КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ СЕМЕЙСТВА THRAUSTOCHYTRIACEAE И СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ СЕМЕЙСТВА THRAUSTOCHYTRIACEAE Российский патент 2024 года по МПК C12N1/12 C12N1/04 C12R1/89 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композиции для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae и к способу криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae с их использованием.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Микроводоросли, которые представляют собой фитопланктон, находятся на самом нижнем уровне пищевой цепочки морской экосистемы. Среди них микроводоросли, принадлежащие семейству Thraustochytriacea, в отличие от других микроводорослей, характеризуются скорее как гетеротрофы, чем как аутотрофы, получающие энергию в процессе фотосинтеза, и играют важную роль в обеспечении морской экосистемы полиненасыщенными жирными кислотами омега-3, включая докозагексаеновую кислоту и эйкозапентаеновую кислоту, путем продуцирования полиненасыщенных жирных кислот омега-3, включая докозагексаеновую кислоту и эйкозапентаеновую кислоту, и содержания их в высокой концентрации.

Большинство микроорганизмов можно сохранять в течение длительного времени с помощью способов криоконсервации или консервации лиофилизацией. Однако эти общие способы хранения микроорганизмов не подходят для длительного эффективного хранения микроводорослей Thraustochytriaceae. Соответственно до настоящего времени эти микроводоросли сохраняли в форме субкультуры. Однако поскольку микроводоросли Thraustochytriaceae характеризуются как гетеротрофы, они требуют более частого пересева при хранении, чем большинство других микроорганизмов в зависимости от условий окружающей среды, что делает их чувствительными к контаминации и приводит к повышению стоимости хранения. Следовательно, существует потребность в разработке нового способа длительного хранения микроводорослей Thraustochytriaceae.

ДОКУМЕНТЫ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

Патентный Документ 1: публикация заявки на патент США US 2013/0089901 А1

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

В настоящем изобретении предложена композиция для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащая обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия.

В настоящем изобретении предложен способ криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae с использованием композиции для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae или способ получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae.

В настоящем изобретении предложена лиофилизированная биомасса микроводорослей Thraustochytriaceae, полученная с использованием способа получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae.

В настоящем изобретении предложено применение композиции для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащей обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия, для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae.

В настоящем изобретении предложено применение композиции для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащей обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия, для получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Каждое описание и воплощение, описанное в настоящем описании, также можно применить к другим описаниям и воплощениям. То есть, все комбинации различных элементов, описанных в настоящей заявке, попадают в объем настоящего изобретения. Кроме этого, не следует рассматривать приведенное ниже подробное описание как ограничивающее объем настоящего изобретения. Кроме того, специалист в данной области техники понимает или способен определить множество эквивалентов в отношении определенных аспектов настоящего изобретения, описанных в настоящей заявке, с использованием только традиционных экспериментов. Также предусмотрено, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.

В одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащая обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия.

Термин "обезжиренное молоко" относится к молоку, из которого удален жир.

Термин "Thraustochytriaceae", используемый здесь, означает микроводоросли, принадлежащие семейству Thraustochytriales, и микроводоросли могут включать по меньшей мере одни из выбранных из Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Aurantiochytrium sp., Thraustochytriidae sp., Japonochytrium sp., Monorhizochytrium sp., Sicyoidochytrium sp., Ulkenia sp., Parietichytrium sp., Botryochytrium sp., Hondaea sp.и Labyrinthulochytrium sp. Однако воплощения настоящего изобретения не ограничены ими.

Композиция может содержать обезжиренное молоко в количестве от 0,5 масс. % до 20 масс. % от общей массы композиции. Например, количество обезжиренного молока, содержащегося в композиции, может составлять от 0,5 масс. % до 15 масс. %, от 0,5 масс. % до 10 масс. %, от 0,5 масс. % до 8 масс. %, от 1 масс. % до 20 масс. %, от 1 масс. % до 15 масс. %, от 1 масс. % до 10 масс. %, от 1 масс. % до 8 масс. %, от 2 масс. % до 20 масс. %, от 2 масс. % до 15 масс. %, от 2 масс. % до 10 масс. %, от 2 масс. % до 8 масс. %, от 3 масс. % до 20 масс. %, от 3 масс. % до 15 масс. %, от 3 масс. % до 10 масс. % или от 3 масс. % до 8 масс. % от общей массы композиции.

