Способ получения биомассы, содержащей белок и омега-3 жирные кислоты, из одной микроводоросли и полученная посредством этого биомасса Российский патент 2025 года по МПК C12N1/12 C12P7/64 C12R1/89 

Настоящая заявка относится к способу получения биомассы, содержащей белок и омега-3 жирные кислоты, из одной микроводоросли и к биомассе, полученной посредством этого.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ненасыщенные жирные кислоты представляют собой жирные кислоты, имеющие одну или более чем одну двойную связь в жирнокислотной цепи, и, когда жирные кислоты включают две или более чем две двойные связи, они называются полиненасыщенным жирными кислотами (PUFA). Среди них докозагексановая кислота (DHA) и эйкозапентановая кислота (ЕРА) представляют собой типичные омега-3 жирные кислоты, которые являются незаменимыми жирными кислотами для тканей мозга, глаза и нервной системы. Кроме того, известно, что они играют важную роль в развитии нервной системы, как, например, остроты зрения и возможностей моторных нейронов младенцев, и в предупреждении сердечно-сосудистого заболевания и являются самыми многочисленными компонентами в структурных липидах мозга.

С точки зрения промышленного производства главным источником поставки полиненасыщенных жирных кислот, таких как омега-3 жирные кислоты, является рыбий жир, выделенный из жира синей рыбы, а рыбная мука также широко используется в качестве источника белков в пищевых продуктах или кормах. Однако из-за трудностей в непрерывной поставке рыбьего жира и рыбной муки, таких как ограниченный отлов и т.д., имеется потребность в разработке альтернативного источника омега-3 жирных кислот и белков, которые могут заменять рыбий жир и рыбную муку.

С недавнего времени проводятся исследования по продуцированию полиненасыщенных жирных кислот культурой микроводорослей. Однако, поскольку данные исследования сосредоточены на исследовании, нацеленном на продуцирование масел, таких как жирные кислоты, исследования в отношении способа, способного продуцировать высокое содержание белков из микроводорослей, являются недостаточными. Соответственно, авторы настоящего изобретения осуществили настоящее раскрытие посредством разработки способа получения биомассы, содержащей омега-3 жирные кислоты и имеющей высокое содержание белков, из одной микроводоросли.

Документы предшествующего уровня техники

Патентные документы

(Патентный документ 1) Публикация патента США № US 2016/0208297 А1

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Задачей настоящего раскрытия является предложение способа получения биомассы, происходящей из микроводоросли Thraustochytrid, включающего культивирование в среде одного штамма микроводоросли Thraustochytrid; непрерывную подачу источника азота в течение указанного культивирования, а также биомассы, происходящей из одной микроводоросли Thraustochytrid, которая получена данным способом.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Каждое описание и воплощение, раскрытое в настоящей заявке, также можно применять к любому другому описанию и воплощению. Другими словами, все комбинации разных элементов, раскрытых в настоящей заявке, попадают в пределы объема настоящей заявки. Кроме того, объем настоящей заявки не следует истолковывать как ограниченный конкретным описанием, раскрытым ниже. Кроме того, специалисты в данной области признают и подтвердят многие эквиваленты конкретных аспектов настоящей заявки, описанные в настоящей заявке, используя лишь обычный эксперимент. Кроме того, подразумевается то, что такие эквиваленты содержатся в настоящей заявке.

В одном аспекте согласно настоящей заявке предложен способ получения биомассы, происходящей из микроводоросли Thraustochytrid, включающий культивирование в среде одного штамма микроводоросли Thraustochytrid; и непрерывную подачу источника азота в течение указанного культивирования.

Термин «Thraustochytrid» в том виде, как он здесь используется, относится к микроводорослям, принадлежащим к порядку Thraustochytriales. Микроводоросли Thraustochytrid могут представлять собой микроводоросли, принадлежащие к Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Aurantiochytrium sp. или Thraustochytriidae sp.

Термин «Thraustochytrium sp.», «Schizochytrium sp.», «Aurantiochytrium sp.» или «Thraustochytriidae sp.» в том виде, как он здесь используется, относится к одному роду, принадлежащему к порядку Thraustochytriales, семейству Thraustochytriaceae, и может использоваться взаимозаменяемо с термином «род Thraustochytrium», «род Schizochytrium», «род Aurantiochytrium» или «род Thraustochytriidae», соответственно.

Кроме того, термин «микроводоросли» относится к живым организмам, которые видны только через микроскоп, так как они не видны невооруженным глазом, из числа растений, которые фотосинтезируют с использованием хлорофилла и живут, плавая в воде, и они также называются фитопланктоном.

В одном конкретном воплощении микроводоросли Thraustochytriidae могут представлять собой, например, микроводоросль Thraustochytriidae sp. CD01-6003, которая была депонирована с № доступа KCTC14346 ВР, или микроводоросль Schizochytrium sp. CD01-5004, которая была депонирована с № доступа KCTC14345 ВР, но не ограничиваясь ими.

