СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Российский патент 2025 года по МПК G01N1/38 

Изобретение относится к области медицины, офтальмологии, а именно к лабораторному методу исследования биологических жидкостей, таких как слезная жидкость (СЖ).

Определение физико-химических, биохимических и иммунологических параметров слезы является достаточно информативным для диагностики, наблюдения динамики и изучения патогенеза многих офтальмологических заболеваний. В слезе часть компонентов могут накапливаться раньше, чем в общем кровотоке, что определяет особую актуальность изучения компонентов слезы в ряде случаев. Слезная железа кровоснабжается слезной артерией, являющейся ветвью глазничной артерии. Следовательно, состав слезы пропорционально отражает процессы, протекающие в сосудистой системе глаза.

В то же время, существует ряд объективных ограничений использования слезы для лабораторной диагностики, а именно:

- отсутствие тест-систем (реагентов), аттестованных для работы со слезой;

- малое количество слезы, доступное к получению одномоментно;

- искажение (разбавление) концентрации исследуемых компонентов СЖ при стимулированном слезоотделении.

В литературе описано большое количество методов и устройств для получения СЖ, все из которых имеют ряд достоинств и недостатков. Например, предложены способы получения СЖ с помощью помещения в конъюнктивальный мешок дисков из целлюлозной фильтровальной бумаги (патент RU 2743330 C1, опубликовано 17.02.2021, патент RU 2469095 С2, опубликовано 10.12.2012). Достоинством данной методики авторы считают, простоту выполнения, минимальную степень рефлекторной стимуляции слёзопродукции с получением базальной секреции СЖ. Экстракция компонентов СЖ требует выполнения смывов с дисков с помещением проб в ультразвуковую ванну. Недостатком метода можно считать тот факт, что, удаляя диски из пробирки, часть жидкости и белковых компонентов будут удалены вместе с дисками.

Существуют способы получения слезной жидкости с применением различных устройств, капиллярных трубок, канюль, которые помещают в конъюнктивальный мешок и соединяют с резервуаром для накопления СЖ (патент RU 12962 U1, опубликовано 20.03.2000, патент US 7133712 В2, опубликовано 13.11.2003, патент на полезную модель RU 125449 U1, опубликовано 10.03.2013). Недостатком данных методов являются раздражение конъюнктивы при соприкосновении с устройством, следовательно, получение слезы в условиях механически стимулированной секреции, что неконтролируемо снижает концентрацию компонентов СЖ. Также, приобретение специальных устройств удорожает диагностику.

Прототипом предлагаемого на регистрацию изобретения является способ забора СЖ, описанный в статье автора Sahay P. и др. «Functional Activity of Matrix Metalloproteinases 2 and 9 in Tears of Patients With Glaucoma». Способ заключается в том, что забор производят при помощи тест-полосок Ширмера, которые помещают в нижний свод конъюнктивы на 5 минут без применения местной анестезии. Затем полоску подвергают действию 0,2 мл экстракционного буфера, содержащего 0,5 гр/моль физраствора и 0,5 % полисорбата 20 (твин 20), и выдерживают в шейкере-качалке в течение 3 ч. при комнатной температуре. Далее полоски центрифугируют в пробирке с режимом 10 000 об/мин в течение 1-2 мин, а затем помещают на хранение с температурой -80°С для последующего анализа. Недостатком прототипа является применение экстракционного буфера, смеси физраствора и полисорбата 20, которое не позволяет при лабораторном исследовании СЖ оценить концентрацию биохимических компонентов. Полисорбат 20 является поверхностно активным веществом, его присутствие может изменить свойства реакционных смесей при выполнении различных лабораторных тестов.

Задача предлагаемого способа состоит в получении СЖ с максимальной концентрацией биохимических компонентов, отражающих их истинное содержание при базальной секреции слезы для последующего аналитического лабораторного исследования.

Техническим результатом способа является минимальная рефлекторная стимуляция слезопродукции с максимальной концентрацией биологических компонентов, экстрагируемых в буферную среду, которая позволяет определять компоненты слезы различными лабораторными методиками и реагентами.

Технический результат достигается за счет того, что осуществляют забор СЖ путем сорбции на полоску фильтровальной бумаги по методу Ширмера, пропитанную часть полоски погружают в пробирку типа эппендорф с 0,4 мл стерильного физраствора, затем содержимое пробирки инкубируют при комнатной температуре на лабораторном миксере в режиме встряхивания в течение 90 мин, далее полоску закрепляют под крышкой пробирки типа эппендорф таким образом, чтобы бумага не погружалась в жидкую фазу, после чего пробирку центрифугируют с осушиванием фильтровальной полоски в режиме 2000 g в течение 4 мин.

Способ осуществляется следующий образом.

Для сбора слезы используют сорбционный метод при помощи полоски фильтровальной бумаги (по методу Ширмера) с минимальным контактом с конъюнктивой. Далее полоску фильтровальной бумаги для экстракции с неё компонентов слезы погружают в пробирку типа эппендорф, содержащую 0,4 мл стерильного физраствора. Эппендорф инкубируют при комнатной температуре на лабораторном миксере в режиме встряхивания в течение 90 минут. Далее полоску фильтровальной бумаги закрепляют под крышкой пробирки типа эппендорф, чтобы она не погружалась в жидкую фазу, при необходимости полоску складывают вдвое. В таком положении эппендорф центрифугируют (режим 2000 g, 4 минуты) для осушения полоски фильтровальной бумаги. Центрифугирование с осушиванием сорбционной полоски фильтровальной бумаги позволяет максимально перенести без потерь все биологические компоненты в раствор для экстракции. Применение физиологического раствора для экстракции компонентов слезы обусловлено его рН 4.5-7.0, которая совместима с реакционными смесями большинства реагентов широкого спектра лабораторных методик.

