Новые штаммы микроводорослей рода Thraustochytrium и способ получения полиненасыщенных жирных кислот с их использованием Российский патент 2021 года по МПК C12N1/00 C12P7/64 C12R1/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к штаммам рода Thraustochytrium, имеющим высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот, к биомассе, полученной из этих штаммов, к липиду, содержащему в этих штаммах, и к способу получения полиненасыщенных жирных кислот.

Предшествующий уровень техники

Докозагексаеновая кислота (DHA), которая является полиненасыщенной жирной кислотой, представляет собой жирную кислоту, необходимую для мозга, тканей глаза и нервной системы, и, как известно, играет важную роль в развитии остроты зрения и способности двигательных нейронов у младенцев. Сообщалось, что количество DHA значительно снижено в мозге пациента с деменцией, и недавно было обнаружено, что DHA обладает различными антивозрастными функциями, такими как подавление дегенерации желтого пятна при пресбиопии. Кроме того, сообщалось, что DHA также можно использовать в качестве кормовой добавки для рыбы (публикация корейской патентной заявки 10-2007-0040751). Поскольку большинство высших животных, включая человека, не может легко синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты, необходимые для нормальных биологических функций, они должны потреблять полиненасыщенные жирные кислоты в качестве необходимых питательных веществ и Всемирная организация здравоохранения рекомендует постоянное потребление DHA-содержащих в количестве по меньшей мере 1 г/сутки. Традиционно источниками полиненасыщенных жирных кислот DHA являются глубоководные рыбы, такие как тунец и лосось, которые занимают верхний уровень морской экосистемы. Однако по мере ухудшения загрязнения морской среды возрастает риск при поедании глубоководных рыб из-за накопления в организме глубоководных рыб загрязняющих веществ, таких как ртуть, тяжелые металлы, гормоны из окружающей среды и радиоактивные вещества.

Следовательно, в качестве нового средства для безопасного и надежного снабжения полиненасыщенным жирнокислотным маслом DHA, очень важное промышленное значение имеют микроводоросли рода Thraustochytrium.

Различные способы сверхэкспрессии генов были предложены для микроводорослей рода Thraustochytrium. Были описаны технологии трансформации микроводорослей рода Thraustochytrium с использованием различных генов устойчивости к антибиотикам в качестве селективных маркеров с тех пор, как генетические методы трансформации микроводорослей рода Thraustochytrium с использованием ацетолактатсинтазы в качестве селекционного маркера были впервые введены корпорацией Martec. В частности, в публикации корейской патентной заявки 2015-0084148 описан "рекомбинантный вектор для повышения продуктивности биомассы микроводорослей и липида и его применение".

Однако до сих пор технология генетической трансформации, разработанная для микроводорослей рода Thraustochytrium, представляет собой метод хромосомной интеграции, при котором гены, введенные совместно, встраивают в хромосомную ДНК, преимуществом этого метода является стабильное сохранение встроенных генов, но ограничением этого метода является количество копий генов и контроль экспрессии по сравнению с методом экспрессии генов с использованием центромерной или эписомальной плазмиды со способностью к саморепликации.

Описание изобретения

Техническая задача

Соответственно, авторы настоящего изобретения разработали микроводоросли, имеющие улучшенное содержание и продуцирование докозагексаеновой кислоты путем мутирования микроводорослей КС01 рода Thraustochytrium и разработали биомассу, включающую липиды, содержащие докозагексаеновую кислоту и способ получения биомасла путем культивирования этих микроводорослей. На основании этих разработок было завершено данное изобретение.

Решение технической задачи

Одной задачей настоящего изобретения является предложение микроводорослей CJM01 (номер депонирования: КСТС 13538 ВР) рода Thraustochytrium с помощью которых увеличивается продуцирование докозагексаеновой кислоты (DHA) и уменьшается получение аминокислот по сравнению с микроводорослями дикого типа.

Другой задачей настоящего изобретения является предложение способа получения биомассы, включающего стадии: культивирования микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium; и извлечения биомассы, содержащей докозагексаеновую кислоту (DHA) из микроводорослей, продукта их культивирования, их высушенного продукта или их пульверизированного продукта.

Еще одной задачей настоящего изобретения является создание способа получения биомасла, включающего стадии: культивирования микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium; и извлечение липида, содержащего докозагексаеновую кислоту (DHA) из микроводорослей, продукта их культивирования, их высушенного продукта или их пульверизированного продукта.

Полезные эффекты изобретения

В новых микроводорослях CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению продуцирование аминокислот существенно снижено, а содержание жира в биомассе и содержание ненасыщенных жирных кислот, таких как докозагексаеновая кислота, является высоким, так что сами микроводоросли, биомасса, полученная путем культивирования и ферментации микроводорослей, концентрат биомассы и высушенный продукт из биомассы являются очень полезными в качестве кормовой композиции.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 представлена фотография, показывающая штаммы КС01 рода Thraustochytrium, наблюдаемые при помощи оптического микроскопа.

На Фиг. 2 показано филогенетическое дерево штаммов КС01 рода Thraustochytrium, штаммов рода Thraustochytrium, штаммов рода Aurantiochytrium и штаммов рода Schizochytrium.

Лучший вариант осуществления изобретения

Ниже настоящее изобретение будет описано подробно.