Термин «биомасса» в том виде, как он здесь используется, относится к таким организмам как растения, животные, микроорганизмы и т.д., которые можно использовать в качестве химической энергии, то есть, энергетических источников биоэнергии. Термин «биомасса» в экологическом смысле также относится к массе или количеству энергии конкретного живого организма, выходящему на единицу времени и пространства. Кроме того, хотя биомасса и содержит соединения, секретируемые клетками, она также может содержать клетки и/или внутриклеточное содержимое, а также внеклеточные вещества, но не ограничивается ими. В настоящем раскрытии данная биомасса может представлять собой сами микроводоросли Thraustochytriidae, продукт их культивирования, их высушенный продукт, их измельченный продукт, продукт, продуцируемый культивированием или ферментированием микроводорослей, или может представлять собой конденсат биомассы или высушенный продукт биомассы, но биомасса не ограничивается ими.

Термин «продукт культивирования» микроводорослей Thraustochytriidae относится к продукту, получаемому культивированием микроводорослей, и, в частности, он может представлять собой культуральную среду, содержащую микроводоросли, или культуральную среду, из которой микроводоросли удалены, но не ограничивается ими. Термин «высушенный продукт» продукта культивирования микроводорослей Thraustochytriidae относится к продукту, получаемому удалением влаги из продукта культивирования данных микроводорослей, например, в виде сухого тела клеток микроводорослей, но не ограничиваясь им. Кроме того, термин «измельченный продукт» высушенного продукта в совокупности относится к продукту, получаемому измельчением высушенного продукта, который получен удалением влаги из продукта культивирования микроводорослей, например, в виде порошка сухих тел клеток, но не ограничиваясь ими.

Продукт культивирования микроводорослей Thraustochytriidae можно получать согласно способу культивирования, включающему инокулирование микроводорослей в культуральную среду микроводорослей и непрерывную подачу источника азота в течение указанного культивирования. Высушенный продукт указанного продукта культивирования и его измельченный продукт могут быть получены согласно способу обработки или сушки микроводорослей или культуральной среды, которые известны в данной области.

В том, что касается способа получения биомассы, источник азота может подаваться с момента немедленно после инокулирования микроводорослей в среду до окончания культивирования.

Кроме того, источник азота может непрерывно подаваться таким образом, что общая концентрация азота в культуральной среде составляет 300 млн^-1 (ppm) или более. Например, источник азота может непрерывно подаваться таким образом, что общая концентрация азота в культуральной среде поддерживается в пределах интервала от 300 млн^-1 до 10000 млн^-1, от 300 млн^-1 до 8000 млн^-1, от 300 млн^-1 до 5000 млн^-1, 300 млн^-1 до 3000 млн^-1, от 300 млн^-1 до 2000 млн^-1, от 300 млн^-1 до 1500 млн^-1, от 350 млн^-1 до 10000 млн^-1, от 350 млн^-1 до 8000 млн^-1, от 350 млн^-1 до 5000 млн^-1, от 350 млн^-1 до 3000 млн^-1, от 350 млн^-1 до 2000 млн^-1 или от 350 млн^-1 до 1500 млн^-1.

В том, что касается способа получения биомассы, данная среда может содержать источник углерода и источник азота.

В том, что касается способа получения биомассы, источник азота в непрерывно подаваемом источнике азота и источник азота, содержащийся в среде, могут представлять собой (1) любой один или более чем органический источник азота, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, говяжьего экстракта, пептона и триптона, или (2) любой один или более чем один неорганический источник азота, выбранный из группы, состоящей из ацетата аммония, нитрата аммония, хлорида аммония, сульфата аммония, нитрата натрия, мочевины, мононатрия глутамата (MSG) и аммиака, но источник азота не ограничивается ими, пока его используют при культивировании микроводорослей Thraustochytriidae.

Непрерывная подача источника азота может осуществляться, например, непрерывной подачей среды, содержащей данный источник азота, в культуральную среду, или непрерывной подачей газообразного аммиака в ферментатор, где культивируются микроводоросли, но не ограничивается ими. Непрерывная подача среды, содержащей источник азота, в культуральную среду может осуществляться, например, способом периодической подпитки, при котором эта среда подается периодически, или способом непрерывного культивирования, при котором эта среда подается непрерывно.

Данный способ может дополнительно включать непрерывную подачу источника углерода в течение культивирования. Данная непрерывная подача источника углерода может осуществляться, например, непрерывной подачей среды, содержащей источник углерода, в культуральную среду, но не ограничиваясь ей. Данная непрерывная подача среды, содержащей источник углерода, в культуральную среду может осуществляться, например, способом периодической подпитки или способом непрерывного культивирования. Данную непрерывную подачу источника углерода можно проводить при поддержании концентрации источника углерода в культуральной среде 5% (масс./об.) или менее.

Источник углерода в непрерывно подаваемом источнике углерода и источник углерода, содержащийся в среде, могут представлять собой любой один или более чем один, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, мальтозы, галактозы, маннозы, сахарозы, арабинозы, ксилозы и глицерина, но данный источник углерода не ограничивается ими, пока он используется при культивировании микроводорослей Thraustochytriidae.

