ЕВРОПИЕВЫЙ КОМПЛЕКС МОНОНАТРИЕВОЙ СОЛИ 2,2',2'',2'''-(2,2'-((5'-(4-АМИНОФЕНИЛ)-2,2'-БИПИРИДИН-6-ИЛ)МЕТИЛАЗАДИИЛ)БИС-(ЭТАН-2,1-ДИИЛ))-БИС(АЗАТРИИЛ)ТЕТРАУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2023 года по МПК C07F5/00 C09K11/06 

1. Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к области люминесцентных комплексных соединений европия с гетероциклическим 2,2′-бипиридиновым лигандом 1 с хелатирующим фрагментом на основе диэтилендиаминотетрауксусной кислоты (DTTA) и аминогруппой, пригодной для создания мостика пептидной биоконъюгации (Фиг. 1). Изобретение может быть использовано в качестве люминесцентной метки для иммуноанализа и может найти применение в медицине, а также в научно-исследовательских лабораториях.

2. Уровень техники.

Производные пиридина и их аннелированные аналоги являются достаточно известными хромофорами для комплексообразования с различными катионами металлов. Наибольшее практическое значение приобрели их комплексы с лантаноидами, такими, как Sm³⁺, Dy³⁺, Pr³⁺, Ho³⁺, Yb³⁺, Nd³⁺, Er³⁺. Такие соединения демонстрируют интересные магнитные свойства (G.M. Davies, S.J.A. Pope, H. Adams, S. Faulkner, M.D. Ward, Inorg. Chem. 44 (2005) 4656. DOI:10.1021/ic050512k), а также способны к люминесценции в ИК-диапазоне (S. Quici, M. Cavazzini, G. Marzanni, G. Accorsi, N. Armaroli, B. Ventura, F. Barigelletti, Inorg. Chem. 44 (2005) 529. DOI:10.1021/ic0486466) и в видимой части спектра (L. Armelao, S. Quici, F. Barigelletti, G. Accorsi, G. Bottaro, M. Cavazzini, E. Tondello, Coord. Chem. Rev. 254 (2009) 487. DOI:10.1016/j.ccr.2009.07.025), что делает возможным их применение в магнитно-резонансной терапии (S. Aime, S.G. Crich, E. Gianolio, G.B. Giovenzana, L. Tei, E. Terreno, Coord. Chem. Rev. 250 (2006) 1562. DOI:10.1016/S1002-0721(13)60022-8), а также в области телекоммуникаций (Y. Oshishi, T. Kanamori, T. Kitagawa, S. Takashashi, E. Snitzer, G. H. Jr. Sigel, Opt. Lett. 16 (1991) 1747. DOI:10.1364/OL.16.001747) и в качестве меток для иммуноанализа (J. Yan, G. Wang, Trends Anal. Chem. 25 (2006) 490. DOI:10.1016/j.trac.2005.11.013). В последнем случае для успешного применения необходимо наличие в составе таких соединений линкера для связывания с биологическими молекулами организма, в качестве которого могут выступать такие функциональные группы, как карбоксильная (S. P. Martsev, V. A. Preygerzon, Y. I. Mel’nikova, Z. I. Kravchuk, G. V. Ponomarev, V. E. Lunev, A. P. Savitsky, J. Immunol. Methods. 186 (1995) 293. DOI:10.1016/0022-1759(95)00154-3 ), альдегидная (S. Poupart, C. Boudon, P. Peixoto, M. Massonneau, P.-Y. Renard, A. Romieu, Org. Biomol. Chem. 4 (2006) 4165. DOI:10.1039/B612805J), сульфохлоридная (A. Chan, E. P. Diamandis, M. Krajden, Anal. Chem. 2 (1993) 158. DOI:10.1021/ac00050a012), и некоторые другие, например, аминогруппа. В случае наличия в составе лиганда последней возможно как её непосредственнео связывание с карбоксильной группой биомолекулы (N. Meltola, P. Jauria, P. Saviranta, H. Mikola, Bioconjugate Chem. 10 (1999) 325. DOI:10.1021/bc980013q), так и трансформация в изотиоцианатную посредством реакции с тиофосгеном, что позволяет получить более удобный в использовании линкер, обычно гладко и селективно реагирующий с первичными аминогруппами биологических молекул с образованием производных тиомочевины (H. Takalo, V. M. Mukkala, H. Mikola, P. Liitti, I. Hemmila, Bioconjugate Chem. 5 (1994) 278. DOI:10.1021/bc00027a015).

