемые птичьи клетки с получением конкретного витамина. Другие питательные вещества включают, но не ограничиваются указанными, незаменимые микроэлементы, минералы, ковитамины, незаменимые жирные кислоты, незаменимые аминокислоты, ферменты, антиоксиданты и т.д.

Согласно еще одному варианту реализации способ согласно настоящему изобретению также может включать добавление ароматизатора и/или вкусоароматического вещества. Ароматизатор может быть добавлен во время этапа смешивания или может быть смешан с любым из компонентов (например, культивируемыми клетками) перед этапом смешивания. Примеры ароматизаторов, придающих вкус и восприятие органами чувств, включают искусственные подсластители, соли глутаминовой кислоты, соли глицина, соли гуаниловой кислоты, соли инозиновой кислоты, соли рибонуклеотидов и органические кислоты, включая уксусную кислоту, лимонную кислоту, яблочную кислоту, винную кислоту и полифенолы. Несколько типичных примеров обычных вкусоароматических веществ включают изоамилацетат (банан), коричный альдегид (корица), этилпропионат (фруктовый), лимонен (апельсин), этил-(E,Z)-2,4-декадиеноат (груша), аллилгексаноат (ананас), этилмальтит (сахар, сахарная вата), метилсалицилат (винтергрин (wintergreen)) и их смеси.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен усилитель цвета (краситель), который может быть добавлен к культивируемым клеткам для придания пищевому продукту более привлекательного внешнего вида. Кроме того, краситель может действовать как физиологический антиоксидант, обеспечивая посредством этого еще одно важное питательное вещество. Например, можно использовать цветные антиоксиданты, такие как некоторые флавоноиды, каротиноиды, антоцианы и т.п. из томатов, черной смородины, винограда, голубики, клюквы и т.п. Предпочтительно краситель представляет собой натуральный продукт или очищенный, или частично очищенный продукт. Например, в качестве красителя можно использовать очищенные катехины, ресвератрол, антоцианин, бета-каротины, ликопин, лютеин, зеаксантин и т.п.

Согласно еще одному варианту реализации пищевые продукты согласно настоящему изобретению можно применять для получения любого вида пищевого продукта, при этом они могут придавать вкус, текстуру и вносить вклад в содержание питательных веществ. Синтетические пищевые продукты согласно настоящему изобретению могут быть маринованными, вареными, подвергнутыми кулинарной обработке, копчеными, жареными, запеченными, высушенными или замороженными и, как правило, употребляются в пищу в качестве закуски или как часть еды. Готовые пищевые (съедобные) продукты, полученные в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, могут быть получены в виде любой из форм для потребления, включая, но не ограничиваясь указанными, суп, пюре, пасту, пирог, пеллеты, крошки, гель, порошок, гранулы, таблетку, чипсы, капсулу, спред, колбасу и тому подобное. Готовый пищевой продукт может быть приготовлен на 3D-принтере. 3D-печать пищи разрабатывается Novameat, Jet-Eat, Meatech и другими компаниями. В частности, Novameat было разработано синтетическое мясо, напечатанное на 3D-принтере, с текстурой говядины или курицы (см. https://www.novameat.com/). Для полного изучения 3D-печати пищи (см., например, Sun J. et al., 2015).

Каждый готовый пищевой продукт содержит некоторую часть культивируемых клеток птиц в качестве ключевого ингредиента, но также может содержать другие нетоксичные вещества, например, вещество растительного происхождения (включая культивируемые растительные клетки).

Наконец, следует отметить, что упомянутые выше варианты реализации используются только для иллюстрации технического решения настоящего изобретения и не ограничиваются указанными, несмотря на ссылку на варианты реализации, упомянутые выше. Конкретные варианты реализации могут быть модифицированы или эквивалентно заменены, однако эти модификации или изменения не исключаются из объема защиты формулы настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение биомассы клеток

Материал и методы

Банк клеток

В качестве исходного материала использовали банк стволовых клеток птиц (Valneva, линия утиных клеток, рабочий банк клеток GMP), приготовленный из клеток, адаптированных для размножения в бессывороточной среде Ex-Cell^® EBx^™ GRO-I (SAFC, номер по каталогу 14530C) с добавлением 2,5 мМ L-глутамина (L-Gln).