Между тем, конкретные структурные и функциональные описания воплощений, раскрытых здесь, предназначены только для целей иллюстрации других воплощений. Настоящее изобретение может быть воплощено во многих разных формах без отступления от сущности и существенных характеристик настоящего изобретения. Таким образом, воплощения настоящего изобретения раскрыты только для иллюстративных целей и их не следует истолковывать как ограничивающие настоящее изобретение.

Для достижения вышеуказанных целей в одном аспекте настоящего изобретения предложены микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium, у которых продукция докозагексаеновой кислоты (DHA) увеличена, а продукция аминокислот уменьшена, по сравнению с микроводорослями дикого типа.

Используемый здесь термин "штаммы рода Thraustochytrium" относится к органическим гетеротрофным микроводорослям, которые играют важную роль в качестве источников триацилглицерина, содержащего различные полиненасыщенные жирные кислоты, включая докозагексаеновую кислоту (DHA) в высокой концентрации. Кроме того, "микроводоросли" относятся к живым организмам, которые можно увидеть только через микроскоп, потому что их нельзя увидеть невооруженным глазом, и которые свободно плавают в воде, и также называются фитопланктоном.

Используемые здесь, например, штаммы дикого типа КС01 рода Thraustochytrium облучают гамма-лучами для создания мутантных штаммов, из мутантных штаммов выделяют штаммы, обладающие повышенной продукцией масла, содержащего полиненасыщенные кислоты, и эти штаммы были названы как штаммы CJM01 рода Thraustochytrium и депонированы 30 мая 2018 года в Корейской коллекции типовых культур (КСТС), международный депозитарий в соответствии с Будапештским договором под номером депонирования КСТС 13538 ВР.

Кроме того, микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению могут иметь 18s рРНК с SEQ ID NO: 1, но настоящее раскрытие не ограничено ими.

Используемый здесь термин "докозагексаеновая кислота (DHA)" представляет собой одну из полиненасыщенных жирных кислот, представленную формулой С₂₂Н₃₂О₂, и является веществом, экстрагируемым в широких масштабах из голубой рыбы (bluefish), такой как тунец или сардина. Кроме того, докозагексаеновая кислота (DHA) принадлежит к омега-3 вместе с эйкозапентаеновой кислотой (ЕРА) и α-линоленовой кислотой (ALA).

Микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению могут включать большое количество докозагексаеновой кислоты (DHA) по сравнению со штаммами КС01 рода Thraustochytrium, которые являются родительскими штаммами. В частности, микроводоросли CJM01 могут включать докозагексаеновую кислоту (DHA) в количестве 30% масс.-65% масс., 30% масс.-60% масс., 40% масс -65% масс. или 40% масс.-60% масс, исходя из общей массы жирных кислот, входящих в состав микроводорослей, но настоящее изобретение не ограничивается этим.

Кроме того, микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению могут иметь улучшенное продуцирование докозагексаеновой кислоты (DHA) по сравнению со штаммами КС01 рода Thraustochytrium, которые являются родительскими штаммами. Продуцирование докозагексаеновой кислоты (DHA) можно измерить по концентрации (г/л) докозагексаеновой кислоты (DHA), продуцируемой за 1 час. Микроводоросли по настоящему изобретению могут иметь продуцирование докозагексаеновой кислоты (DHA) 0,4-0,8 (г/л/ч), 0,4-0,7 (г/л/ч), 0,5 - 0,8 (г/л/ч) или 0,5-0,7 (г/л/ч), но настоящее раскрытие не ограничивается этим.

В то же время в микроводорослях CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению продуцирование аминокислот может быть уменьшено по сравнению со штаммами КС01 рода Thraustochytrium, которые являются родительскими штаммами. В частности, микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению или их культуральный раствор может не включать по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аспартата, серина, глутамата, глицина, аланина, валина, метионина, изолейцина, лейцина, тирозина, фенилаланина, лизина и аргинина. Например, как видно из Примера 2, аспартат, серии, глутамат, глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, лизин и аргинин может не определяться в культуральном растворе микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению.

Например, общее количество аминокислот, продуцируемых микроводорослями CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению, может быть снижено на 90% или более, 95% или более, 97% или более, или 99% или более, по сравнению со штаммами КС01 рода Thraustochytrium, которые являются родительскими штаммами. Это указывает на то, что штаммы CJM01 более эффективно используются в пути биосинтеза докозагексаеновой кислоты по сравнению с родительскими штаммами КС01. В частности, поскольку микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению редко продуцируют аминокислоты, культуральный раствор этих штаммов может включать аминокислоты в количестве только 0,1-20 мг/л, 0,1-15 мг/л, 0,1-10 мг/л, 0,1-7 мг/л или 0,1-5 мг/л.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения биомассы, включающий культивирование микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium; и извлечение биомассы, содержащей докозагексаеновую кислоту (DHA), из микроводорослей, из продукта их культивирования, из их высушенного продукта или из пульверизированного продукта. Кроме того, биомасса может быть получена в форме сухого грибного тела, но настоящее раскрытие не ограничивается этим.

В настоящем изобретении предложена биомасса, полученная данным способом. Биомасса может включать докозагексаеновую кислоту (DHA) в количестве 15-40% масс, 20-35% масс., или 25-30% масс., исходя из их общей массы, но настоящее раскрытие не ограничивается этим.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения биомасла, включающий: культивирование микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium; и извлечения липида, содержащего докозагексаеновую кислоту (DHA) из микроводорослей, продукта их культивирования, их высушенного продукта или их пульверизированного продукта.