Данная методика забора слезы была применена в рамках исследования «Сравнительная оценка местной воспалительной реакции после факоэмульсификации, осложненной развитием синдрома интраоперационой девиации ирригационного потока, с выполнением дренирующего заднего капсулорексиса», проводимое на базе АО «Екатеринбургский центр МНТК «Микрохирургия глаза». Были сформированы 3 группы пациентов:

1. контрольная группа – неосложненная факоэмульсификация (ФЭК) (10 пациентов);

2. группа сравнения – ФЭК, осложненная развитием синдрома интраоперационой девиации ирригационного потока (СИДИП) с хрусталиковым детритом в ретролентальном пространстве (стандартное завершение вмешательства) (10 пациентов);

3. исследуемая группа – ФЭК, осложненная развитием СИДИП с выполнением дренирующего заднего капсулорексиса (10 пациентов).

Для оценки местной воспалительной реакции были выбраны следующие провоспалительные цитокины: ИЛ-6 и ИЛ-8.

Концентрацию в слезной жидкости ИЛ-6, ИЛ-8 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением тест-систем «Интерлейкин-6-ИФА-БЕСТ», «Интерлейкин-8-ИФА-БЕСТ» (АО «ВЕКТОР-БЕСТ», Россия). Были получены следующие значения провоспалительных цитокинов в слезе:

до операции - контрольная группа: ИЛ-6 2,63 + 1,62 пг/мл, ИЛ-8 13,48 + 4,3 пг/мл;

1 сут. после операции – контрольная группа: ИЛ-6 5,92 + 3,67 пг/мл, ИЛ-8 22,67 + 10,78 пг/мл; группа сравнения – ИЛ-6 6,5 + 3,03 пг/мл, ИЛ-8 32,2 + 7,95 пг/мл; исследуемая группа – ИЛ-6 5,95 + 2,96 пг/мл, ИЛ-8 32,12 + 9,97 пг/мл;

1 нед. после операции – контрольная группа: ИЛ-6 0,37 + 0,23 пг/мл, ИЛ-8 6,54 + 2,45 пг/мл; группа сравнения – ИЛ-6 1,57 + 0,33 пг/мл, ИЛ-8 14,25 + 2,75 пг/мл; исследуемая группа – ИЛ-6 0,7 + 0,58 пг/мл, ИЛ-8 8,3 + 3,05 пг/мл.

Таким образом, во всех группах, включенных в исследование, отмечалось повышение уровня провоспалительных цитокинов в слезе на 1 сутки после оперативного лечения. Через 1 неделю после оперативного лечения катаракты отмечалось снижение уровня провоспалительных цитокинов на фоне проводимой противовоспалительной терапии. Наиболее высокий уровень ИЛ-6 и ИЛ-8 на 1 сутки и через 1 неделю после оперативного лечения был выявлен в группе сравнения (ФЭК, осложненная развитием СИДИП с хрусталиковым детритом в ретролентальном пространстве).

Выявленные изменения профиля провоспалительных цитокинов в слезе коррелировали с изменениями центральной толщины сетчатки и объема макулярной области как маркерами послеоперационного воспалительного процесса. Наибольшее увеличение центральной толщины сетчатки и объема макулярной области было выявлено в группе сравнения.

Изобретение относится к области офтальмологии. Раскрыт способ получения слезной жидкости (СЖ) для лабораторного исследования, включающий забор СЖ путем сорбции на полоску фильтровальной бумаги по методу Ширмера, погружение пропитанной слезой части фильтровальной полоски в пробирку типа эппендорф, инкубирование содержимого пробирки при комнатной температуре и последующее центрифугирование, причем пропитанную часть полоски фильтровальной бумаги погружают в пробирку типа эппендорф с 0,4 мл стерильного физраствора, затем содержимое пробирки инкубируют при комнатной температуре на лабораторном миксере в режиме встряхивания в течение 90 мин, далее полоску фильтровальной бумаги закрепляют под крышкой пробирки таким образом, чтобы бумага не погружалась в жидкую фазу, после чего пробирку центрифугируют с осушиванием фильтровальной полоски в режиме 2000 g в течение 4 мин. Изобретение обеспечивает минимальную рефлекторную стимуляцию слезопродукции с максимальной концентрацией биологических компонентов, экстрагируемых в буферную среду, которая позволяет определять компоненты слезы различными лабораторными методиками и реагентами. 1 н. и 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения слезной жидкости (СЖ) для лабораторного исследования, включающий забор СЖ путем сорбции на полоску фильтровальной бумаги по методу Ширмера, погружение пропитанной слезой части фильтровальной полоски в пробирку типа эппендорф, инкубирование содержимого пробирки при комнатной температуре и последующее центрифугирование, отличающийся тем, что пропитанную часть полоски фильтровальной бумаги погружают в пробирку типа эппендорф с 0,4 мл стерильного физраствора, затем содержимое пробирки инкубируют при комнатной температуре на лабораторном миксере в режиме встряхивания в течение 90 мин, далее полоску фильтровальной бумаги закрепляют под крышкой пробирки таким образом, чтобы бумага не погружалась в жидкую фазу, после чего пробирку центрифугируют с осушиванием фильтровальной полоски в режиме 2000 g в течение 4 мин.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при закреплении полоски фильтровальной бумаги под крышкой пробирки полоску складывают вдвое.