НОВЫЙ ШТАММ SCHIZOCHYTRIUM SP. И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/12 A23K10/16 C12P7/6409 C12P7/6427 C12P7/6432 C12P7/6434 C12R1/89 

Область изобретения

Настоящая заявка на изобретение относится к новым штаммам рода Schizochytrium {Schizochytrium sp.) и способу получения полиненасыщенных жирных кислот с их использованием.

Предшествующий уровень техники

Ненасыщенные жирные кислоты представляют собой жирные кислоты, имеющие одну или более чем одну двойную связь в цепи жирной кислоты, и ненасыщенные жирные кислоты, включающие две или более двойных связей, называют полиненасыщенными жирными кислотами (PUFA). Среди полиненасыщенных жирных кислот докозагексаеновая кислота (DHA) и эйкозапентаеновая кислота (ЕРА) являются типичными омега-3 жирными кислотами, которые важны для головного мозга, глазной ткани и нервной системы. Кроме того, известно, что они играют важную роль в развитии нервной системы, такой как острота зрения и способность двигательных нейронов у детей, и в профилактике сердечно-сосудистых заболеваний, и являются наиболее распространенным компонентом в структурных липидах головного мозга.

Большинство высших организмов, включая людей, не могут самостоятельно синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты, таким образом, полиненасыщенные жирные кислоты должны потребляться в виде существенных питательных веществ, и главным образом поставляются от глубоководных рыб, которые занимают более высокие разряды морской экологической окружающей среды, таких как тунец и лосось. Главный промышленный источник полиненасыщенных жирных кислот, идентифицированных до настоящего времени, представляет собой рыбий жир, экстрагированный из жиров голубой рыбы, такой как макрель, сайра, тунец, ставрида, сардина и сельдь, который также очень полезен для корма для рыб, такого как первичный корм для морской рыбы. Тем не менее, поскольку качество рыбьего жира варьирует в зависимости от вида, сезона и места промысла, и существуют трудности в непрерывном снабжении рыбьим жиром, а также вследствие проблем загрязнения рыбьего жира тяжелыми металлами и органическими химическими веществами, уникального рыбьего запаха рыбьего жира и ограниченной продукции вследствие окисления двойных связей в ходе процессов переработки, возникает потребность в альтернативных источниках полиненасыщенная жирных кислот.

Для решения этих проблем в настоящее время проводится исследование в области способов получения полиненасыщенных жирных кислот, включающих докозагексаеновую кислоту, посредством микробной культуры. В частности, микроводоросли могут продуцировать липиды и их легко культивировать, что позволяет продуцировать биомассу, имеющую относительно постоянный биохимический состав. Кроме того, липиды, продуцируемые микроводорослями, не имеют неприятного запаха подобно рыбьему жиру, и имеют более простую композицию жирных кислот, чем рыбий жир, поэтому может быть легко выделить конкретные жирные кислоты. Соответственно, новые микроводоросли, способные стабильно продуцировать специфическую жирную кислоту на высоком уровне, имеют большую промышленную ценность, и поэтому необходимо разрабатывать такие микроводоросли.

Описание

Техническая проблема

Задача настоящей заявки заключается в том, чтобы предложить микроводоросли рода Schizochytrium (Schizochytrium sp.), которые депонированы под номером доступа KCTC14344BP или KCTC14345BP и способны продуцировать докозагексаеновую кислоту (DHA), эйкозапентаеновую кислоту (ЕРА) и пальмитиновую кислоту (РА).

Задача настоящей заявки также заключается в том, чтобы предложить биомассу, имеющую происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, и включающую ее кормовую композицию.

Задача настоящей заявки также заключается в том, чтобы предложить способ получения биомассы или биомасла, имеющих происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium.

Техническое решение

Каждое описание и воплощение, раскрытые в данной заявке, также могут применяться к другим описаниям и воплощениям. То есть, все комбинации различных элементов, раскрытых в заявке, входят в объем заявки. Кроме того, не следует трактовать, что объем настоящей заявки ограничен подробным раскрытием, описанным ниже. Кроме того, специалисты в данной области техники понимают или подтверждают множество эквивалентов описанных здесь конкретных аспектов настоящей заявки исключительно при помощи экспериментов, известных в области техники. Кроме того, предполагается, что такие эквиваленты включены в данную заявку.

В одном аспекте предложены микроводоросли рода Schizochytrium, обладающие способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и пальмитиновую кислоту, и депонированные под номером доступа KCTC14344BP или KCTC14345BP.

Используемый здесь термин "Thraustochytrid" относится к микроводорослям порядка Thraustochytriales. Кроме того, используемый здесь термин "род Schizochytrium (Schizochytrium sp.)" представляет собой одно из названий рода, принадлежащего к семейству Thraustochytriaceae порядка Thraustochytriales, и может быть использован взаимозаменяемо с термином "род Schizochytrium". Кроме того, термин "микроводоросли" относится к организмам, которые фотосинтезируют с хлорофиллом, которые свободно плавают в воде, которые нельзя увидеть невооруженным глазом, а можно увидеть только через микроскоп, и эти микроводоросли также называют фитопланктоном.

Используемый здесь термин "докозагексаеновая кислота (DHA)" относится к одной из полиненасыщенных жирных кислот, имеющих формулу C₂₂H₃₂O₂, и она является одной из омега-3 жирных кислот наряду с альфа-линоленовой кислотой (ALA) и эйкозапентаеновой кислотой (ЕРА), ее тривиальным названием является цервоновая кислота, и также может быть сокращенно обозначена как 22:6 n-3.

Использованный здесь термин "эйкозапентаеновая кислота (ЕРА)" относится к одной из полиненасыщенных жирных кислот, имеющих формулу С₂0Н₃₀О₂, и она является одной из омега-3 жирных кислот наряду с ALA и DHA, и сокращенно также может быть обозначена как 20:5 n-3.

Использованный здесь термин "пальмитиновая кислота (РА)" относится к одной из насыщенных жирных кислот, имеющих формулу С₁₆Н₃₂О₂.

Микроводоросли рода Schizochytrium могут представлять собой новые микроводоросли дикого типа CD01-5000 рода Schizochytrium, депонированные под номером доступа KCTC14344BP, или их вариант, микроводоросли CD01-5004 рода Schizochytrium, депонированные под номером доступа KCTC14345BP.

Микроводоросли рода Schizochytrium могут обладать нуклеотидной последовательностью 18S рРНК (рибосомальная РНК) с SEQ ID NO: 1, но без ограничения ею. Например, микроводоросли рода Schizochytrium могут обладать 18S рРНК, состоящей из нуклеотидной последовательности, демонстрирующей идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью с SEQ ID NO: 1, равную 80% или больше, 85% или больше, 90% или больше, 95% или больше, 98% или больше или 99% или больше, но не ограниченную этим.