Композиция может содержать сахарозу в количестве от 1 масс. % до 20 масс. % от общей массы композиции. Например, количество сахарозы, содержащейся в композиции, может составлять от 1 масс. % до 15 масс. %, от 1 масс. % до 12 масс. %, от 2 масс. % до 20 масс. %, от 2 масс. % до 15 масс. %, от 2 масс. % до 12 масс. %, от 4 масс. % до 20 масс. %, от 4 масс. % до 15 масс. %, от 4 масс. % до 12 масс. %, от 6 масс. % до 20 масс. %, от 6 масс. % до 15 масс. %, от 6 масс. % до 12 масс. % или от 6 масс. % до 9 масс. % от общей массы композиции.

Композиция может содержать хлорид натрия в количестве от 0,1 масс. % до 10 масс. % от общей массы композиции. Например, количество хлорида натрия, содержащегося в композиции, может составлять от 0,1 масс. % до 9 масс. %, от 0,1 масс. % до 8,5 масс. %, от 0,5 масс. % до 10 масс. %, от 0,5 масс. % до 9 масс. %, от 0,5 масс. % до 8,5 масс. %, от 1 масс. % до 10 масс. %, от 1 масс. % до 9 масс. %, от 1 масс. % до 8,5 масс. %, от 2 масс. % до 10 масс. %, от 2 масс. % до 9 масс. %, от 2 масс. % до 8,5 масс. %, от 3 масс. % до 10 масс. %, от 3 масс. % до 9 масс. %, от 3 масс. % до 8,5 масс. %, от 5 масс. % до 8,5 масс. % или от 6 масс. % до 8,5 масс. % от общей массы композиции.

Композиция может содержать обезжиренное молоко и сахарозу в массовом отношении от 1:0,5 до 1:10. Например, композиция может содержать обезжиренное молоко и сахарозу в массовом соотношении от 1:0,5 до 1:8, от 1:0,5 до 1:5, от 1:0,5 до 1:3, от 1:1 до 1:10, от 1:1 до 1:8, от 1:1 до 1:5, от 1:1 до 1:3, от 1:1,2 до 1:10, от 1:1,2 до 1:8, от 1:1,2 до 1:5 или от 1:1,2 до 1:3.

Композиция может содержать обезжиренное молоко и хлорид натрия в массовом отношении от 1:0,5 до 1:10. Например, композиция может содержать обезжиренное молоко и хлорид натрия в массовом отношении от 1:0,5 до 1:8, от 1:0,5 до 1:5, от 1:0,5 до 1:3, от 1:1 до 1:10, от 1:1 до 1:8, от 1:1 до 1:5, от 1:1 до 1:3, от 1:1,2 до 1:10, от 1:1,2 до 1:8, от 1:1,2 до 1:5 или от 1:1,2 до 1:3.

Термин "криоконсервация", используемый здесь, относится к сохранению материала в жидком состоянии после замораживания этого материала до твердого состояния и может включать "консервацию лиофилизацией". Например, композиция может представлять собой композицию для консервации лиофилизацией микроводорослей Thraustochytriaceae. Термин "лиофилизация", используемый здесь, относится к способу высушивания, при котором влагу в образце возгоняют и удаляют из него путем замораживания образца в жидком состоянии и содержания его при пониженном давлении. Лиофилизацию можно использовать для длительного сохранения микроорганизмов. Однако для предупреждения повреждения клеток в процессе лиофилизации нужно использовать подходящий криопротектор.

Композицию для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащую обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия, можно использовать вместе с другими криопротекторами. Например, хлорид натрия, диметилсульфоксид (DMSO), декстран, сахарозу, глицерин, маннит, сорбит, фруктозу, раффинозу, сывороточный альбумин и им подобные можно использовать в комбинации в зависимости от задачи, но воплощения настоящего изобретения не ограничены ими.

В другом аспекте предложен способ криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, включающий: 1) культивирование микроводорослей Thraustochytriaceae в среде, содержащей композицию для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащую обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия; 2) выделение продукта, культивированного на стадии (1); и 3) лиофилизацию культивированного продукта с получением биомассы.

Композиция для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae является такой как описано выше.

Термин "культура", используемый здесь, относится к выращиванию микроводорослей в условиях среды, контролируемых подходящим образом. Процесс культивирования по настоящему изобретению можно проводить в соответствии с подходящими средами и условиями культивирования, известными в данной области техники. Специалист в данной области техники может легко регулировать и применять этот процесс культивирования в соответствии с выбранными микроводорослями.

В частности, культуру микроводорослей Thraustochytriaceae по настоящему изобретению можно получать в гетеротрофных условиях, но не ограничиваясь этим.