В настоящем изобретении предложено биомасло, полученное этим способом. Биомасло может включать докозагексаеновую кислоту (DHA) в количестве 30-65% масс., 30-60% масс., 40-65% масс., или 40-60% масс., на основе общей массы жирных кислот, но настоящее изобретение не ограничивается этим.

В частности, способ получения биомасла согласно настоящему изобретению может включать стадии: культивирования микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium; получение биомассы, содержащей докозагексаеновую кислоту (DHA), из микроводорослей, продукта их культивирования, их высушенного продукта или их пульверизированного продукта; и извлечение липида, содержащего докозагексаеновую кислоту (DHA), из полученной биомассы. Однако настоящее раскрытие не ограничивается этим.

"Род Thraustochytrium " и "докозагексаеновая кислота" описаны выше.

Используемое здесь "биомасло" получают из биомассы при помощи биологического, термохимического или физико-химического процесса экстракции. Биомасло, полученное в соответствии с настоящим описанием, может включать: полиненасыщенную жирную кислоту, в частности докозагексаеновую кислоту, но настоящее раскрытие не ограничивается этим.

Дополнительно, "биомасса" относится к организмам, таким как растения, животные и микроорганизмы, которые могут быть использованы в качестве химической энергии, то есть энергетических источников биоэнергии. Кроме того, биомасса экологически также относится к массе или количеству энергии конкретного организма, выходящей в единицу времени и пространства. Кроме того, хотя биомасса включает соединения, секретируемые клетками, она может также включать внеклеточные вещества, а также клетки и/или внутриклеточное содержимое. При использовании в настоящем документе биомасса может представлять собой саму микроводоросль CJM01 рода Thraustochytrium, продукт ее культивирования, ее высушенный продукт, ее пульверизированный продукт, продукт, полученный путем культивирования или ферментации микроводорослей, или может представлять концентрат биомассы или высушенный продукт биомассы. Однако биомасса не ограничивается этим.

Используемый здесь культуральный продукт микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium относится к продукту, полученному путем культивирования микроводорослей и, в частности, может представлять собой культуральный раствор, включающий микроводоросли, или культуральный раствор, не включающий микроводоросли, но настоящее раскрытие не ограничивается этим. При использовании здесь культуральный продукт микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium относится к продукту, полученному путем удаления влаги из микроводорослей и, в частности, может быть приготовлен в виде сухого грибного тела, но настоящее раскрытие не ограничивается этим. При использовании здесь, пульверизированный продукт водорослей CJM01 рода Thraustochytrium относится в совокупности к продукту, полученному путем пульверизирования микроводорослей, и может быть изготовлен в виде супернатанта или гранул, но настоящее раскрытие не ограничивается ими.

Сами микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium, продукт их культивирования, их высушенный продукт или их пульверизированный продукт включают докозагексаеновую кислоту и могут быть использованы для получения биомассы или биомасла.

При использовании здесь термин "культивирование" означает, что микроводоросли выращивают в умеренно контролируемых условиях окружающей среды. Процесс культивирования по настоящему изобретению может быть осуществлен в зависимости от подходящей питательной среды и условий культивирования. Такой процесс культивирования может быть легко адаптирован специалистами в данной области в соответствии с выбранными микроводорослями.

В частности, культивирование микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению можно выполнять в гетеротрофных условиях, но настоящее раскрытие не ограничивается этим.

При использовании здесь "гетеротрофное питание" представляет собой питательную форму, которая зависит от органического вещества, полученного из источника энергии (питания) in vitro, и является термином, соответствующим независимому питанию. Микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению могут улучшить количество и продуктивность по докозагексаеновой кислоте путем оптимизации состава питательной среды источника углерода или источника азота в гетеротрофных условиях. Кроме того, используемый здесь термин "гетеротрофное питание" можно использовать взаимозаменяемо с "темной культурой" (dark culture).

Кроме того, стадия культивирования конкретно не ограничена и может быть выполнена посредством известного способа периодической культуры, известного способа непрерывной культуры, способа культуры с подпиткой и тому подобного. Питательная среда и другие условия культивирования, используемые при культивировании микроводорослей по настоящему изобретению, можно использовать без ограничений до тех пор, пока они могут быть в целом использованы для культивирования микроводорослей. В частности, микроводоросли по настоящему изобретению можно культивировать в общей питательной среде, включающей источник углерода, источник азота, источник фосфора, неорганическое соединение, аминокислоты и/или витамины, при регулировании температуры, рН и тому подобного в аэробных условиях.

В частности, оптимальное значение рН (например рН 5-9, в частности рН 6-8, и более конкретно рН 6,8) можно регулировать с помощью основного соединения (например гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислотного соединения (например фосфорной кислоты или серной кислоты), но настоящее раскрытие не ограничивается этим.

Кроме того, кислород или кислородсодержащий газ может быть введен в культуру для поддержания аэробного состояния культуры, или газообразный азот, газообразный водород или газообразный диоксид углерода может быть введен в культуру без введения кислорода или кислородсодержащего газа для поддержания анаэробного или неаэробного состояния культуры, но настоящее раскрытие не ограничивается этим.