Данная среда может дополнительно содержать подходящие источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины и т.д., которые используются для культивирования микроводорослей Thraustochytriidae. Например, источники фосфора могут включать калия дигидрофосфат, дикалия гидрофосфат, соответствующие им натрийсодержащие соли и т.д., индивидуально или в смеси, но не ограничиваются ими.

Данное культивирование может осуществляться в течение 95 часов или менее. Например, данное культивирование может осуществляться в течение 30 часов - 95 часов, 35 часов 95 часов, 40 часов 95 часов, 45 часов 95 часов, 30 часов 90 часов, 35 часов 90 часов, 40 часов 90 часов или 45 часов 90 часов.

Данное культивирование может осуществляться при 20°С-35°С. Например, данное культивирование может осуществляться при 25°С-35°С, 20°С-30°С или 25°С-30°С, но не ограничиваясь ими.

Кроме того, в ходе культивирования для поддержания аэробного состояния культивируемого продукта кислород или кислородсодержащий газ могут инжектироваться в продукт культивирования, или для поддержания анаэробного или неаэробного состояния газ может не инжектироваться, или может инжектироваться газообразный азот, водород или диоксид углерода, но настоящее раскрытие не ограничивается этим.

Культивирование может осуществляться при регулировании рН, например осуществляемом регулированием рН для поддержания рН от 3,5 до 9,0, рН от 4,0 до 9,0, рН от 5,0 до 9,0, рН от 3,5 до 8,0, рН от 4,0 до 8,0, рН от 4,5 до 8,0 или рН от 5,0 до 8,0 с использованием основного соединения (например гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислотного соединения (например фосфорной кислоты или серной кислоты), но не ограничиваясь ими.

Данный способ получения биомассы может дополнительно включать выделение биомассы из штамма, продукта культивирования штамма, высушенного продукта указанного продукта культивирования или измельченного продукта указанного высушенного продукта.

Выделение биомассы может представлять собой сбор целевой биомассы с использованием подходящего способа, известного в данной области. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, анионообменную хроматографию, кристаллизацию, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) и т.д. Дополнительно может быть включен способ очистки.

Биомасса, полученная приведенным выше способом получения, может содержать 50% по массе или более белков и 37% по массе или менее жиров на основе общей массы биомассы. Данная биомасса может содержать, например, от 50% по массе до 80% по массе, от 50% по массе до 75% по массе, от 50% по массе до 70% по массе, от 55% по массе до 80% по массе, от 55% по массе до 75% по массе или от 55% по массе до 70% по массе белков; и от 5% по массе до 37% по массе, от 5% по массе до 35% по массе, от 5% по массе до 30% по массе, от 5% по массе до 25% по массе, от 10% по массе до 37% по массе, от 10% по массе до 35% по массе, от 10% по массе до 30% по массе, от 10% по массе до 25% по массе, от 15% по массе до 37% по массе, от 15% по массе до 35% по массе, от 15% по массе до 30% по массе или от 15% по массе до 25% по массе жиров.

Биомасса, полученная приведенным выше способом получения, может содержать 50% по массе или более белков и омега-3 жирных кислот на основе общей массы биомассы. Данные омега-3 жирные кислоты могут содержать любую одну или более чем одну из докозагексаеновой кислоты (DHA) и эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА).

«DHA», в том виде, как здесь используется данный термин, представляет собой одну из полиненасыщенных жирных кислот, представленных формулой С₂₂Н₃₂О₂, и принадлежит к омега-3 жирной кислоте, наряду с α-линоленовой кислотой (ALA) и ЕРА, и ее тривиальное название цервоновая кислота, и она также может сокращенно обозначаться как 22:6 n-3.

«ЕРА» в том виде, в котором здесь используется данный термин, представляет собой одну из полиненасыщенных жирных кислот, представленных формулой С₂₀Н₃₀О₂, и принадлежит к омега-3 жирной кислоте, наряду с ALA и DHA, и также может сокращенно обозначаться как 20:5 n-3.

В том, что касается биомассы, содержащей 50% по массе или более белков и омега-3 жирных кислот, данная биомасса может содержать от 3% по массе до 30% по массе, от 3% по массе до 25% по массе, от 3% по массе до 20% по массе или от 3% по массе до 15% по массе омега-3 жирных кислот на основе общей массы биомассы. Кроме того, данная биомасса может содержать от 15% по массе до 60% по массе, от 15% по массе до 55% по массе или от 15% по массе до 50% по массе омега-3 жирных кислот на основе общей массы жирных кислот.

Согласно другому аспекту предложена биомасса, происходящая из одной микроводоросли Thraustochytriidae, которая получена способом получения биомассы, включающим культивирование в среде одного штамма микроводорослей Thraustochytriidae; и непрерывную подачу источника азота в течение указанного культивирования.

Способ получения биомассы является таким же, как описано выше.