Термин "гетеротрофный" означает способ питания, который зависит от органического вещества, полученного из источника энергии или источника питательных веществ вне организма, представляет собой термин, отличный от термина "аутотрофный", и его можно использовать взаимозаменяемо с термином "темновая культура".

Процесс культивирования микроводорослей Thraustochytriaceae специально не ограничен этим, но может быть выполнен способом периодического культивирования, способом непрерывного культивирования, способом периодического культивирования с подпиткой и им подобным, которые все известны в данной области техники. Любую среду, применяемую для культивирования микроводорослей по настоящему изобретению, можно использовать без ограничения, при условии что она представляет собой культуральную среду, в которой растут микроводоросли Thraustochytriaceae. В частности, можно использовать традиционную среду, содержащую источник углерода, источник азота, источник фосфора, неорганическое соединение, аминокислоту и/или витамин, подходящие для микроводорослей по настоящему изобретению.

Источник углерода, содержащийся в среде, используемой для культивирования микроводорослей Thraustochytriaceae, может представлять собой по меньшей мере один источник, выбранный из глюкозы, фруктозы, мальтозы, галактозы, маннозы, сахарозы, арабинозы, ксилозы и глицерина. Однако можно использовать любой источник углерода, при условии что он применим для культивирования микроводорослей.

Источник азота, содержащийся в среде, используемой при культивировании микроводорослей Thraustochytriaceae, может представлять собой: 1) по меньшей мере один органический источник азота, выбранный из дрожжевого экстракта, мясного экстракта, пептона и триптона, или 2) по меньшей мере один неорганический источник азота, выбранный из ацетата аммония, нитрата аммония, хлорида аммония, сульфата аммония, нитрата натрия, мочевины и глутамата натрия (MSG). Однако воплощения настоящего изобретения не ограничены этим, и в настоящем изобретении можно использовать любой источник азота, который используют для культивирования микроводорослей.

Среда, используемая для культивирования микроводорослей Thraustochytriaceae, в качестве источника фосфора может содержать дигидрофосфат калия, гидроортофосфат калия, соответствующую им натрийсодержащую соль или их комбинацию. Однако источник фосфора не ограничен ими.

Условия культивирования для культивирования микроводорослей Thraustochytriaceae могут представлять собой любые условия культивирования, при условии что микроводоросли Thraustochytriaceae растут при этих условиях. Например, культура может быть получена при контролировании температуры, рН и так далее в аэробных условиях.

В частности, основное соединение (например гидроксид натрия, гидроксид калия или аммиак) или кислотное соединение (например фосфорную кислоту или серную кислоту) используют для подведения рН культуры до подходящего уровня (например от рН 5 до рН 9, в частности рН 6-8). Однако воплощения настоящего изобретения не ограничены этим.

Дополнительно для поддержания аэробного состояния культуры в культуру можно вводить кислород или кислородсодержащий газ; или для поддержания анаэробного или микроаэробного состояния газ можно не вводить или можно вводить азот, водород или углекислый газ. Однако воплощения настоящего изобретения не ограничены этим.

Дополнительно можно поддерживать температуру культуры от примерно 20°С до примерно 45°С, или от примерно 25°С до примерно 40°С, в течение от примерно 10 часов до примерно 160 часов, от примерно 10 часов до примерно 120 часов, от примерно 10 часов до примерно 80 часов, от примерно 10 часов до примерно 50 часов или от примерно 10 часов до примерно 40 часов. Однако условия культивирования не ограничены этим. Дополнительно во время культивирования можно использовать пеногаситель, такой как полигликолевый эфир жирной кислоты, для подавления появления пузырей, но воплощения настоящего изобретения не ограничены этим.

Выделение культуры может представлять собой сбор целевой культуры подходящим способом, известным в данной области техники. Например, можно применять центрифугирование, фильтрование, анионообменную хроматографию и так далее, но не ограничиваясь этим.

Термин "биомасса", используемый здесь, относится к таким организмам как растения, животные и микроорганизмы, которые можно использовать в качестве источников химической энергии, то есть энергетических источников биологической энергии, и в контексте экологического аспекта может относиться к массе или количеству энергии организма, которая существует в пределах единицы времени и пространства. Дополнительно биомасса включает, но не ограничиваясь этим, соединение, секретируемое клеткой, и может содержать внеклеточный материал, а также клеточное и/или внутриклеточное содержимое. В настоящем изобретении биомасса может представлять собой сами микроводоросли Thraustochytriaceae, их культуру или продукт, полученный путем культивирования или ферментирования микроводорослей, или может представлять собой концентрат биомассы. Однако биомасса не ограничена этим.

Термин "культивированный продукт" микроводорослей Thraustochytriaceae относится к продукту, полученному путем культивирования микроводорослей. В частности, культивированный продукт может представлять собой культуральную среду, содержащую микроводоросли, или фильтрат культуры, в котором микроводоросли были удалены из культуральной среды. Однако культивированный продукт не ограничен этим. Культивированный продукт микроводорослей Thraustochytriaceae можно получить путем инокуляции микроводорослей в среду для культивирования микроводорослей и последующего продолжения процесса культивирования в соответствии со способом культивирования, известным в данной области техники.

Получение биомассы путем лиофилизации культивированного продукта может быть выполнено в соответствии со способом лиофилизации, известным в данной области техники. Например, культивированный продукт микроводорослей выделяют, помещают во флакон для лиофилизации (флакон FD) и соединяют с устройством для лиофилизации при поддержании вакуума, и затем из него удаляют воду при поддержании условий постоянной температуры и постоянного давления. Условие постоянной температуры может представлять собой, например, температуру -50°С или ниже, и условие постоянного давления может представлять собой давление 0,133 мБар (13,3 Па) или ниже, но условия температуры и давления не ограничены этим.

Способ криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae может дополнительно включать отсутствие замораживания микроводорослей до и после стадии (3). Например, процесс предварительного замораживания можно не выполнять до стадии (3). Согласно этому способу микроводоросли можно хранить без больших затрат путем простого процесса изготовления лиофилизированный массы, не включающего процесс предварительного замораживания.

В другом аспекте предложен способ получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae, включающий: 1) культивирование микроводорослей Thraustochytriaceae в среде, содержащей композицию для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащую обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия; 2) выделение культивированного продукта со стадии (1); и 3) лиофилизацию культивированного продукта с получением биомассы.

Композиция для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, культивирование микроводорослей Thraustochytriaceae, выделение культивированного продукта и получение лиофилизированной биомассы являются такими, как описано выше.

Способ получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae может дополнительно включать отсутствие замораживания микроводорослей до и после стадии (3). Например, процесс предварительного замораживания можно не выполнять до стадии (3). Согласно этому способу лиофилизированную биомассу можно получить без больших затрат путем простого процесса изготовления лиофилизированный биомассы, не включающего процесс предварительного замораживания.

В другом аспекте предложена лиофилизированная биомасса микроводорослей Thraustochytriaceae, включающая: а) композицию для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащую обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия; и б) микроводоросли Thraustochytriaceae, где лиофилизированная биомасса получена способом получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae.

Композиция для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae и способ получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae являются такими, как описано выше.

Лиофилизированную биомассу можно хранить при 15°С-25°С в течение 12 недель или дольше. Например, лиофилизированную биомассу можно хранить при комнатной температуре в течение от 3 месяцев до 5 лет, от 3 месяцев до 3 лет, от 3 месяцев до 2 лет, от 3 месяцев до 1 года, от 3 месяцев до 10 месяцев, от 3 месяцев до 8 месяцев, от 3 месяцев до 6 месяцев.

Термин "комнатная температура", используемый здесь, может относиться к температуре примерно 15°С-25°С, и его можно использовать взаимозаменяемо с термином "обычная температура".

Термин "способная сохраняться", используемый здесь, может относиться к признаку, при котором клетки могут расти, когда лиофилизированную биомассу хранят и затем снова культивируют в среде, или при котором активность клеток поддерживается на уровне 60% или более, 70% или более, 80% или более или 90% или более по сравнению с живыми, не лиофилизированными клетками.

Лиофилизированная биомасса может содержать от 1,0×107 до 1,0×1012 живых клеток на 1 мл биомассы после хранения при 15°С-25°С в течение по меньшей мере 12 недель. Например, после хранения при 15°С-25°С в течение по меньшей мере 12 недель лиофилизированная биомасса может содержать в 1 мл от 1,0×107 до 1,0×1011, от 1,0×107 до 1,0×1010, от 1,0×108 до 1,0×1012, от 1,0×108 до 1,0×1011, от 1,0×108 до 1,0×109, от 1,0×109 до 1,0×1012, от 1,0×109 до 1,0×1011 или от 1,0×109 до 1,0×1010живых клеток.

Лиофилизированная биомасса может содержать от 1,0×107 до 1,0×1012 КОЕ (колониеобразующих единиц)/мл живых клеток после хранения при 15°С-25°С в течение по меньшей мере 12 недель. Например, после хранения при 15°С-25°С в течение по меньшей мере 12 недель лиофилизированная биомасса может содержать от 1,0×107 до 1,0×1011, от 1,0×107 до 1,0×1010, от 1,0×108 до 1,0×1012, от 1,0×108 до 1,0×1011, от 1,0×108 до 1,0×10¹⁰, от 1,0×10⁹ до 1,0×10¹², от 1,0×10⁹ до 1,0×10¹¹ или от 1,0×10⁹ до 1,0×10¹⁰ КОЕ/мл живых клеток.

В другом аспекте предложено применение композиции для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащей обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия, для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae.

В другом аспекте предложено применение композиции для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащей обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия, для получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae.

Композиция для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, способ криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae и способ получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae являются такими, как описано выше.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с композицией для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae и способом криоконсервации с использованием этой композиции микроводоросли можно стабильно хранить в течение длительного периода времени, и стоимость консервации микроводорослей можно снизить путем сокращения процесса. Дополнительно согласно способу получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae с использованием данной композиции активность микроорганизмов поддерживается даже при хранении в течение длительного времени при комнатной температуре, и лиофилизированную биомассу в форме порошка, удобного для хранения и транспортировки, получают путем простого процесса.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 представлено изображение флаконов с лиофилизированным содержимым (А-Г), полученным согласно одному аспекту изобретения, и изображения, подтверждающие образование колоний после инокуляции содержимого флаконов на чашки с агаром (Д-З) (АЗ: на А представлено изображение флакона с лиофилизированным содержимым, полученным в соответствии с Условием 1-1; на Д представлено изображение, подтверждающее что колония образовалась после того, как содержимое флакона из А инокулировали на чашку с агаром; на Б представлено изображение флакона с лиофилизированным содержимым, полученным в соответствии с Условием 1-2; на Е представлено изображение, подтверждающее что колония образовалась после того, как содержимое флакона Б было инокулировано на чашку с агаром; на В представлено изображение флакона с лиофилизированным содержимым, полученным в соответствии с Условием 1-3; на Ж представлено изображение, подтверждающее, что колония образовалась после того, как содержимое флакона В инокулировали на чашку с агаром; на Г представлено изображение флакона с лиофилизированным содержимым, полученным в соответствии с Условием 1-4, и на 3 представлено изображение, подтверждающее, что колония образовалась после того, как содержимое флакона Г инокулировали на чашку с агаром).

На Фиг. 2 представлено подтверждение образования колонии после того, как лиофилизированная биомасса согласно одному аспекту изобретения была инокулирована на чашку с агаром (АД: на А представлено подтверждение образования колонии после инокуляции биомассы, лиофилизированной в соответствии с Условием 3-1, на чашку с агаром; на Б представлено подтверждение образования колонии после инокуляции биомассы, лиофилизированной в соответствии с Условием 3-2, на чашку с агаром; на В представлено подтверждение образования колонии после инокуляции биомассы, лиофилизированной в соответствии с Условием 3-3, на чашку с агаром; на Г представлено подтверждение образования колонии после инокуляции биомассы, лиофилизированной в соответствии с Условием 3-4, на чашку с агаром; на Д представлено подтверждение образования колонии после инокуляции биомассы, лиофилизированной в соответствии с Условием 3-5, на чашку с агаром).

На Фиг. 3 представлен график кривой роста, на котором поглощение измерено для каждой контрольной точки времени культивирования после инокуляции лиофилизированной биомассы согласно одному аспекту настоящего изобретения в культуральной колбе.

На Фиг. 4 представлен график кривой роста, на котором поглощение измерено для каждой контрольной точки времени культивирования после хранения лиофилизированной биомассы согласно одному аспекту настоящего изобретения при комнатной температуре в течение 7 суток и последующей инокуляции в культуральную колбу.

На Фиг. 5 представлено изображение, подтверждающее, что колония образовалась после того, как лиофилизированную биомассу согласно одному аспекту настоящего изобретения хранили при комнатной температуре в течение 12 недель и затем инокулировали на чашку с агаром.

ПРИМЕРЫ

Здесь и далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров. Однако эти примеры предназначены для описания одного или более чем одного воплощения для иллюстративных целей, и объем настоящего изобретения не ограничен этими примерами.

Пример 1. Подтверждение жизнеспособности клеток в соответствии с условиями лиофилизации микроводорослей

Пример 1-1. Получение лиофилизированного консерванта

В сумме 4 мл лиофилизированного консерванта получили путем смешивания 0,8 мл 4% раствора обезжиренного молока, 1,6 мл 20% раствора сахарозы и 1,6 мл 20% раствора хлорида натрия, в которых каждый компонент растворен в дистиллированной воде.

Пример 1-2. Лиофилизацня микроводорослей Thraustochytriaceae

Микроводоросли рода Schizochytrium CD01-5004 (No. доступа: КСТС14345 ВР) инокулировали в среду GYEP (10 г/л глюкозы, 1 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л пептона, 2 г/л MgSO₄⋅7H₂O, 20 г/л морской соли, 5,0 мг/л H₃ ВО₃, 3,0 мг/л MnC1₂, 0,2 мг/л CuSO₄, 0,05 мг/л NaMo₄⋅2H₂O, 0,05 мг/л CoSO₄ и 0,7 мг/л ZnSO₄-7H₂O), которая представляет собой среду, в которой могут расти микроводоросли Thraustochytriaceae, и инкубировали в течение ночи в колбе на 500 мл при 28°С и 180 об/мин. Культуру выделяли и центрифугировали и из нее удаляли супернатант. Оставшийся в результате осадок ресуспендировали в консерванте для лиофилизации, полученном в Примере 1-1, с получением суспензии биомассы микроводорослей. После этого полученную суспензию биомассы помещали во флакон для лиофилизации ампульного типа (флакон FD), в случае Условий от 1-1 до 1-3 выполняли предварительное замораживание в условиях, представленных в Таблице 1, а суспензию, которую не подвергали предварительному замораживанию, получали как Условие 1-4.

Флаконы для лиофилизации с содержимым, полученным при каждых условиях, соединяли с устройством для лиофилизации и лиофилизировали в условиях поддержания температуры -50°С или ниже и давления 0,133 мБар (13,3 Па) или ниже в условиях вакуума. Когда большое число ампул присоединено к устройству для лиофилизации, давление в устройстве повышается и, следовательно, влияет на рост лиофилизированных клеток. Соответственно, одну ампулу присоединяли и затем, после того как давление в устройстве понижалось до 0,133 мБар (13,3 Па) или ниже, к нему присоединяли дополнительно следующую ампулу. После того как все ампулы были подсоединены к устройству, лиофилизацию проводили в течение примерно 3 часов, и ампулы, которые были лиофилизированы, запаивали с помощью газовой горелки, так чтобы поддерживать вакуум.

Примеры 13. Подтверждение жизнеспособности лиофилизированных клеток

Для подтверждения выживаемости лиофилизированных клеток, полученных в Примере 1-2, образец сухой биомассы в форме порошка ресуспендировали в дистиллированной воде и распределяли по чашке с агаром GYEP, и затем визуально следили за ростом колоний.

В результате, как показано на Фиг. 1, в случае лиофилизированной биомассы из Условий от 1-1 до 1-3, претерпевшей процесс предварительного замораживания, колонии не росли или не образовывались на чашке с агаром, и только в случае Условий 1-4, не предусматривающих процесс предварительного замораживания, было подтверждено, что лиофилизированная биомасса обладает способностью к росту и образованию колоний на чашках с агаром.

Пример 2. Подтверждение жизнеспособности лиофилизированных клеток в соответствии с компонентами консерванта для лиофилизации

Для оценки консервирующего эффекта лиофилизации в зависимости от компонентов консерванта для лиофилизации, как показано в Таблице 2, для каждого условия было получено 4 мл консерванта для лиофилизации, содержащего соответствующие компоненты в указанных конечных концентрациях.

Такой же способ, как использовали в Примере 1-2, использовали для получения суспензии биомассы с последующей лиофилизацией без процесса предварительного замораживания, за исключением того, что микроводоросли Schizochytrium sp.CD01-5004 (No. доступа: КСТС14345 ВР) инокулировали в среду GYEP, содержащую 30 г/л глюкозы, и использовали лиофилизированный консервант, полученный в композиции из Таблицы 2.

Образец сухой биомассы в форме порошка ресуспендировали в дистиллированной воде и разводили так, чтобы поглощение (Оптическая плотность: OD) при 680 нм составляла 0,1. Полученный в результате раствор в количестве 1 мл распределяли по чашке с агаром GYEP и подсчитывали число колоний, образованных на каждой чашке. В качестве контроля часть клеточной культуры, выделенной до получения суспензии биомассы в лиофилизированном консерванте, 1 мл раствора, разведенного до значения OD 0,1 при 680 нм, без ресуспендирования, распределяли по чашке с агаром GYEP и подсчитывали число образовавшихся колоний. Поскольку в одной колонии содержится 1×10⁶ клеток, число жизнеспособных клеток на 1 мл культуры рассчитывали путем умножения числа колоний, образованных в каждой экспериментальной группе, на 106, и жизнеспособность в каждых условиях рассчитывали в процентах относительно контрольной группы.

В результате, как показано в Таблице 3, было подтверждено, что колонии образовывались в пределах 72 часов после распределения по чашке для Условий 2-1, 2-5 и 2-6. Консерванты для лиофилизации, используемые для этих условий, обычно содержали 6-10% обезжиренного молока и 4-10% сахарозы, и в частности, для Условия 2-6, где использовали консервант для лиофилизации, содержащий обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия, жизнеспособность была существенно выше при 16,67%.

Пример 3. Подтверждение скорости роста лиофилизированные клеток в соответствии с соотношением компонентов консерванта для лиофилизации

Пример 3 1. Подтверждение образования колоний на чашках с агаром

Для оценки консервирующего эффекта лиофилизации в зависимости от соотношения концентраций обезжиренного молока, сахарозы и хлорида натрия, которые являются наиболее эффективными компонентами консерванта, полученного в Примере 2, как показано в Таблице 4 ниже, для каждого условия получали 4 мл консерванта для лиофилизации, содержащего соответствующие компоненты в указанных конечных концентрациях. После лиофилизации микроводорослей Thraustochytriaceae таким же способом, как описано в Примере 2, с использованием консервантов для лиофилизации для каждого условия число образовавшихся колоний подсчитывали путем ресуспендирования в дистиллированной воде и распределения полученной суспензии по чашке с агаром GYEP. В экспериментальных группах, в которых образовались колонии, образование колоний визуально подтверждали начиная с 24 часов после нанесения, и наличие или отсутствие выживших клеток и степень образования колоний можно было четко выявить начиная с 40 часов.

В результате, как показано на Фиг. 2 и в Таблице 4, колонии не образовались в Условии 3-4 при использовании консерванта, содержащего только 10% обезжиренного молока, и Условии 3-5 при использовании консерванта, содержащего 5% обезжиренного молока и 5% хлорида натрия, а в других условиях образование колоний было подтверждено.

Пример 3 2. Подтверждение роста клеток в культуральных колбах

В отношении лиофилизированный клеток в Условиях от 3-1 до 3-3, для которых образование колоний было подтверждено в Примере 3-1, измеряли степень роста клеток в культуральной колбе.

В частности, среду GYEP, содержащую 30 г/л глюкозы, помещали в колбу на 500 мл и инокулировали в нее лиофилизированную биомассу из Условий от 3-1 до 3-3 и культивировали при 28°С и 180 об/мин. Культуру из каждого Условия собирали в каждой контрольной точке времени культивирования и значение OD измеряли при 680 нм с помощью спектрофотометра для подтверждения степени роста клеток.

В результате, как показано на Фиг. 3, лиофилизированные клетки из Условий от 3-1 до 3-3 демонстрировали увеличение значения OD вследствие полноценного роста клеток примерно через 12 часов после начала культивирования и похожего роста клеток в группах для всех Условий.

Пример 4. Подтверждение стабильности при хранении лиофилизированных образцов в соответствии с соотношением компонентов консервантов для лиофилизации

После хранения лиофилизированной биомассы из Условий от 3-1 до 3-3, полученной в Примере 3-1, при комнатной температуре в течение 7 суток во флаконе для лиофилизации, биомассу культивировали в колбе таким же способом, как описано в Примере 3-2, и степень роста клеток подтверждали путем измерения поглощения для каждого времени культивирования.

В результате, как показано на Фиг. 4, было подтверждено, что есть различие в степени роста при разных условиях. В частности, в Условии 3-3 была показана самая высокая скорость роста, в Условии 3-1 был показан в некоторой степени замедленный рост, и в Условии 3-2 рост не был выявлен вплоть до 40 часов от начала культивирования.

Пример 5. Стабильность образцов лиофилизированной биомассы при длительном хранении

Для подтверждения стабильности образцов лиофилизированной биомассы при длительном хранении получали консервант для лиофилизации, содержащий 4% обезжиренного молока, 8% сахарозы и 8% хлорида натрия, имеющий такой же состав консерванта для лиофилизации, как в Условии 3-3 из Примера 3-1, и затем микроводоросли Thraustochytriaceae лиофилизировали таким же способом, как описано в Примере 2. Полученную лиофилизированную биомассу хранили при комнатной температуре в течение 12 недель (84 суток), затем ресуспендировали с дистиллированной воде и распределяли по чашке с агаром GYEP для подсчета числа образовавшихся колоний.

В результате, как показано на Фиг. 5, примерно 47 колоний образовалось в образце, разведенном в 10^-2 раз, и было обнаружено, что число жизнеспособных клеток на 1 мл культуры составило примерно 4,7×10⁹ Следовательно, было подтверждено, что лиофилизированная биомасса, полученная с использованием консерванта для лиофилизации, согласно настоящему описанию, обеспечивает число жизнеспособных клеток в определенном количестве или более даже при хранении в течение по меньшей мере 12 недель.

На основании вышеприведенного описания специалисту в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение, понятно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения его технической идеи или существенных характеристик. В этом отношении следует понимать, что описанные здесь воплощения приведены исключительно для иллюстративных целей во всех отношениях и не ограничивают объем настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения следует рассматривать как включающий все изменения или модификации, происходящие из значения и объема пунктов прилагаемой формулы изобретения и эквивалентных им концепций, а не ограниченный вышеприведенным подробным описанием.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены водная композиция для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащая от общей массы композиции, масс.%: обезжиренное молоко от 0,5 до 20; сахарозу - от 1 до 20; хлорид натрия - от 0,1 до 10 при следующих массовых соотношениях: обезжиренное молоко и сахароза - от 1:0,5 до 1:10; обезжиренное молоко и хлорид натрия - от 1:0,5 до 1:10; способ криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, включающий культивирование микроводорослей Thraustochytriaceae в среде, содержащей водную композицию для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, выделение культивированного продукта и его лиофилизацию с получением биомассы; лиофилизированная биомасса микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащая водную композицию для криоконсервации Thraustochytriaceae, обезжиренное молоко, сахарозу, хлорид натрия и микроводоросли Thraustochytriaceae, и способ ее получения. Изобретения обеспечивают стабильность образцов лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae с сохранением числа жизнеспособных клеток в указанном количестве при длительном хранении в течение по меньшей мере 12 недель. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Водная композиция для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащая обезжиренное молоко в количестве от 0,5 масс.% до 20 масс.% от общей массы композиции; сахарозу в количестве от 1 масс.% до 20 масс.% от общей массы композиции; хлорид натрия в количестве от 0,1 масс.% до 10 масс.% от общей массы композиции при следующих массовых соотношениях: обезжиренное молоко и сахароза - в массовом соотношении от 1:0,5 до 1:10; обезжиренное молоко и хлорид натрия - в массовом соотношении от 1:0,5 до 1:10.

2. Композиция по п. 1, где микроводоросли Thraustochytriaceae включают по меньшей мере одни из выбранных из Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Aurantiochytrium sp., Thraustochytriidae sp., Japonochytrium sp., Monorhizochytrium sp., Sicyoidochytrium sp., Ulkenia sp., Parietichytrium sp., Botryochytrium sp., Hondaea sp. и Labyrinthulochytrium sp.

3. Способ криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, включающий:

1) культивирование микроводорослей Thraustochytriaceae в среде, содержащей водную композицию для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae по п. 1;

2) выделение культивированного продукта со стадии (1); и

3) лиофилизацию выделенного культивированного продукта с получением биомассы.

4. Способ по п. 3, где микроводоросли не замораживают ни до, ни после стадии (3).

5.Способ получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae, включающий:

1) культивирование микроводорослей Thraustochytriaceae в среде, содержащей водную композицию для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae по п. 1;

2) выделение культивированного продукта со стадии (1); и

3) лиофилизацию выделенного культивированного продукта с получением биомассы.

6. Способ по п. 5, где микроводоросли не замораживают ни до, ни после стадии (3).

7. Лиофилизированная биомасса микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащая:

а) водную композицию для криоконсервации микроводорослей Thraustochytriaceae, содержащую обезжиренное молоко, сахарозу и хлорид натрия; и

б) микроводоросли Thraustochytriaceae,

где лиофилизированная биомасса получена способом получения лиофилизированной биомассы микроводорослей Thraustochytriaceae по п. 5.

8. Лиофилизированная биомасса по п. 7, способная сохраняться в течение по меньшей мере 12 недель при температуре от 15°С до 25°С.

9. Лиофилизированная биомасса по п. 8, содержащая от 1,0×10⁷ до 1,0×10¹² живых клеток на 1 мл лиофилизированной биомассы после хранения при температуре от 15°С до 25°С в течение по меньшей мере 12 недель.