Первоначально линию клеток выделяли из бластодермы утки и адаптировали для размножения в суспензии в бессывороточной среде без каркаса или матрикса. Клетки характеризуются способностью размножаться в суспензии без носителя при 37°C в небольшом масштабе (в колбах Эрленмейера) или в большем масштабе в биореакторах. Клетки пролиферируют в виде скоплений, когда их поддерживают при постоянном взбалтывании.

Приготовление ростовой среды CD

Среда, используемая в способе, представляла собой среду с определенным химическим составом HYQ CDM4 Avian (Hyclone, номер по каталогу SH31036.02) с добавлением 2,5 или 4 мМ L-Gln (LONZA, номер по каталогу BE17-605E).

Смесь для замораживания

1,46 М раствор сахарозы готовили путем растворения 50 г порошка сахарозы (Sigma, S1888) в 100 мл стерильной воды (B Braun). Затем раствор стерильно фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм (Millipore). Смесь для замораживания содержит 20% диметилсульфоксида (ДМСО) (Sigma, D2438) и 0,2 М сахарозы, разведенной в свежей среде CD с добавлением 2,5 мМ L-Gln. Эту смесь для замораживания готовили для немедленного применения и перед использованием помещали на 4°C.

Размораживание банка клеток и адаптация к среде CD перед замораживанием

Размораживание клеток выполняли как можно быстрее, помещая криопробирку в водяную баню при 37°C. Затем клетки разводили в 30 мл предварительно нагретой ростовой среды CD с добавлением 2,5 мМ L-Gln. Количество и жизнеспособность клеток оценивали в аликвоте клеток с помощью счетчика клеток на основе метода исключения трипана (VI-Cell XR, Beckman Coulter). Для удаления среды для замораживания применяли центрифугирование клеток при 1200 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования осадок клеток ресуспендировали в полной ростовой среде с получением конечной концентрации для посева, содержащей от 0,5 до 1,5×10⁶ клеток/мл, и суспензию клеток переносили в колбу Эрленмейера объемом 125 мл. Клетки культивировали при 37°C и 7,5% CO₂ при влажности приблизительно 90% (инкубатор Thermo, модель 311, класс Hepa 100) при постоянном взбалтывании при 125 об/мин (взбалтыватель IKA, номер по каталогу KS260).

После оживления культуру клеток ежедневно проверяли с помощью наблюдения под микроскопом. В течение этого периода после размораживания клетки регулярно подсчитывали для оценки восстановления клеток. Свежую ростовую среду CD добавляли на день 2 и день 3, чтобы избежать чрезмерной плотности. На день 4 клетки высевали в колбу Эрленмейера объемом 250 мл при 0,3×10⁶ клеток/мл в 60 мл ростовой среды CD. Скорость взбалтывания увеличивали до 135 об/мин.

Для амплификации клетки высевали при 0,3×10⁶ клеток/мл в колбы Эрленмейера объемом 500 мл и 1 л в соответствии с рекомендацией поставщика.

Замораживание основного банка клеток (MCB)

Клетки, адаптированные к среде CD, собирали в экспоненциальной фазе размножения в пробирки объемом 500 мл с помощью центрифугирования при 1200 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования осадок клеток разводили в истощенной среде при 40×10⁶ клеток/мл и по каплям добавляли эквивалентный объем холодной смеси для замораживания, чтобы в результате получить суспензию клеток при 20×10⁶ клеток/мл. Наконец, среда для криоконсервации состояла из ДМСО (10%) (Sigma, номер по каталогу D2438-50mL), 0,1 М сахарозы (6,5%) (Sigma, номер по каталогу S188), 50% истощенной среды CD, извлеченной из культуры, и 33,5% свежей среды CD с добавлением 2,5 мМ L-Gln. Криопробирки (Corning, номер по каталогу 430488) заполняли 1 мл смеси для замораживания клеток и помещали при -80°C в контейнер для замораживания (Nalgene, Mr. Frosty^™) перед переносом в жидкий азот (-196°C) для долгосрочного хранения.

Размораживание и культивирование линии клеток, адаптированной к среде CD

Криопробирки, содержащие клетки, адаптированные для размножения в среде CD, размораживали в колбе Эрленмейера объемом 125 мл в 15 мл свежей среды CD и помещали в шейкер-инкубатор (Kuhner, номер по каталогу ISF1-XC) при скорости взбалтывания 150 об/мин, 7,5% CO₂ и 80% влажности. После добавления 15 мл и 20 мл среды в день 1 и день 2, соответственно, клетки субкультивировали на день 3 для последующего этапа амплификации.