Кроме того, во избежание рассеяния энергии возбуждённого состояния лантанида посредством передачи её молекулам растворителя необходимо насыщение его координационной сферы. Так как координационное число лантанидов равно девяти, лиганд должен быть девятидентантен. Это достигается посредством введения в его структуру дополнительных хелатирующих групп, в качестве которых используются остатки полиаминоуксусных кислот, таких как IDA, DO3A и DTTA (A. M. Prokhorov, V. N. Kozhevnikov, D. S. Kopchuk, H. Bernard, N. Le Bris, R. Tripier, H. Handel, B. Koenig, D. N. Kozhevnikov, Tetrahedron 67 (2011) 597. DOI:10.1016/j.tet.2010.11.058).

Представленные в литературе лиганды, отвечающие всем указанным требованиям, основаны на использовании в качестве хромофора 2,2′:6′,2′′-терпиридинов (Z. Wang, J. Yan, K. Matsumoto, Luminescence 20 (2005) 347. DOI:10.1002/bio.843), а также пиридина, функционализированного по С4 положению (H. Takalo, P. Pasanen, J. Kankare, Acta Chem. Scand. B 42 (1988) 373. DOI:10.3891/acta.chem.scand.42b-0373), либо сопряжённого с пятичленными азотсодержащими гетероциклами (J. Yuan, G. Wang, K. Majima, K. Matsumoto, Anal. Chem. 73 (2001) 1869. DOI:10.1021/ac0013305).

Значительно реже встречаются лиганды, основанные на использовании в качестве хромофора 2,2′-бипиридинов. К настоящему моменту в литературе представлены всего два примера подобных лигандов (лиганды 2 и 3, Фиг. 2), подходящих для биоконьюгации с белком (A. M. Prokhorov, V. N. Kozhevnikov, D. S. Kopchuk, H. Bernard, N. Le Bris, R. Tripier, H. Handel, B. Koenig, D. N. Kozhevnikov, Tetrahedron 67 (2011) 597. DOI:10.1016/j.tet.2010.11.058). При этом структура лишь одного из них, лиганда 2, обеспечивает насыщение координационной сферы европия, что обеспечивается наличием в α-положении к атому азота остатка DTTA. Его европиевый комплекс показал достаточно высокое время жизни возбуждённого состояния (0.60 мс) с невысоким квантовый выходом фотолюминесценции (0.6%). Лиганд 2 (Фиг. 2), как соединение с наиболее совпадающими признаками был выбран нами в качестве прототипа.

3. Сущность изобретения.

Сущность изобретения составляет водорастворимый европиевый комплекс 1 лиганда 2,2′-бипиридинового ряда 4 (Фиг. 1), структура которого обеспечивает насыщение координационной сферы европия и может быть пригодна для биоконьюгации с белком (H. Takalo, V. M. Mukkala, H. Mikola, P. Liitti, I. Hemmila, Bioconjugate Chem. 5 (1994) 278. DOI:10.1021/bc00027a015), отличающийся смещением максимума поглощения в более длинноволновую область, положением аминогруппы в аминофенильном заместителе (пара- вместо мета-), увеличенным временем жизни возбуждённого состояния.

Представляемое изобретение демонстрирует улучшенные фотофизические свойства по сравнению с прототипом, а именно: значительное смещение максимума поглощения (с 325 нм до 350 нм) при одновременном увеличении времени жизни возбуждённого состояния (с 0.6 мс до 0.88 мс), что делает его более пригодным для практического применения.