Кроме того, температуру культивирования можно поддерживать на уровне 20°С-45°С, в частности 25°С-40°С, и культивирование можно выполнять в течение примерно 10-160 часов, но настоящее раскрытие не ограничивается этим. Кроме того, во время культивирования образование пузырьков можно ингибировать с помощью пеногасителя, такого как полигликолевый эфир жирной кислоты, но настоящее раскрытие не ограничивается этим.

Культивирование водорослей CJM01 рода Thraustochytrium по настоящему изобретению может быть выполнено путем использования культуральной среды, содержащей источник углерода и источник азота.

Используемый здесь термин "культуральная среда" относится к среде для культивирования микроводорослей по настоящему изобретения и/или к продукту, полученному после культивирования микроводорослей. Культуральная среда может иметь как форму, включающую микроводоросли, так и форму, полученную путем удаления микроводорослей из культурального раствора, включающего микроводоросли, путем центрифугирования, фильтрации или тому подобного.

Кроме того, в культуральной среде, используемой в настоящем изобретении, в качестве источников углерода можно использовать отдельно или в комбинации сахара и углеводы (например глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, галактоза, манноза, мальтоза, арабиноза, ксилоза, меласса, крахмал и целлюлоза), жиры и масла (соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота), спирты (например глицерин и этанол) и органические кислоты (например уксусная кислота). В частности, источником углерода может быть по меньшей мере один источник выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, мальтозы, галактозы, маннозы, сахарозы, арабинозы, ксилозы и глицерина, без ограничения ими, при условии, что он может быть использован для культивирования микроводорослей. Кроме того, в культуральной среде, используемой в настоящем изобретении, в качестве источника углерода можно использовать глюкозу в концентрации 10-50 г/л, 10-40 г/л, 20-50 г/л, 20-40 г/л или 25-35 г/л, но настоящее изобретение не ограничивается этим.

Источники азота в культуральной среде, используемой в настоящем изобретении, можно разделить на органические источники азота и неорганические источники азота, но эти органические источники азота и неорганические источники азота можно использовать отдельно или в комбинации. В частности, источником азота может быть органический источник азота, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, говяжьего экстракта, пептона и триптона, или может быть неорганический источник азота, выбранный из группы, состоящей из ацетата аммония, нитрата аммония, хлорида аммония, сульфата аммония, нитрата натрия, мочевины и однозамещенного глутамата натрия (MSG).

Кроме того, в культуральной среде, используемой в настоящем изобретении, примеры источника азота могут включать дрожжевой экстракт, сульфат аммония, нитрат натрия и MSG, без ограничения ими, при условии, что его можно использовать для культивирования микроводорослей.

В частности, дрожжевой экстракт может быть включен в культуральную среду в концентрации 0,1-10 г/л, 0,5-10 г/л, 0,5-7 г/л, 0,5-5 г/л, 0,5-3 г/л, 0,5-2 г/л или 0,5-1,5 г/л, сульфат аммония может быть включен в культуральную среду в концентрации 1-5 г/л, 1-4 г/л, 2-5 г/л или 2-4 г/л, нитрат натрия может быть включен в культуральную среду в концентрации 0,1-10 г/л, 0,5-9 г/л, 1-9 г/л, 2-9 г/л, 3-9 г/л, 5-9 г/л или 7-9 г/л и MSG может быть включен в культуральную среду в концентрации 0,1-2 г/л, 0,1-1,5 г/л, 0,5-2 г/л или 0,5-1,5 г/л. Однако настоящее изобретение не ограничивается этим.

Для целей настоящего изобретения, поскольку штаммы CJM01 характеризуются тем, что они не обладают ингибированием аммиаком и могут расти в широком диапазоне концентрации солей, источники углерода и источники азота могут быть соответствующим образом скорректированы с учетом этих характеристик.

В культуральной среде, используемой в настоящем раскрытии, в качестве источника фосфора могут быть использованы дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия и соответствующие им натрийсодержащие соли по отдельности или в комбинации, но настоящее изобретение не ограничивается этим. Культуральная среда может включать другие соли металлов (например сульфат магния и сульфат железа), аминокислоту и незаменимые вещества, способствующие росту, такие как витамин.

На стадии извлечения биомассы из микроводорослей, культивируемых на стадии культивирования, из продукта их культивирования, высушенного продукта или пульверизированного продукта, необходимая биомасса может быть собрана с использованием подходящего способа, известного в данной области техники.

На стадии извлечения докозагексаеновой кислоты, продуцируемой на стадии культивирования, необходимая докозагексаеновая кислота может быть извлечена из самих микроводорослей или продукта их культивирования посредством использования подходящего способа, известного в данной области. Например, необходимая биомасса или необходимая докозагексаеновая кислота может быть извлечена из микроводорослей, культивируемых посредством подходящего способа, известного в данной области, продукта их культивирования, их высушенного продукта или их пульверизированного продукта, при этом можно использовать центрифугирование, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию, ВЭЖХ или тому подобное. Стадия извлечения биомассы или докозагексаеновой кислоты может, кроме того, включать стадию разделения и/или стадию очистки.