Микроводоросли рода Schizochytrium могут продуцировать от 35 масс. % до 60 масс. % DHA на основе общей массы жирных кислот. Например, микроводоросли рода Schizochytrium могут продуцировать от 40 масс. % до 60 масс. %, от 45 масс. % до 60 масс. %, от 50 масс. % до 60 масс. %, от 35 масс. % до 58 масс. %, от 40 масс. % до 58 масс. %, от 45 масс. % до 58 масс. % или от 50 масс. % до 58 масс. % DHA на основе общей массы жирных кислот. Кроме того, микроводоросли рода Schizochytrium могут включать от 35 масс. % до 60 масс. % DHA на основе общей массы жирных кислот.

Микроводоросли рода Schizochytrium могут продуцировать от 0,5 масс. % до 10 масс. % ЕРА на основе общей массы жирных кислот. Например, микроводоросли рода Schizochytrium могут продуцировать от 0,5 масс. % до 8 масс. %, от 0,5 масс. % до 5 масс. %, от 0,5 масс. % до 3 масс. %, от 0,8 масс. % до 10 масс. %, от 0,8 масс. % до 8 масс. %, от 0,8 масс. % до 5 масс. %, от 0,8 масс. % до 3 масс. %, от 1 масс. % до 10 масс. %, от 1 масс. % до 8 масс. %, от 1 масс. % до 5 масс. % или от 1 масс. % до 3 масс. % ЕРА на основе общей массы жирных кислот. Кроме того, микроводоросли рода Schizochytrium могут включать от 0,5 масс. % до 10 масс. % ЕРА на основе общей массы жирных кислот.

Микроводоросли рода Schizochytrium могут продуцировать от 10 масс. % до 30 масс. % РА на основе общей массы жирных кислот. Например, микроводоросли рода Schizochytrium могут продуцировать от 15 масс. % до 30 масс. % или от 20 масс. % до 30 масс. % РА на основе общей массы жирных кислот. Кроме того, микроводоросли рода Schizochytrium могут включать от 10 масс. % до 30 масс. % РА на основе общей массы жирных кислот.

Микроводоросли рода Schizochytrium могут обладать способностью продуцировать каротиноиды. Например, микроводоросли рода Schizochytrium могут продуцировать по меньшей мере один каротиноид, выбранный из группы, состоящей из β-каротина, лютеина, астаксантина, капсантина, аннато, кантаксантина, ликопина, β-апо-8-каротиналя, зеаксантина сложного эфира и β-апо-8-каротиналя.

Используемый здесь термин "каротиноид" относится к пигменту терпеноидов, синтезированному из фитоена, состоящего из 40 атомов углерода, и продуцируемому микроорганизмами, такими как микроводоросли и бактерии, или грибы, такие как плесневые грибы и высшие грибы, и более высшими организмами. Каротиноиды широко используются в качестве пищевых или кормовых добавок вследствие их уникального цвета и обладают сильным антиоксидантным действием вследствие своей длинной цепи с двойными связями и кетоновой группы (С=O) или гидроксильной группы (-ОН) и, таким образом, также исследуются в качестве лекарственных средств и продуктов лечебного питания. Каротиноиды включают β-каротин, лютеин, астаксантин, капсантин, аннато, кантаксантин, ликопин, β-апо-8-каротиналь, зеаксантин или сложный эфир β-апо-8-каротиналя т.п.

В других аспектах предложены: микроводоросли рода Schizochytrium, депонированные под номером доступа KCTC14344BP или KCTC14345BP и обладающие способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и пальмитиновую кислоту; и биомасса, имеющая происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, включая культуры указанных микроводорослей, высушенные продукты указанной культуры или лизаты указанных высушенных продуктов.

Микроводоросли рода Schizochytrium являются такими как описано выше.

Используемый здесь термин "биомасса" относится к организмам, таким как растения, животные и микроорганизмы, которые могут быть использованы в качестве химической энергии, то есть, энергетический источник биоэнергии, и экологически относится к массе или количеству энергии у конкретного организма, который существует в единицу времени и пространства. Кроме того, биомасса включает, без ограничения ими, соединения, секретируемые клетками, и может содержать клетки и/или внутриклеточное содержимое, а также внеклеточные материалы. В настоящей заявке биомасса может представлять собой сами микроводоросли рода Schizochytrium, их культуру, высушенный продукт, лизат или продукт, продуцируемый путем культивирования или ферментирования указанных микроводорослей, или может представлять собой концентрат или высушенный продукт биомассы, но не ограничивается ими.

Термин "культура" микроводорослей рода Schizochytrium относится к продукту, полученному путем культивирования микроводорослей, в частности, термин может относиться к культуральной среде, включающей микроводоросли, или культуральному фильтрату, в котором микроводоросли удалены из культуральной среды, но не ограничен этим. "Высушенный продукт" культуры микроводорослей рода Schizochytrium может представлять собой продукт, в котором влага удалена из культуры микроводорослей, например, в форме высушенных клеток микроводорослей, но не ограничиваясь этим. Кроме того, "лизат" высушенного продукта представляет собой общий термин для получающихся в результате продуктов разрушения высушенного материала, в которых влага удалена из культуры микроводорослей, и может представлять собой, например, порошок из высушенных фрагментов, но не ограничиваться этим. Культура микроводорослей рода Schizochytrium может быть получена посредством инокулирования микроводорослей в культурную среду для микроводорослей и культивирования в соответствии со способами культивирования, известными в области техники, а высушенные продукты указанной культуры и их лизаты могут быть получены путем обработки или посредством способов сушки микроводорослей или культурной среды, известными в области техники.

Биомасса, имеющая происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, может включать от 35 масс. % до 60 масс. % DHA на основе общей массы жирных кислот, может включать от 0,5 масс. % до 10 масс. % ЕРА на основе общей массы жирных кислот, и может включать от 10 масс. % до 30 масс. % РА на основе общей массы жирных кислот.

Кроме того, биомасса, имеющая происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, может включать каротиноиды, например, по меньшей мере один каротиноид, выбранный из группы, состоящий из β-каротина, лютеина, астаксантина, капсантина, аннато, кантаксантина, ликопина, β-апо-8-каротиналя, зеаксантина и сложного эфира β-апо-8-каротиналя.

Биомассу можно продуцировать посредством способа получения биомассы, имеющей происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium в соответствии с аспектом.

В еще одном аспекте предложена композиция, включающая микроводоросли рода Schizochytrium, культуры указанных микроводорослей, высушенные продукты указанных культур или лизаты указанных высушенных продуктов, где микроводоросли депонированы под номером доступа KCTC14344BP или KCTC14345BP и обладают способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и пальмитиновую кислоту. Композиция может включать биомассу или биомасло, имеющие происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium.

В еще одном аспекте предложена кормовая композиция, включающая биомассу, имеющую происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, либо концентраты или высушенные продукты указанной биомассы, где микроводоросли депонированы под номером доступа KCTC14344BP или KCTC14345BP и обладают способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и пальмитиновую кислоту.

Микроводоросли рода Schizochytrium, биомасса, культура указанных микроводорослей, высушенный продукт указанной культуры и лизат указанного высушенного продукта являются такими, как описано выше.

Концентрат или высушенный продукт биомассы могут быть получены в соответствии со способами обработки, концентрирования или сушки микробной биомассы, известными в области техники.

Используемый здесь термин "биомасло" относится к маслу, полученному из биомассы при помощи способов биологического, термохимического и физико-химического экстрагирования, и биомасло, полученное в этой заявке, может содержать полиненасыщенные жирные кислоты, в частности, может содержать DHA и ЕРА, но без ограничения этим.

Композиция может находиться в форме раствора, порошка или суспензии, но не ограничивается ими. Композиция может представлять собой, например, пищевую композицию, кормовую композицию или композицию кормовой добавки.

Используемый здесь термин "кормовая композиция" относится к корму, которым кормят животных. Кормовая композиция относится к материалу, который обеспечивает поступление органических или неорганических питательных веществ, необходимых для поддержания жизни животных, или продуцирования мяса, молока и т.п. Кормовая композиция дополнительно может включать необходимые питательные вещества для поддержания жизни животных или продуцирования мяса, молока и т.п. Кормовая композиция может быть приготовлена в виде корма в различных формах, известных в области техники и, в частности, эти формы могут включать концентрированные корма, крупнозернистые корма и/или специальные корма.

Используемый здесь термин "кормовая добавка" включает вещество, добавляемое в корм для различных целей, таких как дополнение питательными веществами, предупреждение потери массы, улучшение перевариваемости волокна в корме, улучшение качества масла, предупреждение репродуктивных расстройств, улучшение степени осеменения и предупреждение высокотемпературного стресса летом и т.п. Кормовая добавка в соответствии с настоящей заявкой соответствует подкормке в соответствии с Актом руководства по кормлению (Feed Management Act), и может дополнительно включать препараты минералов, таких как бикарбонат натрия, бентонит, оксид магния, сложные минеральные вещества и т.п, препараты микроэлементов, таких как цинк, медь, кобальт, селен и т.п., препараты витаминов, таких как каротин, витамин Е, витамины A, D, Е, никотиновая кислота, комплекс витаминов В и т.п., препараты защищенных аминокислот, таких как метионин и лизин, и т.п., защищенные жирные кислоты, такие как кальциевые соли жирной кислоты и т.п., живые бактерии, такие как пробиотики (молочнокислые бактерии), дрожжевые культуры, ферментированные продукты плесневых грибов и т.п., дрожжи и т.п.

Используемый здесь термин "пищевая композиция" включает все формы функциональных продуктов, пищевых добавок, продуктов для здоровья и пищевых добавок и т.п., и вышеупомянутые типы пищевых композиций могут быть получены в различных формах в соответствии с общим способом, известным в области техники.

Композиция в соответствии с настоящей заявкой может дополнительно включать зерновые, такие как измельченная или молотая пшеница, овес, ячмень, кукуруза и рис; корма на основе растительного белка, такие как корма, имеющие в качестве основных ингредиентов сою и подсолнечник; корм на основе животного белка, такой как кровяная мука, мясная мука, костная мука и рыбная мука; сахар и молочные продукты, например, сухие ингредиенты, состоящие из различного сухого молока и сывороточного порошка и т.п., и могут дополнительно включать пищевые добавки, усилители пищеварения и поглощения, усилители роста и т.п.

Композиция в соответствии с настоящей заявкой может быть введена животному сама по себе или в сочетании с другими кормовыми добавками в съедобном носителе. Кроме того, композиция легко может быть введена животным в виде подкормки или будучи непосредственно смешана с кормом, или в виде композиции для перорального введения, отделенной от корма. Когда композицию вводят отдельно от корма, тогда композиция может быть приготовлена в виде композиции с немедленным высвобождением или длительным высвобождением путем комбинирования с фармацевтически приемлемым съедобным носителем, как хорошо известно в области техники. Такой съедобный носитель может быть твердым или жидким и может представлять собой, например, кукурузный крахмал, лактозу, сахарозу, соевые хлопья, арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло и пропиленгликоль. При использовании твердого носителя композиция может представлять собой таблетку, капсулу, порошок, пастилку или сахаросодержащую таблетку, или подкормку в микродисперсной форме. Когда используют жидкий носитель, тогда композиция может находиться в форме мягкой желатиновой капсулы или сиропа, суспензии, эмульсии или раствора.

Композиция в соответствии с настоящей заявкой может содержать, например, консервант, стабилизатор, увлажнитель или эмульгатор, криопротектор или эксципиент и т.п. Криопротектор может представлять собой по меньшей мере криопротектор, выбранный из группы, состоящей из глицерина, трегалозы, мальтодекстрина, сухого молока и крахмала.

Консервант, стабилизатор или наполнитель могут быть включены в композицию в эффективном количестве, достаточном для того, чтобы уменьшить деградацию микроводорослей рода Schizochytrium, включенных в композицию. Кроме того, криопротектор может быть включен в композицию в эффективном количестве, достаточном для уменьшения деградации микроводорослей рода Schizochytrium, включенных в композицию, когда композиция находится в высушенном состоянии.

Эта композиция может быть добавлена в корм для животных путем капания, распыления или смешивания, и использована.

Композиция в соответствии с настоящей заявкой может быть добавлена в диеты для множества животных, включая млекопитающих, птиц, рыб, ракообразных, цефалоподов, рептилий и амфибий, но без ограничения ими. Например, млекопитающие могут включать свиней, коров, овец, коз, лабораторных грызунов, домашние животных и т.д., птицы могут включать сельскохозяйственных птиц, и сельскохозяйственные птицы могут включать кур, индюков, уток, гусей, фазанов или перепелов и т.п., но не ограничиваться ими. Кроме того, рыбы могут включать коммерчески выращиваемых рыб и их мальков, аквариумных рыб и т.п, и ракообразные могут включать креветок, моллюсков и т.п, но не ограничиваться ими. Кроме того, эта композиция может быть добавлена в рацион коловраток, которые представляют собой зоопланктон.

В еще одном аспекте предложен способ получения биомассы, имеющей происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, включающий: культивирование микроводорослей; и выделение биомассы из указанных микроводорослей, культур микроводорослей, высушенных продуктов указанной культуры или лизатов указанных высушенных продуктов, где микроводоросли рода Schizochytrium депонированы под номером доступа KCTC14344BP или KCTC14345BP и обладают способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и пальмитиновую кислоту.

Микроводоросли рода Schizochytrium, биомасса, культура указанных микроводорослей, высушенный продукт указанной культуры и лизат указанного высушенного продукта являются такими, как описано выше.

Используемый здесь термин "культура" означает выращивание микроводорослей в надлежащим образом контролируемых условиях окружающей среды. Процессы культивирования в соответствии с настоящей заявкой могут быть осуществлены в соответствии с подходящими условиями среды и культуральными условиями, известными в области техники. Эти процессы культивирования могут быть легко адаптированы и использоваться специалистами в данной области техники в соответствии с выбранными микроводорослями.

В частности, выращивание микроводорослей рода Schizochytrium в соответствии с настоящей заявкой может быть осуществлено в гетеротрофных условиях, но не ограничено этим.

Используемый здесь термин "гетеротрофный" относится к способу питания, который основан на органических веществах, полученных извне организма, в качестве источника энергии или источника питательных веществ, и представляет собой термин, противоположный "автотрофному", и может использоваться взаимозаменяемо с термином 'темновая культура'.

Выращивание микроводорослей рода Schizochytrium может быть осуществлено при помощи известного способа периодического культивирования, способа непрерывного культивирования, способа культивирования с подпиткой и т.п, но конкретно этим не ограничено. В качестве среды и других условий культивирования, используемых для культивирования микроводорослей в соответствии с настоящей заявкой, без конкретного ограничения может быть использована любая среда, используемая для культивирования микроводорослей в данной области техники. В частности, микроводоросли в соответствии с настоящей заявкой могут культивироваться в среде согласно данной области техники, содержащей подходящие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины и т.п., при контроле температуры, рН и т.п., в аэробных условиях.

В частности, соответствующий рН (например рН 5-9, конкретно, рН 6-8, конкретней рН 6,8) может корректироваться с использованием основного соединения (например гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислотного соединения (например ортофосфорной кислоты или серной кислоты), но этим не ограничиваться.

Кроме того, для поддержания аэробного состояния культуры кислород или содержащий кислород газ может быть инжектирован в культуру, или для поддержания анаэробного и микроаэробного состояния газ может не инжектироваться, или может быть инжектирован газообразный азот, водород или диоксид углерода, но без ограничения этим.

Кроме того, культура может поддерживаться при температуре от 20°С до 45°С или от 25°С до 40°С, и может культивироваться в течение от приблизительно 10 часов до 160 часов, но не ограничиваться этим. Кроме того, во время культивирования пенообразование может подавляться путем использования пеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты, но не ограничиваться этим.

Источник углерода, включенный в среду, используемую при культивировании микроводорослей рода Schizochytrium, может представлять собой по меньшей мере источник углерода, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, мальтозы, галактозы, маннозы, сахарозы, арабинозы, ксилозы и глицерина, но не ограничиваться этим, и может использоваться любой источник углерода, используемый для культивирования микроводорослей.

Источник азота, включенный в среду, используемую при культивировании микроводорослей рода Schizochytrium, может представлять собой: (1) по меньшей мере один органический источник азота, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, говяжьего экстракта, пептона и триптона, или (2) по меньшей мере один неорганический источник азота, выбранный из группы, состоящей из ацетата аммония, нитрата аммония, хлорида аммония, сульфата аммония, нитрата натрия, мочевины и однозамещенного глутамата натрия (MSG), но не ограничиваться этим, и может применяться любой источник азота, используемый для культивирования микроводорослей.

В среду, используемую для культивирования микроводорослей рода Schizochytrium, в качестве источника фосфора могут быть включены по отдельности или в смеси дигидрофосфат калия, дикалия гидрофосфат, соответствующие им натрийсодержащие соли, но не ограничиваться этим.

Выделение биомассы из микроводорослей, культуры микроводорослей, высушенного продукта указанной культуры или лизата указанного высушенного продукта может представлять собой сбор желаемой биомассы с использованием подходящего способа, известного в области техники. Например, могут быть использованы центрифугирование, фильтрование, анионообменная хроматография, кристаллизация и высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) и т.п., и дополнительно может быть включен процесс очистки.

В еще одном аспекте предложен способ получения биомасла, имеющего происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, включающий: культивирование микроводорослей рода Schizochytrium; и выделение липидов из указанных микроводорослей, культуры указанных микроводорослей, высушенных продуктов указанной культуры или лизатов указанных высушенных продуктов, где микроводоросли рода Schizochytrium депонированы под номером доступа ЛСТС14344ВР или ЛСТС14345ВР и обладают способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и пальмитиновую кислоту.

Микроводоросли рода Schizochytrium, биомасло, культура указанных микроводорослей, высушенный продукт указанной культуры и лизат указанного высушенного продукта, и культивирование микроводорослей являются такими, как описано выше.

Выделение липидов из микроводорослей, культуры указанных микроводорослей, высушенного продукта указанной культуры или лизата указанного высушенного продукта может представлять собой сбор желаемых липидов с использованием подходящего способа, известного в области техники. Например, могут быть использованы центрифугирование, фильтрование, анионообменная хроматография, кристаллизация и HPLC и т.п., и дополнительно может быть включен процесс очистки.

Например, липиды и производные липидов, такие как альдегиды жирных кислот, жирные спирты и углеводороды (например алканы) могут быть экстрагированы при помощи гидрофобного растворителя, такого как гексан. Липиды и производные липидов также могут быть экстрагированы с помощью таких способов, как ожижение, масляное ожижение и сверхкритическая экстракция СО₂ и т.п. Кроме того, известный способ выделения липидов из микроводорослей включает, например, (1) сбор клеток путем центрифугирования, промывания дистиллированной водой и сушки лиофилизацией и (2) размалывание полученного клеточного порошка и затем экстрагирование липидов н-гексаном (Miao, X and Wu, Q, Biosource Technology (2006) 97:841-846).

Благоприятные эффекты

Новые микроводоросли рода Schizochytrium (Schizochytrium sp.) в соответствии с одним аспектом имеют высокое содержание жира в биомассе и, в частности, высокое содержание полиненасыщенных жирных кислот, таких как докозагексаеновая кислота (DHA) и эйкозапентаеновая кислота (ЕРА), и, таким образом, микроводоросли и биомасса или биомасло, полученные из них, могут быть полезны в качестве источника корма и т.п.

Описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой фотографию штамма CD01-5000 Schizochytrium sp., полученную при помощи оптического микроскопа.

Фиг. 2 представляет собой график кривых роста штаммов CD01-5000 и CD01-5004 Schizochytrium sp.

Фиг. 3 представляет собой график кривой роста штамма CD01-5004 Schizochytrium sp.

Осуществление изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано подробней при помощи примеров. Тем не менее, предполагается, что эти примеры иллюстрируют по меньшей мере один конкретный пример, и объем настоящего изобретения не ограничен этими примерами.

Пример 1. Выделение микроводорослей, представляющих собой Thraustochytrids

Для выделения микроводорослей, которые представляют собой Thraustochytrids, образцы окружающей среды в форме морской воды, почвы и осадка собирали в общей сложности из 50 прибрежных районов в Taean, Chungcheongnam-do и Gunsan, Jeollabuk-do, Корея. Собранные образцы окружающей среды транспортировали в лабораторию, и загрязнители, такие как грибы, другие бактериальные микроорганизмы и простейшие и т.п. удаляли в течение 7 суток, в то время как непосредственное высевание и нанесение на пыльцу сосны использовали для того, чтобы выделять микроводоросли, которые представляют собой Thraustochytrids. В процессе непрерывного удаления загрязнителей и выделения микроводорослей были выделены образцы, которые демонстрируют сходные формы с клетками, образующими зооспоры, и включают их, что является характеристиками микроводорослей, представляющих собой Thraustochytrids, и их высевали штрихом на модифицированной среде пептон - дрожжевой экстракт (YEP) (1 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л пептона, 2 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 20 г/л морской соли, 5,0 мг/л Н₃ВО₃, 3,0 мг/л MnCl₂, 0,2 мг/л CuSO₄, 0,05 мг/л NaMO₄⋅2H₂O, 0,05 мг/л CoSO₄, 0,7 мг/л ZnSO₄⋅7H₂O и 15 г/л агара), представляющей собой среду для выделения морских микроводорослей. Полученные колонии выделяли с очисткой путем нескольких субкультивирований. Колонии с персистирующим загрязнением обрабатывали раствором антибиотической смеси (от 0 мг/л до 100 мг/л сульфата стрептомицина, от 0 мг/л до 100 мг/л ампициллина, от 0 мг/л до 100 мг/л пенициллина G и от 0 мг/л до 100 мг/л сульфата канамицина) для контроля и удаления загрязнителей. В вышеописанном способе выделяли и получали приблизительно 50 колоний.

Чистые выделенные колонии выращивали в колбе объемом 250 мл в условиях от 10°С до 35°С и от 100 об./мин до 200 об./мин в течение приблизительно 7 суток с использованием модифицированной среды глюкоза - пептон- дрожжевой экстракт (GYEP) (10 г/л глюкозы, 1 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л пептона, 2 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 20 г/л морской соли, 5,0 мг/л Н₃ВО₃, 3,0 мг/л MnCl₂, 0,2 мг/л CuSO₄, 0,05 мг/л NaMO₄⋅2H₂O, 0,05 мг/л CoSO₄ и 0,7 мг/л ZnSO₄⋅7H₂O). Среди колоний был в итоге выделен один тип микроводорослей, способных расти при температуре 25°С или выше, обладающих превосходной скоростью роста, и из которых может быть сохранено достаточное количество клеток, который был обозначен как CD01-5000. Морфологию выделенного штамма устанавливали при помощи оптического микроскопа (Фиг. 1).

Пример 2. Идентификация нового штамма CD01-5000 Schizochytrium sp.

Для молекулярно-биологической идентификации микроводорослей штамма CD01-5000, выделенных и отобранных в Примере 1, анализировали последовательность гена 18S рРНК.

В частности, после экстракции и выделения нДНК (направляющая ДНК) из колоний чистых выделенных микроводорослей CD01-5000 осуществляли реакцию ПЦР путем использования праймеров, представленных в Таблице 1 ниже, в качестве праймеров для амплификации генов области 18S рРНК.

Для реакции ПЦР денатурацию при 95°С в течение 5 минут с последующей денатурацией при 95°С в течение 30 секунд, отжигом при 55°С в течение 30 секунд и полимеризацией при 72°С в течение 1 минуты 30 секунд повторяли 38 раз, и затем осуществляли полимеризацию при 72°С в течение 5 минут путем использования реакционного раствора, содержащего taq полимеразы. Реакционный раствор, амплифицированный при помощи способа ПЦР, подвергали электрофорезу в 1%-ном агарозном геле для подтверждения того, что амплифицировали фрагменты ДНК, имеющие размер приблизительно от 1600 п.о. до 2000 п.о., и осуществляли анализ путем секвенирования. В результате анализа получили нуклеотидную последовательность, имеющую размер, составляющий приблизительно, 1800 п.о. (SEQ ID NO: 1), и подтвердили, что эта нуклеотидная последовательность демонстрирует гомологию 99,3% с нуклеотидной последовательностью 18S рРНК штамма OUC192 Schizochytrium limacinum (NCBI №: НМ042913.2), относящегося к микроводорослям, которые представляют собой Thraustochytrids, и гомологию 99,3% с нуклеотидной последовательностью 18S рРНК штамма SH104 Schizochytrium sp.(NCBI №: KX379459.1) путем поиска NCBI BLAST. Посредством этого подтвердили, что выделенные микроводоросли CD01-5000 представляет собой новый штамм рода Schizochytrium, и этот штамм был назван Schizochytrium sp. CD01-5000 и 26 октября 2020 года был депонирован в Корейской коллекции типовых культур (KCTC), представляющей собой международный депозитарий в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры, и ему был присвоен номер доступа KCTC14344BP.

Пример 3. Разработка мутантных штаммов микроводорослей

Пример 3-1. Измерение показателя гибели в соответствии с облучением гамма-лучами

Для разработки искусственного мутантного штамма из новой микроводоросли CD01-5000, идентифицированной в Примере 2, были выбраны условия гамма-излучения путем измерения показателей гибели в зависимости от доз гамма-лучей.