4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

4.1. Для подтверждения возможности осуществления изобретения приводится способ получения соединения 1

Графически схема синтеза представлена на Фиг. 3.

Получение 1,2,4-триазина 5.

Растворили гидразон 6 (417 мг, 2 ммоль), синтезированный по описанной методике (O. P. Shkurko, L. L. Gogin, S. G. Baram, V. P. Mamaev, Chem. Heterocycl. Compd. 23 (1987) 216. DOI:10.1007/BF00663866) в этаноле (30 мл), добавили раствор 6-метилпиколинальдегида (2.42 г, 2 ммоль) в этаноле (25 мл). Выдержали при комнатной температуре в течение 10 ч. Осадок отфильтровали, промыли этанолом, сушили на воздухе, суспендировали в ледяной уксусной кислоте (30 мл), нагрели до кипения два раза. Реакционную массу упарили в вакууме. К остатку добавили этанол (30 мл); полученную суспензию отфильтровали, промыли этанолом, сушили на воздухе. Продукт был использован на следующей стадии без дополнительной очистки.

3-(6-Метилпиридин-2-ил)-6-(4-нитрофенил)-1,2,4-триазин (5). Выход 481 мг (1.64 ммоль, 82%). Т_пл. > 250 °C. ЯМР ¹Н (DMSO-d₆, δ, м.д.): 2.68 (с, 3H, CH₃), 7.41 (м, 1H, Н-5′), 7.88 (дд, 1Н, ³J 7.8, 7.8 Гц, Н-4′), 8.36 (м, 1H, Н-3′), 8.44 и 8.61 (оба м, 2H, C₆H₄NO₂), 9.62 (с, 1H, H-5). ESI-MS, m/z: найдено 294.10, вычислено 294.09 (М+Н)⁺.

Получение 2,2′-бипиридина 7.

В o-ксилоле (25 мл) суспендировали триазин 5 (733 мг, 2.5 ммоль), добавили 2,5-норборнадиен (1.0 мл, 10 ммоль), кипятили в течение 18 ч с добавлением дополнительного 2,5-норборнадиена (1.0 мл, 10 ммоль) каждые 9 ч. Растворитель упарили в вакууме. Остаток хроматографировали, элюент: смесь этилацетата и дихлорметана (1:9). Элюаты, содержащие продукт, объединили и упарили в вакууме. Аналитический образец был получен перекристаллизацией из этанола.

6′-Метил-5-(4-нитрофенил)-2,2′-бипиридин (7). Выход 390 мг (1.34 ммоль, 54%). Т_пл. 194-196 °C. ЯМР ¹Н (DMSO-d₆, δ, м.д.): 2.62 (с, 3H, CH₃), 7.23 (м, 1H, Н-5′), 7.76 (дд, 1Н, ³J 7.6, 7.6 Гц, Н-4′), 8.03 (м, 2H, C₆H₄NO₂), 8.22 (дд, 1H, ³J 8.2 Hz, ⁴J 2.4 Гц, Н-4), 8.27 (м, 1H, Н-3′), 8.35 (м, 2H, C₆H₄NO₂), 8.56 (д, 1H, ³J 8.2 Гц, Н-3), 9.00 (д, 1H, ⁴J 2.4 Гц, Н-6). ESI-MS, m/z: найдено 292.11, вычислено (М+Н)⁺. Вычислено для С₁₇Н₁₃N₃О₂, %: С 70.09, Н 4.50, N 14.42. Найдено, %: С 70.17, Н 4.36, N 14.21.

Получение бромметил-2,2′-бипиридина 8.

В сухом CCl₄ (50 мл) растворили метилбипиридин 7 (292 мг, 1 ммоль), N-бромсукцинимид (125 мг, 0.7 ммоль) и каталитическое количество перекиси бензоила, смесь кипятили при освещении лампой накаливания в течение 8 ч. Осадок отфильтровали, фильтрат упарили в вакууме. Остаток очистили колоночной хроматографией, элюент - смесь ДХМ и этилацетата (9:1). Элюаты, содержащие продукт объединили и упарили в вакууме. Аналитический образец был получен перекристаллизацией из этанола.