Данная биомасса может содержать 50% по массе или более белков и 37% по массе или менее жиров на основе общей массы биомассы. Данная биомасса может содержать, например, от 50% по массе до 80% по массе, от 50% по массе до 75% по массе, от 50% по массе до 70% по массе, от 55% по массе до 80% по массе, от 55% по массе до 75% по массе или от 55% по массе до 70% по массе белков; и от 5% по массе до 37% по массе, от 5% по массе до 35% по массе, от 5% по массе до 30% по массе, от 5% по массе до 25% по массе, от 10% по массе до 37% по массе, от 10% по массе до 35% по массе, от 10% по массе до 30% по массе, от 10% по массе до 25% по массе, от 15% по массе до 37% по массе, от 15% по массе до 35% по массе, от 15% по массе до 30% по массе или от 15% по массе до 25% по массе жиров.

Данная биомасса может содержать, например, 50% по массе или более белков и омега-3 жирных кислот на основе общей массы биомассы, где данные омега-3 жирные кислоты могут содержать любую одну или более чем одну из DHA и ЕРА.

В том, что касается биомассы, содержащей 50% по массе или больше белков и омега-3 жирных кислот, данная биомасса может содержать от 3% по массе до 30% по массе, от 3% по массе до 25% по массе, от 3% по массе до 20% по массе или от 3% по массе до 15% по массе омега-3 жирных кислот на основе общей биомассы. Кроме того, данная биомасса может содержать от 15% по массе до 60% по массе, от 15% по массе до 55% по массе или от 15% по массе до 50% по массе омега-3 жирных кислот на основе общей массы жирных кислот.

Согласно еще одному другому аспекту предложена композиция, содержащая биомассу, происходящую из одной микроводоросли Thraustochytriidae, или конденсат или высушенный продукт указанной биомассы, который получен способом получения биомассы, включающим культивирование в среде одного штамма микроводоросли Thraustochytriidae; и непрерывную подачу источника азота в ходе указанного культивирования.

Способ получения биомассы и биомасса, происходящая из одной микроводоросли Thraustochytriidae, являются такими же, как описано выше.

Концентрат или высушенный продукт биомассы можно получать согласно способу обработки, концентрирования или сушки микробной биомассы, который известен в данной области.

Данная композиция может находиться в виде раствора, порошка или суспензии, но не ограничиваясь ими. Данная композиция может представлять собой, например, пищевую композицию, кормовую композицию или композицию кормовой добавки.

Термин «кормовая композиция» в том виде, как он здесь используется, относится к корму, скармливаемому животным. Данная кормовая композиция относится к веществу, которое поставляет органические или неорганические питательные вещества, необходимые для поддержания жизни животного или продуцирования мяса, молока и т.д. Данная кормовая композиция может дополнительно содержать питательные вещества, необходимые для поддержания жизни животного или продуцирования мяса, молока и т.д. Данную кормовую композицию можно получать в виде разных типов кормов, известных в данной области, и, в частности, она может включать концентрированный корм, неочищенный корм и/или специализированный корм.

Термин «кормовая добавка» в том виде, как он здесь используется, относится к веществу, которое добавляют в корм с целью достижения разных эффектов, таких как пополнение питательных веществ, предупреждение потери массы, улучшение пищеварительного использования целлюлозы в кормах, улучшение качества молока, предупреждение репродуктивного расстройства, улучшение показателя оплодотворения и предупреждение высокотемпературного стресса летом. Кормовая добавка по настоящему раскрытию соответствует кормовой добавке согласно закону о контроле над кормами и может дополнительно включать минеральный препарат, такой как натрия гидрокарбонат, бентонит, магния оксид, сложный минерал и т.д., минеральный препарат, который представляет собой микроэлемент, такой как цинк, медь, кобальт, селен и т.д., витаминный препарат, такой как каротин, витамин А, витамин D, витамин Е, никотиновая кислота, комплекс витаминов В и т.д., препарат защищенной аминокислоты, такой как метионин, лизин и т.д., препарат защищенной жирной кислоты, такой как кальциевая соль жирной кислоты и т.д., препарат живой бактерии, такой как пробиотическая бактерия (молочнокислая бактерия), культуры дрожжей или продукты ферментации плесеней и т.д., дрожжевой препарат и т.д.

Термин «пищевая композиция» в том виде, как он здесь используется, включает все типы пищевых продуктов, такие как функциональные пищевые продукты, питательные добавки, пищевые продукты для здоровья и пищевые добавки. Приведенную выше пищевую композицию можно получать в разных формах согласно обычным способам, известным в данной области.

Композиция по настоящему раскрытию может дополнительно содержать сельскохозяйственные культуры, такие как измельченное или дробленое зерно пшеницы, овса, ячменя, кукурузы и риса; корма на основе растительного белка, например, корма, главным образом состоящие из сои и подсолнечника; корма на основе животного белка, такие как кровяная мука, мясная мука, костная мука и рыбная мука; сахар и молочные продукты, например, разные сухие ингредиенты, состоящие из сухого молока и сухой молочной сыворотки, и может дополнительно содержать питательные добавки, усилители переваривания и поглощения, стимуляторы роста и т.д.

Композиция по настоящему раскрытию может вводиться животным одна или в комбинации с другими кормовыми добавками в съедобном носителе. Кроме того, данная композиция может представлять собой приправу, может непосредственно смешиваться с кормами или может легко вводиться животным в виде пероральных лекарственных форм отдельно от кормов. При введении отдельно от кормов данную композицию можно объединять с фармацевтически приемлемыми съедобными носителями и готовить в виде композиций с немедленным высвобождением или композиций с замедленным высвобождением, также известных в данной области. Данные съедобные носители могут быть твердыми или жидкими, например, кукурузным крахмалом, лактозой, сахарозой, соевыми хлопьями, арахисовым маслом, оливковым маслом, кунжутным маслом и пропиленгликолем. При использовании твердых носителей данная композиция может находиться в виде таблетки, капсулы, порошка, пастилки, лепешки или может представлять собой недиспергируемую приправу. При использовании жидких носителей данная композиция может находиться в виде мягких желатиновых капсул, сиропа, суспензии, эмульсии или раствора.

Композиция по настоящему раскрытию, например, может содержать консерванты, стабилизаторы, увлажнители, эмульгаторы, криопротекторы, эксципиенты и т.д. Криопротекторы могут представлять собой один или более чем один выбранный из группы, состоящей из глицерина, трегалозы, мальтодекстрина, обезжиренного сухого молока и крахмала.

Данные консерванты, стабилизаторы или эксципиенты могут содержаться в композиции в эффективном количестве, достаточном для уменьшения порчи микроводорослей Thraustochytriidae, которые содержатся в данной композиции. Кроме того, криопротектор может содержаться в композиции в достаточном эффективном количестве для уменьшения порчи микроводорослей Thraustochytriidae, которые содержатся в данной композиции, когда данная композиция находится в высушенном состоянии.

Данную композицию можно добавлять в корма для животных посредством закапывания, напыления или смешивания для применения.

Композицию по настоящему раскрытию можно применять в отношении рациона разных животных, таких как млекопитающие, птицы, рыба, ракообразные, головоногие, пресмыкающиеся и земноводные. Например, данные млекопитающие могут включать свиней, коров, овец, коз, лабораторных грызунов, домашних животных и т.д., птицы могут включать дичь, которая может включать куриц, индеек, уток, гусей, фазанов, перепелок и т.д., но не ограничиваясь ими. Кроме того, рыба может включать искусственно выращенную для продажи рыбу и ее мальков, декоративную рыбу и т.д., и ракообразные могут включать креветок, усоногих раков и т.д., но не ограничиваясь ими. Данная композиция также может применяться для кормления коловраток, которые представляют собой животный планктон.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ

Согласно способу получения биомассы по одному аспекту возможно получение биомассы, происходящей из одной микроводоросли, которая содержит высокое содержание белков и омега-3 жирных кислот, посредством непрерывной подачи источников азота в течение процесса культивирования. Полученную посредством этого биомассу можно использовать в качестве одного микробного источника белков и омега-3 жирных кислот.

СПОСОБ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ

Далее настоящее раскрытие будет более подробно описано со ссылкой на типичные воплощения. Однако данные типичные воплощения служат только для иллюстрирования одного или более чем одного конкретного воплощения, и объем настоящего раскрытия ограничивается данными типичными воплощениями.

Пример 1. Анализ продуцируемых количеств жиров и белков согласно способу культивирования микроводорослей Thraustochytriidae sp.

1-1. Получение и посевная культура микроводорослей

Микроводоросли Thraustochytriidae sp.CD01-6003 (№ доступа KCTC14346BP) высевали в стерильную среду MJW01 (30 г/л глюкозы, 3,0 г/л MgSO₄⋅7H20, 10 г/л Na₂SO₄, 1,0 г/л NaCl, 9,0 г/л дрожжевого экстракта, 1,0 г/л MSG⋅H₂O, 1,0 г/л NaNO₃, 0,1 г/л KH₂PO₄, 0,5 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л CaCl₂ и 10 мл/л смешанного раствора витаминов) и культивировали в колбе на 250 мл в условиях от 20°С до 35°С и от 100 об/мин до 300 об/мин в течение 10 часов 30 часов.

1-2. Главная культура

1-2-1. Сравнительный пример (1)

Посевную культуру, полученную в Примере 1-1, дозировали в ферментатор на 5 л, содержащий стерильную среду MJW01, дополненную 6 г/л сульфата аммония ((NH₄)₂⋅SO₄) и 5 г/л дрожжевого экстракта в качестве источников азота, и культивировали в условиях от 20°С до 35°С, от 100 об/мин до 500 об/мин и от 0,5 vvm (объем на едицу объема в минуту) до 1,5 vvm в течение всего 101 часа до тех пор, пока объем данной культуры в ферментаторе не достигал 2,8 л. Немедленно после начала культивирования с использованием дополнительных источников азота в ферментатор непрерывно в течение 14 часов подавали газообразный аммиак таким образом, чтобы общая концентрация азота в культуральной среде составляла 300 млн^-1 или более, и затем поставку газообразного аммиака прекращали. В течение всего процесса культивирования непрерывно поставляли питание, содержащее источник углерода, таким образом, чтобы концентрация источника углерода в культуральной среде поддерживалась ниже 5%.