Культивирование в малых масштабах

После размораживания клетки выращивали в колбах Эрленмейера объемом от 250 мл до 3 л (Corning, номер по каталогу 431144, 431147 и 431253), поддерживаемых при постоянном взбалтывании (150 об./мин (для колб Эрленмейера объемом 250, 500 или 1 л) или 80 об./мин (колбы Эрленмейера объемом 3 л) при орбитальным радиусе 25 мм) на шейкере-инкубаторе (Kuhner, номер по каталогу ISF1-XC) при 37°C, 80% влажности и 7,5% CO₂. Клетки высевали при 0,3×10⁶ клеток/мл и субкультивировали каждые 3 дня. Посев выполняли, соответственно, в 60 мл, 400 мл или 1 л в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, 1 л или 3 л.

Кинетика размножения

Клетки высевали в колбы Эрленмейера объемом 250 мл из расчета от 0,1 до 0,5×10⁶ клеток/мл в 100 мл среды CD с добавлением 2,5 мМ L-Gln. После переноса ежедневно подсчитывали количество клеток для проверки концентрации и жизнеспособности клеток после посева.

Параметры, используемые для крупномасштабного получения в резервуарном биореакторе объемом 30 л с перемешиванием

После амплификации в колбах Эрленмейера объемом 3 л клетки высевали при 0,8×10⁶ клеток/мл в 20 л предварительно нагретой среды в биореакторе объемом 30 л из нержавеющей стали (Applikon, номер по каталогу ADI 1075). Контроль инкубации был установлен, как описано ниже: pH 7,2, регулируемое введением CO₂ или NaOH, заданное значение O₂ 50%, скорость перемешивания 40 об./мин и температура 37°C. Во время культивирования клеток ежедневно контролировали потребление источников углерода (глюкозы, глутамата и глутамина) и высвобождение побочных продуктов метаболизма (лактата и аммония) (анализатор Bioprofile Flex, Nova Biomedical).

Сбор клеток и приготовление осадка

Через три дня после посева клетки собирали из биореактора в бутылки объемом 1 л и подвергали центрифугированию при 3450 g в течение 10 минут (Beckman Coulter, номер по каталогу AVANTI JXN-26/ротор JL-8.1000). После удаления истощенной среды клетки ресуспендировали в 1× фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (LONZA, номер по каталогу BE17-516F) для промывания и переносили в пробирки объемом 500 мл для второго цикла центрифугирования при 3450 g (4000 об/мин) в течение 10 минут (ThermoFisher Scientific, номер по каталогу Sorvall ST40). После удаления буфера пробирки объемом 500 мл, содержащие сухие осадки, взвешивали (весы: Denver, номер по каталогу SI 4002) и помещали при -80°C (Sanyo, номер по каталогу MDF-U73V) для хранения. Массу осадка клеток рассчитывали путем вычитания массы пробирки объемом 500 мл из общей массы (пробирка объемом 500 мл + осадок клеток).

Результаты

Адаптация стволовых клеток птиц к среде с определенным химическим составом

Первым этапом способа было изготовление банка стволовых клеток птиц, адаптированных к размножению в среде с определенным химическим составом HYQ CDM4 Avian.

Цель этого этапа заключалась в приготовлении уникального источника клеток:

- чтобы избежать нескольких адаптаций;

- чтобы обеспечить возможную валидацию/выпуск основного банка клеток;

- чтобы использовать один и тот же исходный материал для нескольких партий продукции;

- чтобы сократить сроки, отведенные для видов биопродукции с определенным химическим составом;

- чтобы минимизировать изменчивость между партиями.

Адаптация клеток и приготовление банка клеток

Чтобы избежать адаптации стволовых клеток к среде CD для каждого производственного цикла, проводили однократную адаптацию и готовили рабочий банк из 165 флаконов, как описано ниже и показано на Фигуре 1.

Одну криопробирку стволовых клеток птиц, первоначально выращенных в Ex-cell GRO-I SFM, размораживали непосредственно в 30 мл среды CDM4 Avian CD с добавлением 2,5 мМ L-Gln. После центрифугирования выделяли 7,2×10⁶ клеток и высевали в 12 мл среды в концентрации 0,6×10⁶ клеток/мл в колбу Эрленмейера объемом 125 мл. Клетки помещали в инкубатор на шейкер при 125 об/мин. На день 2 и день 3 после размораживания добавляли, соответственно, 8 мл и 15 мл среды CD. На день 4 отбирали аликвоту для подсчета клеток, и клетки собирали путем центрифугирования. Осадок клеток ресуспендировали в свежей среде CD; затем одну колбу Эрленмейера объемом 250 мл засевали при концентрации 0,3×10⁶ клеток/мл в 60 мл и инкубировали с взбалтыванием при 135 +/- 15 об/мин. Следующие два пассажа выполняли следующим образом: на день 7 или день 10 клетки собирали и переносили в 3 новые колбы Эрленмейера объемом 500 мл или колбы Эрленмейера объемом 3 л, разводили до 0,3×10⁶ клеток/мл в 200 мл или 1 л среды CD, соответственно. На день 13 из колб Эрленмейера объемом 3 л собрали приблизительно 11 миллиардов клеток. Конечная концентрация клеток составила 9,1×10⁶ клеток/мл, а жизнеспособность 91%.

Непосредственная адаптация в среде HYQ CDM4 Avian была очень эффективной; через 10 дней после размораживания в среде CD клетки восстанавливались с ожидаемой плотностью 5×10⁶ клеток/мл и хорошей жизнеспособностью (более 80%) (см. Фигуру 2A). Как следствие, быстро достигнутое время удвоения популяции (PDT) находилось в ожидаемом диапазоне от 15 до 16 часов (см. Фигуру 2B). В отношении морфологии клетки сохраняли их способность размножаться в суспензии в виде скоплений из десятка клеток, которые можно было легко ресуспендировать с помощью пипетки. На день 13 концентрация клеток достигла 9,1×10⁶ клеток/мл, а жизнеспособность клеток составила 91%. Это позволило создать банк клеток из 165 флаконов (банк 5777). Таким образом, всего четырех пассажей и 13 дней было достаточно для адаптации стволовых клеток птиц в среде HYQ CDM4 Avian CD, чтобы приготовить основной банк клеток высокого качества.

Валидация банков клеток

Чтобы гарантировать качество банка стволовых клеток птиц после адаптации к CD, банк клеток размораживали и контролировали устойчивость клеток, их жизнеспособность и стабильность плотности клеток и PDT по пассажам.

Для проверки устойчивости и стабильности клеток банк 5777 размораживали и поддерживали в культуре в течение четырех дополнительных пассажей. Как проиллюстрировано на Фигуре 3, немедленно после размораживания жизнеспособность банка была очень хорошей и достигла 91%. Этап замораживания не был ассоциирован с потерей клеток, так как общее количество клеток, внесенных во флаконы, было полностью восстановлено. После 3 дней инкубации плотность клеток достигла приблизительно 5×10⁶ клеток/мл, что указывает на быструю пролиферацию клеток. Для следующих пассажей концентрация выше 6×10⁶ клеток/мл подтвердила хорошее качество банка клеток.

Кинетика размножения

Чтобы определить оптимальную плотность, которая потенциально может быть достигнута при использовании адаптированных стволовых клеток птиц, колбы Эрленмейера объемом 250 мл засевали при различных концентрациях, помещали на инкубацию и ежедневно проверяли плотность и жизнеспособность клеток. На Фигуре 4А показана плотность клеток, полученная после 3 и 4 дней культивирования; на Фигуре 4B показана соответствующая жизнеспособность клеток. Данные демонстрируют, что увеличение плотности посева до 0,4×10⁶ клеток/мл не улучшило оптимальную концентрацию клеток после 4 дней культивирования. Во всех условиях с посевом более 0,2×10⁶ клеток/мл жизнеспособность имела тенденцию к небольшому снижению на 4 день. В отношении жизнеспособности и концентрации клеток хорошим компромиссом для достижения оптимальной плотности с хорошей жизнеспособностью в колбе Эрленмейера объемом 250 мл будет посев клеток в количестве от 0,3 до 0,4×10⁶ клеток/мл.

Увеличение масштаба для засева биореактора объемом 30 л

Чтобы получить биомассу клеток, необходимую для засева биореактора объемом 30 л, мы разморозили банк адаптированных стволовых клеток птиц 5777 и амплифицировали клетки в соответствии со способом увеличения масштаба, выполняемым в колбах Эрленмейера.