6′-(Бромметил)-5-(4-нитрофенил)-2,2′-бипиридин (8). Выход 93 мг (0.25 ммоль, 25%). Т_пл. 166-168 °C. ЯМР ¹Н (DMSO-d₆, δ, м.д.): 4.69 (с, 2H, CH₂), 7.58 (м, 1H, Н-5′), 7.92 (дд, 1Н, ³J 8.0, 8.0 Гц, Н-4′), 8.04 (м, 2H, C₆H₄NO₂), 8.27 (дд, 1H, ³J 8.2 Гц, ⁴J 2.4 Гц, Н-4), 8.35 (м, 2H, C₆H₄NO₂), 8.40 (м, 1H, Н-3′), 8.58 (д, 1H, ³J 8.2 Гц, Н-3), 9.03 (д, 1H, ⁴J 2.4 Гц, Н-6). ESI-MS, m/z: найдено 370.02, вычислено (М+Н)⁺. Вычислено для С₁₇Н₁₂BrN₃О₂, %: С 55.16, Н 3.27, N 11.35. Найдено, %: С 55.12, Н 3.15, N 11.23.

Способ получения тетраэфира 9.

В сухом ацетонитриле (40 мл) растворили эфир DTTA (218 мг, 0.39 ммоль) и бромметилбипиридин 8 (130 мг, 0.35 ммоль), карбонат калия (244 мг, 1.77 ммоль), кипятили в атмосфере аргона в течение 8 ч. Реакционную массу упарили в вакууме. Продукт был экстрагирован из остатка ДХМ (3×20 мл), сушили безводным сульфатом натрия, упарили в вакууме. Остаток очистили колоночной хроматографией, элюент - хлористый метилен, затем – этилацетат. Элюаты, содержащие продукт, упарили в вакууме.

Тетра-трет-бутил 2,2′,2′′,2′′′-(((((5′-(4-аминофенил)-[2,2′-бипиридин]-6-ил)ме-тил)азадиил)бис(этан-2,1-диил))бис(азатриил))тетраацетат (9). Тёмно-жёлтое масло. Выход 212 мг (0.25 ммоль, 71%). ЯМР ¹Н (DMSO-d₆, δ, м.д.): 1.40 (с, 36H, Bu^t), 2.67 (т, 4H, ³J 6.0 Гц, NCH₂), 2.83 (т, 4H, ³J 6.0 Гц, NCH₂), 3.42 (с, 8H, CH₂COOBu^t), 3.89 (с, 2H, PyCH₂), 7.59 (м, 1H, Н-5′), 7.96 (дд, 1H, ³J 7.8, 7.8 Гц, Н-4′), 8.16 (м, 2H, C₆H₄NO₂), 8.36 (дд, 1H, ³J 8.2 Гц, ⁴J 2.4 Гц, Н-4), 8.38-8.44 (м, 3H, Н-3′, C₆H₄NO₂), 8.56 (д, 1H, ³J 8.2 Гц, Н-3), 9.16 (д, 1H, ⁴J 2.4 Гц, Н-6). ESI-MS, m/z: найдено 818.47, вычислено 818.47 (М+Н)⁺.

Синтез тетраэфира 10.

Растворили тетраэфир 9 (255 мг, 0.3 ммоль) в метаноле (50 мл), каталитический палладий (10%) на углероде (25 мг), восстановили водородом, в течение 8 часов при комнатной температуре. Реакционную массу упарили в вакууме. Полученный остаток очищен колоночной хроматографией, элюент - хлористый метилен, затем – этилацетат. Элюаты, содержащие продукт, был упарены в вакууме.