1-2-2. Пример (1)

Культивирование проводили таким же образом, как ив 1-2-1, всего в течение 86 часов, за исключением того, что на протяжении всего процесса культивирования в ферментатор непрерывно подавали газообразный аммиак таким образом, чтобы общая концентрация азота в культуральной среде составляла 300 млн^-1 или более.

1-2-3. Пример (2)

Культивирование проводили таким же образом, как ив 1-2-1, всего в течение 75 часов, за исключением того, что на протяжении всего процесса культивирования в ферментатор непрерывно подавали газообразный аммиак таким образом, чтобы общая концентрация азота в культуральной среде составляла 300 млн^-1 или более, и в стерильную среду MJW01 добавляли только 18 г/л сульфата аммония в качестве источника азота.

1-2-4. Пример (3)

Культивирование проводили таким же образом, как ив 1-2-1, всего в течение 55 часов, за исключением того, что на протяжении всего процесса культивирования в ферментатор непрерывно подавали газообразный аммиак таким образом, чтобы общая концентрация азота в культуральной среде составляла 300 млн^-1 или более, и в питание, содержащее источник углерода, дополнительно добавляли 10 г/л сульфата аммония в качестве источника азота.

1-2-5. Пример (4)

Культивирование проводили таким же способом, как и в 1-2-1, всего в течение 92 часов, за исключением того, что на протяжении всего процесса культивирования в ферментер непрерывно подавали газообразный аммиак таким образом, чтобы общая концентрация азота в культуральной среде составляла 300 млн^-1 или более, в стерильную среду MJW01 добавляли только 6 г/л сульфата аммония, и в питание, содержащее источник углерода, дополнительно добавляли 12 г/л сульфата аммония в качестве источника азота.

1-3. Анализ содержания жира

Каждую из культур микроводорослей, культивировавшуюся в 1-2-1 - 1-2-5, собирали и центрифугировали. Затем полученные клетки три раза промывали PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) и сушили при 60°С в течение 16 часов. Обеспечивали реакцию гидролиза при 80°С посредством добавления 8,3 М раствора соляной кислоты к 2 г высушенных клеток. Затем к продукту реакции добавляли 30 мл этилового эфира и 20 мл петролейного эфира, и перемешивание в течение 30 секунд и центрифугирование повторяли три раза или больше. Отделенный слой растворителя переносили в предварительно взвешенную круглую колбу и затем сушили в контейнере, из которого удаляли растворитель и остаточную влагу посредством продувания азота (N₂). Общее содержание масла рассчитывали измерением массы масла, которое оставалось после сушки растворителя. Содержание омега-3 жирных кислот (DHA и ЕРА) в масле измеряли газовой хроматографией после предварительной обработки 0,5 н. метанольным NaOH и 14% трифторборанового метанола (BF₃-MeOH).

В результате, как показано в Таблице 1, общее содержание жирных кислот (TFA) в биомассе было более низким в Примерах (1) - (4), в которых культивирование проводили при непрерывной подаче источников азота, по сравнению со Сравнительным примером (1). Однако содержание ЕРА, DHA и омега-3 в общих жирных кислотах в Примерах (1) (4) было эквивалентым или более высоким, чем их содержание в Сравнительном примере (1).

1-4. Анализ содержания белка

В отношении каждых 0,5 г 1 г высушенных клеток, полученных таким же образом, как и в 1-3, количественно анализировали содержание азота в образце с использованием элементного анализатора. Массовое отношение (TN%) азота, присутствующего в каждом образце, умножали на 6,25 и рассчитывали в виде общего содержания белка в данном образце.

В результате, как показано в Таблице 2, все Примеры (2) (4) показали общее содержание белка 55% или более, и Пример (1) продемонстрировал общее содержание жирных кислот 28,9% при измерении в 1-3. Считая, что биомасса микроводорослей обычно имеет содержание углеводов от примерно 2% до примерно 3% и содержание золы от примерно 8% до примерно 10%, можно оценить, что общее содержание белка может достигать вплоть до примерно 58,10%. Кроме того, Сравнительный пример (1) продемонстрировал общее содержание жирных кислот 43,42% при измерении в 1-3, оценивая, что максимальное общее содержание белка составляет просто примерно 43,58%. Данные результаты подтвердили, что при культивировании микроводорослей в условиях непрерывной подачи источника азота белки могут продуцироваться с высоким содержанием 55% или больше.

Пример 2. Анализ продуцируемых количеств жиров и белков согласно способу культивирования микроводорослей Schizochytrium sp.

2-1. Получение и посевная культура микроводорослей

Посевную культуру микроводорослей Schizochytrium sp. CD01-5004 (№ доступа: KCTC14345 ВР) осуществляли таким же способом, как и в Примере 1-1.