Например, липиды и производные липидов, такие как жирные альдегиды, жирные спирты и углеводороды (например алканы), могут быть экстрагированы гидрофобным растворителем, таким как гексан (Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717). Липиды и производные липидов также могут быть извлечены с помощью ожижения (Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17: 33-39 и Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6 (4): 269-274); масляного ожижения (Minowa et al. 1995, Fuel 74 (12): 1735-1738); и экстракции CO₂ в сверхкритическом состоянии (Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356: 328-334). Кроме того, в протоколе известного извлечения липидов микроводорослей раскрыт способ, включающий следующие этапы 1) сбор клеток с использованием центрифугирования, промывка собранных клеток дистиллированной водой и последующая лиофилизация промытых клеток с получением порошка клеток, и 2) пульверизация полученного клеточного порошка в ступке и последующее извлечение липидов с помощью н-гексана [Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846].

Еще одном аспекте настоящего раскрытия предлагается композиция, включающая микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium, продукт их культивирования, их высушенный продукт или их пульверизированный продукт.Композиция может включать биомассу или биомасло, полученные с использованием микроводорослей.

Микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium, продукт их культивирования, их высушенный продукт и их пульверизированный продукт являются такими, как описано выше. Биомасса или биомасло, получаемые с использованием микроводорослей, также описаны выше. Для получения композиции, включающей высокое содержание докозагексаеновой кислоты, могут быть использованы микроводоросли по настоящему изобретению. Композиция может быть получена в виде раствора, порошка или суспензии, но настоящее раскрытие не ограничивается ими. В частности, может быть предложена пищевая композиция, кормовая композиция или кормовая добавка, включающая микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium, продукт их культивирования, их высушенный продукт или их пульверизированный продукт.

Используемый здесь термин "корм" относится к пище для животных для съедания, проглатывания и переваривания, или относится к любой подходящей естественной или искусственной диете, к одному приему пищи или к ингредиенту одного приема пищи. Корм по настоящему изобретению, который включает композицию для предупреждения или лечения метаболических заболеваний в качестве активного ингредиента, может быть изготовлен в виде различных типов кормов, известных в данной области техники, и конкретные примеры этого могут включать концентрированные корма, грубые корма и/или специальные корма.

Используемый здесь термин "кормовая добавка" относится к веществу, которое добавляют в корм для различных эффектов, таких как пополнение питательных веществ, предупреждение потери веса, улучшение пищеварительного использования целлюлозы в корме, улучшение качества масла, предупреждение репродуктивных расстройств, улучшение оплодотворяемости и предупреждение высокотемпературного стресса летом. Кормовая добавка по настоящему изобретению соответствует дополнительному корму в соответствии с законом об использовании кормов, и может дополнительно включать минеральный препарат, такой как гидрокарбонат натрия, бентонит, оксид магния или минеральный комплекс; минеральный препарат, представляющий собой микроэлемент, такой как цинк, медь, кобальт или селен; витаминный препарат, такой как каротин, витамин Е, витамины А, витамин D, никотиновая кислота или комплекс витаминов группы В; защитный аминокислотный препарат, такой как метионин или лизин; защитный жирнокислотный препарат, такой как кальциевая соль жирных кислот; препарат живых бактерий, таких как пробиотические бактерии (молочнокислые бактерии), дрожжевые культуры или продукты брожения с использованием плесневых грибов; и дрожжевой препарат.

Используемый здесь термин "пищевая композиция" включает все виды пищевых продуктов, таких как функциональная пища, питательная добавка, здоровая пища и пищевые добавки. Вышеуказанная пищевая композиция может быть получена в различных формах в соответствии со способами, общеизвестными в данной области техники.

В настоящем изобретении предложен способ получения композиции, содержащей биомассу или биомасло. Биомасса, биомасло и композиция являются такими, как описано выше.

В указанном выше способе получения биомасла, биомасло, включающее высокое содержание докозагексаеновой кислоты, может быть получено посредством стадии культивирования микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium, имеющих высокую продуктивность докозагексаеновой кислоты, в культуральной среде, содержащей источник углерода определенного состава и источник азота определенного состава в гетеротрофных условиях.

Способ осуществления изобретения

Ниже настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры. Однако эти Примеры являются лишь иллюстративными для настоящего изобретения и объем настоящего изобретения не ограничен этими Примерами.

Микроводоросли CJM01 по настоящему изобретению представляют собой микроводоросли, принадлежащие к семейству Thraustochytrid и способны продуцировать полиненасыщенные жирные кислоты, включающие высокое содержание докозагексаеновой кислоты. Микроводоросли CJM01 по настоящему изобретению имеют нуклеотидную последовательность ДНК гена 18S рРНК, представленную в SEQ ID ΝΟ:1, и имеют высокое содержание биомассы в гетеротрофных условиях, но не в ростовых условиях в световой культуре (light culture).

В следующих Примерах экспериментальные методы описаны более подробно.

Пример 1: Выделение водорослей КС01 семейства Thraustochytrid

Для выделения штаммов водорослей семейства Thraustochytrid были проведены следующие эксперименты.

В частности, собирали морскую воду, почву, листья и пробы окружающей среды из 20 прибрежных районов областей Кодже и Тхонъён в Кенсан-Намдо, Южная Корея. Затем образцы хранили в ящике со льдом при температуре 10°С и переносили в лабораторию. Образцы использовали в работе по выделению бактерий в течение 2-3 суток. Эти образцы были непосредственно нанесены мазками на среду с агаром и затем штаммы Thraustochytrid выделяли, используя метод нанесения жидкого соснового порошка. Каждый образец, включающий микроводоросли-подобную форму, наблюдаемую в микроскопе, наносили мазками на культуральную среду IYP для микробиологического выделения (1 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л пептона, 2 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 20 г/л морской соли, 5,0 мг/л Н₃ВО₃, 3,0 мг/л МnСl₂, 0,2 мг/л CuSO₄, 0,05 мг/л NaMo₄⋅2H₂O, 0,05 мг/л CoSO₄, 0,7 мг/л ZnSO₄⋅7H₂O и 15 г/л агара) с получением колоний. Полученные колонии несколько раз подвергали субкультивированию для очистки и отделения, и затем отбирали и выделяли только штаммы, образующие зооспорангии, характерные для микроводорослей Thraustochytrid. Природные образцы, которые не могут быть подтверждены посредством микроскопического наблюдения, разбавляли и промывали, используя стерилизованную морскую воду с соленостью 1,5%, а затем эти образцы распрыскивали с сосновым порошком и культивировали. Микробные сообщества, полученные посредством культивирования при температуре и рН, аналогичных окружающей среде каждой коллекции, наносили мазками на культуральную среду IYP для выделения микроорганизмов и субкультивировали для очистки и разделения. В этом случае вводили раствор коктейля антибиотиков (0-500 мг/л сульфата стрептомицина, 0-500 мг/л ампициллина, 0-500 мг/л пенициллина G и 0-500 мг/л сульфата канамицина) с корректировкой их концентрации и таким образом контролировали рост и загрязнение другими микробами.

Отделенные колонии культивировали в колбе объемом 500 мл при температуре от 15°С до 28°С и скорости вращения от 50 до 200 об/мин в течение примерно 7 суток с использованием культуральной среды IGGYP (10 г/л глицерина, 10 г/л глюкозы, 1 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л пептона, 2 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 20 г/л самосадочной соли, 5,0 мг/л Н₃ВО₃, 3,0 мг/л МnСl₂, 0,2 мг/л CuSO₄, 0,05 мг/л NaMo₄⋅2H₂O, 0,05 мг/л CoSO₄, 0,7 мг/л ZnSO₄⋅7H₂O и 10 мл/л раствора смеси витаминов). Наконец был выбран один вид микроводорослей, скорость роста которого была быстрой и условия культивирования небыли сложными, и были выделены грибные тела. Формы выделенных штаммов наблюдали с помощью оптического микроскопа (показано на Фиг. 1). Выбранные грибные тела промывали фосфатным буферным раствором (PBS, рН 7,5) и затем сушили в сухой печи при 55°С в течение 16 часов с получением сухих грибных тел.

Последовательность гена 18s рРНК была проанализирована для молекулярной идентификации штаммов окончательно выбранных микроводорослей. ДНК выделяли от чисто отделенных колоний выбранных видов и затем 18s рРНК амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров для амплификации генов в области 18s рРНК. Праймеры для амплификации генов обощены в Таблице 1 ниже.

В этом случае после денатурации при 95°С в течение 5 минут, выполняли PCR, в течение в общей сложности 25 циклов В следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд; отжиг при 52°С в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°С в течение 1 минуты и 30 секунд. После этого была проведена реакция полимеризации при 72°С в течение 7 минут.

В результате анализа нуклеотидной последовательности с использованием амплифицированного реакционного раствора, была получена нуклеотидная последовательность 1 (SEQ ID NO: 1) размером примерно 1792 п.н. В результате поиска с помощью NCBI BLAST было обнаружено, что нуклеотидная последовательность 1 имеет примерно 99% гомологию со штаммами рода Thraustochytrium, о которых сообщалось ранее, и примерно 84% гомологию со штаммами рода Aurantiochytrium и рода Schizochytriит.

Таким образом, получено филогенетическое дерево для штаммов и результаты этого показаны на Фиг. 2. Соответствующие штаммы были идентифицированы как микроводоросли рода Thraustochytrium семейства Thraustochytrid и были, таким образом, названы, как КС01 рода Thraustochytrium.

Пример 2: Разработка мутантных водорослей

Пример 2-1: Отбор мутантных микроводорослей с помощью метода искусственных мутаций

В настоящем изобретении был проведен следующий эксперимент с целью выделения штаммов, обладающих улучшенной продуктивностью докозагексаеновой кислоты (DHA), посредством индукции мутации при помощи гамма-облучения с получением штаммов КС01 рода Thraustochytrium, которые были выделены в Примере 1.

В частности, штаммы КС01 рода Thraustochytrium культивировали в культуральной среде GYEP (2% глюкозы, 1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта и 2% самосадочной соли) в течение 24 часов для активации штаммов. Активированные штаммы инокулировали в субкультуральной среде (5% глюкозы, 1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта и 2% самосадочной соли), которая была стерилизована при 121°С в течение 15 минут, и культивировали в течение 14 часов и затем выделяли грибные тела. Выделенные грибные тела суспендировали в 50 мл буфера PBS, облучали гамма-лучами в дозе 1-5 кГр в течение 1 часа, и затем культивировали в 50 мл базовой культуральной среды (5% глюкозы, 1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта и 2% самосадочной соли) с использованием 500 мл колбы при температуре 28°С и вращении при 120 об/мин в течение 2 суток. Затем суспендированные грибные тела были соответствующим образом разбавлены при уровне гибели 99% и их дважды субкультивировали в культуральной среде GYEP в плоском планшете (2% глюкозы, 1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта и 2% самосадочной соли, 2% агара, рН 7,0).

В первую очередь были отобраны колонии, цвет которых становится белым, для того, чтобы выбрать штаммы, которые, по прогнозам, будут иметь сниженные сульфатированные пигменты, продуцируемые в дополнение к маслам, содержащим полиненасыщенные жирные кислоты. Мутантные штаммы, полученные вышеуказанным способом, были названы штаммами CJM01 рода Thraustochytrium, и депонированы 30 мая 2018 г в Корейской коллекции типовых культур (КСТС), международный депозитарий в соответствии с Будапештским договором под номером депонировния КСТС 13538 ВР.

Пример 2-2: Анализ способности впервые выделенных микроводорослей и мутантных штаммов продуцировать масло, содержащее полиненасыщенные жирные кислоты.

Штаммы CJM01 и КС01, выбранные из Примера 2-1, культивировали следующим образом, чтобы сравнить способность штаммов CJM01 продуцировать масло, содержащее полиненасыщенные жирные кислоты, со способностью штаммов КС01 продуцировать масло, содержащее полиненасыщенные жирные кислоты.

В частности, чтобы культивировать штаммы CJM01 и КС01, которые представляют собой микроводоросли рода Thraustochytrium по настоящему изобретению, штаммы CJM01 и КС01 культивировали в культуральной среде MJW01 (30 г/л глюкозы, 3,0 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 10 г/л Na₂SO₄, 1,0 г/л NaCl, 9,0 г/л дрожжевого экстракта, 1,0 г/л MSG⋅1H₂O, 1,0 г/л NaNO₃, 0,1 г/л KН₂РO₄, 0,5 г/л K₂НРO₄, 0,5 г/л СаСl₂ и 10 мл/л раствора смеси витаминов) в условиях базовой культуральной среды 28°С, 300 об/мин, 1 об/об/мин и рН 7,5 в течение 4 суток. Грибные тела извлекали центрифугированием, трижды промывали буфером PBS, а затем сушили при 55°С в течение 12 часов для измерения массы грибных тел.

Содержание масла, содержащего докозагексаеновую кислоту, при использовании сухих грибных тел, измеряли следующим образом. В частности, на 2 г сухих грибных тел наносили 8,3 м раствора соляной кислоты для гидролиза клеточных стенок грибных тел микроводорослей при 80°С, к сухим грибным телам добавляли 30 мл этилового эфира и 20 мл петролейного эфира и перемешивали в течение 30 секунд, а затем смесь разделяли в центрифуге 3. Эту процедуру повторяли три раза или более. Затем отделенный слой растворителя извлекали, помещали в круглую колбу, массу которой предварительно измеряли, продували азотом для удаления растворителя, а затем полученный продукт помещали в емкость, из которой была удалена влага, и сушили. Массу высушенного масла измеряли для расчета общего содержания масла. Содержание DHA в масле измеряли посредством хроматографии после предварительной обработки масла 0,5 н. метанольным NaOH и 14% трифторидом бора (BF₃)- метанолом.

Характеристики культуры штаммов КС01 рода Thraustochytrium, культивируемых вышеуказанным способом, и характеристики культуры мутантных штаммов CJM01, полученных посредством гамма-облучения, представлены в Таблицах 2 и 3. Из Таблиц 2 и 3 было установлено, что была получена DHA, которая является высокофункциональным омега-3 маслом.

"Биомасса" в Таблицах 2 и 3 относится к концентрации грибных тел в культуральном растворе и может использоваться в комбинации с сухой массой клеток (DCW). Содержание DHA выражают как ее содержание по отношению к биомассе или к общему количеству жирных кислот (TFA).

Как показано в следующих результатах, было обнаружено, что продуцирование DHA мутантными штаммами CJM01 была улучшено по сравнению с продуцированием родительскими штаммами (штаммами КС01 рода Thraustochytrium) (см. Таблицы 2 и 3). В частности, продуцирование DHA мутантными штаммами CJM01 была увеличено примерно в 1,3 раза по сравнению со штаммами КС01. Кроме того, было установлено, что продуцирование DHA мутантными штаммами CJM01 было увеличено примерно в 1,7 раза по сравнению со штаммами КС01, поскольку время культивирования было значительно сокращено без уменьшения полученных грибных тел.

Из приведенных выше результатов было установлено, что штаммы CJM01, являющиеся мутантными штаммами, имели повышенное содержание DHA и улучшенную проводимость DHA по сравнению со штаммами КС01, которые являются родительскими штаммами.

Пример 2-3: Анализ способности впервые выделенных микроводорослей и мутантных штаммов продуцировать аминокислоты.

Для оценки характеристик культуры штаммов CJM01 определяли общее содержание аминокислот в вышеуказанном культуральной растворе.

В частности, из каждого из указанных выше культуральных растворов отбирали 10 мл пробы, разбавляли дистиллированной водой в 20 раз и фильтровали, и затем общее содержание аминокислот анализировали с использованием жидкостной хроматографии. В результате анализа суммарной концентрации аминокислот аспартат, серии, глутамат, глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, лизин и аргинин были соответственно обнаружены в культуральном растворе родительских штаммов КС01 в количестве 10 мг/л, тогда как большинство аминокислот не было обнаружено в культуральном растворе штаммов CJM01, имеющих улучшенное содержание DHA

В частности, было обнаружено, что в случае мутантных штаммов CJM01 общая концентрация аминокислот как побочных продуктов, отличных от DHA, снижена примерно на 99% или более, по сравнению с родительскими штаммами КС01 (см. Таблицу 4).