Для получения готовой биомассы клеток птиц in vitro использовали биореактор из нержавеющей стали объемом 30 л. Для засева биореактора объемом 30 л потребовалось 16 миллиардов клеток с 20 л клеточной суспензии при концентрации 0,8×10⁶ клеток/мл. Благодаря свойству стволовых клеток птиц размножаться при высокой плотности клеток методика увеличения масштаба не была трудоемкой, поскольку необходимое количество клеток было получено уже с 2 л суспензии. На Фигуре 5 проиллюстрирован типичный способ быстрой амплификации клеток для засева биореактора.

На Фигуре 6 показаны значения плотности клеток, полученные при каждом пассаже в способе увеличения масштаба. На последнем этапе амплификации достигнутая концентрация клеток составила 10,3×10⁶ клеток/мл, что позволило собрать в общей сложности 20,6 миллиарда клеток.

Периодическое выращивание клеток в биореакторе объемом 30 л

Клетки, собранные из обеих колб Эрленмейера объемом 3 л, высевали в биореактор объемом 30 л при концентрации 0,8×10⁶ клеток/мл в 20 литров предварительно нагретой среды CD с добавлением 4 мМ L-Gln. Заданные значения для регуляции pH и кислорода были скорректированы до 7,2 и 50%, соответственно, а скорость взбалтывания составляла 40 об/мин. Ни глюкозу, ни глутамин не корректировали, поскольку способ осуществляли периодическим методом. Во время культивирования клеток ежедневно контролировали потребление источников углерода (глюкозы, глутамата и глутамина) и высвобождение побочных продуктов метаболизма (лактата и аммония) (анализатор Bioprofile Flex, Nova Biomedical).

Провели три цикла с использованием параметров, описанных ранее. На Фигуре 7 проиллюстрировано размножение и жизнеспособность клеток в течение 3 дней получения. После посева не наблюдали лаг-фазу, и пролиферация клеток была очень быстрой, о чем свидетельствует короткое время удвоения популяции (менее 12 часов) между посевом и днем 1 (см. Табл. 1). На день 3 мы наблюдали увеличение PDT (более 35 часов), что демонстрирует замедление пролиферации в сочетании со снижением жизнеспособности.

Таблица 1. Наблюдение за временем удвоения популяции после посева в биореактор объемом 30 л

(A) Время удвоения популяции (в часах); (B) плотность жизнеспособных клеток (в ×10⁶ клеток/мл); (C) жизнеспособность (в %) во время получения клеток.

A

° Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 День 1 12 11,4 9,6 День 2 14,7 13,1 13,7 День 3 35,3 108,2 48,9

B

° Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 День 1 2,7 2,4 3,1 День 2 7,7 10 8,9 День 3 12,5 11,5 12,7

C

° Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 День 1 98 97,4 98 День 2 97,4 97,5 98,4 День 3 88,7 86,3 87,5

На основании среднего значения более высокой концентрации клеток, полученного для трех циклов, и соответствующей жизнеспособности, был сделан вывод, что оптимальная плотность была достигнута между днем 2 и днем 3 с приблизительной концентрацией 14×10⁶ общего количества клеток/мл.

Исследования метаболитов, проведенные во время трех циклов, продемонстрировали высокое потребление глутамина, глутамата и глюкозы (данные не показаны).

Сбор клеток

Центрифугирование

После 3 дней размножения клеток в биореакторе птичьи клетки собирали в бутылки объемом 1 л (см. Фигуру 8) путем центрифугирования на высокой скорости (3450 g), промывали в ФСБ, переносили в пробирки объемом 500 мл и осаждали с помощью второго цикла центрифугирования (см. Фигуру 9).

Осадки взвешивали после последнего цикла центрифугирования. Соответственно, в результате цикла 1, цикла 2 и цикла 3 получили 304 г, 282 г и 281 г, это свидетельствует о воспроизводимости способа в отношении получения биомассы. Наконец, осадок замораживали при -80°C для хранения.

Седиментация и декантация

Сбор биомассы клеток с помощью центрифугирования представляет собой трудоемкий способ, и без системы охлаждения после нескольких циклов центрифугирования может наблюдаться повышение температуры, что влечет за собой риск изменения биологического материала. Таким образом, полагали, что этап декантации перед центрифугированием (или фильтрацией) уменьшит объем суспензии.

Поскольку клетки EBx размножаются в виде небольших агрегатов, исследовали условия, индуцирующие образование скоплений клеток, чтобы способствовать седиментации клеток. Добавление в среду хлорида кальция вызывает образование скоплений клеток. Поскольку утиные и куриные клетки не чувствительны к одному и тому же диапазону концентраций кальция, тестировали различные условия. К суспензиям куриных или утиных клеток в конце экспоненциальной фазы добавляли 50, 100, 150, 200 или 300 мг/л хлорида кальция и инкубировали от 2 до 6 часов при 37°C при взбалтывании. Для линий клеток EBx агрегацию наблюдали уже после двух часов инкубации. Самые большие скопления получили при использовании самых высоких концентраций кальция. Было замечено, что размер скоплений последовательно увеличивался с повышением концентрации кальция. Образование скоплений клеток более выражено для утиных клеток, поскольку почти все клетки агрегируют после 2 часов инкубации в присутствии 50 мг/мл хлорида кальция.

Для более точной оценки процента популяции клеток, осевших на дне пробирок после 6 часов инкубации с хлоридом кальция и 20 минут отстаивания, подсчитывали остаточные клетки в супернатантах. Полученные данные обобщены в табл. 2 и 3. Было обнаружено, что 42,8% суспензии куриных клеток могут оседать в течение 20 минут без добавления кальция. Обработка в течение 6 часов улучшает этот процент седиментации с максимальным значением 75,5%, которое достигается при самой высокой протестированной дозе хлорида кальция (300 мг/л). Для утиных клеток не наблюдали очевидной седиментации через 20 минут без кальция, но добавления 50 мг/л хлорида кальция было достаточно для осаждения 95% биомассы клеток.

Аналогичным образом, этап седиментации клеток может быть применен к биореакторам в конце способа амплификации клеток. В результате биомасса клеток будет осаждаться на дне контейнера. Если отверстия для сбора расположены в самой нижней части контейнеров, концентрированная клеточная «паста» в уменьшенном объеме может быть собрана и использована на следующих этапах биоспособа.

Таблица 2. Влияние хлорида кальция на седиментацию куриных клеток

Линия куриных клеток Время седиментации (минуты) 0 20 Концентрация CaCl₂ (мг/л) 0 0 100 200 300 Общая плотность клеток в супернатанте (×10⁶ клеток/мл) 8,2 4,7 2,3 2,1 2,0 Процент седиментации (%) 0 42,8 71,8 74,0 75,5

Таблица 3. Влияние хлорида кальция на седиментацию утиных клеток

Линия утиных клеток Время седиментации (минуты) 0 20 Концентрация CaCl₂ (мг/л) 0 0 50 100 150 Общая плотность клеток в супернатанте (×10⁶ клеток/мл) 17,0 16,9 0,8 0,5 0,5 Процент седиментации (%) 0 0,9 95,4 97,0 97,2

Другие соли кальция, такие как ацетат кальция, карбонат кальция, цитрат кальция и лактат кальция или подобные, могут рассматриваться в качестве альтернативы.

Выход продукции

В ходе цикла 1, цикла 2 и цикла 3 получили, соответственно, 304 г, 282 г и 281 г стволовых клеток птиц. Таким образом, на основании количества клеток, собранных из биореакторов (см. Табл. 2), продуктивность биомассы (общая масса, деленная на общее количество собранных клеток) составила 1,18 +/- 0,07 мг на миллион клеток. Поскольку для функционирования 20 л биореактора необходимо 385,6 г порошка среды, выход продукции составил приблизительно 0,75 г биомассы на 1 г порошка среды.

Таблица 4. Выходы продукции и продуктивность

° Цикл 1 Цикл 2 Цикл 3 Среднее Плотность на день 3 (×10⁶ клеток/мл) 12,5 11,5 12,7 12,3 Общее количество собранных клеток (×10⁹ клеток) 250 230 254 245 Масса биомассы (г) 304 282 281 289 мг клеток/×10⁶ клеток 1,22 1,23 1,1 1,18 Соотношение (г биомассы/г порошка среды) 0,79 0,73 0,73 0,75

Таким образом, на основании данных, полученных во время исследования кинетики в колбах Эрленмейера и потребления метаболитов, улучшение выхода продукта может быть достигнуто с помощью:

- модификации начального посева клеток, чтобы продлить размножение клеток после дня 3;

- пополнения среды CD, чтобы избежать истощения;

- применения способа с подпиткой или перфузионного способа.

Список литературы:

Biswas and Hutchins. 2007. “Embryonic Stem Cells.” Stem cells and Development 16: 213-221.

Chang et al., 1992. “Simple method for isolation of primordial germ cells from chick embryos.” Cell Biol Int. Reports 16(9): 853-857.

Eyal-Giladi and Kochan, 1976. “From cleavage to primitive steak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick.” Developmental Biology 49: 321-337.

Galbraith H. 2002. “Hormones in international meat production: biological, sociological and consumer issues.” Nutrition Research Reviews 15: 293-314.

GEAS. October 2012. “Growing greenhouse gas emissions due to meat production.”

Greger M. 2007. “The human/animal interface: emergence and resurgence of zoonotic infection diseases”. Critical Reviews in Microbiology 33: 243-299.

Hamburger V. and Hamilton H. 1951. “A series of normal stages in the development of the chick embryo”.

Hedenus F., Wirsenius D. and Johansson J.A. 2014. “The importance of reduced meat and dairy comsimption for meeting stringent climate change targets”. Climatic Change 124: 79-91.

Hsu P., Lander E.S., and Zhang F. 2014. “Development and application of CRISPR_Cas9 for genome engineering”. Cell 157, June 5:1262-1278.

Jeong SH. et al., 2010. “Risk assessment of growth hormones and antimicrobial residues in meat:” Toxicol. Res. 26(4): 301.313.

Jeongseok Lee et al. 1999. “Control of fed-batch fermentations.” Biotechnol Adv 17: 29-48.

Kadim I.T. et al. 2015. “Cultured meat from muscle stem cells: a review of challenges and prospects.” J. Integrative Agriculture 14(2): 222-233.

Konstantinov K. et al. 2006. “The “push-to-low” approach for optimization of high-density perfusion cultures of animal cells.” Adv Biochem Engin Biotechnol 101: 75-98.

Kraus B. et al. 2011. “Avian cell line - technology for large scale vaccine production.” BMC Proceedings 5(suppl 8):52.

Mekonnen and Hoekstra. “The green, blue and gray water footprint of farm animals and animal products.” UNESCO-IHE, Research Report Series No. 48. December 2010.

Naito M. et al. 1994. “Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells.” Molecule Reproduction and Development 39: 153-161.

Nikolay A. et al. 2018. “Process intensification of EB66 cell cultivations leads to high-yield yellow fever and Zika virus production.” Applied Microbiol Biotechnol 102: 8725-8737.

Olivier S. et al. 2010. “EB66 cell line, a duck embryonic stem cell-derived substrate for the industrial production of therapeutic monoclonal antoibodies with enhanced ADCC activity.” MAbs 2(4): 405-15.

Opio C., Gerber P., Falcucci A., et al., 2013. “Greenhouse gas emissions from ruminant supply chains.

A global life cycle assessment.” Report prepared by Food and Agriculture organization of the United Nations (FAO), Rome.

Resnick R. et al. 1990. “Phylogenetic Distribution of the Novel Avian Endogenous Provirus Family EAV-0.” L Virology 64(10): 4640:4653.

Ritchie and Roser. 2018. “Meat and Seafood Production & Consumption.”

Sellier N., Brillard J-P and Bakst M.R. 2006. “Comparative staging of embryo development in chicken, turkey, duck, goose, Guinea fowl, and Japanese quail assessed from five hours after fertilization through seventy-two hours of incubation.” J Appl Poult Res 15: 219-228.

Sun J. et al. 2015. “A Review on 3D Printing for Customized Food Fabrication”, Procedia Manufacturing 1: 308-319.

Tapia F. et al. 2016. “Bioreactors for high cell density and continuous multi-stage

cultivations: options for process intensification in cell culture-based viral vaccine production.” Appl Microbiol Biotechnol 100: 2121-2132.

Tuomisto H, Ellis M.J. and Haastrup P. “Environmental impacts of cultured meat:

alternative production scenarios.” Proceedings of the 9th International Conference on Life Cycle Assessment in the Agri-Food Sector. 2014

Vázquez-Ramírez D. et al. 2018. “High-cell-density cultivations to increase MVA virus production.” Vaccine 36: 3124-3133.

Yamanè & Shimizu. 1984. “Fed-batch Techniques in Microbial Processes.” Advances in Biochem Eng. Biotechnol 30: 147-194.

Yasuda Y. et al. “A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells.” J Reprod. Fert. 96: 521-528. 1992.

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности. Предложен синтетический пищевой продукт, который содержит или по существу состоит из биомассы клеток из клеток птиц, выращенных in vitro в бессывороточной культуральной среде с определенным химическим составом в контролируемых условиях. Пищевой продукт по настоящему изобретению предлагает новый подход к получению мяса и/или мясоподобных продуктов и не содержит каких-либо опасных загрязнений. 13 з.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл., 1 пр.

1. Синтетический пищевой продукт, содержащий или по существу состоящий из биомассы клеток птиц, содержащий до 10¹⁵ клеток, полученный способом, включающим культивирование непрерывной и стабильной линии клеток птиц в суспензии, причем указанная линия клеток птиц i) происходит из эмбриональных стволовых клеток птиц, ii) способна к пролиферации в основной культуральной среде в отсутствии экзогенных факторов роста, питающих клеток и/или сыворотки животных, и iii) способна непрерывно размножаться в суспензии, причем указанная линия клеток птиц происходит из куриных эмбриональных стволовых клеток или утиных эмбриональных стволовых клеток.

2. Синтетический пищевой продукт по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает этап сбора биомассы клеток путем седиментации и декантации, при этом седиментацию клеток выполняют путем добавления соли кальция к суспензии клеток, где, в частности, соль кальция представляет собой хлорид кальция, используемый в конечной концентрации от 10 до 500 мг/л, предпочтительно от 50 до 300 мг/л, более предпочтительно 50 мг/л.

3. Синтетический пищевой продукт по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает этап обработки пищи, в частности 3D-печать.

4. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащий другие клетки, такие как мышечные клетки, жировые клетки или хрящевые клетки, происходящие не от человека, или их комбинации, которые выращивают in vitro вместе с указанными клетками птиц или добавляют после сбора указанных клеток птиц.

5. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-4, дополнительно содержащий дополнительные ингредиенты, повышающие питательную ценность, выбранные из группы, включающей минералы, витамины, ковитамины, незаменимые жирные кислоты, незаменимые аминокислоты, ферменты и антиоксиданты или их комбинации.

6. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-5, дополнительно содержащий один или более ароматизаторов, вкусоароматических веществ и/или красителей или их комбинации.

7. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанный пищевой продукт переработан в любую из форм для употребления, выбранную из группы, включающей пасту, пюре, суп, пирог, порошок, гранулы, чипсы, таблетку, капсулу, спред и колбасу.

8. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанная линия клеток птиц не содержит функциональных эндогенных ретровирусов или других вирусных частиц.

9. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что (i) указанная линия клеток птиц происходит из вида SPF, или (ii) указанная линия клеток птиц выбрана из группы, состоящей из линии куриных клеток EB14, линии куриных клеток EB 0, линии куриных клеток EBv13, линии куриных клеток DL43, линии куриных клеток DL46, линии утиных клеток EB24, линии утиных клеток EB26 и линии утиных клеток EB66, в частности указанная линия клеток птиц выбрана из группы, состоящей из линии куриных клеток DL43, линии куриных клеток DL46, линии утиных клеток EB24 и линии утиных клеток EB26, таких как линия куриных клеток DL43 или линия утиных клеток EB26.

10. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что указанную линию клеток культивируют в биореакторе с объемом, равным или большим, чем 30 литров, 50 литров, 100 литров, 1000 литров, предпочтительно 10000 литров.

11. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что указанную линию клеток культивируют при температуре приблизительно 37°C, pH 7,2, pO₂ приблизительно 50% и при скорости перемешивания приблизительно 40 об/мин или выше.

12. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанную линию клеток культивируют до достижения плотности клеток приблизительно 10⁷ клеток/мл, в частности приблизительно 10⁸ клеток/мл, в частности более 10⁸ клеток/мл.

13. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что выход указанного способа составляет по меньшей мере приблизительно от 0,5 до 1 г биомассы на 1 г среды.

14. Синтетический пищевой продукт по любому из пп. 1-13, дополнительно включающий один или более этапов обработки пищи, выбранных из охлаждения, замораживания, отверждения, высушивания, маринования, кипячения, кулинарной обработки, запекания, жарки, копчения и упаковки.