А именно, новые микроводоросли CD01-5000 культивировали в модифицированной среде GYEP, содержащей 3% глюкозы, в течение приблизительно 20 часов или больше для достижения экспоненциальной фазы. Образец культуральной среды с культивированными клетками центрифугировали при 4000 об./мин в течение 15 минут для сбора клеток, и образец культуральной среды микроводорослей, суспендированный в PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) до 10⁹ клеток/мл, помещали в коническую пробирку объемом 50 мл и использовали для экспериментов с гамма-излучением. Эксперименты по облучению гамма-лучами осуществляли в Передовом научно-исследовательском центре по изучению радиации Корейского научно-исследовательского института по атомной энергии (Advanced Radiation Research Center of the Korea Atomic Energy Research Institute), и образец культуральной среды микроводорослей облучали гамма-лучами 2000 Гр (грэй), 2500 Гр, 3000 Гр, 3500 Гр, 4000 Гр, 4500 Гр, 5000 Гр, 5500 Гр, 6000 Гр, 7000 Гр или 8000 Гр. После удаления супернатанта путем центрифугирования образца культуральной среды микроводорослей, облученного гамма-лучами, этот образец инокулировали в среду GCBS, содержащую 1% глюкозы (10 г/л глюкозы, 5 г/л жидкого кукурузного экстракта, 5 г/л говяжьего экстракта, 5 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 15 г/л морской соли, 20,08 мг/л лимонной кислоты, 5,3 мг/л FeSO₄⋅7H₂O, 0,5 мг/л ZnSO₄⋅7H₂O, 1,0 мг/л MnCl₂, 0,1 мг/л CuSO₄, 0,1 мг/л NaMO₄⋅2H₂O, 0,1 мг/л CoSO₄, 1,0 мг/л биотина, 1,0 мг/л тиамин хлоргидрата, 1,0 мг/л САРА, и 0,1 мг/л витамина В12) и выращивали при 30°С в течение приблизительно 48 часов. Затем культуральную среду инокулировали и наносили штрихом на среду GYEP, содержащую 2% (20 г/л) агара, и культивировали при 30°С в течение 48 часов, а затем подсчитывали количество выросших колоний, и показатель гибели рассчитывали в зависимости от доз гамма-лучей в соответствии с уравнением 1.

Уравнение 1

Показатель гибели (%)=[{(Число колоний в необработанной группе) - (Число колоний в обработанной группе)}/(Число колоний в необработанной группе)] X 100

В результате, когда облучали дозой гамма-лучей 6000 Гр или больше, тогда все микроводоросли погибали, и колонии не могут быть сохранены, и выбирали условие с дозой гамма-излучения 5500 Гр, которая демонстрировала показатель 99,99%.

Пример 3-2. Выделение мутантных штаммов микроводорослей После облучения нового штамма микроводорослей CD01-5000 гамма-лучами в дозе 5000 Гр таким же образом, как описано в Примере 3-1, образцы культуры микроводорослей инокулировали и наносили штрихом соответственно на твердую среду GYEP и твердую среду GYEP, дополненную бутанолом и изониазидом, и выращивали при 30°С. Отбирали колонии микроводорослей, выросшие в каждой чашке с твердой средой в течение приблизительно 4 недель, и разделяли путем субкультивирования в такой же среде и условиях культивирования. Каждую колонию, выделенную путем субкультивирования, оценивали как отдельный мутантный штамм и дополнительно отбирали колонии и штаммы, способные к непрерывному росту.

Пример 3-3. Отбор превосходных мутантных штаммов микроводорослей

Для мутантных штаммов, отобранных в Примере 3-2, осуществляли оценку культуры в масштабе колбы и превосходный мутантный штамм был выбран при помощи анализов неочищенного жира и жирных кислот.

А именно, для культивирования новых микроводорослей дикого типа CD01-5000, подтвержденных в Примере 2, и мутантных микроводорослей, отобранных в Примере 3-2 в масштабе колбы, рабочий объем был установлен равным 50 мл в колбе объемом 500 мл, и в среде GYEP, включающей 3% (30 г/л) глюкозы, выращивали микроводоросли при 30°С и 180 об./мин в течение 24 часов для получения определенного количества клеток, которые могут быть проанализированы. Затем культуральную среду центрифугировали, используя коническую пробирку объемом 50 мл, затем супернатант удаляли и клетки собирали и трижды промывали PBS с рН 7,5 а затем высушивали в сушильном шкафу при 60°С в течение ночи для получения каждой из групп высушенных клеток.

8,3 М раствор соляной кислоты добавляли к 2 г каждой из групп полученных высушенных клеток для гидролиза клеточных стенок клеток микроводорослей при 80°С, и затем процессы добавления 30 мл этилового эфира и 20 мл петролейного эфира, перемешивания в течение 30 секунд и затем центрифугирования повторяли три или более раз. Отделенный слой разстворителя собирали, переносили в предварительно взвешенную круглую колбу и затем растворитель удаляли путем продувания азотом и высушивания в дессикаторе до постоянной массы. Массу высушенного масла измеряли путем вычитания массы пустой колбы из массы колбы после сушки. Кроме того, полученное высушенное масло предварительно обрабатывали 0,5 н. метанольным NaOH и 14% трифторборанового метанола (BF₃), и затем содержание пальмитиновой кислоты (РА), эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА) и докозагексаеновой кислоты (DHA), включенных в масло, измеряли с использованием газовой хроматографии, и содержание рассчитывали в виде процентной доли относительно общего масла, то есть массы неочищенного жира.

(В Таблице 3 РА обозначает пальмитиновую кислоту, ЕРА обозначает эйкозапентаеновую кислоту и DHA обозначает докозагексаеновую кислоту)

В результате, как показано в Таблице 3, новый штамм CD01-5000 Schizochytrium sp.демонстрировал очень высокое содержание DHA, составляющее 50% или выше, и было также показано, что содержание пальмитиновой кислоты и ЕРА было выше, чем в других вариантах. Кроме того, 'Вариант 3', который демонстрировал содержание DHA более высокое, чем в штамме дикого типа, и также продемонстрировал более высокое содержание пальмитиновой кислоты и ЕРА, чем другие варианты, был выбран в качестве превосходного варианта среди экспериментальных вариантов, обозначен как CD01-5004 Schizochytrium sp., и 26 октября 2020 года был депонирован в Корейской коллекции типовых культур (КСТС), представляющей собой международный депозиторий в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры, и ему был присвоен номер доступа KCTC14345 ВР.

Пример 4. Подтверждение характеристик культуры штамма CD01-5000 дикого типа Schizochytrium sp.и мутантного штамма CD01-5004 Schizochytrium sp.

Подтвердили дополнительные характеристики культуры нового штамма дикого типа CD01-5000 Schizochytrium sp.и его мутантного штамма CD01-5004 Schizochytrium sp.

Пример 4-1. Анализ биомассы и содержания жирной кислоты

Штамм CD01-5000, штамм CD01-5004 и штамм Schizochytrium sp. АТСС20888, который представляет собой контрольную группу, культивировали в ферментаторе объемом 5 л до достижения общего объема 3 л. Штаммы культивировали в условиях от 20°С до 35°С, от 100 об./мин до 500 об./мин и от 0,5 vvm (объем на единицу объема в минуту) до 1,5 vvm, в среде GYEP, включающей 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л пептона в качестве источников азота, и высушенные клетки получали из культуральной среды таким же образом, как описано в Примере 3-3, и анализировали содержание внутриклеточных неочищенных жиров и жирных кислот.

(В Таблице 4 ЕРА обозначает эйкозапентаеновую кислоту и DHA обозначает докозагексаеновую кислоту)

В результате, как показано в Таблице 4, было подтверждено, что штаммы CD01-5000 и CD01-5004 демонстрируют рост биомассы, сходный со штаммом Schizochytrium sp.АТСС20888, который культивировали в качестве контрольной группы, при продуцировании и накоплении высоких уровней ЕРА и DHA в клетках.

Пример 4-2. Анализ содержания белков и аминокислот

Для анализа содержания внутриклеточных белков и аминокислот осуществляли дополнительные культуральные тесты со штаммом CD01-5004, который демонстрировал самое высокое содержание биомассы и содержание ЕРА.

А именно, штамм культивировали в общей сложности 63 часа в таких же условиях культивирования, как описанные в Примере 4-1, за исключением того, что использовали среду GYEP, включающую 10 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л хлорида аммония в качестве источников азота. После окончания культивирования из культуральной среды получали высушенные клетки таким же образом, как описано в Примере 3-3.

Для анализа содержания белка количественно определяли содержание азота в образце с использованием элементного анализатора для 0,5 г - 1,0 г высушенных клеток соответственно. Массовую долю (TN%) азота, присутствующего в каждом образце, умножали на 6,25 для расчета содержания неочищенных белков в образце.

Для анализа содержания аминокислот 0,5 г - 1 г каждой группы высушенных клеток подвергали кислотному гидролизу и затем осуществляли жидкостную хроматографию. Компонентную долю (%) каждой аминокислоты рассчитывали в виде процентной доли каждой аминокислоты относительно общей концентрации аминокислот в образце.

В качестве результата, как представлено в Таблице 5, общая продукция клеток составляла 60,5 г/л, и было подтверждено, что содержание неочищенного белка в высушенных клетках составляет 74,38%. Внутриклеточные аминокислоты в основном состояли из глутамата в количестве 23,31% и фенилаланина в количестве 20,51%, а затем гистидин, аланин, валин, пролин, метионин, аспарагиновая кислота, глицин, лейцин, изолейцин и серии.

Пример 5. Подтверждение скорости роста штамма дикого типа Schizochytrium sp.CD01-5000 и мутантного штамма Schizochytrium sp.CD01-5004

Измеряли и сравнивали скорости роста нового штамма дикого типа Schizochytrium sp.CD01-5000 и его мутанта, Schizochytrium sp.CD01-5004.

А именно, каждый из штаммов CD01-5000 и CD01-5004 инокулировали в среду GYEP, содержавшую 3% глюкозы, так, что окончательный рабочий объем составил 50 мл в колбе объемом 500 мл, и культивировали в инкубаторе со встряхиванием в условиях 30°С и 180 об./мин. В ходе культивирования измеряли поглощение в виде величины оптической плотности (OD) при длине волны 680 нм с использованием спектрофотометра УФ/видимый свет для измерения степени клеточного роста на каждой стадии.

В результате, как представлено на Фиг. 2, было подтверждено, что вариант CD01-5004 демонстрирует скорость потребления сахара и клеточный рост, равные или превышающие таковые у штамма дикого типа CD01-5000, и достигает экспоненциальной фазы приблизительно на 5 часов быстрее, чем штамм дикого типа.

Пример 6. Подтверждение характеристик роста штамма дикого типа Schizochytrium sp.CD01-5000 и мутантного штамма Schizochytrium sp.CD01-5004

Было подтверждено, что при культивировании нового штамма дикого типа Schizochytrium sp.CD01-5000 и его мутанта Schizochytrium sp.CD01-5004 рост был возможен в широком диапазоне рН.

А именно, штаммы CD01-5000 и CD01-5004 инокулировали в каждую из сред GYEP, имеющих рН 2, 3, 3,5, 4, 6, 8, 8,5, 9 или 9,5, в колбы объемом 500 мл и культивировали так же, как описано в Примере 4, и затем для оценки степени клеточного роста измеряли поглощение в каждый из моментов времени 0, 24, 40 и 48 часов после инициирования культивирования.

(Каждая величина представляет собой поглощение для каждого времени культивирования в зависимости от условий рН)

В результате, как представлено в Таблице 6 и на Фиг. 3, было подтверждено, что штамм CD01-5004 способен расти в широком диапазоне рН от рН 3,5 до рН 9, а штамм CD01-5000 также продемонстрировал характеристики роста, сходные с вышеприведенными характеристиками.

Кроме того, в свете того факта, что культуральная среда при культивировании штаммов CD01-5000 и CD01-5004 демонстрировала темно-красное окрашивание, было обнаружено, что штаммы продуцируют антиоксидантные пигменты каротиноидного семейства, такие как β-каротин, лютеин, астаксантин, капсантин, аннато, кантаксантин, ликопин, β-апо-8-каротиналь, зеаксантин, сложный эфирβ-апо-8-каротиналя и т.п.

Исходя из вышеприведенного описания, специалист в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, способен понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения его технической идеи или существенных характеристик. Таким образом, понятно, что вышеприведенные примеры являются не ограничивающими, а иллюстративными во всех аспектах. Объем настоящей заявки следует рассматривать как включающий все изменения или модификации, полученные исходя из смысла и объема формулы изобретения, описанной позже, и эквивалентных концепций, а не приведенного выше подробного описания изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> НОВЫЙ ШТАММ SCHIZOCHYTRIUM SP. И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ

ЖИРНЫХ КИСЛОТ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

<130> PX067052

<160> 3

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1784

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 18s рРНК Shizochytrium sp. CD01-5000

<400> 1

atctggttga tcctgccagt agtcatatgc tcgtctcaaa gattaagcca tgcatgtgta 60

agtataagcg attgtactgt gagactgcga acggctcatt atatcagtaa taatttcttc 120

ggtagtttct tttatatgga tacctgcagt aattctggaa ataatacatg ctgtaagagc 180

cctgtatggg gctgcactta ttagattgaa gccgatttta ttggtgaatc atgataattg 240

agcagattga ctatttggtc gatgaatcgt ttgagtttct gccccatcag ttgtcgacgg 300

tagtgtattg gactacggtg actataacgg gtgacggaga gttagggctc gactccggag 360

agggagcctg agagacggct accatatcca aggatagcag caggcgcgta aattacccac 420

tgtggactcc acgaggtagt gacgagaaat atcgatgcga agcgtgtatg cgttttgcta 480

tcggaatgag agcaatgtaa aaccctcatc gaggatcaac tggagggcaa gtctggtgcc 540

agcagccgcg gtaattccag ctccagaagc atatgctaaa gttgttgcag ttaaaaagct 600

cgtagttgaa tttctggcat gggcgaccgg tgctttccct gaatggggat tgattgtctg 660

tgttgccttg gccatctttt tcttttcttt ataggggaga aatctttcac tgtaatcaaa 720

gcagagtgtt ccaagcaggt cgtatgaccg gtatgtttat tatgggatga taagatagga 780

cttgggtgct attttgttgg tttgcacgcc tgagtaatgg ttaataggaa cagttggggg 840

tattcgtatt taggagctag aggtgaaatt cttggatttc cgaaagacga actagagcga 900

aggcatttac caagcatgtt ttcattaatc aagaacgaaa gtctggggat cgaagatgat 960

tagataccat cgtagtctag accgtaaacg atgccgactt gcgattgttg ggtgcttttt 1020

tatgggcctc agcagcagca catgagaaat caaagtcttt gggttccggg gggagtatgg 1080

tcgcaaggct gaaacttaaa ggaattgacg gaagggcacc accaggagtg gagcctgcgg 1140

cttaatttga ctcaacacgg gaaaacttac caggtccaga cataggtagg attgacagat 1200

tgagagctct ttcatgattc tatgggtggt ggtgcatggc cgttcttagt tggtggagtg 1260

atttgtctgg ttaattccgt taacgaacga gacctcggcc tactaaatag tgcgtggtat 1320

ggcaacatag tacgttttaa cttcttagag ggacatgtcc ggtttacggg caggaagttc 1380

gaggcaataa caggtctgtg atgcccttag atgttctggg ccgcacgcgc gctacactga 1440

tgggttcatc gggttttaat tctgttttta tggaattgag tgcttggtcg gaaggcctgg 1500

ctaatccttg gaacgctcat cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg 1560

aggaattcct agtaaacgca agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac 1620

acaccgcccg tcgcacctac cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gtttctgttt 1680

ggattaattt ttggacagag gcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa 1740

gtcgtaacaa ggtttccgta ggtgaacctg cggaaggatc atta 1784

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 18s-001F (праймер)

<400> 2

aacctggttg atcctgccag ta 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 18s-013R (праймер)

<400> 3

ccttgttacg acttcacctt cctct 25

<---

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к штамму микроводорослей рода Schizochytrium, депонированному под номером доступа KCTC14344BP, и штамму микроводорослей рода Schizochytrium, депонированному под номером доступа KCTC14345BP, обладающему способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту (DHA), эйкозапентаеновую кислоту (EPA) и пальмитиновую кислоту (PA), и их применению. Также предложены продукт, имеющий происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, кормовая композиция, содержащая указанный продукт или концентраты указанного продукта, способ получения указанного продукта и способ получения биомасла с использованием указанных штаммов. Изобретение обеспечивает высокий уровень продукции докозагексаеновой кислоты (DHA), эйкозапентаеновой кислоты (EPA) и пальмитиновой кислоты (PA). 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 6 пр.

1. Штамм микроводорослей рода Schizochytrium, депонированный под номером доступа KCTC14344BP и обладающий способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту (DHA), эйкозапентаеновую кислоту (EPA) и пальмитиновую кислоту (PA).

2. Штамм микроводорослей по п. 1, где микроводоросли продуцируют от 35 до 60 масс.% докозагексаеновой кислоты на основе общей массы жирных кислот.

3. Штамм микроводорослей по п. 1, где микроводоросли продуцируют от 0,5 до 10 масс.% эйкозапентаеновой кислоты на основе общей массы жирных кислот.

4. Штамм микроводорослей по п. 1, где микроводоросли продуцируют от 10 до 30 масс.% пальмитиновой кислоты на основе общей массы жирных кислот.

5. Штамм микроводорослей рода Schizochytrium, депонированный под номером доступа KCTC14345BP и обладающий способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту (DHA), эйкозапентаеновую кислоту (EPA) и пальмитиновую кислоту (PA).

6. Штамм микроводорослей по п. 5, где микроводоросли продуцируют от 35 до 60 масс.% докозагексаеновой кислоты на основе общей массы жирных кислот.

7. Штамм микроводорослей по п. 5, где микроводоросли продуцируют от 0,5 до 10 масс.% эйкозапентаеновой кислоты на основе общей массы жирных кислот.

8. Штамм микроводорослей по п. 5, где микроводоросли продуцируют от 10 до 30 масс.% пальмитиновой кислоты на основе общей массы жирных кислот.

9. Продукт, имеющий происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, для получения докозагексаеновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты и пальмитиновой кислоты, содержащий: микроводоросли рода Schizochytrium по п. 1 или 5, культуры указанных микроводорослей или высушенные продукты указанных культур.

10. Кормовая композиция, содержащая продукт, имеющий происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, по п. 9, или концентраты указанного продукта.

11. Способ получения продукта, имеющего происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, по п. 9, включающий: культивирование микроводорослей рода Schizochytrium, депонированных под номером доступа KCTC14344BP или KCTC14345BP и обладающих способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и пальмитиновую кислоту; и выделение указанного продукта из указанных микроводорослей.

12. Способ по п. 11, где культивирование осуществляют в гетеротрофных условиях.

13. Способ по п. 11, где культивирование осуществляют посредством использования среды, содержащей источник углерода и источник азота.

14. Способ по п. 13, где указанный источник углерода представляет собой по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, мальтозы, галактозы, маннозы, сахарозы, арабинозы, ксилозы и глицерина.

15. Способ по п. 13, где указанный источник азота представляет собой: (1) по меньшей мере один органический источник азота, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, мясного экстракта, пептона и триптона, или (2) по меньшей мере один неорганический источник азота, выбранный из группы, состоящей из ацетата аммония, нитрата аммония, хлорида аммония, сульфата аммония, нитрата натрия, мочевины и глутамата натрия (MSG).

16. Способ получения биомасла, имеющего происхождение из микроводорослей рода Schizochytrium, включающий: культивирование микроводорослей рода Schizochytrium, депонированных под номером доступа KCTC14344BP или KCTC14345BP и обладающих способностью продуцировать докозагексаеновую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и пальмитиновую кислоту; и выделение биомасла из указанных микроводорослей.