Таким образом, было обнаружено, что в случае мутантных штаммов CJM01 рост грибных тел находится на эквивалентном уровне по сравнению с родительскими штаммами КС01, и общее содержание липидов не сильно снижено по сравнению с содержанием грибных тел, и, таким образом, мутантные штаммы CJM01 используют предоставляемый источник углерода для механизма биосинтеза DHA более эффективно, чем родительские штаммы КС01.

Пример 3: Оптимимзация условий культуральной среды

Для дальнейшего улучшения содержания и продуцирования DHA с использованием штаммов CJM01, имеющих пониженное содержание аминокислот и улучшенное содержание DHA, из примера 2 были выбраны штаммы, и условия среды были оптимизированы.

В частности, на основе культуральной среды MJW01, используемой в Примере 2-2, для того чтобы увеличить содержание источников азота в культуральной среде и снизить себестоимость продукции, концентрацию дрожжевого экстракта в качестве органического источника азота понижали, добавляли (NH₄)₂SO₄ в качестве неорганического источника азота и повышали концентрацию NaNO₃ для превращения культуральной среды MJW01 в культуральную среду MJW02 (30 г/л глюкозы, 5,0 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 3 г/л Na₂SO₄, 0,5 г/л NaCl, 1,0 г/л дрожжевого экстракта, 1,0 г/л MSG⋅1H₂O, 8,0 г/л NaNO₃, 3,0 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,1 г/л KН₂РO₄, 0,5 г/л K₂НРO₄, 0,1 г/л СаСl₂, и 10 мл/л раствора смеси витаминов).

Чтобы сравнить условия культуральной среды MJW01 с условиями культуральной среды MJW02, штаммы CJM01 соответственно культивировали в вышеуказанных культуральных средах. В результате, как показано в Таблице 5 ниже, количество грибных тел уменьшалось с уменьшением концентрации дрожжевого экстракта, но время культивирования значительно сокращалось с увеличением источника неорганического азота. Следовательно, было обнаружено, что содержание DHA в культуральной среде MJW02 равно или превышает количество DHA в культуральной среде MJW01, и продуцирование DHA в культуральной среде MJW02 увеличено в 1,13 раза по сравнению с продуцированием DHA в культуральной среде MJW01.

Как описано выше, специалисты в данной области смогут понять, что настоящее изобретение может быть легко выполнено в других подробных формах без изменения технической идеи или его существенных признаков. Поэтому следует понимать, что вышеуказанные воплощения являются иллюстративными во всех аспектах и не являются ограничивающими. Объем настоящего изобретения представлен нижеописанной формулой изобретения, а не подробным описанием, и следует понимать, что значение и объем формулы изобретения, а также все изменения или модифицированные формы, полученные из их эквивалентов, входят в объем настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium КСТС 13538ВР, обладающие повышенным продуцированием докозагексаеновой кислоты (DHA) и уменьшенным продуцированием аминокислот; способ получения биомассы, включающий культивирование заявленных микроводорослей, и способ получения биомасла, включающий культивирование заявленных микроводорослей и извлечение из них липида, содержащего докозагексаеновую кислоту (DHA). Изобретения обеспечивают получение продукта с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот, в частности докозагексаеновой кислоты, пригодного для использования в качестве кормовой композиции. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 3 пр.

1. Микроводоросли CJM01 (номер депонирования: КСТС 13538ВР) рода Thraustochytrium, у которых увеличено продуцирование докозагексаеновой кислоты (DHA) и уменьшено продуцирование аминокислот по сравнению с микроводорослями дикого типа.

2. Микроводоросли по п. 1, где микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium содержат докозагексаеновую кислоту в количестве 40% масс. - 60% масс. в расчете на общую массу жирных кислот.

3. Микроводоросли по п. 1, где микроводоросли CJM01 рода Thraustochytrium имеют продуцирование докозагексаеновой кислоты от 0,5 до 0,7 г/л/ч.

4. Способ получения биомассы, включающий:

культивирование микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium по п. 1 и извлечение биомассы, содержащей докозагексаеновую кислоту, из микроводорослей, продукта их культивирования, их высушенного продукта и их пульверизированного продукта.

5. Способ по п. 4, где культивирование проводят в гетеротрофных условиях.

6. Способ по п. 4, где культивирование осуществляют с использованием культуральной среды, включающей источник углерода и источник азота.

7. Способ по п. 6, где источник углерода представляет собой по меньшей мере один источник, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, мальтозы, галактозы, маннозы, сахарозы, арабинозы, ксилозы и глицерина.

8. Способ по п. 6, где источник азота представляет собой 1) органический источник азота, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, говяжьего экстракта, пептона и триптона, или 2) неорганический источник азота, выбранный из группы, состоящей из ацетата аммония, нитрата аммония, хлорида аммония, сульфата аммония, нитрата натрия, мочевины и однозамещенного глутамата натрия (MSG).

9. Способ получения биомасла, включающий: культивирование микроводорослей CJM01 рода Thraustochytrium по п. 1 и извлечение липида, содержащего докозагексаеновую кислоту (DHA), из микроводорослей, продукта их культивирования, их высушенного продукта или их пульверизированного продукта.