2-2. Главная культура

2-2-1. Сравнительный пример (2)

Посевную культуру, полученную в Примере 2-1, дозировали в ферментатор на 5 л, содержащий стерильную среду MJW01, и культивировали в условиях от 20°С до 35°С, от 100 об/мин до 500 об/мин и от 0,5 vvm до 1,5 vvm в течение всего 105 часов до тех пор, пока объем культуры в ферментаторе не достигал 2,8 л. Немедленно после начала культивирования с использованием дополнительных источников азота в ферментатор непрерывно подавали газообразный аммиак в течение 10 часов таким образом, чтобы общая концентрация азота в культуральной среде составляла 300 млн^-1 или более, и затем поставку газообразного аммиака прекращали. Во время всего процесса культивирования непрерывно подавали питание, содержащее источник углерода, таким образом, чтобы поддерживалась концентрация источника углерода в культуральной среде ниже 5%.

2-2-2. Пример (5)

Культивирование проводили таким же образом, как и в 2-2-1, всего в течение 84 часов, за исключением того, что на протяжении всего процесса культивирования в ферментатор непрерывно подавали газообразный аммиак таким образом, чтобы общая концентрация азота в культуральной среде составляла 300 млн^-1 или более, и в стерильную среду MJW01 дополнительно добавляли 6 г/л сульфата аммония и 10 г/л дрожжевого экстракта в качестве источников азота.

2-2-3. Пример (6)

Культивирование проводили таким же образом, как и в 2-2-2, за исключением того, что культивирование проводили всего в течение 53 часов.

2-2-4. Примеры (7) и (8)

Культивирование проводили таким же образом, как и в 2-2-2, за исключением того, что культивирование проводили всего в течение 50 часов.

2-2-5. Пример (9)

Культивирование проводили таким же образом, как и в 2-2-2, за исключением того, что культивирование проводили всего в течение 47 часов.

2-2-6. Пример (10)

Культивирование проводили таким же образом, как и в 2-2-2, всего в течение 47 часов, за исключением того, что в стерильную среду MJW01 дополнительно добавляли 5 г/л MSG в качестве источника азота.

2-3. Анализ содержания жира

Каждую из культур микроводорослей, культивированную в 2-2-1 2-2-6, собирали и содержание в них жиров анализировали таким же способом, как и в Примере 1-3.

В результате, как показано в Таблице 3, общее содержание жирных кислот (TFA) в биомассе было ниже в Примерах (5) - (10), в которых культивирование проводили при непрерывной подаче источников азота, по сравнению со Сравнительным примером (2). Однако содержание ЕРА, DHA и омега-3 в общихжирных кислотах в Примерах (5) (10) было эквивалентным или более высоким, чем их содержание в Сравнительном примере (2).

2-4. Анализ содержания белка

Каждую из культур микроводорослей, культивированных в 2-2-1-2-2-6, собирали и содержание белка в них анализировали таким же образом, как и в Примере 1-4.

В результате, как показано в Таблице 4, все Примеры (5) (10) демонстрировали общее содержание белка 58% или более, а Сравнительный пример (2) демонстрировал общее содержание жирных кислот 41,91% при измерении в 2-3. Считая, что биомасса микроводорослей обычно имеет содержание углеводов от примерно 2% до примерно 3% и содержание золы от примерно 8% до примерно 10%, можно оценить, что общее содержание белка может достигать вплоть до примерно 45,1%. Данные результаты подтвердили, что при культивировании микроводорослей в условиях непрерывной подачи источника азота белки могут продуцироваться с высоким содержанием 58% или более.

2-5. Анализ содержания и состава аминокислот

Культуру микроводорослей Примера (10), культивированную в 2-2-6, собирали, сухие клетки получали таким же способом, как ив 1-3, и от 0,5 г до 1 г данных сухих клеток подвергали кислотному гидролизу. Затем полученное в результате подвергали жидкостной хроматографии, и анализировали общее содержание аминокислот и содержание индивидуальных аминокислот. Концентрации индивидуальных аминокислот в образце нормировали к количеству сухих клеток, использованных для расчета содержания (%) индивидуальных аминокислот относительно массы сухих клеток, и общее содержание аминокислот (%) относительно массы сухих клеток рассчитывали сложением содержания всех выявленных аминокислот.

В результате, как показано в Таблицах 5 и 6, Пример (10), в котором микроводоросли культивировали в условиях непрерывной подачи источников азота, продемонстрировал общее содержание белка в биомассе 43,09% и имел наивысшее содержание глутамата среди индивидуальных аминокислот, и отношение содержания глутамата к аргинину составляло 2,04.

Следует понимать, что описанные здесь воплощения следует рассматривать только в описательном смысле и не с целью ограничения. Описания характеристик или аспектов в пределах каждого воплощения типично следует рассматривать как доступные для других аналогичных характеристик или аспектов в других воплощениях. В то время как одно или более чем одно воплощение было описано со ссылкой на графические материалы, обычным специалистам в данной области будет понятно, что в них можно делать разные изменения формы и подробностей без отступления от сущности и объема данного раскрытия, как определено следующей формулой изобретения.

Изобретение относится к масложировой и биотехнологической промышленности. Способ получения биомассы из микроводорослей Thraustochytrid, включающий: культивирование микроводорослей Thraustochytrid в среде для культивирования микроводорослей Thraustochytrid, содержащей 30 г/л глюкозы, 3,0 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 10 г/л Na₂SO₄, 1,0 г/л NaCl, 9,0 г/л дрожжевого экстракта, 1,0 г/л MSG⋅H₂O, 1,0 г/л NaNO₃, 0,1 г/л KH₂PO₄, 0,5 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л CaCl₂ и 10 мл/л смешанного раствора витаминов, или в среде для культивирования микроводорослей Thraustochytrid, содержащей 30 г/л глюкозы, 3,0 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 10 г/л Na₂SO₄, 1,0 г/л NaCl, 9,0 г/л дрожжевого экстракта, 1,0 г/л MSG⋅H₂O, 1,0 г/л NaNO₃, 0,1 г/л KH₂PO₄, 0,5 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л CaCl₂, 10 мл/л смешанного раствора витаминов и сульфат аммония; и непрерывную подачу дополнительного источника азота в течение указанного культивирования таким образом, что общая концентрация азота в культуральной среде составляет 300 ppm (млн^-1) или более. Указанный источник азота можно подавать немедленно после инокулирования микроводорослей в среду до конца культивирования, где полученная биомасса содержит от 50% по массе до 80% по массе белков и от 10% по массе до 30% по массе жиров на основе общей массы биомассы и от 15% по массе до 60% по массе омега-3 жирных кислот на основе общей массы жирных кислот. Биомасса из микроводорослей Thraustochytrid, полученная вышеуказанным способом, где указанная биомасса содержит от 50% по массе до 80% по массе белков и от 10% по массе до 30% по массе жиров на основе общей массы биомассы и от 15% по массе до 60% по массе омега-3 жирных кислот на основе общей массы жирных кислот. Изобретение позволяет получить биомассу из микроводорослей, которая обладает высоким содержанием белков и омега-3 жирных кислот. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 табл., 10 пр.

1. Способ получения биомассы из микроводорослей Thraustochytrid, включающий:

культивирование микроводорослей Thraustochytrid в среде для культивирования микроводорослей Thraustochytrid, содержащей 30 г/л глюкозы, 3,0 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 10 г/л Na₂SO₄, 1,0 г/л NaCl, 9,0 г/л дрожжевого экстракта, 1,0 г/л MSG⋅H₂O, 1,0 г/л NaNO₃, 0,1 г/л KH₂PO₄, 0,5 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л CaCl₂ и 10 мл/л смешанного раствора витаминов, или в среде для культивирования микроводорослей Thraustochytrid, содержащей 30 г/л глюкозы, 3,0 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 10 г/л Na₂SO₄, 1,0 г/л NaCl, 9,0 г/л дрожжевого экстракта, 1,0 г/л MSG⋅H₂O, 1,0 г/л NaNO₃, 0,1 г/л KH₂PO₄, 0,5 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л CaCl₂, 10 мл/л смешанного раствора витаминов и сульфат аммония; и

непрерывную подачу дополнительного источника азота в течение указанного культивирования таким образом, что общая концентрация азота в культуральной среде составляет 300 ppm (млн^-1) или более,

где указанный источник азота можно подавать немедленно после инокулирования микроводорослей в среду до конца культивирования, где полученная биомасса содержит от 50% по массе до 80% по массе белков и от 10% по массе до 30% по массе жиров на основе общей массы биомассы и от 15% по массе до 60% по массе омега-3 жирных кислот на основе общей массы жирных кислот.

2. Способ по п. 1, где указанный источник азота представляет собой (1) любой один или более чем один органический источник азота, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, говяжьего экстракта, пептона и триптона, или (2) любой один или более чем один неорганический источник азота, выбранный из группы, состоящей из ацетата аммония, нитрата аммония, хлорида аммония, сульфата аммония, нитрата натрия, мочевины, мононатрия глутамата (MSG) и аммиака.

3. Способ по п. 1, где микроводоросли Thraustochytrid представляют собой микроводоросли Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Aurantiochytrium sp. или Thraustochytriidae sp.

4. Способ по п. 1, дополнительно включающий выделение биомассы из указанного штамма, продукта культивирования указанного штамма, высушенного продукта указанного продукта культивирования или измельченного продукта указанного высушенного продукта.

5. Способ по п. 1, где указанная омега-3 жирная кислота содержит любую одну или более чем одну из докозагексаеновой кислоты (DHA) и эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА).

6. Биомасса из микроводорослей Thraustochytrid, полученная способом по любому из пп. 1-5, где указанная биомасса содержит от 50% по массе до 80% по массе белков и от 10% по массе до 30% по массе жиров на основе общей массы биомассы и от 15% по массе до 60% по массе омега-3 жирных кислот на основе общей массы жирных кислот.

7. Биомасса по п. 6, где указанная биомасса содержит от 10% по массе до 25% по массе жиров на основе общей массы биомассы.

8. Биомасса по п. 6, где указанная омега-3 жирная кислота содержит любую одну или более чем одну из докозагексаеновой кислоты и эйкозапентаеновой кислоты.

9. Биомасса по п. 6, где указанная биомасса содержит от 15% по массе до 55% по массе омега-3 жирных кислот на основе общей массы жирных кислот.