Тетра-трет-бутил 2,2′,2′′,2′′′-(((((5′-(4-аминофенил)-[2,2′-бипиридин]-6-ил)ме-тил)азадиил)бис(этан-2,1-диил))бис(азатриил))тетраацетат («тетраэфир 10»). Тёмно-жёлтое масло. Выход 115 мг (0.14 ммоль, 47%). ЯМР ¹Н (DMSO-d₆, δ, м.д.): 1.41 (с, 36H, Bu^t), 2.66 (т, 4H, ³J 6.0 Гц, NCH₂), 2.83 (т, 4H, ³J 6.0 Гц, NCH₂), 3.36 (с, 8H, CH₂COOBu^t), 3.85 (с, 2H, PyCH₂), 5.07 (уш. с, 2H, NH₂), 6.70 и 7.40 (оба м, 2H, C₆H₄NH₂), 7.48 (м, 1H, Н-5′), 7.77 (дд, 1H, ³J 7.8, 7.8 Гц, Н-4′), 7.92 (дд, 1H, ³J 8.2 Гц, ⁴J 2.4 Гц, Н-4), 8.26 (м, 1H, Н-3′), 8.40 (д, 1H, ³J 8.2 Гц, Н-3), 8.78 (д, 1H, ⁴J 2.4 Гц, Н-6). ESI-MS, m/z: найдено 819.50, вычислено 819.50 (М+Н)⁺.

Получение лиганда 4.

Тетраэфир 10 (82 мг, 0.1 ммоль) растворили в смеси 5 мл 11Н соляной кислоты и 5 мл воды и выдержали при комнатной температуре в течение 8 часов. Реакционную массу упарили в вакууме, к остатку добавили 10 мл 11Н соляной кислоты, смесь выдержали при комнатной температуре в течение 2 часов, упарили в вакууме, остаток обработали сухим ацетонитрилом (25 мл), выдержали полученную смесь при комнатной температуре в течение 8 часов. Осадок отфильтровали, высушили в вакууме.

Гидрохлорид 2,2′,2′′,2′′′-(2,2′-((5′-(4-Аминофенил)-2,2′-бипиридин-6-ил)метил-азадиил)бис(этан-2,1-диил))бис(азатриил)тетрауксусной кислоты («лиганд 4»). Выход 74 мг (0.08 ммоль, 81%). Найдено, %: C 38.53, H 6.04, N 8.71, Cl 18.05. Вычислено для C₂₉H₃₄N₆O₈•9/2HCl•17/2H₂O: C 38.20, H 6.14, N 9.22, Cl 17.50.

Получение европиевого комплекса 1.

Лиганд 4 (55 мг, 0.06 ммоль) растворили в 10 мл воды, к раствору прибавили расчетное количество гидроксида натрия (20.5 мг, 0.51 ммоль). Затем к раствору добавляют EuCl₃•6H₂O (22 мг, 0.06 ммоль) и перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Растворитель отгоняли в вакууме, остаток экстрагировали горячим метанолом (3×20 мл), экстракт упарили в вакууме.

1 («комплекс»). Выход 42 мг (0.049 ммоль, 81%). Найдено, %: С 40.59, Н 4.59, N 9.74. Вычислено для C₂₉H₃₀EuN₆NaO₈•5H₂O: С 40.71, Н 4.71, N 9.82. ESI-MS, m/z: найдено 743.13, вычислено 743.13 [M-Na]^-.

Заявленное соединение представляет собой бесцветное порошкообразное вещество, растворимое в метаноле и воде, нерастворимое в хлороформе, 1,2-дихлорэтане и толуоле.

4.2. Подтверждение насыщенности координационной сферы европия.

Таблица. 1. Координационные свойства европиевого комплекса 1.

τ_H2O, мс τ_D2O, мс q 0.88 1.63 0.34

τ – время жизни возбуждённого состояния; q – параметр, соответствующий количеству молекул воды в координационной сфере европия, q = 1.2*(1/τ_H2O – 1/τ_D2O – 0.25)

Для измерения времени жизни европиевой люминесценции использовался спектрофлюориметр Varian Cary Eclipse с ксеноновой импульсной лампой, время вспышки лампы 0,001 мс. Было получено 5 параллелей по 50 измерений, результаты усреднены. Измерения в H₂O и D₂O проводились в одинаковых условиях.

Как следует из результатов измерения времён жизни возбуждённого состояния европия в воде и тяжёлой воде, приведённых в табл. 1, и соответствующих расчётов, выполненных в соответствие с формулой (A. Beeby, I.M. Clarkson, R.S. Dickins, S. Faulkner, D. Parker, L. Royle, A.S. De Sousa, J.A.G. Williams, M. Woods, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 3 (1999) 493. DOI:10.1039/A808692C) в координационной сфере европия, хелатированного лигандом 4, отсутствуют молекулы воды (дентатность лиганда равна 9), то есть структура последнего исключает безызлучательную релаксацию энергии возбуждённого состояния европия.

4.3. Измерение относительного квантового выхода.

Таблица 2. Фотофизические свойства европиевого комплекса 1.

Поглощение, λ_max, нм (ε, 10^-3М^-1см^-1) Φ_EM 271, 350 (12.08) 0.6

Ф – квантовый выход фотолюминесценции

Электронные спектры поглощения регистрировали с использованием стандартной программы Shimadzu Scan на двулучевом спектрофотометре UV-2600 (“Shimadzu”, Япония) в диапазоне 190 – 700 нм с точностью установки длины волны ± 0,1 нм.

Спектры европиевой фотолюминесценции записаны на спектрофлюориметре Varian Cary Eclipse с взаимно перпендикулярными лучами, точность установки длины волны 0.5 нм. Измерения проводились в диапазонах от 190 до 800 нм в кварцевых кюветах SUPRASIL 111-QS 10 (“Hellma”, Германия), ширина зоны вокруг стационарной точки возбуждения/испускания составляет 10 нм. Длина волны стационарной точки возбуждения задавалась каждый раз максимуму в спектрах поглощения и испускания, длина волны стационарной точки испускания – максимуму в спектрах возбуждения. Напряжение на ФЭУ выбиралось исходя из люминесцентного отклика во время тестовой регистрации. В спектрах учитывалась люминесценция растворителей.

Относительные квантовые выходы растворов соединений измерялись при 22+1 °С по методике, доступной на www.jyhoriba.co.uk (Jobin Yvon Ltd. 2 Dalston Gardens, Stanmore, Middlesex HA7 1BQ UK). Образцом сравнения выступал водный раствор рутениевого комплекса [Ru(bpy)₃]Cl₂·3H₂O. Для измерения квантового выхода использовалось не менее 4-х параллелей с усреднением результатов, R² ≥0,99. Абсорбция в точке возбуждения не превышала 0,05 Abs для исключения реабсорбции.

Как следует из приведённых данных (Фиг. 4 и Табл. 2), максимум поглощения европиевого комплекса находится в области 350 нм, соединение демонстрирует характерную европиевую фотолюминесценции с максимумом длины волны испускаемого излучения 613 нм (красный цвет). Квантовый выход европиевой фотолюминесценции составляет 0.6 %.

Изобретение относится к области люминесцентных комплексных соединений европия, а именно к европиевому комплексу мононатриевой соли (2,2′,2′′,2′′′-(2,2′-((5′-(4-аминофенил)-2,2′-бипиридин-6-ил)метилазадиил)бис-(этан-2,1-диил))-бис(азатриил)тетрауксусной кислоты формулы 1. Предложенный комплекс демонстрирует улучшенные фотофизические свойства и может быть использован в качестве люминесцентной метки для иммуноанализа и найти применение в медицине. 4 ил., 2 табл.

Европиевый комплекс мононатриевой соли (2,2′,2′′,2′′′-(2,2′-((5′-(4-аминофенил)-2,2′-бипиридин-6-ил)метилазадиил)бис-(этан-2,1-диил))-бис(азатриил)тетрауксусной кислоты формулы 1 - люминесцентный краситель: